JPH08127600A

JPH08127600A - プロテインａに対する抗体およびその製造方法

Info

Publication number: JPH08127600A
Application number: JP6264806A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Miyoshi; 洋三好; Takeshi Hachiman; 健八幡; Toru Chiba; 徹千葉; Yoshikazu Honda; 喜員本多; Makoto Seki; 誠関; Suguru Yamada; 英山田
Original assignee: Shin Etsu Chemical Co Ltd; Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Shin Etsu Chemical Co Ltd; Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1994-10-28
Filing date: 1994-10-28
Publication date: 1996-05-21

Abstract

(57)【要約】【目的】プロテインＡに対し高活性であり、簡便、大
量かつ安価に得ることのできる抗体およびその製造方法
を提供する。【構成】プロテインＡを抗原として鳥類に投与するこ
とにより、その産卵した卵中の卵黄よりプロテインＡに
対する抗体を得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】プロテインＡに対する抗体は、診
断薬や検査薬等の研究開発及び製造における、抗原抗体
反応によるアッセイ系及び抗体の精製等に際し有用な試
薬であり、本発明は、その抗プロテインＡ抗体及びその
製造方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】プロテインＡは黄色ぶどう球菌（Ｓｔａ
ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）の細胞壁成分
として産生する分子量４２０００のタンパクであり、哺
乳動物のイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）と特異的に結合
することが知られている。他の血清タンパクとの成分と
の相互作用がみられず、ＩｇＧと結合して抗原抗体反応
に類似した反応による結合物をつくることから、これを
分離洗浄して解離しＩｇＧを単離することも可能であ
り、不溶化して活性吸着剤としての利用も行なわれてい
る（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ，２０：２４１−２５３，１９７８）。

【０００３】一方、上述の不溶化したプロテインＡによ
るＩｇＧ精製の際に劣化等により溶出するプロテインＡ
の検出・確認や、プロテインＡを使用した検出系中のプ
ロテインＡの高感度検出には、抗プロテインＡ抗体の必
要性は非常に高いものであった。この抗プロテインＡ抗
体は、哺乳類においても調製は可能ではあるが、プロテ
インＡが哺乳類のＩｇＧと結合してしまうことから考え
ると、他の方法での調製が好ましい。

【０００４】ところで、鳥類のＩｇＧはプロテインＡと
結合しないことが知られている［Ｋｒｏｎｖａｌｌ，
Ｇ．，Ｓｅａｌ，Ｕ．Ｓ．，Ｓｅｖｅｎｓｓｏｎ，Ｓ．
＆Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊｒ．，Ｒ．Ｃ．：Ａｃｔａ
Ｐａｔｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｅｃ
ｔｉｏｎＢ．８２，１２−１８（１９７４）］。ま
た、古くから鳥類の血清中での抗プロテインＡ抗体の産
生が確認され、プロテインＡに対する哺乳動物のＩｇＧ
との結合の差異等についても比較研究がなされている
（ＬａｒｓｓｏｎＡｎｄｅｒｓ，Ｗｅｊａａｋｅｒ
Ｐ．Ｅｒｉｋ，ａｎｄＳｊｏｅｑｕｉｓｔＪｏｈｎ、
Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、Ｖｏｌ１１、Ｎｏ２、ｐ２３９
〜２４３、１９９２）。そして現在では、鳥類の血清中
から調製された抗プロテインＡ抗体は、市販試薬として
販売も行なわれている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上述の
ようにプロテインＡに対する抗体は、鳥類の血清からも
調製可能ではあるが、その抗体の大量調製が必要とする
場合には、免疫を行なった鳥の全採血の必要があり、免
疫を行なった鳥の殺害の必要性が生じる。また、複数を
殺害することも避けられず、結果としてプロテインＡに
対する抗体試薬は非常に高価なものになってしまってい
る。

【０００６】したがって、本発明の目的は、プロテイン
Ａに対し高活性であり、簡便、大量かつ安価に得ること
のできる抗体およびその製造方法を提供することにあ
る。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記目的達成のため、請
求項１に記載の発明は、プロテインＡに対する抗体であ
って、プロテインＡを抗原として鳥類に投与することに
より、その産卵した卵中の卵黄より得られることを特徴
とする。

【０００８】請求項２に記載の発明は、プロテインＡに
対する抗体の製造方法であって、プロテインＡを抗原と
して鳥類に投与し、その産卵した卵中の卵黄より抗体を
得ることを特徴とする。

