WO2011019082A1 - オートファジーの測定方法 - Google Patents

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宮脇敦史
片山博幸
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独立行政法人科学技術振興機構
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    • G01N21/80—Indicating pH value

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring autophagy.
  • the present invention also relates to a method for screening a therapeutic agent for autophagy abnormality-related diseases using the measurement method.
  • Autophagy is a degradation pathway for cytoplasmic components commonly found in eukaryotic cells. Autophagy is classified into three types: macroautophagy, microautophagy, and chaperone-mediated autophagy, but the cytoplasmic components in all pathways are ultimately lysosomes (vacuum in yeast and plants). It is taken in and decomposed by the decomposing enzyme present there. Cytoplasmic components that undergo degradation include not only proteins and other molecules, but also organelles such as mitochondria and endoplasmic reticulum.
  • autophagy is a method of observing cells with an electron microscope, degrading proteins labeled with radioisotopes, and measuring the activity of enzymes that are specifically activated by autophagy.
  • GFP fluorescent protein represented by GFP
  • a method of labeling a protein involved in autophagy with a fluorescent protein and measuring its dynamics by fluorescence methods such as microscopic imaging and flow cytometry has been generalized. I came.
  • autophagy can be easily measured in living cells.
  • macro autophagy a part of the cytoplasm is first surrounded by a membrane called an isolation membrane, and vesicles called autophagosomes having a diameter of about 1 ⁇ m are formed. Thereafter, autophagosomes fuse with lysosomes, and the incorporated cytoplasmic components are degraded.
  • proteins involved in autophagy that have been found so far, those involved in the formation of autophagosomes, such as LC3, are known to be localized in the membrane.
  • autophagy is measured by fusing such proteins with fluorescent proteins and expressing them in cells, monitoring their accumulation in vesicular structures and the decrease in fluorescence intensity due to degradation in lysosomes.
  • autophagosome formation is a phenomenon observed only in macroautophagy, this method cannot detect microautophagy or chaperone-mediated autophagy.
  • the cytoplasmic pH is neutral around 7, whereas the pH in lysosomes and vacuoles where the cytoplasmic components are degraded by autophagy is acidic around 4 and the degrading enzyme
  • the cytoplasmic components are ultimately taken up by lysosomes and vacuoles, so this method can measure the total amount of autophagy.
  • Rosado et al. Rosado et al. (Rosado, CJ et al., Autophagy, Vol. 4, p.
  • a probe reagent is used in which a fluorescent protein (DsRed.T3) that emits light and a fluorescent protein (super eclectic pHluorin) that decreases in fluorescence intensity as the pH approaches acid are linked via a peptide serving as a linker.
  • DsRed. T3 is a fluorescent protein that emits red (587 nm), and super eclectic pHluorin is green (508 nm).
  • the autophagy activity is measured by expressing the probe in the cytoplasm and measuring the change in pH when taken into the lysosome together with other cytoplasmic components as the change in the ratio of the fluorescence intensity of the two colors.
  • autophagy is a degradation system of cytoplasmic components such as proteins and organelles, exhibited by cells.
  • autophagy is resistant to degradation activity by utilizing the reaction that the cytoplasm component is taken into the acidic lysosome and vacuole from the cytoplasm where the pH is neutral.
  • the present inventors have found a novel method for measuring intracellular autophagy, characterized by using a single fluorescent protein that changes its spectrum in response to changes in the number of probes as a probe reagent.
  • the present invention is summarized as follows.
  • a method for screening a therapeutic agent for a disease caused by autophagy abnormality wherein cells associated with the disease are resistant to lysosomal or vacuolar degrading enzyme activity, and pH is acidic to neutral.
  • a probe reagent comprising a single fluorescent protein that does not denature or inactivate in an environment and can change the excitation spectrum or fluorescence spectrum when placed in an acidic and neutral environment, and a candidate
  • the autophagy activity of the cell is measured using the method according to any one of (1) to (8) above and the activity is increased compared to the control, the candidate drug is treated
  • the method comprising determining to have an effect.
  • a conventional fluorescent protein is used in combination by using a single fluorescent protein as a probe reagent, which has strong resistance to degradation, and changes the fluorescence intensity in acid and neutral in opposite directions. Compared to when the autophagy was detected, the activity of autophagy was captured as a change in the ratio of the greater fluorescence intensity. Thereby, a slight difference in the amount of activity can be identified more clearly. In addition, since measurement problems caused by differences in characteristics such as folding speed and quenching speed of the two fluorescent proteins are eliminated, more quantitative autophagy measurement can be performed.
  • FIG. 1 shows the change of the excitation spectrum of mKeima with pH.
  • FIG. 1A shows the excitation spectrum, fluorescence spectrum, and pH dependence of mKeima (monomer fluorescent protein derived from common coral (Montipola sp.)).
  • FIG. 1B shows the pH dependent change of the excitation peak ratio (586 nm / 440 nm) of mKeima.
  • FIG. 1C shows excerpts of the excitation peaks at pH 7.0 (cytoplasmic pH) and 4.0 (pH of lysosome) from FIG. 1A, and changes in pH-dependent excitation peaks are observed.
  • FIG. 2 shows an example of autophagy detection in MEF cells.
  • FIG. 2A, B, and C show fluorescence images 24 hours after transfection of mKeima into MEF cells. Specifically, a fluorescence image (A) excited by a 438/24 filter, a fluorescence image (B) excited by a 550DF30 filter, and a ratio image (C) of B / A are shown. From the figure, a signal from mKeima transferred to acidic lysosomes by autophagy is observed.
  • FIG. 2D shows the ratio value (550 nm / 438 nm) of mKeima signal from cytoplasm or lysosome.
  • FIG. 3 shows an example of mitophagy detection in MEF cells.
  • FIG. 3A, B, and C MEF cells expressing 2 ⁇ COX8mKeima were treated with 2 mM FCCP + 1 mg / ml Oligomycin to induce mitophagy. Specifically, a fluorescent image (A) excited by a 438/24 filter, a fluorescent image (B) excited by a 550DF30 filter, and a ratio image (C) of B / A are shown.
  • FIG. 3D shows the ratio value (550 nm / 438 nm) of mKeima signal from mitochondria or lysosomes.
  • the present invention is described in further detail below.
  • the present invention is a method for measuring intracellular autophagy, which is resistant to degradative enzyme activity in lysosomes or vacuoles, does not denature or inactivate in an acidic to neutral environment, and Dependent on pH changes associated with autophagy, using a single fluorescent protein as a probe reagent that can change the excitation spectrum or fluorescence spectrum when placed in acidic and neutral environments
  • a method is provided that includes measuring a change in the fluorescent properties of a fluorescent probe reagent, thereby measuring the presence or activity of autophagy.
  • autophagy As described in the Background Art section, autophagy (also referred to as “autophagy”) is a mechanism in which cells degrade cytoplasmic components such as their own proteins and organelles (for example, mitochondria and endoplasmic reticulum). There are three types according to its mechanism: macro autophagy, micro autophagy, and chaperone-mediated autophagy. The method of the present invention makes it possible to accurately measure the total amount of these autophagic activities that occur in cells.
  • autophagy activity refers to the intracellular clearance (purification) ability. When autophagy activity is higher, it can be said that clearance is functioning in living cells. Moreover, when autophagy is functioning normally, it is thought that the homeostasis of a cell is maintained.
  • cytoplasmic components such as proteins and organelles and phospholipids accumulate in the cytoplasm.
  • Phagosomes are formed, and in the case of animal cells, autophagosomes and intracellular lysosomes undergo membrane fusion to form autolysosomes, while in the case of yeast and plant cells, autophagosomes and vacuoles are membrane-fused, As a result, in the lysosome or vacuole, the degradation pathway is such that cytoplasmic components are degraded by the proteolytic enzymes present there.
  • Microautophagy is such a degradation pathway in which cytoplasmic components such as overproduced proteins and abnormal proteins are taken directly into lysosomes and vacuoles and do not go through membrane fusion.
  • Chaperone-mediated autophagy is a degradation pathway in which the chaperone binds to cytoplasmic components such as overproduced proteins and abnormal proteins, and the cytoplasmic components are taken into lysosomes and vacuoles and decomposed inside. is there.
  • Recent studies have revealed that autophagy is involved in a variety of life phenomena such as protein and organelle quality control, bacterial infection, antigen presentation, cell death, canceration, and embryogenesis. It is said to be involved in the degradation and removal of abnormal proteins that accumulate and aggregate in the body.
  • the method of the present invention is characterized in that a single fluorescent protein is used as a probe reagent.
  • This fluorescent protein is (i) resistant to degradative enzyme activity in lysosomes or vacuoles, (ii) not denatured or deactivated in an acidic to neutral environment, and (iii) acidic region
  • the excitation spectrum or fluorescence spectrum can be changed when placed in a neutral environment.
  • the characteristic (i) is that the method of the present invention is to measure autophagy, and therefore, if the probe reagent used for the measurement is degraded in lysosomes or vacuoles, accurate measurement will be hindered. Resistant to degradation enzyme activity.
  • the above characteristic (ii) is that the cell has a neutral pH in the cytoplasm, whereas the lysosome or vacuole has an acidic pH, and the probe reagent used in the present invention has a neutral pH. In order to be placed in the intracellular environment of the acidic region, it must not be denatured or inactivated under such circumstances.
  • the characteristic (iii) is such a characteristic that when the probe reagent is placed in an acidic range and a neutral range, it has a spectrum that changes the fluorescence intensity in the opposite direction between the acidic range and the neutral range. is there.
  • FIG. 1A there is an iso-absorption point or iso-fluorescence point where the fluorescence intensity is almost constant at about 500 nm without depending on the pH change, and the fluorescence depends on the pH change before and after the wavelength. It can be seen that the intensity changes in the opposite direction (FIG. 1C).
