DE202018101225U1

DE202018101225U1 - Hepatoprotektive Zusammensetzung

Info

Publication number: DE202018101225U1
Application number: DE202018101225.8U
Authority: DE
Original assignee: MARIA VON MED BIOTECHNOLOGY CO Ltd; MARIA VON MED-BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: MARIA VON MED BIOTECHNOLOGY CO Ltd; MARIA VON MED-BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2018-03-05
Filing date: 2018-03-05
Publication date: 2018-05-15
Anticipated expiration: 2028-03-06

Abstract

Eine hepatoprotektive Zusammensetzung, umfassend eine von einem Säugetier stammende Vollblutsammlung mit einer therapeutisch wirksamen Menge und pharmakologisch oder ernährungsphysiologisch akzeptablen Hilfsstoffen.

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, durch die die Leber vor einer alkoholbedingten Lebererkrankung geschützt wird, und deren Anwendungen für Medikamente und gesundheitsfördernde Nahrungsmittelprodukte.
Stand der Technik
Das Konsumieren von Alkohol ist eine uralte Aktivität, die sich mit dem Fortschritt der menschlichen Zivilisation immer weiterentwickelt hat. Mäßiger Alkoholkonsum hilft, emotionale Barrieren abzubauen und ferner im sozialen Miteinander zwischenmenschliche Kommunikation, Zuneigung und Freundschaft zu fördern. Ethanol ist der wichtigste chemische Bestandteil aller Arten von alkoholischen Getränken. Die richtige Menge an Ethanol ist nicht toxisch für Menschen. Die Geschwindigkeit des Ethanolstoffwechsels im menschlichen Körper ist jedoch begrenzt. Bei oral aufgenommenem Alkohol wird nur ein kleiner Teil über die Lungenatmung oder über die Schweißdrüsen ausgeschieden und der größte Teil wird vom Körper über das Jejunalsegment (Jejunum) des Dünndarms absorbiert. Nach dem Absorbieren gelangen etwa 90 % des Alkohols in die Leber für den Stoffwechsel. Alkohol wird in der Leber durch drei Enzymsysteme, nämlich das Alkoholdehydrogenase-System, das mikrosomale Ethanoloxidationssystem und das Katalasesystem, zu Acetaldehyd oxidiert. Das entstandene Acetaldehyd wird durch die Wirkung der Aldehyd-Dehydrogenase (aldehyde dehydrogenase, ALDH) in Essigsäure umgewandelt. Anschließend tritt Essigsäure als Acetyl-Coenzym A in den Tricarbonsäurezyklus ein und es wird Wärme erzeugt.
Alkoholkonsum über einen längeren Zeitraum oder übermäßiger Alkoholkonsum können jedoch leicht zu einer alkoholbedingten Lebererkrankung (alcoholic liver disease, ALD) führen. Am Anfang erscheinen die Symptome der Steatose und der alkoholbedingten Fettleber und anschließend entwickelt sich eine alkoholbedingte Hepatitis (alkoholtoxische Hepatitis) und eine Leberfibrose und es kann schließlich sogar zu einer Zirrhose kommen. Die wichtigsten klinischen Merkmale einer alkoholbedingten Lebererkrankung sind Übelkeit, Erbrechen, Gelbsucht sowie Vergrößerung und Empfindlichkeit der Leber. Ferner kann sie auch gleichzeitig Leberversagen und Blutungen im oberen Gastrointestinaltrakt verursachen. Der pathologische Mechanismus der alkoholbedingten Lebererkrankung ist sehr komplex. Allgemein wird angenommen, dass die Hauptursache für eine alkoholbedingte Lebererkrankung als das Ergebnis des Zusammenspiels vieler Faktoren, wie direkte oder indirekte Induktion von oxidativem Stress, Entzündungen und Ernährungsstörungen im Stoffwechselprozess von Ethanol und seiner Derivate, zu betrachten ist. Acetaldehyd, das während des Stoffwechsels aus Alkohol entsteht, kann den strukturellen Funktionen verschiedener Organellen und Enzyme in den Leberzellen schaden und eine unmittelbare Schädigung der Leber hervorrufen. Ferner kann sich Acetaldehyd im Körper mit verschiedenen Proteinen zur Bildung von Acetaldehydaddukten mit hoher Immunogenität verbinden, was das menschliche Immunsystem reizen und eine immunreaktive Leberschädigung induzieren kann. Acetaldehyd kann auch die β-Oxidation von mitochondrialen Fettsäuren beeinträchtigen, Lipidperoxidationsreaktionen hervorrufen, die Biosynthese von Glutathion (GSH) hemmen und die antioxidativen Funktionen von Peroxidasen reduzieren. Wenn eine große Menge an Alkohol in kurzer Zeit eingenommen wird, entsteht eine zu hohe Alkoholkonzentration im Blut und es wird zum Alkoholabbau das mikrosomale Ethanol-oxidierende System aktiviert. Bei diesem Prozess entsteht eine große Menge an reaktiven Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS), die