ES2861225T3 - Extracto vegetal, composiciones que lo contienen, método de extracción y usos del mismo - Google Patents

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Abstract

Un extracto vegetal seco, obtenido hojas de la planta Morus alba L, que tiene un valor de CI50, para inhibir a la α-glucosidasa I, a una concentración de menos de 90 μg/ml caracterizado porque comprende: · 8-30 % (p/p) de iminoazúcares totales, medidos por HPLC cuantitativa y/o LC-MS (cromatografía líquida/espectrometría de masas), incluidos la DNJ, la fagomina y la N-metil-DNJ; en donde el contenido de DNJ es del 1 al 10 % (p/p) calculado sobre la base del peso total del extracto seco, y en donde los iminoazúcares incluyen además, 1,4 didesoxi-1,4-imino-D-arabinitol (DAB), 2-O-α-D-galactopiranosil-DNJ (GAL-DNJ) y calistegina B; y · 30-60 % (p/p) de aminoácidos totales que incluyen arginina, leucina, lisina y fenilalanina; y · es de color amarillo pálido o casi blanco; · es fácilmente soluble en agua; · tiene un valor de pH de entre 5,5-6,5 en una solución acuosa al 1 %; y · un espectro UV que muestra una absorción máxima a 218 nm y 263 nm.

Description

DESCRIPCIÓN
Extracto vegetal, composiciones que lo contienen, método de extracción y usos del mismo
La presente invención se refiere a un extracto vegetal, a las composiciones que contienen el mismo, a un método de extracción y al uso de dicho extracto.
Antecedentes
Las hojas de morera tienen una larga historia de uso medicinal en los países asiáticos, en particular en China. En los últimos años, los fitoquímicos aislaron varios constituyentes iminoazúcares de las hojas de morera, tales como la 1-desoxinojirimicina (DNJ), la fagomina y la N-metil-DNJ. Las estructuras químicas de los iminoazúcares son similares a las de los monosacáridos, que son en su mayoría heterocíclicos polihidroxilados con un anillo de 5 a 6 miembros. La diferencia clave entre los dos radica en los heteroátomos del heterociclo. El primero contiene átomos de nitrógeno (N) mientras que el último contiene oxígeno (O).
Se demostró que los constituyentes iminoazúcares de las hojas de morera exhiben cierta actividad inhibitoria sobre las a-glucosidasas I y II, entre los que la DNJ mostró la actividad más fuerte. Experimentos farmacológicos adicionales revelaron que la DNJ actuaba sobre el melanocito mediante la inhibición del proceso de maduración de la TYR, lo que dio como resultado la reducción de la producción de melanina. (Genji Imokawa, Analysis of Carbohydrate Properties Essential for Melanogenesis in TYRs of Cultured Malignant Melanoma Cells by Differential Carbohydrate Processing Inhibition. The Journal of Investigative dermatology, 1990, 95 (1): 39-49; Ju Young Park, hyunjung Choi, Jae Sung hwang, Junoh Kim, Ih-Seop Chang, Enhanced depigmenting effects of N-glycosylation inhibitors delivered by pH-sensitive liposomes into HM3KO melanoma cells, Journal of Cosmetic Science, 2008, 59: 139-150.)
Los inventores de la presente invención llevaron a cabo un conjunto de experimentos enzimáticos y encontraron que el extracto de iminoazúcar total (medido por el contenido de 1 desoxinojirimicina (DNJ), N-metil-DNJ y fagomina) de las hojas de morera como se describe en los extractos de la presente invención poseía una actividad inhibitoria más potente sobre las a-glucosidasas I y II que el químico DNJ puro. Este descubrimiento hace posible el uso de tales extractos de morera para lograr la inhibición de las a-glucosidasas I y II con concentraciones menores de DNJ, de esta manera se reduce la posibilidad de una posible reacción adversa al fármaco (RAF) y hace que el producto terminado sea más seguro de usar. Además, ya que el costo de producir el extracto de morera, como se describe en la presente invención, es mucho menor que el de obtener el químico DNJ puro, el costo de tratar las afecciones relacionadas con la hiperpigmentación podría reducirse en gran medida.
Por lo tanto, los cosméticos y los productos farmacéuticos fabricados a partir de tales extractos tienen enormes ventajas en eficacia, seguridad y costo sobre aquellos que contienen químicos puros como la DNJ, cuya estructura se da más abajo.
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Estructura de la 1-desoxinojirimicina (DNJ)
En el pasado, hubo varios investigadores en China o en el extranjero que intentaron comercializar los extractos de morera en el mercado de productos de belleza para blanquear y reducir manchas. Sin embargo, en comparación, el presente extracto tiene características bastante diferentes y ofrece varias ventajas.
La patente China ZL99123894X describe una composición de extractos vegetales para el tratamiento de la pigmentación de la piel, que se compone de una combinación de tres ingredientes principales, específicamente un extracto de plantas del género Morus, un extracto de plantas del género Scutellaria y derivados del ácido salicílico. El extracto de Morus de esa invención se obtuvo de la raíz de morera, que contenía principalmente kuwanona y no había una especificación clara del extracto.
La solicitud de patente de EE. UU. Núm. 347884 describe el uso de un extracto de las ramas del árbol morera para los mismos fines cosméticos, con los componentes activos en los extractos que son oxiresveratrol y mulberrósido. En comparación con estas dos invenciones, la presente invención tiene las siguientes ventajas y características:
1. Ventaja de la materia prima. La materia prima, hojas de morera, usada en la presente invención, es más fácil de regenerar, y ofrece un recurso más sostenible que las raíces y las ramas. También ofrece un costo relativamente menor que las dos invenciones mencionadas anteriormente.
2. Diferentes mecanismos de acción. En las dos invenciones mencionadas anteriormente, la actividad se logró a través de la inhibición competitiva sobre la TYR. En la presente invención, el mecanismo de acción es reducir la producción de melanina a través de la inhibición de laa-glucosidasa, lo que da como resultado una TYR menos madura (y menos/ inactiva).
3. Diferentes principios activos. En las patentes mencionadas anteriormente, los principios activos fueron flavonoides, por ejemplo kuwanonas, o difeniletanoides, por ejemplo oxiresveratrol y mulberrósidos. Por el contrario los principios activos de la presente invención son iminoazúcares, y se emplean diferentes métodos de preparación para aislar un extracto rico en estos iminoazúcares.
4. Proceso de preparación único. El proceso se diseñó para asegurar una extracción y purificación óptimas de los ingredientes activos que mejoren por ejemplo las propiedades físicas del extracto, lo que lo hace más adecuado para ser usado en, por ejemplo, productos cosméticos.
Otra técnica citada y distinguida incluye:
JP2007060908;
CN101224240'
WO2006119038
EP2255822;
WO2008025249;
US2001018090;
WO2005009351;
US2007036874;
BUTT MS Y OTROS, "Morus alba L. nature's functional tonic", TRENDS IN FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY, vol. 19, núm. 10, páginas 505 - 512;
XP025610590 [I] 1-17, página 508 - 510;
CN101007017;
KR100864852B; y
LIU, YINGHUA Y OTROS, "Inhibition of extract from mulberry leaves on tyrosinase activity", CHINESE JOURNAL OF CLINICAL REHABILITATION, vol. 9, núm. 3, páginas 164 - 165, (documento XP008153575)
La melanina es el factor más importante para determinar el color de la piel humana. Se biosintetiza en el melanosoma de los melanocitos en la capa basal de la epidermis. Bajo condiciones fisiológicas normales, la melanina protege la piel de las lesiones por luz ultravioleta. Cuando el metabolismo de la síntesis de melanina se afecta por factores externos, trastornos hormonales, procesos seniles, etc., la melanina en la capa basal de la epidermis aumentará y el color de la piel se oscurecerá. Esto a su vez dará como resultado afecciones de pigmentación o enfermedades tales como las pecas, el cloasma, las estrías del embarazo, la placa senil y el melanoma. Además, hay un gran número de personas preocupadas por la belleza quienes anhelan una piel más blanca y por lo tanto existe una demanda para agentes y cosméticos para aclarar la piel, blanquear y reducir las manchas.
En resumen, la biosíntesis de melanina incluye las siguientes etapas
Figure imgf000004_0001
La tirosinasa (TYR), un tipo de glicoproteína que contiene cobre iónico, y es la enzima clave para la biosíntesis de melanina. Cataliza la reacción para transformar la tirosina en dopa y dopaquinona. La TYR se considera un blanco importante para reducir la pigmentación y se usa frecuentemente en el área de investigación para productos con la función de blanquear la piel y reducir las manchas.
Actualmente la forma principal de dirigirse a TYR es inhibir su formación y actividad para reducir la producción de melanina. Los productos actuales que contienen inhibidores de la TYR incluyen el 1,4-dihidroxibenceno (hidroquinona) y sus derivados, el ácido kójico y sus derivados, y la arbutina.
Mientras que el 1,4-dihidroxibenceno y sus derivados son capaces de inhibir el 100 % de la actividad de la TYR, también estimulan a los melanocitos y muestran citotoxicidad. El uso prolongado acoplado con la exposición a la luz podría causar manchas de pigmento exógenas. Por lo tanto están prohibidos en los productos para el cuidado de la piel.
El ácido kójico es muy estable y tiene buenos efectos en la reducción de manchas de pigmento a través de la quelación de iones de cobre para disminuir la actividad de la TYR. Sin embargo, el uso prolongado del ácido kójico podría causar citotoxicidad lo que da como resultado enfermedades de la piel. Los investigadores japoneses demostraron que el ácido kójico podría causar cáncer de hígado (Tamotsu Takizawa, Toshio Imai, Jun-ichi Onose, Makoto Ueda, Toru Tamura, Kunitoshi Mitsumori, Keisuke Izumi y Masao Hirose. Enhancement of Hepatocarcinogenesis by Kojic Acid in Rat Two-Stage Models after Initiation with N-bis(2-hydroxypropyl) nitrosamine or N-diethylnitrosamine. Toxicological Sciences 200481(1):43-49).
La arbutina se considera un producto de belleza blanqueador y reductor de manchas con muy pocos efectos secundarios pero es altamente sensible a la luz y como consecuencia, se requiere que se añadan grandes cantidades de agentes de protección solar al producto terminado, lo que aumenta la carga para la piel y por lo tanto acelera su proceso senil.
Las deficiencias anteriores restringen la aplicación de los productos existentes en el mercado de productos de belleza para blanquear la piel y reducir las manchas.
