TWI484970B

TWI484970B - 植物萃取物、含有該植物萃取物之組成物、萃取方法及該植物萃取物之用途

Info

Publication number: TWI484970B
Application number: TW099131430A
Authority: TW
Inventors: Chen Xie; Yingshu Zou
Original assignee: Botan Century Beijing Co Ltd
Priority date: 2010-09-16
Filing date: 2010-09-16
Publication date: 2015-05-21
Also published as: TW201212934A

Description

植物萃取物、含有該植物萃取物之組成物、萃取方法及該植物萃取物之用途

本發明係關於一種植物萃取物、含有該植物萃取物之組成物、一種萃取方法及該萃取物之用途。

背景

在亞洲國家，特別是中國，桑葉具有悠久的藥用歷史。近年來，植物化學家已從桑葉中單離出數種亞胺糖組份，諸如1-去氧野艽黴素(1-deoxynojirimycin；DNJ)、蕎麥鹼(fagomine)以及N-甲基-DNJ。這些亞胺糖的化學結構類似於單醣，大多數為具有5至6-員環的多羥基雜環化合物。兩者間的主要差別在於雜環中的雜原子。前者含有氮原子(N)，而後者含氧(O)。

經發現，源自於桑葉的亞胺糖組份對於α-葡糖苷酶I和II會顯現出某種抑制活性，其中DNJ展現出最強的活性。進一步的藥理實驗顯示，DNJ作用於黑色素細胞以抑制TYR的成熟過程，導致黑色素的產量降低(Genji Imokawa,Analysis of Carbohydrate Properties Essential for Melanogenesis in TYRs of Cultured Malignant Melanoma Cells by Differential Carbohydrate Processing Inhibition.The Journal of Investigative dermatology ,1990,95 (1):39-49；Ju Young Park,hyunjung Choi,Jae Sung hwang,Junoh Kim,Ih-Seop Chang,Enhanced depigmenting effects of N-glycosylation inhibitors delivered by pH-sensitive liposomes into HM3KO melanoma cells,Journal of Cosmetic Science ,2008,59 :139-150.)。

本發明的發明人進行了數組酵素實驗，發現到被稱為本發明萃取物的源自於桑葉的總體亞胺糖萃取物(由1-去氧野艽黴素(DNJ)、N-甲基-DNJ以及蕎麥鹼的含量所測得)相較於純質DNJ化學品對於α-葡糖苷酶I和II具有更強的抑制活性。此一發現使得運用此類桑萃取物而以較低的DNJ濃度來抑制α-葡糖苷酶I和II成為可能，從而降低發生不良藥物反應(ADR)的可能性，並使得成品在使用上更為安全。另外，因為製造本發明所述桑萃取物的成本遠較於製得純質DNJ化學品的成本為低，所以治療色素沈澱過度相關性患疾的成本可明顯降低。

因此，由此種萃取物所製成的化妝品和藥品在有效性、安全性和成本上相較於含有DNJ等純質化學品者具有重大優勢，DNJ的結構如下。

1-去氧野艽黴素(DNJ)的結構

過去，在中國國內或國外有一些研究者已嘗試將桑萃取物予以商品化，供美容產品市場作為美白和除斑之用。然而，相較而言，本案萃取物具有極為不同的特性並提供許多優點。

中國專利ZL99123894X揭露一種用於治療皮膚色素沈澱的植物萃取物組成物，其由三種主要組份組合而成，亦即，一源自於桑屬(Morus )植物的萃取物、一源自於黃芩屬(Scutellaria )植物的萃取物以及水楊酸衍生物。該項發明的桑萃取物係得自於桑的根部，其主要含有桑酮(kuwanone)，且沒有該萃取物的詳細說明。

美國專利申請案第347884號揭露將一種源自於桑樹枝條的萃取物應用於相同的化妝用途，而萃取物中的活性成份為氧化白藜蘆醇和桑皮苷。相較於這兩項發明，本發明有下列優點和特徵：

1.原料優勢。 本發明中所使用的原料-桑葉-相較於根部和枝條更易於再生且提供更有持久性的來源。它相較於前述兩項發明提供更低的成本。

2.不同的作用機制。 在前述兩項發明中，活性是經由對於TYR的競爭性抑制來達成。在本發明中，作用機制乃是經由抑制α-葡糖苷酶來降低黑色素的生成，導致較不成熟(且較少/較不具活性)的TYR。

3.不同的活性本源。 在前述專利中，活性本源為諸如桑酮等類黃酮，或是諸如氧化白藜蘆醇和桑皮苷等二苯乙烯類化合物(diphenyl ethenoids)。相對而言，本發明的活性本源為亞胺糖，並運用不同的製備方法來單離一種富含這些亞胺糖的萃取物。

4.特殊製備方法。 該方法被設計成可確使活性組份的萃取及其純化最佳化，以改善諸如萃取物的物理性質，使其更適用於諸如化妝產品。

黑色素在人類膚色的決定上是最重要的因素。它是在位於表皮基層處的黑色素細胞的黑色素小體內被生物合成。在正常生理條件下，黑色素保護皮膚免於UV光的傷害。當黑色素的合成代謝被外在因素、內分泌疾病、衰老過程等所干擾時，位於表皮基層處的黑色素會增加，且膚色變黑。此轉而導致色素沈澱的不適或疾病，諸如雀斑(freckle)、黃褐斑(chloasma)、妊娠纹(striae of pregnancy)、老人斑(senile plaque)以及黑色素瘤(melanoma)。此外，有許多愛美人士渴望具有白晢的皮膚，因而對於皮膚淨白、美白和除斑劑和化妝品存在有需求。

簡言之，黑色素的生物合成包括下列步驟：

酪胺酸酶(TYR)是一種含有銅離子的醣蛋白，且為黑色素生物合成的關鍵酵素。它催化將酪胺酸轉化為多巴和多巴醌(dopaquinone)的反應。TYR被認為是一個用以降低色素沈澱的重要標的，且經常使用於具有皮膚美白和除斑功能之產品的研究領域中。

目前，致標TYR的主要方式是抑制它的生成和活性，以降低黑色素的產生。現今含TYR抑制劑的產品包括1,4-苯二酚(氫醌)及其衍生物、麴酸(kojic acid)及其衍生物以及熊果素(arbutin)。

雖然1,4-苯二酚及其衍生物能夠抑制100%的TYR活性，但它們也會刺激黑色素細胞且顯現出細胞毒性。長時間使用加上暴露於光照下可能會造成外因性色斑。它們因而被排除用於護膚產品中。

麴酸非常安定，且經由螯合銅離子以降低TYR活性而在減除色斑上具有良好效果。但是，長期使用麴酸可能造成細胞毒性，導致皮膚病變。日本研究者顯示，麴酸可能會導致肝癌(Tamotsu Takizawa,Toshio Imai,Jun-ichi Onose,Makoto Ueda,Toru Tamura,Kunitoshi Mitsumori,Keisuke Izumi and Masao Hirose. Enhancement of Hepatocarcinogenesis by Kojic acid in Rat Two-Stage Models after Initiation with N-bis(2-hydroxypropyl)nitrosamine or N-diethylnitrosamine.Toxicological Sciences 200481 (1):43-49)。

熊果素咸認是一種具有極少副作用的美白和除斑美容產品，但其對於光線高度敏感，造成成品中必須添加大量防曬劑，這些防曬劑會增加皮膚的負擔，因而加速皮膚的老化過程。

前述缺點使得既有產品在美白皮膚和減除斑點用美容產品市場上的應用受到侷限。

TYR是一種帶有糖鏈的蛋白(醣蛋白)。當代生化研究已顯示，在它的生成(以及成熟)過程中，原生糖鏈必須接受一系列修飾作用，以將新生TYR轉化成為具有正常生物功能的成熟TYR。α-葡糖苷酶I和II在此一過程中是關鍵酵素。α-葡糖苷酶I主要負責「切斷」位於糖鏈遠端處帶有α-1,2鍵結的葡萄糖部分，而α-葡糖苷酶II會於兩個步驟中切斷由α-1,3鍵結所連接的其餘兩個葡萄糖部分(Mehta A,Zitzmann N,Rudd PM,Block TM,Dwek RA. α-Glucosidase inhibitors as potential broad based anti-viral agents,FEBS Letters ,1998,430 (1):17-22)。

咸相信，當α-葡糖苷酶I和II被抑制時，會遲滯該醣蛋白糖鏈之修飾，致使無法產生成熟的TYR。由於「不成熟的TYR」，黑色素的產生會隨後成比例地下降(Hiroyuki Takahashi,Peter G. Parsons,Rapid and reversible inhibition of TYR activity by glucosidase inhibitors in human melanoma cells,The Journal of Investigative dermatology ,1992,98 (4):481-487)。