die Leberzellen angreifen. Reaktive Sauerstoffspezies können über verschiedene Wege der Leber schaden. Die mitochondriale DNA-Depletion und Lipidperoxidation führt zu Apoptose und Nekrose von Hepatozyten und es kommt zu einem Abbau von reduziertem Glutathion (GSH), wodurch sich die Schutzfunktion der Leber vor Peroxidation verringert. Darüber hinaus erhöht sich bei der Metabolisierung des Acetaldehyds in Essigsäure das NADH/NAD⁺-Verhältnis in den Hepatozyten, sodass die Oxidationsfähigkeit der Hepatozyten für Fettsäuren abnimmt und somit die Aktivität des Tricarbonsäurezyklus abnimmt, was zu einer Ansammlung von Fett in der Leber und schließlich zu einer Fettleber führt. Durch die Erhöhung der Anzahl der Mitochondrien wird zudem zu viel Sauerstoff verbraucht. Aufgrund des Sauerstoffmangels kann es dazu kommen, dass die Leberzellen anfällig für Nekrose und Fibrose sind.
In China ist in den letzten Jahren der Anteil von Patienten mit einer alkoholbedingten Lebererkrankung, bei denen im gleichen Zeitraum eine Lebererkrankung behandelt wurde, immer weiter gestiegen, genauer gesagt von 4,2 % im Jahr 1991 auf 21,3 % im Jahr 1996. Im Zusammenhang mit der Ätiologie lässt sich sagen, dass unter den Leberzirrhosen der Anteil der alkoholbedingten Leberzirrhose von 10,8 % im Jahr 1999 auf 24,0 % im Jahr 2003 gestiegen ist.
Daher besteht in der Industrie ein dringender Bedarf an Zusammensetzungen und medizinischen Anwendungen, die die Fähigkeit besitzen, der Leber Schutz vor einer alkoholbedingten Lebererkrankung zu bieten.
Aufgabe der Erfindung
Der Erfinder der vorliegenden Erfindung hat überraschenderweise festgestellt, dass Verbesserungen hinsichtlich einer alkoholbedingten Lebererkrankung durch eine von Säugetieren, insbesondere von echten Schweinen (Suidae) - beispielsweise von Hausschweinen (Sus scrofa domestica) -, stammende Vollblutsammlung erreicht werden können. Zur Beurteilung der Wirkung der Vollblutsammlung auf eine alkoholbedingte Lebererkrankung wurde vom Erfinder der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf das von Lieber et al. vorgeschlagene Standardverfahren (de la, M. H. P., Lieber, C. S., DeCarli, L. M., French, S. W., Lindros, K. O., Jarvelainen, H., Bode, C., Parlesak, A., and Bode, J. C. (2001). Models of alcoholic liver disease in rodents: a critical evaluation. Alcohol Clin. Exp. Res. 25, 254S-261S) ein Mausmodell entwickelt, in dem eine alkoholbedingte Lebererkrankung durch chronische Fütterung mit Alkohol versetztem Futter induziert wird. Für die Erfindung wurden im Tiermodell die Leberzustände durch biochemische Indikatoren der Leberfunktion, die antioxidative Enzymaktivität und die Histopathologie untersucht, wodurch sich bewahrheitet hat, dass die oben beschriebene Vollblutsammlung bei der Behandlung einer alkoholbedingten Lebererkrankung wirksam ist. Somit kann diese als ergänzendes oder alternatives Medikament zur Behandlung einer alkoholbedingten Lebererkrankung eingesetzt werden.
Lösung der Aufgabe
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine hepatoprotektive Zusammensetzung bereitgestellt, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass die Zusammensetzung eine von einem Säugetier stammende Vollblutsammlung mit einer therapeutisch wirksamen Menge und pharmakologisch oder ernährungsphysiologisch akzeptablen Hilfsstoffen umfasst.
Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die zur Herstellung eines pharmazeutischen Produkts zur Prävention oder Behandlung von alkoholbedingten Lebererkrankungen bei einem Individuum verwendet wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung eine von einem Säugetier stammende Vollblutsammlung mit einer therapeutisch wirksamen Menge und pharmakologisch oder ernährungsphysiologisch akzeptablen Hilfsstoffen umfasst.
Um ein vollständiges Verständnis der Aufgaben, der Merkmale und der vorteilhaften Effekte der vorliegenden Erfindung zu ermöglichen, werden im Folgenden bevorzugte Ausführungsbeispiele unter Bezugnahme auf die anliegenden Zeichnungen detailliert beschrieben.
Nachfolgend wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die Figuren in schematischer Darstellung näher im Detail beschrieben.
Figurenliste

1 zeigt histopathologische Bilder, die gefärbte Gewebeschnitte von aus Maustiermodellen erhaltenen Lebergeweben zeigen.