La TYR es una proteína con una cadena de azúcar (glicoproteína). La investigación moderna en bioquímica reveló que en el proceso de su producción (y madurez) la cadena de azúcar original debe sufrir una serie de modificaciones para transformar la TYR recién producida en TYR madura que tiene las funciones biológicas normales. Las a-Glucosidasas I y II son las enzimas claves en este proceso. La a-Glucosidasa I es responsable principalmente de "cortar" el grupo de glucosa con el enlace a-1,2 en el extremo lejano de la cadena de azúcar mientras que la a-Glucosidasa II cortará, en dos etapas, los dos grupos de glucosa restantes, enlazados por una conexión a-1,3. (Mehta A, Zitzmann N, Rudd PM, Block TM, Dwek RA. a-Glucosidase inhibitors as potential broad based anti-viral agents, FEBS Letters, 1998, 430(1):17-22).
Se cree que cuando las a-glucosidasas I y II se inhiben, se retarda la modificación de la cadena de azúcar de la glicoproteína lo que da como resultado la no producción de la TYR madura. Con "la TYR inmadura" la producción de melanina se reduce consecuentemente en proporción. (Hiroyuki Takahashi, Peter G. Parsons, Rapid and reversible inhibition of TYR activity by glucosidase inhibitors in human melanoma cells, The Journal of Investigative dermatology, 1992, 98(4):481-487.)
Por lo tanto, sería un enfoque altamente factible reducir la producción de melanina y a su vez la pigmentación de la piel mediante la inhibición de las a-glucosidasas I y II para minimizar la formación de TYR madura, como se ilustra en la Figura 4 que muestra el mecanismo de acción propuesto. para la inhibición de la síntesis de melanina. La modificación esencial de la tirosinasa, catalizada por la a-glucosidasa, se inhibe por el extracto de Morus lo que da como resultado la formación de tirosinasa inactiva.
Breve resumen de la descripción
De acuerdo con la presente invención se proporciona un extracto vegetal seco, obtenido de hojas de la planta Morus alba L, que tiene un valor de CI50, para inhibir a la a-glucosidasa I, a una concentración de menos de 90 pg/ml caracterizado porque comprende:
• 8-30 % (p/p) de iminoazúcares totales, medido por HPLC cuantitativa y/o LC-MS (cromatografía líquida/espectrometría de masas), que incluye DNJ, fagomina y N-metil-DNJ; en donde el contenido de DNJ es del 1 al 10 % (p/p) calculado sobre la base del peso total del extracto seco, y en donde los iminoazúcares incluyen además, 1,4 didesoxi-1,4-imino-D-arabinitol (DAB), 2-O-a-D-galactopiranosil-DNJ (GAL-DNJ) y calistegina B; y
• 30-60 % (p/p) de aminoácidos totales que incluyen arginina, leucina, lisina y fenilalanina; y
• es de color amarillo pálido o casi blanco;
• es fácilmente soluble en agua;
• tiene un valor de pH de entre 5,5-6,5 en una solución acuosa al 1 %; y
• un espectro UV que muestra una absorción máxima a 218 nm y 263 nm.
Preferentemente la planta tiene un valor de Capara inhibir a la a-glucosidasa I a una concentración de menos de 70 pg/ml y con mayor preferencia de 5- 60 pg/ml y con mayor preferencia todavía de 5-40 pg/ml.
El CI50 se puede determinar como se detalla en el Experimento 1.
Se considera que la mejora de la actividad de los extractos sobre la DNJ pura aislada se debe a la actividad de los otros iminoazúcares presentes en el extracto. Los iminoazúcares totales se miden mediante HPLC cuantitativa y/o LC-MS (cromatografía líquida/espectrometría de masas). Los iminoazúcares medidos incluyen a la 1 desoxinojirimicina (DNJ), la N-metil-DNJ y la fagomina.
Con mayor preferencia el extracto comprenderá el 15-20 % (p/p) de los iminoazúcares totales.
Mediante el control con precisión del contenido de los componentes químicos característicos, se vuelve posible controlar efectivamente la calidad del producto por lo tanto se proporciona cierta seguridad en cuanto al efecto cosmético o terapéutico del producto.
La presencia de DAB, que es un inhibidor de la glucógeno fosforilasa, puede ser de importancia en el uso de extractos en el control del metabolismo del azúcar cuya aplicación constituye un aspecto adicional de la invención.
Con mayor preferencia el extracto contiene del 40-50 % (p/p) de aminoácidos totales.
Los aminoácidos presentes en el extracto incluyen 8 aminoácidos esenciales que el cuerpo humano es incapaz de producir e incluyen arginina, leucina, lisina y fenilalanina que promueven la secreción de insulina. Como es bien sabido, los aminoácidos son esenciales para mantener la hidratación y elasticidad de la piel. La deficiencia de aminoácidos debilitará el metabolismo de la piel y acelerará el proceso senil de la piel. (Marty J. P., NMF and cosmetology of cutaneous hydration. Annales de Dermatologie et de Vénéréologie, 2002, 129(1 Pt 2):131-136.).
Por lo tanto el extracto de la presente invención también funcionará para ayudar a mantener la salud de la piel.
El extracto de la invención se obtiene a partir de hojas de Morera de la familia Moraceae, género Morus, especie Morus alba L.
Los inventores de la presente invención llevaron a cabo análisis químicos de los componentes químicos de las hojas de las plantas de Morus comunes y descubrieron que las hojas de M. alba tenían el mayor contenido de iminoazúcares.
Con mayor preferencia el contenido de iminoazúcar se estandariza con referencia a la DNJ que está presente en una cantidad del 1-10 % (p/p) de (DNJ) calculado sobre la base del peso total del extracto, con mayor preferencia del 2-10 % (p/p) de (DNJ) calculado sobre la base del peso total del extracto y, en dependencia del uso previsto, ya sea 4-6 % (p/p) de (DNJ) calculado sobre la base del peso total del extracto o 1-3 % (p/p) de (DNJ) calculado sobre la base del peso total del extracto. La DNJ es también el iminoazúcar presente predominante (mayor rendimiento).
El extracto de la invención difiere de los extractos de Morera actuales en varias formas que incluyen:
• su color - es amarillo pálido,
• su solubilidad - es fácilmente soluble en agua,
• su pH: tiene un valor de pH de entre 5,5 - 6,5 en una solución acuosa al 1%, y
• su espectro UV - muestra una absorción máxima a 218 nm y 263 nm.
El extracto se puede producir mediante el uso de un nuevo proceso de extracción y purificación que comprende tres etapas básicas cuyo proceso constituye un aspecto adicional de la invención.
De acuerdo con un segundo aspecto de la presente invención se proporciona un método para producir un extracto vegetal seco de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, de hojas de la planta Morus alba L, que tiene un valor de C I50 para inhibir a la a-glucosidasa I a una concentración de menos de 90 pg/ml que comprende las etapas de:
a. Llevar a cabo una etapa de extracción acuosa o alcohólica del material de la hoja;
b. Llevar a cabo una etapa de purificación por cromatografía en columna mediante el uso de una resina de intercambio catiónico de ácido fuerte, lavar con agua, y eluir con una solución de amoniaco colectar el eluyente y retirar el amoniaco del mismo;
c. Someter el eluyente a cromatografía en columna mediante el uso de una resina de absorción macroporosa, colectar la solución; y
d. Concentrar y secar el extracto
en donde:
en la etapa a) las hojas de la planta se secan y se convierten en un polvo grueso, la etapa de extracción se lleva a cabo con 10-13 veces de agua o 20-30 % de un alcohol de bajo peso molecular por la cantidad de hojas de la planta Morus alba L (p/p), y se repite hasta 5 veces,
en la etapa b) la columna se lava con 1-2 veces de agua del volumen de la columna y se desecha el lavado, la columna se eluye con 2-8 veces de solución acuosa de amoniaco a 0,2-1,0 N del volumen de la columna, a una velocidad de elución de 1-3 veces del volumen de la columna por hora, y el eluyente se colecta con un valor de pH de entre 9,0 y 11,0,
en la etapa c) la columna se eluye con una relación de volumen entre la solución y la columna de entre 20:1 a 5:1, y
en la etapa d) el extracto seco se pulveriza para pasarlo a través de un tamiz de 80 mesh.
Detalles más completos del proceso de extracción para obtener el extracto de la invención se detallan más abajo:
Extracción (Etapa 1): Las hojas de la planta se secaron al horno y se convirtieron en un polvo grueso. Extraer el polvo con 10-13 veces de o agua o de alcohol de bajo peso molecular al 20-30 % por la cantidad de hojas de la planta Morus alba L (p/p), y se repite hasta 5 veces y con mayor preferencia con 11 veces de la cantidad de materia prima (p/p) de alcohol de bajo peso molecular al 25%, para obtener el extracto líquido.
Purificación 1 (Etapa 2): Cromatografía en columna mediante el uso de una resina de intercambio catiónico: Después de la filtración del extracto líquido obtenido en la etapa (1), la solución se pasa a través de una columna rellenada con una resina catiónica de ácido fuerte. Eluir la columna con 1-2 veces, preferentemente 1,5 veces, del volumen de la columna de agua, y desechar el eluyente. Adicionalmente eluir la columna con 2-8 veces del volumen de la columna de solución acuosa de amoniaco a 0,2-1,0 N, preferentemente 5 veces, solución acuosa de amoniaco a 0,7 N, con una velocidad de elución de 1-3 veces del volumen de la columna por hora, preferentemente 1,5 veces por hora. Colectar el eluyente con valores de pH de entre 9,0 y 11,0.
Purificación (Etapa 3): Cromatografía en columna mediante el uso de una resina de absorción macroporosa: Eliminar el amoniaco del eluyente en la etapa (2) y ajustar a pH 7. Pasar la solución a través de la columna rellenada con una resina de absorción macroporosa. La relación de volumen entre la solución y la columna debe ser de 20:1 a 5:1, preferentemente 15:1 a 10:1 y con mayor preferencia 13:1. Concentrar el fluido colectado corrido a través de la columna y secar el concentrado, que luego se pulveriza para pasarlo a través de un tamiz de 80 mesh para obtener el extracto de la presente invención.
Basado en el método de extracción mencionado anteriormente en la etapa (1), dicho alcohol de bajo peso molecular debe ser un alcohol alquílico de cadena lineal con no más de 4 átomos de carbono, preferentemente, metanol o etanol. Dicha extracción se extrae bajo reflujo durante 1-3 horas, preferentemente 1-2 horas y con mayor preferencia 2 horas.
Después de la filtración del extracto líquido obtenido en la etapa (1), se pueden adaptar medidas adicionales para eliminar más impurezas, mejorar la bioactividad del extracto y decolorar el extracto. Aquellas medidas incluyen precipitación con alcohol, precipitación floculante, y otras adecuadas para la eliminación de proteínas, taninos y polisacáridos. Los precipitados se pueden eliminar ya sea mediante centrifuga o filtración. El método de purificación preferido en la presente descripción es la precipitación con alcohol y la centrifugación: Concentrar la infusión a % del volumen original, añadir 1-3 veces de etanol al 95 %, agitar durante media hora y dejarlo durante 8-12 horas, centrifugar a 12000 r/min durante 15 min. Conservar el sobrenadante para purificación adicional.
