KR102259767B1

KR102259767B1 - 병풀 유래 아미노산 혼합물을 포함하는 화장료 조성물 및 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR102259767B1
Application number: KR1020200184202A
Authority: KR
Inventors: 홍재화; 허윤회; 이현진; 박송희; 이성현; 최영헌; 공광택; 김지영; 김민기
Original assignee: 한국콜마주식회사; 주식회사 두래
Priority date: 2020-12-28
Filing date: 2020-12-28
Publication date: 2021-06-02

Abstract

본 발명은 병풀 유래 아미노산 혼합물을 포함하는 화장료 조성물과 이의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 병풀 유래 아미노산 혼합물을 피부에 적용 시 독성이 없고, 콜라겐 합성을 억제하는 효소의 생성을 억제하거나 프로콜라겐의 합성을 촉진하고, 생체 내 활성 산소 및 라디칼을 효과적으로 제거하여 항산화 또는 주름 개선 등의 피부 개선 효과가 매우 뛰어나다.

Description

병풀 유래 아미노산 혼합물을 포함하는 화장료 조성물 및 이의 제조 방법 {Cosmetic composition comprising amino acids obtained from Centella Asiatica and method for preparing the same}

본 발명은 병풀 유래 아미노산 혼합물을 포함하는 항산화 또는 주름 개선 등의 다양한 기능성 화장료 조성물과 이의 제조 방법에 관한 것이다.

사람의 피부는 크게 표피층, 진피층, 피하지방층으로 구성되어 있으며, 피부의 가장 기본적인 역할은 우리 몸으로부터 수분이 증발되는 것을 막아주며 외부로부터 유해성분이 침입하는 것을 막아주는 역할을 한다. 이러한 피부는 항상 외부 자극으로부터 노출되어 있기 때문에 다양한 방어 능력을 가지고 있다.

사람은 나이가 들면서 피부 노화가 일어나게 되는데 그 대표적인 증상이 주름(wrinkle)이다. 주름은 나이를 나타내는 하나의 현상으로서, 주름이 생기는 대표적인 원인은 피부의 진피에서 매트릭스를 형성하는 콜라겐의 분해에 기인한다. 피부의 콜라겐은 노화가 진행됨에 따라 생성이 저하되기도 하나, 자외선 등의 외부 자극에 의해 콜라겐 분해 효소(matrix metallo proteinase, MMP-1)의 활성도가 높아지면서 콜라겐이 쉽게 분해되어 주름의 생성이 증가되는 임상 보고들도 많다.

MMP는 다형핵호중구(polymorphonuclear neutrophil), 대식세포(macrophage), 섬유아세포(fibroblast) 등과 같은 세포로부터 분비되는 칼슘 및 아연 의존성 엔도펩티다제(endopeptidase)로 중성 pH에서 작용하며, 기질로서 여러 가지 세포의 기질을 이용한다. 주로 피부에서는 MMP-1, MMP-2, MMP-9 이외에 여러 가지 효소들이 작용하는데, 콜라겐 분해와 관련되어 가장 근본적으로 작용하는 효소는 MMP-1이다. 일반적으로 콜라겐 합성을 촉진하는 종래의 물질로는 레티노이드, TGF-β(transforming growth factor), 베툴린산 등이 있으며, MMP-1의 생성을 억제하는 물질로는 TGF-β(transforming growth factor)가 대표적으로 알려져 있으며, 그 외에도 다양한 천연물들이 MMP-1 생합성을 억제하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 주름 생성을 억제하기 위해서는 콜라겐 합성을 촉진하거나, 또는 콜라겐 분해효소의 생성 및 활성을 억제 하는 방법을 사용할 수 있다.

현재까지 피부 노화 억제를 위하여 사용된 물질로는 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase, SOD) 효소, 지용성 또는 수용성 항산화제 또는 라디칼 소거제 등이 있으며, 이들은 주로 피부노화에 따른 주름 형성을 억제하는 예방 효과가 있다. 그 외에도 레티놀, 비타민 C, β-카로텐(carotene) 등은 그 항산화 효과를 통해 피부 노화를 완화하여 주름을 개선하고 피부 탄력을 증진하는 것으로 알려져 있다. 그러나 레티놀과 비타민 C 등은 빛을 받았을 경우 빛에 의해 변성되면서 피부에 자극을 일으키는 광독성이나 안정성 등이 문제되고 있다.

이에 따라, 최근에는 안전하면서도 항산화 효과와 주름개선 효과가 뛰어난 화장료 조성물의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

본 발명의 일 목적은 병풀 유래 아미노산 혼합물을 포함하는 항산화 또는 주름 개선 등의 다양한 기능성 화장료 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 다른 목적은 상기한 화장료 조성물을 제조하는 방법을 제공하고자 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, 병풀(Centella asiatica)로부터 병풀 유래 아미노산 혼합물을 얻는 단계를 포함하는, 화장료 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 병풀 유래 아미노산 혼합물을 얻는 단계는, 상기 병풀을 제1 효소로 추출하여 병풀 단백질 추출물을 얻는 단계; 및 상기 병풀 단백질 추출물을 제2 효소로 추출하여 병풀 유래 아미노산 혼합물을 얻는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 효소는 펩신(Pepsin), 트립신(Trypsin), 알파키모트립신(α-chymotrypsin), 파파인(Papain), 브로멜라인(Bromelain), 누트라제(Neutrase), 프로타멕스(Protamex), 플라보르자임(Flavourzyme), 판크레아제(Pancrease) 및 중성 프로테아제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

본 발명에서 상기 제2 효소는 세린계 프로테아제(serine type protease)일 수 있다.