【０００９】鳥類においては、親鳥の血中の抗体が卵中
に移行し、特に卵黄中にはＩｇＧに相当する抗体が多く
蓄積されていることが知られている。この卵黄中の抗体
は哺乳類のＩｇＧと物理化学的に若干性質が異なること
から、イムノグロブリンＹ（ＩｇＹ）と呼ばれている。

【００１０】鳥類の中でも特にニワトリにおいては、抗
体価が最大の時点で比較を行なった場合には、その卵黄
中に蓄積された特異抗体の量は、血清中の特異抗体の量
の１０倍以上であることが知られている（Ｂｒｉａｎ
Ｌ．Ｅｒｍｅｌｉｎｇ，ＥａｒｌＫ．Ｓｔｅｆｆｅ
ｎ，ＲｉｃｈａｒｄＥ．Ｆｉｓｈ，ａｎｄＲｅｕｅ
ｌＲ．Ｈｏｏｋ，Ｊｒ．、ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡ
ｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ４２、Ｎｏ
４、ｐ４０２〜４０７、１９９２）。また、ニワトリ
は、養鶏技術が確立されているので、大量かつ安価な飼
育が可能である。

【００１１】本発明者らは、プロテインＡに対して鳥類
の産卵する卵中からの抗体のプロテインＡに対する特異
抗体の産生について鋭意検討した結果、プロテインＡに
対する特異抗体の産生を確認し、更にはその精製を行な
うことに成功した。これによって、プロテインＡに対す
る高活性な抗体を簡便、大量かつ安価に得ることに成功
し、本発明を完成するに至った。

【００１２】本発明によってプロテインＡに対する抗体
を得る場合、次のような工程を経る。（１）鳥類にプロテインＡを投与（接種）する。この
際、必要に応じてプロテインＡを免疫増強剤（アジュバ
ント）と共に投与（接種）する。好ましくは、増粘剤を
併せて投与する。（２）免疫を行なった鳥の卵の卵黄中から抗体を抽出
する。この工程では、まず卵から卵黄を分離し、その卵
黄からリポタンパク質および脂質を除去する。（３）卵黄の脱リポタンパク質溶液から粗精製抗体を
得る。これは、卵黄の脱リポタンパク質溶液に対し、飽
和硫酸アンモニウム水溶液を加えて塩析沈降させるか、
あるいはポリエチレングリコール等の高分子を加えて抗
体を凝集させ、遠心分離によって回収して生理的リン酸
緩衝液（ＰＢＳ）等に溶解することで達成される。（４）実用上問題があるような交差反応がある場合に
は、粗精製抗体をさらに抗原によるアフィニティークロ
マトによって精製を行なう。

【００１３】本発明において、プロテインＡに対する特
異抗体を得るためにプロテインＡを投与（接種）する鳥
類の種類としては、産卵数が多く、継続的に産卵し、結
果的にプロテインＡに対する特異抗体の産生量が多く期
待できる種が好ましい。このような要件に該当する種と
しては、具体的にはニワトリ、ウズラ等を挙げることが
できる。

【００１４】抗原となるプロテインＡとしては、黄色ぶ
どう球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕ
ｓ）由来の他に、遺伝子組み換えによりプロテインＡ
遺伝子を、バチルス属の細菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）等に
組み込んだ組み換え体から得られるものを使用すること
もできる。

【００１５】鳥類への免疫に際しては、プロテインＡを
免疫増強剤（アジュバント）と共に接種させる。免疫増
強剤としては、フロイントの完全アジュバント［Ｆｒｅ
ｕｎｄ’ｓＣｏｍｐｌｅｔｅＡｄｊｕｖａｎｔ（Ｆ
ＣＡ）］、フロイントの不完全アジュバント（Ｆｒｅｕ
ｎｄ’ｓＩｎｃｏｍｐｌｅｔｅＡｄｊｕｖａｎ
ｔ）、水酸化アルミニウムアジュバントやＨｕｎｔｅ
ｒ’ｓＴｉｔｅｒＭａｘ（Ｖａｘｃｅｌ社製）等の
様々な免疫増強剤の使用が好適である。もっとも、本発
明で使用することのできる免疫増強剤の種類は、これら
に制限されるものではない。また、本発明において抗原
プロテインＡの体内での拡散を防ぐポリビニルピロリド
ン、ポリエチレングリコール等の増粘剤の使用も勿論可
能である。