Basado en el método de extracción descrito en la presente descripción, el volumen total del extracto líquido en la etapa (2) debe ser 2-20 veces de la columna de resina de intercambio catiónico, preferentemente 10-15 veces y con mayor preferencia 13 veces.
Bajo estas condiciones los componentes activos pueden ser absorbidos efectivamente por la resina de intercambio catiónico que ayuda a aumentar el contenido de los químicos activos.
La resina catiónica de ácido fuerte usada en la presente descripción se puede seleccionar de los siguientes tipos: 001X7 (#732), Amberlite IR-120, Dowex-50, Lewatit-100, Zrolit 225 o Diaion SK-1, etc., con 001X7 (732) como la más preferida debido a su mejor propiedad de absorción para concentrar los componentes activos y su costo menor.
Durante la elución de la columna de resina de intercambio catiónico mediante el uso de agua amoniacal, el valor de pH del eluyente aumentó gradualmente. El análisis biológico y químico del eluyente reveló que el contenido de las fracciones con pH 9-11 mostró la actividad más alta y por tanto solo se colectaron aquellas fracciones con pH 9-11.
Basado en el método de extracción descrito en la presente descripción, el régimen de flujo en la etapa (3) debe ser 1­ 4 veces, preferentemente 2 veces, del volumen de la columna por hora. Esto asegura la máxima absorción de las impurezas de color por la resina macroporosa lo que asegura una buena decoloración.
Se pueden seleccionar cuatro tipos de resinas macroporosas para la cromatografía en columna mencionada anteriormente: AB-8, HP20, S-8 y YWD03F4. Después de la comparación y validación del proceso, se encontró que la resina S-8 produjo el mejor resultado de decoloración y por lo tanto la resina Tipo S-8 es el material de resina macroporosa preferido.
El extracto de hoja de morera obtenido de acuerdo con el proceso anterior tiene un pico de absorción máximo a 218,3 nm bajo escaneo UV y es de color amarillo pálido, que es distinguible del de otros extractos de hoja de morera actualmente disponibles en el mercado. La mayoría de los extractos de hojas de morera usados en productos de belleza en el mercado tienen un color más profundo, es decir, ya sea amarillo o amarillo parduzco, lo que da como resultado productos terminados de color, lo que no se considera como una apariencia ideal.
El extracto descrito en la presente invención es fácilmente soluble en agua y esto proporciona una mejor difusión y absorción de los ingredientes activos en el área blanco. Los extractos de morera que se usan actualmente en los productos de belleza para blanquear contienen flavonoides (por ejemplo, kuwanonas) y difeniletanoides (por ejemplo, oxiresveratrol y mulberrósidos) y como consecuencia tienen una solubilidad en agua relativamente pobre con una difusibilidad promedio, que en la práctica requiere el uso de alcohol de bajo peso molecular para mejorar la solubilidad, lo que aumenta por lo tanto la carga sobre la piel.
El extracto descrito en la presente invención tiene un valor de pH de 5,5-6,5 en una solución acuosa al 1 %. Este pH ligeramente ácido está cerca del pH de la película de sebo sobre la superficie de la piel que es 4,5-6,6. Cuando dicho extracto se convierte en productos para el cuidado de la piel, se reduce por lo tanto la irritación a la piel causada por los componentes activos.
El extracto de la presente invención puede formularse para su uso como producto farmacéutico o cosmético para su uso como un agente aclarador de la piel o para reducir la hiperpigmentación de la piel o como un producto farmacéutico, nutracéutico o ingrediente alimenticio o de bebida para controlar los niveles de glucosa en sangre. Por lo tanto, puede usarse para, por ejemplo, tratar la diabetes tipo 2 o para disminuir el índice glicémico de un alimento o bebida.
De acuerdo con un tercer aspecto de la presente invención se proporciona el uso de un extracto vegetal seco de la invención o el producto del método de la invención para tratar: las pecas, el cloasma, las estrías del embarazo, y la placa senil.
Preferentemente la aplicación cosmética o terapéutica es para reducir la producción de melanina, que incluye el tratamiento de afecciones o enfermedades causadas por hiperpigmentación que incluyen: las pecas, el cloasma, las estrías del embarazo, la placa senil y el melanoma.
Un experimento farmacológico mediante el uso del extracto de hoja de morera de la presente invención reveló que dicho extracto inhibía efectivamente la actividad de la a-glucosidasa con mayor potencia que una muestra cuantitativamente equivalente de DNJ pura. Se requirió solo la mitad de la concentración de DNJ para que el extracto lograra el mismo efecto que la DNJ pura. Cuando se probó en líneas celulares, dicho extracto mostró un efecto de inhibición significativo contra la formación de melanina en las líneas celulares de melanoma A375 y B16 y la potencia fue mayor que la de los ingredientes usados frecuentemente en los productos blanqueadores de belleza comercializados, tales como la arbutina y el L-ascorbil-2-fosfato de magnesio. Los mecanismos de acción del extracto de hojas de morera de la presente invención difieren de los de la arbutina y el L-ascorbil-2-fosfato de magnesio. Los dos últimos inhiben directa y competitivamente la actividad de la TYR, mientras que dicho extracto de hoja de morera inhibe principalmente la formación de TYR activa maduro. La ventaja de dicho extracto de hoja de morera incluye una mayor potencia y una acción más prolongada. Debido a los diferentes mecanismos de acción, dicho extracto de la presente invención puede usarse solo o junto con los inhibidores de TYR mencionados anteriormente. Un estudio clínico en humanos confirma estos datos in vitro y después de 28 días de aplicación tópica de una formulación de crema de extracto de hoja de morera al 0,2 % o al 0,5 % hubo una reducción significativa en la pigmentación de la piel (P<0,001) y un aclaramiento significativo de la piel (P<0,001)
De acuerdo con un cuarto aspecto de la presente invención, se proporciona un extracto vegetal seco de la invención o el producto del método de la invención para su uso en el control de la glucosa en sangre.
Preferentemente el extracto para usar en el control de la glucosa en sangre comprende además un inhibidor de la glucógeno fosforilasa.
En el experimento con animales mediante el uso del modelo de rata Wistar, y el estudio clínico en humanos, el extracto de hojas de morera de la presente invención demostró un efecto hipoglucemiante en la sangre significativo.
El extracto de la invención es particularmente bueno ya que se beneficia de una combinación de activos. Por lo tanto, los componentes iminoazúcares, tales como la DNJ, inhiben a la a-glucosidasa en el intestino, lo que da como resultado la reducción de la absorción de sacáridos (Asano N., Glycosidase inhibitors: update and perspectives on practical use. Glycobiology, 2003, 13(10): 93R -104R.). Se encontró que otro de los iminoazúcares 1,4-didesoxi-1,4-imino-D-arabinitol (DAB1), tiene una fuerte actividad inhibitoria contra la glucógeno fosforilasa hepática y también para inhibir in vivo la descomposición del glucógeno hepático. Como consecuencia es antihiperglicémico. Además, la presencia de aminoácidos tales como la arginina, la leucina, la lisina y la fenilalanina, tiene la función de promover la secreción de insulina.
Por lo tanto, los extractos descritos en la presente invención pueden usarse para controlar los niveles de glucosa en sangre después de las comidas y ajustar el equilibrio de la glucosa en sangre.
Tales extractos se pueden formular para su uso como un medicamento o producto sanitario (tales como un aditivo o suplemento alimenticio) para el control de la glucosa en sangre.
Para proporcionar el tercer aspecto el extracto puede formularse como un cosmético o medicamento que comprende excipientes y opcionalmente uno o más activos alternativos.
Para su uso como agentes aclaradores de la piel, otros activos se pueden seleccionar de, por ejemplo, vitamina C y sus derivados, tales como fosfatidato de vitamina-magnesio, ácido kójico, arbutina, diacetilboldina, ácido azelaico, ácido octadecenodioico, undecilenoilfenilalanina (DEP-11), extracto de regaliz, extracto de aloe, extracto de berro (Nastutium officinale), extracto de Ascophyllum (Ascophyllum nodosum), extracto de lúpulo (Humulus lupulus), glutatión, ecdisona y/o ácido elágico.
Un cosmético o medicamento preferido comprende el extracto de la invención junto con el derivado de la vitamina C, L-ascorbil-2-fosfato de magnesio (VC-PMG).
Preferentemente, en un producto combinado el extracto está presente en una relación de 10:1 a 1:1 de extracto a otro agente aclarador de la piel, con mayor preferencia 5:1.
Cuando se fabrican cosméticos o fármacos para enfermedades de la piel mediante el uso del extracto de hoja de morera de la presente invención o una composición que contiene también otros ingredientes, todos los materiales de base comunes aceptables en farmacéutica pueden usarse, lo que incluye materiales de base solubles en agua tales como la glicerina, el polietilenglicol, los derivados de celulosa, etc. y materiales de base liposolubles tales como las grasas, los lípidos, los hidrocarburos, etc. Los siguientes excipientes también se usan comúnmente, e incluyen conservantes, tales como las nipaginas, el clorobutanol y los ácidos sórbicos; antioxidantes tales como el sulfito de sodio, el bisulfito de sodio, el BHT, etc; espesantes, tales como el ácido esteárico, la cera de abejas, la parafina, el alcohol láurico, la carboximetilcelulosa (CMC), etc; emulsionantes tales como la trietanolamina, el monoestearato de glicerol, el Tweens, etc; agentes protectores solares tales como el metoxicinamato de octilo, la benzofenona-3, etc; humectantes (hidratante) tales como la glicerina, el propilenglicol, el sorbitol, etc; desodorantes, fragancias y agentes colorantes, etc. Las cantidades de los excipientes mencionados anteriormente se conocerán por la persona calificada.
Cuando dicho extracto se usa en productos cosméticos para reducir la producción de melanina, la cantidad recomendada en el producto terminado debe ser de 0,05-2 %, preferentemente de 0,1-1 % y con mayor preferencia de 0,2-0,5 % (p/p).
Para proporcionar el cuarto aspecto el extracto puede formularse en un producto farmacéutico o nutracéutico, añadirse a un alimento o bebida o proporcionarse como un suplemento para añadirlo al mismo en una cantidad efectiva. En un alimento o bebida funciona para disminuir el índice glicémico. En tales casos puede usarse una dosis de 50­ 600 mg por ración (en dependencia del tamaño).
Cuando se fabrican fármacos orales para el control del nivel de glucosa en sangre el extracto de hoja de morera de la presente invención puede formularse con excipientes comunes para fármacos orales tales como, agentes desintegrantes (por ejemplo, almidón seco, carboximetil almidón sódico, L-HPC, PVP entrecruzado, etc); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, polvo de talco, benzoato de sodio, polietilenglicol 4000, etc) y adhesivos (por ejemplo, CMC).