본 발명에서 상기 제2 효소는 서브틸리신(subtilisin)일 수 있다.

본 발명에서 상기 제2 효소는 알칼라제(Alcalase)일 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 효소의 첨가에 앞서, 상기 병풀에 산을 첨가하여 pH 2 내지 4로 조절하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 산의 첨가 시 상기 병풀의 10 내지 50배의 중량의 정제수를 추가로 첨가할 수 있다.

본 발명에서 상기 제2 효소의 첨가에 앞서, 상기 병풀 단백질 추출물에 염기를 첨가하여 pH 6 내지 8로 조절하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 효소에 의한 추출은 30 내지 50 ℃의 온도 하에서 1 내지 24 시간 동안 수행될 수 있다.

본 발명에서 상기 제2 효소에 의한 추출은 40 내지 80 ℃의 온도 하에서 1 내지 24 시간 동안 수행될 수 있다.

본 발명에서 상기 병풀 유래 아미노산을 80 내지 100 ℃의 온도에서 10 분 내지 6 시간 동안 실활 처리하는 단계; 상기 실활 처리된 병풀 유래 아미노산 혼합물을 여과하여 여액을 얻는 단계; 상기 여액을 감압 농축하여 농축된 여액을 얻는 단계; 및 상기 농축된 여액을 동결 건조하여 병풀 유래 아미노산 혼합물을 얻는 단계;를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 병풀 유래 아미노산 혼합물을 유효 성분으로 포함하는, 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 병풀 유래 아미노산 혼합물은 상기 병풀을 제1 효소로 추출하여 얻어진 병풀 단백질 추출물을 제2 효소로 추출하여 얻어진 것일 수 있다.

본 발명에서 상기 제2 효소는 알칼라제(Alcalase)일 수 있다.

본 발명에서 상기 화장료 조성물은 항산화 또는 주름 개선의 피부 개선용일 수 있다.

본 발명에서 제공하는 병풀 유래 아미노산 혼합물을 피부에 적용 시 독성이 없고, 콜라겐 합성을 억제하는 효소의 생성을 억제하거나 프로콜라겐의 합성을 촉진하며, 생체 내에서 활성 산소 및 라디칼을 효과적으로 제거해 항산화 또는 주름 개선 등의 피부 개선 효과가 매우 뛰어나다.

도 1은 실험예 1에서 인체섬유아세포에 실시예 1의 병풀 유래 아미노산 혼합물을 또는 비교예 1의 병풀 단백질을 농도별로 처리한 뒤 세포 독성을 평가한 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 병풀 유래 아미노산 혼합물을 또는 비교예 1의 병풀 단백질을 농도별로 처리한 뒤 세포 독성을 평가한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 실험예 2에서 실시예 1의 병풀 유래 아미노산 혼합물을 또는 비교예 1의 병풀 단백질의 프로콜라겐 생성능을 평가한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 실험예 3에서 실시예 1의 병풀 유래 아미노산 혼합물을 또는 비교예 1의 병풀 단백질의 UV 자극에 의한 MMP-1 생성 억제능을 평가한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 실험예 4에서 실시예 1의 병풀 유래 아미노산 혼합물 또는 비교예 2의 병풀 에탄올 추출물의 UV 자극에 의한 MMP-1 생성 억제능을 평가한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 실험예 5에서 실시예 1의 병풀 유래 아미노산 혼합물을 또는 비교예 1의 병풀 단백질의 DPPH 라디칼 소거 활성을 평가한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 실험예 6에서 실시예 1의 병풀 유래 아미노산 혼합물을 또는 비교예 1의 병풀 단백질의 SOD 유사 활성을 평가한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, 병풀 유래 아미노산 혼합물을 유효 성분으로 포함하는 화장료 조성물 및 그 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명에서, 상기 병풀 유래 아미노산 혼합물은 아래의 단계에 따라 제조될 수 있다.

(1) 병풀을 준비하는 단계;

본 발명에서, 상기 "병풀(Centella asiatica)"은 남아시아에서 주로 서식하는 다년생 포복성 약용 식물로서, 우리나라에서는 제주도 및 중남부 지역 저습지에 군생한다. 원줄기는 옆으로 뻗고, 뿌리가 내리는 마디 근처에 2개의 퇴화된 비늘 모양의 잎이 있으며, 잎은 마디에서 밀생하고, 신장형이며, 지름은 2 내지 5cm이고, 표면은 광택이 나며, 가장 자리에 둔한 톱니가 있고, 잎자루의 길이는 4 내지 20cm이다. 병풀의 주요성분으로는 마데카소사이드(madecassoside), 마데카식애씨드(madecassic acid), 아시아티코사이드(asiaticoside) 및 아시아틱애씨드(asiatic acid) 등이 있다.

본 발명에서, 상기와 같이 준비된 병풀의 부위는 특별히 제한하지 않으며, 뿌리, 줄기, 잎, 종자 및/또는 열매가 모두 사용 가능하나, 바람직하게는 잎 부위를 사용할 수 있다.