  • the fluorescence intensity can be measured by a ratiometric (ratio measurement) method by measuring the fluorescence intensity at an appropriate two wavelengths between the isoabsorption point or the isofluorescence point. Since the fluorescence intensities of the two wavelengths change in opposite directions, a large change in the ratio (ratio) can be obtained.
  • ratiometric ratio measurement
  • the fluorescent protein having the above-mentioned properties is not limited to the following, but, for example, a fluorescent protein (Keima) derived from common coral (Monipora sp.), For example, its monomer Keima (mKeima) or dimer Keima (dKeima), Variants thereof, such as dKeima-Red, having fluorescent properties equivalent to them TM (Amalgaam, MBL, etc .; Kogure, T. et al., (2006) Nat. Biotechnol. 24: 577-581).
  • the “equivalent fluorescence property” particularly refers to the property (iii) above, but the mutant that can be used in the present invention should also have the properties (i) and (ii) above. is there.
  • the excitation spectrum of mKeima has an excitation peak of 586 nm at pH 4.0 and 440 nm at 7.0, and has an isosbestic point at about 500 nm.
  • the fluorescence intensity changes in the opposite direction depending on the pH.
  • the fluorescence wavelength has a peak at 620 nm, which is almost constant between pH 4-10.
  • the maximum excitation wavelength is 440 nm
  • the maximum fluorescence wavelength is 616 nm
  • its isosbestic point exists in the vicinity of about 550 nm.
  • substitutions are conservative amino acid substitutions or non-conservative amino acid substitutions, which are each between or different from the same amino acid of any chemical or physical property such as electrical, structural, hydrophobic / polar, etc. Substitution between amino acids.
  • hydrophobic amino acids include Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro
  • polar amino acids include Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr Cys
  • acidic amino acids include Asp, Glu.
  • the basic amino acids include Arg, Lys, and His
  • the aromatic amino acids include Phe, Tyr, Trp, and His. Replacement can be combined with PCR methods (Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press. Mark, D. F .; Mark. , Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the fluorescent protein used in the present invention should have the above characteristics (i), (ii) and (iii), and can be implemented from various new and known fluorescent proteins.
  • the fluorescent protein used in the present invention may be any of a purified protein from nature, a recombinant protein, and a chemically synthesized (peptide synthesized) protein, but the recombinant protein is used in that it can be produced in a relatively large amount. preferable.
  • Recombinant proteins can be produced using conventional genetic recombination techniques (Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Cold Spring Harbor Laboratory, Prostosold Press, Protosold Press, Protosold Press, AuShort Press in Molecular Biology, 3rd edition, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, et al.).
  • DNA encoding a fluorescent protein is cloned from a biological cell that expresses the protein. That is, when the primary structure of the DNA is known, a primer based on the partial sequence is synthesized, and the target DNA is obtained by performing a polymerase chain reaction (PCR) using the cDNA library of the cell as a template. It can be amplified and cloned by incorporating it into an appropriate vector (eg, plasmid, phage, cosmid, etc.).
  • PCR polymerase chain reaction
  • Fluorescent proteins are gene recombination technology using prokaryotic cells such as Escherichia (such as E.
  • E. coli plasmids include plasmids such as pBlue series such as pBluescript series, pUC series such as pUC18 and pUC19, pBR series such as pBR322, pQE series such as pQE-30 and pQE-60, and pMAL series such as pMAL-C2 and pMAL-p2. It can be used without limitation.
  • the vector can appropriately include a primer, a replication origin, an SD (Shine-Dalgarno) sequence, a stop codon, a terminator, a poly A sequence, a multiple cloning site, and the like.
  • the multi-cloning site includes a plurality of restriction enzyme recognition sites, which is convenient when inserting the target DNA.
  • a selection marker such as a drug resistance gene (for example, an ampicillin resistance gene, a kanamycin resistance gene, etc.) can be included.
  • a His tag e.g., (His)
  • promoters include, but are not limited to, lac promoter, trp promoter, ⁇ P L Promoter, ⁇ P R Promoters, tac promoters, glycolytic enzyme promoters and the like are included.
  • Introduction of the vector into the cells can be performed by techniques such as calcium phosphate method, lipofection method, electroporation method and the like.
  • Recombinant protein expressed by culturing cells can be obtained from intracellular or extracellular fluid (when using signal peptides), for example, cell wall disruption, ammonium sulfate, ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, hydrophobic interaction It can be recovered and purified by methods such as chromatography, affinity chromatography, and HPLC.
  • the above-described fluorescent protein or a vector containing DNA encoding the same is used to measure cell autophagy (its activity or presence).
  • the cells used here are in particular eukaryotic cells (fungal cells such as yeast, filamentous fungi, basidiomycetes, etc., plant cells, insect cells, animal cells such as mammalian cells, etc.).
  • a suitable vector plasmid, phage, cosmid, virus, etc.
  • vectors suitable for yeast include pG-1, YEp13, YCp50, pGBT9, pGAD424, pACT2 (Clontech) and the like.
  • vectors suitable for plant cells include pBI vectors and T-DNA vectors.
  • vectors suitable for animal cells include pRc / RSV, pEF6 / Myc-His, pRc / CMV (Invitrogen et al.), Bovine papillomavirus plasmid pBPV (Amersham Pharmacia Biotech), EB virus plasmid pCEP4 (Invitrogen), baculovirus Insect viruses, etc. are mentioned.
  • the vector can appropriately include a primer, an enhancer, a replication origin, a ribosome binding sequence, a stop codon, a terminator, a poly A sequence, a multicloning site, and the like.
  • a selectable marker can be included.
  • a His tag e.g., (His)
  • (His) 10 May be bound to the 5 ′ end or 3 ′ end of the DNA encoding the target fluorescent protein and expressed as a fusion protein.
  • promoters include, but are not limited to, ADH1 promoter, ubiquitin promoter, cauliflower mosaic virus promoter, Rous sarcoma virus (RSV) promoter, cytomegalovirus (CMV) promoter, simian virus (SV40) early or late promoter, mouse papillae Tumor virus (MMTV) promoter and the like.
  • Vector introduction ie, transformation or transfection
  • Vector introduction into the cells is carried out by calcium phosphate method, DEAE dextran method, lipofection method, electroporation method, microinjection method, liposome method, Agrobacterium method, gene gun, virus infection Method, spheroplast method, protoplast method, and the like.
  • the fluorescent protein when the fluorescent protein is directly introduced into cells, it can be introduced into cells by binding to a membrane-permeable peptide or encapsulating in liposomes.
  • the fluorescent protein used in the present invention may be a single protein or a conjugate with an endogenous protein, polypeptide or peptide, or other functional protein, polypeptide or peptide involved in autophagy. It can be introduced into a cell in the form of a gate (ie, a conjugate or a fusion).
  • the endogenous protein, polypeptide or peptide includes all those involved in autophagy such as disease, nutrient starvation, bacterial infection, immune response and antigen presentation, cell death, and canceration.
  • diseases include, but are not limited to, neurodegenerative diseases such as Huntington's disease, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, cancer, heart failure, diabetes, etc.
  • Endogenous proteins are proteins involved in the causes of these diseases (ie , A disease-related protein). Examples of such disease-related proteins include amyloid precursor protein, polyglutamine, alpha-synuclein, parkin and the like.
  • the other functional protein, polypeptide or peptide described above includes, for example, a transition signal sequence (for example, a mitochondrial transition signal peptide, chloroplasts) capable of selectively transferring the protein to a specific organelle such as mitochondria or endoplasmic reticulum.
  • Body translocation signal peptides, etc. Body translocation signal peptides, etc.
  • membrane-permeable peptides that allow introduction of proteins into cells eg, polyarginine, tat peptides, etc.
  • antibodies that can specifically bind to the above endogenous proteins monoclonal antibodies, single antibodies, etc.
  • Chain antibodies, synthetic antibodies, etc. or fragments thereof.
  • the amino acids and base sequences of the above proteins, polypeptides or peptides can be obtained from literature and DNA databases such as DDBJ / EMBL / GenBank (NCBI (USA), etc.).
  • the conjugate may bind between protein-protein, protein-polypeptide or protein-peptide via a linker as necessary.
  • the linker is a peptide consisting of about 2 to 50 amino acid residues, and any linker can be used as long as it does not impair cell functions and does not affect the properties and three-dimensional structure of the fluorescent protein and the endogenous protein. Peptides can also be used. DNA encoding the conjugate is synthesized, inserted into the vector, introduced into a cell, and expressed in the cell. The technique for this is as described above. ⁇ Measurement of autophagy> In the method of the present invention, as described above, intracellular autophagy activity is measured by measuring changes in the spectral characteristics of a single fluorescent protein probe reagent depending on changes in pH.
  • the fluorescent protein can be used alone in the cell or in the form of a conjugate.
  • the fluorescent protein Since autophagy occurs at an unspecified location in the cytoplasm, the fluorescent protein is expressed as it is in the cytoplasm, and the total amount of autophagy is measured from the change in fluorescence when it is transported to the lysosome.
  • the target endogenous protein such as a protein involved in the disease
  • the fluorescence is produced by fusing the protein and the fluorescent protein. taking measurement.
  • the cell particularly includes all eukaryotic cells. That is, the cells include, but are not limited to, fungal cells such as yeast, plant cells, animal cells (eg, invertebrate cells, vertebrate cells, warm-blooded animal cells, mammalian cells, human cells, etc.). Is included.
  • the fluorescent probe reagent is resistant to degradative enzyme activity in lysosomes and vacuoles, and is denatured and deactivated in an environment of at least pH 4 to 8 in which the pH is acidic to neutral.
  • the fluorescent probe reagent uses a single fluorescent protein that significantly changes the excitation or fluorescence spectrum when placed in a neutral environment.
  • the spectrum has an iso-absorption point or iso-fluorescence point where the fluorescence intensity is almost constant without depending on the change in pH, and changes the fluorescence intensity in the reverse direction depending on the change in pH before and after the wavelength.