Cuando dicho extracto se usa para controlar el nivel de glucosa en sangre, basado en las concentraciones de los componentes activos en el extracto, la dosis recomendada es de 25-600 mg cada vez, 3 veces al día; preferentemente 100-300 mg cada vez, 3 veces al día; con mayor preferencia 50-150 mg cada vez, 3 veces al día.
Convencionalmente, las siguientes formas de los productos pueden fabricarse para cosméticos o fármacos para enfermedades de la piel. Estas formas incluyen soluciones que contienen agua, agua-alcohol o aceite, gel/coloides que contienen agua o aceite, microemulsiones, emulsiones diluidas o espesas, polvos sueltos o densos, dispersiones con aceite en fase acuosa formadas con la ayuda de micropartículas tales como partículas y cápsulas de polímero, y lo mejor de todo, vesículas lipídicas iónicas o no iónicas.
Cuando se fabrican cosméticos o fármacos para enfermedades de la piel mediante el uso del extracto de hoja de morera o una composición pueden aparecer en las siguientes "formas de dosificación" con relativa fluidez: crema, pomada, loción, líquido lechoso, emulsión fluida, mucílago, pasta, espuma, aerosol, y preparación sólida anhidra (por ejemplo, en forma de barra).
Cuando se fabrican los fármacos orales mediante el uso del extracto de hojas de morera de la presente invención para controlar el nivel de glucosa en sangre, se pueden convertir en formas de dosificación oral comúnmente usadas tales como las tabletas, las cápsulas y los polvos.
Breve descripción de las figuras
Las modalidades de la invención se describen con más detalle de aquí en adelante con referencia a las figuras acompañantes, en las cuales:
La Figura 1 es una huella digital de HPLC del extracto vegetal del Ejemplo 1 La traza superior es la HPLC estándar de la DNJ y la traza inferior es la huella digital de HPLC del extracto vegetal del Ejemplo 1;
La Figura 2 es el espectro UV del extracto vegetal del Ejemplo 1;
La Figura 3 es un espectro UV de un extracto de la técnica anterior;
La Figura 4 es un esquema que ilustra el mecanismo de acción detrás de la reducción de la pigmentación;
Las Figuras 5a y b muestran el nivel de inhibición de la a-glucosidasa por el extracto de Morus (5a) y la DNJ (5b); La Figura 6 es el efecto comparativo de la DNJ, la arbutina y el extracto de Morus sobre la tirosinasa;
La Figura 7 es el efecto comparativo de la DNJ, el VC-PMG y el extracto de Morus sobre la inhibición de la síntesis de melanina;
Las Figuras 8a, b y c muestran la toxicidad celular comparativa de la DNJ (a), el VC-PMG (b) y el extracto de Morus (c);
La Figura 9 es el efecto hipoglucemiante del extracto de Morus en ratas Wistar;
La Figura 10 son los efectos hipoglucemiantes del extracto de Morus en humanos; y
Las Figuras 11a y b son los efectos aclaradores de la piel del extracto de Morus en humanos
Descripción detallada
La HPLC de la Figura 1 se obtuvo mediante el uso de una configuración como se indica a continuación:
Instrumento: Equipo de HPLC Waters (EE. UU.) w600-2420-717, sistema de procesamiento de datos Empower.
Columna: Columna Old Shodex Asahipak NH2P-50E (250 X 4,65 |jm) usada en reversa.
Reactivos: Acetonitrilo-agua que contiene 6,5 nmol de acetato de amonio.
Columna: temperatura: 40 °C
Régimen de flujo: 1,0 ml/min
Detector: W2420 ELSD
Ganancia: 100; Temperatura del tubo de deriva 50 °C; Nivel de calentamiento del pulverizador 60 %
Fase móvil: Acetonitrilo: Agua (que contiene 6,5 nmol de acetato de amonio) (84: 16)
espectro UV de la Figura 2 y la Figura 3 se obtuvo mediante el uso de:
Instrumento: Espectrofotómetro UNICO UV-2100
Longitud de onda de escaneo: 200-600 nm
Concentración de la muestra: 1 mg/ml
El extracto vegetal de la invención se puede obtener mediante la metodología como se describe con referencia a los Ejemplos 1, 2, 5, 6 y 9 y mediante el uso de hojas de morera como se ilustra con referencia a los Ejemplos excepto los Ejemplos 6 a 8. Los Extractos de los Ejemplos 1-3, 5 y 9 caen dentro del alcance de las reivindicaciones del extracto vegetal.
El extracto vegetal resultante se puede formular para su uso como un cosmético o medicamento o como suplemento o aditivo alimenticio o de bebida como se ilustra con referencia a los Ejemplos 10 a 16.
Las diferentes actividades del extracto se ilustran con más detalle por medio de los Experimentos 1 a 8.
Ejemplo 1.
Pulverizar 100 kg de hojas de morera secas de la especie Morus alba y extraer bajo reflujo 3 veces (1 hora cada vez) con 12 veces de etanol al 30 % (comparado con el peso de la materia prima). Condensar el extracto hasta un volumen dado y pasarlo a través de una columna rellenada con una resina catiónica de ácido fuerte, tal como 001X 7. El volumen de la columna fue 1/14 del líquido extraído. La columna se lavó con agua (1,5 veces del volumen de la columna) y el componente de interés (iminoazúcares) se liberó de la columna mediante el uso de agua amoniacal a 0,7 N (5 veces del volumen de la columna), a un régimen de flujo de 1,5 veces del volumen de la columna por hora. Se colectó el eluyente de agua amoniacal con un pH de 9-11. El eluyente se condensó hasta un volumen dado, se eliminó el amonio y el pH se ajustó a pH 7. El eluyente luego se pasó a través de una columna rellenada con una resina macroporosa, tal como S-8. El volumen de la columna fue 1/10 del líquido eluyente y el régimen de flujo 2 veces del volumen de la columna por hora. El fluido colectado luego se secó bajo vacío y el producto seco se pulverizó para pasarlo a través de un tamiz de 80 mesh. Se obtuvieron 1,4 kg de un polvo amarillo pálido, que contenía 5,8 % de DNJ, 21 % de iminoazúcares totales y 48 % de aminoácidos totales.
El contenido de iminoazúcar se determinó mediante el uso de un ensayo como se indica a continuación y el resultado se muestra en la Figura 1 cuyo perfil inferior es un cromatograma de HPLC que muestra los picos de imino principales (el estándar DNJ se muestra en el perfil superior).
(a) Pesar con precisión una cantidad adecuada de DNJ como control, añadir metanol para fabricar una solución de 0,1 mg/ml y agitar bien. Transferir 1 ml de la solución, medido con precisión, a un matraz volumétrico de 25 ml, al que se añade 1 ml de la solución tampón de ácido bórico-cloruro de potasio a 0,4 mol/L (pH 8,5) y 2 ml de FMOC-CI en acetonitrilo anhidro a 5 mmol/L. Después de ultrasonicar durante 20 min. a temperatura ambiente, se añaden inmediatamente 2 ml de solución de glicina a 0,2 mol/L y ácido acético al 0,1 % a volumen, agitar bien para obtener la solución de la muestra control.
(b) Disolver 0,3 g del extracto en una cantidad adecuada de agua y pasar a través de una columna de poliamida pretratada. Eluir con una solución de ácido clorhídrico (pH 3). Colectar el eluyente, que luego se condensó bajo vacío a aproximadamente 10 ml. Colocar la solución en una columna de resina de intercambio aniónico pretratada. Lavar la columna con agua y colectar el eluyente. Después de condensarse bajo vacío a aproximadamente 30 ml, el eluyente se transfirió a un matraz volumétrico de 50 ml y se añadió agua a volumen. Transferir 1 ml de la solución, medido con precisión, a un matraz volumétrico de 25 ml y seguir el procedimiento anterior en (a) y comenzar desde "al que se añade 1 ml." para obtener la solución de prueba.
(c) Las soluciones se corrieron en una HPLC como se indica a continuación y se determinó el contenido de imino de las mismas (por Empower). Absorbente: C18-ODS; Fase móvil: acetonitrilo: Ácido acético al 0,1 % (30:70), correr durante 30 min, cambiar la fase móvil a acetonitrilo: Ácido acético al 0,1 % (70: 30) correr durante 10 min. Equilibrar el sistema mediante el uso de la fase móvil original antes de inyectar la siguiente muestra. El tiempo de registro del cromatograma fue de 30 minutos con la longitud de onda de detección a 265 nm. Inyectar 20 pl, medidos con precisión, de la solución control y de la solución de prueba, respectivamente, en el equipo de HPLC y correr para obtener los resultados de HPLC.
El contenido total de aminoácidos se ensayó mediante el uso de un instrumento de análisis de aminoácidos estándar.
Ejemplo 2.
Pulverizar 100 kg de hojas de morera secas de la especie Morus alba y extraer bajo reflujo 3 veces (1 hora cada vez) con 18 veces de agua (al peso de la materia prima). Pasar el extracto a través de una columna rellenada con una resina catiónica de ácido fuerte, tal como Dowex-50. El volumen de la columna fue 1/20 del extracto. Lavar la columna con agua (2 veces del volumen de la columna) seguido de agua con amonio a 0,5 N (8 veces del volumen de la columna) a un régimen de flujo de 3 veces del volumen de la columna por hora. Colectar el eluyente de agua con amonio con un pH de 9-11. Condensar hasta un volumen dado, eliminar el amonio y ajustar a pH 7. Correr el eluyente a través de una columna rellenada con una resina macroporosa, tal como, HP20. El volumen de la columna fue 1/20 del eluyente y el régimen de flujo 4 veces del volumen de la columna por hora. El fluido colectado luego se secó bajo vacío y el producto seco se pulverizó para pasarlo a través de un tamiz de 80 mesh. Se obtuvieron 1,4 kg de un polvo amarillo pálido, que contenía 4,3 % de DNJ, 19 % de iminoazúcares totales y 40 % de aminoácidos totales.
El espectro UV se ilustra en la Figura 2. Los dos picos distintos diferencian el extracto de otros extractos de Morus (Ver la Figura 3) que contienen una mayor proporción de impurezas. Estas impurezas dan como resultado la no distinción entre picos, y podrían conducir a niveles menores de eficacia.
