JP2016003193A - フィトエン及び／又はフィトフルエンを含有する抗糖化剤 - Google Patents

Abstract

【課題】新たなＡＧＥｓ生成抑制物質であるフィトエン及び／又はフィトフルエンを含有する新たな抗糖化剤の提供。
【解決手段】フィトエン及び／又はフィトフルエンを含有する抗糖化剤。
【選択図】図１

Description

本発明は、フィトエン及び／又はフィトフルエンを含有する抗糖化剤に関する。

終末糖化産物ＡＧＥｓ（Advanced Glycation End-products）は、その生成過程に関し
ては未だ不明の点が多いが、生体内において、ブドウ糖などの還元糖とタンパク質との間で糖化反応(メイラード反応)により生成され、通常は、代謝によって体外へ排出されることが知られている。しかし、加齢に伴い代謝速度が遅くなって生体内の各組織に蓄積され、ＡＧＥｓの受容体と結合することにより、種々の症状を引き起こすといわれている。例えば、皮膚においてＡＧＥｓが蓄積すると、肌全体の衰えの一因になり、また、糖尿病患者では、高血糖により生じたＡＧＥｓが白内障、動脈硬化、腎機能障害などの合併症を引き起こす。そのため、ＡＧＥｓ生成を抑制する成分や、ＡＧＥｓ分解成分の探索が行われている（特許文献１〜４）。

しかし、ＡＧＥｓ産生抑制剤のような医薬品はまだ開発段階であり、また、従来このような合成化合物には予期せぬ副作用が伴うことが多く、合成医薬品による治療よりは食生活を通じて疾患を予防、抑制、改善及び治療できる機能を持った成分又は食品成分に対する研究が注目されるようになってきた。

一方で、植物や、緑藻などの藻類、細菌、酵母などの生体内では、カロテノイド合成経路において、グルコースなどその生物種に対して適切な炭素源を出発物質として、最初のカロテノイドであるフィトエンが合成され、次いでフィトフルエンが合成されることが知られている。カロテノイド合成経路において合成されるカロテノイドのうち、フィトエン、フィトフルエンは、その構造の一部に共役二重結合を欠損する物質である。特にフィトエンは、細胞の脂質過酸化抑制作用を有することが知られている。

フィトエンは、デュナリエラ藻体内に多量に含まれている。癌や生活習慣病の予防等を目的として、このデュナリエラ藻体自体を配合した食品や、デュナリエラ藻体の培養により得られるフィトエンを配合した食品などが知られている（特許文献５）。さらに、フィトエン及びフィトフルエンが皮膚細胞中のメラニン含有量を低減させること、抗酸化特性を有すること、紫外線を吸収すること等の知見に基づいて、これらを含有する皮膚漂白剤や、酸化または紫外線によって生じる皮膚損傷の予防のための化粧品または医薬品なども知られている（特許文献６、７）。

特開２０１２−１９３１７４号公報 特開２０１１−２４６３５３号公報 特開２０１０−２４８１５０号公報 特開２００３−２１２７４９号公報 特開２００３−１８３１３０号公報 特開２００８−１３５４１号公報 特開２００８−１７２１号公報

フィトエンやフィトフルエンが、癌や生活習慣病の予防等の効果を有すること、メラニ
ン含有量を低減させること、抗酸化特性を有することなどは知られていたが、ＡＧＥｓ生成抑制活性を有することは知られていなかった。
本発明は、この様な状況下でなされたものであり、新たなＡＧＥｓ生成抑制物質であるフィトエン及び／又はフィトフルエンを含有する新たな抗糖化剤を提供することを課題とする。

本発明者らは、鋭意検討した結果、以下に示すような新たな抗糖化剤が上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下に示すとおりである。
〔１〕フィトエン及び／又はフィトフルエンを含有する抗糖化剤。