본 발명은, 상기와 같이 준비된 병풀을 건조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 여기서 상기 건조는 열풍 건조, 감압 건조, 진공 건조, 비등 건조, 분무 건조 또는 동결 건조하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명은, 상기와 같이 건조된 병풀을 분쇄하여 병풀 분말을 얻는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명은, 상기 병풀 분말을 제1 효소로 추출하여 병풀 단백질 추출물을 얻는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서, 상기 제1 효소는 펩신(Pepsin), 트립신(Trypsin), 알파키모트립신(α-chymotrypsin), 파파인(Papain), 브로멜라인(Bromelain), 누트라제(Neutrase), 프로타멕스(Protamex), 플라보르자임(Flavourzyme), 판크레아제(Pancrease) 및 중성 프로테아제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 바람직하게는 펩신(pepsin)일 수 있다.

본 발명에서, 상기 제1 효소에 의한 추출은 30 내지 50 ℃, 바람직하게는 35 내지 45 ℃의 온도 하에서 1 내지 24 시간, 바람직하게는 2 내지 12 시간 동안 수행하는 것이, 상기 제1 효소의 활성을 높일 수 있다.

본 발명은, 상기 제1 효소의 첨가에 앞서, 상기 병풀 분말에 산, 바람직하게는 구연산을 첨가하여 pH 2 내지 4로 조절하는 단계를 더 포함함으로써 첨가되는 제1 효소의 활성을 높일 수 있다.

본 발명에서, 상기 산의 첨가 시 상기 병풀 분말에 정제수를 추가로 첨가할 수 있다. 이때 상기 정제수는 상기 병풀 분말에 상기 산을 첨가하기 전 또는 첨가한 후에 첨가될 수 있고, 혹은 산과 함께 첨가될 수 있다. 또한, 상기 정제수는 분쇄된 병풀의 10 내지 50배의 중량, 바람직하게는 10 내지 30배의 중량의 양으로 첨가될 수 있다.

본 발명은, 상기 병풀 단백질 추출물을 제2 효소로 추출하여 병풀 유래 아미노산 혼합물을 얻는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서, 상기 제2 효소는 세린계 프로테아제(serine type protease)일 수 있고, 바람직하게는 서브틸리신(subtilisin)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 알칼라제®(Alcalase®), 알칼라제® 0.6L(Alcalase® 0.6L), 알칼라제® 2.5L(Alcalase® 2.5L), ALK-효소(ALK-enzyme), 바실로펩티다제 A(bacillopeptidase A), 바실로펩티다제 B(bacillopeptidase B), 바실러스 서브틸리시 알칼리성 프로테이나제 바이오프라제(Bacillus subtilis alkaline proteinase bioprase), 바이오프라제 AL 15(bioprase AL 15), 바이오프라제 APL 30(bioprase APL 30), 콜리스티나제(colistinase), 서브틸리신 J(subtilisin J), 서브틸리신 S41(subtilisin S41), 서브틸리신 센다이(subtilisin Sendai), 서브틸리신 GX(subtilisin GX), 서브틸리신 E(subtilisin E), 서브틸리신 BL(subtilisin BL), 제네나제 I(genenase I), 에스페라제®(Esperase®), 막사타제(maxatase), 터모아제 PC 10(thermoase PC 10), 프로테아제 XXVII(protease XXVII), 터모아제(thermoase), 수페라제(superase), 서브틸리신 DY(subtilisin DY), 서브틸로펩티다제(subtilopeptidase), SP 266, 사비나제® 8.0L(Savinase® 8.0L), 사비나제® 4.0L(Savinase® 4.0T), 카주사제(kazusase), 프로테아제 VIII(protease VIII), 옵티클레안(opticlean), 바실러스 서브틸리스 알칼리성 프로테이나제(Bacillus subtilis alkaline proteinase), 프로틴 A 3L(protin A 3L), 사비나제®(Savinase®), 사비나제® 16.0L(Savinase® 16.0L), 사비나제® 32.0L EX(Savinase® 32.0 L EX), 오리엔타제 10B(orientase 10B) 및 프로테아제 S(protease S)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 가장 바람직하게는 Alcalase®일 수 있다.

본 발명에서, 상기 "세린계 프로테아제(serine type protease)"는 단백질에서, 효소의 활성 부위 중 세린이 친핵성 아미노산으로 작용하는 부위를 절단하는 효소를 의미한다. 세린계 프로테아제는 진핵 생물 및 원핵 생물 모두에서 발견되며 구조에 따라 키모트립신계 프로테아제 또는 서브틸리신계 프로테아제로 나뉜다.

본 발명에서, 상기 "서브틸리신(subtilisin)"은 초기에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터 분리된 프로테아제로, 알칼리성 비-특이적 세린계 프로테아제에 해당하며, 효소 활성 부위의 세린 잔기를 통해 펩타이드 결합을 친핵성 공격하여 작용하고, 단백질과 펩타이드 아마이드의 가수분해를 촉매화한다.

본 발명에서, 상기 "알칼라제(Alcalase®)"는 덴마크 생명공학회사인 노보자임스(Novozymes)에서 판매되는 효소로, 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)에 의해 분비되는 서브틸리신 칼스버그(Subtilisin Carlsberg)에 해당한다.