Ejemplo 3. (El método comparativo queda fuera de las reivindicaciones)
Pulverizar 20 kg de hojas de morera secas de la especie. Morus alba y extraer bajo reflujo 3 veces con 5 veces de etanol al 40 % al peso de la materia prima. Filtrar el extracto combinado, al que se añadió un volumen igual de etanol, agitar con velocidad constante durante media hora y dejarlo durante la noche. Eliminar el precipitado mediante centrifugación a 12 000 r/min durante 15 min, recuperar el etanol hasta un volumen dado. Pasar el líquido sobrenadante a través de una columna rellenada con una resina catiónica de ácido fuerte, por ejemplo, de tipo 001X7. El volumen de la columna fue 1/3 del líquido. Lavar la columna con agua (la misma cantidad que el volumen de la columna) y eluir con agua amoniacal a 1,0 N (2 veces del volumen de la columna) con un régimen de flujo del volumen de la columna por hora. Colectar el eluyente de agua amoniacal con un pH 9-11. Condensar hasta un volumen dado, eliminar el amonio y ajustar a pH 7. Pasar el eluyente a través de una columna rellenada con una resina macroporosa, tal como S-8. El volumen de la columna fue 1/13 del eluyente y el régimen de flujo, el volumen de la columna por hora. El fluido colectado luego se secó bajo vacío y el producto seco se pulverizó para pasarlo a través de un tamiz de 80 mesh. Se obtuvieron 0,11 kg de un polvo casi blanco, que contenía 9,1 % de DNJ, 29 % de iminoazúcares totales y 32 % de aminoácidos totales.
Ejemplo 4. (El producto y el método comparativo quedan fuera de las reivindicaciones)
Pulverizar 50 kg de hojas de morera secas de la especie. Morus alba y extraer bajo reflujo 3 veces con 12 veces de etanol al 40 % al peso de la materia prima. Filtrar el extracto combinado y añadir un agente de precipitación, alumbre de potasio, a pH 3, y agitar durante 30 min. Después de dejarlo durante 2 horas, eliminar el precipitado mediante centrifugación. Ajustar el sobrenadante a pH 7. Pasar el sobrenadante a través de una columna rellenada con una resina catiónica, 001X7. El volumen de la columna fue 1/13 del líquido. Lavar la columna con agua (2 veces del volumen de la columna) y eluir con agua amoniacal a 0,2 N (8 veces del volumen de la columna), a un régimen de flujo del volumen de la columna por hora. Colectar el eluyente de agua con amonio con un pH de 9-11. Condensar hasta un volumen dado, eliminar el amonio y ajustar a pH 7. Pasar el líquido eluyente a través de una columna rellenada con una resina macroporosa AB-8. El volumen de la columna fue 1/20 del eluyente y el régimen de flujo, 2 veces del volumen de la columna por hora. El fluido colectado luego se secó bajo vacío, el producto seco se pulverizó y se pasó a través de un tamiz de 80 mesh. Se obtuvieron 0,12 kg de un polvo casi blanco, que contenía 18,6 % de DNJ, 39 % de iminoazúcares totales y 21 % de aminoácidos totales.
Ejemplo 5.
Pulverizar 50 kg de hojas de morera secas de la especie. Morus alba y extraer bajo reflujo 4 veces con 11 veces de etanol al 25 % al peso de la materia prima. Filtrar el extracto combinado, que luego se puso a través de una columna de resina catiónica rellenada con el tipo Amberlite IR-120 (H ). El volumen de la columna fue 1/15 del líquido. Lavar la columna con agua (1,5 veces del volumen de la columna) y eluir con agua amoniacal a 0,7 N (5 veces del volumen de la columna), a un régimen de flujo de 1,5 veces del volumen de la columna por hora. Colectar el eluyente de agua amoniacal con un pH de 9-11. Condensar hasta un volumen dado, eliminar el amonio y ajustar a pH 7. Pasar el eluyente a través de una columna rellenada con una resina macroporosa S-8. El volumen de la columna fue 1/5 del eluyente y el régimen de flujo fue un volumen de columna por hora. El fluido colectado luego se secó bajo vacío y el producto seco se pulverizó para pasarlo a través de un tamiz de 80 mesh. Se obtuvieron 0,46 kg de un polvo amarillo pálido, que contenía 5,6 % de d Nj , 24 % de iminoazúcares totales y 48 % de aminoácidos totales.
Ejemplo 6. (Especie comparativa)
Pulverizar 5 kg de hojas de morera secas de la especie. Morus alba variedad multicaulis L. y extraer bajo reflujo 3 veces con 11 veces de etanol al 25 % al peso de la materia prima. Filtrar el extracto combinado, que luego se pasó a través de una columna rellenada con una resina de intercambio catiónico de tipo 001X7. El volumen de la columna fue 1/13 del líquido. Eluir la columna con agua (2 veces del volumen de la columna) seguido de agua amoniacal a 0,5 N (5 veces del volumen de la columna) con un régimen de flujo de 1,5 veces del volumen de la columna por hora. Colectar el eluyente de agua amoniacal con un pH de 9-11. Condensar hasta un volumen dado, eliminar el amonio y ajustar a pH 7. Poner el eluyente a través de una columna rellenada con una resina macroporosa HP20. El volumen de la columna fue 1/10 del líquido eluyente y el régimen de flujo 4 veces del volumen de la columna por hora. El fluido colectado luego se secó bajo vacío y el producto seco se pulverizó para pasarlo a través de un tamiz de 80 mesh. Se obtuvieron 48 g de un polvo amarillo pálido, que contenía 2,1 % de DNJ, 8,3 % de iminoazúcares totales y 65 % de aminoácidos totales.
Ejemplo 7. (Especie y método comparativos)
Pulverizar 5 kg de hojas de morera secas de la especie. Morus nigra y extraer bajo reflujo 3 veces con 8 veces de etanol al 80 % al peso de la materia prima. Filtrar el extracto combinado y condensarlo a aproximadamente 6 L, a los que se le añadieron aproximadamente 12 L de etanol. Agitar a velocidad constante durante media hora y dejarlo toda la noche. Eliminar el precipitado mediante centrifugación a 12000 r/min durante 15 min, recuperar el etanol hasta un volumen dado y añadir una cantidad adecuada de un floculante, tal como el sulfato de aluminio. Después de la precipitación completa, al dejar de lado, eliminar el precipitado por centrifugación. Pasar el líquido sobrenadante a través de una columna rellenada con una resina de intercambio catiónico, tal como 001X7. El volumen de la columna fue 1/10 del líquido. Lavar la columna con agua (la misma cantidad que el volumen de la columna) seguido de agua amoniacal a 0,5 N (4 veces del volumen de la columna) con un régimen de flujo de 3 veces del volumen de la columna por hora. Colectar el eluyente de agua amoniacal con un pH de 9-11. Condensar hasta un volumen definido, eliminar el amonio y ajustar a pH 7. Pasar el líquido eluyente a través de una columna rellenada con una resina macroporosa HP20. El volumen de la columna fue 1/15 del líquido eluyente y el régimen de flujo, 4 veces del volumen de la columna por hora. El fluido colectado luego se secó bajo vacío y el producto seco se pulverizó para pasarlo a través de un tamiz de 80 mesh. Se obtuvieron 40 g de un polvo casi blanco, que contenía 3,9 % de DNJ, 15 % de iminoazúcares totales y 58 % de aminoácidos totales.
Ejemplo 8. (Especie y método comparativos)
Pulverizar 5 kg de hojas de morera secas de la especie Morus australis Poir. y extraer bajo reflujo 3 veces con 8 veces de etanol al 80 % del peso de la materia prima. Filtrar el extracto combinado, que luego se pasó a través de una columna rellenada con la resina catiónica de tipo Amberlite IR-120 (H+). El volumen de la columna fue 1/10 del líquido. Eluir la columna con agua (1,5 veces del volumen de la columna) seguido de agua amoniacal a 0,7 N (5 veces del volumen de la columna) a un régimen de flujo de 1,5 veces del volumen de la columna por hora. Colectar el eluyente de agua amoniacal con un pH 9-11. Condensar hasta un volumen dado, eliminar el amonio y ajustar a pH 7. Poner el líquido eluyente a través de una columna rellenada con una resina macroporosa AB-8. El volumen de la columna fue 1/13 del líquido eluyente y el régimen de flujo, 2 veces del volumen de la columna por hora. El fluido colectado luego se secó bajo vacío y el producto seco se pulverizó para pasarlo a través de un tamiz de 80 mesh. Se obtuvieron 42 g de un polvo amarillo pálido que contenía 1,4 % de DNJ, 5,2 % de iminoazúcares totales y 68 % de aminoácidos totales.
Ejemplo 9
Pulverizar 50 kg de hojas de morera secas de la especie Morus alba y extraer bajo reflujo una vez con 10 veces de etanol al 30 % del peso de la materia prima. Filtrar el extracto, que luego se puso a través de una columna rellenada con resina catiónica de tipo Amberlite IR-120 (H+). El volumen de la columna fue 1/13 del líquido. Eluir la columna con agua (1,5 veces del volumen de la columna) seguido de agua amoniacal a 0,7 N (7 veces del volumen de la columna) con un régimen de flujo de 2 veces del volumen de la columna por hora. Colectar el eluyente de agua amoniacal con un pH de 9-11. Condensar hasta un volumen dado, eliminar el amonio y ajustar a pH 7. Pasar el eluyente a través de una columna rellenada con una resina macroporosa AB-8. El volumen de la columna fue 1/15 del eluyente y el régimen de flujo fue el volumen de la columna por hora. El fluido colectado luego se secó bajo vacío y el producto seco se pulverizó para pasarlo a través de un tamiz de 80 mesh. Se obtuvieron 0,5 kg de un polvo amarillo pálido que contenía 4,2 % de DNJ, 22 % de iminoazúcares totales y 46 % de aminoácidos totales.
Ejemplo 10.
Mezclar 8 porciones de ácido esteárico, 5 porciones de monoestearato de glicerol, 3 porciones de parafina líquida, 8 porciones de cera de espermaceti, 1 porción de cera de abeja y 5 porciones de aceite de silicio, y calentar a 75 °C (formación de la "Base 1"). Mezclar 0,7 porciones de trietanolamina, 5 porciones de glicerina, 0,05 porciones de metilparabeno y calentar a 75 °C (formación de la "Base 2").). A las bases combinadas 1 y 2, añadir 3 porciones (p/p) del extracto de hoja de morera del Ejemplo 1, mezclar bien y añadir agua hasta 100 ml. Cuando se enfríe añadir una cantidad adecuada de fragancia para producir una crema blanqueadora de belleza que contiene dicho extracto de hoja de morera.
Ejemplo 11.
Mezclar 7 porciones (p/p) de glicerina, 4 porciones de propilenglicol, 0,2 porciones de NaOH al 30 % y 0,1 porciones de sorbato de potasio. Añadir agua destilada hasta 100 ml para obtener la fase acuosa. Mezclar por separado 10 porciones de ácido esteárico, 8 porciones de estearato de butilo, 1 porción de monoestearato de glicerol y 3 porciones de alcohol estearílico y calentar para obtener la fase aceitosa. Calentar la fase acuosa anterior a 95 °C. Añadir lentamente la fase aceitosa a la fase acuosa a la misma temperatura con agitación continua. A aproximadamente 45 °C, añadir a la mezcla 2 porciones del extracto de hoja de morera del Ejemplo 4 y 0,4 porciones de L-ascorbil-2-fosfato de magnesio, y unas pocas gotas de fragancia, y continuar la agitación hasta que se mezclen las dos fases. Enfriar para obtener una pasta.