本発明によれば、新たなＡＧＥｓ生成抑制物質であるフィトエン及び／又はフィトフルエンを含有する新たな抗糖化剤を提供することができる。

本発明の一実施態様における、フィトエン濃度と糖化反応阻害率との関係を示す図である。

＜１．フィトエン＞
本発明に係る抗糖化剤は、フィトエン及び／又はフィトフルエンを含有する。フィトエンは、その構造が次の化学式で表される既知の物質である。

上記フィトエンを得る方法は特段限定されず、植物や微生物から抽出してもよいし、微生物に生産させて回収してもよいし、化学合成により生産してもよい。
植物から抽出する場合、その植物の種類は特段限定されないが、フィトエンを多く含有することから、例えば、トマト、オレンジ白菜などの植物が好ましく、さらにトマトを加工したトマトパウダーなども好ましい。微生物から抽出する場合、その微生物の種類は特段限定されず、例えば、光合成又は非光合成細菌、酵母、カビなどを挙げることができる。中でも、フィトエンを多く含有することから、例えば、緑藻（デュナリエラ、ヘマトコッカス）などの藻類や、海水由来の非光合成細菌Ａｌｇｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ．（アルギ
バクター・エスピー）などが好ましい。微生物にフィトエンを生産させて回収する場合には、フィトエンを産生するように変異させたＰａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（パラコッカス・エスピー）ＦＡ１又はＦＡ３や、フィトエンを生成するように外来遺伝子が導入された遺伝子組換え大腸菌を利用してもよい。本発明のフィトエンは、上記したいずれか１種の方法により得たものを使用してもよいし、２種以上の方法により得たものを使用してもよい。

植物や微生物からのフィトエンの抽出方法及び抽出条件は特段限定されず、例えば、水抽出、熱水抽出、温水抽出、アルコール抽出、超臨界抽出等の公知の抽出方法を用いることができる。
溶媒抽出を行う場合、溶媒としては例えば水；メタノール、無水エタノール、エタノール等の低級アルコールや、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の多価
アルコール等のアルコール類（無水、含水の別を問わない）；アセトン等のケトン類、ジエチルエーテル、ジオキサン、アセトニトリル、酢酸エチルエステル等のエステル類、キシレン、ベンゼン、クロロホルム等が挙げられ、好ましくは水、エタノール等である。これらの溶媒は、いずれか１種のみを用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。

また、トマトから抽出する場合であれば、特開２００８−１３５４１号公報に記載の方法などに従ってもよい。デュナリエラのような藻類から抽出する場合であれば、特開２００３−１８０３８７号公報、海水由来の非光合成細菌Ａｌｇｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ．（ア
ルギバクター・エスピー）から抽出する場合であれば、特開２００８−５４１６９７号公報に記載の方法などに従ってもよい。また、変異体Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（パラコッカス・エスピー）ＦＡ１又はＦＡ３を用いて発酵により生産する場合には、ＷＯ２００９−１１５６２９号パンフレットに記載の方法などに従ってもよい。さらに、フィトエンを生成するように外来遺伝子が導入された遺伝子組換え大腸菌に生産させて回収する場合には、J.Agric. Food Chem., 59(18), 9996-10005 (2011)や、Appl. Microbiol. Botechnol., 81(5), 915-925 (2009)に記載の方法などに従ってもよい。

得られた抽出物をそのままの状態で使用することもできるが、乾燥させた粉末状のものを用いてもよい。また、必要に応じて得られた抽出物に精製、濃縮処理等を施してもよい。精製処理としては、濾過又はイオン交換樹脂や活性炭カラム等を用いた吸着、脱色といった処理を行うことができる。また、濃縮処理としては、エバポレーター等の常法を利用できる。

また、得られた抽出物（又は精製処理物若しくは濃縮物）を凍結乾燥処理に供して粉末化する方法、デキストリン、コーンスターチ、アラビアゴム等の賦形剤を添加してスプレードライ処理により粉末化する方法等、公知の方法に従って粉末化してもよい。さらにその後に、必要に応じて純水、エタノール等に溶解して用いてもよい。