因此，藉由抑制α-葡糖苷酶I和II使得成熟TYR的形成最少化，以降低黑色素的產生並轉而降低皮膚的色素沈澱，將是極為可行的手段，第4圖顯示所提出之抑制黑色素合成的作用機制。由α-葡糖苷酶所催化之酪胺酸酶的必要性修飾作用被桑萃取物所抑制，造成非活化性酪胺酸酶的生成。

揭露內容概要

依據本發明，其係提供一種得自於桑屬(Morus )植物葉片的植物萃取物，該植物萃取物對於抑制α-葡糖苷酶I具有一位在低於90 μg/ml之濃度的IC50數值。

較佳地，該植物對於抑制α-葡糖苷酶I具有一低於70 μg/ml之濃度的IC50數值，該IC50數值更佳為位於5-60 μg/ml之間，尤以5-40 μg/ml為佳。

IC50可依實驗1所述進行測定。

萃取物相對於純質單離型DNJ在活性上的增進被認為是源自存在於萃取物內的其他亞胺糖的活性。較佳地，該萃取物依據定量型HPLC及/或LC-MS(液相層析/質譜法)所測得者係包含有5-40%(w/w)的總體亞胺糖。測得的亞胺糖包括有1-去氧野艽黴素(DNJ)、N-甲基-DNJ和蕎麥鹼。

更佳地，該萃取物包含8-30%(w/w)的總體亞胺糖，尤以包含有15-20%(w/w)的總體亞胺糖為佳。

藉由準確地控制特徵性化學組份的含量，可以有效控制產物的品質，從而對於產物的化妝或治療效果提供確切的保證。

最佳地，該萃取物更包含有亞胺糖：1,4-雙去氧-1,4-亞胺基-D-阿拉伯糖醇(DAB)、2-O-α-D-吡喃半乳糖基-DNJ(GAL-DNJ)以及打碗花精B(calystegin B)。

DAB是一種肝糖磷解酶抑制劑，它的存在對於萃取物在控制糖類代謝上的用途具有重要性，該應用構成本發明的另一態樣。

除了亞胺糖以外，該萃取物係較佳為包含20-70%(w/w)的總體胺基酸。

更佳地，該萃取物含有30-60%(w/w)的總體胺基酸，尤以含有40-50%(w/w)的總體胺基酸為佳。

萃取物內所存在的胺基酸包括人體無法製造的8種必須胺基酸，包括促進胰島素分泌的精胺酸、白胺酸、離胺酸和苯丙胺酸。如人們所熟知，胺基酸為保持皮膚溼潤度和彈性所必須者。胺基酸的缺乏會使皮膚代謝減弱並加速皮膚老化過程(Marty J. P.,NMF and cosmetology of cutaneous hydration.Annales de Dermatologie et de V n r ologie ,2002,129 (1 Pt 2):131-136)。本發明的萃取物因而亦有助於保持皮膚健康。

本發明的萃取物得自於桑科(Moraceae)桑屬(Morus)的桑樹葉片，其選自於：

a.　白桑(Morus alba L.)

b.　魯桑(Morus alba var.multicaulis L.)

c.　黑桑(Morus nigra )以及

d.　小葉桑(Morus australis Poir)。

本案發明人對於常見桑樹植物葉片之化學組份進行了化學分析，並發現到前述物種的葉片相較於其他物種皆含有更高的亞胺糖含量，且白桑的葉片具有最高的亞胺糖含量。

更佳地，亞胺糖含量係參照DNJ而被標準化，其存在量經計算係以萃取物的總重量為準含有1-20%(w/w)之(DNJ)，更佳為以萃取物的總重量為準經計算為含有2-10%(w/w)之(DNJ)，且依據所欲用途而定，其可以萃取物的總重量為準經計算為含有4-6%(w/w)之(DNJ)，或是以萃取物的總重量為準經計算為含有1-3%(w/w)之(DNJ)。DNJ亦為存在其中的主要亞胺糖(產量最高)。

本發明的萃取物在下列數個方面上不同於既有的桑萃取物，包括：

‧　其色澤-其呈淡黃色；

‧　其溶解度-其易溶於水；

‧　其pH值-其配成1%水溶液具有一介於5.5-6.5的pH值；以及

‧　其UV光譜-其在218nm和263nm處顯示最高吸光值。

該萃取物可運用新穎的萃取和純化過程來製成，其包含三個基本步驟，該方法構成本發明的另一態樣。

依據本發明的第二態樣，其係提供一種用於從桑屬植葉片製造一萃取物的方法，該萃取物對於抑制α-葡糖苷酶I具有一低於90 μg/ml之濃度的IC50數值，該方法包含下列步驟：

a.　對於葉片材料進行一水或醇萃取步驟；

b.　運用一強酸型陽離子交換樹脂進行管柱層析純化步驟，以水洗滌之，並利用一氨溶液予以洗提，收集洗提液，並將氨從洗提液中移除；

c.　令該洗提液接受運用有一巨孔吸附樹脂的管柱層析，收集溶液；以及

d.　濃縮並乾燥該萃取物。

較佳地，將該植物葉片置入烘箱中乾燥，並製成粗粉，以及

a.　萃取步驟是以5-18倍於桑屬植物葉片之份量(w/w)的0-40%低分子量醇來進行，且重覆至多5次；

b.　該管柱是以1-2倍管柱體積的水來洗滌並將滌出液拋棄，該管柱是以2-8倍管柱體積的0.2-1.0 N氨水溶液在每小時1-3倍管柱體積的洗提速率下進行洗提，並收集pH值介於9.0和11.0間的洗提液；

c.　該管柱是以20:1至5:1的溶液/管柱體積比進行洗提；以及

d.　將經乾燥之萃取物予以磨碎以通過80目篩網。

茲將獲取本發明萃取物的萃取步驟完整地詳述於後：

萃取E(步驟1)： 將植物葉片烘乾，並製成粗粉。粉末是以5-18倍於原料量(w/w)的0-40%低分子量醇萃取1-5次，較佳為以10-13倍於原料量(w/w)的20-30%低分子量醇且更佳為以11倍於原料量(w/w)的25%低分子量醇進行萃取，以獲得液體萃取物。

純化1(步驟2)： 運用一陽離子交換樹脂進行管柱層析：將步驟(1)中所獲得的液體萃取物予以過濾後，令溶液通過一填充有強酸型陽離子樹脂的管柱。以1-2倍且較佳為1.5倍管柱體積之水來洗提該管柱，並拋棄洗提液。以2-8倍管柱體積的0.2-1.0N氨水溶液且較佳為5倍管柱體積的0.7N氨水溶液，於每小時1-3倍管柱體積且較佳為每小時1.5倍管柱體積的洗提速率下，再次洗提管柱。收集pH值介於9.0和11.0間的洗提液。

純化(步驟3)： 運用巨孔吸附樹脂進行管柱層析：從步驟(2)之洗提液中移除氨並調節至pH 7。令溶液通過一填充有巨孔吸附樹脂的管柱。溶液與管柱間的體積比應當為20:1至5:1，較佳為15:1至10:1且更佳為13:1。將收集到的流體予以濃縮，令其通過管柱並將濃縮物予以乾燥，隨後將之磨碎以通過80目篩網，以獲得本發明的萃取物。

依據前述步驟(1)的萃取方法，該低分子量醇應當是具有不超過4個碳原子的直鏈烷基醇，較佳為甲醇或乙醇。將該萃取物予以回流萃取1-3小時，較佳為1-2小時且更佳為2小時。

將步驟(1)中所獲得的液體萃取物予以過濾後，可採用進一步的手段來移除更多的雜質、增進萃取物的生物活性以及脫除萃取物的色澤。這些手段包括醇沈澱、絮凝沈澱以及其他適於去除蛋白質、單寧和多醣的手段。沈澱物可藉由離心或過濾來移除。於此，較佳的純化方法為醇沈澱和離心：將輸注液濃縮至原始體積的，添加1-3倍的95%乙醇，攪拌半個小時並靜置8-12小時，再於12000轉/分鐘的速率下離心15分鐘。保留上澄液供進一步純化。

依據本案所敘述的萃取方法，步驟(2)中液體萃取物的總體積應當為陽離子交換樹脂管柱的2-20倍，較佳為10-15倍且更佳為13倍。

在這些條件下，活性組份可有效地被陽離子交換樹脂所吸附，有助於增加活性化合物的含量。

本案所使用的強酸型陽離子樹脂可選自於下列類型001X7(#732)、Amberlite IR-120、Dowex-50、Lewatit-100、Zrolit 225或Diaion SK-1等，以001X7(732)為最佳者，因其吸附性質較佳可供濃縮活性組份且成本較低。

在利用氨水洗提陽離子交換樹脂管柱的期間，洗提液的pH值會逐漸上升。洗提液的生物和化學分析顯示出，pH 9-11的分離部分的內容物展現出最高的活性，因此僅收集這些pH值為9-11的分離部分。