Ejemplo 12.
Mezclar 7 porciones (p/p) de glicerina, 4 porciones de propilenglicol, 0,2 porciones de NaOH al 30 % y 0,1 porciones de sorbato de potasio. Añadir agua destilada hasta 100 ml para obtener la fase acuosa. Mezclar por separado 10 porciones de ácido esteárico, 8 porciones de estearato de butilo, 1 porción de monoestearato de glicerol y 3 porciones de alcohol estearílico y calentar para obtener la fase aceitosa. Calentar la fase acuosa anterior a 95 °C. Añadir lentamente la fase aceitosa a la fase acuosa a la misma temperatura con agitación continua. A aproximadamente 60 °C, añadir a la mezcla 2 porciones del extracto de hoja de morera del Ejemplo 1 y 0,2 porciones de DEP-11. Añadir unas pocas gotas de fragancia y continuar revolviendo hasta que las dos fases se mezclen bien. Enfriar para obtener una pasta.
Ejemplo 13.
A 0,4 porciones (p/p) del extracto de hojas de morera del Ejemplo 5 añadir 0,1 porciones de etilparabeno, 0,5 porciones de bisulfato de sodio, 0,1 porciones de edetato disódico y 9 porciones de glicerina, y añadir agua destilada hasta 100 ml para obtener la loción.
Ejemplo 14.
Mezclar bien 5 kg del extracto de hoja de morera del Ejemplo 1 con 1,8 kg de almidón, 1,5 kg de celulosa microcristalina, 0,45 kg de PVP entrecruzado, 0,55 kg de CSM-Na, y cantidades adecuadas de estearato de magnesio y micropolvo de silicio. Fabricar 20000 tabletas, que pesen aproximadamente 0,5 g cada una.
Ejemplo 15.
Mezclar 1,0 kg del extracto de hoja de morera del Ejemplo 3 con una cantidad adecuada de almidón, rellenar 10000 cápsulas para hacer que cada cápsula contenga 100 mg del extracto.
Ejemplo 16.
A 2,0 kg del extracto de hoja de morera del Ejemplo 3 añadir 0,5 kg de vitamina C, 1,0 kg de ácido cítrico, 0,8 kg de bicarbonato de sodio, 0,08 kg de manitol, pVp , PEG 6000, agente saborizante y agente aglutinante para fabricar gránulos efervescentes.
Experimentos de prueba de actividad
Experimento 1. Ensayo de actividad de inhibición del extracto de hoja de morera sobre la a-glucosidasa
El objetivo fue investigar la actividad inhibitoria del extracto de hojas de morera de la presente invención sobre la aglucosidasa. Los reactivos y equipos se detallan más abajo:
(1) Extracto de hojas de morera del Ejemplo 1,
(2) Químico estándar de referencia DNJ,
(3) La a-glucosidasa (Tipo I de levadura de Panadería, EC232.604.7), se convierte en una solución de 0,42 U/ml mediante el uso de tampón de ácido fosfórico a 0,1 mol/L (pH 6,8)
(4) El pNPG, se convierte en una solución de 5 mmol/L mediante el uso de tampón de ácido fosfórico a 0,1 mol/L (5) El pNP, se convierte en una solución de 200 pmol/L mediante el uso de tampón de ácido fosfórico a 0,1 mol/L (pH 6,8)
(6) Lector de microplacas Multiskan Ascent (Thermo Electron Co., EE. UU.)
El método fue el que se detalla más abajo:
Curva estándar
Diluir la solución de pNP a 200 pmol/L mediante el uso de tampón de ácido fosfórico a 0,1 mol/L, respectivamente, a 100 pmol/L, 50 pmol/L, 25 pmol/L, 12,5 pmol/L, 6,25 pmol/L y 3,125 pmol/L. De cada una de las soluciones diluidas tomar 200 pl para las mediciones de DO a 405 nm y usar los valores de DO para trazar la curva estándar.
Ensayo de la muestra de prueba
(1) Poner 80 pl de cada una de las muestras de prueba de diferentes concentraciones en pocillos individuales de la microplaca y 80 pl de solución tampón de ácido fosfórico como placebo.
(2) A cada pocillo, añadir 30 pl de enzima (0,42 U/ml), colocar sobre la mesa durante 30 s, incubar junto con el sustrato (pNPG) durante 15 min. a 37 °C y encender el lector de microplacas, ajustar la temperatura a 37 °C, el modo de medición a cinético y el intervalo a 10 s. Tomar las lecturas 13 veces (2 min totales.).
(3) A cada pocillo añadir 90 pl de sustrato (pNPG a 5 mmol/L), agitar sobre la mesa durante 30 s, colocarlo en el lector de microplacas, presionar START, medir continuamente los valores de DO a 37 °C.
(4) Con las concentraciones de pNP como eje X y los valores de DO como eje Y, trazar la curva estándar. Usar los valores de DO obtenidos en la etapa (3) contra la curva estándar para obtener cantidades relacionadas del producto de reacción.
(5) Para el placebo y las muestras de prueba de diferentes concentraciones, tomar el tiempo como eje X y la cantidad de producto como eje Y para trazar una curva de progreso de la reacción. La pendiente de la línea recta es la velocidad de reacción.
(6) Con la concentración de las muestras de prueba como eje X y la velocidad de reacción como eje Y, establecer la curva de concentración de la muestra de prueba y obtener el CI50. Actividad de inhibición (U/pg) = (0,5 X actividad enzimática de cada pocillo) / (CIso X el volumen de las muestras de cada pocillo) = (0,5 X 0,42 X 0,03) / (CI50 X 0,08) = 0,07875/ CI50.
Resultados y discusión:
Los resultados del experimento anterior mostraron que el CI50 del extracto de hojas de morera en el Ejemplo 1 tenía un valor de CIso de 13,6 pg/ml en la inhibición de la a-glucosidasa mientras que el de la DNJ pura fue de 70 pg/ml. Esto demostró que la actividad del primero fue mucho mayor que la del último. Teniendo en cuenta el hecho de que el contenido de DNJ en el extracto de hojas de morera en el Ejemplo 1 fue solo del 3,5 %, se vuelve posible usar dicho extracto para lograr la misma o mejor actividad mientras que se reducen las posibles reacciones adversas causadas por el uso de concentraciones mayores del compuesto puro. Ver las Figuras 5a y b. que muestran respectivamente la inhibición in vitro de la a-glucosidasa por el extracto de Morus y la DNJ, Velocidad inicial de reacción versus concentración.
Experimento 2: Ensayo de actividad de inhibición del extracto de hoja de morera y la arbutina sobre la TYR
El objetivo fue investigar el impacto y los mecanismos de acción de las muestras de prueba sobre la actividad de la TYR en la línea celular de melanoma B16. Los reactivos y equipos fueron los que se detallan más abajo:
(1) Extracto de hoja de morera del Ejemplo 1
(2) Químico estándar de referencia DNJ
(3) Químico estándar de referencia arbutina,
(4) Solución de L-dopa a 1 mg/ml en tampón de ácido fosfórico de pH 6,8, preparada inmediatamente antes de su uso
(5) Tampón de lisis celular WIP
(6) Placa de cultivo celular (24 pocillos y 96 pocillos)
(7) Microscopía óptica
(8) Centrífuga
(9) Lector de microplacas
Los métodos fueron los que se detallan más abajo
Las células de melanoma B16 se lavaron con tampón fosfato salino y se colectaron en un tubo de centrífuga. Después de la centrifugación, se añadió tampón de lisis WIP que contiene fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) al pellet celular para lisar las células y la solución se dejó reposar en hielo durante 30 minutos. La solución se centrifugó subsecuentemente durante 10 min, a 12 000 g, a 4 °C, y el sobrenadante (extracto celular) que contiene los componentes celulares se retuvo para los fines del ensayo.
Para determinar el efecto directo de la DNJ, la arbutina y el extracto de Morus sobre la actividad catalítica de la tirosinasa, 60 pl de DNJ, arbutina o extracto de Morus (la concentración de los compuestos usada varió) se añadieron a 60 pl de extracto celular en una microplaca de 96 pocillos. La placa se incubó a 37 °C durante 1 hora, y luego se añadieron 80 pl de L-dopa a cada pocillo. La absorbancia (492 nm) de cada pocillo se registró a intervalos de 5 minutos durante 30 minutos a 37 °C mediante el uso de un lector de microplacas.
Para determinar el efecto indirecto de la DNJ, la arbutina y el extracto de Morus sobre la actividad catalítica de la tirosinasa, se cultivaron células de melanoma B16 con diferentes concentraciones de DNJ, arbutina o extracto de Morus durante tres días antes de la extracción y evaluación. Seguido de la extracción, se colocaron 40 pl de extracto celular, 120 pl de tampón fosfato (pH 6,8) y 40 pl de L-Dopa (2 mg/ml) en una microplaca de 96 pocillos, y se registró la absorbancia de cada pocillo a 492 nm a intervalos de 5 minutos durante 30 minutos a 37 °C mediante el uso de un lector de microplacas.
Resultados y discusión
Los resultados de los ensayos se pueden ver en la Figura 6. Las columnas claras muestran el efecto directo de la DNJ, la arbutina, y el extracto de Morus sobre la actividad de la tirosinasa en los extractos celulares, mientras que las columnas oscuras muestran los resultados de los efectos indirectos de los compuestos de la actividad de la tirosinasa.
En el ensayo de actividad directa, la arbutina redujo la actividad de la tirosinasa en una manera dependiente de la dosis, mientras que la DNJ y el extracto de Morus no mostraron ningún efecto sobre la actividad de la tirosinasa. Sin embargo, en el ensayo de actividad indirecta, después de que las células se incubaron durante tres días de incubación en presencia de los compuestos de prueba, hubo una disminución dependiente de la dosis en la actividad de la tirosinasa en los grupos de la DNJ y el extracto de Morus, pero las células incubadas con arbutina no mostraron ningún efecto sobre la actividad de la tirosinasa.
Estos hallazgos están en línea con la literatura reportada y soportan los diferentes mecanismos de acción propuestos para los inhibidores de la a-glucosidasa, DNJ y extracto de Morus. En el ensayo de actividad directa, la arbutina interactuó directamente con la tirosinasa, mediante la unión al sitio activo e inactivación de la enzima, lo que por lo tanto reduce la oxidación de L-dopa a o-dopaquinona. Los inhibidores de laorGlucosidasa no afectan directamente la actividad de la tirosinasa y esto se reflejó en los resultados del ensayo de actividad directa donde se demostró que la DNJ y el extracto de Morus no tenían actividad inhibitoria de la tirosinasa.
