CN105943625A - 一种从莲子渣中提取α-淀粉酶抑制剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从莲子渣中提取α‑淀粉酶抑制剂的方法，以莲子加工副产物莲子渣为制备α‑淀粉酶抑制剂的原料，将莲子渣经浸提、破碎、水解、离心、灭酶、盐析、溶解、冷冻干燥后制得成品。该工艺主要优点是使莲子加工副产物得到了有效利用，且提取过程简单、产品无毒安全、纯度高、抑制活性强，其提取得率由原来的1.45%提高到了2.36%（提取得率由提取得到的产品的干重占原料总重的百分比），用3,5‑二硝基水杨酸法测得其对淀粉酶的抑制率最高可达77.24%，是治疗糖尿病和减肥的有效成分。
Description
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，涉及一种从莲子渣中提取α-淀粉酶抑制剂的方法。
背景技术
近年来，随着人们生活水平的提高，我们从食物中获取的能量越来越多，而能量的过度摄入也常常伴随着各种疾病的发生，如糖尿病、高血压、肥胖症已经成为危害人类身体健康的三大疾病，严重影响人们的生活。糖尿病是一组以高血糖为主要特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有而引起的疾病，而且糖尿病长期存在的高血糖，会导致各种组织的慢性损害、功能性障碍，特别是对眼、肾、心脏、血管、神经等。因此，为了更好的预防和治疗糖尿病，我们迫切的需要一种能够有效的抑制或阻遏摄入食物向能量转化的物质，以达到降低餐后血糖水平的目的，其中又以抑制淀粉类碳水化合物的消化具有较大的意义，而α-淀粉酶抑制剂就是一种能够很好的抑制淀粉酶活性的物质，通过抑制淀粉的消化，达到降低血糖的目的。这对今后预防和控制糖尿病具有重要的意义。
莲子为睡莲科植物莲（Nelumbo nucifera Gaertn）的干燥成熟种子，分布于我国南北各省，具有补脾止泻，止带，益肾涩精，养心安神之功效；常用于脾虚泄泻，带下，遗精，心悸失眠。因此，莲子被加工成各种产品，而这也伴随着大量的莲子加工副产物的产生，如莲子渣。本发明从莲子渣中提取的α-淀粉酶抑制剂是一种能够特异性抑制人体唾液和肠道淀粉酶活性的糖蛋白，主要通过抑制淀粉的水解来达到降低餐后血糖水平的目的，因而在预防和控制糖尿病方面具有广泛的前景。目前，作为提取α-淀粉酶抑制剂的原料主要有白芸豆、小麦麦麸、鹰嘴豆等，而把莲子渣作为提取α-淀粉酶抑制剂原料的还未见报道；关于提取α-淀粉酶抑制剂的方法主要有热处理法和/或使用溶剂法、双水相萃取法、超声波萃取法以及超临界CO2萃取法等。
例如：CN1665521A公开了一种利用超临界CO2纯化淀粉酶抑制剂的方法，该方法主要是把经过粗研磨的豆子用超临界CO2进行提取和除杂，再用加热的去离子水对处理过的豆子进行保温提取，重复两次，最后将两次收集的提取液混合，用热交换浓缩和冷冻干燥得到产品。该法主要存在如下的缺点：一是超临界CO2萃取设备投资大，单次萃取量有限，使得生产成本增加，不利于工业化生产；二是用超临界CO2萃取设备对粗研磨的豆子进行除杂，其效率较低；三是重复用加热的去离子水提取，会降低淀粉酶抑制剂的活性。
CN 103520374 A公开了一种从茶果皮中提取α-淀粉酶抑制剂的方法，该方法主要用无水乙醇浸泡经过干燥粉碎后的茶果皮2-3小时，离心得茶果皮；再用乙醇水溶液浸泡并在300W-350W频率下超声提取3-4小时后离心，得到上清液；向上清液中依次加入丙酮、氯仿、正丁醇，最后得到正丁醇的萃余液；将正丁醇的萃余液冷冻干燥得到α-淀粉酶抑制剂。该法主要存在如下的缺点：一是用到了大量的有机溶剂，而有机溶剂会严重的污染环境，如果用于工业化生产，其有机溶剂废液处理将会是一个问题，会显著增加生产成本；二是产品中有机溶剂的残留问题，有机溶剂对人体存在严重的危害，会破坏人的神经系统，造成人体肝脏、肾脏机能损伤，因此不利于将该产品应用于治疗糖尿病或肥胖症等疾病中。
CN101575368A公开了一种从小麦麸皮中提取α-淀粉酶抑制剂的方法，该方法主要将小麦麸皮与水按料液比8：1的比例混合，搅拌2h后过滤除去残渣，将滤液于70℃水浴灭酶30min并离心取上清液；上清液用分子量为10000D的超滤膜超滤后加入硫酸铵至溶液的硫酸铵饱和度为70%，沉淀后离心得沉淀物；最后将沉淀物溶解并用分子量为10000D的透析袋透析后冷冻干燥即得α-淀粉酶抑制剂。该方法主要存在的缺点是直接将小麦麸皮用于提取，在提取过程中，由于麸皮的粒度不够细且没有经过酶水解这一步，麸皮中所含的α-淀粉酶抑制剂不能被充分的提取出来，使最后得到的α-淀粉酶抑制剂较少，降低了麸皮的利用率。
