JP2014516407A - 治療の方法においておよび化合物のスクリーニングのために有用なアミロドーシスターゲット - Google Patents
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Abstract
【選択図】図7
Description
a)シャペロンタンパク質の既知の三量体/単量体比を含む水性混合物を準備する工程;
b)前記1種以上の候補化合物を混合物に添加する工程;
c)前記1種以上の候補化合物を混合物中のシャペロンタンパク質と相互作用させる工程;
d)混合物中のシャペロンタンパク質の三量体/単量体比を測定する工程;および
e)前記1種以上の候補化合物が、
e1)シャペロンタンパク質の三量体/単量体比が候補化合物(複数可)の存在下で減少する場合、状態の治療において活性である;または
e2)シャペロンタンパク質の三量体/単量体比が候補化合物(複数可)の存在下で減少しない場合、状態の治療において活性でない
ということを結論する工程
を含んでいる。
f)フィブリル化タンパク質およびシャペロンタンパク質を含む第2の水性混合物を準備する工程;
g)工程e1)において活性とみなされた前記1種以上の候補化合物を第2の混合物に添加して、シャペロンタンパク質の三量体/単量体比を減少させる工程;
h)第2の混合物中でシャペロンタンパク質を前記1種以上の候補化合物およびフィブリル化タンパク質と相互作用させる工程;
i)第2の混合物中のフィブリル化タンパク質のフィブリルの形成を測定する工程;ならびに
j)前記1種以上の候補化合物が、
j1)フィブリル化タンパク質のフィブリル形成が候補化合物(複数可)の存在下で減少する場合、状態の治療において活性である;または
j2)フィブリル化タンパク質のフィブリ形成が候補化合物(複数可)の存在下で減少しない場合、状態の治療において活性でない
ということを結論する工程
を含んでいる。
a)
a1)本発明によるスクリーニング方法において活性について1種以上の候補化合物をスクリーニングすること;または
a2)本発明によるスクリーニング方法を用いて前のスクリーニング手順の結果を利用すること
によって活性化合物を準備する工程;および
b)活性化合物を1種以上の適切な医薬成分と製剤化して、医薬組成物を与える工程
を含む方法を提供する。
配列番号1 ヒトBri2
配列番号2 ヒトBri2(90〜243)
配列番号3 ヒトBri2Brichos[Bri2(137〜231)]
配列番号4 ヒトBri3
配列番号5 ヒトBri3(97〜242)
配列番号6 ヒトBri3Brichos[Bri3(136〜230)]
配列番号7 ヒトproSP−C
配列番号8 ヒトCTproSP−C[CTproSP−C(59〜197)]
配列番号9 ヒトCTproSP−CBriochos[CTproSP−C(90〜197)]
配列番号10 ヒトAβ1〜40ペプチド
配列番号11 ヒトAβ1〜42ペプチド
[発明の詳細な説明]
Bri2(配列番号1)(内在性膜タンパク質2B(ITM2B)とも呼ばれる)は、残基137〜231(配列番号3)にわたる進化的に保存されたBrichosドメインを含む。本明細書で決定されたCTpro−CのBrichosドメインによるアライメント(図8)に基づいて、Bri2のBrichosドメインは、代わりにスパニング残基(spanning residue)131〜231とみなされてもよい。
アミロイド疾患におけるproSP−C変異を有するILD
分子シャペロンは、アミロイドーシスを含む、タンパク質ミスフォールディング疾患の強力なモジュレータと思われてきたが、不適切なシャペロン機能が疾患をもたらす例は、記載されていない。組換えCTC(CTproSP−C)は、proSP−CのTM領域に由来するペプチドに結合し、それにより、β−シート凝集およびフィブリル形成を防止する。proSP−C遺伝子(SFTPC)中の50を超える異なる変異が、間質性肺疾患(ILD)に罹っている患者で見出されてきた。興味深いことに、これらのうちの5つだけが、成熟TM SP−Cヘリックスで見出される一方で、大部分は、リンカーおよびBRICHOSドメインに位置している。リンカー領域の最初の半分は、進化を通して高度に保存されているが、その機能は知られていない。