依據本案所敘述的萃取方法，步驟(3)中的流速應當是每小時1-4倍且較佳為2倍管柱體積。此確保有色雜質被巨孔樹脂的吸附最大化，從而確保良好的脫色作用。

有四種類型的巨孔樹脂可供選用於前述管柱層析：AB-8、HP20、S-8和YWD03F4。經過方法的比較和驗證，發現樹脂S-8能夠產生最佳的脫色結果，因此S-8型樹脂為較佳的巨孔樹脂材料。

依據前述方法所製得的桑葉萃取物在UV掃描下於218.3nm處具有最高吸收峰，且呈現淡黃色，有別於現今市面上可得的其他桑葉萃取物。供用於市面上美容產品中的大多數桑葉萃取物具有較深的顏色，亦即呈現黃色或褐黃色，導致成品帶有顏色，此不被認為是理想的外觀。

本發明所述萃取物易溶於水，此致使活性組份容易擴散並吸附於標的區域。目前用於美白產品中的桑萃取物含有類黃酮(例如桑酮)以及二苯乙烯類化合物(例如氧化白藜蘆醇和桑皮苷)，結果是它們具有較低的水溶性和平庸的擴散性，現實上需要應用低分子量醇來增進溶解度，因而增加皮膚的負擔。

本發明所述萃取物配成1%水溶液具有一為5.5-6.5的pH值。此一微酸性的pH與皮膚表面皮脂膜的pH值4.5-6.6相近。當該萃取物製成護膚產品時，活性組份對於皮膚所造成的刺激因而降低。

本發明的萃取物可經配製以作為供使用為皮膚美白劑或是用於降低皮膚的色素沈澱過度的藥品或化妝品，抑或是用於控制血糖位準的藥品、營養醫學補充品(nutraceutical)或食品或飲料成份。因此，舉例而言，它可供用以治療第2型糖尿病或是降低食品或飲料的升糖指數。

依據本發明的第三態樣，其係提供一種依據本發明第一態樣的植物萃取物或是依據本發明第二態樣之方法的產物，以供作為一用於治療由色素沈澱所導致之病況的化妝品或藥物。

較佳地，該化妝或治療用途係供降低黑色素的生成，包括治療由雀斑、黃褐斑、妊娠纹、老人斑和黑色素瘤等色素沈澱過度所導致之不適和疾病。

一個運用本發明之桑葉萃取物的藥理實驗顯示出，該萃取物能夠有效地抑制α-葡糖苷酶的活性，且相較於一純質DNJ的等量樣品具有更高的效力。萃取物中僅需含有一半的DNJ濃度即可達到與純質DNJ相同的效果。當於細胞株中進行測試時，該萃取物在黑色素瘤細胞株A375和B16中對於黑色素的形成展現出顯著的抑制效應，且效力相較於諸如熊果素和L-抗壞血酸基-2-磷酸鎂等市售美白產品中常用組份的效力更高。本發明桑葉萃取物的作用轉制與熊果素和L-抗壞血酸基-2-磷酸鎂不相同。後兩者是直接且競爭性地抑制TYR的活性，而該桑葉萃取物主要是抑制成熟具活性的TYR之生成。該桑葉萃取物的優點包括較高的效力且較長的作用時間。由於作用機制不同，本發明的萃取物可被單獨使用或是與前述TYR抑制劑共同使用。一個人類的臨床研究確認了此一活體外數據，且經過28天局部施用0.2%或0.5%之桑葉萃取物的油膏調配物後，皮膚的色素沈澱顯著地降低(P<0.001)且皮膚明顯變白(P<0.001)。

依據本發明的第四態樣，其係提供一種依據本發明第一態樣的植物萃取物或是依據本發明第二態樣之方法的產物，以供用於控制血糖位準。

較佳地，該用於控制血糖位準的萃取物另包含一肝糖磷解酶抑制劑。

在應用威斯塔大鼠模型的動物實驗以及人類臨床研究中，本發明的桑葉萃取物展現出顯著的血糖降低效應。

本發明的萃取物特佳之處在於其得益於活性物質的組合。因此，諸如DNJ等亞胺糖組份會抑制胃腸中的α-葡糖苷酶，致使多醣的吸收下降(Asano N.,Glycosidase inhibitors: update and perspectives on practical use. Glycobiology,2003,13(10): 93R-104R.)。經發現，另一種亞胺糖，即1,4-雙去氧-1,4-亞胺基-D-阿拉伯糖醇(D-AB1)，對於肝糖磷解酶具有強力抑制活性，且亦於活體內抑制肝糖的分解。結果，其能夠對抗高血糖症。再者，精胺酸、白胺酸、離胺酸和苯丙胺酸等胺基酸的存在具有促進胰島素分泌的功能。

因此，本發明中所敘述的萃取物可供用於控制飯後血糖的位準以及調節血糖平衡。

這些萃取物可經配製成作為一種用於控制血糖的藥物或健康產品(諸如食品添加劑或補充劑)。

為達該第三態樣，萃取物可被配製成一種化妝品或藥物，其包含賦形劑以及任擇地一或多種替代性活性物質。

舉例而言，下列活性物質可選用作為皮膚淨白劑：維生素C及其衍生物，諸如維生素-磷脂酸鎂、麴酸、熊果素、二乙醯博丁(diacetylboldin)、壬二酸、十八烯二酸、十一烯醯苯丙胺酸(DEP-11)、甘草萃取物、蘆薈萃取物、水田芥(Nastutium officinale )萃取物、囊葉藻萃取物(Ascophyllum nodosum )、蛇麻子(Humulus lupulus )萃取物、麩胱甘肽、蛻皮激素及/或土耳其鞣酸(ellagic acid)。

一種較佳的化妝品或藥物包含有本發明的萃取物以及維生素C衍生物，即L-抗壞血酸基-2-磷酸鎂(VC-PMG)。

較佳地，在一組合型產品中，該萃取物係呈萃取物相對於其他皮膚淨白劑為10:1至1:1的比例，更佳為5:1的比例。

當運用本發明的桑葉萃取物或是另含有其他組份的組成物來製造供皮膚疾病用的化妝品或藥物時，可以使用製藥上可接受的所有常用基質，其包括諸如甘油、聚乙二醇、纖維素衍生物等水溶性基質，以及諸如油脂、脂肪、烴類等脂溶性基質。下列賦形劑亦經常使用，其包括對羥苯甲酸酯、氯丁醇和山梨酸等防腐劑；亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、BHT等抗氧化劑；硬脂酸、蜂蠟、石蠟、月桂醇、羧甲基纖維素(CMC)等增稠劑；三乙醇胺、單硬脂酸甘油酯、杜溫(Tweens)等乳化劑；甲氧肉桂酸辛酯、二苯酮-3等防曬劑；甘油、丙二醇、山梨糖醇等保溼劑(溼潤劑)；除臭劑、香精和著色劑等。前述賦形劑的用量為習於本項技藝者所熟知。

當將該萃取物使用於化妝產品以降低黑色素的生成時，其在成品中的建議用量應當為0.05-2%，較佳為0.1-1%且更佳為0.2-0.5%(wt/wt)。

為達該第四態樣，該萃取物可被配製成一種藥學或營養醫學補充品，其被添加於食品或飲料內或是被製成一供添加於食品或飲料內以達有效含量的補充物。

在食品或飲料中，它發生作用以降低升糖指數。在這些情形下，可使用每份為50-600mg的劑量(依大小而定)。

當製造一種用於控制血糖位準的口服藥物時，本發明的桑葉萃取物可與下列常用賦形劑共同配製成口服藥物，例如崩散劑(諸如無水澱粉、羧甲基澱粉鈉、L-HPC、交聯型PVP等)；潤滑劑(諸如硬脂酸鎂、滑石粉、苯甲酸鈉、聚乙二醇4000等)以及添加劑(諸如CMC)。

當該萃取物供用於控制血糖位準時，依據萃取物內活性組份的濃度為基準，建議劑量為每次25-600mg，每日3次；較佳為每次100-300mg，每日3次；更佳為每次50-150mg，每日3次。

一般而言，可製成下列形式的產品以作為供皮膚疾病用的化妝品或藥物。這些形式包括含有水、水-醇或油的溶液、含有水或油的凝膠/膠體、微型乳劑、稀釋或濃稠乳劑、鬆散或緻密粉末、具有藉助於聚合物顆粒等微粒所形成之水包油相的懸浮液，以及膠囊，且最好的是離子性或非離子性載劑。

當應用該桑葉萃取物或組成物來製造一種供皮膚疾病用的化妝品或藥物時，它們可呈下列具有相當流動性的劑型：油膏、軟膏、洗劑、乳狀液、乳劑流體、膠漿、糊劑、泡沫體、氣溶膠以及無水固體製劑(例如棒狀)。