发明内容
为了解决上述α-淀粉酶抑制剂提取中所存在的问题，本发明提供了一种以莲子渣为原料、生产工艺更为简单、成本更为低廉的提取α-淀粉酶抑制剂的方法，将莲子渣经浸提、破碎、水解、离心、灭酶、盐析、溶解、冷冻干燥后制得成品，具体包括如下步骤：
（1）浸提：取莲子渣，按料液比1:4~6加入浓度为1.0wt%-3.0wt%的NaCl溶液；
（2）破碎：将浸提后的莲子渣用高速组织捣碎机破碎；
（3）水解：向破碎后的莲子渣中加入食用级纤维素酶和淀粉酶100-300ug复合水解，纤维素酶和淀粉酶的质量比为1:1，并置于35℃-45℃条件下恒温水浴震荡1h-2.5h；
（4）离心：冷却至室温后于3000-10000rpm、常温下离心20min，取上清液；
（5）灭酶：将步骤（4）得到的上清液70℃水浴灭酶15min后离心取上清液；
（6）盐析：往步骤（5）得到的上清液中加硫酸铵，使上清液中的硫酸铵浓度达60wt%-80wt%，静置2-3h，离心收集沉淀；
（7）溶解：沉淀用蒸馏水溶解；
（8）冷冻干燥：将溶液冷冻干燥，即得α-淀粉酶抑制剂产品。
所制得的α-淀粉酶抑制剂为白色粉末状，比活力为45-55U/mg。
本发明的有益效果在于：
（1）首次采用莲子加工副产物为原料，使莲子加工副产物得到了有效的利用；
（2）提取时在较温和的温度下进行，避免了高温重复提取对α-淀粉酶抑制剂造成的破坏，而有利于获得较高抑制活性的α-淀粉酶抑制剂，对淀粉酶的抑制率最高可达77.24%；
（3）用食用级纤维素酶和淀粉酶复合水解，使莲子渣的细胞壁溶解，细胞内溶物更多的释放出来，提高了α-淀粉酶抑制剂的得率；
（4）加硫酸铵进行盐析并离心收集沉淀，此过程中没有用到有机溶剂，故不存在有机溶剂残留问题，产品无毒安全；
（5）无需用到昂贵的仪器设备，生产成本较低，操作步骤简单，有利于进行大批量的工业化生产。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加的便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的解释说明，但应该理解本发明并不受这些内容所限制。
3, 5-二硝基水杨酸法
取0.5mL浓度为1mg/mL的α-淀粉酶抑制剂及等量的淀粉酶溶液（100U/mL），在37℃条件下预温15min；然后加入2%的可溶性淀粉溶液2.5mL，准确反应5min；再加入2mL DNS试剂，沸水浴中反应5min后流水冷却；最后将溶液稀释至适当的倍数，在540nm处测定吸光值，记为OD；对照管中不加入α-淀粉酶抑制剂（以同体积的蒸馏水代替），其他步骤一样，测得的吸光值记为OD′；以蒸馏水做空白管，测得的吸光值记为OD″，淀粉酶抑制率直接用上述情况下α-淀粉酶抑制剂对淀粉酶活性的抑制，其还原糖含量减少造成吸光值降低的百分率来表示，具体测定体系如表1所示。
表1 α-淀粉酶抑制率测定体系
α-淀粉酶抑制剂的抑制率可按下式计算：
考马斯亮蓝法
本发明采用考马斯亮蓝法测定所得的α-淀粉酶抑制剂中的蛋白质含量。取0.1mL待测样与5mL考马斯亮蓝在室温下混合，放置2min后在595nm处测定吸光值，通过标准曲线查得蛋白质含量。蛋白质的标准曲线按表2绘制，分别取标准蛋白液0-100μL，用蒸馏水补足到100μL后加入5mL考马斯亮蓝染液，放置2min后在595nm处测定吸光值，以浓度为横坐标，相应吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
表2 蛋白质标准曲线的绘制
实施例1：
（1）浸提：取100g莲子渣，按料液比1:4加入400ml浓度为3.0wt%的NaCl溶液；
（2）破碎：将浸提后的莲子渣用高速组织捣碎机破碎；
（3）水解：向破碎后的莲子渣中加入食用级纤维素酶和淀粉酶100ug复合水解，纤维素酶和淀粉酶的质量比为1:1，并于35℃条件下恒温水浴震荡2.5h；
（4）离心：冷却至室温后于10000rpm、常温下离心20min，取上清液；
（5）灭酶：将步骤（4）得到的上清液70℃水浴灭酶15min后离心取上清液；
（6）盐析：往步骤（5）得到的上清液中加硫酸铵，使上清液中的硫酸铵浓度达80wt%，静置2h，离心收集沉淀；
（7）溶解：沉淀用蒸馏水溶解；
（8）冷冻干燥：将溶液冷冻干燥，即得α-淀粉酶抑制剂产品。
