CN101874824B

CN101874824B - 一种含三叶苷的活性提取物及其用途

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Publication number: CN101874824B
Application number: CN200910027421.2A
Authority: CN
Inventors: 顾书华; 孙伟新; 赵维民; 蒋华良
Original assignee: CHANGZHOU HIGH-TECH INDUSTRIAL DEVELOPMENT ZONE SANWEI INDUSTRY TECHNOLOGY RESEARCH Co Ltd
Current assignee: CHANGZHOU HIGH-TECH INDUSTRIAL DEVELOPMENT ZONE SANWEI INDUSTRY TECHNOLOGY RESEARCH Co Ltd
Priority date: 2009-05-01
Filing date: 2009-05-01
Publication date: 2015-07-15
Anticipated expiration: 2029-05-01
Also published as: CN101874824A

Abstract

本发明公开了一种活性提取物，所述活性提取物是用5-95％的乙醇水溶液作为溶剂从壳斗科等植物中提取得到的，所述活性提取物中三叶苷的含量为30-99.9％；本发明还公开所述活性提取物的制备方法和其在制备治疗糖尿病、糖尿病肾病和肝水肿的药物中的用途。

Description

一种含三叶苷的活性提取物及其用途

技术领域

本发明涉及一种从壳斗科等植物中提取得到的主要含有三叶苷的高含量的活性提取物及其制备方法，以及用于制备治疗糖尿病、糖尿病肾病和肝水肿的药物组合物中的应用。

背景技术

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)，糖尿病肾小球硬化症，是糖尿病常见而难治的微血管并发症，为糖尿病的主要死因。在西方，DN已成为终末期肾病的首要原因；在美国约1/3的I型糖尿病和1/5的II型糖尿病患者最终会发展为糖尿病肾病(宋春光，中药研究与信息，2005，7(10)：19-20，26)。

糖尿病患者肾脏功能和结构病变的演变可分为以下五期：I期：以高肾小球滤过率(GFR越位150ml/min)和肾脏增大为特征。II期：无临床症状肾损害期，但出现肾小球基质膜增厚的结构损害。运动后可出现可逆性尿白蛋白排泄量(UAE)升高。III期：糖尿病肾病高危期，UAE持续升高(20-200μg/min)，GFR可恢复正常(130ml/min)，血压可升高但未到高血压水平，已有肾小球结节型和弥漫型病变以及小动脉玻璃样变，并已开始出现肾小球荒废。IV期：显性蛋白尿肾病期，出现进行性临床非选择性蛋白尿(UAE＞200μg/ml或尿蛋白＞0.5g/24h；GFR逐步下降，临床上可出现水肿，大量蛋白尿等肾病综合症的表现，高血压常与蛋白尿水平平行，组织学改变为肾小球硬化，属临床DN。V期：肾功能衰竭期，出现尿毒症的临床表现和组织学改变，为终末期DN。DN已成为终末期肾病(end stage renal disease，ESRD)最主要的病因(刘灿辉等，中华医学全科杂志，2004，3(11)：35-36；张明霞，河北医药，2006，28(11)：1087-1088)。

目前DN药物治疗有降血糖药物如噻唑烷二酮类、磺酰脲类、双胍类、胰岛素类、葡萄糖苷酶抑制剂等，降压药物如血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)、血管紧张素II受体拮抗剂(ARB)、钙通道阻断剂、利尿剂等，肝素及内皮素(ET1)受体阻断剂等单独或联合用药(国际泌尿系统杂志，2006，26(5)：696-701；中国实用内科杂志，2003，23(1)：58-59)。无论单独或联合使用降血糖，降压药物，都因其副作用之大而无法长期用药。(中国医药论坛2005年7月第3卷第7期(总第29期)；CHINA SCIENCE AND TECHNOLOGY INFORMATION No.24 Dec2005)。