본 발명에서, 상기 제2 효소에 의한 추출은 40 내지 80 ℃, 바람직하게는 50 내지 70 ℃의 온도 하에서 1 내지 24 시간, 바람직하게는 2 내지 12 시간 동안 수행하는 것이, 상기 제2 효소의 활성을 높일 수 있다.

본 발명은, 상기 제2 효소의 첨가에 앞서, 상기 병풀 단백질 추출물에 염기, 바람직하게는 수산화나트륨(NaOH)을 첨가하여 pH 6 내지 8로 조절하는 단계를 더 포함함으로써 첨가되는 제2 효소의 활성을 높일 수 있다.

본 발명에서, 상기 염기의 첨가 시 필요에 따라서는 상기 병풀 단백질 추출물에 정제수를 추가로 첨가할 수 있다. 이때 상기 정제수는 상기 병풀 단백질 추출물에 상기 염기를 첨가하기 전 또는 첨가한 후에 첨가될 수 있고, 혹은 염기와 함께 첨가될 수 있다.

본 발명은, 상기 병풀 유래 아미노산 혼합물을 가열하여 실활 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서, 상기 실활 처리는 80 내지 100 ℃, 바람직하게는 90 내지 95 ℃의 온도에서 10 분 내지 6 시간, 바람직하게는 1 내지 2 시간 동안 가열하며 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은, 상기 실활 처리된 병풀 유래 아미노산 혼합물을 여과하여 여액을 얻는 단계를 더 포함할 수 있다. 여기서, 상기 여과는 여과지, 바람직하게는 0.5 ㎛의 공극도를 갖는 여과지를 사용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 상기 여액을 농축하여 농축된 여액을 얻는 단계를 더 포함할 수 있다. 여기서, 상기 농축은 감압 증류 장치를 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 상기 농축된 여액을 건조하여 분말 형태의 병풀 유래 아미노산 혼합물을 얻는 단계를 더 포함할 수 있다. 여기서, 상기 건조는 열풍 건조, 감압 건조, 진공 건조, 비등 건조, 분무 건조 또는 동결 건조하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 화장료 조성물은 상기와 같이 얻어진 병풀 유래 아미노산 혼합물 또는 병풀 유래 아미노산 혼합물을 유효 성분으로 포함함으로써, 콜라겐 분해 효소인 기질금속단백질분해효소(matrixmetalloprotease; MMP)의 생성을 억제하고, 프로콜라겐(procollagen)의 합성을 촉진하며, 생체 내 활성 산소 및 라디칼을 효과적으로 제거하여, 항산화 또는 주름 개선 등의 피부 개선 효과가 매우 뛰어나다.

본 발명에서, 상기 "항산화"는 피부의 주요 구성물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등이 산화하여 결과적으로 피부 세포 및 조직의 노화 과정을 촉진하게 되는데, 이러한 노화 과정을 억제하는 작용을 말한다.

본 발명에서, 상기 "유효 성분으로 포함하는"이란 상기의 병풀 유래 아미노산 혼합물 또는 병풀 유래 아미노산 혼합물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물에 포함된 병풀 유래 아미노산 혼합물 또는 병풀 유래 아미노산 혼합물의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다. 다만, 본 발명에서 화장료 조성물이 그 효과를 발휘하기 위해서는 상기 병풀 유래 아미노산 혼합물 또는 병풀 유래 아미노산 혼합물의 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 50 중량%로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 화장료 조성물은 화장수, 영양로션, 영양에센스, 마사지 크림, 미용목욕물첨가제, 바디로션, 바디밀크, 배스오일, 베이비오일, 베이비파우더, 샤워겔, 샤워크림, 선스크린로션, 선스크린크림, 선탠크림, 스킨로션, 스킨크림, 자외선차단용 화장품, 파운데이션, 메이크업베이스, 비비크림, 스킨커버, 컨실러, 립스틱, 립그로스, 립밤, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 아이라이너, 마스카라, 치크칼라, 아이브로우 펜슬류, 크렌징밀크, 탈모제(화장용), 페이스 및 바디로션, 페이스 및 바디크림, 피부미백크림, 핸드로션, 헤어로션, 화장용크림, 쟈스민오일, 목욕비누, 물비누, 미용비누, 샴푸, 손세정제(핸드클리너), 약용비누{비의료용}, 크림비누, 페이셜 워시, 전신 세정제, 두피 세정제, 헤어린스, 화장비누, 치아미백용 겔, 치약 등의 형태로 제조될 수 있다. 이를 위해 본 발명의 조성물은 화장료 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 용매나, 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물 내에 더 추가될 수 있는 용매의 종류는 특별히 한정하지 않으나, 예를 들어, 물, 식염수, DMSO 또는 이들의 조합을 사용할 수 있고, 담체, 부형제 또는 희석제로는 정제수, 오일, 왁스, 지방산, 지방산 알콜, 지방산 에스테르, 계면활성제, 흡습제(humectant), 증점제, 항산화제, 점도 안정화제, 킬레이팅제, 완충제, 저급 알콜 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 필요에 따라 미백제, 보습제, 비타민, 자외선 차단제, 향수, 염료, 항생제, 항박테리아제, 항진균제를 포함할 수 있다.