＜２．フィトフルエン＞
本発明に係る抗糖化剤はフィトエン及び／又はフィトフルエンを含有する。フィトフルエンは、その構造が次の化学式で表される既知の物質である。

上記フィトフルエンを得る方法は特段限定されず、上記したフィトエンの場合と同様である。また、抽出方法及び抽出条件、得られた抽出物のその後の処理についても、上記したフィトエンの場合と同様である。

＜３．抗糖化剤＞
本発明は、上述したフィトエン及び／又はフィトフルエンを含有する抗糖化剤である。該抗糖化剤は、ＡＧＥｓの生成に至るまでに、３−デオキシグルコソン（３ＤＧ）、グリオキサール（ＧＯ）、グリコアルブミン（ＧＡ）、メチルグリオキサール（ＭＧ）、カルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）、カルボキシメチルアルギニン（ＣＭＡ）、ペントシジン、ピラリン等の中間体が生成するので、それらの中間体を抑制したり、ＡＧＥｓへの結合またはＡＧＥｓの生成を阻害することにより、体内でのＡＧＥｓの蓄積を抑制することができる。
このことから、本発明に係る抗糖化剤は、化粧料や医薬品、食品に用いられ、特に化粧料に好ましく用いられる。

本発明に係る抗糖化剤は、フィトエン及び／又はフィトフルエンを単独で使用することもできるが、上記成分以外に公知の賦形剤、香料、着色料、乳化剤、安定化剤、増粘剤、酵素、防腐剤、滑沢剤、界面活性剤、崩壊剤、崩壊抑制剤、結合剤、吸収促進剤、吸着剤、保湿剤、可溶化剤、保存剤、風味剤、甘味剤等を、本発明の効果を損なわない範囲で必要に応じて配合することができる。

抗糖化剤全量に対する上記フィトエン及び／又はフィトフルエンの含有量は、本発明の所望の効果が奏される限り特に限定されないが、総量で、通常０．０００１〜１０質量％であり、好ましくは０．０００５〜３質量％であり、より好ましくは０．００１〜１質量％である。

＜４．化粧料＞
本発明に係る抗糖化剤を化粧料の素材として用いる場合、該抗糖化剤を水溶液、ローション、スプレー液、懸濁液および乳化液などの液状；粉末、顆粒およびブロック状などの固体状；クリームおよびペーストなどの半固体状；ゲル状等の各種所望の剤形の化粧料に調製することができる。このような化粧料は、洗顔料、乳液、クリーム、ゲル、エッセンス（美容液）、パック・マスク等の基礎化粧料、ファンデーション、口紅等のメーキャップ化粧料、口腔化粧料、芳香化粧料、毛髪化粧料、ボディ化粧料等の各種化粧料として有用である。本発明により得られるフィトエン及び／又はフィトフルエンを含有する抗糖化剤を含む化粧料は、美白用化粧料、ニキビ改善用化粧料、しわ改善化粧料として使用される。
本発明に係る抗糖化剤を含有する化粧料は、常法に従って製造することができる。また、化粧料への抗糖化剤の配合量、配合方法、配合時期は適宜選択することができる。さらに、必要に応じて、瓶、袋、缶、スプレー缶、噴霧容器、箱、パック等の適宜の容器に封入することができる。
本発明に係る抗糖化剤を化粧料の素材として用いる場合、化粧料全量に対する上記抗糖化剤の含有量は、本発明の所望の効果が奏される限り特に限定されないが、フィトエン及び／又はフィトフルエンとして、総量で、通常０．０００１〜１０質量％であり、好ましくは０．０００５〜３質量％であり、より好ましくは０．００１〜１質量％である。