从天然植物中提取安全有效成分来治疗糖尿病及糖尿病肾病已成为近年来研究的热点。多穗柯甜茶是近年来开发出来的一种天然保健茶，其制作工艺已相当成熟(《一种甜茶提取物及其制备方法和应用》专利CN1122447C，《一种甜茶及其制作方法》申请号CN1613339A)，报道了长期饮用该茶对高血压、高血脂、糖尿病有疗效。从该植物中分离到的三叶苷作为抗氧化剂和食品甜味剂已被广泛报道，例如专利JP2006056831，JP02292208，US3821417，US3857962，US3087821；以及Evans等人的Archives of Biochemistry and Biophysics 199(2)：342-8(1980)，Zhou Wenhua等人的《食品科学》148：17-19(1992)，Yang Daijian等人的《中草药》22(3)：99-101(1991)。

到目前为止仍然没有一种工艺简便、成本低廉且适合于大规模生产的制备高含量三叶苷的提取方法，也没有一种高含量的三叶苷活性提取物用于制备治疗糖尿病中的应用。因此，有必要进行进一步的研究。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种高含量三叶苷的活性提取物。

本发明的目的之二是提供一种适合于大规模生产的制备高含量三叶苷的方法，该方法简便易行、不污染环境，而且成本低廉。

本发明的目的之三是提供一种高含量三叶苷的活性提取物的药物组合物。

本发明的目的之四是提供一种三叶苷提取物的新用途，即用于制备治疗糖尿病、糖尿病肾病和肝水肿的药物。

本发明的高含量的三叶苷活性提取物指活性提取物中的三叶苷重量含量高于20％、30％、50％以上，优选30％-99.9％。

因此本发明提供了一种活性提取物，其中三叶苷的含量占该提取物重量的30-99.9％，优选为50-99.9％，特别优选为70-99.9％。在本发明的一个特别优选实例中，本发明方法制备的活性提取物为一晶体，其X-衍射图谱在衍射角为2θ时，具有下述特征峰：4.660，d＝18.947，I/I₀＝86；9.340，d＝9.461，I/I₀＝52；12.340，d＝7.167，I/I₀＝42；16.180，d＝5.474，I/I₀＝99；18.700，d＝4.741，I/I₀＝67；20.240，d＝4.384，I/I₀＝92；22.800，d＝3.897，I/I₀＝99；24.300，d＝3.660，I/I₀＝96；29.720，d＝3.004，I/I₀＝46。

本发明的高含量三叶苷的活性提取物是用5-95％的乙醇水溶液作为溶剂从壳斗科植物中提取得到的。

所述壳斗科植物包括水青冈属(Fagus)，栗属(Castanea)，锥属(Castanopsis)，柯属(Lithocarpus)，栎属(Quercus)，青冈亚属(Cyclobalanopsis)，三棱栎属(Trigonobalanus)。

本发明所述的壳斗科植物优选Lithocarpus polystachyus，Lithocarpuslitseifolius，Lithocarpus lithoserfolins，Lithocarpus lithoseifolius和Lithocarpus pachyphyllus等植物。

本发明所述的壳斗科植物特别优选多穗柯甜茶。

本发明所述的壳斗科植物主要来源于长江以南地区，包括：湖南、江西、重庆、四川、云南、福建、广西、安徽、浙江。优选湖南、江西、云南、四川、安徽地区。特别优选湖南、江西地区的多穗柯甜茶。

本发明含高含量三叶苷的活性提取物可以从所述植物的地下部分或地上部分提取，包括叶、嫩枝、树皮、树根。但是优选从新鲜的叶子中分离，新鲜的叶子优选在生长周期的早期收集。

本发明的活性提取物中三叶苷的含量为30-99.9％，除了三叶苷外，提取物中还可以含有其它的多酚，包括但不限于其中一种或多种成分如茶多酚、咖啡碱、谷氨酸、天门冬氨酸、亮氨酸、脯氨酸、赖氨酸、根皮苷、3-羟基根皮苷。

本发明的另一方面，是提供了一种适合于大规模生产高含量三叶苷的方法，该方法简便易行、不污染环境，而且成本低廉。

在本发明方法的优选实例中，是将植物原料用5-95％乙醇水溶液提取后，得到的粗提物再用聚酰胺或大孔吸附树脂进行进一步的分离纯化。本发明方法中所用的聚酰胺或大孔吸附树脂的粒径为10～200目，粗提物与聚酰胺或大孔树脂的重量比为1∶1～50，层析柱的直径与高的比为1∶2～30。特别优选的是：聚酰胺或大孔吸附树脂的粒径为10～100目，三叶苷粗提物与聚酰胺或大孔树脂的重量比为1∶5～40，层析柱的直径与高的比为1∶5～20。