상기 오일로서는 수소화 식물성유, 피마자유, 면실유, 올리브유, 야자인유, 호호바유, 아보카도유가 이용될 수 있으며, 왁스로는 밀랍, 경랍, 카르나우바, 칸델릴라, 몬탄, 세레신, 액체 파라핀, 라놀린이 이용될 수 있다.

지방산으로는 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 올레산이 이용될 수 있고, 지방산 알콜로는 세틸 알콜, 옥틸 도데칸올, 올레일 알콜, 판텐올, 라놀린 알콜, 스테아릴 알콜, 헥사데칸올이 이용될 수 있으며 지방산 에스테르로는 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 부틸 스테아레이트가 이용될 수 있다.

계면 활성제로는 당업계에 알려진 양이온 계면활성제, 음이온 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 사용가능하며 가능한 한 천연물 유래의 계면활성제가 바람직하다.

그 외에도 화장품 분야에서 널리 알려진 흡습제, 증점제, 항산화제 등을 포함할 수 있으며, 이들의 종류와 양은 당업계에 공지된 바에 따른다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

[실시예 1] 병풀 유래 아미노산 혼합물의 제조

병풀을 건조한 후, 분쇄하여 원물을 분말 형태로 준비하였다. 100 g의 분쇄된 병풀 원물을 20 배 중량에 해당하는 2.0 kg의 정제수를 첨가하고 구연산을 첨가하여 pH를 3으로 조절한 뒤 펩신(pepsin) 효소를 첨가하여 40 ℃에서 5 시간 동안 1차 효소 추출을 수행하였다. 이 후, 수산화나트륨을 첨가하여 pH를 7.0으로 조절하고 Alcalase®(Novozymes NS, 덴마크) 효소를 첨가하여 60 ℃에서 5시간 동안 2차 효소 추출을 수행하였다. 효소 추출이 종료되면 90 ℃에서 1 시간동안 실활 처리를 수행하고 0.5 ㎛ 공극도의 여과지로 여과한 후 그 여액을 감압 농축하였다. 감압 농축이 진행된 여액에 남아있는 용매를 제거하기 위해 동결 건조하여 분말상의 병풀 유래 아미노산 혼합물을 제조하였다.

[비교예 1] 병풀 단백질의 제조

병풀을 건조한 후, 분쇄하여 원물을 분말 형태로 준비하였다. 100 g의 분쇄된 병풀 원물을 20 배 중량에 해당하는 2.0 kg의 정제수를 첨가하고 구연산을 첨가하여 pH를 3으로 조절한 뒤 펩신(pepsin) 효소를 첨가하여 40 ℃에서 5 시간 동안 효소 추출을 수행하였다. 효소 추출이 종료되면 90 ℃에서 1 시간동안 실활 처리를 수행하고 0.5 ㎛ 공극도의 여과지로 여과한 후 그 여액을 감압 농축하였다. 감압 농축이 진행된 여액에 남아있는 용매를 제거하기 위해 동결 건조하여 분말상의 병풀 단백질을 제조하였다.

[비교예 2] 병풀 에탄올 추출물의 제조

병풀을 건조한 후, 분쇄하여 원물을 분말 형태로 준비하였다. 병풀 분말 100g에 70%(w/v) 에탄올을 1L를 가하고, 상온에서 3시간 정도 침지하여 추출하였고, 얻어진 추출물을 여과한 후, 여과액을 진공 감압농축하여 병풀 추출물을 수득하였다.

[준비예 1] 세포 배양

인체섬유아세포(Normal human Fibroblast, NHF)를 배양 접시의 바닥에 접종한 후, 페니실린(100IU/mL), 스트렙토마이신(100μg/mL), 보충제(Insulin 0.1%, rhFGF-B 0.1%, GA-1000 0.1%, FBS 2%)를 함유하는 섬유아세포 기본 FBM(Fibroblast Basal Medium) 배지를 넣고 37 ℃, 5% CO₂를 포함하는 배양기 내에서 배양하였다.

사람각질세포(Human Keratinocyte)인 HaCaT을 배양 접시의 바닥에 접종한 후, 페니실린(100IU/mL), 스트렙토마이신(100μg/mL), 10% FBS(fetal bovine serum)를 함유하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지를 넣고 37 ℃, 5% CO₂를 포함하는 배양기 내에서 배양하였다.

인체피부섬유아세포(Human foreskin fibroblast, Hs68)를 배양 접시의 바닥에 접종한 후, 페니실린(100IU/mL), 스트렙토마이신(100μg/mL), 10% FBS(fetal bovine serum)를 함유하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지를 넣고 37 ℃, 5% CO₂를 포함하는 배양기 내에서 배양하였다.

[실험예 1] 세포 독성(Cell toxicity) 평가

인체섬유아세포(NHF)를 0.6 x 10⁴ 세포/웰, 인체피부섬유아세포(Hs68)를 1.5 x 10⁴ 세포/웰씩 분주한 후, 24시간 동안 세포가 플레이트(plate)에 잘 붙도록 37 ℃, 5% CO₂ 조건의 세포 배양기에 배양하였다. 인체섬유아세포에는 보충제(supplement)를 포함하지 않은 FBM 배지를 사용하여 세포를 기아 상태로 만들어 주었고, 인체피부섬유아세포에는 FBS를 포함하지 않은 DMEM 배지를 사용하여 기아 상태로 만들어 주었다. 다음 날 시험 물질로 상기 실시예 1 및 비교예 1에서 각각 제조된 병풀 유래 아미노산 혼합물 또는 병풀 단백질을 농도 별로 처리하여 배양하였다. 세포에 WST-1 시약(DoGen, EZ-3000)을 처리하여 반응시키고, ELISA 리더(Thermo, 51119300)로 450nm에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 표 1과 도 1 및 2에 나타내었다. 세포 생존율은 하기 식 1로 계산하였다.