【００１６】接種にあたっては、鳥の脚部、胸部等に皮
下注射、筋肉注射等が好ましいが、鳥の健康を損なうも
のでなければ接種の部位は特に限定されない。もっと
も、一般的には、注射の容易さ・鳥の健康に対する影響
等の理由から、胸部への皮下注射が好ましい。なお、腹
腔内投与でも良い。１回あたりの抗原の接種量は、抗体
価が上昇し、鳥の健康を損ねない範囲で具体的には０．
０１ｍｇ〜１０ｍｇ程度が望ましく、更に好ましくは
０．１ｍｇ〜５ｍｇである。上述の免疫を行なった鳥の
卵の卵黄中には、数週間以内に特異抗体が産生される。
特異抗体産生の持続には２週間程度の間隔で更に免疫を
繰り返すことが望ましい。もっとも、最終的に充分な抗
体量が確保できれば回数には制限されない。

【００１７】このようにして免疫を行なった鳥の卵の卵
黄中から抗体を抽出するには、まず卵から卵黄を分離
し、その卵黄からリポタンパク質および脂質を除去す
る。卵黄からリポタンパク質および脂質を除去する方法
としてはジエチルエーテル、クロロホルム（Ｔ．Ｔ．Ｋ
ｒａｍｅｒａｎｄＨ．Ｇ．Ｃｈｏ，Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ，１９，１５７，１９７０：Ｒ．Ｅ．Ｆａｉｔｈ
ａｎｄＬ．Ｗ．Ｃｌｅｍ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，
２５，１５１，１９７３）等の有機溶剤処理によって抽
出する方法やラムダ−カラギナン（特開昭６４−３８０
９８号公報）等の天然多糖類の処理によって抽出する方
法等が好適である。もっとも、結果的に卵黄中のリポタ
ンパク質および脂質が除去できれば、これらの方法に限
定されるものではない。ごく一般的な超遠心分離（Ｍｃ
Ｂｅｅ，Ｌ．Ｆ．＆Ｃｏｔｔｅｒｉｌｌ，Ｏ．Ｊ．：
Ｊ．ＦｏｏｄＳｃｉ．４４，６５６〜６６０、１９７
９）などの方法で行うことも可能である。。

【００１８】上記のうち、有機溶剤処理によって抽出す
る方法は、例えば以下のような手順に従う。卵黄に生理
的緩衝液を加えて混合後、クロロホルムを加えて卵黄リ
ポタンパクを有機層へ抽出除去する。次いで遠心分離に
かけ、上澄み液を抗体抽出液として利用する。

【００１９】また、天然多糖類の処理によって抽出する
方法は、以下のような手順に従う。（１）卵黄液に、寒天、カラギーナン、ペクチン、キ
サンタンガム等の天然多糖類のうち一種以上を加えて、
卵黄リポタンパク質を沈澱させる。（２）次いで、遠心分離、加圧濾過、デカンテーショ
ン等によって沈澱した卵黄リポタンパク質を分離除去す
る。

【００２０】得られた卵黄の脱リポタンパク質溶液に対
して３０〜６０％（ｖ／ｖ）、更に好ましくは４０〜５
０％（ｖ／ｖ）となるように飽和硫酸アンモニウム水溶
液を加えて塩析沈降させるか、あるいはポリエチレング
リコール等の高分子を加えて凝集させ、遠心分離によっ
て回収して生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳ）等に溶解する
ことで粗精製抗体が得られる。

【００２１】粗精製抗体からの当該プロテインＡに対す
る特異抗体の精製は、粗精製抗体中に実用上の問題があ
るような交差反応が認められない場合にはその必要性を
生じない。しかし、交差反応が認められる場合には、現
在一般的に文献等（例えば、西岡久壽彌、島田孝吉、真
崎知生編、役に立つ免疫実験法、ｐ３４〜３７、１９９
１）に記載されている抗原によるアフィニティー精製を
行なうことによって容易に行なうことができる。この抗
原アフィニティー精製用のプロテインＡ固定化カラムに
ついては市販品が数多く市販されており、これらを利用
することができる。