當運用本發明的桑葉萃取物來製造供控制血糖位準的口服藥物時，可將它們製成常用的口服劑型，諸如錠劑、膠囊和粉末。

圖式簡單說明

本發明的具體例係參照所附圖式進一步敘述於後，其中：

第1圖是實例1之植物萃取物的HPLC指紋圖譜。上圖是DNJ的標準HPLC，而下圖是實例1之植物萃取物的HPLC指紋圖譜；第2圖是實例1之植物萃取物的UV光譜；第3圖是先前技術萃取物的UV光譜；第4圖顯示色素沈澱降低背後的作用機制示意圖；第5a和b圖顯示被桑萃取物(5a)和DNJ(5b)所抑制的α-葡糖苷酶位準；第6圖是DNJ、熊果素和桑萃取物對於酪胺酸酶的比較效應；第7圖是DNJ、VC-PMG和桑萃取物在黑色素合成抑制性上的比較效應；第8a、b和c圖顯示DNJ(a)、VC-PMG(b)和桑萃取物(c)的相對細胞毒性；第9圖是桑萃取物在威斯塔大鼠中的葡萄糖降低效應；第10圖是桑萃取物在人體中的葡萄糖降低效應；以及第11a和b圖是桑萃取物在人體中的皮膚淨白效應。

詳細說明

第1圖的HPLC是利用下列設定條件所獲得者：

‧　儀器：華特(Waters)(USA)HPLC裝置w600-2420-717，Empower數據處理系統。

‧　管柱：反相使用之舊式Shodex Asahipak NH2P-50E(250 X 4.65 μm)管柱。

‧　試劑：含有6.5 nmol乙酸銨的乙腈-水。

‧　管柱溫度：40℃

‧　流速：1.0毫升/分鐘

‧　檢測器：W2420 ELSD

‧　增益值：100；漂移管溫度50℃；噴霧器加熱位準60%

‧　移動相：乙腈：水(含有6.5nmol乙酸銨)(84: 16)第2圖和第3圖的UV光譜是利用下列條件所獲得：

‧　設備：UNICO UV-2100光譜儀

‧　掃描波長：200-600nm

‧　樣品濃度：1毫克/毫升

本發明的植物萃取物可藉由參照實例1至5所述方法並利用實例6至9中所例示之不同桑葉來獲得。

所得到的植物萃取物可參照實例10至16所示配製成供用作為化妝品或藥物，或是供用作為食品或飲料補充物或添加物。

萃取物的不同活性係藉由實例1至8進一步例示。

實例1.

將100公斤的乾燥白桑桑葉予以磨碎並以12倍之30%乙醇(相對於原料的重量)於回流下萃取3次(每次1小時)。將萃取物濃縮至一給定體積，並令其通過一填充有諸如001X 7之強酸型陽離子樹脂的管柱。管柱的體積為萃取液體的1/14。以水(1.5倍管柱體積)洗滌管柱，並在每小時1.5倍管柱體積的流速下，利用0.7 N氨水(5倍管柱體積)使所欲成份(亞胺糖)從管柱釋出。收集pH為9-11的氨水洗提液。將洗提液濃縮至一給定體積，將銨予以移除並將pH調節至pH 7。隨後，令洗提液通過一填充有諸如S-8之巨孔樹脂的管柱。管柱的體積為洗提液體的1/10，且流速為每小時2倍管柱體積。接著，在真空下將收集到的流體予以乾燥，並將乾燥產物予以磨碎以通過80目篩網。獲得1.4公斤之淡黃色粉末，其含有5.8%之DNJ、21%之總體亞胺糖以及48%之總體胺基酸。

亞胺糖的含量是利用下列分析所測定，而結果示於第1圖，其中下圖為HPLC層析圖，顯示亞胺基主峰(DNJ基準體顯示於上圖)。

(a)正確地稱取適量DNJ作為對照組，添加甲醇以製成0.1毫克/毫升的溶液並充分搖盪。正確測取1毫升溶液並轉移至一個25毫升量瓶中，再加入1毫升之0.4莫耳/升硼酸-氯化鉀緩衝液(pH 8.5)以及2毫升配於無水乙腈內的5毫莫耳/升FMOC-CI。於室溫下經超音波振盪20分鐘後，立即加入2毫升之0.2莫耳/升甘胺酸溶液以及補入0.1%乙酸至該體積，充分搖盪以獲得對照組樣品溶液。

(b)將0.3克萃取物溶解於適量的水中，並令其通過一經預處理的聚醯胺管柱。以一氫氯酸溶液(pH 3)予以洗提。收集洗提液，接著在真空下濃縮至約10毫升。將溶液饋入一經預處理之陰離子交換樹脂管柱。以水洗滌管柱並收集洗提液。在真空下濃縮至約30毫升後，將洗提液轉移至一個50毫升量瓶中，並補水至該體積。正確測取1毫升溶液並轉移至一個25毫升量瓶中，並遵循前述步驟(a)中從「再加入1毫升之...」開始的程序，以獲得測試溶液。

(c)令溶液進行HPLC如下，由其測定亞胺基含量(藉由Empower系統)。吸附劑：C18-ODS；移動相：乙腈：0.1%乙酸(30:70)，進行30分鐘，將移動相改變成乙腈：0.1%乙酸(70:30)，進行10分鐘。利用原始移動相將該系統予以平衡，再注入次一樣品。層析圖譜記錄時間為30分鐘，而檢測波長為265nm。分別正確測取20 μl的對照組溶液和測試溶液，並注入HPLC裝置中進行操作，以獲得HPLC結果。

總體胺基酸的含量係利用一標準胺基酸分析設備進行分析。

實例2.

將100公斤的乾燥白桑桑葉予以磨碎並以18倍的水(相對於原料的重量)於回流下萃取3次。令萃取物通過一填充有諸如Dowex-50之強酸型陽離子樹脂的管柱。管柱的體積為萃取物的1/20。以水(2倍管柱體積)洗滌管柱，再於每小時3倍管柱體積的流速下通過0.5 N氨水(8倍管柱體積)。收集pH為9-11的氨水洗提液。濃縮至一給定體積，將銨予以移除並調節至pH 7。令洗提液通過一填充有諸如HP20之巨孔樹脂的管柱。管柱的體積為洗提液的1/20，且流速為每小時4倍管柱體積。接著，在真空下將收集到的流體予以乾燥，並將乾燥產物予以磨碎以通過80目篩網。獲得1.4公斤之淡黃色粉末，其含有4.3%之DNJ、19%之總體亞胺糖以及40%之總體胺基酸。

UV光譜示於第2圖。兩個獨特的波峰使該萃取物不同於含有較高比例雜質的其他桑萃取物(參見第3圖)。這些雜質導致波峰間無法區辨，且可能導致較低度的有效性位準。

實例3.

將20公斤的乾燥白桑桑葉予以磨碎並以5倍於原料重量的40%乙醇於回流下萃取3次。將併合的萃取物予以過濾，添加等體積的乙醇，定速攪拌半小時，並靜置至隔日。藉由於12000轉/分鐘下進行離心15分鐘來移除沈澱物，以乙醇回復至一給定體積。令上澄液通過一填充有諸如001X7型的強酸型陽離子樹脂的管柱。管柱的體積為液體的1/3。以水(等量於管柱體積)洗滌管柱，並於每小時1倍管柱體積的流速下，以1.0 N氨水(2倍管柱體積)進行洗提。收集pH為9-11的氨水洗提液。濃縮至一給定體積，將銨予以移除並調節至pH 7。令洗提液通過一填充有諸如S-8之巨孔樹脂的管柱。管柱的體積為洗提液的1/13，且流速為每小時1倍管柱體積。接著，在真空下將收集到的流體予以乾燥，並將乾燥產物予以磨碎以通過80目篩網。獲得0.11公斤接近白色的粉末，其含有9.1%之DNJ、29%之總體亞胺糖以及32%之總體胺基酸。

實例4.

將50公斤的乾燥白桑桑葉予以磨碎並以12倍於原料重量的40%乙醇於回流下萃取3次。將併合之萃取物予以過濾，並添加沈澱劑硫酸鋁鉀至pH 3,，攪拌30分鐘。經靜置2小時後，藉由離心來移除沈澱物。將上澄液調節至pH 7。令上澄液通過一填充有諸如001X7之陽離子樹脂的管柱。管柱的體積為液體的1/13。以水(2倍管柱體積)洗滌管柱，並於每小時為1倍管柱體積的流速下，以0.2 N氨水(8倍管柱體積)進行洗提。收集pH為9-11的氨水洗提液。濃縮至一給定體積，將銨予以移除並調節至pH 7。令洗提液通過一填充有諸如AB-8之巨孔樹脂的管柱。管柱的體積為洗提液的1/20，且流速為每小時2倍管柱體積。接著，在真空下將收集到的流體予以乾燥，將乾燥產物予以磨碎並通過80目篩網。獲得0.12公斤接近白色的粉末，其含有18.6%之DNJ、39%之總體亞胺糖以及21%之總體胺基酸。

實例5.