＜５．医薬品＞
本発明に係る抗糖化剤を医薬品の素材として用いる場合、その剤形は、予防または治療しようとする疾患や医薬品の使用形態、投与経路等に応じて選択することができる。例えば、錠剤、被覆錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、注射剤、坐剤、浸剤、煎剤、チンキ剤等が挙げられる。これらの各種製剤は、常法に従って主薬に対して必要に応じて充填剤、増量剤、賦形剤、結合剤、保湿剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用し得る既知の補助剤を用いて製剤化することができる。また、この医薬製剤中に着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を含有させてもよい。
本発明の抗糖化剤は、乳癌、前立腺癌、骨粗しょう症、心疾患、更年期障害の予防や治療のために使用することができる。

本発明に係る抗糖化剤を医薬品の素材として用いる場合、医薬品全量に対する上記抗糖化剤の含有量は、本発明の所望の効果が奏される限り特に限定されないが、フィトエン及び／又はフィトフルエンとして、総量で、通常０．０００５〜２０質量％であり、好ましくは０．００１〜５質量％であり、より好ましくは０．００３〜１質量％である。

＜６．食品＞
本発明に係る抗糖化剤を食品の素材として用いる場合、一般の食品の他、特定保健用食品、栄養補助食品、機能性食品、病者用食品、食品添加物等として使用できる。食品の形態としては、本発明に係る抗糖化剤を含む清涼飲料、ミルク、プリン、ゼリー、飴、ガム、グミ、ヨーグルト、チョコレート、スープ、クッキー、スナック菓子、アイスクリーム、アイスキャンデー、パン、ケーキ、シュークリーム、ハム、ミートソース、カレー、シチュー、チーズ、バター、ドレッシング等を例示することができる。

本発明に係る抗糖化剤は、水、タンパク質、糖質、脂質、ビタミン類、ミネラル類、有機酸、有機塩基、果汁、フレーバー類等を主成分として使用することができる。タンパク質としては、例えば、全脂粉乳、脱脂粉乳、部分脱脂粉乳、カゼイン、大豆タンパク質、鶏卵タンパク質、肉タンパク質等の動植物性タンパク質、及びこれらの加水分解物、バターなどが挙げられる。糖質としては、糖類、加工澱粉（デキストリンのほか、可溶性澱粉、ブリティッシュスターチ、酸化澱粉、澱粉エステル、澱粉エーテル等）、食物繊維などが挙げられる。脂質としては、例えば、ラード、サフラワー油、コーン油、ナタネ油、ヤシ油、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の植物性油脂などが挙げられる。ビタミン類としては、例えば、ビタミンＡ、カロチン類、ビタミンＢ群、ビタミンＣ、ビタミンＤ群、ビタミンＥ、ビタミンＫ群、ビタミンＰ、ビタミンＱ、ナイアシン、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン、イノシトール、コリン、葉酸などが挙げられ、ミネラル類としては、例えば、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、銅、鉄、マンガン、亜鉛、セレン、乳清ミネラルなどが挙げられる。有機酸としては、例えば、リンゴ酸、クエン酸、乳酸、酒石酸などが挙げられる。これらの成分は、２種以上を組み合わせて使用してもよく、合成品及び／又はこれらを多く含む食品を用いてもよい。

本発明に係る抗糖化剤を含有する食品は、常法に従って製造することができる。また、食品への抗糖化剤の配合量、配合方法、配合時期は適宜選択することができる。さらに、必要に応じて、瓶、袋、缶、箱、パック等の適宜の容器に封入することができる。
本発明に係る抗糖化剤を食品の素材として用いる場合、食品全量に対する上記抗糖化剤の含有量は、本発明の所望の効果が奏される限り特に限定されないが、フィトエン及び／又はフィトフルエンとして、総量で、通常０．００００５〜２質量％であり、好ましくは０．０００１〜１質量％であり、より好ましくは０．００１〜０．３質量％である。