[식 1]

세포 생존율 (%)= (시험물질 처리군의 흡광도/대조군의 흡광도)*100

시험 물질		처리 농도 (㎍/㎖)	인체섬유아세포 생존율 (%)	인체피부섬유아세포 생존율 (%)
대조군			100.00±0.74	100.00±0.23
병풀 추출물	단백질 (비교예 1)	50	102.96±0.94	107.23±7.45
		100	104.79±3.55	122.90±3.42
		200	110.70±3.30	120.43±8.89
		400	112.25±6.29	129.95±4.47
	아미노산 혼합물 (실시예 1)	50	94.81±5.45	114.27±1.92
		100	102.81±8.50	113.06±2.55
		200	95.36±2.42	119.19±4.02
		400	106.75±6.80	131.54±3.58

상기 표 1과 도 1 및 2에서 보는 바와 같이, 인체섬유아세포(NHF) 및 인체피부섬유아세포(Hs68)에 병풀 유래 아미노산 혼합물을 최고 농도인 400㎍/㎖로 처리하여도 세포 독성이 나타나지 않는 것을 확인할 수 있었다. 이에 따라, 이하의 실험에서는 세포 독성 실험 결과를 토대로 세포 독성이 없는 농도에서 병풀 유래 아미노산 혼합물을 처리하여 효능 시험을 진행하였다.

[실험예 2] 프로콜라겐(procollagen) 생성 효능 평가

96 웰 플레이트에 인체피부섬유아세포(Hs68)를 1.5 x 10⁴ 세포/웰씩 분주한 후, 24시간 동안 세포가 플레이트에 잘 붙도록 37 ℃, 5% CO₂ 세포 배양기에서 배양하였다. 24시간 후, FBS를 포함하지 않은 DMEM 배지를 사용하여 세포를 기아 상태로 만들어 준 후, 다음 날 시험 물질로 실시예 1의 병풀 유래 아미노산 혼합물과 비교예 1의 병풀 단백질을 농도 별로 처리하여 배양하였다. 이 때의 양성 대조군으로 TGF-b 또는 비타민 C(Vit. C)를 사용하였으며 프로콜라겐 (Takara, MK101) ELISA 키트를 이용하여 실험 후, ELISA 리더로 450nm 흡광도를 측정하였다. 최종 생성된 프로콜라겐의 양은 일정 단백질 당 프로콜라겐의 양으로 환산하여 음성 대조군과 비교하였다. 세포 내에 포함된 단백질의 양을 측정하기 위해서는, 배지를 회수하고 PBS로 세척 후, 1N NaOH를 처리하여 세포를 용해시켜 주었다. 단백질 정량법 중 하나인 로리 어쎄이(Lowry assay)를 수행하였으며, Bio-Rad의 DC 단백질 어쎄이(500-0116) 제품을 사용하였다. 시약 A(Reagent A): 시약 S(Reagent S) = 50 : 1로 하여 반응시켜준 후, 시약 B(Reagent B)를 처리하여 상온에서 20 분간 반응시켜주었다. ELISA 리더로 750 nm에서 흡광도를 측정하고, 단백질의 양은 소 혈청 알부민 (Bovine serum albumin)으로부터 얻은 표준 곡선을 이용하여 결정하였다. 프로콜라겐 생성 효능을 평가한 실험 결과는 하기 표 2 및 도 3에 나타내었다.

시험 물질		농도 (㎍/㎖)	프로콜라겐 생성량 (%)
대조군			100.00±4.59
TGF-β (10ng/ml)			165.45±7.66
Vit.C (0.176 μg/ml)			217.99±10.60
병풀 추출물	단백질 (비교예 1)	100	74.76±1.93
		200	72.41±6.39
		400	67.96±7.47
	아미노산 혼합물 (실시예 1)	100	108.68±4.89
		200	104.22±6.35
		400	124.83±5.49

상기 표 2 및 도 3에서 보는 바와 같이, 병풀 단백질의 경우 프로콜라겐 생성 효능을 보이지 않은 반면, 병풀 유래 아미노산 혼합물은 프로콜라겐 생성 효능을 확인할 수 있었다.

이를 통해 본 발명에 따르는 병풀 유래 아미노산 혼합물이 병풀 단백질에 비하여 프로콜라겐 생성능이 더 뛰어난 것을 알 수 있었다.