10μm厚の肺組織切片を、脱パラフィン化し、コンゴーレッドで染色し、偏光顕微鏡でアミロイドを調べた。非常に顕著な慢性炎症が、観察されたアミロイド沈着物が急性期血清タンパク質A(AA)起源のものであり得るかどうかの問題を提起し得、したがって、切片をタンパク質AAに対する抗体で免疫標識した。アミロイド沈着物を含む材料すべてからの他の切片を、成熟SP−C、proSP−CのN−末端ペプチドセグメント、またはCTCに対するウサギ抗血清で免疫標識した。3,3’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリドによる展開後、免疫標識された切片をアミロイドおよび免疫反応性の同時検出のためにコンゴーレッド溶液で染色した。ヒトproSP−Cの残基24〜45に対応する合成ペプチドを、振とうしながら10%ギ酸水溶液中200μMの濃度において37℃で7日間インキュベートした。液滴(0.8マイクロリットル)を顕微鏡スライドに塗布し、空気乾燥させ、コンゴーレッドB溶液で染色した。カバースリップ下に取り付け後、材料をコンゴーフィリアおよび緑色複屈折について偏光顕微鏡で調べた。電子顕微鏡検査については、2μlのアリコートを200メッシュ銅グリッド上で1分間吸着させ、50%エタノール水溶液中2%酢酸ウラニルで30秒間染色し、その後、75kVで操作されたHitachi H7100顕微鏡を用いて調べ、撮影した。
CTproSP−CおよびproSP−CBrichos水素重水素交換(HDX)試験
水素重水素交換(HDX)
質量分析に接続された水素重水素交換(HDX−MS)は、タンパク質骨格アミド中への重水素取り込みの測定によって構造動力学についての情報を与える。可変性または溶媒に曝露されたセグメントは、急速な交換を可能にするが、一方であまり曝露されていないまたはきつく折り畳まれたセグメントは、より遅く交換する。異なるタンパク質領域における重水素取り込みの様々な度合いは、ペプシン消化およびLC−MS分析を用いて測定した。
重水素化CTCのアリコートを解凍し、予備冷却されたハミルトン注射器を用いてHPLCシステム中に注入した。システムは、分析の間に氷浴中に沈めた。タンパク質試料は、5μlの試料ループ中に注入し、0.05%TFA中17μl/分で稼動させた、Porozyme Immobilized Pepsin Cartridge(Applied Biosystems、Foster City、CA)においてオンランで消化した。ペプシンペプチドを、Waters Symmetry C18トラップカラムを用いて脱塩し、17μl/分の流量で0.1%ギ酸を含む70%アセトニトリルを用いて一段階で溶出させた。消化および脱塩は、10分間行った。試料は、T−コネクターを介してHPLCに接続された50μmの開口部を有するテーパーチップエミッタを通して質量分析計に送達した。
proSP−CのBrichosドメインの構造
円偏光二色性(CD)分光法
遠紫外領域(190〜260nm)におけるCDスペクトルを、Jasco J−810−150S分光偏光計(Jasco、東京、日本)によって、1nmのバンド幅および2秒の応答時間を用いて22℃で記録し、10データ点/nmを収集した。示したスペクトルは、3回のスキャンの平均である。スペクトルは、CTC(CTproSP−C;15μM)およびトリプシン処理CTC(10μM)について記録した。
トリプシン処理CTCの切断部位は、タンパク質を30%アセトニトリル/0.1%ギ酸に溶解させ、続いて、MS分析によって測定した。11540Daの平均分子量を有するフラグメントが認められ、Cys121とCys189の間のジスルフィド架橋によって連結された、残基82〜160および残基168〜197を切断タンパク質が包含することを示した(理論的平均分子量:11541Da)。
構造決定に適切な結晶を、トリプシンによるインサイチューでのタンパク質分解によって数週間以内に得た。MS分析は、結晶化材料が、proSP−Cの残基82〜160および残基168〜197に対応することを示唆する。本明細書で提示される構造は、0.3〜0.7mMの範囲の様々な濃度において、293Kおよび277Kでシッティングドロップ法(sitting-drop method)を用いて得られた、セレノメチオニル化タンパク質の結晶に由来した。空間群C2に属する単結晶(a=132.05Å、b=39.33Å、c=114.76Å、β=99.6°)を、0.1M Bis−Tis pH6.5および20%(w/v)PEG MME 5Kから成長させた。結晶を30%(w/v)PEG400に浸し、液体窒素中で急速冷凍し、データ収集のために用いた。