  • the fluorescence measurement by the ratiometric (ratio measurement) method can be performed by measuring the fluorescence intensity at two appropriate wavelengths sandwiching the isosbestic or isofluorescent points. Since the fluorescence intensities of the two wavelengths change in opposite directions, a large change in the ratio (ratio) of the fluorescence intensity can be obtained.
  • ratiometric method changes in fluorescence intensity that do not depend on pH, such as differences in the distribution of probe reagents in cells, uneven illumination of excitation light, and fading of fluorescence, can be canceled. Measurement is possible. Moreover, since it measures with a single fluorescent protein, there is no problem which arises when using two fluorescent proteins as mentioned above.
  • the transfer of the probe reagent to lysosomes or vacuoles, that is, autophagy activity can be measured clearly and accurately.
  • the total amount of autophagy activity occurring within an arbitrary time can be measured by using a fluorescent protein having strong resistance to degrading enzymes.
  • the probe reagent can be used to measure intracellular autophagy by introducing the gene, DNA or RNA encoding the amino acid sequence into the cell to express it in the cell, or by directly introducing the probe reagent into the cell. Can do.
  • the introduction of the probe reagent or the gene, DNA or RNA encoding the same into the cell includes the calcium phosphate method, the DEAE dextran method, the lipofection method, the electroporation method, the microinjection method, the liposome method, and the membrane-permeable peptide. And the like, the Agrobacterium method, the virus infection method, the spheroplast method, and the protoplast method can be used.
  • the gene or DNA may be retained in the cells, and cells that stably express the probe reagent may be produced and used for measurement.
  • the fluorescent probe reagent may be fused with a certain protein and expressed in cells. Further, it may be expressed by adding a transition signal sequence for selective localization to a certain organelle. By these operations, it becomes possible to measure autophagy of specific proteins and organelles.
  • the fluorescent protein as a probe reagent changes the excitation spectrum greatly according to the change in pH. When the change in the fluorescence spectrum is small, the fluorescence intensity is measured at two different excitation wavelengths and the ratio ( 2 wavelength excitation 1 wavelength fluorescence measurement which calculates
  • the fluorescence spectrum is greatly changed according to the change in pH, but when the change in the excitation spectrum is small, the fluorescence intensity is measured at two different fluorescence wavelengths and the ratio is obtained. Measurements can be made.
  • the measurement of autophagy can be performed based on the method specifically described in Example 1. For example, cells are seeded in culture dishes and cultured overnight in conventional culture media for yeast, plant cells or animal cells. A fluorescent protein or a conjugate (probe reagent), or a vector containing DNA encoding them, is introduced into a cell by the above-described method. After culturing for about 6 hours, the medium is replaced with a new medium, and further cultured for 24 hours, and analyzed by a fluorescence microscope imaging system.
  • autophagy is measured as the presence or amount of probe reagent that has migrated into lysosomes or vacuoles within the cell.
  • a microscope imaging system in which a detector such as a cooled CCD camera is connected to a fluorescence microscope can be used. If the analyzer has a function of time-lapse imaging, autophagy that occurs in the cell can be visualized in real time.
  • a wavelength switching device is combined with a light source for excitation of a microscope so that two arbitrary wavelengths can be selected.
  • a filter switching device or a monochromator can be used as the wavelength switching device.
  • a filter switching device and a two-wavelength spectrometer for imaging are connected in front of the detector.
  • a microscope imaging device a laser scanning confocal microscope, a multiphoton excitation microscope, or the like can be used.
  • measurement can be performed with a fluorescence measuring apparatus such as a general fluorescence spectrophotometer or flow cytometry.
  • the present invention further relates to a method for screening a therapeutic agent for a disease caused by autophagy abnormality, wherein a cell associated with the disease is resistant to lysosomal or vacuolar degrading enzyme activity, and pH is acidic.
  • a probe reagent comprising a single fluorescent protein that does not denature or inactivate in a neutral environment and can change the excitation or fluorescence spectrum when placed in an acidic and neutral environment;
  • the candidate drug is introduced, and the autophagy activity of the cell is measured using the above-described method for measuring autophagy activity. When the activity is increased compared to the control, the candidate drug has a therapeutic effect.
  • the screening method of the present invention prepares a cell (including a cell line) associated with a disease caused by autophagy abnormality, and a probe reagent containing the above fluorescent protein (for example, a probe reagent fused with a disease-causing protein)
  • a probe reagent containing the above fluorescent protein for example, a probe reagent fused with a disease-causing protein
  • a probe reagent in which an antibody or antibody fragment having a binding affinity with a disease-causing protein and a candidate drug are introduced into the cell, and autophagy activity is measured by the above-described measurement method.
  • the probe reagent may be encoded in a vector, and in this case, it is expressed in a cell to become a proteinaceous probe reagent.
  • the probe reagent can be directly introduced into the cell.
  • autophagy is used for neurodegenerative diseases such as Huntington's disease, Alzheimer's disease, and Parkinson's disease, diseases such as cancer, heart failure, diabetes, nutritional starvation, bacterial infection, immune response and antigen presentation, and (program) cell death. It is known to be involved (Yoshimori, edited by “Autophagy against disease”, Experimental Medicine Vol. 27, No. 18, 2009, Yodosha (Japan)), and these are subject to diseases of the method of the present invention. sell.
  • the method of the present invention can be used to screen therapeutic agents for neurodegenerative diseases and cancer such as Huntington's disease, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, among others.
  • a candidate agent is determined to have a therapeutic effect when autophagy activity is increased compared to a control (ie, activity when using cells that do not contain the candidate agent).
  • Candidate drugs are low molecular weight compounds (or small molecules), high molecular weight compounds, natural compounds, inorganic substances, organic substances, proteins (or polypeptides), peptides, amino acids, carbohydrates (or sugars), oligosaccharides, lipids (phospholipids) ), Nucleic acids (including artificial nucleic acids), oligonucleotides, siRNA, shRNA, miRNA, nucleosides and the like.
  • Example 1 An example in which autophagy was measured using a fluorescent protein (monomer) derived from common coral (Monitorora sp.) As a fluorescent probe reagent and mKeima is shown below. ⁇ Excitation spectrum of mKeima> MKeima was purified by the following procedure, and spectral characteristics depending on pH were examined. Competent cells with pRSET B (Invitrogen) inserted with mKeima cDNA (* Note: cDNA cloning is described in Kogure, T. et al., (2006) Nat. Biotechnol.
  • JM109 JM109 (DE3).
  • mKeima was purified by performing gel filtration with Sephadex TM G-25 (Pharmacia).
  • MKeima purified as described above was diluted with a pH 4-10 buffer to a concentration of 2 ⁇ g / ml.
  • the composition of the buffer is as follows: pH 4.0-5.0 is 50 mM acetate buffer containing 30 mM KCl and 120 mM sodium gluconate, pH 6.0 is Na 2 HPO 4 -NaH 2 PO 4 buffer, pH 7.0-8.0. Is a HEPES buffer, pH 9.0-10.0 is a glycine buffer.
  • the excitation spectrum of mKeima with an excitation wavelength of 350-600 nm and a fluorescence wavelength of 620 nm was measured with a fluorescence spectrophotometer (SPEX Fluorolog-3, Horiba, Japan).
  • the spectrum normalized with the maximum value of the obtained fluorescence intensity as 1 is shown in FIG. From the measured results, the excitation spectrum of mKeima has an excitation peak of 586 nm at pH 4.0 and an excitation wavelength of 440 nm at 7.0, has an isosbestic point at about 500 nm, and depends on the pH before and after this wavelength. It was shown that the fluorescence intensity changed in opposite directions.
  • the fluorescence wavelength had a peak at 620 nm, which was almost constant at a pH of 4-10.
  • the pKa is 6.5, which is located between the pH of the lysosome and the cytoplasm, indicating that this fluorescent protein has characteristics suitable as a probe reagent for measuring autophagy.
  • plasmid pEF6 / Myc-His (Invitrogen) into which the cDNA of mKeima (above) was inserted was transfected into an exemplary Mouse embryonic blast (MEF) cell, and autophagy was detected and visualized.
  • MEF cells were seeded on a 35 mm ⁇ glass bottom dish and cultured overnight in DMEM medium containing 5% fetal calf serum.
  • 1 ⁇ g of plasmid DNA was mixed with 100 ⁇ l of Opti-MEM medium.
  • 1.5 ⁇ l of Lipofectamine TM 2000 (Gibco BRL) was mixed with 100 ⁇ l of Opti-MEM medium.
  • the camera is iXon EM + (Andor Technology)
  • the objective lens is UPlan SApo 60x
  • oil Oil (Olympus, Japan)
  • the excitation filter is 438 nm bandpass, half width 24 nm (Semrock) and 550 nm bandpass, half width 30 nm (Omega) 610 nm long pass (Omega) was used for the filter for fluorescence, and 590 nm (Omega) was used for the dichroic mirror.
  • Image acquisition and analysis were performed with MetaMorph (Universal Imaging Corporation). The results are shown in FIG.
  • pIND ecdysone-inducible vector
  • pVgRXR both Invitrogen
  • EGFP-Parkin pEF6 / Myc-His mitophagy facilitating factor Parkin
  • the system used for imaging is the same as that used for the autophagy detection described above.
  • the results are shown in FIG.
  • the ratio of the fluorescence intensity at 550 nm / 438 nm was determined, a high value was obtained for this mitochondria, indicating that the pH of the region was acidic. This result indicates that mitophagy produced in MEF cells could be detected as a change in fluorescence characteristics accompanying the transport and accumulation of mKeima to lysosomes.
  • neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, and Huntington's disease are caused by abnormal protein accumulation due to insufficient cellular autophagy.
  • the present invention is useful in the fields of medicine and industry, such as elucidation of diseases, development of treatment methods, and search for drugs, for these diseases. All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.

