CN113801906A - 3羟基根皮苷的制备及其工艺优化 - Google Patents

3羟基根皮苷的制备及其工艺优化 Download PDF

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汪鋆植
余泇兴
周子键
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
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Abstract

本发明涉及3羟基根皮苷的制备及其工艺优化方法，其反应条件温和，生产能耗小，环境污染少，可操作性强，步骤包括：取一定体积的粗酶液，加入合适比例的一定浓度的根皮苷溶液，于实验要求温度下水浴相应时间，沸水加热5 min。确定的实际取值为根皮苷浓度1.20mM，转化时间6.0h，粗酶浓度13.0 U*mL‑1。此条件下由公式计算的理论值为93%，得到3‑羟基根皮苷的摩尔转化率为92.5%±0.525%；取转化液，用等体积甲醇稀释，0.22μm的微孔滤膜过滤；采用HPLC分析滤液中的根皮苷和3‑羟基根皮苷含量，并根据其标准曲线回归方程计算含量；将上述所得反应液用大孔树脂吸附，水洗去杂，然后用30‑90%乙甲醇依次洗脱，收集含3‑羟基根皮苷的组分，浓缩干燥得到黄色无定形粉末3‑羟基根皮苷。

Description

3羟基根皮苷的制备及其工艺优化
技术领域
本发明涉及一种微生物转化根皮苷生产3羟基根皮苷的方法。
背景技术
湖北海棠原产地适应性极强，在我国广为分布，但湖北西部连片分布，是湖北海棠原产地。是良好的可利用资源。具有药用、食用、观赏多种价值。卫生部2014年第20号公告批准湖北海棠（茶海棠）叶为新食品原料。《湖北省中药材质量标准》2009年版收载了药材质量标准。
湖北海棠叶作茶饮用已有千年历史。含有根皮苷、3-羟基根皮苷、齐墩果酸、熊果酸等化合物。具有保肝、雌激素样作用等多种作用。其作用是多种成分共同作用的结果。湖北海棠叶早期以根皮苷为主要成分。为了控制海棠茶内在成分比例，优化药理作用。同时制备不同成分，进一步扩大湖北海棠的应用。我们发明了一种微生物转化根皮苷生产3羟基根皮苷的方法。
发明内容
本发明的目的在于：控制海棠茶内在成分比例，优化药理作用，同时制备不同成分，进一步扩大湖北海棠的应用。具体地提供了一种制备及其工艺优化方法：它包括如下操作步骤：
（1）粗酶的制备：
①菌种的扩大培养：取斜面菌种接种至平板培养基上，于25℃恒温培养箱中培养7d，备用。
②菌种液体发酵：a.接种用菌悬液制备：将平板上菌种接种于装有玻璃珠的200mL发酵培养基中，于30 ℃、120 r/min条件下，培养24 h，制得种子液;b.液体发酵：以5%的接种量吸取种子液至200 mL 发酵培养基中，于30 ℃、120 r/min条件下培养。
③粗酶获得与酶活测定：a.粗酶：收集发酵液，过滤，弃去菌丝体，上清液用50%硫酸铵4℃下盐析12h，在4℃于12 000 r/min离心30 min，弃去上清液，收集沉淀;沉淀加入少量去离子水，溶解，脱盐，冷冻干燥得到粗酶;b.多酚氧化酶活性测定：粗酶用适宜缓冲液溶解，取1mL粗酶液+2mL0.1mol/L的pH6.5磷酸盐缓冲液+3mL反应液（pH6.5缓冲液：0.1%脯氨酸：0.1M邻苯二酚=10:2:3），37℃，反应10min，以每分钟OD420值增加0.001为一个酶活力单位，以沸水浴灭活1mL粗酶液+2mL 0.1mol/L的pH6.5磷酸缓冲液+3mL反应液同步反应做空白。
（2）根皮苷的生物转化方法：取上述一定体积的粗酶液，按照实验设计加入合适比例的一定浓度的根皮苷溶液，于实验要求温度下水浴相应时间，沸水加热5 min，以终止反应。
（3）取转化液，用等体积甲醇稀释， 0.22 μm的微孔滤膜过滤；采用HPLC分析滤液中的根皮苷和3-羟基根皮苷含量，并根据他们的标准曲线回归方程计算含量；实验中，同时设立对照组，即只加转化液，不加底物。
（4）分离纯化：将上述所得反应液用大孔树脂吸附，水洗去杂，然后用30-90%乙甲醇依次洗脱，收集含3-羟基根皮苷的组分，浓缩干燥得到黄色无定形粉末3-羟基根皮苷。
（5）3-羟基根皮苷鉴定：化合物黄色无定形粉末，其ESI-MS质谱显示其准分子离子峰475[M+Na]+，结合NMR数据，得出其分子式为C21H24O11，推测化合物可能为查耳酮类型的黄酮类化合物。
附图说明
图1 根皮苷浓度和转化时间交互影响效价的曲面图和等高线图
图2 根皮苷浓度和粗酶浓度交互影响效价的曲面图和等高线图