將50公斤的乾燥白桑桑葉予以磨碎並以11倍於原料重量的25%乙醇於回流下萃取4次。將併合之萃取物予以過濾，隨後令其通過一填充有Amberlite IR-120(H+)型樹脂的陽離子樹脂管柱。管柱的體積為液體的1/15。以水(1.5倍管柱體積)洗滌管柱，並於每小時為1.5倍管柱體積的流速下，以0.7 N氨水(5倍管柱體積)進行洗提。收集pH為9-11的氨水洗提液。濃縮至一給定體積，將銨予以移除並調節至pH 7。令洗提液通過一填充有S-8巨孔樹脂的管柱。管柱的體積為洗提液的1/5，且流速為每小時1倍管柱體積。接著，在真空下將收集到的流體予以乾燥，並將乾燥產物予以磨碎以通過80目篩網。獲得0.46公斤之淡黃色粉末，其含有5.6%之DNJ、24%之總體亞胺糖以及48%之總體胺基酸。

實例6.

將5公斤的乾燥魯桑桑葉予以磨碎並以11倍於原料重量的25%乙醇於回流下萃取3次。將併合之萃取物予以過濾，隨後令其通過一填充有001X7型陽離子交換樹脂的管柱。管柱的體積為液體的1/13。以水(2倍管柱體積)洗提管柱，再於每小時為1.5倍管柱體積的流速下，以0.5 N氨水(5倍管柱體積)進行洗提。收集pH為9-11的氨水洗提液。濃縮至一給定體積，將銨予以移除並調節至pH 7。令洗提液通過一填充有巨孔樹脂HP20的管柱。管柱的體積為洗提液的1/10，且流速為每小時4倍管柱體積。接著，在真空下將收集到的流體予以乾燥，並將乾燥產物予以磨碎以通過80目篩網。獲得48克之淡黃色粉末，其含有2.1%之DNJ、8.3%之總體亞胺糖以及65%之總體胺基酸。

實例7.

將5公斤的乾燥黑桑桑葉予以磨碎並以8倍於原料重量的80%乙醇於回流下萃取3次。將併合之萃取物予以過濾並濃縮至約6升，再添加約12升乙醇。於定速下攪拌半小時，並靜置至隔日。藉由在12000轉/分鐘下進行離心15分鐘來移除沈澱物，以乙醇回復至一給定體積，並添加適量的絮凝劑，諸如硫酸鋁。經靜置而完全沈澱後，藉由離心來移除沈澱物。令上澄液通過一填充有諸如001X7之陽離子交換樹脂的管柱。管柱的體積為液體的1/10。以水(等量於管柱體積)洗滌管柱，再於每小時3倍管柱體積的流速下，以0.5 N氨水(4倍管柱體積)進行洗提。收集pH為9-11的氨水洗提液。濃縮至一界定體積，將銨予以移除並調節至pH7。令洗提液通過一填充有巨孔樹脂HP20的管柱。管柱的體積為洗提液的1/15，且流速為每小時4倍管柱體積。接著，在真空下將收集到的流體予以乾燥，並將乾燥產物予以磨碎以通過80目篩網。獲得40克接近白色的粉末，其含有3.9%之DNJ、15%之總體亞胺糖以及58%之總體胺基酸。

實例8.

將5公斤的乾燥小葉桑桑葉予以磨碎並以8倍於原料重量的80%乙醇於回流下萃取3次。將併合之萃取物予以過濾，隨後令其通過一填充有Amberlite IR-120(H+)型陽離子樹脂的管柱。管柱的體積為液體的1/10。以水(1.5倍管柱體積)洗提管柱，再於每小時1.5倍管柱體積的流速下，以0.7 N氨水(5倍管柱體積)進行洗提。收集pH為9-11的氨水洗提液。濃縮至一給定體積，將銨予以移除並調節至pH7。令洗提液通過一填充有AB-8巨孔樹脂的管柱。管柱的體積為洗提液的1/13，且流速為每小時2倍管柱體積。接著，在真空下將收集到的流體予以乾燥，並將乾燥產物予以磨碎以通過80目篩網。獲得42克之淡黃色粉末，其含有1.4%之DNJ、5.2%之總體亞胺糖以及68%之總體胺基酸。

實例9

將50公斤的乾燥白桑桑葉予以磨碎並以10倍於原料重量的30%乙醇於回流下萃取1次。將萃取物予以過濾，隨後令其通過一填充有Amberlite IR-120(H+)型陽離子樹脂的管柱。管柱的體積為液體的1/13。以水(1.5倍管柱體積)洗提管柱，再於每小時2倍管柱體積的流速下，以0.7 N氨水(7倍管柱體積)進行洗提。收集pH為9-11的氨水洗提液。濃縮至一給定體積，將銨予以移除並調節至pH 7。令洗提液通過一填充有AB-8巨孔樹脂的管柱。管柱的體積為洗提液的1/15，且流速為每小時1倍管柱體積。接著，在真空下將收集到的流體予以乾燥，並將乾燥產物予以磨碎以通過80目篩網。獲得0.5公斤之淡黃色粉末，其含有4.2%之DNJ、22%之總體亞胺糖以及46%之總體胺基酸。

實例10.

將8份硬脂酸、5份單硬脂酸甘油酯、3份液態石蠟、8份鯨蠟、1份蜂蠟以及5份聚矽氧油予以混合，並加熱至75℃(形成「基質1」)。將0.7份三乙醇胺、5份甘油和0.05份對羥苯甲酸甲酯予以混合，並加熱至75℃(形成「基質2」)。在經併合的基質1和2中，添加3份(w/w)實例1桑葉萃取物，充分混合並補水至100毫升。冷卻時，添加適量香精以製成一種含有該桑葉萃取物的美白油膏。

實例11.

將7份(w/w)甘油、4份丙二醇、0.2份30% NaOH和0.1份山梨酸鉀予以混合。添加蒸餾水至100毫升，以獲得水相。將10份硬脂酸、8份硬脂酸丁酯、1份單硬脂酸甘油酯、3份硬脂醇分別予以混合並加熱，以獲得油相。將前述水相加熱至95℃。在相同溫度下，緩慢地將油相加入水相中，並持續地施予攪拌。在約45℃下，將2份的實例4桑葉萃取物、0.4份L-抗壞血酸基-2-磷酸鎂和數滴香精加入混合物中，並持續攪拌直至兩相混合為止。冷卻以獲得一糊劑。

實例12.

將7份(w/w)甘油、4份丙二醇、0.2份30% NaOH和0.1份山梨酸鉀予以混合。添加蒸餾水至100毫升，以獲得水相。將10份硬脂酸、8份硬脂酸丁酯、1份單硬脂酸甘油酯和3份硬脂醇個別予以混合並加熱，以獲得油相。將前述水相加熱至95℃。在相同溫度下，緩慢地將油相加入水相中，並持續地施予攪拌。在約60℃下，將2份的實例1桑葉萃取物和0.2份DEP-11加入混合物中。添加數滴香精並持續攪拌直至兩相充分混合為止。冷卻以獲得一糊劑。

實例13.

在0.4份(w/w)實例5桑葉萃取物中，添加0.1份對羥苯甲酸乙酯、0.5份硫酸氫鈉、0.1份依地酸鈉和9份甘油，並補入蒸餾水至100毫升，以獲得一洗劑。

實例14.

將5公斤實例1桑葉萃取物與1.8公斤澱粉、1.5公斤微晶纖維素、0.45公斤交聯型PVP、0.55公斤CSM-Na、適量硬脂酸鎂和矽微粉予以充分混合。製成20,000個錠劑，各約0.5克重。

實例15.

將1.0公斤實例3中之桑葉萃取物與適量澱粉予以混合，填充於10,000個膠囊內，以使各個膠囊含有100毫克的萃取物。

實例16.