2.1Åに対するデータを、ID23eh1ビームラインでADSC Q315検出器を用いて、欧州放射光施設(European Synchrotron Radiation Facility)、仏国において収集した。すべてのデータは、MOSFLM12で処理して、SCALA13でスケーリングした。データは、2.3ÅのBragg間隔に対して実質的に100%完全であり、次いで急速に外れ、2.1Åに対して外側分解能シェルにおいて約60%完全であるのみである。
一つのサブ単位のモデルを平均化マップで構築し、他の5つのNCS関連サブ単位を作成するために用いた。精密化および再構築は、ピーク(pk)波長データを用いて行い、Coot、O、Refmac5、Buster、およびPhenixの組合せを用いて行った。
準備およびMDシミュレーションは、Schrodinger Suite2009(Schrodinger、LCC、New York、NY、2009年)に実装されたソフトウェアで行った。Maestroソフトウェアを用いて、4つの異なるシステム、それぞれ、野性型単量体および三量体、ならびにD105N単量体および三量体変異体を構築し、Protein Preparation Wizardワークフローを用いて水素を加えた。
構造決定に適した結晶は、トリプシンによるインサイチュータンパク質分解にかけた組換えCTCから得た。結晶化タンパク質のサイズは、11540Daの平均分子質量に一致するようにMSで測定した。予測されたトリプシン切断部位を考慮すると、これは、L82〜K160およびD168〜Y197を包含する産物と適合している。トリプシン処理された材料についての円偏光二色性スペクトルは、本質的にCTCについてのものと同じであり、両方ともトリペプチドVVVに結合し、これは、proSP−C20のTM部分の代表的な配列である。これは、CTCのトリプシン処理が、構造部分を有意には変えなかったこと、および可変性部分が、基質結合に重要でないと主張される。
proSP−Cは、動物界にわたって、特に哺乳動物のうちで高度に保存されている。proSP−CのBRICHOSドメインにおける保存された残基は、構造的に重要な位置および潜在的なペプチド結合面を同定するために結晶構造上でマップ化した。ループ領域に位置する、いくつかの保存されたGlyおよびPro残基は、ドメインの折り畳みおよび動的特性に重要であり得る。C121とC189の間の保存されたジスルフィド架橋は、β4およびα2を連結し、安定性に重要であり得る。残存する厳密に保存された残基は、主にβ−シートの面Aおよび面Bに位置する。ILDの患者で同定されたCTC点変異の多くは、厳密に保存されたアミノ酸部位と一致する。
リン脂質膜におけるSP−CへのCTCの結合に関するデータは、SP−Cの非構造化された合成非ヘリックス形態が認められ、らせん状構造に転換されるが、一方でヘリックスSP−Cは、認められない。これは、CTCが、極めて疎水性でβ−構造になりがちなTMproSP−Cペプチドセグメントのための立体シャペロンとして作用すること、およびそれが、前述のβ−ヘアピン構造における非天然のproSP−Cを特異的に捕捉することを示唆する。中央のβ−シートの保存された疎水性面は、このような機能に十分に適しているように見える。いくつかの点で、これは、他の立体シャペロンの働き方と同等である。一例は、折り畳み鋳型/足場(scaffold)として作用することによって、疎水性プラットフォームが、非折り畳み構造を捕捉し、特異的構造へのそれらの折り畳みを促進するために用いられるシャペロン/アッシャー(usher)経路の立体シャペロンである。シャペロンは、多かれ少なかれ、基質の不存在下で溶液からそれらの疎水性結合面を遮蔽するために、しばしばそれらの面を埋没させるホモ複合体を形成することによって、ある種の「キャッピング」機構を用いる。出発構造として結晶学的wtとD105N変異体三量体のモデルの両方ともを用いるMDシミュレーションは、wt単量体構造において起こる移動のいずれも三量体で起こり得ないことを示す。したがって、三量体は、シャペロンキャッピング機構としてのその役割と一致して、推定結合部位を遮断する配座におけるサブ単位を安定化させる。とりわけ、Δ91〜93欠失変異体および点変異の多くは、BRICHOS三量体界面に位置している。