[실험예 3] UV 자극에 의한 MMP-1 생성 억제능 평가(1)

6 웰 플레이트에 HaCaT을 2.5 x 10⁵ 세포/웰씩 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 배지를 버리고 PBS로 세척한 다음 FBS를 포함하지 않은 DMEM 배지(serum free 배지)를 사용하여 세포를 기아 상태로 만들어 준 후, 다음 날 UV를 처리하여 배양하였다. 96 웰 플레이트에 인체섬유아세포를 0.6 x 10⁴ 세포/웰씩 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 보충제를 포함하지 않은 FBM 배지를 사용하여 세포를 기아 상태로 만들어 준 후, 다음 날 UV 자극을 받은 HaCaT 배양액을 시험 물질로 실시예 1의 병풀 유래 아미노산 혼합물과 비교예 1의 병풀 단백질과 함께 인체섬유아세포에 처리하여 배양하였다. 이 때의 양성 대조군으로 녹차의 카테킨 성분인 에피갈로카테킨 갈레이트(Epigallocatechin gallate; EGCG) 및 레티노산(retinoic acid; RA)를 사용하였다. MMP-1 (R&D System, DY901) ELISA 키트를 이용하여 실험 후, ELISA 리더로 450nm에서 흡광도를 측정하였으며, 최종 MMP-1의 양은 실험예 2와 동일한 방법으로 일정 단백질 당 MMP-1 양으로 환산하여 음성 대조군과 비교하였고, 그 결과는 하기 표 3 및 도 4에 나타내었다.

시험 물질		농도 (㎍/㎖)	MMP-1 생성량 (%)
대조군			100.00±8.09
UV (20mJ)			283.12±5.36
EGCG (10μM)			105.58±1.92
RA (10μM)			18.39±1.53
병풀 추출물	단백질	100	196.13±2.42
		200	179.46±5.59
		400	186.14±8.12
	아미노산 혼합물	100	138.97±4.80
		200	148.83±2.22
		400	90.22±3.03

상기 표 3 및 도 4에서 보는 바와 같이, 병풀 유래 아미노산 혼합물을 처리한 경우가 병풀 단백질을 처리한 경우에 비하여 UV 자극으로 인하여 증가된 MMP-1의 생성 억제능이 현저히 더 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.

[실험예 4] UV 자극에 의한 MMP-1 생성 억제능 평가(2)

본 발명에 따른 병풀 유래 아미노산 혼합물과 병풀 에탄올 추출물의 MMP-1 생성 억제능을 평가하기 위하여, 상기 실험예 3과 동일한 방법으로 실험을 수행하되, 대조군으로 비교예 1의 병풀 유래 아미노산 혼합물 대신에 비교예 2의 병풀 에탄올 추출물을 처리하였다. 최종 MMP-1의 양을 측정하여 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에서 보는 바와 같이, 병풀 유래 아미노산 혼합물을 처리한 경우는 병풀 에탄올 추출물을 처리한 경우 보다 뛰어난 수준으로 UV 자극으로 인하여 증가된 MMP-1의 생성을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

[실험예 5] DPPH 라디칼 소거 활성 평가

체내의 라디칼을 직접적으로 측정하기는 어려우므로, 2,2-디페닐-1-피크릴하이드라질(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl; DPPH) 라디칼을 사용하여 시험 물질인 실시예 1의 병풀 유래 아미노산 혼합물과 비교예 1의 병풀 단백질의 항산화력을 예측 및 평가하였다. 구체적으로는, 96 웰 이뮨 플레이트(immune plate)에 각 시료(실시예 1의 병풀 유래 아미노산 혼합물 또는 비교예 1의 병풀 단백질) : 1mM DPPH 용액 = 1 : 4 의 비율로 넣은 후 30분간 반응시켜준다. 반응 후 ELISA 리더로 520 nm에서 흡광도를 측정하여 최종 IC₅₀ (시료가 라디칼의 농도를 절반으로 감소시킬 때 해당되는 시료의 농도를 뜻함)에 해당하는 값을 얻었고, 그 결과는 하기 표 4 및 도 6에 나타내었다.

시험 물질		농도 (㎍/㎖)	DPPH 라디칼 소거 활성 (%)	IC₅₀ (㎍/㎖)
병풀 추출물	단백질	125	7.20±2.98	623.50
		250	15.98±2.95
		500	37.62±2.52
		1000	87.49±0.66
	아미노산 혼합물	125	11.08±3.28	382.86
		250	31.62±3.55
		500	66.01±1.31
		1000	93.22±0.31

상기 표 4 및 도 6에서 보는 바와 같이, 병풀 단백질과 병풀 유래 아미노산 혼합물의 IC₅₀은 각각 623 ㎍/㎖ 및 382 ㎍/㎖로 측정되었는 바, 병풀 단백질에 비하여 병풀 유래 아미노산 혼합물의 DPPH 라디칼 소거 활성이 더 우수한 것을 확인할 수 있었다.

[실험예 6] SOD 유사 활성 평가

슈퍼옥사이드 디스뮤타제(Superoxide dismutase; SOD)는 각종 세포의 대사 과정에서 끊임없이 생성되는 활성 산소들 중 슈퍼옥사이드 음이온(superoxide anion)을 산소와 과산화수소로 전환시키는 반응을 촉매하는 항산화 효소이다. 시험 물질로 실시예 1의 병풀 유래 아미노산 혼합물과 비교예 1의 병풀 단백질의 SOD 유사 활성능을 확인하기 위하여 어쎄이 키트(Dogen, DG-SOD400)를 사용하였다. 96 웰 이뮨 플레이트에 양성 대조군으로 비타민 C(Ascorbic acid)와 각 시료(실시예 1의 병풀 유래 아미노산 혼합물 또는 비교예 1의 병풀 단백질) 또는 용매 (Blank)를 20 μl씩 넣고 발색 시약인 WST 용액을 200 μl를 넣었다. 크산틴 옥시다제(Xanthine oxidase) 용액을 20 μl 넣고 블랭크(Blank)에는 키트에 제공된 버퍼를 20 μl 넣은 후 37 ℃에서 20 분간 반응시켰다. 이후, 450 nm에서 흡광도를 측정하여 최종 IC₅₀ (시료가 라디칼의 농도를 절반으로 감소시킬 때 해당되는 시료의 농도를 뜻함)에 해당하는 값을 얻었고, 그 결과는 하기 표 5 및 도 7에 나타내었다.