En el ensayo de actividad indirecta, se demostró que ambos el DNJ y el extracto de Morus tenían actividad inhibitoria sobre la tirosinasa. Los inhibidores de la a-Glucosidasa actúan sobre la tirosinasa inmadura, y mediante la prevención de la unión de la calnexina durante la maduración de la tirosinasa, hay cambios conformacionales que afectan la actividad enzimática de la tirosinasa madura. Estos cambios se evidenciaron por la disminución en la actividad enzimática después de tres días de incubación con la DNJ y el extracto de Morus. La arbutina compite directamente por el sitio activo de la tirosinasa y en el ensayo indirecto, donde la arbutina no estaba presente en la solución de ensayo, no hubo inhibición de la actividad enzimática.
Experimento 3. Impacto sobre el contenido de melanina en los melanocitos por el extracto de hoja de morera de la invención
El objetivo fue investigar el impacto de las muestras de prueba sobre el contenido de melanina de la línea celular de melanoma B16. El reactivo y los equipos usados se detallan más abajo:
(1) Extracto de hoja de morera del Ejemplo 1
(2) Químico estándar de referencia DNJ
(3) Químico estándar de referencia VC PMG
(4) Tampón de lisis WIP
(5) Microscopio óptico
(6) Placa de cultivo celular (24 pocillos y 96 pocillos)
(7) Centrífuga
(8) Lector de microplacas
El método fue el que se detalla más abajo:
1. Cosechar las células de melanoma B16 en la fase logarítmica y ajustar la suspensión celular a una concentración adecuada, dividir en placas de 24 pocillos y permitir que las células se adhieran a las paredes.
2. A cada pocillo añadir 1 ml de muestra de prueba de diferente concentración hecha mediante la dilución con el medio (4 duplicados para cada concentración). Incubar durante 2 días, renovar la solución de muestra y continuar la incubación durante 2 días.
3. Cosechar las células el día 4 y lavar bien dos veces con PBS. Añadir 250 pl de tampón de lisis WIP y permitir lisar en un baño de hielo, mezclar con vórtex una vez cada 5 min por 4-5 veces.
4. Centrifugar durante 10 min a 12000 rpm a 4 °C. Desechar el sobrenadante y disolver el precipitado con 400 pl de NaOH a 1N y mantenerlo en un baño de agua a 80 °C durante 1 hora.
5. Usar un lector de microplacas para medir el valor de DO a 405 nm, y calcular el contenido relativo.
Resultados y discusión:
Los resultados de los ensayos se pueden ver en la Figura 7. Las columnas de tonos medios mostraron el efecto inhibitorio de la DNJ sobre el contenido de melanina en las células de melanoma B16, mientras que las columnas oscuras y las columnas claras mostraron los resultados de los efectos inhibitorios del VC-PMG y el extracto de Morus sobre el contenido de melanina en células de melanoma B16. Todos los efectos son después de 3 días de incubación con DNJ, VC-PMG o extracto de Morus a diferentes concentraciones.
Comparado con el control el contenido de melanina en los tratamientos de DNJ, VC-PMG y el Ejemplo 1 a diferentes niveles de concentración disminuyó significativamente en una manera dependiente de la dosis. La intensidad de la actividad de los tres compuestos, de fuerte a débil, fue: DNJ> Extracto de Morus> VC-PMG.
La DNJ es un compuesto activo identificado a partir del extracto de Morus, como un inhibidor de laor-glucosidasa y puede reducir la actividad de la tirosinasa lo que da como resultado la reducción de la melanina en las líneas celulares de melanoma B-16. Ya que el contenido de DNJ de origen natural en todas las plantas es muy bajo, es imposible usar la DNJ natural con fines comerciales. Pero con el extracto de Morus, aunque el contenido de DNJ en el extracto de Morus es tan bajo como 2-5 %, el extracto de Morus todavía demostró una potencia de actividad similar a la DNJ, lo que indicó que dentro del extracto de Morus, la DNJ puede funcionar sinérgicamente con otros compuestos activos para generar un fuerte efecto de antipigmentación.
Según nuestra observación, cuando la concentración de VC-PMG aplicada a la célula de melanoma B16 aumentó sobre 200 ppm, la viabilidad de la célula disminuyó, lo que indicó que una concentración excesiva de VC-PMG puede causar daño a las células. El extracto de Morus, como un producto natural, tiene un mejor perfil de seguridad y una eficacia más fuerte en comparación con el VC-PMG, y su mecanismo de acción difiere del VC-PMG, por lo tanto el extracto de Morus se puede usar ya sea solo o combinado con VC-PMG para lograr un mejor efecto de antipigmentación.
Para desarrollar el extracto de Morus como productos aclaradores en cosméticos, consideramos la dosis del ingrediente aclarador que se usa habitualmente en los cosméticos: arbutina: 1 %-5 %, ácido kójico: 0,2 %-3 %, derivados vitamínicos: <3 %. Basado en nuestro estudio, la dosis recomendada del Ejemplo 1 es más abajo del 3 %.
Experimento 4. Impacto del extracto de hoja de morera de la presente invención sobre el crecimiento de los melanocitos
Métodos
Viabilidad celular
La supervivencia celular se midió mediante el uso del ensayo MTT, que se basa en la conversión de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio en cristal de MTT-formazano por la enzima mitocondrial en células viables. El MTT se preparó recientemente a 2 mg/ml en tampón fosfato salino (PBS). 2*104 células por ml se sembraron en placas de 96 pocillos, se añadieron DNJ, VC-PMG, extracto de Morus o DMEM al medio de cultivo. Se añadieron al pocillo alícuotas de 20 pl de solución madre de MTT en diferentes intervalos de tiempo a lo largo del experimento, y la placa se incubó a 37 °C durante 4 h en una incubadora humidificada con CO2 al 5 %. Después de 4 h, los cristales de formazano de estas células se solubilizaron en 100 pl de DMSO por agitación suave. Después de 10 min, la cantidad de formazano se cuantificó espectrofotométricamente mediante el uso de un lector de placas ELISA a 540 nm.
Determinación del contenido de melanina en células de melanoma
Las células de melanoma B16 se sembraron a una densidad de 4x104 células por pocillo de placas de cultivo de 24 pocillos, se incubaron a 37 °C bajo una atmósfera de CO2 al 5 % durante 24 h. Las células luego se trataron con diversas concentraciones de DNJ, VC-PMG o extracto de Morus durante 3 días. Las células se lavaron con tampón fosfato salino y se colectaron en un tubo de centrífuga. Después de la centrifugación, los pellets celulares se rompieron en tampón de lisis WIP que contenía fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) en hielo durante 30 min. La solución se centrifugó durante 10 min a 12000 g a 4 °C, los pellets se disolvieron en NaOH a 1 N mediante hervor durante 1 hora a 70 °C. El contenido de melanina se ensayó a 405 nm en un espectrofotómetro.
Resultados y Discusión
Los efectos de la DNJ, el VC-PMG y el extracto de Morus sobre la viabilidad Celular
Los datos sobre el ensayo de viabilidad celular mediante el uso de MTT para las células de melanoma B16 se dan en la Figura 8A, la Figura 8B y la Figura 8C.
La DNJ, el VC-PMG y el extracto de Morus no indujeron inhibición del crecimiento de las células de melanoma B16 a la concentración dada. Estos datos mostraron claramente la naturaleza no citotóxica de la DNJ, el VC-PMG y el extracto de Morus en las células de melanoma B16 más abajo de la concentración de 200 ppm, e indican que el crecimiento celular no fue una influencia para el análisis del contenido de melanina más abajo.
Experimento 5: Impacto del extracto de hoja de morera de la invención sobre la glucosa en sangre de ratas Wistar
Los reactivos y equipos se detallan más abajo:
(1) Extracto de hoja de morera del Ejemplo 1
(2) Solución salina
(3) Químico estándar de referencia miglitol
(4) 64 ratas Wistar
(5) Medidor de glucosa en sangre Johnson's One Touch Ultra y tiras reactivas de glucosa en sangre Código 9
El método usado fue el que se detalla más abajo:
Los animales recibieron extracto de Morus vía inyección intraperitoneal (15 mg/kg o 30 mg/kg) o intragástricamente (25 mg/kg o 50 mg/kg). El miglitol (Glyset®) (25 mg/kg), un inhibidor de la a-glucosidasa aprobado para la diabetes tipo 2 se usó como control positivo. Los niveles de azúcar en sangre en ayuno se registraron como línea base, y los niveles de azúcar en sangre se midieron a intervalos de tiempo 05. h, 1 h y 2 h después de recibir una comida con almidón. A los animales se les dosificó el extracto de Morus antes de recibir la comida con almidón.
Resultados y discusión:
Glucosa en sangre en 0,5 h, 1 h, 2 h después de dar el almidón (X±DE, n=10)
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Los resultados mostraron que el extracto de Morus redujo significativamente los niveles de glucosa en sangre. La vía de administración intragástrica mostró que los compuestos activos tienen una buena biodisponibilidad oral y no se inactivan a través del metabolismo. Ambas las dosis intragástrica e intraperitoneal disminuyeron significativamente los niveles de glucosa en sangre con la dosis de 50 mg/kg que fue tan efectiva como el miglitol (Glyset®) en este estudio. Ver la Figura 9
Experimento 6: Efecto del extracto de Morera sobre la reducción de los niveles de glucosa en sangre en humanos Métodos
En un pequeño estudio en humanos, los participantes recibieron ya sean 400 mg de extracto de Morus o placebo, más 50 g de azúcar suave después de un ayuno de toda la noche. Los niveles de azúcar en sangre se monitorearon durante tres horas. Adicionalmente, un paciente recibió 50 g de miglitol para actuar como control positivo.
Resultados y discusión
Los datos mostraron que el extracto de Morus redujo drásticamente los niveles de azúcar en sangre, redujo el pico inicial de azúcar en sangre en un 59,91 %, redujo los niveles de azúcar en sangre sobre dos horas en un 50,78 %, y sobre tres horas en un 47,18 %. El extracto de Morus fue capaz de reducir el índice glicémico del azúcar suave de 83,8 a 41,2. Ver la Figura 10
Experimento 7: Efecto del extracto de Morera sobre el aclaramiento de la piel en humanos
Métodos
El extracto de morera como en el Ejemplo 1 se convirtió en una formulación de crema al 0,2 % y al 0,5 % para el estudio. Veinte sujetos femeninos (edad 18 y mayores) que dieron su consentimiento informado, aplicaron cada formulación en áreas predefinidas en cada antebrazo dos veces al día. Antes del primer tratamiento, las mediciones del color de la piel se midieron mediante el uso de un Cromámetro CR300 en las zonas definidas.
Después de 28 días de tratamiento, los sujetos regresaron al laboratorio de pruebas donde se hicieron nuevas mediciones del color de la piel en las mismas zonas definidas como en el día 0.
Se hicieron evaluaciones sobre tres parámetros de estudio que fueron:
- L* (de oscuro a claro). Este es el parámetro de claridad de la piel. Un aumento en este parámetro caracteriza un aclaramiento de la piel.