Aβペプチドについての凝集動態
ペプチドおよびタンパク質
Aβペプチド。Aβ(M1〜40)(配列番号10)およびAβ(M1〜42)(配列番号11)を、合成遺伝子由来の大腸菌(E.coli)で発現させ、イオン交換およびサイズ排除工程を用いてバッチ形式で精製したが、これは、高度に純粋な単量体ペプチドをもたらす。精製ペプチドを20〜30の同一のアリコートに分割し、凍結させた。次いで、それぞれの実験のセットアップ直前に精製ペプチドのアリコートをゲルろ過することによって、単量体を単離し、凍結解凍の間に形成された微量の凝集体を除去し、緩衝液をそれぞれの実験に用いられるものと交換した。単量体ピークの後半部分を、氷上のローバインドエッペンドルフ管(Axygene)に集め、酸加水分解後の吸光度およびアミノ酸分析によって濃度を測定した。この単量体をそれぞれの実験にそのままで、または所望の濃度に希釈して用いた。
凝集動態を、プレートリーダ(BMG Labtech、Offenberg、独国のFluoStar Omega)において時間の関数としてThT蛍光強度を記録することにより試験した。440nmの励起フィルターおよび480nmの発光フィルターを用いて、透明底を有するハーフエリア96ウェルPEGコート黒ポリスチレンプレート(Corning3881)において底部の光学装置を用いて記録した。Aβ単量体は、20mMのリン酸Na、200μMのEDTA、0.02%のNaN3(Aβ(M1〜40)の場合はpH7.4およびAβ(M1〜42)の場合はpH8.0で)中上記のとおりのゲルろ過により単離し、同じ緩衝液中Aβ(M1〜40)の場合は6または8μMに、およびAβ(M1〜42)の場合は3または6μMに希釈し、2mMの原液から20μMのThTを補充した。96ウェルプレートにおいて各ウェルに、最初に緩衝液(20mMのTris/HCl pH7.4)10μlまたはBRICHOSタンパク質もしくは対照タンパク質のいずれか10μlを20mMのTris/HCl pH7.4中の所望の最終濃度の10倍で加えた。次いで、各ウェルに90μlの氷冷Aβ単量体溶液を加え、プレートを37℃のプレートリーダに直ちに入れ、読み取りの間に100rpmで連続的に振とうしながら6分毎に蛍光を読み取った。Aβ(M1〜40)を、単独で、または17nMから17μMの範囲の濃度のproSP−C BRICHOSもしくは60nMから6μMの範囲の濃度のBri2 BRICHOSと一緒に試験した。Aβ(M1〜42)を、単独で、または60pMから17μMの範囲の濃度のproSP−C BRICHOSもしくは20nMから6μMの範囲の濃度のBri2 BRICHOSと一緒に試験した。AβおよびBRICHOSタンパク質の濃度は、酸加水分解後のアミノ酸分析により測定した。
y=y0+(ymax−y0)/(1+exp(−k(t−t1/2))
に適合させることによって得て、ラグタイム、tlagは、
tlag=t1/2−2/k
のとおりに定義した。
Aβペプチドについての停止実験
進行中の凝集過程の間にBRICHOS添加の効果をモニターするために、8μMのAβ40を有する試料を、時間の関数としてThT蛍光強度を記録することによってモニターした。実験の開始直前、または0.3から11.2時間の範囲の種々の時点で、濃縮原液から800nMのBri2 BRICHOSを加えた。同様の実験を、6から109分間の範囲の種々の時点で加えた1.8μMのBri2 BRICHOSを有する3μMのAβ42について行った。図10に示されるように、凝集過程は、ラグタイム中のどこで添加される場合も、BRICHOSタンパク質によって遅延させ得る。図10において、8μMのAβ40の凝集を、100rpmの振とうとともに、37℃で、20mMのリン酸Na、pH7.4、200μMのEDTA、20μMのThT、0.02%NaN3中時間の関数としてThT蛍光強度を記録することによりモニターした。垂直の矢印で示されるとおりに実験の開始前(最も上の追跡)または実験開始後の種々の時点(0.3から11.2時間の範囲)で、800nMのBri2 BRICHOSを濃縮原液から加えた。
Aβペプチドの二次構造に対するBrichosタンパク質の影響