以下、具体的な実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

〔フィトエン濃度算出方法〕
下記「１．フィトエンの製造」および「２．ＡＧＥｓ生成抑制能の測定」において、分離精製した各サンプルにおけるフィトエンの定量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて以下の条件で行った。所定条件下、フィトエンの異性体は４３分及び４６分に保持時間を有する。

（分析条件）
分析カラム： Ｎｏｖａ−Ｐａｋ Ｃ１８、３．９×３００ｍｍ （Ｗａｔｅｒｓ）
検出波長： ２８６ｎｍ、３５０ｎｍ、４００ｎｍ、４５０ｎｍ
移動相： アセトニトリル／メタノール／イソプロパノール ＝ ９０／６／４
カラム温度：３０℃
流速： １ｍＬ／ｍｉｎ

標準液のフィトエン濃度は、フィトエンの検出波長２８６ｎｍにおけるｎ−ヘキサン溶液でのε（分子吸光係数）（ｍＭ^−１ｃｍ^−１）＝５０、標準液の２８６ｎｍにおける吸
光度（Ａ）、フィトエン分子量＝５４４．９４及び上記分析条件でＨＰＬＣ分析を行ったときのフィトエンピークの面積百分率％（Ｂ）を用いて、下記式（１）により算出した。
（標準液のフィトエン濃度算出式）
標準液のフィトエン濃度（ｍｇ／Ｌ）＝Ａ／（５０×Ｂ×５４４．９４）・・・（１）

サンプルのフィトエン濃度は、以下の方法で算出した。
（サンプルの調製および検出）
測定においては、各工程で得られた溶液状態のサンプル液を直接、又はｎ−ヘキサンで希釈（希釈率Ｘ）した状態で上記分析カラムに２０μＬ注入し、カラム溶離液中のフィトエンの検出を波長２８６ｎｍで行った。

（サンプルのフィトエン濃度算出式）
測定サンプルのフィトエン濃度（ｍｇ／Ｌ）＝（サンプル中のフィトエンピークの面積百分率（％）×希釈率（Ｘ）×標準液のフィトエン濃度（ｍｇ／Ｌ））／標準液中のフィトエンピークの面積百分率（％）・・・（２）

＜１．フィトエンの製造＞
［工程１：抽出工程］
トマトパウダー（カゴメ株式会社製）中のフィトエン濃度を分析した結果、０．１１％（乾重あたりの濃度）であった。このトマトパウダー２０ｇ（乾重）に、水６０ｇ、エタノール１５８ｇ、２５％ＮａＯＨ水溶液１０ｇを加え、窒素雰囲気下、室温（２０〜３０℃）にて３０分間攪拌しながら油脂類のケン化処理及びカロテノイドの抽出を行った。その後、ｎ−ヘキサン１３２ｇを加え、窒素雰囲気下、室温（２０〜３０℃）にて３０分間攪拌しながらフィトエンを含む低極性カロテノイドの抽出を行った。この抽出液を分液ロートへ移液し、静置によって分液後、下層を除き、フィトエン約１８ｍｇを含有する赤褐色のｎ−ヘキサン抽出液１０２ｇ（１１６ｍｇ／Ｌ）を得た。

［工程２：抽出液濃縮、カラムチャージ液調製工程］
工程１で得られた抽出液をロータリー・エバポレーターにて４０℃以下で濃縮乾固した。その後、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝９９／１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の溶離液６ｍＬで再溶解し、フィトエン含有カラムチャージ液を得た。

［工程３：シリカゲルカラム分取工程］
工程２で得られたフィトエン含有チャージ液を、ワコーシルＣ３００を充填したシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供して分取を実施し、フィトエン含有フラクションを回収した。溶媒はｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝９９／１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を用いて溶出し、５ｍＬずつフラクションカットして各フラクション液を得た。分取の結果、得られたフラクション溶出液をＨＰＬＣ分析し１５．６ｍｇのフィトエンを含む黄色の溶液を得た。