用3, 5-二硝基水杨酸法测定按上述提取方法得到的α-淀粉酶抑制剂对淀粉酶的抑制率，用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。经过计算，α-淀粉酶抑制剂对淀粉酶的抑制率为77.24%，总蛋白含量为0.25g，比活力为53.86U/mg，总抑制活力为13074U。
实施例2：
（1）浸提：取200g莲子渣，按料液比1:6加入1200ml浓度为3.0wt%的NaCl溶液；
（2）破碎：将浸提后的莲子渣用高速组织捣碎机破碎；
（3）水解：向破碎后的莲子渣中加入食用级纤维素酶和淀粉酶300ug复合水解，纤维素酶和淀粉酶的质量比为1:1，并于40℃条件下恒温水浴震荡2h；
（4）离心：冷却至室温后于8000rpm、常温下离心20min，取上清液；
（5）灭酶：将步骤（4）得到的上清液70℃水浴灭酶15min后离心取上清液；
（6）盐析：往步骤（5）得到的上清液中加硫酸铵，使上清液中的硫酸铵浓度达70wt%，静置2.5h，离心收集沉淀；
（7）溶解：沉淀用蒸馏水溶解；
（8）冷冻干燥：将溶液冷冻干燥，即得α-淀粉酶抑制剂产品。
用3, 5-二硝基水杨酸法测定按上述提取方法得到的α-淀粉酶抑制剂对淀粉酶的抑制率，用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。经过计算，α-淀粉酶抑制剂对淀粉酶的抑制率为68.73%，总蛋白含量为0.44g，比活力为52.14U/mg，总抑制活力为22526U。
实施例3：
（1）浸提：取300g莲子渣，按料液比1：4加入1200ml浓度为2.0%的NaCl溶液；
（2）破碎：将浸提后的莲子渣用高速组织捣碎机破碎；
（3）水解：向破碎后的莲子渣中加入食用级纤维素酶和淀粉酶200ug复合水解，纤维素酶和淀粉酶的质量比为1:1，并于45℃条件下恒温水浴震荡1.5h；
（4）离心：冷却至室温后于6000rpm、常温下离心20min，取上清液；
（5）灭酶：将步骤（4）得到的上清液70℃水浴灭酶15min后离心取上清液；
（6）盐析：往步骤（5）得到的上清液中加硫酸铵，使上清液中的硫酸铵浓度达60wt%，静置3h，离心收集沉淀；
（7）溶解：沉淀用蒸馏水溶解；
（8）冷冻干燥：将溶液冷冻干燥，即得α-淀粉酶抑制剂产品。
用3, 5-二硝基水杨酸法测定按上述提取方法得到的α-淀粉酶抑制剂对淀粉酶的抑制率，用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。经过计算，α-淀粉酶抑制剂对淀粉酶的抑制率为64.52%，总蛋白含量为0.57g，比活力为50.38U/mg，总抑制活力为27741U。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (3)
1.一种从莲子渣中提取α-淀粉酶抑制剂的方法，其特征在于：以莲子加工副产物莲子渣为制备α-淀粉酶抑制剂的原料，将莲子渣经浸提、破碎、水解、离心、灭酶、盐析、溶解、冷冻干燥后制得成品。
2.根据权利要求1中所述一种从莲子渣中提取α-淀粉酶抑制剂的方法，其特征在于：具体包括如下步骤：
（1）浸提：取莲子渣，按料液比1:4~6加入浓度为1.0wt%-3.0wt%的NaCl溶液；
（2）破碎：将浸提后的莲子渣用高速组织捣碎机破碎；
（3）水解：向破碎后的莲子渣中加入食用级纤维素酶和淀粉酶100-300ug复合水解，纤维素酶和淀粉酶的质量比为1:1，并置于35℃-45℃条件下恒温水浴震荡1h-2.5h；
（4）离心：冷却至室温后于3000-10000rpm、常温下离心20min，取上清液；
（5）灭酶：将步骤（4）得到的上清液70℃水浴灭酶15min后离心取上清液；
（6）盐析：往步骤（5）得到的上清液中加硫酸铵，使上清液中的硫酸铵浓度达60wt%-80wt%，静置2-3h，离心收集沉淀；
（7）溶解：沉淀用蒸馏水溶解；
（8）冷冻干燥：将溶液冷冻干燥，即得α-淀粉酶抑制剂产品。
3.根据权利要求1和2中所述的方法，其特征在于：所制得的α-淀粉酶抑制剂为白色粉末状，比活力为45-55 U/mg。
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| 寇秀颖: "α-淀粉酶抑制剂制备方法研究进展", 《食品工业科技》 * |
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