本发明方法中，三叶苷粗提物通过聚酰胺进一步分离后可得到无色或淡黄色的三叶苷针状结晶体。该结晶体包括用含0-50％乙醇水溶液重结晶得到的含结晶水的三叶苷结晶体和用无水有机溶剂重结晶得到的不含结晶水的三叶苷结晶体。

本发明还提供了一种药物组合物，其包括本发明的治疗有效量的活性提取物和可药用载体。优选本发明的药物组合物含有三叶苷含量为50-99.9％的活性提取物，特别优选本发明的药物组合物含有三叶苷含量为70-99.9％的活性提取物。

本发明的药物组合物，制备成各种药物制剂，该制剂为口服给药制剂、注射给药制剂或局部给药制剂，其中：

(1)口服给药制剂包括普通片、缓释片、颗粒剂、硬或软胶囊、糖浆剂、溶液剂、乳剂；口服给药制剂的载体包括填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、着色剂、矫味剂或者其他常规添加剂，具体包括淀粉、乳糖、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙甲纤维素、硬脂酸镁、二氧化硅和聚山梨脂-80、十二烷基硫酸钠；

(2)注射给药制剂包括无菌注射的水溶液、无菌注射的水包油微乳液、注射用无菌粉末；注射给药制剂的载体包括注射用溶剂、注射用附加剂，具体注射溶剂包括注射用水、注射用油如大豆油，注射用增溶剂如乙醇、丙二醇、聚乙二醇、甘油，等渗物质如氯化钠、葡萄糖；

(3)局部给药制剂是贴剂、栓剂、霜剂、膏剂、凝胶剂、溶液、靶向制剂或混悬液，其中靶向制剂包括脂质体、微球剂、毫微粒、包含物、单克隆抗体耦联物；局部给药制剂的载体包括药学上用于局部给药的常规载体。

药物制剂给药形式包括：静脉、肌内、腹膜、皮下、口服、直肠栓剂插入法、阴道栓剂插入法、靶向给药、吸入式、灌胃式、鼻饲式、舌下给药、滴药法、微针式给药、连续给药系统和局部给药，局部给药方式如贴皮制剂、或植入式连续给药释放系统，其中贴皮制剂载体包括骨架材料如疏水的聚硅氧烷和亲水的聚乙烯醇等，控释膜材料如聚硅氧烷和乙烯-醋酸乙烯共聚物等，压敏胶如聚异丁烯、聚硅氧烷和聚丙烯酸酯，活性成分一般分散在压敏胶中；其中植入式连续给药释放系统所选用的高分子材料包括聚乳酸一乙醇酸共聚物、聚乙二醇聚乳酸共聚物、聚乳酸/聚己内酯、聚[碳酸(亚丁酯-co-ε-己内酯)酯]、聚丁内酯戊内酯、聚二氧环己酮(PDS)、聚-3-羟基丁酸酯(PHB)、聚左旋乳酸(PLLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚ε-己内酯(PCL)、聚己内酯/聚乙交酯丙交酯(PCL/PLGA)、甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)。

用于口服给药的本发明药物制剂可依据本领域用于制备口服药物组合物的任何已知方法制得，并且这样的组合物，除了含有本发明的活性提取物和可药用载体外，还可包含一种或多种选自下列的物质：甜味剂、矫味剂、着色剂和防腐剂，以提供药学美观和适口的制剂。

片剂含有活性组分以及与其混合的适于制备片剂的无毒的药学上可接受的赋形剂。这些赋形剂可以是：惰性稀释剂如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；制粒剂和崩解剂例如微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、玉米淀粉或藻酸；粘合剂例如淀粉、明胶、聚乙烯吡咯烷酮或阿拉伯树胶；和润滑剂例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。