［工程４：活性炭処理脱色工程］
工程３で得られた黄色のフィトエン含有フラクション１３．２ｍＬに、８０ｍｇの活性炭（強力シラサギ）を加え、窒素雰囲気下、室温（２０〜３０℃）にて１５分間攪拌を実施した。その後、活性炭を除去し、ロータリー・エバポレーターにて４０℃以下で濃縮乾固し、１１．４ｍｇの無色カロテノイドであるフィトエンを取得した。

＜２．ＡＧＥｓ生成抑制能の測定＞
［試験例１］
４０ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）水溶液０．２ｍＬ、２Ｍのグルコース水溶液０．１ｍＬ、１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．５ｍＬおよび蒸留水０
．１ｍＬを混合した。この混合液に、フィトエンが終濃度で５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬとなるように添加し、６０℃で４０時間インキュベーションした。その後、この反応液の糖化反応生成物量を、蛍光強度として、励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４４０ｎｍで測定した。

［比較試験例１−１］
上記グルコースを含まない混合液を用いたこと以外は試験例１と同様にしたものを比較試験例１−１とした。
［比較試験例１−２］
上記フィトエンの代わりに蒸留水を添加したものを用いたこと以外は、試験例１と同様にしたものを比較試験例１−２とした。
［比較試験例１−３］
また、上記グルコースを含まない混合液を用いたこと以外は比較試験例１−２と同様にしたものを比較試験例１−３とした。
糖化反応阻害率は下記式（３）により算出した。

糖化反応阻害率（％）＝｛１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）｝×１００ ・・・（３）
Ａ：試験例１の糖化反応生成物量
Ｂ：比較試験例１−１の糖化反応生成物量
Ｃ：比較試験例１−２の糖化反応生成物量
Ｄ：比較試験例１−３の糖化反応生成物量

反応液におけるフィトエン濃度と糖化反応阻害率との関係を表すグラフを図１に示す。図１に示すように、試験例１のフィトエンは、５〜３０μｇ／ｍＬの濃度で糖化反応生成物の生成を抑制することが確認された。

＜３．官能試験＞
（１）化粧クリームの官能試験
［実施例１、比較例１］
表１に記載の処方に基づいて調製したクリームを用いて官能試験を実施した。

パネラーは、小じわや皮膚のハリが気になると自覚する４０代の女性パネラー１５名で
、１日２回朝夕洗顔後、右目尻周辺には実施例１のクリームを、また左目尻周辺には比較例１のクリームを３週間使用した。その後、触診で両目尻の皮膚表面の「滑らかさ」や「ハリのよさ」を比較した。その結果を表２に示す。

表２の結果より、フィトエン含有トマト抽出物を含む実施例１のクリームを使用することで、目尻の皮膚表面の「滑らかさ」および「ハリのよさ」が改善されることが分かった。

（２）化粧ローションの官能試験
［実施例２、比較例２］
表３に記載の処方に基づいて調製した化粧ローションを用いて官能試験を実施した。

パネラーは、小じわや皮膚のハリが気になると自覚する４０代の女性パネラー１５名で、１日２回朝夕洗顔後、顔右半分には実施例２のローションのみを適量使用、また、顔左半分には比較例２のローションのみを同量使用した。１か月経過後、触診で左右のほほ皮膚表面の「滑らかさ」および「ハリのよさ」を比較した。その結果を表４に示す。

表４の結果より、フィトエン含有トマト抽出物を含む実施例２のローションを使用することで、ほほの皮膚表面の「滑らかさ」や「ハリのよさ」が改善されることが分かった。

＜４．配合例＞
錠剤、飲料（清涼飲料）、食品（キャンデー）の配合例を、それぞれ表５〜７に記載した。

本発明は、化粧料や医薬、食品等の製剤技術に適用できる。

Claims (1)

1. フィトエン及び／又はフィトフルエンを含有する抗糖化剤。
   

Images