在2.0公斤實例3桑葉萃取物中，添加0.5公斤維生素C、1.0公斤檸檬酸、0.8公斤碳酸氫鈉、0.08公斤甘露醇、PVP、PEG 6000、調味劑和黏著劑，以製成泡騰顆粒。

活性測試實驗 實驗1.桑葉萃取物對於α-葡糖苷酶的抑制活性分析

本實驗之目的在於檢驗本發明桑葉萃取物對於α-葡糖苷酶的抑制活性。試劑和裝置敘述如下：

(1)實例1的桑葉萃取物

(2)DNJ基準參考化合物

(3)α-葡糖苷酶(第I型，源自於麵包酵母，EC232.604.7)，利用0.1莫耳/升之磷酸緩衝液(pH 6.8)製成0.42 U/ml的溶液

(4)pNPG，利用0.1莫耳/升之磷酸緩衝液製成5毫莫耳/升的溶液

(5)pNP，利用0.1莫耳/升之磷酸緩衝液(pH 6.8)製成200 μmol/L的溶液

(6)微皿讀數儀(Multiskan Ascent microplate reader)(Thermo Electron Co.,USA)

方法敘述於後：

標準曲線

利用0.1莫耳/升之磷酸緩衝液，將200 μmol/L的pNP溶液稀釋成100 μmol/L、50 μmol/L、25 μmol/L、12.5 μmol/L、6.25 μmol/L和3.125 μmol/L。從各個稀釋溶液中取出200 μl供於405 nm下進行OD測量，並運用這些OD數值繪製標準曲線。

測試樣品分析

(1)　將80 μl不同濃度之各個測試樣品置入微皿的個別井孔中，並以80 μl之磷酸緩衝液作為安慰劑。

(2)　在各個井孔中加入30 μl酵素(0.42 U/ml)，置於實驗檯上歷時30秒，在37℃下與受質(pNPG)共同培育15分鐘，啟動微皿讀數儀，將溫度設定於37℃，測量模式設定成動態且間隔為10秒。讀取讀數13次(總共2分鐘)。

(3)　在各個井孔中加入90 μl受質(5毫莫耳/升之pNPG)，於實驗檯上搖盪30秒，置入微皿讀數儀中，按下START，於37℃下連續測量OD值。

(4)　以pNP的濃度為X軸，並以OD值為Y軸，繪製出標準曲線。利用步驟(3)中所得到的OD值對應該標準曲線而求得反應產物的相關量。

(5)　針對安慰劑和不同濃度的測試樣品，取時間作為X軸並以產物含量作為Y軸，繪製出一反應進行曲線。該直線的斜率即為反應速率。

(6)　以測試樣品的濃度作為X軸並以反應速率作為Y軸，建立測試樣品濃度曲線並求得IC50。抑制活性(U/μg)=(0.5 X各井孔之酵素活性)/(IC50 X各井孔之樣品體積)=(0.5 X 0.42 X 0.03)/(IC50 X 0.08)=0.07875/IC50。

結果與討論：

前述實驗的結果顯示出，實例1中之桑葉萃取物在抑制α-葡糖苷酶上的IC50具有一為13.6 μg/ml的IC50數值，而純質DNJ的IC50數值則為70 μg/ml。此顯示前者的活性遠高於後者。考量到實例1桑葉萃取物內的DNJ含量僅為3.5%此一事實，可以運用該萃取物達到相同或更佳的活性，同時降低因運用較高濃度之純質化合物所導致的可能不良副作用。請參見第5a和b圖，其分別顯示桑萃取物和DNJ對於α-葡糖苷酶的活體外抑制性，以初始反應速率相對於濃度表示之。

實驗2：桑葉萃取物和熊果素對於TYR的抑制活性分析

本實驗之目的在於檢驗測試樣品在黑色素瘤細胞株B16中對於TYR活性的衝擊和作用機制。試劑和裝置敘述如下：

(1)　實例1的桑葉萃取物

(2)　DNJ基準參考化合物

(3)　熊果素基準參考化合物

(4)　L-多巴溶液，1毫克/毫升配於pH 6.8之磷酸緩衝液中，使用前立即製備

(5)　WIP細胞分解緩衝液

(6)　細胞培養皿(24個井孔和96個井孔)

(7)　光學顯微鏡

(8)　離心機

(9)　微皿讀數儀

方法敘述於後：

以經磷酸鹽緩衝化之生理食鹽水來洗滌B16黑色素瘤細胞，並收集於一離心管中。經離心後，將含有苯甲基磺醯氟(PMSF)的WIP-分解緩衝液加入細胞沈澱丸粒中使細胞分解，令溶液靜置於冰上，歷時30分鐘。接著，於4℃下，以12000g之速率將溶液予以離心10分鐘，保留含有細胞成份的上澄液(細胞萃取物)供分析之用。

為了測定DNJ、熊果素和桑萃取物對於酪胺酸酶的催化活性的直接效應，將60μl之DNJ、熊果素或桑萃取物(將化合物所使用的濃度加以變化)加入位於一個96井孔型微皿內的60μl細胞萃取物中。於37℃下，將微皿予以培育1小時，隨後將80μl之L-多巴加入各個井孔中。於37℃下，運用一微皿讀數儀，每隔5分鐘記錄各井孔的吸光值(492nm)，歷時30分鐘。

為了測定DNJ、熊果素和桑萃取物對於酪胺酸酶的催化活性的間接效應，令B16黑色素瘤細胞與不同濃度的DNJ、熊果素或桑萃取物共同培養3日，再進行萃取和評估。經萃取後，將40μl之細胞萃取物、120μl之磷酸鹽緩衝液(pH 6.8)和40μl之L-多巴(2毫克/毫升)置入一個96井孔型微皿內，並於37℃下，運用一微皿讀數儀，每隔5分鐘記錄各井孔於492nm處的吸光值，歷時30分鐘。

結 果與討論：

這些分析的結果可見於第6圖。淡色柱體表示DNJ、熊果素和桑萃取物對於細胞萃取物內之酪胺酸酶活性的直接效應，而深色柱體表示化合物對於酪胺酸酶活性的的間接效應之結果。

在直接活性分析中，熊果素係以劑量相依方式使酪胺酸酶的活性降低，而DNJ和桑萃取物對於酪胺酸酶活性未顯現效應。然而，在間接活性分析中，細胞在測試化合物之存在下被培育3日後，DNJ和桑萃取物組在酪胺酸酶活性上顯現劑量相依性的下降，但與熊果素共同培育的細胞則對於酪胺酸酶活性未顯現效應。

這些發現符合於經發表的文獻，且支持所提出的DNJ和桑萃取物等α-葡糖苷酶抑制劑的不同作用機制。在直接活性分析中，熊果素直接與酪胺酸酶進行交互作用，其結合至活性位址並使酵素失活，因而降低L-多巴氧化成為o -多巴醌。α-葡糖苷酶抑制劑不會直接影響酪胺酸酶的活性，此反映在直接活性分析的結果中，其中DNJ和桑萃取物顯示出不具有酪胺酸酶抑制活性。

在間接活性分析中，DNJ和桑萃取物此二者均顯示出對於酪胺酸酶具有抑制活性。α-葡糖苷酶抑制劑作用於未成熟的酪胺酸酶，並藉由於酪胺酸酶成熟化期間阻止鈣聯蛋白(calnexin)的結合，造成構形變化而影響成熟酪胺酸酶的酵素活性。這些變化係藉由與DNJ和桑萃取物共同培育3日後發生酵素活性降低而獲得證實。熊果素直接與酪胺酸酶的活性位址相競爭，而在間接分析中，熊果素不存在於分析溶液內，酵素活性未受到抑制。

實驗3.本發明的桑葉萃取物對於黑色素細胞內的黑色素含量之衝擊

本實驗之目的在於檢驗測試樣品對於黑色素瘤細胞株B16的黑色素含量之衝擊。所使用的試劑和裝置敘述如下：

(1)　實例1的桑葉萃取物

(2)　DNJ基準參考化合物

(3)　VC PMG基準參考化合物

(4)　WIP分解緩衝液

(5)　光學顯微鏡

(6)　細胞培養皿(24個井孔和96個井孔)

(7)　離心機

(8)　微皿讀數儀

方法敘述於後：

1.　收取處於對數期的黑色素瘤B16細胞，並將細胞懸浮液調節至適當濃度，分配至24井孔型培養皿中，並使細胞附著於井孔內。

2.　在各個井孔中，添加1毫升由培養基稀釋而成的不同濃度測試樣品(各濃度有4個測試複本)。培育2日，更換樣品溶液並持續培育2日。

3.　於第4日時收取細胞，並以PBS充分洗滌二次。添加250 μl之WIP分解緩衝液，於冰浴中令其分解，每5分鐘振盪混合一次，達4-5次。

4.　於4℃下，以12000rpm之速率進行離心10分鐘。拋棄上澄液，並以400 μl之1N NaOH將沈澱物予以溶解，將它置入80℃的水浴中1小時。

5.　運用一具微皿讀數儀來測量位於405 nm處的OD值，並計算相對含量。

結果與討論：

分析的結果可見於第7圖。中間色柱體顯示DNJ對於B16黑色素瘤細胞中之黑色素含量的抑制效應，而深色柱體和淡色柱體顯示VC-PMG和桑萃取物對於B16黑色素瘤細胞中之黑色素含量的抑制效應之結果。所有的效應均是經過3日與不同濃度的DNJ、VC-PMG或桑萃取物培育後所得。

相較於對照組，以不同濃度位準之DNJ、VC-PMG和實例1進行處理會呈劑量相依方式顯著地降低黑色素的含量。這三種化合物的活性強度由強至弱為：DNJ>桑萃取物>VC-PMG。

DNJ是一種從桑萃取物中鑑定出而作用為α-葡糖苷酶抑制劑的活性化合物，且能夠降低酪胺酸酶的活性，致使B-16黑色素瘤細胞株中之黑色素減少。由於所有植物內的天然DNJ含量極低，所以不可能使用天然DNJ供商業用途。惟，就桑萃取物而言，縱使桑萃取物中的DNJ含量低達2-5%，但是桑萃取物仍然展現出類似於DNJ的活性效力，此指出在桑萃取物內，DNJ可能與其他活性化合物協同作用，而產生強力的抗色素沈澱效應。