本发明的口服制剂还可以以硬明胶胶囊提供，其中活性组分与惰性固体稀释剂例如碳酸钙、磷酸钙和高岭土混合，或以软明胶胶囊提供，其中活性成分与水溶性载体例如聚乙二醇或油性介质例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。

本发明的分散粉剂和粒剂，适于使用时通过加入水来制备水混悬液。它提供了与分散剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的活性组分。

本发明的糖浆剂和酏剂可以用甜味剂例如甘油、丙二醇、山梨糖醇或蔗糖配制。这样的制剂还可包含缓冲剂、防腐剂、矫味剂和着色剂以及抗氧剂。

本发明的药物制剂可以是无菌注射水溶液的形式。可使用的载体或溶剂包括水、林格溶液、氯化钠和/或葡萄糖注射液。

本发明的活性提取物或药物组合物在制备治疗下列疾病的药物中的应用：

增加高密度脂蛋白的水平、增强记忆力、改善学习能力、衰老、代谢类疾病、糖尿病、糖尿病肾病、糖尿病足病、糖尿病视网膜病、糖尿病性神经病、糖尿病并发症、延迟伤口愈合、胰岛素抗性、高血糖、高胰岛素血症、脂肪酸或甘油的水平升高、高脂血症、肥胖症、高甘油三酯血症、动脉粥样硬化、高血压、代谢综合症(X综合症)、贫血(如镰刀细胞贫血)、粉刺、肿瘤、风湿性关节炎、关节炎、肠炎、银屑病、多发性硬化症、神经变性紊乱、充血性心力衰竭、中风、主动脉瓣狭窄、肾炎、肾衰竭、痛风、红斑狼疮、IgA肾病、阑尾炎、胰腺炎、变态反应(如鼻炎、鼻窦炎)、纤维症、骨病、骨质疏松、心血管疾病(如心律失常、心血管休克、心绞痛)、放疗及化疗并发症、肝病(如肝炎)、胃肠道病症(如胃炎和胃肠炎)、结膜炎、斯耶格伦(Sjogren′s)综合症、肺病、肾病(如多囊肾病)、皮炎、HIV相关病症、疟疾(如脑疟)、强直性脊椎炎、麻风病、免疫性疾病、抑郁症、老年痴呆症、水肿、溃疡、精神分裂症、精神障碍性疾病、过敏性休克、尿崩症、哮喘、青光眼、线粒体疾病、帕金森、、病理老化的糖基化终端产物、能量代谢异常、基质金属蛋白酶病理性疾病。

本发明所说的病理老化的糖基化终端产物相关疾病包括但不限于糖尿病、老年痴呆症、动脉粥样硬化、肾病、骨关节炎、骨质疏松、衰老等疾病中的一种或多种。

本发明所说的基质金属蛋白酶病理性疾病包括但不限于动脉粥样硬化、中枢神经系统炎症、阿耳茨海默(氏)病、哮喘、皮肤老化、类风湿性关节炎、骨关节炎、骨质疏松、脓毒性关节炎、子宫内膜异位症、角膜溃疡粘连、骨病、蛋白尿、腹主动脉瘤、退化性软骨损耗、多动性硬化症、髓鞘神经耗损、肝纤维化、nephroglomerular病、胚膜破裂、肠炎、牙周病、老年黄斑变性、糖尿病视网膜疾病、视网膜玻璃体增生、视网膜发育不良、眼炎、角膜溃疡、sjogren′s并发症、眼近视瘤、肿瘤转移中的一种或多种。

本发明所说的线粒体疾病包括但不限于眼肌麻痹、肌肉病变、运动失调、癫痫发作、肌阵挛、中风、视神经病变、感音神经性聋、痴呆、周围神经病、肌张力障碍、脊髓病变、心肌病、白内障、色素性视网膜病变、代谢性酸中毒、恶心、呕吐、肝病、肾病、假性肠梗阻、铁粒幼细胞贫血、糖尿病、胰腺外分泌功能障碍和甲状旁腺功能低下症中的一种或多种。

