JP6984815B2 - 神経変性疾患タンパク質の異常凝集を伴って発症する神経疾患に対する予防又は治療剤、及び上記予防又は治療剤のスクリーニング方法 - Google Patents

Description

本発明は、神経変性疾患タンパク質の異常凝集を伴って発症する神経疾患に対する予防又は治療剤、及び上記予防又は治療剤のスクリーニング方法に関する。

アルツハイマー型認知症、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）の患者の脳からはミスフォールディングした（異常に折りたたまれた）アミロイドβの蓄積、タウタンパク質の異常凝集が見られる。また、ミスフォールディングしたポリグルタミンタンパク質の異常凝集を伴って発症する疾患（ポリグルタミン病）としてハンチントン病（以下ＨＤともいう。）も知られている。

ＨＤは、３１４５アミノ酸残基のハンチンチン（以下、Ｈｔｔともいう。）タンパク質の変異（以下、変異Ｈｔｔともいう。）によって起こる病である。Ｈｔｔタンパク質をコードするＨｔｔ遺伝子は、ヒト第４染色体短腕４ｐ１６．３に位置する。ＨＤは、Ｈｔｔ遺伝子のエクソン１におけるＣＡＧ（グルタミンをコード）反復伸長が関連する常染色体優性疾患である。
ＣＡＧの繰り返しが増加した変異Ｈｔｔ遺伝子からはアミノ末端のグルタミンの連続が長くなった変異Ｈｔｔタンパク質が作られ、このような変異Ｈｔｔタンパク質は特に異常凝集を起こしやすくなっている。
ＨＤ疾患モデルとして、Ｒ６／２マウスの病態のいくつかの特徴はヒトＨＤをミミックしていると一般的に受け入れられている。例えば、Ｈｔｔのエクソン１−Ｑ１２０±５を発現するＲ６／２トランスジェニックマウスは、ＨＤ疾患モデルとして長い歴史がある（例えば、非特許文献１）。
Ｋｕ７０はＨｔｔタンパク質と直接相互作用するタンパク質であることが知られ（例えば、非特許文献２）、Ｋｕ７０のトランスジェニック過剰発現が、Ｒ６／２マウスＨＤモデルの寿命を最も延長する物質の１つであることが知られている（非特許文献２）。

Ｍａｎｇｉａｒｉｎｉ，Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｅｘｏｎ１ ｏｆ ｔｈｅ ＨＤｇｅｎｅ ｗｉｔｈ ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ＣＡＧ ｒｅｐｅａｔｉｓ ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｏ ｃａｕｓｅ ａ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ． Ｃｅｌｌ ８７，４９３−５０６（１９９６）． Ｅｎｏｋｉｄｏ，Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｍｕｔａｎｔ ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ ｉｍｐａｉｒｓ Ｋｕ７０−ｍｅｄｉａｔｅｄ ＤＮＡ ｒｅｐａｉｒ． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １８９，４２５−４４３（２０１０）．

上記従来技術に鑑み、本発明者は、神経変性疾患タンパク質の異常凝集を伴って発症する神経疾患（例えば、アルツハイマー型認知症、ＦＴＬＤ、ＨＤ等）に対する予防又は治療剤を開発する観点から、変異Ｈｔｔにより機能が損なわれ得る神経細胞における非常に重要なＤＮＡ損傷修復タンパク質であるＫｕ７０と変異Ｈｔｔとの間の相互作用を阻害する化合物をスクリーニングした結果、神経変性疾患タンパク質の異常凝集を伴って発症する神経疾患に対する予防又は治療剤の候補化合物を見出した。

すなわち、本発明は、神経変性疾患タンパク質の異常凝集を伴って発症する神経疾患（例えば、アルツハイマー型認知症、ＦＴＬＤ、ＨＤ等）に対する予防又は治療剤、及び上記予防又は治療剤をスクリーニングする方法の提供を目的とする。

本発明者は、上記目的について鋭意研究した結果、ヘプタヒスチジン等の特定の化合物が変異Ｈｔｔペプチド断片の凝集を変化させること、及びタウタンパク質のＲ３イソフォームペプチド断片の凝集の動態を変化させることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。

（１）神経変性疾患タンパク質の異常凝集を伴って発症する神経疾患に対する予防又は治療剤であって、ヘプタ−ヒスチジン、アンジオテンシンＩＩＩ、黄体形成ホルモン放出ホルモンペプチド断片、ヘプタ−グルタミン、ケンプチド酢酸塩、及びそれら化合物と同一性８０％以上のアミノ酸配列からなりかつ上記神経変性疾患タンパク質と直接相互作用するタンパク質に対する親和性を有する化合物、並びに、ノルジヒドログアイアレチン酸エステル、スフィンゴシン−１−フォスフェート、及びそれら化合物の化学修飾化合物よりなる群から選択される少なくとも１つの化合物を有効成分とする、予防又は治療剤。
（２）上記化合物が、上記神経変性疾患タンパク質の凝集の動態を変化させる化合物である、上記（１）に記載の予防又は治療剤。
（３）上記神経変性疾患タンパク質がアミロイドβ、タウタンパク質又はポリグルタミン病タンパク質である、（１）又は（２）に記載の予防又は治療剤。
（４）上記ポリグルタミン病タンパク質がＨｔｔタンパク質である、（３）に記載の予防又は治療剤。
（５）上記神経変性疾患タンパク質の異常凝集を伴って発症する神経疾患が、アルツハイマー型認知症、ＦＴＬＤ又はＨＤである、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の予防又は治療剤。

（６）神経変性疾患タンパク質と直接相互作用するタンパク質の親和性に対する被験物質の影響を指標として、上記神経変性疾患タンパク質の異常凝集を伴って発症する神経疾患に対する予防又は治療剤をスクリーニングする方法。
（７）上記予防又は治療剤が、上記神経変性疾患タンパク質の凝集の動態を変化させる化合物である、（６）に記載の予防又は治療剤をスクリーニングする方法。
（８）上記被験物質がヘプタ−ヒスチジン、アンジオテンシンＩＩＩ、黄体形成ホルモン放出ホルモンペプチド断片、ヘプタ−グルタミン、ケンプチド酢酸塩、及びそれら化合物と同一性８０％以上のアミノ酸配列からなりかつ上記神経変性疾患タンパク質と直接相互作用するタンパク質に対する親和性を有する化合物、並びに、ノルジヒドログアイアレチン酸エステル、スフィンゴシン−１−フォスフェート、及びそれら化合物の化学修飾化合物よりなる群から選択される少なくとも１つの化合物である、（６）又は（７）に記載のスクリーニングする方法。
（９）上記神経変性疾患タンパク質と直接相互作用するタンパク質に対する上記被験物質の親和性を単一分子蛍光分光法により測定する工程を含む（６）〜（８）のいずれか１項に記載のスクリーニングする方法。
（１０）上記神経変性疾患タンパク質がアミロイドβ、タウタンパク質又はポリグルタミン病タンパク質である、（６）〜（９）のいずれか１項に記載のスクリーニングする方法。
（１１）上記ポリグルタミン病タンパク質がＨｔｔタンパク質である、（１０）に記載のスクリーニングする方法。
（１２）上記神経変性疾患タンパク質の異常凝集を伴って発症する神経疾患が、アルツハイマー型認知症、ＦＴＬＤ又はＨＤである、（６）〜（１１）のいずれか１項に記載のスクリーニングする方法。