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Abstract

　この発明は、細胞内のオートファジーを測定する方法であって、リソソームまたは液胞内での分解酵素活性に耐性があり、pHが酸性から中性の環境下で変性または失活せず、かつ、酸性域と中性域の環境に置かれたときに励起スペクトルまたは蛍光スペクトルを変化させることができる単一の蛍光蛋白質を蛍光プローブ試薬として使用して、オートファジーに関連したpHの変化に依存したプローブ試薬の蛍光特性の変化を測定し、これによってオートファジーの存在または活性を測定することを含む方法に関する。

Description

オートファジーの測定方法
　本発明は、オートファジーの測定方法に関する。
　本発明はまた、上記測定方法を利用してオートファジー異常関連疾患の治療薬をスクリーニングするための方法に関する。
　オートファジーは、真核細胞に普遍的にみられる細胞質成分の分解経路である。オートファジーはそのメカニズムから、マクロオートファジー、ミクロオートファジー、シャペロン介在性オートファジーの３つに分類されているが、いずれの経路でも細胞質成分は最終的にリソソーム（酵母や植物では液胞）に取り込まれ、そこに存在する分解酵素により分解される。分解を受ける細胞質成分としては、蛋白質などの分子にとどまらず、ミトコンドリアや小胞体などといったオルガネラも含まれる。オートファジーは栄養成分の飢餓によって誘導されるため、細胞質成分の分解物の再利用による細胞への栄養成分の補給がそのおもな役割と考えられてきたが、最近、蛋白質やオルガネラの品質管理、細菌感染、抗原提示、さらには細胞死や癌化など、多様な生命現象に関わることが明らかになってきた。また、細胞内で蓄積、凝集する異常な蛋白質の分解、除去にも関わるため、このような異常蛋白質の蓄積による細胞死によって発症するとされるハンチントン病やアルツハイマー病などの神経変性疾患にも関係することが示唆されている（Ｄｅｒｅｔｉｃ，Ｖ．ａｎｄ　Ｋｌｉｏｎｓｋｙ，Ｄ．Ｊ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ，Ｖｏｌ．２９８，ｐ．７４−８１，２００８）。このような状況で、これらの生命現象のメカニズムの解明や関連する疾患の治療法の開発のために簡便で精度の高いオートファジーの測定法の開発が望まれている。
　従来、オートファジーは電子顕微鏡による細胞の観察や、放射性同位元素で標識された蛋白質の分解、オートファジーが起こることで特異的に活性化するように仕組まれた酵素の活性を測定するなどといった手法で測定されてきたが、いずれもオートファジーに特異的なものではなかったり、操作が煩雑で熟練と時間を要したりしていた。
　最近では、ＧＦＰで代表される蛍光蛋白質の応用技術の発展により、オートファジーに関与する蛋白質を蛍光蛋白質で標識し、その動態を顕微鏡イメージングやフローサイトメトリといった蛍光法で計測する手法が一般化されてきた。このような手法により、オートファジーが生きた細胞で簡便に測定できるようになった。
　マクロオートファジーでは、まず細胞質の一部が隔離膜と呼ばれる膜によって取り囲まれ、直径約１μｍのオートファゴソームと呼ばれる小胞が形成される。その後、オートファゴソームがリソソームと融合することで、取り込まれた細胞質成分が分解される。これまでに見つかっているオートファジーに関与する蛋白質の中には、ＬＣ３のようにオートファゴソームの形成に関わり、その膜に局在するものが知られている。そこでこのような蛋白質を蛍光蛋白質と融合させて細胞に発現させ、その小胞状構造への集積や、リソソームでの分解による蛍光強度の減少をモニタすることで、オートファジーの測定が行われている（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｎ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．３６，ｐ．２４９１−２５０２，２００４およびＳｈｖｅｔｓ，Ｅ．ｅｔ　ａｌ．，Ａｕｔｏｐｈａｇｙ，Ｖｏｌ．４，ｐ．６２１−６２８，２００８）。
　しかし、オートファゴソームの形成はマクロオートファジーにのみ見られる現象のため、この方法ではミクロオートファジーやシャペロン介在性オートファジーの検出は行えない。ミクロオートファジーやシャペロン介在性オートファジーでは、オートファゴソームのような輸送用の小胞形成は行われず、細胞質成分が直接リソソームに取り込まれるとされているが、マクロオートファジーほど研究が進んでおらず、有効な測定法が存在していないのが現状である。したがって、細胞内で起きているすべてのタイプのオートファジーの総量を知ることができない。
　一方で、細胞質のｐＨが７付近の中性であるのに対し、オートファジーで細胞質成分の分解が行われるリソソームや液胞内のｐＨが４付近の酸性であることを利用して、分解酵素に耐性をもつ蛍光プローブ試薬の、リソソームや液胞への移行にともなうｐＨの変化に依存した蛍光特性の変化からオートファジーを検出する方法がある。すべてのタイプのオートファジーで、細胞質成分は最終的にリソソームや液胞に取り込まれるため、この方法ではオートファジーの総量を測定することができる。この方法の例として、Ｒｏｓａｄｏら（Ｒｏｓａｄｏ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，Ａｕｔｏｐｈａｇｙ，Ｖｏｌ．４，ｐ．２０５−２１３，２００８）は、環境のｐＨの変化に依存せず比較的一定の蛍光を発する蛍光蛋白質（ＤｓＲｅｄ．Ｔ３）と、ｐＨが酸性に向かうと蛍光強度が弱くなる蛍光蛋白質（ｓｕｐｅｒ　ｅｃｌｉｐｔｉｃ　ｐＨｌｕｏｒｉｎ）をリンカーとなるペプチドを介して連結させた形のプローブ試薬を使用している。ＤｓＲｅｄ．Ｔ３は赤色（５８７ｎｍ）の、ｓｕｐｅｒ　ｅｃｌｉｐｔｉｃ　ｐＨｌｕｏｒｉｎは緑色（５０８ｎｍ）の蛍光を発する蛍光蛋白質である。このプローブを細胞質に発現させ、他の細胞質成分とともにリソソームに取り込まれたときのｐＨの変化を２色の蛍光強度のレシオの変化として計測することでオートファジー活性が測定されている。
　しかし、上記のＲｏｓａｄｏらの場合２つの蛍光蛋白質を使用しているため、標識としてのサイズが大きくなり、ある対象とする蛋白質に融合させたときには、立体的な障害によりその活性や局在を阻害する可能性が大きいこと、２つの蛍光蛋白質が細胞内のプロテアーゼで切断されてしまったときに不正なシグナルを発するおそれがあること、２つの蛍光蛋白質の細胞内でのフォールディング速度や退色などによる消光特性などｐＨに依存しない蛍光特性にも差があることから、レシオの値がその時々の実験条件で変わってしまう可能性が大きいこと、レシオの変化がｓｕｐｅｒ　ｅｃｌｉｐｔｉｃ　ｐＨｌｕｏｒｉｎの蛍光の変化にのみ依存しているため、大きな変化を得ることができないことなどから、精確なオートファジーの活性の測定が困難であるという問題がある。
　上記背景技術に記載した事情により、簡便で精度の高いオートファジーの測定法の開発が望まれている。
　本発明者らは、今回、細胞が示す、蛋白質やオルガネラなどの細胞質成分の分解系であるオートファジーの活性をより精確に測定する方法を見出した。具体的には、オートファジーが、細胞質成分が、ｐＨが中性である細胞質から酸性であるリソソームや液胞に取り込まれる反応であることを利用して、そこでの分解活性に耐性があり、ｐＨの変化に応じてスペクトルを変化させる単一の蛍光蛋白質をプローブ試薬として使用することを特徴とする、細胞内のオートファジーの新規測定法を見出した。すなわち、酸性と中性で蛍光強度を逆方向に変化させるスペクトルをもつ単一の蛍光蛋白質をプローブ試薬とすることで、細胞のオートファジーの活性をより精確に測定することができる。
　したがって、本発明は、以下のように要約される。
　（１）細胞内のオートファジーをインビトロで測定する方法であって、リソソームまたは液胞内での分解酵素活性に耐性があり、ｐＨが酸性から中性の環境下で変性または失活せず、かつ、酸性域と中性域の環境に置かれたときに励起スペクトルまたは蛍光スペクトルを変化させることができる単一の蛍光蛋白質をプローブ試薬として使用して、オートファジーに関連したｐＨの変化に依存した蛍光プローブ試薬の蛍光特性の変化を測定し、これによってオートファジーの存在または活性を測定することを含む、ただし該蛍光特性の変化を２波長励起１波長蛍光測定または１波長励起２波長蛍光測定によって行い、このとき２つの異なる励起波長または２つの異なる蛍光波長で蛍光強度を測定しそのレシオ（比率）を決定することを特徴とする、上記方法。
　（２）上記オートファジーの存在または活性が、上記細胞内でリソソームまたは液胞内へ移行したプローブ試薬の存在またはその量として測定される、上記（１）に記載の方法。
　（３）上記酸性から中性の環境が、少なくともｐＨ４~８の環境である、上記（１）または（２）に記載の方法。
　（４）上記蛍光蛋白質が、コモンサンゴ（Ｍｏｎｔｉｐｏｌａ　ｓｐ．）由来の蛍光蛋白質またはそれと同等の蛍光特性をもつその変異体である、上記（１）~（３）のいずれかに記載の方法。
　（５）上記蛍光蛋白質が、目的の内在性蛋白質と、場合によりリンカーを介して、結合されたコンジュゲートの形態で前記細胞内に存在する、上記（１）~（４）のいずれかに記載の方法。
　（６）上記内在性蛋白質が、疾患関連蛋白質である、上記（５）に記載の方法。
　（７）上記蛍光蛋白質が、オルガネラへ選択的に移行させるための移行シグナル配列と結合されたコンジュゲートの形態で上記細胞内に存在する、上記（１）~（４）のいずれかに記載の方法。
　（８）上記蛍光蛋白質または上記コンジュゲートが、該蛍光蛋白質またはコンジュゲートをコードするＤＮＡを含む発現ベクターの形態で上記細胞内に導入される、上記（１）~（７）のいずれかに記載の方法。
　（９）オートファジー異常を原因とする疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、該疾患と関連する細胞に、リソソームまたは液胞内での分解酵素活性に耐性があり、ｐＨが酸性から中性の環境下で変性または失活せず、かつ、酸性域と中性域の環境に置かれたときに励起スペクトルまたは蛍光スペクトルを変化させることができる単一の蛍光蛋白質を含むプローブ試薬と、候補薬剤とを導入し、上記（１）~（８）のいずれかに記載の方法を用いて、該細胞のオートファジー活性を測定し、該活性が対照と比べて増加したとき該候補薬剤が治療効果を有すると決定することを含む、上記方法。
　（１０）上記疾患が、神経変性疾患である、上記（９）に記載の方法。