本发明所说的能量代谢异常疾病包括但不限于创伤、缺血及再灌注损伤导致的疾病，如各种急性化学物理因素所致的创伤、中毒、休克、高原病、放射病、尘肺、电击伤、晕动病、急慢性心功能不全，心律失常、心脏传导异常、人工心脏起搏、心血管介入疗法、瓣膜病、动脉粥样硬化、冠心病、(包括猝死)、先天性心脏病、高血压、感染性心内膜炎、肺源性心脏病、心包炎、心肌病、周围血管疾病(包括多发性大动脉炎、雷诺综合症、血栓闭塞性脉管炎、闭塞性动脉硬化等)、心脏移植手术、神经痛、神经炎、各种周围神经病、各种脊髓疾病、急性脑血管疾病(包括脑梗死、脑栓塞、脑出血、蛛网膜下腔出血等)、颅内肿瘤、中枢神经系统感染(包括病毒和细菌性脑炎、脑膜炎等)、运动障碍性疾病(帕金森病、舞蹈病、肝豆状核变性、肌张力障碍、抽搐与振颤)发作性疾病(包括癫痫、偏头痛、发作性睡病与猝倒症等)、脱髓鞘性疾病(包括多发性硬化症、视神经脊髓炎、脑白质营养不良)、骨骼肌肉病(包括肌营养不良症、强直性肌病、重症肌无力、炎症性肌病、代谢性肌病、周期性瘫痪)、自主神经疾病(包括雷诺病、红斑性肢痛、间脑综合症)、弥散性血管内凝血等；胰岛素抵抗及内分泌等因素引起的疾病，如肥胖症、各种原因所致低血糖、胰岛素抵抗综合症、代谢综合症、营养不良(营养不良性干瘦、恶性营养不良、继发性蛋白质能量营养不良)、肠内营养、肠外营养、水电解质代谢紊乱、酸碱平衡紊乱、糖尿病、糖尿病心血管疾病、糖尿病周围神经病变、糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病、糖尿病足、妊娠与糖尿病、糖尿病并发感染、糖尿病急性代谢并发症、乳酸性酸中毒、各型糖原累积病、血脂蛋白紊乱、高氨基酸尿症、黄瘤、粘多糖病、果糖不耐受症、半乳糖血症、其他嘌呤和嘧啶代谢疾病、营养与代谢障碍性皮肤病(维生素缺乏、肠病性肢端皮炎、原发性皮肤淀粉样变、皮肤卟啉病、黄瘤病)、糖尿病视网膜并发症、生长激素缺乏性侏儒症、成年人腺垂体功能减退症、肾上腺病、甲状腺病、甲状旁腺病、卵巢病、性早熟、胰岛内分泌肿瘤、多发性内分泌腺病等疾病；肿瘤等疾病，如各种肿瘤、癌症、肉瘤、血癌、急慢性白细胞及粒细胞性白血病、各种原因所致的贫血(包括骨髓性贫血、再生障碍性贫血、镰状红细胞性贫血)、淋巴组织细胞病、自身免疫性疾病、原发性和继发性免疫缺陷病、肺部肿瘤、肺肉瘤、消化性溃疡、食道癌、胃癌、胃肿瘤、大肠癌、肾脏肿瘤、口腔肿瘤、原发性和继发性肝癌、胆管肿瘤、艾滋病、各种皮肤癌、骨髓肿瘤等疾病；炎症、严重感染和免疫反应导致的疾病，如感染性休克、多脏器功能衰竭、高温、低温综合症、感染性疾病(呼吸道感染、哮喘、严重急性呼吸综合症、病毒性肝炎、流行性腮腺炎、流行性乙型脑炎、狂犬病、脊