CD分光法
CDスペクトルを、JASCO J−B15分光偏光計を用いて4mm石英キュベット中で記録した。遠紫外スペクトルは、20nm/分のスキャン速度を用いて185〜250nmで、1nm間隔で記録し、応答時間は8秒、および帯域通過は1nmであった。Aβ(M1〜40)単量体を、40mMのNaFおよび200μMのEDTAと一緒の10mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.4中ゲルろ過によって単離し、氷上で収集し、緩衝液、proSP−CまたはBri2 BRICHOSで補充された3種の試料中に最終濃度8μMのAβ(M1〜40)に分割し、添加なしまたは0.8μMのproSP−C BRICHOSもしくは0.8μMのBri2 BRICHOSであった。試料を37℃で加熱し、直接にまたは100rpmの振とうとともに37℃で、最大18時間までのインキュベーションの異なる時間後に試験した。緩衝液のスペクトルは、同じキュベット中で別個に記録し、全スペクトルから差し引いた。0.8μMのproSP−CまたはBri2 BRICHOSのスペクトルは、別個に記録した。
Brichosタンパク質とAβペプチドの間の相互作用
サイズ排除クロマトグラフィー
Superdex75カラム(GE Healthcare、Uppsala、スウェーデン国)上のサイズ排除クロマトグラフィーを、BioLogic HR FPLCシステム(Biorad)を用いて行った。カラムを、脱気した緩衝液(凝集試験のための試料を調製するためのpH7.4またはpH8.0での20mMのリン酸Na、200μMのEDTA、0.02%のNaN3、およびCD試験のための試料を調製するための10mMのリン酸Na、40mMのNaF、pH7.4)中で平衡化および操作した。試料を1mLのループから注入し、クロマトグラムを280nmでの吸光度をモニターすることによって記録した。タンパク質相互作用をモニターするために、AβとBRICHOSドメインの混合物を、混合後に直接に、またはpH7.4もしくはpH8.0で20mMのリン酸ナトリウム、200μMのEDTA、0.02%のNaN3中37℃でインキュベーション2もしくは20時間後に注入した。画分(0.3〜0.7ml)をクロマトグラムの間に収集し、凍結乾燥し、10〜20%勾配ゲル中SDS PAGEにより分析した。
リガンドを用いたAβ動態の実験
実験は、三量体/単量体比を恐らくは減少させる候補化合物の、組換えヒトproSP−C BRICHOSまたは組換えヒトBri2 BRICHOSへの添加が、Aβフィブリル形成の阻害に関してBRICHOSドメインの有効性を増加させ得るかどうか測定するために行った。
Aβ(M1〜40)およびAβ(M1〜42)を合成遺伝子由来の大腸菌で発現させ、記載したとおりのイオン交換およびサイズ排除工程を用いてバッチ形式で精製した。
凝集動態は、プレートリーダ(BMG Labtech、Offenberg、独国からのFluoStar Omega)において時間の関数としてチオフラビンT(ThT)蛍光強度を記録することによって試験した。蛍光は、440nmの励起フィルターおよび480nmの発光フィルターを用いて、透明底を有するハーフエリア96ウェルPEGコート黒ポリスチレンプレート(Corning3881)において底部の光学装置を用いて記録した。
組換えヒトproSP−CまたはBri2 BRICHOS単独では、Aβフィブリル形成の開始を遅延させ、すなわち、遅延期を延長させた。proSP−C BRICHOSへの120nMのビス−ANSの添加、またはBri2 BRICHOSへの300nMのビス−ANSの添加は、フィブリル形成の開始の遅延を有意に強めた。proSP−C BRICHOSについて、120nMのビス−ANSの添加は、ラグタイムをほぼ倍加したが、一方でBri2 BRICHOSへの300nMのビス−ANSの添加は、少なくとも3倍ラグタイムを延長させた。トリペプチドの添加は、Aβフィブリル形成を遅延させるBRICHOSドメインの能力に対して検出可能な効果を示さなかった。
Claims (47)