图3 粗酶浓度和转化时间交互影响效价的曲面图和等高线图
图4 3-羟基根皮苷的结构
图5 1H-NMR图谱
图6 13C-NMR、DEPT图谱
具体实施方式
本具体实施方式采用以下技术方案：
1材料与仪器
1.1实验材料
对照品：根皮苷（≥98%）、3-羟基根皮苷（≥98%），实验室自制；甲醇、乙腈，色谱纯，其余试剂为分析纯。毛栓菌（Trametes trogii）：购于中科院微生物所,菌种编号:5.629。
PDA培养基（1L）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20g，蒸馏水1 000 mL，pH自然，121 ℃灭菌30 min。
液体发酵培养基；马铃薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO4 3g，MgSO4 3g，VB10.01g，CaCl2 0.05g，麸皮10g，酵母浸粉6g，酪氨酸 0.182g，蒸馏水1 000 mL，pH自然，121 ℃灭菌30 min。
1.2实验仪器
高效液相色谱仪，DIONEX Ultimate 3000；检测器，Ultimate 3000 Diode ArrayDetector；色谱柱：COSMOSIL C18 (250×4.6mm, 5μm）；HEV-50型自动灭菌锅：日本HIRAYAMA公司；SB-100旋转蒸发仪：日本EYELA公司；0.22 μm尼龙膜针筒过滤器：天津津腾实验设备有限公司; HH-6数显恒温水浴锅：金坛市城西春兰实验仪器厂；ME215S型十万分之一电子天平：德国Sartorios公司。
1.3实验方法
1.3.1 主要成分测定的色谱条件
色谱条件：Cosmail C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（25:75，V/V）；检测波长为284 nm，流速为1.0 mL/min，柱温：30 ℃，进样量：10 μL。
1.3.2 根皮苷、3-羟基根皮苷标准曲线的制作
精密称取0.1000 g的根皮苷和0.0680g的3-羟基根皮苷标准品，置于100 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度线，摇匀，即得质量浓度为1.0 mg*mL-1的根皮苷和0. 68 mg*mL-1的3-羟基根皮苷标准品溶液。精密吸取标准溶液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、5.0 mL、10.0 mL，分别置于10 mL容量瓶，用甲醇定容，配成质量浓度为50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、500 μg/mL、1000 μg/mL的系列根皮苷标准溶液，34 μg/mL、68 μg/mL、136 μg/mL、340 μg/mL、680 μg/mL的系列3-羟基根皮苷标准溶液。吸取10 μL，于上述色谱条件下进样分析，每个质量浓度进样3次，计算平均峰面积。以根皮苷和3-羟基根皮苷质量浓度（X）为横坐标，
峰面积积分值（Y）为纵坐标，进行线性回归，得根皮苷标准回归方程为：Y=0.2915X-0.2599（R2=0.9992）、3-羟基根皮苷标准回归方程为：Y=0.112X+1.264（R2=0.9997）。
1.3.3 粗酶的制备
菌种的扩大培养：取斜面菌种接种至平板培养基上，于25℃恒温培养箱中培养7d，备用。
菌种液体发酵：（1）接种用菌悬液制备：将平板上菌种接种于装有玻璃珠的200 mL发酵培养基中，于30 ℃、120 r/min条件下，培养24 h，制得种子液。（2）液体发酵：以5%的接种量吸取种子液至200 mL 发酵培养基中，于30 ℃、120 r/min条件下培养。
粗酶获得与酶活测定：（1）粗酶：收集发酵液，过滤，弃去菌丝体，上清液用50%硫酸铵4℃下盐析12h，在4℃于12 000 r/min离心30 min，弃去上清液，收集沉淀。沉淀加入少量去离子水，溶解，脱盐，冷冻干燥得到粗酶。（2）多酚氧化酶活性测定：粗酶用适宜缓冲液溶解，取1mL粗酶液+2mL0.1mol/L的pH6.5磷酸盐缓冲液+3mL反应液（pH6.5缓冲液：0.1%脯氨酸：0.1M邻苯二酚=10:2:3），37℃，反应10min，以每分钟OD420值增加0.001为一个酶活力单位，以沸水浴灭活1mL粗酶液+2mL 0.1mol/L的pH6.5磷酸缓冲液+3mL反应液同步反应做空白。