髓灰质炎、麻疹、风疹、天花、水痘、单纯疱疹、带状疱疹、流行性出血热、黄热病、肠道病毒所致的各系统感染、传染性单核细胞增多症、巨细胞病毒感染、艾滋病、立克次体病、衣原体感染、支原体感染、细菌性疾病(包括结核性疾病厌氧菌感染、败血症、破伤风等)、真菌性疾病、螺旋体病、寄生虫病、各种原因引起的感染性腹泻、急性出血坏死性小肠炎、溃疡性结肠炎、肠梗阻、胃动力性和功能性疾病、急性腹膜炎、急性胰腺炎、各种原因引起肝硬化、脂肪肝、黄疸、腹泻、消化道出血、反流性食管炎、爆发性肝功能衰竭、肝性脑病、胆石病、胆囊炎、急慢性肾功能衰竭、血液净化疗法、急慢性呼吸功能不全、慢性阻塞性肺疾病、支气管哮喘、支气管扩张、各种原因引起的肺炎、肺脓肿、肺水肿、肺栓塞、肺静脉瘘、肺结核、先天性肺发育不全、阻塞性睡眠呼吸暂停综合症、呼吸衰竭、急性呼吸窘迫综合征、急慢性肾炎、肾病综合症、微小病变性肾病、膜性肾病、局灶性肾小球硬化症、系膜增殖性肾小球肾炎、系膜毛细血管增生性肾炎、继发性肾小球疾病、遗传性肾炎、泌尿道感染、间质性肾炎、肾小管疾病、肾石病、牙周脓肿、病毒性皮肤疾病、细菌性皮肤疾病、真菌性皮肤病、荨麻疹类皮肤病、失聪、美尼尔氏综合症、急慢性中耳炎、结膜病、角膜病、白内障、青光眼、葡萄膜病、视网膜病、视神经病、急慢性扁桃体炎、扁桃体脓肿、骨关节炎、代谢性骨病、骨质疏松症、痛风和高尿酸血症、结节病、淀粉样变性、大骨节病、色素性皮肤病(白癜风、黄褐斑、雀斑、黑变病、遗传性大疱性表皮松解症、鱼鳞病、毛周角化病、家族性良性天疱疮、日光性皮肤病、冻疮、放射性皮肤病、痤疮、脂溢性皮炎、斑秃、雄激素源性脱发、风湿热、系统性红斑囊疮、类风湿性关节炎、脊柱关节病、多发性肌炎和皮肌炎、硬皮病和系统性硬化症、过敏性疾病等；各种原因所致线粒体功能障碍导致的退行性病变以及神经精神性疾病，如衰老、阿尔兹海默病、各种原因导致的线粒体疾病，如亨廷顿氏疾病、帕金森病(PD)、肌萎缩性侧索硬化、线粒体脑肌病伴乳酸中毒及中风样发作综合征(MELAS)、肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维病(MERRF)、Leber遗传性视神经病(LHON)、线粒体心肌病、肌病、痴呆、突发的不能控制的肌肉收缩(肌阵挛性的癫痫)、精神疾病包括器质性精神障碍(痴呆综合症、谵妄综合症、遗忘综合症、艾滋病所致精神障碍)、精神活性物质所致精神障碍(酒精中毒和酒精依赖、药物依赖)、精神分裂症、情感障碍、神经症性障碍(恐怖症、焦虑症、强迫症、神经衰弱、癔症、疑病症)、进食障碍、睡眠障碍、广泛性发育障碍、精神发育迟滞、多动障碍、抽动障碍、男性性功能障碍等疾病急慢性缺血、创伤、严重感染、糖尿病和肿瘤等。