【００２２】アフィニティー精製を行なう場合には、ま
ず上述の粗精製抗体を透析、脱塩装置、ゲル濾過等によ
ってＰＢＳに対する平衡化を行なう。その平衡化を行な
った粗精製抗体液をあらかじめＰＢＳに対して平衡化を
行なった、例えば官能基としてジエチルアミノエチル
（ＤＥＡＥ）基などを持った陰イオン交換樹脂のカラム
に通して、負電荷のタンパク質を吸着させて除去する。
その陰イオン交換樹脂のカラムの非吸着分画を回収し適
当に限外濾過等によって濃縮する。次に、群特異アフィ
ニティーゲルであるＡｖｉｄＡＬ（ＵｎｉＳｙｎＴ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）のカラムに通して、粗精
製液中の活性分画である全イムノグロブリン分画を吸着
させ、適当な容量のイオン交換水や１０〜４０％（ｖ／
ｖ）程度のメタノールで洗浄した後、ｐＨ４．５以下の
酢酸ナトリウム緩衝液や中性域でのチオシアン化カリウ
ム溶液で溶出し、全イムノグロブリン分画を回収する。
その全イムノグロブリン分画を飽和硫酸アンモニウム水
溶液による塩析や透析、脱塩装置、ゲル濾過等を組み合
わせて最終的にＰＢＳに対して平衡化を行なう。

【００２３】さらにプロテインＡ固定化カラムによるア
フィニティー精製は、上述のように全イムノグロブリン
分画の状態としてから行なう方が好ましいが、それらの
操作を省略して、粗精製液をそのままプロテインＡ固定
化カラムによるアフィニティー精製に用いてもよい。

【００２４】精製度としては、診断薬や検査薬等の研究
開発における、抗原抗体反応によるアッセイ系及び抗体
の精製に際し、交差反応等の実用上の問題の生じない精
製度であれば上述のどの段階でもよい。上述の一連の抗
体精製操作は、抗体の活性を損なわないためにも出来る
限り4℃前後の低温で行うことが望ましい。

【００２５】本発明によって得られるプロテインＡに対
する抗体は、以下のような性質を有する。（１）抗体の種類：ＩｇＧ（ＩｇＹ）（２）分子量：約１５０ｋＤａ（キロダルトン）（３）得られた抗体は、プロテインＡと結合する。

【００２６】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に
説明するが、これらにより本発明を制限するものではな
い。実施例（１）投与抗原抗原として使用したプロテインＡは、Ｚｙｍｅｄ社製の
ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓＣｏｗ
ａｎ１株のプロテインＡ遺伝子を組み込んだＢａｃｉｌ
ｌｕｓの組換え体からのプロテインＡを購入して使用し
た。

【００２７】（２）プロテインＡのニワトリへの投与プロテインＡを０．０１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．２）で
２ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解、希釈し、これに等量のＦＣ
Ａを加えて乳化させ、投与用の抗原液とした。この抗原
液をそれぞれニワトリの胸部皮下中に注射した。この操
作を２週間間隔で４回行なった。

【００２８】（３）抗体の精製抗原液を投与した後に産卵した卵を採取し、精製に供し
た。卵から卵黄を分離し、それと等容量の０．０１Ｍの
ＰＢＳ（ｐＨ７．２）を加えて混合した。さらにその混
合液に３倍容量のクロロホルムを加えて混合後、１時間
静置した。１００００ｒｐｍで１５分間遠心後、水溶性
画分を集め、それに対して４５％（ｖ／ｖ）となるよう
に飽和硫酸アンモニウム水溶液（ｐＨ７．２）を加えて
タンパク質成分を塩析沈降させた。沈降物を遠心分離に
より回収し、ＰＢＳに溶解して粗精製抗体を得た。これ
を抗体価の測定に供した。

【００２９】（４）抗体価の測定（３）で調製した粗精製抗体をＰＢＳで希釈して１０μ
ｇ／ｍｌの濃度にし、ポリスチレン製９６穴マイクロプ
レートの各ウェルに１００μｌずつ分注した。３７℃で
１時間静置して粗精製抗体をマイクロプレートに固定し
た。ＰＢＳで洗浄後、非特異的吸着反応を抑制するため
に、市販のブロッキング剤（ブロックエース；雪印乳業
製）で被覆した。０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０の
入ったＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で洗浄後、市販の西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識プロテインＡ（Ｚｙｍ
ｅｄ社製）をブロッキング剤の希釈液で５０００倍に希
釈して１００μｌずつ分注し、３７℃で静置して２時間
反応した。ＰＢＳＴで洗浄後、発色剤として３，３’，
５，５’−テトラメチルベンジジン・ジヒドロクロライ
ド（ＴＭＢＺ・ＨＣｌ）溶液を１００μｌずつ分注し、
３７℃で２０分間反応した後、１Ｎ硫酸を２００μｌず
つ分注して反応を停止させた。呈色液をマイクロプレー
トリーダーを用いて４５０ｎｍの吸光度を測定すること
によりＨＲＰの活性を測定した。この方法で初回免疫か
らの抗体価の経時的推移を調べた結果を図１に示す。