本発明によれば、神経変性疾患タンパク質の異常凝集を伴って発症する神経疾患（例えば、アルツハイマー型認知症、ＦＴＬＤ、ＨＤ等）に対する予防又は治療剤、及び上記予防又は治療剤をスクリーニングする方法を提供することができる。

本発明の第２の態様に係るスクリーニング方法の概要を示す図である。 （ａ）、（ｂ）は、様々な長さのポリＱと、Ｋｕ７０タンパク質の様々なセグメントとの間の分子ドッキングシミュレーション結果を示す図であり、（ｃ）は、サイト４に対する１〜１０残基のポリアミノ酸のＬｉｂＤｏｃｋスコアを示す図であり、（ｄ）は様々な長さのポリＨのＬｉｂＤｏｃｋスコアを示す図である。 ハエスクリーニング結果を示す図である。 マウススクリーニング結果を示す図である。 ＧＳＴ−ＨｔｔＥｘｏｎ１−１１０Ｑの凝集の動的光散乱の結果を示す図である。 Ｒ３イソフォームペプチド断片の凝集の動的光散乱の結果を示す図である。 （ａ）は、分化７日目の神経突起長を示す図であり、（ｂ）は、分化１４日目の分化１４日目で樹状突起の長さ及び分岐点数を示す図であり、（ｃ）は、分化１４日目のスパイン密度を示す図であり、（ｄ）は、分化１４日目のＨｔｔ包含体陽性神経細胞数を示す図である。 スフィンゴシン−１−フォスフェートによる変異Ｈｔｔノックインマウスの運動機能障害の回復を示す図である。 （ａ）は、ＹＡＰのシグナル強度を、各グループの４匹のマウスからの１００ニューロンにおいて定量した結果、各グループの４匹のマウスからの線条体における１０視野から％Ｈｔｔ包含体陽性細胞を定量した結果を示す図である。（ｂ）は、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理的食塩水）注射ＷＴマウスグループ（対照：Ｃ５７ＢＬ／６）、ＰＢＳ注射変異Ｈｔｔ−ＫＩマウスグループ及びＳ１Ｐ注射変異Ｈｔｔ−ＫＩマウスグループ（Ｎ＝３）の４２０、５０９及び５０７細胞から、細胞当たりのＥＲ−ＣＦＰ体積及びシグナル強度を算出した結果を示す図である。

以下、本発明の実施態様について詳細に説明するが、本発明は、以下の実施態様に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。
本明細書では、アミノ酸配列におけるアミノ酸残基を、当該技術分野で周知の一文字表記（例えば、グリシン残基を「Ｇ」）又は三文字表記（例えば、グリシン残基を「Ｇｌｙ」）で表記する場合がある。

＜神経変性疾患タンパク質の異常凝集を伴って発症する神経疾患に対する予防又は治療剤＞
本発明の第１の態様に係る発明は、神経変性疾患タンパク質の異常凝集を伴って発症する神経疾患に対する予防又は治療剤であって、ヘプタ−ヒスチジン（ＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号１））（以下、７Ｈともいう。）、アンジオテンシンＩＩＩ（ＲＶＹＩＨＰＦ（配列番号２））、黄体形成ホルモン放出ホルモンペプチド断片４−１０（ＳＹＧＬＲＰＧ（配列番号３）−ＮＨ_２）（以下、（ＬＨ−ＲＨ４−１０ペプチド断片ともいう。）、ヘプタ−グルタミン（ＱＱＱＱＱＱＱ（配列番号４））（以下、７Ｑともいう。）、ケンプチド酢酸塩（ＬＲＲＡＳＬＧ（配列番号５））、及びそれら化合物と同一性８０％以上のアミノ酸配列からなりかつ上記神経変性疾患タンパク質と直接相互作用するタンパク質に対する親和性を有する化合物、並びに、ノルジヒドログアイアレチン酸エステル、スフィンゴシン−１−フォスフェート（以下、Ｓ１Ｐともいう。）、及びそれら化合物の化学修飾化合物よりなる群から選択される少なくとも１つの化合物を有効成分とする、予防又は治療剤である。

本明細書で言う「同一性８０％以上のアミノ酸配列」とは、７Ｈ、アンジオテンシンＩＩＩ、ＬＨ−ＲＨ４−１０ペプチド断片、７Ｑ、ケンプチド酢酸塩のアミノ酸配列上の置換、挿入、欠失等による変異ペプチドであって、アミノ酸の同一性が８０％以上であることを意味し、同一性は好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９７％以上である。
アミノ酸の側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるものであるが、実質的にペプチドの３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が、経験的にまた物理化学的な実測により知られている。例えば、アミノ酸残基の置換としては、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）又はバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）又はＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）等が挙げられる。特に、７Ｈにおける少なくとも１つのＨの他の極性側鎖アミノ酸残基（例えば、Ｑ）への置換、７Ｑにおける少なくとも１つのＱの他の極性側鎖アミノ酸残基（例えば、Ｈ）への置換等も挙げられる。
ノルジヒドログアイアレチン酸エステルの化学修飾化合物、スフィンゴシン−１−フォスフェート（以下、Ｓ１Ｐともいう。）の化学修飾化合物における化学修飾としては、構成炭素原子の任意の位置の炭素数１〜３の直鎖状又は分岐状アルキル基（例えばメチル基、エチル基、イソプロピル基等）によるアルキル化修飾等が挙げられる。

本発明において、上記神経変性疾患タンパク質と直接相互作用するタンパク質とは、上記神経変性疾患タンパク質に直接結合するタンパク質又は上記神経変性疾患タンパク質に他の物質を介して間接的に結合するタンパク質を意味する。
上記神経変性疾患タンパク質と直接相互作用するタンパク質としては、Ｈｔｔタンパク質と直接相互作用するタンパク質であり、かつ変異Ｈｔｔにより機能が損なわれ得る神経細胞におけるＤＮＡ損傷修復タンパク質であるＫｕ７０タンパク質等が挙げられる。

第１の態様に係る予防又は治療剤において、上記化合物が、後述の実施例、図５及び６に示したように、上記神経変性疾患タンパク質の凝集の動態を変化させる化合物であることが好ましい。
上記神経変性疾患タンパク質の凝集の動態の変化は、動的光散乱（ＤＬＳ）により測定することができる。

第１の態様に係る予防又は治療剤において、上記神経変性疾患タンパク質がアミロイドβ、タウタンパク質又はポリグルタミン病タンパク質であることが好ましい。
上記ポリグルタミン病タンパク質としては、Ｈｔｔタンパク質、アタキシン１、アタキシン２、アタキシン３、アタキシン６、アタキシン７、ＴＡＴＡ結合タンパク質、アトロフィン、アンドロジェン受容体等が挙げられ、Ｈｔｔタンパク質であることが好ましい。
アルツハイマー型認知症もしくはＦＴＬＤ等の発症は、アミロイドβとタウタンパク質、もしくは、タウタンパク質、ＴＤＰ４３タンパク質、ＦＵＳタンパク質などの異常凝集に伴うことが知られている。
ハンチントン病の発症は、Ｈｔｔタンパク質の異常凝集に伴うことが知られている。
第１の態様に係る予防又は治療剤において、上記神経変性疾患タンパク質の異常凝集を伴って発症する神経疾患が、アルツハイマー型認知症、ＦＴＬＤ又はＨＤであることが好ましい。