本发明所说的糖尿病并发症包括但不限于糖尿病肾病、糖尿病足病、糖尿病视网膜病、糖尿病性神经病等与糖尿病相关的微血管疾病。

统称为“X综合症”(也称做代谢综合症)的病症、疾病和疾患是以中心性肥胖为核心，合并血压、血糖、甘油三酯升高和/或HDL-C降低，是胰岛素抵抗所致的糖，脂代谢紊乱，以合并出现多种代谢性疾病为临床特点的一组严重影响健康的症候群。详述于Johannsson J.Clin.Endocrinol.Metab.，82，727-34(1997)中。

当把本发明的药物组合物和药物制剂对人体给药时，日剂量通常由处方医师决定，并且剂量一般随个体患者的年龄、体重、性别和反应以及患者症状的严重程度而变。通常，成人每天给药剂量为1-500mg活性提取物/kg体重，优选为每天5-300mg活性提取物/kg体重。

本发明的研究表明：三叶苷提取物具有保护肾脏和肝细胞的作用，对体重也有一定程度的减轻作用。

因此，本发明的再一方面是提供了一种三叶苷活性提取物的新用途，即用于制备预防和治疗治疗糖尿病肾病、肝水肿，尤其是药物性肝水肿的药物。

附图说明

表1三叶苷对DN大鼠血生化及大体病理变化

图1三叶苷单体X衍射图

具体实施方式

本发明将结合实施例作进一步的说明。

通过实施例来帮助进一步理解本发明。所用的具体材料、物种和条件都是为了举例说明本发明，而不是限制本发明的合理范围。本发明的分子结构有的存在立体异构体，它们通过手性试剂定向合成或分子拆分或经纯化柱制得单纯的立体异构体，这些立体异构体在本实施例中未全部说明但不限制本发明。

下面的实施例仅仅用于进一步解释本发明，而不是对本发明范围的限制。

实施例1大孔树脂精制三叶苷

将多穗柯嫩叶加入8倍量浓度为70％的乙醇水溶液中，浸泡2小时后，加热至回流状态，并回流1小时，过滤；滤渣加入6倍量的70％乙醇水溶液加热至回流状态并回流1小时，过滤；重复此过程1次。合并过滤液，减压浓缩回收乙醇，得到三叶苷浸膏。

将30g三叶苷干浸膏放于100ml蒸馏水中，加热至80℃并不断搅拌使三叶苷完全溶解，趁热抽滤得到棕褐色澄清溶液，静置冷却至20～40℃，将该溶液加到中等极性大孔吸附树脂(DM-301)首端，用蒸馏水洗脱除去部分水溶性杂质及色素后，用20％-50％的乙醇水溶液进行洗脱，薄层检测，收集末端洗脱液，浓缩过滤，滤液放置析晶，对析出的粗结晶用适量蒸馏水重结晶，得到10.0g纯度在99％以上的三叶苷精品。

m.p.168.0～169.0℃；X-衍射图谱见附图1。

ESI-MS(m/z)：435[(M-1)⁺]及ESI-MS(m/z)：437[(M+H)⁺]，459[(M+Na)⁺]。

IR cm^-1：3414，1596，1515，1076，980，825

¹H-NMR(DMSO-d₆)δ：2.79(2H，t，J＝7.4Hz)，3.16-3.71(8H，m)，4.88(1H，d，J＝7.7Hz)，4.52-5.30(4H，m)，6.05(2H，s)，6.66(2H，dt，J＝2.8，8.4Hz)，7.04(2H，d，J＝8.4Hz)，9.10(1H，s)，12.25(2H，s)。

¹³C-NMR(DMSO-d₆)δ：29.3，45.6，60.5，69.4，73.0，76.4，77.1，95.1(×2)，99.6，105.3，115.0(×2)，129.2(×2)，131.5，155.4，163.4，163.7(×2)，205.1。

实施例2聚酰胺精制三叶苷

将多穗柯嫩叶加入10倍量的80％乙醇水溶液，浸泡30分钟后，加热至回流状态，并回流1小时，过滤；滤渣加入5倍量浓度为80％的乙醇水溶液加热至回流状态并回流1小时，过滤；此过程重复1次。合并过滤液，常压回收乙醇，浓缩得到三叶苷浸膏。

将30g三叶苷干浸膏放于100ml蒸馏水中，加热至80℃并不断搅拌使三叶苷完全溶解，趁热抽滤得到棕褐色澄清溶液，静置冷却至20～40℃，将该溶液加到聚酰胺首端，用蒸馏水洗脱除去部分水溶性杂质及色素后，用20％-40％的乙醇水溶液进行洗脱，薄层检测，收集末端洗脱液，浓缩过滤，滤液放置析晶，对析出的粗结晶用适量蒸馏水重结晶，得到13.2g纯度在99.2％以上的三叶苷精品。

实施例3

按下列配方制得本发明的片剂：(所用含量均为重量百分含量)