- b* (del azul al amarillo). Una disminución en este parámetro caracteriza una disminución en el componente amarillo de la piel.
- ATI° (Ángulo Tipológico Individual). Este parámetro muestra el grado de pigmentación de la piel de un sujeto mediante el uso de los parámetros de claridad (L*) y de melanina cutánea (b*). Un aumento en el ATI° caracteriza una disminución en la pigmentación de la piel.
Resultados y discusión
El parámetro L* aumentó significativamente (P<0,001) después de 28 días de uso diario del producto al 0,2 % (+0,54 U.A. en promedio) lo que representa una claridad aumentada en la coloración de la piel. Este efecto se observó en el 90 % de los sujetos. Ver la Figura 11a
El parámetro del ángulo tipológico individual (ATI°) aumentó significativamente (P<0,001) después de 28 días de uso diario del producto al 0,2 % (+1 U.A. en promedio), lo que indica una disminución en la pigmentación de la piel. Este efecto se observó en el 57 % de los sujetos. Ver la Figura 11B
Para el producto al 0,5 %: El parámetro L* aumentó significativamente (P<0,001) después de 28 días de uso diario lo que indica un aumento en la claridad de la piel. Este efecto se observó en el 86 % de los sujetos. Ver la Figura 11A
El parámetro de ángulo tipológico individual (ATI°) para la formulación al 0,5 % aumentó significativamente (P<0,001) después de 28 días de uso diario del producto lo que indica una disminución en la pigmentación de la piel. Este efecto se observó en el 67 % de los sujetos. Ver la Figura 11B
Experimento 8. Datos del extracto
Los extractos de la presente invención (Muestras 1 a 3) difieren de los extractos de la técnica anterior en sus características como se ilustra en la Tabla 1 más abajo:
Tabla 1.
Figure imgf000019_0001
Explicación de la Tabla 1 anterior:
Las muestras 1-3 se refieren a los productos fabricados en los Ejemplos 1-3;
La muestra 4 se refiere al producto fabricado de acuerdo con la Patente CN1589835;
La muestra 5 se fabricó con el método descrito más abajo: Pulverizar las hojas de morera y extraer bajo reflujo con etanol al 80 % por 3 veces, 1-2 horas cada vez. Para la primera vez, usar 6 veces (p/p) de etanol del peso de la materia prima, seguido de 4 veces para ambas las 2da y 3ra veces. Combinar los extractos y dejarlos durante 24 horas antes de la filtración. Concentrar la solución filtrada y extraer el extracto condensado con agua 5 veces a 70-80 °C. Cada vez usar 10 veces de agua del peso del material de partida (hojas de morera). Ajustar el pH del extracto acuoso combinado a pH 3-4 y añadir NaCl a una concentración del 3-5 %. El líquido se sometió a cromatografía de resina macroporosa D101 con una columna de 60 cm (H) x 3 cm (D). Lavar con agua hasta que el eluyente se aclare y luego eluir con 5 veces de etanol al 30-50 % del volumen de la columna, régimen de flujo 20/ml. Colectar el eluyente, condensar y secar para obtener la muestra (5).
La muestra 6 se fabricó con el método descrito más abajo: Pulverizar las hojas de morera y extraer dos veces con etanol al 50-60 % a 50 °C, mediante el uso de 10-12 veces de etanol del peso de las hojas de morera cada vez. Concentrar el extracto y pasarlo a través de una columna rellenada con resina macroporosa de ácido fuerte D72 y colectar el fluido (fracción 1). Eluir con etanol para obtener la fracción 2 seguida de etanol al 70 % que contiene amonio al 2 % para obtener la fracción 3. Centrifugar y concentrar las fracciones 1, 2 y 3, respectivamente. Secar y mezclar para obtener la muestra (6).
La muestra 7 se fabricó con el método descrito más abajo: Pulverizar las hojas de morera y extraer con agua a 80 °C dos veces, (10-15 veces de agua). Ajustar el pH del extracto combinado a pH 2-3, enfriarlo a 0 °C hasta completar la precipitación. Filtrar y someter el filtrado concentrado a cromatografía de resina catiónica. Eluir con agua seguida de una mezcla de una cantidad igual de etanol al 50 % y una solución acuosa de amoniaco hasta que el eluyente se vuelva incoloro. Concentrar el eluyente y secarlo para obtener la muestra (7).
La muestra 8 se fabricó con el método descrito más abajo: Pulverizar las hojas de morera y extraer con etanol al 30 % por 3 veces (5 veces el peso de las hojas de morera, cada vez). Concentrar el extracto combinado y al concentrado añadir etanol para precipitar. Añadir agua al sobrenadante concentrado y pasarlo a través de una columna de resina macroporosa D101 y colectar el fluido. Eluir con 3 veces de agua y combinar el fluido y el eluyente acuoso para obtener la fracción 1. Continuar la elución de la columna con etanol al 60 % (5 veces) para obtener la fracción 2. Ajustar la fracción 1 a pH 4 y ponerla a través de una columna de intercambio catiónico. Lavar la columna con agua hasta que el eluyente se vuelva incoloro, Eluir con una solución de amoniaco al 0,5 N (8 veces) y colectar el eluyente para obtener la fracción 3. Concentrar y secar las fracciones 2 y 3, respectivamente para obtener la muestra (8).
Los términos de solubilidad usados en la Tabla se definen más abajo:
• La muestra "Fácilmente soluble" de 1 g se disolverá en menos de 1 ml de agua;
• La muestra "Soluble" de 1 g se disolverá en 10-30 ml de agua;
• La muestra "Promedio" de 1 g se disolverá en 30-100 ml de agua;
Los resultados anteriores demostraron que el producto de la presente invención es mejor que los productos actuales en actividad, contenido del principio activo clave, color y solubilidad en agua.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un extracto vegetal seco, obtenido hojas de la planta Morus alba L, que tiene un valor de CI50, para inhibir a la a-glucosidasa I, a una concentración de menos de 90 pg/ml caracterizado porque comprende:
• 8-30 % (p/p) de iminoazúcares totales, medidos por HPLC cuantitativa y/o LC-MS (cromatografía líquida/espectrometría de masas), incluidos la DNJ, la fagomina y la N-metil-DNJ; en donde el contenido de DNJ es del 1 al 10 % (p/p) calculado sobre la base del peso total del extracto seco, y en donde los iminoazúcares incluyen además, 1,4 didesoxi-1,4-imino-D-arabinitol (DAB), 2-O-a-D-galactopiranosil-DNJ (GAL-DNJ) y calistegina B; y
• 30-60 % (p/p) de aminoácidos totales que incluyen arginina, leucina, lisina y fenilalanina; y
• es de color amarillo pálido o casi blanco;
• es fácilmente soluble en agua;
• tiene un valor de pH de entre 5,5-6,5 en una solución acuosa al 1 %; y
• un espectro UV que muestra una absorción máxima a 218 nm y 263 nm.
2. Un extracto vegetal seco como se reivindicó en la reivindicación 1 en donde el contenido de DNJ es 1-3 o 4-6 % (p/p) calculado sobre la base del peso total del extracto seco.
3. Un extracto vegetal seco como se reivindicó en la reivindicación 1 o 2 que tiene un valor de CI so, para inhibir a la a-glucosidasa I, a una concentración de 5-40 pg/ml.
4. Un extracto vegetal seco como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende 15-20 % (p/p) de iminoazúcares totales.
5. Un extracto vegetal seco como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende 40-50 % (p/p) de aminoácidos totales.
6. Un extracto vegetal seco como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde dicho extracto contiene 4-6 % (p/p) de (DNJ) calculado sobre la base del peso total del extracto seco.
7. Un extracto vegetal seco como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde dicho extracto contiene 1-3 % (p/p) de (DNJ) calculado sobre la base del peso total del extracto seco.
8. Un método para producir un extracto vegetal seco de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, de hojas de la planta Morus alba L, que tiene un valor de CI 50 para inhibir a la a-glucosidasa I a una concentración de menos de 90 pg/ml que comprende las etapas de:
a. Llevar a cabo una etapa de extracción acuosa o alcohólica del material de la hoja;
b. Llevar a cabo una etapa de purificación por cromatografía en columna mediante el uso de una resina de intercambio catiónico de ácido fuerte, lavar con agua, y eluir con una solución de amoniaco colectar el eluyente y retirar el amoniaco del mismo;
c. Someter el eluyente a cromatografía en columna mediante el uso de una resina de absorción macroporosa, colectar la solución; y
d. Concentrar y secar el extracto
en donde:
en la etapa a) las hojas de la planta se secan y se convierten en un polvo grueso, la etapa de extracción se lleva a cabo con 10-13 veces de agua o 20-30 % de un alcohol de bajo peso molecular por la cantidad de hojas de la planta Morus alba L (p/p), y se repite hasta 5 veces,
en la etapa b) la columna se lava con 1-2 veces de agua del volumen de la columna y se desecha el lavado, la columna se eluye con 2-8 veces de solución acuosa de amoniaco a 0,2-1,0 N del volumen de la columna, a una velocidad de elución de 1-3 veces del volumen de la columna por hora, y el eluyente se colecta con un valor de pH de entre 9,0 y 11,0,
en la etapa c) la columna se eluye con una relación de volumen entre la solución y la columna de entre 20:1 a 5:1, y
en la etapa d) el extracto seco se pulveriza para pasarlo a través de un tamiz de 80 mesh.
9. Uso de un extracto vegetal seco como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o el producto del método como se reivindicó en la reivindicación 8 para tratar: pecas, cloasma, estrías del embarazo y placa senil.
10. Un extracto vegetal seco como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o el producto del método como se reivindicó en la reivindicación 8 para su uso en el control de la glucosa en sangre.
11. Un cosmético o medicamento que comprende un extracto vegetal seco como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o el producto del método como se reivindicó en la reivindicación 8 en combinación con uno o más agentes aclaradores de la piel seleccionados de: vitamina C y sus derivados, ácido kójico, arbutina, diacetilboldina, ácido azelaico, ácido octadecenodioico, undecilenoilfenilalanina, extracto de regaliz, extracto de aloe, extracto de berro, extracto de ascophyllum, extracto de lúpulo, glutatión, ecdisona y/o ácido elágico.
12. Un cosmético o medicamento como se reivindicó en la reivindicación 11 en donde dicho derivado de la vitamina C es L-ascorbil-2-fosfato de magnesio (VC-PMG).
13. Un cosmético o medicamento como se reivindicó en la reivindicación 11 o 12 en donde la relación del extracto vegetal seco y los otros agentes aclaradores de la piel es de 10:1 a 1:1.
14. Un producto farmacéutico, nutracéutico o aditivo o suplemento alimenticio o de bebidas que comprende un extracto vegetal seco como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o el producto del método como se reivindicó en la reivindicación 8.
15. Un alimento o bebida que comprende un extracto vegetal seco como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o el producto del método como se reivindicó en la reivindicación 8.
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