- 哺乳動物におけるアミロイドタンパク質フィブリルの形成に関連する状態の治療における活性について1種以上の候補化合物をスクリーニングする方法であって、シャペロンタンパク質の三量体/単量体比が前記1種以上の候補化合物の存在下で減少するかどうかを測定することを含み、前記シャペロンタンパク質が、80個以上のアミノ酸残基を含んでおり、かつヒト由来のBri2の残基90〜243(配列番号2)、ヒト由来のBri2のBrichosドメイン(配列番号3)、ヒト由来のBri3の残基97〜242(配列番号5)、ヒト由来のBri3のBrichosドメイン(配列番号6)、ヒト由来のCTproSP−C(配列番号8)、およびヒト由来のCTproSP−CのBrichosドメイン(配列番号9)からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいる方法。
- 前記シャペロンタンパク質が、200個以下のアミノ酸残基を含んでいる、請求項1に記載の方法。
- 前記シャペロンタンパク質が、150個以下のアミノ酸残基を含んでいる、請求項2に記載の方法。
- 前記シャペロンタンパク質が、ヒト由来のBri2の残基90〜243(配列番号2)、ヒト由来のBri3の残基97〜242(配列番号5)、およびヒト由来のCTproSP−C(配列番号8)からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記シャペロンタンパク質が、ヒト由来のBri2(配列番号3)、Bri3(配列番号6)およびCTproSP−C(配列番号9)のBrichosドメインからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- a)前記シャペロンタンパク質の既知の三量体/単量体比を含む水性混合物を準備する工程;
b)前記1種以上の候補化合物を前記混合物に添加する工程;
c)前記1種以上の候補化合物を前記混合物中の前記シャペロンタンパク質と相互作用させる工程;
d)前記混合物中の前記シャペロンタンパク質の三量体/単量体比を測定する工程;および
e)前記1種以上の候補化合物が、
e1)前記シャペロンタンパク質の三量体/単量体比が前記候補化合物の存在下で減少する場合、前記状態の治療において活性である;または
e2)前記シャペロンタンパク質の三量体/単量体比が前記候補化合物の存在下で減少しない場合、前記状態の治療において活性でない
と結論づける工程;
を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。 - 前記状態に関連するフィブリル化タンパク質のフィブリルの形成が、前記シャペロンタンパク質および前記1種以上の活性候補化合物の存在下で減少するかどうかを測定することをさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- f)前記フィブリル化タンパク質および前記シャペロンタンパク質を含む第2の水性混合物を準備する工程;
g)工程e1)において活性とみなされた前記1種以上の候補化合物を前記第2の混合物に添加して、前記シャペロンタンパク質の三量体/単量体比を減少させる工程;
h)前記第2の混合物中で前記シャペロンタンパク質を前記1種以上の候補化合物および前記フィブリル化タンパク質と相互作用させる工程;
i)前記第2の混合物中の前記フィブリル化タンパク質のフィブリルの形成を測定する工程;ならびに
j)前記1種以上の候補化合物が、
j1)前記フィブリル化タンパク質のフィブリル形成が前記候補化合物の存在下で減少する場合、前記状態の治療において活性である;または
j2)前記フィブリル化タンパク質のフィブリル形成が前記候補化合物の存在下で減少しない場合、前記状態の治療において活性ではない
と結論づける工程
をさらに含む、請求項7に記載の方法。 - 前記フィブリル化タンパク質が、Aβ−ペプチド、ADan、ABriおよびSP−Cからなる群から選択される、請求項7および8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フィブリル化タンパク質が、Aβ−ペプチドである、請求項9に記載の方法。
- 哺乳動物におけるアミロイドタンパク質フィブリルの形成に関連する状態の治療のための医薬組成物を製造する方法であって、
a)a1)請求項1〜10の方法のいずれか一つに従って、活性について1種以上の候補化合物をスクリーニングすること;または
a2)請求項1〜10の方法のいずれか一つに従った以前のスクリーニング手順の結果を利用すること