第１の態様に係る予防又は治療剤は、経口または非経口的に全身又は局所的に投与することができる。非経口的な投与方法としては、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などを挙げることができる。患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。その投与量は、年齢、投与経路、投与回数により異なり、当業者であれば適宜選択できる。
非経口投与に適した製剤形態として、例えば安定剤、緩衝剤、保存剤、等張化剤等の添加剤を含有したものは挙げられ、さらに薬学的に許容される担体や添加物を含むものでもよい。このような担体及び添加物の例として、水、有機溶剤、高分子化合物（コラーゲン、ポリビニルアルコールなど）、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ツルビトール、ラクトース、界面活性剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

有効成分である第１の態様に係る予防又は治療剤の投与量としては、一般的には一回につき体重１ｋｇあたり０．１μｇ〜１００ｍｇ程度の範囲である。

＜神経変性疾患タンパク質の異常凝集を伴って発症する神経疾患に対する予防又は治療剤をスクリーニングする方法＞
本発明の第２の態様に係る発明は、神経変性疾患タンパク質と直接相互作用するタンパク質の親和性に対する被験物質の影響を指標として、上記神経変性疾患タンパク質の異常凝集を伴って発症する神経疾患に対する予防又は治療剤をスクリーニングする方法である。
第２の態様に係るスクリーニング方法において、スクリーニングとは、上記神経変性疾患タンパク質と直接相互作用するタンパク質の親和性に対する被験物質の影響を指標として、被験物質の母集団を少なくとも絞ることを意味する。
第２の態様に係るスクリーニング方法において、上記神経変性疾患タンパク質と直接相互作用するタンパク質としてはＫｕ７０タンパク質等が挙げられる。
第２の態様に係るスクリーニング方法において、上記予防又は治療剤が、上記神経変性疾患タンパク質の凝集の動態を変化させる化合物であることが好ましい。

第２の態様に係るスクリーニング方法に供される被験物質としては任意の物質を使用することができる。被験物質の種類は特に限定されず、合成ペプチド（オリゴないしポリペプチド）でもよし、核酸分子でもよいし、抗体でもよく、個々の低分子合成化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよい。あるいは、被験物質はまた、合成ペプチド（オリゴないしポリペプチド）ライブラリー、化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリーもしくはコンビナトリアルライブラリーでもよく、特に、後述のインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）のスクリーニング方法を行う場合には仮想ライブラリーであってもよい。
合成ペプチド（オリゴないしポリペプチド）ライブラリー、化合物ライブラリー又は仮想ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の合成ペプチド（オリゴないしポリペプチド）ライブラリー、仮想ライブラリー、化合物ライブラリー又は仮想ライブラリーを使用することもできる。

被験物質は、合成ペプチド（合成ペプチドライブラリー）、低分子化合物（例えば、化合物ライブラリー）、核酸分子又は抗体であることが好ましい。
なお、後述の実施例においては、１９４６８種の低分子化合物ライブラリー、３０１０３２１種の仮想ライブラリー、アミノ酸１０残基以下のポリアミンライブラリーを用いた。
上記被験物質としては、ヘプタ−ヒスチジン、アンジオテンシンＩＩＩ、ＬＨ−ＲＨ４−１０ペプチド断片、ヘプタ−グルタミン、ケンプチド酢酸塩、及びそれら化合物と同一性８０％以上のアミノ酸配列からなりかつ上記神経変性疾患タンパク質と直接相互作用するタンパク質に対する親和性を有する化合物、並びに、ノルジヒドログアイアレチン酸エステル、スフィンゴシン−１−フォスフェート、及びそれら化合物の化学修飾化合物よりなる群から選択される少なくとも１つの化合物であることがより好ましい。

第２の態様に係るスクリーニング方法において、上記神経変性疾患タンパク質と直接相互作用するタンパク質（例えば、Ｋｕ７０タンパク質）に対する被験物質の親和性を評価して、神経変性疾患タンパク質の異常凝集を伴って発症する神経疾患に対する予防又は治療剤候補を選定することが好ましい。
第２の態様に係るスクリーニング方法において、スクリーニング方法としては、神経変性疾患タンパク質と直接相互作用するタンパク質（例えば、Ｋｕ７０タンパク質）に対する被験物質の親和性を指標とする限り、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）、インシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）等の任意のスクリーニング方法であってもよい。

第２の態様に係るスクリーニング方法において、インビトロにおいて、上記神経変性疾患タンパク質と直接相互作用するタンパク質に対する被験物質の親和性を評価する工程として、上記被験物質の上記タンパク質に対する親和性を単一分子蛍光分光法により評価して、上記予防又は治療剤候補を選定する工程を含むことが好ましい。
単一分子蛍光分光法によれば、タンパク質−タンパク質間相互作用（タンパク質のいずれか一方を蛍光標識することが好ましい。）を、被験物質存在下における測定値と、被験物質非存在下における測定値とを比較することにより、被験物質の上記タンパク質に対する親和性を測定することができる。
後述の実施例においては、タンパク質精製のためのＨｉｓタグを付したＫｕ７０タンパク質（以下、Ｈｉｓタグ−Ｋｕ７０タンパク質ともいう。）を任意の蛍光試薬で蛍光標識したＫｕ７０タンパク質と、タンパク質精製のためのＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）タグを付したＨｔｔタンパク質（以下、ＧＳＴ−Ｈｔｔタンパク質ともいう。）とを用いてタンパク質−タンパク質間相互作用を測定した。
単一分子蛍光分光法に用いる装置としてはＭＦ２０（オリンパス社製）等が挙げられる。

第２の態様に係るスクリーニング方法において、インシリコにおいて、上記神経変性疾患タンパク質と直接相互作用するタンパク質に対する被験物質の親和性を評価する工程として、上記被験物質の上記タンパク質に対する親和性を分子ドッキングシミュレーションにより評価して、上記予防又は治療剤候補を選定する工程であることが好ましい。
変異ＨｔｔＥｘｏｎ１と相互作用することが知られているＫｕ７０タンパク質のＮ末端領域であるサイト４（非特許文献２）と、被験物質との分子ドッキングシミュレーションを行うことが好ましい。
分子ドッキングシミュレーションは、例えば、ディスカバリースタジオ２．５（Ｄａｓｓａｕｌｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＢＩＯＶＩＡ社製）によって行うことができる。
ＬｉｂＤｏｃｋはレセプター上の結合サイトへのリガンドのドッキングのためのハイスループットアルゴリズムである。
ＬｉｂＤｏｃｋスコアによりリガンドの親和性を測定することができる。

また、分子ドッキングシミュレーションにおいては、被験物質として仮想ライブラリーを使用することができ、仮想ライブラリーとしては、市販化合物のデータベースＣｈｅｍｉｃａｌ Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｐｕｒｃｈａｓｅ（ＣＡＰ）２００６（Ｄａｓｓａｕｌｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＢＩＯＶＩＡ社製）等が挙げられる。

第２の態様に係るスクリーニング方法において、インビボにおけるスクリーニング工程としては、アルツハイマー型認知症の生物（例えば、ショウジョウバエ、マウス、ラット等）モデル、ＦＴＬＤ生物モデル又はＨＤ生物モデルに被験物質を投与して、寿命、体重又は運動神経機能（例えばロータロッド）等を評価して、上記予防又は治療剤候補を選定するスクリーニング工程が挙げられる。
第２の態様に係るスクリーニング方法において、インビボにおけるスクリーニング工程としては、ショウジョウバエＨＤモデル及びマウスＨＤモデルよりなる群から選択される少なくともいずれかのモデルに被験物質を投与して、寿命、体重又は運動神経機能を評価して、上記予防又は治療剤候補を選定するスクリーニング工程であることが好ましい。