　本発明により、分解に強い耐性があり、酸性と中性で蛍光強度をそれぞれ逆方向に変化させる、単一の蛍光蛋白質をプローブ試薬として使用することにより、従来の２つの蛍光蛋白質を組み合わせて使用したときと比べて、オートファジーの活性をより大きな蛍光強度のレシオ（ｒａｔｉｏ；比率）の変化として捕らえられるようになった。これにより、わずかな活性量の差をより明確に識別できるようになる。また、２つの蛍光蛋白質のフォールディング速度や消光速度などといった特性の違いによって生じる測定上の問題が解消されることから、より定量的なオートファジーの測定が行えるようになる。
　図１は、ｍＫｅｉｍａの励起スペクトルのｐＨによる変化を示す。図１Ａは、ｍＫｅｉｍａ（コモンサンゴ（Ｍｏｎｔｉｐｏｌａ　ｓｐ．）由来の単量体の蛍光蛋白質）の励起スペクトル、蛍光スペクトルとそのｐＨ依存性を示す。図１Ｂは、ｍＫｅｉｍａの励起ピークレシオ（５８６ｎｍ／４４０ｎｍ）のｐＨ依存的変化を示す。図１Ｃは、図１ＡからｐＨ７．０（細胞質のｐＨ）、４．０（リソソームのｐＨ）の各励起ピークを抜粋したものを示し、ｐＨ依存的な励起ピークの変化が観察される。
　図２は、ＭＥＦ細胞でのオートファジーの検出例を示す。図２Ａ，Ｂ，Ｃは、ＭＥＦ細胞にｍＫｅｉｍａをトランスフェクションし、２４時間後の蛍光像を示す。具体的には、４３８／２４フィルターで励起した蛍光像（Ａ）、５５０ＤＦ３０フィルターで励起した蛍光像（Ｂ）、およびＢ／Ａのレシオ画像（Ｃ）をそれぞれ示す。図から、オートファジーにより酸性のリソソームに移行したｍＫｅｉｍａからのシグナルが観察される。図２Ｄは、細胞質またはリソソームからのｍＫｅｉｍａシグナルのレシオ値（５５０ｎｍ／４３８ｎｍ）を示す。
　図３は、ＭＥＦ細胞でのマイトファジーの検出例を示す。図３Ａ，Ｂ，Ｃは、２ｘＣＯＸ８ｍＫｅｉｍａを発現するＭＥＦ細胞を２ｍＭ　ＦＣＣＰ＋１ｍｇ／ｍｌ　Ｏｌｉｇｏｍｙｃｉｎで処理し、マイトファジーを誘導した。具体的には、４３８／２４フィルターで励起した蛍光像（Ａ）、５５０ＤＦ３０フィルターで励起した蛍光像（Ｂ）、Ｂ／Ａのレシオ画像（Ｃ）をそれぞれ示す。図３Ｄは、ミトコンドリアまたはリソソームからのｍＫｅｉｍａシグナルのレシオ値（５５０ｎｍ／４３８ｎｍ）を示す。
　以下に、本発明をさらに詳細に説明する。
　本発明は、細胞内のオートファジーを測定する方法であって、リソソームまたは液胞内での分解酵素活性に耐性があり、ｐＨが酸性から中性の環境下で変性または失活せず、かつ、酸性域と中性域の環境に置かれたときに励起スペクトルまたは蛍光スペクトルを変化させることができる単一の蛍光蛋白質をプローブ試薬として使用して、オートファジーに関連したｐＨの変化に依存した蛍光プローブ試薬の蛍光特性の変化を測定し、これによってオートファジーの存在または活性を測定することを含む方法を提供する。
＜オートファジー＞
　背景技術の欄に記載したように、オートファジー（ａｕｔｏｐｈａｇｙ；「自食作用」ともいう）は、細胞が自らの蛋白質、オルガネラ（例えば、ミトコンドリアや小胞体等）などの細胞質成分を分解する仕組みであり、そのメカニズムから、マクロオートファジー、ミクロオートファジーおよびシャペロン介在性オートファジーの３つに分類される。本発明の方法は、細胞内で起こるこれらのオートファジー活性の総量を精確に測定することを可能にする。
　本明細書において「オートファジー活性」は、細胞内のクリアランス（浄化）能を指す。オートファジー活性がより高いとき、生細胞においてクリアランスが機能しているといえる。また、オートファジーが正常に機能しているとき、細胞の恒常性が維持されると考えられる。
　マクロオートファジーは、栄養成分の飢餓状態、蛋白質の過剰産生、異常蛋白質の蓄積などのストレスを細胞が受けると、そのような蛋白質、オルガネラなどの細胞質成分とリン脂質とが細胞質内に集積しオートファゴソームが形成され、動物細胞の場合にはオートファゴソームと細胞内リソソームが膜融合を起こしてオートリソソームが形成され、一方、酵母や植物細胞の場合にはオートファゴソームと液胞とが膜融合し、その結果、リソソームや液胞内で、そこに存在する蛋白質分解酵素によって細胞質成分が分解される、かような分解経路である。
　ミクロオートファジーは、過剰産生蛋白質や異常蛋白質などの細胞質成分を、膜融合を介さずに、直接、リソソームや液胞に取り込み分解する、かような分解経路である。
　シャペロン介在性オートファジーは、シャペロンが過剰産生蛋白質や異常蛋白質などの細胞質成分に結合することによって、細胞質成分がリソソームや液胞内に取り込まれ、その内部で分解される、かような分解経路である。
　最近の研究によって、オートファジーは、蛋白質やオルガネラの品質管理、細菌感染、抗原提示、細胞死、癌化、胚発生など、多様な生命現象に関わることが明らかになっているし、また、細胞内で蓄積、凝集する異常な蛋白質の分解や除去にも関わるといわれている。さらにまた、そのような異常蛋白質の蓄積による細胞死によって発症するとされるハンチントン病やアルツハイマー病などの神経変性疾患にも関係することが指摘されている。オートファジー活性の精確な測定が、このような疾患に対する病因や治療法の解明などに結びつくかもしれない。
＜蛍光蛋白質＞
　本発明の方法では、プローブ試薬として単一の蛍光蛋白質を使用することを特徴とする。この蛍光蛋白質は、（ｉ）リソソームまたは液胞内での分解酵素活性に耐性があり、（ｉｉ）ｐＨが酸性から中性の環境下で変性または失活せず、かつ、（ｉｉｉ）酸性域と中性域の環境に置かれたときに励起スペクトルまたは蛍光スペクトルを変化させることができるという特性を有する。
　上記特性（ｉ）は、本発明の方法がオートファジーを測定することにあるので、その測定に使用するプローブ試薬がリソソームや液胞内で分解されるようでは精確な測定を妨げることになるため、分解酵素活性に耐性を有している。
　上記特性（ｉｉ）は、細胞では、細胞質内が中性域のｐＨであるのに対して、リソソームや液胞内が酸性域のｐＨであり、本発明で使用されるプローブ試薬は中性域から酸性域の細胞内環境に置かれるため、このような環境下で変性または失活されてはならない。
　上記特性（ｉｉｉ）は、プローブ試薬が酸性域と中性域の環境に置かれたときに、酸性域と中性域とで蛍光強度を逆方向に変化させるスペクトルをもつ、かような特性である。図１Ａをみると、約５００ｎｍにｐＨの変化に依存せずに蛍光強度がほぼ一定である等吸収点または等蛍光点が存在しており、その波長の前後でｐＨの変化に依存して蛍光強度を逆方向に変化していることがわかる（図１Ｃ）。このようなスペクトルの波形から、等吸収点または等蛍光点をはさんだ適当な２波長で蛍光強度の測定を行うことによって、レシオメトリック（比率測定）法による蛍光測定が可能となるし、また、２波長で互いの蛍光強度が逆方向に変化するため、大きなレシオ（比率）の変化を得ることができる。
　上記特性をもつ蛍光蛋白質は、以下のものに限定されないが、例えばコモンサンゴ（Ｍｏｎｔｉｐｏｒａ　ｓｐ．）由来の蛍光蛋白質（Ｋｅｉｍａ）、例えばその単量体Ｋｅｉｍａ（ｍＫｅｉｍａ）または二量体Ｋｅｉｍａ（ｄＫｅｉｍａ）、それらと同等の蛍光特性をもつその変異体、例えばｄＫｅｉｍａ−ＲｅｄＴＭ（Ａｍａｌｇａａｍ社、ＭＢＬ社など；Ｋｏｇｕｒｅ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，（２００６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：５７７−５８１）などを含む。
　ここで「同等の蛍光特性」とは、特に上記（ｉｉｉ）の特性を指すが、本発明で使用可能な上記変異体は、上記（ｉ）および（ｉｉ）の特性も有しているべきである。
　例えば、後述の実施例１に記載されるように、ｍＫｅｉｍａの励起スペクトルは、ｐＨ４．０では５８６ｎｍ、７．０では４４０ｎｍの励起のピークをもつこと、約５００ｎｍに等吸収点を持ち、この波長の前後でｐＨに依存して蛍光強度が互いに逆方向に変化する。一方、蛍光波長は６２０ｎｍにピークをもち、これはｐＨ４−１０の間でほぼ一定である。
　その他、ｄＫｅｉｍａ−Ｒｅｄの場合、最大励起波長が４４０ｎｍであり、最大蛍光波長が６１６ｎｍであり、その等吸収点が約５５０ｎｍ付近に存在する。
　蛍光蛋白質の場合、それにアミノ酸残基の置換などの変異を導入することによって天然型蛋白質と異なる蛍光特性を付与することがよく行われる。このような置換は、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換であり、これはそれぞれ、電気的、構造的、疎水性／極性などのいずれかの化学的または物理的性質の同じアミノ酸間または異なるアミノ酸間での置換をいう。例えば疎水性アミノ酸にはＧｌｙ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ａｌａ，Ｍｅｔ，Ｐｒｏなどが含まれ、極性アミノ酸にはＡｓｎ，Ｇｌｎ，Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，Ｔｙｒ　Ｃｙｓなどが含まれ、酸性アミノ酸にはＡｓｐ，Ｇｌｕが含まれ、塩基性アミノ酸にはＡｒｇ，Ｌｙｓ，Ｈｉｓが含まれ、芳香族アミノ酸にはＰｈｅ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ，Ｈｉｓが含まれる。置換は、ＰＣＲ法と組み合わせてもよい部位特異的突然変異誘発法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，第２版，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８９），Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ；Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：５６６２−５６６６（１９８４））を使用するかあるいは市販の変異導入用キット（例えば、Ｍｕｔａｎ−ｓｕｐｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍキット（Ｔａｋａｒａ））を利用して行うことができる。
　スペクトル特性を変えるには蛋白質に、蛍光を有し安定性が増した構造変化を起こすことが望ましく、そのためには非保存的アミノ酸置換が好ましい。いずれにしても、本発明で使用される蛍光蛋白質は、上記（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の特性を備えているべきであり、種々の新規および公知の蛍光蛋白質のなかから、実施例１＜ｍＫｅｉｍａの励起スペクトル＞に例示したような実験を行うことによって、図１Ａに示すようなスペクトル特性をもつ蛍光蛋白質を選抜することができる。
　本発明で使用される蛍光蛋白質は、天然からの精製蛋白質、組換え蛋白質、化学合成（ペプチド合成）された蛋白質のいずれでもよいが、比較的多量に製造可能であるという点で組換え蛋白質が好ましい。