によって活性化合物を準備する工程;および
b)前記活性化合物を1種以上の適切な医薬成分と製剤化して、医薬組成物を与える工程
を含む方法。 - 前記状態が、アルツハイマー病、家族性デンマーク型認知症、家族性英国型認知症および間質性肺疾患からなる群から選択される、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記状態が、アルツハイマー病である、請求項12に記載の方法。
- 哺乳動物におけるアミロイドタンパク質フィブリルの形成に関連する状態の治療のための候補薬のインビトロターゲットとしての、請求項1〜5のいずれか一項に記載のシャペロンタンパク質の三量体の使用。
- 前記候補薬が、前記シャペロンタンパク質の三量体/単量体比の減少における活性についてスクリーニングされる、請求項14に記載の使用。
- 前記状態が、アルツハイマー病、家族性デンマーク型認知症、家族性英国型認知症および間質性肺疾患からなる群から選択される、請求項14および15のいずれか一項に記載の使用。
- 前記状態がアルツハイマー病である、請求項16に記載の使用。
- 抗体およびアプタマーからなる群から選択される化合物または化合物の組合せであって、前記化合物または組合せが、シャペロンタンパク質の三量体/単量体比を減少させることができ、前記シャペロンタンパク質が、80個以上のアミノ酸残基を含んでおり、かつヒト由来のBri2の残基90〜243(配列番号2)、ヒト由来のBri2のBrichosドメイン(配列番号3)、ヒト由来のBri3の残基97〜242(配列番号5)、ヒト由来のBri3のBrichosドメイン(配列番号6)、ヒト由来のCTproSP−C(配列番号8)、およびヒト由来のCTproSP−CのBrichosドメイン(配列番号9)からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいる、医薬品として使用するための化合物または化合物の組合せ。
- 前記シャペロンタンパク質が、ヒト由来のBri2の残基90〜243(配列番号2)、ヒト由来のBri3の残基97〜242(配列番号5)、およびヒト由来のCTproSP−C(配列番号8)からなる群から選択される、請求項18に記載の使用のための化合物または化合物の組合せ。
- 前記シャペロンタンパク質が、ヒト由来のBri2(配列番号3)、Bri3(配列番号6)およびCTproSP−C(配列番号9)のBrichosドメインからなる群から選択される、請求項18に記載の使用のための化合物または化合物の組合せ。
- 哺乳動物におけるアミロイドタンパク質フィブリルの形成に関連する状態の治療のためのものである、請求項18〜20のいずれか一項に記載の使用のための化合物または化合物の組合せ。
- 前記状態が、アルツハイマー病、家族性デンマーク型認知症、家族性英国型認知症および間質性肺疾患からなる群から選択される、請求項21に記載の使用のための化合物または化合物の組合せ。
- 前記状態がアルツハイマー病である、請求項22に記載の使用のための化合物または化合物の組合せ。
- 80個以上のアミノ酸残基を含み、かつヒト由来のBri2の残基90〜243(配列番号2)、ヒト由来のBri2のBrichosドメイン(配列番号3)、ヒト由来のBri3の残基97〜242(配列番号5)、ヒト由来のBri3のBrichosドメイン(配列番号6)、ヒト由来のCTproSP−C(配列番号8)、およびヒト由来のCTproSP−CのBrichosドメイン(配列番号9)からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、医薬品として使用するためのタンパク質の単量体。
- 哺乳動物におけるアミロイドタンパク質フィブリルの形成に関連する状態の治療において使用するための、請求項24に記載のタンパク質単量体。
- 前記状態が、アルツハイマー病、家族性デンマーク型認知症、家族性英国型認知症および間質性肺疾患からなる群から選択される、請求項25に記載の使用のためのタンパク質単量体。
- 前記状態がアルツハイマー病である、請求項26に記載の使用のためのタンパク質単量体。