上記ショウジョウバエＨＤモデルとしては、「Ｂａｒｃｌａｙ， Ｓ．Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｓｙｓｔｅｍｓ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｉｎ ｖｉｖｏ ｓｃｒｅｅｎ ｄａｔａ ｅｌｕｃｉｄａｔｅｓ ｃｏｒｅ ｎｅｔｗｏｒｋｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｒｅｐａｉｒ ｉｎ ＳＣＡ１． Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ２３， １３４５−１３６４ （２０１４）．」、「Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ， Ｒ．， Ｔａｍｕｒａ， Ｔ．， Ｓｏｎｅ， Ｍ． ＆ Ｏｋａｚａｗａ， Ｈ． Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｆｌｙ ｍｏｄｅｌｓ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｒｉｖｅｒｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｔａｘｉｎ−１ ａｎｄ ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ ｉｎ ｎｅｕｒｏｎ ｓｕｂｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９， ｅ１１６５６７（２０１４）．」に開示されているショウジョウバエＨＤモデルを用いることができる。
上記ショウジョウバエＨＤモデルは、ＯＫ６運動ニューロン固有のドライバの制御下で、運動ニューロン内でＨｔｔタンパク質を発現し、化学的又は遺伝的スクリーニングにおける表現型マーカーとして寿命を使用することができる。

上記マウスＨＤモデルとしてはＲ６／２トランスジェニックマウスを用いることができる。Ｒ６／２トランスジェニックマウスは変異Ｈｔｔのエクソン１を発現し、最も早く発症し得、最も寿命が短くし得る。様々なマウスＨＤモデルに比べて最も重篤な症状ともし得る。Ｒ６／２トランスジェニックマウスは最短期間内で複数の被験物質をスクリーニングするために最も効率的といえる（Ｅｈｒｎｈｏｅｆｅｒ， Ｄ．Ｅ．， Ｂｕｔｌａｎｄ， Ｓ．Ｌ．， Ｐｏｕｌａｄｉ， Ｍ．Ａ． ＆ Ｈａｙｄｅｎ， Ｍ．Ｒ． Ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ： ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｏｎ ａ ｔｈｅｍｅ． Ｄｉｓ Ｍｏｄｅｌ Ｍｅｃｈ ２，１２３−１２９ （２００９）．）。

インビボスクリーニングにおいて寿命を評価する場合には、ログランク検定により評価することができる。
例えば、一般的な５％水準で検定を行うのであれば、このときの有意確率（Ｐ）が０．０５未満になる場合に、帰無仮説を棄却して、被験物質投与群と、被験物質非投与群との間に有意差ありとすることができる。

第２の態様に係るスクリーニング方法は、インビトロにおいて、上記被験物質の上記タンパク質に対する親和性を単一分子蛍光分光法により評価して、上記予防又は治療剤候補を選定する工程と、インシリコにおいて、上記被験物質の上記タンパク質に対する親和性を分子ドッキングシミュレーションにより評価して、上記予防又は治療剤候補を選定する工程とを組み合わせて含むことが好ましい。
第２の態様に係るスクリーニング方法は、インビボにおいて、アルツハイマー型認知症生物モデル、ＦＴＬＤ生物モデル又はＨＤ生物モデルに被験物質を投与して、寿命、体重又は運動神経機能（例えばロータロッド）等を評価して、上記予防又は治療剤候補を選定するスクリーニング工程を更に含むことがより好ましい。

第２の態様に係るスクリーニング方法において、上記神経変性疾患タンパク質がアミロイドβ、タウタンパク質又はポリグルタミン病タンパク質であることが好ましい。
上記ポリグルタミン病タンパク質としては、Ｈｔｔタンパク質、アタキシン１、アタキシン２、アタキシン３、アタキシン６、アタキシン７、ＴＡＴＡ結合タンパク質、アトロフィン、アンドロジェン受容体等が挙げられ、Ｈｔｔタンパク質であることが好ましい。
第２の態様に係るスクリーニング方法において、上記神経変性疾患タンパク質の異常凝集を伴って発症する神経疾患が、アルツハイマー型認知症、ＦＴＬＤ又はＨＤであることが好ましい。

図１は第２の態様に係るスクリーニング方法の概要を示す図である。
図１に示したように、インビトロにおいて、上記被験物質の上記タンパク質に対する親和性を単一分子蛍光分光法により評価して、上記予防又は治療剤候補を選定する工程と、インシリコにおいて、上記被験物質の上記タンパク質に対する親和性を分子ドッキングシミュレーションにより評価して、上記予防又は治療剤候補を選定する工程とを組み合わせて第１のスクリーニング工程とし、
第１のスクリーニング工程で選定された上記予防又は治療剤候補を、上記タンパク質に対する親和性を単一分子蛍光分光法により評価して、上記予防又は治療剤候補を更に選定する工程を第２のスクリーニング工程とし、
第２のスクリーニング工程で選定された上記予防又は治療剤候補を、インビボにおけるスクリーニング工程としては、ショウジョウバエＨＤモデルに投与して、寿命を評価して、上記予防又は治療剤候補を更にまた選定するスクリーニング工程を第３のスクリーニング工程とし、
第３のスクリーニング工程で選定された上記予防又は治療剤候補を、マウスＨＤモデルに投与して、寿命、体重又は運動神経機能を評価して、上記予防又は治療剤候補を更にまた選定するスクリーニング工程を第４のスクリーニング工程とすることもできる。

（神経変性疾患タンパク質の異常凝集を伴って発症する神経疾患に対する予防又は治療効果の確認）
例えば、神経変性疾患タンパク質の異常凝集を伴って発症する神経疾患患者のｉＰＳ細胞から分化した初代ニューロンの形態学的異常の治癒を、任意のマーカーを認識する任意の蛍光標識抗体を使用して顕微鏡観察により確認することができる。

以下、実施例を示して本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例に限定されるものではない。

＜ＧＳＴ−Ｈｔｔタンパク質及びＨｉｓタグ−Ｋｕ７０タンパク質の調製＞
まず、インビトロにおける単一分子蛍光分光法によるスクリーニング工程において使用するＧＳＴ−Ｈｔｔタンパク質及びＨｉｓタグ−Ｋｕ７０タンパク質を調製した。
（ＧＳＴ−Ｈｔｔベクター及びＨｉｓ−Ｋｕ７０ベクターの構築）
１１０又は２０ＣＡＧリピートを含むヒトＨｔｔ遺伝子エクソン１のｃＤＮＡをｐＧＥＸ−３Ｘ（ＧＥヘルスケア社製）にサブクローニングした。
マウスＫｕ７０ ｃＤＮＡは、５’−ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＡＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＣＴＡ−３’プライマー（配列番号６）及び５’−ＡＡＡＣＴＣＧＡＧＴＧＴＴＣＴＴＣＴＣＣＡＡＧＴＧＴＣＴＧＡ−３’プライマー（配列番号７）を用いて、ＲＩＫＥＮ ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｍｏｕｓｅ ｃＤＮＡライブラリーから増幅し、ｐＥＴ２８（ａ）（クロンテック社製）のＢａｍＨＩ部位及びＸｈｏＩ部位にサブクローニングした。