1.3.4 根皮苷的生物转化方法
取上述一定体积的粗酶液，按照实验设计加入合适比例的一定浓度的根皮苷溶液，于实验要求温度下水浴相应时间，沸水加热5 min，以终止反应。取转化液，用等体积甲醇稀释， 0.22 μm的微孔滤膜过滤。采用HPLC分析滤液中的根皮苷和3-羟基根皮苷含量，并根据他们的标准曲线回归方程计算含量。实验中，同时设立对照组，即只加转化液，不加底物。3-羟基根皮苷生成率按如下公式计算：
3-羟基根皮苷生成率=
Figure 5261DEST_PATH_IMAGE002
×100%
式中：C1为转化液中3-羟基根皮苷的摩尔浓度，g/L；C为反应液原始根皮苷摩尔浓度。
1.3.5 Placket-Burman（PB）实验设计
分别选取7个因素的高低2个水平，通过Design Expert 软件选用Factors = 7 ,Runs=12 的PB设计，以3-羟基根皮苷转化率作为响应值。通过比较各因素的显著性水平，筛选出对其影响较为显著的因素。
1.3.6最陡爬坡实验
根据PB实验结果，选取影响3羟基根皮苷生成率较大的三个因素，正效应的取高水平，负效应的取低水平。显著因素的变化步长及方向的实验设计及结果见表5.
1.3.7 Central Composite Design(CCD)-效应面法优化
用中心组合设计进行响应面试验，通过试验数据拟合响应面模型，得到二次多项式，并最终确定最佳制备条件。
2 结果与分析
2.1 影响3羟基根皮苷转化率重要因素的确定
PB试验设计及结果见表1和表2。回归模型的方差分析和主效应分析见表3和表4。根皮苷浓度、温度、粗酶浓度、pH、搅拌速率对转化率呈正效应，时间和酪氨酸浓度对转化率呈负效应。其中粗酶浓度和转化时间的影响显著。所以选取粗酶浓度、根皮苷浓度、转化时间作为最陡爬坡试验和响应面实验的因素。其他因素正效应取高水平，负效应取低水平。
表1 Plackett-Buman 设计因素水平
Figure DEST_PATH_IMAGE004A
注：所加试剂用量均以50mL反应液为基准。
表2 Placket-Bueman 筛选设计（n=3）
Table2 Placket-Burman design and results(n=3)
Figure RE-577980DEST_PATH_IMAGE003
表3 Placket-Burman 设计回归模型方差分析
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE004
表4 Placket-Burman 设计回归模型主效应分析
Figure RE-295400DEST_PATH_IMAGE005
1.3.2最陡爬坡实验设计及结果
根据PB实验结果，根皮苷浓度和粗酶浓度成正效应，转化时间呈负效应。显著因素的变化步长及方向的实验设计及结果见表5。
表5 最陡爬坡实验设计及结果
Figure DEST_PATH_IMAGE012
从表5结果可以看出，最佳因素组合处于第1组与第2组之间。根皮苷消耗率和3羟基根皮苷生成率对底物根皮苷浓度和粗酶浓度呈负效应，与反应时间呈正效应。但时间延长会影响实际生产产率，室温下根皮苷的水中溶解度不大。故综合上述因素选择响应面实验的中心点为：根皮苷浓度1.50mM、时间5h, 粗酶浓度15 U*mL-1。
1.3.3响应面实验结果与分析
1.3.3.1回归模型的建立与分析
根据CCD中心组合实验设计原理，结合单因素实验结果，选取影响3-羟基根皮苷转化率的主要因素。因素水平见表1，以3-羟基根皮苷转化率为指标，实验设计及结果见表2。应用Design Expert 8. 0 软件对试验数据进行多元回归分析，得一次多元回归方程：Y=0.72 –0.099*X1 + 0.086 * X2– 0.075 *X3 (p=0.0109,R2=0.4926)。得二次多元回归
Y=0.88-0.099X1+0.086X2-0.075X3-0.015X1X2+0.034X1X3-0.009X2X3-0.045X1 2-0.11X2 2-0.083X3 2。根据回归结果进行方差分析( 表 3) ，结果表明各变量影响3-羟基根皮苷转化率均显著。 模型回归方程具有显著意义，失拟项结果不显著，说明所选用的回归方程良好。R2=0.9153，精确度10.517，标准偏差0.074，变异系数10.36。
表1 因素水平表
Figure DEST_PATH_IMAGE014
表2 3-羟基根皮苷制备工艺优选星点设计结果
试验号 X<sub>1</sub> X<sub>2</sub> X<sub>3</sub> 3羟基根皮苷转化率