시험 물질		농도 (㎍/㎖)	SOD 유사 활성 (%)	IC₅₀ (㎍/㎖)
대조군(Ascorbic acid)		-	-	390.35
병풀 추출물	단백질	250	31.00±1.61	957.02
		500	39.22±0.28
		1000	51.01±2.97
		2500	91.95±0.15
	아미노산 혼합물	250	25.55±2.05	835.44
		500	39.01±3.73
		1000	55.39±1.76
		2500	82.24±1.42

상기 표 5 및 도 7에서 보는 바와 같이, 병풀 단백질과 병풀 유래 아미노산 혼합물의 IC₅₀은 각각 957㎍/㎖, 835.44㎍/㎖로 측정되었는 바, 병풀 단백질에 비하여 병풀 유래 아미노산 혼합물의 SOD 유사 활성이 더 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

병풀(Centella asiatica)로부터 병풀 유래 아미노산 혼합물을 얻는 단계를 포함하는, 화장료 조성물의 제조 방법으로,
상기 병풀 유래 아미노산 혼합물을 얻는 단계는,
상기 병풀을 제1 효소로 추출하여 병풀 단백질 추출물을 얻는 단계; 및
상기 병풀 단백질 추출물을 제2 효소로 추출하여 병풀 유래 아미노산 혼합물을 얻는 단계를 포함하는, 화장료 조성물의 제조 방법.
삭제
제1항에 있어서,
상기 제1 효소는 펩신(Pepsin), 트립신(Trypsin), 알파키모트립신(α-chymotrypsin), 파파인(Papain), 브로멜라인(Bromelain), 누트라제(Neutrase), 프로타멕스(Protamex), 플라보르자임(Flavourzyme), 판크레아제(Pancrease) 및 중성 프로테아제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 화장료 조성물의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 제2 효소는 세린계 프로테아제(serine type protease)인, 화장료 조성물의 제조 방법.
제4항에 있어서,
상기 제2 효소는 서브틸리신(subtilisin)인, 화장료 조성물의 제조 방법.
제5항에 있어서,
상기 제2 효소는 알칼라제(Alcalase)인, 화장료 조성물의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 제1 효소의 첨가에 앞서, 상기 병풀에 산을 첨가하여 pH 2 내지 4로 조절하는 단계를 더 포함하는, 화장료 조성물의 제조 방법.
제7항에 있어서,
상기 산의 첨가 시 상기 병풀의 10 내지 50배의 중량의 정제수를 추가로 첨가하는, 화장료 조성물의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 제2 효소의 첨가에 앞서, 상기 병풀 단백질 추출물에 염기를 첨가하여 pH 6 내지 8로 조절하는 단계를 더 포함하는, 화장료 조성물의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 제1 효소에 의한 추출은 30 내지 50 ℃의 온도 하에서 1 내지 24 시간 동안 수행되는, 화장료 조성물의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 제2 효소에 의한 추출은 40 내지 80 ℃의 온도 하에서 1 내지 24 시간 동안 수행되는, 화장료 조성물의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 병풀 유래 아미노산 혼합물을 80 내지 100 ℃의 온도에서 10 분 내지 6 시간 동안 실활 처리하는 단계;
상기 실활 처리된 병풀 유래 아미노산 혼합물을 여과하여 여액을 얻는 단계;
상기 여액을 감압 농축하여 농축된 여액을 얻는 단계; 및
상기 농축된 여액을 동결 건조하여 병풀 유래 아미노산 혼합물을 얻는 단계;를 더 포함하는, 화장료 조성물의 제조 방법.
병풀(Centella asiatica) 유래 아미노산 혼합물을 유효 성분으로 포함하며,
상기 병풀 유래 아미노산 혼합물은 상기 병풀을 제1 효소로 추출하여 얻어진 병풀 단백질 추출물을 제2 효소로 추출하여 얻어진 것인, 화장료 조성물.
삭제
제13항에 있어서,
상기 제1 효소는 펩신(Pepsin), 트립신(Trypsin), 알파키모트립신(α-chymotrypsin), 파파인(Papain), 브로멜라인(Bromelain), 누트라제(Neutrase), 프로타멕스(Protamex), 플라보르자임(Flavourzyme), 판크레아제(Pancrease) 및 중성 프로테아제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 화장료 조성물.
제13항에 있어서,
상기 제2 효소는 세린계 프로테아제(serine type protease)인, 화장료 조성물.
제16항에 있어서,
상기 제2 효소는 서브틸리신(subtilisin)인, 화장료 조성물.
제17항에 있어서,
상기 제2 효소는 알칼라제(Alcalase)인, 화장료 조성물.
제13항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 항산화 또는 주름 개선의 피부 개선용인, 화장료 조성물.