（ＧＳＴ−Ｈｔｔタンパク質及びＨｉｓタグ−Ｋｕ７０タンパク質の発現及び精製）
ＧＳＴ−Ｈｔｔタンパク質のためのプラスミド及びＨｉｓタグ−Ｋｕ７０タンパク質のためのプラスミドは、大腸菌ロゼッタ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のコンピテントセルに形質転換した。
形質転換細胞は３７℃、２００ｒｐｍでシェーカーで培養した。波長６００ｎｍにおけるＯＤが０．３に達したときに、ＩＰＴＧ（１．０ｍＭの最終濃度）を添加し、さらに３７℃２時間２００ｒｐｍでインキュベートした。
大腸菌細胞を遠心分離により回収し、ＧＳＴ−Ｈｔｔタンパク質については０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％リゾチーム（Ｓｉｇｍａ社）、及び１／５００プロテアーゼ阻害剤カクテルＩＩＩ−ＥＤＴＡフリー（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を含むＰＢＳ２０ｍｌ中で溶菌し、Ｈｉｓタグ−Ｋｕ７０タンパク質については、１０ｍＭイミダゾール、１％トリトンＸ−１００、及び１／５００プロテアーゼ阻害剤カクテルＩＩＩ−ＥＤＴＡフリー（ｐＨ８．０）を含むＰＢＳ２０ｍｌ中で溶菌した。

出力レベル６（超音波ホモジナイザー：ＵＨ−５０、ＳＭＴ社製）を使用して懸濁液を１分間隔で１５秒間７回超音波処理し、４℃で２０分間１２，０００×ｇで遠心分離した。
ＧＳＴ−Ｈｔｔタンパク質については、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで平衡化した５０％グルタチオンセファロース４Ｂ（ＧＥヘルスケア社製）の４ｍｌに上清を混合し、Ｈｉｓタグ−Ｋｕ７０タンパク質については、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで平衡化したＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ社）の４ｍｌに上清を混合した。その後、４℃で３時間ゆっくり回転した。ＧＳＴ−Ｈｔｔ懸濁液は、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ３２ｍｌ（ｐＨ８．０）で洗浄したグルタチオンセファロース４Ｂカラムに４℃で適用し、４℃で０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ中１０ｍＭグルタチオン４ｍｌで重力流により４回溶出した。
Ｈｉｓタグ−Ｋｕ７０懸濁液は、１％トリトンＸ−１００を含有するＰＢＳ中２０ｍＭイミダゾール３２ｍｌ（ｐＨ８．０）で洗浄したＮｉ−ＮＴＡアガロースカラムに４℃で適用し、２５０ｍＭイミダゾール中の１０ｍＭグルタチオン４ｍｌで重力流により４回溶出した。
各画分を、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳの２Ｌで２回、４℃で１２時間透析し、撹拌した。
タンパク質標識キット（４８８ｎｍ及び６３３ｎｍ）（オリンパス社製）を用いて精製されたＫｕ７０タンパク質を蛍光色素で標識した。

＜第１スクリーニングとしての単一分子蛍光分光法によるインビトロスクリーニング＞
室温で共焦点レーザー顕微鏡を使用して３８４ウェルのガラス底プレートの４０μｌ／ウェルのサンプルの単一分子蛍光を検出するＭＦ２０（オリンパス社製）を用いて蛍光強度分布解析分極（ＦＩＤＡ−ＰＯ）分析及び蛍光相関分光法（ＦＣＳ）分析を行った。
各サンプルは、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０及び１％ＤＭＳＯを含有するＰＢＳ中５ｎＭの蛍光標識Ｋｕ７０タンパク質を含有した。
ＦＩＤＡ−ＰＯ及びＦＣＳの取得したデータはボンフェローニ／ダン検定を用いて分析した。合計で、東京医科歯科大学のケミカルバイオロジースクリーニングセンター（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｃｈｐｃ５．ｔｍｄ．ａｃ．ｊｐ：３０００／ｃｂｄｂ）からの１９，４６８種の化合物を第１スクリーニングとしてスクリーニングした。
その結果のトップ１７７を第２スクリーニングである、再度の単一分子蛍光分光法によるインビトロスクリーニングに供した。

＜インシリコスクリーニング＞
全てのドッキングシミュレーションは、ディスカバリースタジオ２．５（Ｄａｓｓａｕｌｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＢＩＯＶＩＡ社製）及び市販化合物のデータベースＣｈｅｍｉｃａｌ Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｐｕｒｃｈａｓｅ（ＣＡＰ）２００６（Ｄａｓｓａｕｌｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＢＩＯＶＩＡ社製）を用い、ＬｉｂＤｏｃｋを使用して行った。
ポリ（アミノ酸）の構造（１０残基以下）は、「Ｂｕｉｌｄ ａｎｄ Ｅｄｉｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ」コマンドを使用して生成し、ディスカバリースタジオ３．０における結合シミュレーションに使用した。
ＤＮＡに結合したＫｕヘテロダイマーの結晶構造（ＰＤＢ ＩＤ：１ＪＥＹ）を、構造バイオインフォマティクス研究コラボレート（ＲＣＳＢ）タンパク質データバンク（ＰＤＢ）からダウンロードし、単離されたＫｕ７０の結晶構造は複合体（１ＪＥＹ）からインポートした（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｅｘｐｌｏｒｅ／ｅｘｐｌｏｒｅ．ｄｏ？ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｉｄ＝１ＪＥＹ）。

図２（ａ）は、様々な長さのポリＱと、Ｋｕ７０タンパク質の様々なセグメント（サイト１〜２６）との間の分子ドッキングシミュレーションを行った。
結果を図２（ａ）、（ｂ）に示す。
Ｋｕ７０タンパク質のＮ末端領域であるサイト４は、変異ＨｔｔＥｘｏｎ１と相互作用することが知られている（非特許文献２）。
図２（ａ）から明らかなように、Ｎ末端領域であるサイト４にある窪みにポリＱが結合することがわかった。

図２（ｂ）に示した結果から明らかなように、６Ｑはサイト４に対し最も親和性が高く、ポリＱの長さが短いほど、親和性が低くなることがわかる。
７Ｑ以上の長さのポリＱはソフトウエアのアルゴリズムの限界と思われる原因によりシミュレートし得なかった。
図２（ｃ）は、サイト４に対する１〜１０残基の様々なポリアミノ酸のＬｉｂＤｏｃｋスコアを示す図であり、（ｄ）は様々な長さのポリＨのＬｉｂＤｏｃｋスコアを示す図である。
図２（ｃ）及び（ｄ）から明らかなように、７Ｈが最もサイト４に対して親和性が高いポリアミノ酸であることがシミュレートされた。

上記結果に基づき、上記仮想ライブラリーからの３，０１０，１２１種の化合物のサイト４に対する親和性をＬｉｂＤｏｃｋスコアに基づきスクリーニングした。
その結果のトップ２０を第２スクリーニングの単一分子蛍光分光法によるインビトロスクリーニングに供した。
＜第２スクリーニングとしての単一分子蛍光分光法によるインビトロスクリーニング＞
第１スクリーニングとしての単一分子蛍光分光法によるインビトロスクリーニングと同様な方法により第１スクリーニングで選抜された化合物を更にスクリーニングした。
その結果、５９種の化合物が選抜された。