1 -1 -1 -1 74.75%
2 1 -1 -1 48.10%
3 -1 1 -1 90.60%
4 1 1 -1 56.96%
5 -1 -1 1 59.69%
6 1 -1 1 45.87%
7 -1 1 1 70.90%
8 1 1 1 51.83%
9 -1.73 0 0 90.62%
10 1.73 0 0 64.21%
11 0 -1.73 0 36.53%
12 0 1.73 0 81.73%
13 0 0 -1.73 84.05%
14 0 0 1.73 47.76%
15 0 0 0 92.06%
16 0 0 0 85.29%
17 0 0 0 81.79%
18 0 0 0 90.87%
19 0 0 0 84.72%
20 0 0 0 92.39%
表3 3-羟基根皮苷制备方差分析
Figure DEST_PATH_IMAGE016
1.3.3.2 效应面分析
以 Design Expert 8. 0 软件，根据回归方程分析结果，将回归方程中的任意1 个因素固定于一个水平，对剩余 2 个因素按照所得的二元二次方程进行编程运算，分别作三维响应面图和二维等高线图(图1-3)。
响应曲面坡度的陡峭、平缓，表明对于处理条件下改变的反应敏感性大、小。等高线图中椭圆排列越密集，说明因素变化对响应值影响越大；同时，等高线的形状可反映出交互效应的强弱大小（椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则预示可忽略）。由图1-3并结合表3的结果分析可知：3者交互作用不显著。
1.3.4 效应值优化及验证
通过Design Expert 软件分析确定最佳转化工艺为根皮苷浓度1.21mM，转化时间5.88h，粗酶浓度13.02 U*mL-1。考虑到实际操作和生产成本等问题，本实验确定的实际取值为根皮苷浓度1.20mM，转化时间6.0h，粗酶浓度13.0 U*mL-1。此条件下由公式计算的理论值为93%。按此条件进行验证性实验，得到3-羟基根皮苷的摩尔转化率为92.5%±0.525% 。
1.3.5 3-羟基根皮苷分离纯化
分离纯化：将上述所得反应液用大孔树脂吸附，水洗去杂，然后用30-90%乙甲醇依次洗脱，收集含3-羟基根皮苷的组分。浓缩干燥得到3-羟基根皮苷。
3-羟基根皮苷鉴定：
化合物 黄色无定形粉末。其ESI-MS质谱显示其准分子离子峰475[M+Na]+，结合NMR数据，得出其分子式为C21H24O11，推测化合物可能为查耳酮类型的黄酮类化合物。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)图谱(见图5)，δ ppm：较低场的三个质子7.04(d,2.0)，7.04(d,8.4)，6.65(dd,2.0,8.4)为B环ABX自旋系统中H-2和H-5，H-6的信号；较高场的一组二重峰6.12(d,1.6)，5.93(d,2.0)分别为A环H-3′和H-5′的信号，5.08(d,7.2)为葡萄糖的端基质子信号。其余一系列的从3.20-4.92ppm的H质子信号为C-α、C-β、葡萄糖上的10个质子的信号。
13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)图谱(见图6)，δ ppm：101.32，77.77，77.21，73.64，69.94，61.07分别为糖取代基的1，3，5，2，4，6位碳，据碳谱数据确定为β-D-吡喃葡萄糖。205.20为二氢查耳酮羰基碳。165.80，164.86，105.69为二氢查耳酮4′，6′，1′位碳。97.29，94.80分别为二氢查耳酮5′，3′位碳。161.30为2′位碳，与葡萄糖成苷。132.83，129.62，119.33，115.45分别为二氢查耳酮1，2，6，5位碳原子信号。145.34和143.60为二氢查耳酮4，3位碳，因羟基的诱导效应而位于较低场。45.35，29.60分别为二氢查耳酮C-α，C-β位碳。以上数据基本与根皮素-2′-O-β-葡萄糖苷的光谱数据一致，因此该化合物鉴定为3-羟基根皮苷（3-hydroxy-phloridzin），其碳、氢谱数据归属见表4。
表4 化合物 MHE-5的1H(400 MHz)和13C-NMR(100 MHz)数据归属(DMSO- d6)
No δ<sub>C</sub> (ppm) δ<sub>H</sub> (J,Hz) No δ<sub>C</sub> (ppm) δ<sub>H</sub>(J,Hz)