- そのアミノ酸配列が、ヒト由来のBri2の残基90〜243(配列番号2)、およびヒト由来のBri2のBrichosドメイン(配列番号3)からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%を有し、但し、前記タンパク質が、ヒト由来のBri2の残基1〜89に対して少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含んでおらず、前記タンパク質が、ヒト由来のBri2のヒト残基244〜266(Bri23)に対して少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいない、請求項24〜27のいずれか一項に記載の使用のためのタンパク質単量体。
- 前記タンパク質単量体が、200個以下のアミノ酸残基からなっている、請求項24〜28のいずれか一項に記載の使用のためのタンパク質単量体。
- 前記タンパク質単量体が、150個以下のアミノ酸残基からなっている、請求項29に記載の使用のためのタンパク質単量体。
- 前記タンパク質が、ヒト由来のBri2の残基90〜243(配列番号2)、ヒト由来のBri3の残基97〜242(配列番号5)、およびヒト由来のCTproSP−C(配列番号8)からなる群から選択される、請求項24〜27のいずれか一項に記載の使用のためのタンパク質単量体。
- 前記タンパク質が、ヒト由来のBri2(配列番号3)、Bri3(配列番号6)およびCTproSP−C(配列番号9)のBrichosドメインからなる群から選択される、請求項24〜27のいずれか一項に記載の使用のためのタンパク質単量体。
- 治療的有効量の請求項24〜32のいずれか一項に記載のタンパク質の単量体およびそれらに適切な医薬担体を含む医薬組成物。
- 前記タンパク質の三量体/単量体比を減少させることができる、治療的有効量の化合物または化合物の組合せをさらに含む、請求項33に記載の医薬組成物。
- 治療的有効量の請求項18〜23のいずれか一項に記載の化合物または化合物の組合せ、およびそれらに適切な医薬担体を含む、医薬組成物。
- 医薬品として使用するための、請求項33〜35のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 哺乳動物におけるアミロイドタンパク質フィブリルの形成に関連する状態の治療において使用するための、請求項36に記載の医薬組成物。
- 前記状態が、アルツハイマー病、家族性デンマーク型認知症、家族性英国型認知症および間質性肺疾患からなる群から選択される、請求項37に記載の使用のための医薬組成物。
- 前記状態がアルツハイマー病である、請求項38に記載の使用のための医薬組成物。
- 治療を必要としている、ヒトを含む哺乳動物におけるアミロイドタンパク質フィブリルの形成に関連する状態を治療する方法であって、治療的有効量の請求項24〜32のいずれか一項に記載のタンパク質の単量体を前記哺乳動物へ投与することおよび/またはそれに導入することを含む方法。
- 治療的有効量の請求項24〜32のいずれか一項に記載のタンパク質の単量体を前記哺乳動物へ投与することを含む、請求項40に記載の方法。
- 治療的有効量の請求項18〜23のいずれか一項に記載の化合物または化合物の組合せを前記哺乳動物へ投与することを含む、請求項40に記載の方法。
- 治療的有効量の請求項33〜39のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記哺乳動物へ投与することを含む、請求項41に記載の方法。
- 前記状態が、アルツハイマー病、家族性デンマーク型認知症、家族性英国型認知症および間質性肺疾患からなる群から選択される、請求項40〜43のいずれか一項に記載の方法。
- 前記状態がアルツハイマー病である、請求項44に記載の方法。
- 前記治療が、予防的、緩和的および治癒的治療からなる群から選択される、請求項40〜45のいずれか一項に記載の方法。
- 哺乳動物におけるアミロイドタンパク質フィブリルの形成に関連する状態の治療における使用のための、(i)請求項24〜32のいずれか一項に記載のシャペロンタンパク質の単量体、および/または(ii)前記シャペロンタンパク質の三量体/単量体比を減少させることができる、請求項18〜23のいずれか一項に記載の化合物もしくは化合物の組合せの使用。
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