＜第３スクリーニングとしてのハエスクリーニング＞
５９種の化合物のうちの３種は合成困難であったことから、５６種について、以下の第３スクリーニングとしてのショウジョウバエＨＤモデルを用いたインビボスクリーニングに供した。
（ハエの調製）
全てのハエは、特に断りのない限り、コーンミール培地（９．２％コーンミール、３．８５％酵母、３．８％スクロース、１．０５％酒石酸カリウム、０．０９％塩化カルシウム、７．６％グルコース、２．４１６％のｎｉｐａｇｉｎ、１％寒天）で飼育し、１２時間：１２時間の明暗サイクルで２５℃湿度６０％±１０％で維持した。
ＵＡＳ−Ｈｔｔ１０３Ｑトランスジェニックハエ及びＯＫ６−Ｇａｌ４トランスジェニックハエ（Ｔａｍｕｒａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｋｕ７０ ａｌｌｅｖｉａｔｅｓ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ６，ｅ２７４０８（２０１１）．）を交配して、Ｆ１処女雌ハエを、寿命のスクリーニングに供した。
スクリーニングのための化合物又はペプチドは、５ｍＭで蒸留水又はエタノールに溶解させ、９倍量のコーンミール培地で５００μＭの最終濃度になるように均一に混合した。
対照培地として蒸留水又はエタノールのみ加えた。
２０匹の処女雌ハエは、バイアルごとに維持し、２〜３日ごとに新鮮な培地を使用した新しいバイアルに移した。死んだハエの数を２〜３日ごとに定量した。

（統計）
ハエモデルの寿命アッセイ及び後述のマウスモデルの寿命アッセイのために、ログランク検定を用いた。他の生物学的分析は、データが正規分布に従うとみなされ、平均±標準誤差として表した。スチューデントｔ−検定は２群比較（化学処理群対ＰＢＳ適用群）のために適用した。多重グループの比較のため、チューキーのＨＳＤ検定またはＤｕｎｎｅｔｔの比較を適用した。有意水準１％又は５％に設定した。

結果を図３に示す。
図３に示したように、６の化合物で寿命延長効果がみられた。
すなわち、ｐ＜０．０１でのログランク検定での寿命延長効果が、７Ｈ、アンジオテンシンＩＩＩ、ケンプチド酢酸塩で見られた。
また、ｐ＜０．０５でのログランク検定での寿命延長効果が、７Ｑ、ＬＨ−ＲＨ４−１０ペプチド断片、ノルジヒドログアイアレチン酸エステルで見られた。
寿命の延長は長くはなかったが、再現性ある結果であった。
結果を下記表１にまとめる。

＜第４スクリーニングとしてのマウスＨＤモデルを用いたスクリーニング＞
上記６化合物のうち、７Ｈ、アンジオテンシンＩＩＩ、ＬＨ−ＲＨ４−１０ペプチド断片を第４スクリーニングとしてのマウスＨＤモデルを用いたスクリーニングに供した。
（マウスの体重試験）
上記化合物を５０μｇ／ｇ体重で腹腔内注入し体重変化を測定した。
結果を図４（ａ）に示す。
図４（ａ）から明らかなように、Ｒ６／２マウスは約９週齢で体重が減少に転じた。
この体重減少は死ぬまで続くが、７Ｈ、アンジオテンシンＩＩＩの投与により体重減少が抑制されていることがわかる（各週齢でｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）。

（マウスの運動機能試験）
マウスは、１２時間の明／暗サイクル（午前８：００に点灯し午後８：００に消灯）で２２℃で維持し、水及び標準飼料ペレット（クレア齧歯類ダイエットＣＥ−２、日本クレア社製）を自由に摂取させた。ログランク検定を用いて生存曲線を分析した。
ロータロッド試験のために、マウスをロータロッド（軸径：３．２ｃｍ、車線幅５．７ｃｍ、高さ落下１６．５ｃｍ；ファイブステーションロータロッドスタンドアロンフォアマウス、ＥＮＶ−５７７Ｍ、ＭＥＤアソシエイツ社製）上に置き、回転速度を３００秒間に０ｒｐｍから３５ｒｐｍまで直線的に増加し、（４〜１２週齢のマウス用に）追加の６０秒間３５ｒｐｍに維持した。
マウスに対し３日間連続の３回の試験を行った。

結果を図４（ｂ）に示す。
図４（ｂ）から明らかなように、７Ｈは運動機能の改善がみられるが、アンジオテンシンＩＩＩは運動機能の明白な改善は見られなかった。

（Ｒ６／２トランスジェニックマウスへの被験物質投与による寿命延長試験）
雄のＲ６／２マウス及びそれらのバックグラウンドマウス（ＣＢＡ／Ｊ）は、１２時間の明／暗サイクル（午前８：００に点灯し午後８：００に消灯）で２２℃に維持し、各実験の開始に先立って、水及び標準飼料ペレット（クレア齧歯類ダイエットＣＥ−２、日本クレア社製）を自由に摂取させた。
ＰＢＳに溶解した化合物を３週齢から週一回の５０μｇ／ｇ体重でマウスに腹腔内注射した。生存率をログランク検定を用いて分析した。

結果を図４（ｃ）に示す。
図４（ｃ）から明らかなように、７Ｈ及びアンジオテンシンＩＩＩはいずれも寿命延長効果がみられた（ｐ＜０．０５）。
一方、ＬＨ−ＲＨ４−１０ペプチド断片については、３回の試験では寿命延長効果は確認できなかった。
結果を表２にまとめる。

＜動的光散乱（ＤＬＳ）による神経変性疾患タンパク質の異常凝集の動態変化の確認＞
（ＤＬＳ分析（１））
ＤＬＳは、ゼータサイザーμＶ機器（マルバーン社製）で、化合物の存在下及び非存在下でハンチンチンの凝集の時間経過をモニターした。１０μＭのタンパク質を、６日間ＰＢＳ緩衝液中で２５℃で各３種の化合物５００μＭとともにインキュベートし、そのＤＬＳシグナルを数時間毎に記録した。用語「Ｚ平均サイズ」は、「凝集の指標（ＩＳＯ−２２４１２：２００８）」として適用した。各測定は４回繰り返し、４回の測定の平均値を算出した。
結果を図５に示す。
図５中、対照は化合物非存在下１０μＭのＧＳＴ−ＨｔｔＥｘｏｎ１−１１０Ｑである。
Ｎｏ．１は５００μＭの７Ｈ存在下であり、Ｎｏ．２は５００μＭのアンジオテンシンＩＩＩ存在下であり、Ｎｏ．３は５００μＭの黄体形成ホルモン放出ホルモン断片４−１０存在下である。

図５に示した結果から明らかなように、７Ｈ、アンジオテンシンＩＩＩ、黄体形成ホルモン放出ホルモン断片４−１０存在下はいずれも、ＧＳＴ−ＨｔｔＥｘｏｎ１−１１０Ｑの最終的な凝集産物の分子量を著しく増加させることがわかる。また、インキュベーションの初期段階の間では、凝集体形成のプロセスは、化合物の存在下では遅いのに対し、より大きな凝集が進むにつれ急速に分子量が増加することが分かる。
驚くべきことに、ハエ及びマウスＨＤモデルにおいてＨＤ予防ないし治療効果を示した７Ｈ及びアンジオテンシンＩＩＩがＨｔｔの凝集を阻害するよりはむしろ促進していることがわかる。
以上から、７Ｈ、アンジオテンシンＩＩＩのように、ＧＳＴ−ＨｔｔＥｘｏｎ１−１１０Ｑの凝集の動態を少なくとも変化させることにより、神経疾患に対する予防又は治療剤候補になるといえる。