含70％三叶苷的活性提取物 54.5％

微晶纤维素 42.0％

PVP-k30 1.0％

硬脂酸镁 0.5％

羧甲基淀粉钠 2.0％

将三叶苷提取物、微晶纤维素、部分羧甲基淀粉钠混匀，加入PVP-k30的乙醇溶液制软材，经20目筛制粒，60℃鼓风干燥后整粒，加入羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁后混匀压片，即得。

实施例4

按下列配方制得本发明的胶囊剂：(所用含量均为重量百分含量)

含80％三叶苷的活性提取物 50.0％

淀粉 47.5％

羧甲基淀粉钠 2.0％

硬脂酸镁 0.5％

将三叶苷苷提取物与淀粉混合均匀，加入8％淀粉浆制软材，经20目筛制粒，于60℃鼓风干燥后整粒，加入羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁后填充到空胶囊即得。

实施例5

三叶苷结晶体 30.0％

微晶纤维素 66.5％

PVP-k30 1.0％

硬脂酸镁 0.5％

羧甲基淀粉钠 2.0％

将三叶苷结晶体、微晶纤维素、部分羧甲基淀粉钠混匀，加入PVP-k30的乙醇溶液制软材，经20目筛制粒，60℃鼓风干燥后整粒，加入羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁后混匀压片，即得。

实施例6

三叶苷提取物治疗糖尿病肾病、肝水肿的药效学研究。

(一)：动物模型的建立

本药物用在经左肾切除+高脂高糖饲料诱导+STZ选择性破坏胰腺细胞造成糖尿病及单侧肾脏失代偿导致的大鼠糖尿病肾病模型经灌胃给药一个月。给药观察期间，每周称体重并计进食量。在结束试验前每只动物均上代谢笼收集24h尿液，测24h尿蛋白总量；并取血测相关血生化指标，包括血糖，尿素氮，总胆红素，谷丙转胺酶；并且处死动物后取肾脏，肝脏，心脏，测其重量，计算脏器/体重指数；制作石蜡切片。

(二)：药效学实验及其结果

1.三叶苷对DN大鼠血生化及大体病理的影响(见表1)

实验发现，在服用三叶苷的两组动物模型中其谷丙转胺酶、总胆红素、血糖量均较对照组有降低，并有显著性差异。

2.肝细胞病理切片

肝细胞HE染色400x显微镜下显示，模型对照组肝细胞形态较正常细胞有肿胀界限不清，而大剂量组却见较为清晰的细胞界限。肝细胞核见有2-3个核仁/细胞，可能与细胞代谢旺盛有关。给药组较阴性对照组动物转氨酶显著降低的结果与病理切片结果吻合。

(三)药效学结果分析及初步结论

结果显示三叶苷可降低尿素氮，使肾重量缩小；降低血谷丙转氨酶值，减轻肝细胞水肿现象。给药组动物的血糖，血脂及24小时尿蛋白也有不同程度下降。因此，三叶苷有保护肾脏，肝细胞的作用；和降血糖，血脂及蛋白尿作用。

Claims

1.一种含三叶苷的活性提取物在制备治疗糖尿病肾病和肝水肿药物中的应用，其特征在于所述活性提取物是从壳斗科植物中用5-95％乙醇水溶液提取得到粗提物，再用聚酰胺或大孔吸附树脂进行进一步的分离纯化得到的含99-99.9％三叶苷的活性提取物，所述的聚酰胺或大孔吸附树脂的粒径为10～200目，粗提物与聚酰胺或大孔树脂的重量比为1∶1～50，层析柱的直径与高的比为1∶2～30。

2.权利要求1所述的含三叶苷的活性提取物在制备治疗糖尿病肾病和肝水肿药物中的应用，其特征在于所述的聚酰胺或大孔吸附树脂的粒径为10～100目，粗提物与聚酰胺或大孔树脂的重量比为1∶5～40，层析柱的直径与高的比为1∶5～20。

3.一种用于制备治疗糖尿病肾病和肝水肿的药物组合物，其特征在于该药物组合物由权利要求1所述的含99-99.9％三叶苷的活性提取物和药学上可接受的载体组成。

4.权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，将所述药物组合物制备成各种药物制剂，该制剂为口服给药制剂、注射给药制剂或局部给药制剂。