1 132.83qC - 6′ 164.86qC -
2 129.62CH 7.04(d,2.0） C-α 45.35CH<sub>2</sub> 3.70(m),3.51(m)
3 143.60qC C-β 29.60CH<sub>2</sub> 2.78(m)
4 145.34qC - C=O 205.20qC -
5 115.45CH 7.04(d,8.4- Glc - -
6 119.33CH 6.65(dd,2.0,8.4) 1′′ 101.32CH 5.08(d,7.2)
1′ 105.69qC - 2′′ 73.64CH -
2′ 161.30qC - 3′′ 77.77CH -
3′ 94.80CH 6.12(d,1.6) 4′′ 69.94CH -
4′ 165.80qC - 5′′ 77.21CH -
5′ 97.29CH 5.93(d,2.0) 6′′ 61.07CH<sub>2</sub> -

Claims (5)

1.本发明涉及3羟基根皮苷的制备及其工艺优化方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：（1）粗酶的制备：取斜面菌种于25℃恒温培养箱中培养7d，接种于装有玻璃珠的200 mL发酵培养基中，于30 ℃、120 r/min条件下，培养24 h，用50%硫酸铵4℃下盐析12h，在4℃于12 000 r/min离心30 min，弃去上清液，沉淀加入少量去离子水，溶解，脱盐，冷冻干燥得到粗酶；（2）根皮苷的生物转化方法：取上述一定体积的粗酶液，按照实验设计加入合适比例的一定浓度的根皮苷溶液，于实验要求温度下水浴相应时间，沸水加热5 min，以终止反应；（3）取转化液，用等体积甲醇稀释， 0.22 μm的微孔滤膜过滤；采用HPLC分析滤液中的根皮苷和3-羟基根皮苷含量，并根据他们的标准曲线回归方程计算含量；实验中，同时设立对照组，即只加转化液，不加底物；（4）分离纯化：将上述所得反应液用大孔树脂吸附，水洗去杂，然后用30-90%乙甲醇依次洗脱，收集含3-羟基根皮苷的组分；浓缩干燥得到黄色无定形粉末3-羟基根皮苷；（5）3-羟基根皮苷鉴定：化合物黄色无定形粉末，其ESI-MS质谱显示其准分子离子峰475[M+Na]+，结合NMR数据，得出其分子式为C21H24O11，推测化合物可能为查耳酮类型的黄酮类化合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：3-羟基根皮苷生成率按如下公式计算：3-羟基根皮苷生成率=
Figure 844185DEST_PATH_IMAGE001
×100%，式中：C1为转化液中3-羟基根皮苷的摩尔浓度，g/L；C为反应液原始根皮苷摩尔浓度。
3.根据权利要求1、2所述的方法，其特征在于：根据PB实验结果，选取影响3羟基根皮苷生成率较大的三个因素，正效应的取高水平，负效应的取低水平。
4.根据权利要求1、2、3所述的方法，其特征在于：最佳因素组合处于第1组与第2组之间；根皮苷消耗率和3羟基根皮苷生成率对底物根皮苷浓度和粗酶浓度呈负效应，与反应时间呈正效应；但时间延长会影响实际生产产率，室温下根皮苷的水中溶解度不大；考虑到实际操作和生产成本等问题，确定的实际取值为根皮苷浓度1.20mM~1.50mM，转化时间5h ~6.0h，粗酶浓度13.0 U*mL-1~15 U*mL-1；按此条件进行验证性实验，得到3-羟基根皮苷的摩尔转化率为92.5%±0.525% 。
5.根据权利要求1、2、3、4所述的方法，其特征在于：应用 Design Expert 8. 0 软件对试验数据进行多元回归分析，得一次多元回归方程：Y=0.72 – 0.099*X1 + 0.086 * X2 –0.075 *X3 (p=0.0109,R2=0.4926)；得二次多元回归Y=0.88-0.099X1+0.086X2-0.075X3-0.015X1X2+0.034X1X3-0.009X2X3-0.045X1 2-0.11X2 2-0.083X3 2； 3-羟基根皮苷转化率均显著；模型回归方程具有显著意义，失拟项结果不显著，说明所选用的回归方程良好；R2=0.9153，精确度10.517，标准偏差0.074，变异系数10.36。
CN202010551510.3A 2020-06-17 2020-06-17 3羟基根皮苷的制备及其工艺优化 Pending CN113801906A (zh)

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