（ＤＬＳ分析（２））
ゼータサイザーμＶ機器（マルバーン社製）を用いて、図６（ａ）に示すようにタウタンパク質における２４４〜３６９番目のアミノ酸残基からなる微小管結合ドメイン（ＭＢＤ）における３０６〜３３７番目のＲ３イソフォームペプチド断片の凝集の時間経過を化合物の存在下及び非存在下でモニターした。
用いたＲ３イソフォームペプチド断片は以下の通りである。
フルオレセイン−Ｖ^３０６ＱＩＶＹＫＰＶＤＬＳＫＶＴＳＫＣＧＳＬＧＮＩＨＨＫＰＧＧＧＱ^３３６−ＮＨ_２（配列番号８）

１０μＭのＲ３イソフォームペプチド断片（分子量３．６ｋＤａ）を、９日間、５０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ８、１ｍＭヘパリンを含有する緩衝液中で２５℃で各３種の化合物５００μＭとともにインキュベートし、そのＤＬＳシグナルを数時間毎に記録した。
結果を図６（ｂ）に示す。
図６（ｂ）中、対照は化合物非存在下１０μＭのＲ３イソフォームペプチド断片である。
Ｎｏ．１は５００μＭの７Ｈ存在下であり、Ｎｏ．２は５００μＭのアンジオテンシンＩＩＩ存在下であり、Ｎｏ．３は５００μＭの黄体形成ホルモン放出ホルモン断片４−１０存在下である。
図６（ｂ）に示した結果から明らかなように、７Ｈ存在下のＮｏ．１は、Ｒ３イソフォームペプチド断片の凝集が対照に対して１／１０に抑制されているのに対し、アンジオテンシンＩＩＩ存在下のＮｏ．２は、Ｒ３イソフォームペプチド断片の凝集が対照に対して４〜１０倍増加していることが分かる。また、黄体形成ホルモン放出ホルモン断片４−１０存在下のＮｏ．３は、Ｒ３イソフォームペプチド断片の凝集が対照とほぼ同程度であることが分かる。
以上から、７Ｈ、アンジオテンシンＩＩＩは少なくとも、タウタンパク質の凝集の動態を変化することが分かり、アルツハイマー型認知症、ＦＴＬＤ等の神経疾患に対する予防又は治療剤候補であるといえる。

＜神経変性疾患タンパク質の異常凝集を伴って発症する神経疾患に対する予防又は治療効果の確認＞
７Ｈ及びアンジオテンシンＩＩＩ、及びＬＨ−ＲＨ４−１０ペプチド断片について、ヒトＨＤ患者のｉＰＳ細胞から分化した初代ニューロンの形態学的異常に対する治療効果を確認した。
（ｉＰＳ細胞の培養）
２０１Ｂ７は、ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ（ｈｔｔｐｓ：／／ｊａ．ｂｒｃ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ）に由来する。ＨＤ患者のＣＳ９２ｉＨＤ−５７ｎ９のｉＰＳ細胞はコーリエル医学研究所で樹立していた（ｈｔｔｐｓ：／／ｃａｔａｌｏｇ．ｃｏｒｉｅｌｌ．ｏｒｇ）。

（ｉＰＳ細胞の核型分析）
ｉＰＳ細胞の生成中発生する可能性がある異常核型の可能性を排除するためにｉＰＳ細胞株（２０１Ｂ７及びＣＳ９２ｉＨＤ−５７ｎ９）の標準的なＧ−バンディング分析を実施した。

（ｉＰＳ細胞のインビトロ分化）
Ｃｈａｄｄａｈ，Ｒ．，Ａｒｎｔｆｉｅｌｄ，Ｍ．，Ｒｕｎｃｉｍａｎ，Ｓ．，Ｃｌａｒｋｅ，Ｌ．＆ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｏｏｙ，Ｄ．Ｃｌｏｎａｌ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｃｏｌｏｎｉｅｓ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３２，７７７１−７７８１（２０１２）に準じてｉＰＳ細胞の神経分化を行った。
簡単に述べると、ｉＰＳ細胞が１０ｃｍの皿に播種し３μＭのＳＢ４３１５４２、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１及び３μＭのデソモルヒネとともに５日間超維持した。次に、ｉＰＳ細胞は、フィーダー層から剥離し、単一細胞に解離し、２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬのｈＬＩＦ、１０μＭのＹ２７６３２、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１及び２μＭのＳＢ４３１５４２を伴う２×Ｂ２７補充ＫＢＭ培地（ＫＨＯＪＩＮ ＢＩＯ社製）で１０ｃｍの細胞撥皿内で懸濁培養条件で培養しニューロスフェアを形成した。
ニューロスフェアは２回継代し、接着培養法（Ｂ２７及びグルタマックスを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２）を用いて、神経細胞に分化した。ニューロンは、ポリ−Ｌ−オルニチン被覆カバーガラス及びポリ−Ｌ−リジン被覆カバーガラスに１４−２１日間付着させた。

（ｉＰＳ細胞及び分化細胞の免疫染色）
細胞を、氷上で１５分間、４％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳで固定し、以下のタンパク質に対する一次抗体とインキュベートした。：ＳＳＥＡ１（１：１０００、Ａｂｃａｍ社、ａｂ１６２８５）、Ｎａｎｏｇ（１：２００、ＲＣＡＢ０００４ＰＦ、リプロセル社）、βＩＩＩチューブリン（１：１０００、Ｔ８６６０シグマケミカル社）、αＳＭＡ（１：１５０、Ｍ０８５１０１、ダコ社）、及びＳＯＸ１７（１：５００、ａｂ８４９９０、アブカム社）。
次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、アレクサフルオロ４８８結合二次抗体、アレクサフルオロ５５５結合二次抗体、又はアレクサフルオロ６４７結合二次抗体（１：５００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とインキュベートした。

図７（ａ）に示した結果から明らかなように、分化７日目には、７Ｈ、アンジオテンシンＩＩＩ、及びＬＨ−ＲＨ４−１０ペプチド断片はいずれも、神経突起長が改善したことがわかる。
また、図７（ｂ）に示した結果から明らかなように、分化１４日目で樹状突起の長さ及び分岐点数の回復が確認された。
また、図７（ｃ）に示した結果から明らかなように、分化１４日目にＰＳＤ９５を使用した免疫細胞化学により７Ｈ及びアンジオテンシンＩＩＩの添加によりスパイン密度が回復したことを明らかになった。
しかし、図７（ｄ）に示した結果から明らかなように、図５に示したＤＬＳの結果から予想されたように、７Ｈ、アンジオテンシンＩＩＩ、及びＬＨ−ＲＨ４−１０ペプチド断片の投与群は、Ｈｔｔ包含体陽性神経細胞数は減少しなかった。
以上から、Ｈｔｔ包含体形成とは無関係にヒト神経細胞に対する７Ｈ、アンジオテンシンＩＩＩ、及びＬＨ−ＲＨ４−１０ペプチド断片のＨＤ治療効果が確認された。