　組換え蛋白質は、慣用の遺伝子組換え技術を用いて製造することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，第２版，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８９），Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３版，Ａ　ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５），Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ、等）。
　蛍光蛋白質をコードするＤＮＡは、その蛋白質を発現する生物細胞からクローニングされる。すなわち、該ＤＮＡの一次構造が知られている場合には、その部分配列に基づくプライマーを合成し、前記細胞のｃＤＮＡライブラリーを鋳型にしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって目的のＤＮＡを増幅し、それを適当なベクター（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド等）に組み込んでクローニングすることができる。
　蛍光蛋白質は、エシェリキア属（大腸菌など）、バチルス属（バチスル・ズブチリスなど）、ブレビバチルス属（バチルス・ブレビスなど）、シュードモナス属などの原核細胞およびそれらの細胞に適するプラスミドベクターを用いる遺伝子組換え技術にて製造することができる。
　大腸菌プラスミドとして、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９などのｐＵＣシリーズ、ｐＢＲ３２２などのｐＢＲシリーズ、ｐＱＥ−３０、ｐＱＥ−６０などのｐＱＥシリーズ、ｐＭＡＬ−Ｃ２、ｐＭＡＬ−ｐ２などのｐＭＡＬシリーズなどのプラスミドを非限定的に使用することができる。
　ベクターには、プライマー、複製開始点、ＳＤ（シャイン・ダルガルノ）配列、終止コドン、ターミネーター、ポリＡ配列、マルチクローニングサイトなどを適宜含むことができる。マルチクローニングサイトには、複数の制限酵素認識サイトが含まれるため、目的のＤＮＡを挿入するときに便利である。また、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、等）などの選択マーカーを含むことができる。さらにまた、必要に応じて、蛋白質の精製を容易にするために、Ｈｉｓタグ（例えば、（Ｈｉｓ）６~（Ｈｉｓ）１０）をコードするＤＮＡを、目的の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡの５’末端または３’末端に結合し、融合蛋白質として発現させてもよい。
　プロモーターの例は、限定されないが、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、λＰＬプロモーター、λＰＲプロモーター、ｔａｃプロモーター、解糖系酵素プロモーターなどを包含する。
　上記細胞へのベクターの導入（すなわち、形質転換）は、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポーレーション法などの手法によって行うことができる。
　細胞を培養し発現された組換え蛋白質は、細胞内または細胞外液（シグナルペプチド使用の場合）から、例えば、細胞壁破壊、硫酸アンモニウム、エタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどの方法により回収、精製することができる。
　本発明では、細胞のオートファジー（その活性または存在）を測定するために、上記の蛍光蛋白質、またはそれをコードするＤＮＡを含むベクター、を使用する。ここで使用する細胞は、特に真核細胞（酵母、糸状菌、担子菌などの菌類細胞、植物細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞などの動物細胞、等）であるため、ベクターは、それらの細胞に適するベクター（プラスミド、ファージ、コスミド、ウイルス、等）を使用する。
　酵母に適するベクターの例には、ｐＧ−１、ＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０、ｐＧＢＴ９、ｐＧＡＤ４２４、ｐＡＣＴ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）などが挙げられる。
　植物細胞に適するベクターの例には、ｐＢＩベクター、Ｔ−ＤＮＡベクターなどが挙げられる。
　動物細胞に適するベクターの例には、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＥＦ６／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ、ｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ等）、ウシパピローマウイルスプラスミドｐＢＰＶ（アマシャム・ファルマシアバイオテク）、ＥＢウイルスプラスミドｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、バキュロウイルス等の昆虫ウイルス、などが挙げられる。
　ベクターには、プライマー、エンハンサー、複製開始点、リボソーム結合配列、終止コドン、ターミネーター、ポリＡ配列、マルチクローニングサイトなどを適宜含むことができる。また、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、等）、栄養要求性相補遺伝子（例えばＨＩＳ３，ＬＥＵ２，ＬＹＳ２，ＴＲＰ１，ＵＲＡ３、等）などの選択マーカーを含むことができる。さらにまた、必要に応じて、蛋白質の精製を容易にするために、Ｈｉｓタグ（例えば、（Ｈｉｓ）６~（Ｈｉｓ）１０）をコードするＤＮＡを、目的の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡの５’末端または３’末端に結合し、融合蛋白質として発現させてもよい。
　プロモーターの例には、限定されないが、ＡＤＨ１プロモーター、ユビキチンプロモーター、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウイルス（ＳＶ４０）の初期または後期プロモーター、マウス乳頭腫ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターなどが挙げられる。
　上記細胞へのベクターの導入（すなわち、形質転換またはトランスフェクション）は、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、リポフェクション法、エレクトロポーレーション法、マイクロインジェクション法、リポソーム法、アグロバクテリウム法、遺伝子銃、ウイルス感染法、スフェロプラスト法、プロトプラスト法、などの手法によって行うことができる。
　あるいは、上記蛍光蛋白質を細胞内に直接導入する場合には、膜透過性ペプチドと結合させて、またはリポソームに封入して、細胞に導入することができる。
　本発明で使用される蛍光蛋白質は、単独であってもよいし、あるいは、オートファジーに関わる、内在性蛋白質、ポリペプチドまたはペプチド、あるいはその他の機能性の蛋白質、ポリペプチドまたはペプチド、とのコンジュゲート（すなわち、結合体もしくは融合体）の形態で、細胞に導入することができる。
　上記内在性蛋白質、ポリペプチドまたはペプチドには、疾患、栄養飢餓、細菌感染、免疫応答や抗原提示、細胞死、癌化などのオートファジーに関わるすべてのものが含まれる。このうち、疾患には、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病などの神経変性疾患、癌、心不全、糖尿病などが非限定的に含まれ、内在性蛋白質は、これらの疾患の原因に関わる蛋白質（すなわち、疾患関連蛋白質）である。そのような疾患関連蛋白質には、例えば、アミロイド前駆体蛋白質、ポリグルタミン、アルファ−シヌクレイン（α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）、パーキン（ｐａｒｋｉｎ）などがあげられる。
　上記のその他の機能性の蛋白質、ポリペプチドまたはペプチドには、例えば、ミトコンドリアや小胞体などの特定のオルガネラに蛋白質を選択的に移行させることができる移行シグナル配列（例えばミトコンドリア移行シグナルペプチド、葉緑体移行シグナルペプチドなど）、蛋白質を細胞内に導入可能にする膜透過性ペプチド（例えば、ポリアルギニン、ｔａｔペプチドなど）、上記内在性蛋白質と特異的に結合することができる抗体（モノクローナル抗体、単鎖抗体、合成抗体、等）またはそのフラグメント、などが含まれる。
　上記の蛋白質、ポリペプチドまたはペプチド類のアミノ酸および塩基配列は、文献やＤＮＡデータベース、例えばＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ（米国）など）から入手可能である。
　コンジュゲートは、必要に応じてリンカーを介して蛋白質−蛋白質、蛋白質−ポリペプチドまたは蛋白質−ペプチド間を結合してもよい。リンカーは、２~５０程度のアミノ酸残基からなるペプチドであり、細胞機能を障害しない、かつ、蛍光蛋白質と内在性蛋白質の特性、立体構造等に影響を与えないようなものであればいずれのペプチドも使用できる。
　上記コンジュゲートをコードするＤＮＡを合成し、上記のベクターに挿入し、細胞内に導入し、該細胞内で発現させる。このための手法は、上述したとおりである。
＜オートファジーの測定＞
　本発明の方法では、上記のとおり、細胞内でのオートファジー活性の測定を、ｐＨの変化に依存した単一の蛍光蛋白質プローブ試薬のスペクトル特性の変化を測定することによって行う。
　本発明の方法によるオートファジーの測定においては、蛍光蛋白質は、細胞内で単独で使用することもできるし、コンジュゲートの形態で使用することもできる。例えば、つぎのような使用例を挙げることができる。
　（ａ）オートファジーが細胞質の不特定の場所で起こることから、蛍光蛋白質を細胞質にそのまま発現させて、これがリソソームに運ばれたときの蛍光の変化からオートファジーの総量を測定する。
　（ｂ）疾患に関与する蛋白質等の（オートファジーに関わる）目的の内在性蛋白質に注目してそのオートファジーを測定したい場合には、その蛋白質と蛍光蛋白質とを融合させて発現させて蛍光を測定する。
　（ｃ）目的のオルガネラに注目してそのオートファジーを測定したい場合には、そのオルガネラ（例えば、ミトコンドリア）へ蛍光蛋白質もしくはコンジュゲートを選択的に局在させるための移行シグナル配列を融合させて発現させて蛍光を測定する。