基於吾人的觀察，當施加於B16黑色素瘤細胞的VC-PMG濃度增加至超過200ppm時，細胞的存活率會下降，此顯示過高濃度之VC-PMG可能對細胞造成傷害。桑萃取物是一種天然產物，相較於VC-PMG具有更佳的安全性和更高的有效性，且其作用機制不同於VC-PMG，故桑萃取物可供單獨使用或與VC-PMG共同使用，以達成較佳的抗色素沈澱效果。

為了將桑萃取物發展成為化妝品中之淨白用產物，吾人估量化妝品中所常用的淨白組份的劑量為：熊果素：1%-5%、麴酸：0.2%-3%、維生素衍生物：<3%。依據吾人的研究，實例1的建議劑量為低於3%。

實驗4.本發明的桑葉萃取物對於黑色素細胞的生長之衝擊方法 細胞存活率

細胞的存活是利用MTT分析來測量，該分析是基於活細胞內的粒線體酵素會將3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯四唑嗅轉化成為MTT-甲結晶。MTT是剛配製於經磷酸鹽緩衝化之生理食鹽水(PBS)內而呈2毫克/毫升之濃度。將每毫升2×10⁴ 個細胞置入數個96-井孔型培養皿內，將DNJ、VC-PMG、桑萃取物或DMEM加入培養基中。在整個實驗期間的不同時點，將20μl分量的MTT儲備溶液加入井孔中，並於37℃下，將培養皿培育於一個5%CO₂ 溼潤培育箱中，歷時4小時。經4小時後，藉由溫和的搖動，令這些細胞的甲結晶溶解於100μl DMSO內。經10分鐘後，甲的含量係運用一個ELISA培養皿讀數儀於540nm下以光譜定量而得。

黑色素瘤細胞內黑色素含量的測定

以每個井孔為4×10⁴ 個細胞的密度，將B16黑色素瘤細胞接種於數個24-井孔型培養皿中，並於37℃下以及5% CO₂ 的環境中培育24小時。隨後，以各種濃度的DNJ、VC-PMG或桑萃取物處理這些細胞，歷時3日。利用經磷酸鹽緩衝化之生理食鹽水來洗滌細胞，並收集於離心管中，經離心後，在冰上令細胞沈澱丸粒於含有苯甲基磺醯氟(PMSF)的WIP分解緩衝液中瓦解，歷時30分鐘。於4℃下，以12000g之速率將溶液予以離心10分鐘，再藉由於70℃下沸騰1小時，令沈澱丸粒溶解於1N NaOH中。黑色素含量是在一光譜儀中於405nm下進行分析。

結果與討論： DNJ、VC-PMG和桑萃取物對於細胞存活率的效應

利用MTT針對B16黑色素瘤細胞進行細胞存活率分析所得到的數據顯示於第8A圖、第8B圖和第8C中。

DNJ、VC-PMG和桑萃取物在給定的濃度下未對於B16黑色素瘤細胞引發生長抑制作用。這些數據明確顯示DNJ、VC-PMG和桑萃取物在低於200ppm的濃度下，於B16黑色素瘤細胞中不具細胞毒性，且顯示細胞的生長不是後述黑色素含量分析的一個影響因素。

實驗5：本發明桑葉萃取物對於威斯塔大鼠的血糖之衝擊

試劑和裝置敘述如下：

(1)　實例1的桑葉萃取物

(2)　生理食鹽水

(3)　米格列醇(Miglitol)基準參考化合物

(4)　64隻威斯塔大鼠

(5)　嬌生單觸式血糖機(Johnson’s One Touch Ultra blood glucose meter)以及第9號血糖試紙(Code 9 blood glucose test strips)

所使用的方法敘述於後：

動物係經腹膜內注射(15mg/kg或30mg/kg)或經胃內(25mg/kg或50mg/kg)接受桑萃取物。米格列醇(Glyset)(25mg/kg)是一種經許可供用於第2型糖尿病的α-葡糖苷酶抑制劑，其用作為正對照組。記錄空腹血糖位準作為基準值，並於接受一頓澱粉餐後，在05小時、1小時和2小時的時間間隔測量血糖位準。在接受澱粉餐前，將桑萃取物給予這些動物。

結果與討論：:

給予澱粉後,05小時、1小時、2小時時的血糖(X±SD,n=10)

結果顯示，桑萃取物顯著地降低了血糖位準。經胃內途徑的給藥顯示，活性化合物具有良好的口服生物可利用性，且不會經由代謝而失活。經胃內以及經腹膜內給藥皆在50mg/kg的劑量下顯著地降低血糖位準，在此研究中與米格列醇(Glyset)同樣有效。請參見第9圖。

實驗6：桑萃取物對於降低人體血糖位準的效應 方法

在一個小型人體研究中，參與者在禁食隔夜後接受400mg之桑萃取物或是安慰劑，加上50克之綿白糖。監測血糖位準3小時。此外，一位參與者接受50克米格列醇以作為正對照組。

結果與討論：

數據顯示，桑萃取物戲劇性地降低了血糖位準，將初始血糖峰值降低了59.91%，將2小時血糖位準降低了50.78%，並將3小時血糖位準降低了47.18%。桑萃取物能夠將綿白糖的升糖指數從83.8降低至41.2。請參見第10圖。

實驗7：桑萃取物對於人體皮膚淨白的效應 方法

將如實例1的桑萃取物製成0.2%和0.5%的油膏調配物，以供研究用。對於20位知情且同意進行實驗的女性個體(年齡為18歲以上)，將各調配物施用於各前臂的預定區域，每日二次。在初次處理前，運用一具色度儀CR300在界定區域上測量膚色。

經過28日的處理，個體返回測試實驗室，在與第0日相同的界定區域上進行新的膚色測量。

就下列三個研究參數進行評價：

- L*(從暗色至淡色)。此為皮膚淨白參數。此一參數的上升代表皮膚的淨白。

- b*(從藍色至黃色)。此一參數的下降代表皮膚的黃色組成的下降。

- ITA°(個人類型角度)。此一參數利用淨白參數(L*)和皮膚黑色素參數(b*)來顯示出個體的皮膚色素沈澱程度。ITA°的上升代表皮膚色素沈澱的下降。

結果與討論：

在28日內每日使用0.2%產品後(平均+0.54 A.U.)，L*參數顯著上升(P<0.001)，代表膚色上的淨白度增加。於90%的個體上觀察到此一效應。請參見第11A圖。

在28日內每日使用0.2%產品後(平均+1 A.U.)，個人類型角度(ITA°)參數顯著上升(P<0.001)，此指出皮膚色素沈澱減低。於57%的個體上觀察到此一效應。請參見第11B圖。

至於0.5%產品：在28日內每日使用後，L*參數顯著上升(P<0.001)，此指出皮膚淨白度增加。於86%的個體上觀察到此一效應。請參見第11A圖。

在28日內每日使用產品後，0.5%調配物的個人類型角度(ITA°)參數顯著上升(P<0.001)，此指出皮膚色素沈澱減低。於67%的個體上觀察到此一效應。請參見第11B圖。

實驗8.萃取物數據

本發明的萃取物(樣品1至3)在下表1中所列示的特性上與先前技術萃取物不相同：

上表1中之數據闡釋於後：

樣品1-3 意指實例1-3所製成的產物；

樣品4 意指依據專利第03139028.5號所製成的產物；

樣品5 由下述方法所製成：將桑葉予以磨碎並以80%乙醇於回流下萃取3次，每次1-2小時。於第一次時，使用6倍於原料重量(w/w)的乙醇，而後於第二及三次時使用4倍的乙醇。將萃取物加以合併，並靜置24小時，再進行過濾。將濾出溶液予以濃縮，並於70-80℃下，以水萃取經濃縮之萃取物5次。每次使用10倍於原料(桑葉)重量的水。將經併合之水萃取物的pH值調整至pH 3-4，並添加NaCl至3-5%的濃度。運用一個60cm(H) x 3cm(D)的管柱，令液體接受D101巨孔樹脂層析。以水進行洗滌直至洗提液變得澄清為止，隨後以5倍管柱體積的30-50%乙醇進行洗提，流速為20/ml。收集洗提液，加以濃縮並乾燥，以獲得樣品(5)。

樣品6 由下述方法所製成：將桑葉予以磨碎，並以50-60%乙醇於50℃下萃取2次，每次使用10-12倍於桑葉重量的乙醇。將萃取物予以濃縮，令其通過一填充有D72強酸型巨孔樹脂的管柱，並收集流體(分離部分1)。以乙醇進行洗提以獲得分離部分2，再藉由含有2%銨的70%乙醇行洗提以獲得分離部分3。將分離部分1、2和3分別予以離心並濃縮。乾燥並混合以獲得樣品(6)。