＜後発性変異Ｈｔｔノックインマウス（以下、変異Ｈｔｔ−ＫＩマウスともいう。）の運動機能障害のスフィンゴシン−１−フォスフェートによる回復＞
変異Ｈｔｔノックインマウス（Ｗｈｅｅｌｅｒ， Ｖ．Ｃ．， Ａｕｅｒｂａｃｈ， Ｗ．， Ｗｈｉｔｅ， Ｊ．Ｋ．， Ｓｒｉｎｉｄｈｉ， Ｊ．， Ａｕｅｒｂａｃｈ， Ａ．， Ｒｙａｎ， Ａ．， Ｄｕｙａｏ， Ｍ．Ｐ．， Ｖｒｂａｎａｃ， Ｖ．， Ｗｅａｖｅｒ， Ｍ．， Ｇｕｓｅｌｌａ， Ｊ．Ｆ． ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｌｅｎｇｔｈ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｇａｍｅｔｉｃ ＣＡＧ ｒｅｐｅａｔ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｋｎｏｃｋ−ｉｎ ｍｏｕｓｅ． Ｈｕｍ． Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．， ８， １１５−１２２．）を使用して、６９週目（６０週付近の症状発症後２か月以上後）にスフィンゴシン−１−フォスフェート（以下、Ｓ１Ｐともいう。）を髄腔内連続注射（２００ｍＭ、０．１５μｌ／時間）を開始した。
結果を図８及び９に示す。図８及び９中、データは平均±標準誤差として示した。チューキー検定におけるｐ値：＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１。図中ｎ．ｓ．は有意差なし。
ＷＴ（対照：Ｃ５７ＢＬ／６）マウスは、上記と同じプロトコルでＰＢＳの髄腔内注射を受けたマウスである。
図８から明らかなように、Ｓ１Ｐで一週間後に劇的な効果が観察され、改善は７３週の観察まで継続された。注目すべきことに、処理後に運動機能の衰退が発生しなかったことがわかる。

ヒッポ（Ｈｉｐｐｏ）シグナル伝達は、進化的に保存された経路で、細胞密度のレベルの変化に応じて、細胞分裂、アポトーシス及び器官の大きさを制御し得る。比較的低い細胞密度の状態では、転写活性化補助因子であるＹＡＰとＴＡＺが転写因子に結合して、細胞の増殖と分裂に有利に働く遺伝子の発現を誘導し得る（Ｙｕ， Ｆ．Ｘ． ａｎｄ Ｇｕａｎ， Ｋ．Ｌ． （２０１３） Ｔｈｅ Ｈｉｐｐｏ ｐａｔｈｗａｙ： ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．， ２７， ３５５−３７１．）。
ヒッポ経路はＭｓｔとＬａｔｓを活性化し、その後、ＹＡＰをリン酸化し、ＹＡＰの核移行を防止する。これは、ヒッポ経路の活性化が、細胞増殖及び生存を阻害することを意味する（Ｈａｒｖｅｙ， Ｋ． ａｎｄ Ｔａｐｏｎ， Ｎ． （２００７） Ｔｈｅ Ｓａｌｖａｄｏｒ−Ｗａｒｔｓ−Ｈｉｐｐｏ ｐａｔｈｗａｙ−ａｎ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｔｕｍｏｕｒ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｎｅｔｗｏｒｋ． Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｃａｎｃｅｒ， ７， １８２−１９１．）。

図９（ａ）は、ＹＡＰのシグナル強度を、各グループの４匹のマウスからの１００ニューロンにおいて定量した結果、各グループの４匹のマウスからの線条体における１０視野から％Ｈｔｔ包含体陽性細胞を定量した結果を示す図である。

図９（ａ）から明らかなように、核ＹＡＰのシグナル強度は、ＷＴ（Ｃ５７ＢＬ／６）マウスと比較して変異Ｈｔｔ−ＫＩマウスの線条体ニューロンで減少した。
一方、Ｓ１Ｐの投与は核ＹＡＰシグナルの減少を回復するのに対し、Ｈｔｔ包含体陽性細胞数を減少させなかった。

図９（ｂ）は、ＰＢＳ注射ＷＴマウスグループ（対照：Ｃ５７ＢＬ／６）、ＰＢＳ注射変異Ｈｔｔ−ＫＩマウスグループ及びＳ１Ｐ注射変異Ｈｔｔ−ＫＩマウスグループ（Ｎ＝３）の４２０、５０９及び５０７細胞から、細胞当たりのＥＲ−ＣＦＰ体積及びシグナル強度を算出した結果を示す図である。
図９（ｂ）から明らかなように、７３週齢で、変異Ｈｔｔ−ＫＩマウスのＲＳＤの皮質ニューロンにおいてＥＲ不安定性が増加したのに対し、Ｓ１Ｐは不安定性を回復した。
図９（ａ）及び（ｂ）に示した結果から、凝集体とは無関係に、Ｓ１ＰはＹＡＰの核移行を増やすことで、核内部のＹＡＰを増やし、Ｓ１ＰがＹＡＰ増加による治療効果を示すことが示唆される。

Claims (3)

1. 神経変性疾患タンパク質の異常凝集を伴って発症する神経疾患に対する予防又は治療剤であって、
   前記「神経変性疾患タンパク質の異常凝集を伴って発症する神経疾患」が、ハンチントン病、タウタンパク質の異常凝集を伴って発症するアルツハイマー型認知症又はタウタンパク質の異常凝集を伴って発症する前頭側頭葉変性症であり、
   前記神経疾患がハンチントン病であるとき、ヘプタ−ヒスチジン、アンジオテンシンＩＩＩ、ＳＹＧＬＲＰＧ（配列番号３）−ＮＨ_２で表される黄体形成ホルモン放出ホルモンペプチド断片４−１０、ヘプタ−グルタミン、ケンプチド酢酸塩、並びに、スフィンゴシン−１−フォスフェート、及びその化合物の構成炭素原子の任意の位置の炭素数１〜３の直鎖状又は分岐状アルキル基によるアルキル化修飾化合物よりなる群から選択される少なくとも１つの化合物を有効成分とし、
   前記神経疾患がタウタンパク質の異常凝集を伴って発症するアルツハイマー型認知症又はタウタンパク質の異常凝集を伴って発症する前頭側頭葉変性症であるとき、ヘプタ−ヒスチジン、又はアンジオテンシンＩＩＩを有効成分とする、予防又は治療剤。
2. 神経変性疾患タンパク質と直接相互作用するタンパク質の親和性に対する被験物質の影響を指標として、前記神経変性疾患タンパク質の異常凝集を伴って発症する神経疾患に対する予防又は治療剤をスクリーニングする方法であって、
   前記「神経変性疾患タンパク質の異常凝集を伴って発症する神経疾患」が、ハンチントン病、タウタンパク質の異常凝集を伴って発症するアルツハイマー型認知症又はタウタンパク質の異常凝集を伴って発症する前頭側頭葉変性症であり、
   前記神経疾患がハンチントン病であるとき、前記被験物質がヘプタ−ヒスチジン、アンジオテンシンＩＩＩ、ＳＹＧＬＲＰＧ（配列番号３）−ＮＨ_２で表される黄体形成ホルモン放出ホルモンペプチド断片４−１０、ヘプタ−グルタミン、ケンプチド酢酸塩、並びに、スフィンゴシン−１−フォスフェート、及びその化合物の構成炭素原子の任意の位置の炭素数１〜３の直鎖状又は分岐状アルキル基によるアルキル化修飾化合物よりなる群から選択される少なくとも１つの化合物であり、
   前記神経疾患がタウタンパク質の異常凝集を伴って発症するアルツハイマー型認知症又はタウタンパク質の異常凝集を伴って発症する前頭側頭葉変性症であるとき、前記被験物質がヘプタ−ヒスチジン、又はアンジオテンシンＩＩＩである、方法。
3. 前記神経変性疾患タンパク質と直接相互作用するタンパク質に対する前記被験物質の親和性を単一分子蛍光分光法により測定する工程を含む請求項２に記載のスクリーニングする方法。

Images