　従来、オートファジー活性の総量を測定可能にするのに十分良好なプローブ試薬がなかったために、あえてオートファジーに関与する蛋白質に標識しその動態からオートファジーを測定する必要があったが、本発明で使われるような特長をもった蛍光蛋白質を使えば、その必要がなくなり、任意の蛋白質やオルガネラに注目してオートファジー活性が測定できるようになる。
　さらにまた、細胞内での蛍光蛋白質の単独発現では、特定の疾患などの事象を直接対象とするのではなく、細胞としてのオートファジーの活性能を測定することになるので、細胞の代謝活性能の検査を行うことが可能になり、そこから疾患に対する罹りやすさとか、老化度の指標などを得ることができる。
　本発明における、細胞は、特にすべての真核細胞が含まれる。すなわち、該細胞には、非限定的に、酵母などの菌類細胞、植物細胞、動物細胞（例えば、無脊椎動物細胞、脊椎動物細胞、温血動物細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞、等）などが包含される。
　本発明の方法では、蛍光プローブ試薬として、リソソームや液胞内での分解酵素活性に耐性があり、ｐＨが酸性から中性の、少なくともｐＨ４~８の環境で変性、失活せず、酸性域と中性域の環境に置かれたときに励起または蛍光スペクトルを大きく変化させる単一の蛍光蛋白質を使用する。そのスペクトルには、ｐＨの変化に依存せずに蛍光強度がほぼ一定である等吸収点あるいは等蛍光点があり、その波長の前後でｐＨの変化に依存して蛍光強度を逆方向に変化させるという性質がある。このようなスペクトルの特長から、等吸収点あるいは等蛍光点をはさんだ適当な２波長で蛍光強度の測定を行うことで、レシオメトリック（比率測定）法による蛍光測定が可能となる。２波長で互いの蛍光強度が逆方向に変化するため、大きな蛍光強度のレシオ（比率）の変化を得ることができる。
　上記のレシオメトリック法を行うことで、細胞内でのプローブ試薬の分布の違い、励起光の照明のむら、蛍光の退色などといったｐＨに依存しない蛍光強度の変化をキャンセルさせることができ、より定量的な計測が可能となる。また、単一の蛍光蛋白質で測定されるため、上述したような２つの蛍光蛋白質を使用したときに生じる問題がない。このような性質により、プローブ試薬のリソソームや液胞への移行、すなわちオートファジー活性を明確かつ精確に測定することができる。また、分解酵素に対して強い耐性をもつ蛍光蛋白質を使うことで、任意の時間内に起きたオートファジー活性の総量を測定することができる。
　プローブ試薬は、そのアミノ酸配列をコードする遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に導入することで細胞に発現させて、あるいはプローブ試薬を直接細胞内に導入して、細胞内のオートファジーの測定に用いることができる。細胞へのプローブ試薬またはそれをコードする遺伝子、ＤＮＡもしくはＲＮＡの導入には、上記のとおり、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、リポフェクション法、エレクトロポーレーション法、マイクロインジェクション法、リポソーム法、膜透過性ペプチドとの結合、アグロバクテリウム法、ウイルス感染法、スフェロプラスト法、プロトプラスト法などの手法が利用可能である。プローブ試薬を一過性に細胞に発現させる手法に加え、その遺伝子またはＤＮＡを細胞内に保持し、プローブ試薬を安定して発現させる細胞を作製して測定に用いてもよい。このためには、例えば、強力プロモーターの使用、自律複製型ベクターの使用などを例示できる。
　蛍光プローブ試薬はある蛋白質と融合させて細胞に発現させてもよい。またあるオルガネラへ選択的に局在させるための移行シグナル配列を加えて発現させてもよい。これらの操作により、特定の蛋白質やオルガネラのオートファジーを測定することが可能となる。
　蛍光の測定法として、プローブ試薬となる蛍光蛋白質がｐＨの変化に応じて励起スペクトルを大きく変化させるが、蛍光スペクトルの変化が小さいときは、２つの異なる励起波長で蛍光強度を測定しそのレシオ（比率）を求める、２波長励起１波長蛍光測定を行うことができる。これに対して、ｐＨの変化に応じて蛍光スペクトルを大きく変化させるが、励起スペクトルの変化が小さいときは、２つの異なる蛍光波長で蛍光強度を測定しそのレシオを求める、１波長励起２波長蛍光測定を行うことができる。
　オートファジーの測定は、実施例１に具体的に記載された手法に基づいて行うことができる。例えば、細胞を、培養ディッシュに播き、酵母、植物細胞または動物細胞用の慣用の培養培地で一晩培養する。蛍光蛋白質またはコンジュゲート（プローブ試薬）、あるいはそれらをコードするＤＮＡを含むベクター、を前述の手法にて細胞内に導入する。約６時間培養後、新しい培地に交換し、さらに２４時間培養して蛍光顕微鏡イメージングシステムによる解析を行う。このとき、オートファジーを、細胞内でリソソームまたは液胞内へ移行したプローブ試薬の存在またはその量として測定する。
　蛍光計測用の装置として、単一細胞レベルで測定を行う場合は、蛍光顕微鏡に冷却ＣＣＤカメラなどの検出器を接続した顕微鏡用イメージングシステムが使用できる。解析装置にタイムラプスイメージングの機能があれば、細胞内で起こるオートファジーをリアルタイムで可視化することができる。２波長励起１波長蛍光測定では、顕微鏡の励起用の光源に波長切替装置を組み合わせ、任意の２波長を選択できるようにする。波長切替装置としては、フィルター切替装置やモノクロメータなどが使用できる。また、１波長励起２波長蛍光測定では、検出器の前にフィルター切替装置やイメージング用の２波長分光装置を接続する。その他、顕微鏡用のイメージング装置としては、レーザー走査型共焦点顕微鏡や多光子励起顕微鏡なども使用できる。単一細胞レベルでの計測が必要でない場合は、一般的な蛍光分光光度計やフローサイトメトリなどの蛍光測定用の装置で計測が可能である。
＜治療薬のスクリーニング法＞
　本発明はさらに、オートファジー異常を原因とする疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、該疾患と関連する細胞に、リソソームまたは液胞内での分解酵素活性に耐性があり、ｐＨが酸性から中性の環境下で変性または失活せず、かつ、酸性域と中性域の環境に置かれたときに励起スペクトルまたは蛍光スペクトルを変化させることができる単一の蛍光蛋白質を含むプローブ試薬と、候補薬剤とを導入し、上記のオートファジー活性の測定法を用いて、該細胞のオートファジー活性を測定し、該活性が対照と比べて増加したとき該候補薬剤が治療効果を有すると決定することを含む方法を提供する。
　本発明のスクリーニング法は、オートファジー異常を原因とする疾患と関連する細胞（細胞系を含む。）を用意し、上記の蛍光蛋白質を含むプローブ試薬（例えば、疾患原因蛋白質を融合させたプローブ試薬、疾患原因蛋白質と結合親和性を有する抗体もしくは抗体断片を融合させたプローブ試薬など）と候補薬剤とを該細胞内に導入し、上記測定法でオートファジー活性を測定することを含む。
　上記のプローブ試薬は、ベクター中にコードされてもよく、この場合には細胞内で発現されてタンパク性プローブ試薬となる。あるいは、上記のプローブ試薬に細胞膜透過性ペプチドを融合するときには、該プローブ試薬を直接細胞内に導入することが可能になる。
　オートファジーは、上記のとおり、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病などの神経変性疾患、癌、心不全、糖尿病などの疾患、栄養飢餓、細菌感染、免疫応答や抗原提示、（プログラム）細胞死などに関わることが知られており（吉森保編、「疾患に対抗するオートファジー」、実験医学２７巻１８号２００９年、羊土社（日本））、これらは本発明の方法の疾患等の対象となりうる。本発明の方法は、とりわけ、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病などの神経変性疾患や癌に対する治療薬をスクリーニングするために使用しうる。
　本発明の方法では、オートファジー活性が対照（すなわち、候補薬剤を含まない細胞を使用したときの活性）と比べて増加したとき該候補薬剤が治療効果を有すると決定する。
　候補薬剤は、低分子化合物（もしくは小分子）、高分子化合物、天然化合物、無機物質、有機物質、蛋白質（もしくはポリペプチド）、ペプチド、アミノ酸、炭水化物（もしくは糖類）、オリゴ糖、脂質（リン脂質を含む。）、核酸（人工核酸を含む。）、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ヌクレオシドなどを非限定的に含む。
　以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はその実施例によって制限されないものとする。
［実施例１］
　蛍光プローブ試薬としてコモンサンゴ（Ｍｏｎｔｉｐｏｒａ　ｓｐ．）由来の蛍光蛋白質（単量体）、ｍＫｅｉｍａ、を使用してオートファジーを測定した例を以下に示す。
＜ｍＫｅｉｍａの励起スペクトル＞
　以下の手順でｍＫｅｉｍａを精製し、ｐＨに依存したスペクトル特性を調べた。
　ｍＫｅｉｍａのｃＤＮＡ（（注）ｃＤＮＡクローニングは、Ｋｏｇｕｒｅ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，（２００６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：５７７−５８１に記載されている。）を挿入したｐＲＳＥＴＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をコンピテントセルＪＭ１０９（ＤＥ３）に導入した。このコンピテントセルをＬＡプレートに塗布し、３７℃で一晩培養してできたコロニーを、１００ｍｌのＬＡ培地に移し、１８℃で７２時間振とう培養した。この菌体を凍結融解して溶解、遠心して得たｍＫｅｉｍａを含む上清をニッケルカラム（Ｑｉａｇｅｎ）に通して溶出した。この際に用いたイミダゾールを除くため、最後にＳｅｐｈａｄｅｘＴＭ　Ｇ−２５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でゲル濾過を行うことでｍＫｅｉｍａを精製した。
　上記のように精製されたｍＫｅｉｍａをｐＨ４−１０の緩衝液で２μｇ／ｍｌの濃度に希釈した。緩衝液の組成は、ｐＨ４．０−５．０は３０ｍＭ　ＫＣｌおよび１２０ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ｇｌｕｃｏｎａｔｅを含む５０ｍＭ　ａｃｅｔａｔｅ緩衝液、ｐＨ６．０はＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７．０−８．０はＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ９．０−１０．０はｇｌｙｃｉｎｅ緩衝液である。ｍＫｅｉｍａの３５０−６００ｎｍの励起波長、６２０ｎｍの蛍光波長での励起スペクトルを蛍光分光光度計（ＳＰＥＸ　Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ−３，堀場製作所、日本）で測定した。