樣品7 由下述方法所製成：將桑葉予以磨碎，並以80℃的水萃取2次(10-15倍的水)。將經併合之萃取物的pH值調整至pH 2-3，將它冷卻至0℃，直至完全沈澱為止。加以過濾，並令經濃縮之濾出液接受陽離子樹脂層析。以水進行洗提，再運用一由等量之50%乙醇和氨水溶液所構成之混合物進行洗提，直至洗提液變得無色為止。將洗提液予以濃縮並加以乾燥，以獲得樣品(7)。

樣品8 由下述方法所製成：將桑葉予以磨碎，並以30%乙醇萃取3次(每次為5倍於桑葉重量)。將經併合之萃取物予以濃縮，並在濃縮物中加入乙醇進行沈澱。添加水至經濃縮之上澄液中，令它通過一個D101巨孔樹脂管柱，並收集流體。以3倍的水進行洗提，並將流體與水洗提液予以併合，以獲得分離部分1。繼續以60%乙醇(5倍)洗提管柱，以獲得分離部分2。將分離部分1調節至pH4，並令它通過一個陽離子交換管柱。以水洗滌管柱，直至洗提液變得無色為止。以0.5 N氨溶液(8倍)進行洗提並收集洗提液，以獲得分離部分3。將分離部分2和3分別予以濃縮及乾燥，以獲得樣品(8)。

使用於表中溶解度用語定義如後：

‧　「易溶」：1克樣品溶解在少於1毫升的水中；

‧　「可溶」：1克樣品溶解在10-30毫升水中；

‧　「一般」：1克樣品溶解在30-100毫升水中；

前述結果顯示，本發明的產物在活性、關鍵活性本源之含量、顏色以及水溶性上皆優於當前的產品。

第1圖是實例1之植物萃取物的HPLC指紋圖譜。上圖是DNJ的標準HPLC，而下圖是實例1之植物萃取物的HPLC指紋圖譜；

第2圖是實例1之植物萃取物的UV光譜；

第3圖是先前技術萃取物的UV光譜；

第4圖顯示色素沈澱降低背後的作用機制示意圖；

第5a和b圖顯示被桑萃取物(5a)和DNJ(5b)所抑制的α-葡糖苷酶位準；

第6圖是DNJ、熊果素和桑萃取物對於酪胺酸酶的比較效應；

第7圖是DNJ、VC-PMG和桑萃取物在黑色素合成抑制性上的比較效應；

第8a、b和c圖顯示DNJ(a)、VC-PMG(b)和桑萃取物(c)的相對細胞毒性；

第9圖是桑萃取物在威斯塔大鼠中的葡萄糖降低效應；

第10圖是桑萃取物在人體中的葡萄糖降低效應；以及

第11a和b圖桑萃取物經28日的使用後顯著地使皮膚的淨白(L)參數上升，亦即，經28日的使用後，依色度儀所測，皮膚在色澤上顯著變淡.P<0.001。

Claims

一種植物萃取物，其係得自於桑屬(Morus )植物的葉片，其對於抑制α-葡糖苷酶I具有一低於90μg/ml之濃度的IC50數值，且其包含：˙5-40%(w/w)之總體亞胺糖，如依據定量型HPLC及/或LC-MS(液相層析/質譜法)所測量者，包括1-去氧野艽黴素(1-deoxynojirimycin；DNJ)、蕎麥鹼(fagomine)、及N-甲基-DNJ；˙20-70%(w/w)之總體胺基酸；以及˙係呈淡黃色或接近白色；及˙係容易溶解於水。
如申請專利範圍第1項之植物萃取物，其對於抑制α-葡糖苷酶I具有一自5-40μg/ml之濃度的IC50數值。
如申請專利範圍第1或2項之植物萃取物，其包含8-30%(w/w)之總體亞胺糖。
如申請專利範圍第1或2項之植物萃取物，其包含15-20%(w/w)之總體亞胺糖。
如申請專利範圍第1或2項之植物萃取物，其中該等亞胺糖更包括1,4-雙去氧-1,4-亞胺基-D-阿拉伯糖醇(DAB)、2-O-α-D-吡喃半乳糖基-DNJ(GAL-DNJ)以及打碗花精B(calystegin B)。
如申請專利範圍第1或2項之植物萃取物，其包含30-60%(w/w)之總體胺基酸。
如申請專利範圍第6項之植物萃取物，其包含40-50% (w/w)之總體胺基酸。
如申請專利範圍第1或2項之植物萃取物，其中該桑屬植物係選自於：a.白桑(Morus alba L.)；b.魯桑(Morus alba var.multicaulis L.)；c.黑桑(Morus nigra )；以及d.小葉桑(Morus australis Poir)。
如申請專利範圍第1或2項之植物萃取物，其中該萃取物依萃取物的總重量計算係含有1-20%(w/w)之(DNJ)。
如申請專利範圍第1或2項之植物萃取物，其中該萃取物依萃取物的總重量計算係含有2-10%(w/w)之(DNJ)。
如申請專利範圍第1或2項之植物萃取物，其中該萃取物依萃取物的總重量計算係含有4-6%(w/w)之(DNJ)。
如申請專利範圍第1或2項之植物萃取物，其中該萃取物依萃取物的總重量計算係含有1-3%(w/w)之(DNJ)。
如申請專利範圍第1或2項之植物萃取物，其在1%水溶液中具有一介於5.5-6.5的pH值。
如申請專利範圍第1或2項之植物萃取物，其中該萃取物的UV光譜在218nm和263nm處顯示最高吸光值。
一種用於從桑屬植物葉片製造一萃取物的方法，該萃取物對於抑制α-葡糖苷酶I具有一低於90μg/ml之濃度的IC50數值，該方法包含下列步驟：a.自葉片材料進行一水或醇萃取步驟； b.運用一強酸型陽離子交換樹脂進行管柱層析純化步驟，以水洗滌之，並利用一氨溶液予以洗提，收集洗提液，並將氨從洗提液中移除；c.令該洗提液接受運用有一巨孔吸附樹脂的管柱層析，收集溶液；以及d.濃縮並乾燥該萃取物。
如申請專利範圍第15項之方法，其中a.將該等植物葉片加以乾燥並製成粗粉，該萃取步驟是以5-18倍於該等桑屬植物葉片之份量(w/w)的0-40%低分子量醇來進行，且重覆至多5次；b.該管柱是以1-2倍管柱體積的水來洗滌並將滌出液拋棄，該管柱是以2-8倍管柱體積的0.2-1.0N氨水溶液在每小時1-3倍管柱體積的洗提速率下進行洗提，並收集pH值介於9.0和11.0間的洗提液；c.該管柱是以介於20：1至5：1間的溶液與管柱之體積比進行洗提；d.將經乾燥之萃取物予以磨碎以通過80目篩網。
一種植物萃取物之用途，用於製造一供治療色素沈澱所造成之病況的藥物，其中該植物萃取物係如申請專利範圍第1至14項中任一項之植物萃取物或係由如申請專利範圍第15或16項之方法所製成。
如申請專利範圍第17項之用途，其中該藥物係用於降低黑色素的生成。
如申請專利範圍第17或18項之用途，其中該藥物係用於治療色素沈澱過度所造成之不適或疾病，該等不適或疾病包括：雀斑(freckle)、黃褐斑(chloasma)、妊娠纹(striae of pregnancy)、老人斑(senile plaque)以及黑色素瘤(melanoma)。
一種植物萃取物之用途，用於製造一藥物以供控制血糖，其中該植物萃取物係如申請專利範圍第1至14項中任一項之植物萃取物或係由如申請專利範圍第15或16項之方法所製成。
一種組成物，其包含一植物萃取物，該植物萃取物係如申請專利範圍第1至14項中任一項之植物萃取物或係由如申請專利範圍第15或16項之方法所製成，以及一或多種選自於下列物質的皮膚淨白劑：維生素C及其衍生物、麴酸、熊果素、二乙醯博丁(diacetylboldin)、壬二酸、十八烯二酸、十一烯醯苯丙胺酸、甘草萃取物、蘆薈萃取物、水田芥(watercress)萃取物、囊葉藻(ascophyllum)萃取物、蛇麻子(hops)萃取物、麩胱甘肽、蛻皮激素及/或土耳其鞣酸，其中該組成物係化妝品或藥物。
如申請專利範圍第21項之組成物，其中該維生素C衍生物為L-抗壞血酸基-2-磷酸鎂(VC-PMG)。
如申請專利範圍第21或22項之組成物，其中該萃取物與其他皮膚淨白劑的比例為10：1至1：1。
一種組成物，其包含一植物萃取物，該植物萃取物係如申請專利範圍第1至14項中任一項之植物萃取物或係由如申請專利範圍第15或16項之方法所製成，其中該組成物係藥學、營養醫學補充品或是食品或飲料添加物或補充物。
一種食品或飲料，其包含一植物萃取物，該植物萃取物係如申請專利範圍第1至14項中任一項之植物萃取物或係由如申請專利範圍第15或16項之方法所製成。