【００３０】（５）抗体の大量調製プロテインＡに対する抗体活性を有すると判断できた、
図中に示した期間の鶏１羽の産生卵合計１６個（１０５
８ｇ）より、（３）の方法に準じて抗プロテインＡ抗体
の精製を行ない、最終的に塩析による沈殿物を３２ｍｌ
のＰＢＳに溶解した。牛血漿γ−グロブリンを標準物質
としたローリー法によるタンパク定量で測定した結果、
粗精製した抗体液の濃度は４７．６ｍｇ／ｍｌであり、
１５２３．２ｍｇの抗プロテインＡ抗体を得た。

【００３１】（６）非還元抗体の電気泳動（５）で得られた抗体１０μｇを、１２％ポリアクリル
アミドゲルを用いてページバッファー［０．１％ドデシ
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ），１９２ｍＭグリシン，２
５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液
（ｐＨ８．４）］で電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行
った。ゲルを染色液（０．０２５％クーマシーブリリア
ントブルー，５０％メタノール，７％酢酸／水）中で一
晩浸して染色後、脱色液（３０％メタノール，１０％酢
酸／水）中に浸して脱染色を行った。その結果を図２に
示す。１５０ｋＤａ付近に抗プロテインＡ抗体を示すバ
ンドが認められた。

【００３２】（７）還元抗体の電気泳動（５）で得られた抗体溶液に、等量の２％ＳＤＳ，５％
２―メルカプトエタノール，１０％グリセリン，０．０
０５％ブロモフェノールブルー，５０ｍＭトリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ６．８）を加
え、１００℃で５分間加熱して還元を行った。以下
（６）と同様にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。７０ｋ
Ｄａ付近にＨ鎖、２８ｋＤａ付近にＬ鎖を示すバンドが
認められた。

【００３３】

【発明の効果】本発明において得られる卵黄中より得ら
れたプロテインＡに対する抗体は、非常に高力価でかつ
特異的にプロテインＡと作用する。したがって、本発明
によって得られた抗体は、診断薬や検査薬等の研究開発
における抗原抗体反応によるアッセイ系及び抗体の精製
に際し有用である。また、継続的に産卵する鳥類の卵中
の卵黄から抗体を得るため、大量かつ安価な特異抗体の
製造が可能である。以上のように、本発明によれば、生
化学的な研究、開発等に関して非常に有用なプロテイン
Ａに対する抗体を、簡便、大量かつ安価に提供すること
ができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】免疫を行なった際の抗体活性の経時的変化を示
したグラフである。

【図２】本発明で得られた抗体について、非還元サンプ
ルのＳＤＳ−ＰＡＧＥの図である。

【図３】本発明で得られた抗体について、還元サンプル
のＳＤＳ−ＰＡＧＥの図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者八幡健神奈川県川崎市高津区坂戸３丁目２番１号信越化学工業株式会社コーポレートリサーチセンター内 (72)発明者千葉徹神奈川県川崎市高津区坂戸３丁目２番１号信越化学工業株式会社コーポレートリサーチセンター内 (72)発明者本多喜員神奈川県横浜市緑区鴨志田町1000番地三菱化学株式会社横浜総合研究所内 (72)発明者関誠神奈川県横浜市緑区鴨志田町1000番地三菱化学株式会社横浜総合研究所内 (72)発明者山田英神奈川県横浜市緑区鴨志田町1000番地三菱化学株式会社横浜総合研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】プロテインＡを抗原として鳥類に投与す
ることにより、その産卵した卵中の卵黄より得られる該
プロテインＡに対する抗体。
【請求項２】プロテインＡを抗原として鳥類に投与
し、その産卵した卵中の卵黄より抗体を得る該プロテイ
ンＡに対する抗体の製造方法。