　得られた蛍光強度の最大値を１として標準化したスペクトルを図１に示した。測定された結果から、ｍＫｅｉｍａの励起スペクトルは、ｐＨ４．０では５８６ｎｍ、７．０では４４０ｎｍの励起のピークをもつこと、約５００ｎｍに等吸収点を持ち、この波長の前後でｐＨに依存して蛍光強度が互いに逆方向に変化することが示された。蛍光波長は６２０ｎｍにピークをもち、これは４−１０のｐＨでほぼ一定であった。ｐＫａは６．５であり、リソソームと細胞質のｐＨの中間に位置することから、この蛍光蛋白質がオートファジーを計測するプローブ試薬として適した特性をもつことが示された。
＜細胞内でのオートファジーの検出＞
　ｍＫｅｉｍａのｃＤＮＡ（上記）を挿入したプラスミドｐＥＦ６／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、例示としてのＭｏｕｓｅ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ（ＭＥＦ）細胞にトランスフェクションし、オートファジーの検出、可視化を行った。
　ＭＥＦ細胞を３５ｍｍφのガラスボトムディッシュに播き、５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で一晩培養した。プラスミドＤＮＡ　１μｇを１００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地と混合した。また１．５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ　２０００（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）を１００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地と混合した。これらを室温で５分静置した後混合し、さらに１５分静置した。これを細胞が培養されているディッシュに添加し、６時間培養後、新しい培地に交換し、さらに２４時間培養して蛍光顕微鏡イメージングシステムによる解析を行った。イメージングには、カメラにｉＸｏｎ　ＥＭ＋（Ａｎｄｏｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、対物レンズにＵＰｌａｎＳＡｐｏ６０ｘ，ｏｉｌ（オリンパス、日本）、励起用フィルターに４３８ｎｍバンドパス、半値幅２４ｎｍ（Ｓｅｍｌｏｃｋ）および５５０ｎｍバンドパス、半値幅３０ｎｍ（Ｏｍｅｇａ）、蛍光用フィルターに６１０ｎｍロングパス（Ｏｍｅｇａ）、ダイクロイックミラーに５９０ｎｍ（Ｏｍｅｇａ）を使用した。画像の取得、解析はＭｅｔａＭｏｒｐｈ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で行った。
　結果を図２に示す。ｍＫｅｉｍａのＤＮＡを加えた培養２４時間後の細胞で、５５０ｎｍ励起で強い蛍光を発する多数の小胞が観察された。５５０ｎｍ／４３８ｎｍの蛍光強度のレシオを求めたところ、この小胞内で高い値が得られ、その領域のｐＨが酸性であることが示された。この小胞の分布を、リソソームを選択的に染色する蛍光色素、Ａｌｅｘａ４８８−ｄｅｘｔｒａｎの蛍光の分布と比較したところ両者の局在が重なったことから、この小胞がリソソームであることが確認された。これらの結果は、ＭＥＦ細胞内で生じたオートファジーが、ｍＫｅｉｍａのリソソームへの輸送、蓄積にともなう蛍光特性の変化として検出できたことを示している。
＜細胞内でのマイトファジーの検出＞
　マイトファジー（ミトコンドリアのオートファジーを指す。）は、ｍＫｅｉｍａを、例示としてのＭＥＦ細胞のミトコンドリアに選択的に発現させ、その蛍光を測定することで検出した。
　ＭＥＦ細胞を３５ｍｍφのガラスボトムディッシュに播き、５％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地で一晩培養した。２ｘＣＯＸ８ｍＫｅｉｍａのｃＤＮＡを挿入したエクダイソン誘導型ベクターｐＩＮＤ（ＳＰ１）、エクダイソン受容体ＲＸＲ発現ベクターｐＶｇＲＸＲ（ともにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびマイトファジー促進因子Ｐａｒｋｉｎを発現するベクター（ＥＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ　ｐＥＦ６／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ）のプラスミドＤＮＡを各０．５μｇ（計１．５μｇ）を１００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地と混合した。また１．５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ　２０００を１００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地と混合した。これらを室温で５分静置した後混合し、さらに１５分静置した。これを細胞が培養されているディッシュに添加し、６時間培養後、２μＭ　Ｐｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ　Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む新しい培地に交換し、２ｘＣＯＸ８ｍＫｅｉｍａの発現を誘導した。さらに２４時間培養後、細胞質に残る２ｘＣＯＸ８ｍＫｅｉｍａの発現誘導を止め、これを完全にミトコンドリアにターゲッティングさせるためにＰｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ　Ａを除いた培地に交換し、一晩培養して蛍光顕微鏡イメージングシステムによる解析を行った。マイトファジーは２μＭ　ＦＣＣＰと１μｇ／ｍｌ　Ｏｌｉｇｏｍｙｃｉｎ（ともにＳｉｇｍａ）を添加することで誘導した。イメージングに使用したシステムは、上で述べたオートファジーの検出を行ったものと同じである。
　結果を図３に示す。マイトファジー誘導後２４時間後の細胞で、一部のミトコンドリアが５５０ｎｍ励起で強い蛍光を発する様子が観察された。５５０ｎｍ／４３８ｎｍの蛍光強度のレシオを求めたところ、このミトコンドリアで高い値が得られ、その領域のｐＨが酸性であることが示された。この結果は、ＭＥＦ細胞内で生じたマイトファジーが、ｍＫｅｉｍａのリソソームへの輸送、蓄積にともなう蛍光特性の変化として検出できたことを示している。
　近年、アルツハイマー病やパーキンソン病、ハンチントン病などの神経変性疾患が、細胞の不十分なオートファジーによる異常な蛋白質の蓄積がもとで引き起こされていることがわかってきた。本発明はこれらの疾患に対する、病気の解明、治療法の開発、薬剤の探索など、医学、産業の分野で有用である。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (10)

  1. 　細胞内のオートファジーをインビトロで測定する方法であって、リソソームまたは液胞内での分解酵素活性に耐性があり、ｐＨが酸性から中性の環境下で変性または失活せず、かつ、酸性域と中性域の環境に置かれたときに励起スペクトルまたは蛍光スペクトルを変化させることができる単一の蛍光蛋白質をプローブ試薬として使用して、オートファジーに関連したｐＨの変化に依存した蛍光プローブ試薬の蛍光特性の変化を測定し、これによってオートファジーの存在または活性を測定することを含む、ただし該蛍光特性の変化を２波長励起１波長蛍光測定または１波長励起２波長蛍光測定によって行い、このとき２つの異なる励起波長または２つの異なる蛍光波長で蛍光強度を測定しそのレシオ（比率）を決定することを特徴とする、前記方法。
  2. 　前記オートファジーの存在または活性が、前記細胞内でリソソームまたは液胞内へ移行したプローブ試薬の存在またはその量として測定される、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記酸性から中性の環境が、少なくともｐＨ４~８の環境である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記蛍光蛋白質が、コモンサンゴ（Ｍｏｎｔｉｐｏｌａ　ｓｐ．）由来の蛍光蛋白質またはそれと同等の蛍光特性をもつその変異体である、請求項１~３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記蛍光蛋白質が、目的の内在性蛋白質と、場合によりリンカーを介して、結合されたコンジュゲートの形態で前記細胞内に存在する、請求項１~４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　前記内在性蛋白質が、疾患関連蛋白質である、請求項５に記載の方法。
  7. 　前記蛍光蛋白質が、オルガネラへ選択的に移行させるための移行シグナル配列と結合されたコンジュゲートの形態で前記細胞内に存在する、請求項１~４のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　前記蛍光蛋白質または前記コンジュゲートが、該蛍光蛋白質またはコンジュゲートをコードするＤＮＡを含む発現ベクターの形態で前記細胞内に導入される、請求項１~７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　オートファジー異常を原因とする疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、該疾患と関連する細胞に、リソソームまたは液胞内での分解酵素活性に耐性があり、ｐＨが酸性から中性の環境下で変性または失活せず、かつ、酸性域と中性域の環境に置かれたときに励起スペクトルまたは蛍光スペクトルを変化させることができる単一の蛍光蛋白質を含むプローブ試薬と、候補薬剤とを導入し、請求項１~８のいずれか１項に記載の方法を用いて、該細胞のオートファジー活性を測定し、該活性が対照と比べて増加したとき該候補薬剤が治療効果を有すると決定することを含む、前記方法。
  10. 　前記疾患が、神経変性疾患である、請求項９に記載の方法。
PCT/JP2010/063787 2009-08-10 2010-08-10 オートファジーの測定方法 WO2011019082A1 (ja)

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