Detaillierte Beschreibung bevorzugter Ausführungsbeispiele
In der vorliegenden Erfindung ist unter „Vollblutsammlung (whole blood collection)“ aus dem Tierkörper gesammeltes und keinem wesentlichen Trennverfahren unterzogenes Blut zu verstehen. Die Vollblutsammlung umfasst Plasma, mit Plasma beladene Blutzellen und im Plasma gelöste oder suspendierte Substanzen wie Zuckermoleküle, Proteinmoleküle, Mineralien und Hormone. In der vorliegenden Erfindung umfasst die „Vollblutsammlung“ frisch gesammeltes Frischblut, seine Abbauprodukte oder Derivate und Vollblutproben, die mit einem geeigneten Puffer verdünnt und zur Entfernung von Feuchtigkeit in geeigneter Weise konzentriert und/oder mit Zusatzstoffen wie Antikoagulation (z. B. Heparin, EDTA (Ethylendiamintetraacetat), ACD-A (Acid-Citrat-Dextrose in der A-Formulierung)), Proteaseinhibitor, Bakteriziden und Konservierungsmitteln versetzt werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Vollblutsammlung weiteren Verarbeitungsschritten wie Erhitzen, Filtrieren oder Chromatographie unterzogen werden, um unerwünschte Bestandteile zu entfernen oder zu deaktivieren, während im Wesentlichen die Hauptbestandteile der Vollblutsammlung erhalten werden. Diese unerwünschten Bestandteile umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, toxische Chemikalien, Allergene und Pathogene. In einem bevorzugten konkreten Ausführungsbeispiel wird das gesammelte Blut ferner einem herkömmlichen Gefriertrocknungsverfahren unterzogen, sodass die Vollblutsammlung die Form eines lyophilisierten Pulvers annimmt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die „Vollblutsammlung“ von Säugetieren gesammelt, vorzugsweise stammt sie von nicht-menschlichen Säugetieren, die, ohne darauf beschränkt zu sein, Pferde, Rinder, Schweine, Ziegen, Hunde, Katzen, Mäuse, Ratten, Meerschweinchen, Rennmäuse, Hamster, Kaninchen, Schimpansen und Rhesusaffen umfasst. In einem bevorzugten konkreten Ausführungsbeispiel stammt die „Vollblutsammlung“ von Schweinen. Schweine sind in ihrer Struktur und ihren körperlichen Funktionen dem Menschen hinsichtlich Physiologie, Biochemie, Anatomie, Stoffwechsel, Knochenentwicklung, Herz-Kreislauf-System, Immunsystem und Verdauungssystem ähnlich. Daher gilt bisher das Schwein in der medizinischen Forschung und bei der humanen Xenotransplantation als bester Spender. Wie nachfolgend beschrieben wird, ist in der vorliegenden Erfindung mit „Schwein“ jedes Tier gemeint, das zu den echten Schweinen (Suidae) gehört, und, ohne darauf beschränkt zu sein, Wildschweine (wild boar; Sus scrofa), Hausschweine (Sus scrofa domestica), Mini-Schweine (mini swine; Sus Scrofa domestica var.mino guizhounensis Yu.), Warzenschweine (Phacochoerus africanus) und Nabelschweine (peccary; Pecari tajacu) umfasst. In einem bevorzugteren konkreten Ausführungsbeispiel sind die „Schweine“ von Tieren der Schweinegattung (Sus sp.) ausgewählt. Besonders bevorzugt ist hier das Hausschwein (Sus scrofa domestica) ausgewählt, wobei dieses, ohne darauf beschränkt zu sein, Hausschweinrassen wie Landrassenschweine, Yorkshire-Schweine, Duroc-Schweine, Hampshire-Schweine, Berkshire-Schweine und Hausschweine, die von diesen Hausschweinen abstammen, wie z. B. die in großem Maßstab in Taiwan gezüchteten LYD-Schweine, die zum Hausschwein gehören und eine Kreuzung aus den drei Rassen Landrassenschwein, Yorkshire-Schwein und Duroc-Schwein sind, umfasst. Die zur Vollblutsammlung verwendeten Sammelverfahren umfassen alle Verfahren zur Gewinnung von Vollblut aus Säugetieren, bei denen die Bestandteile des Vollbluts nicht zerstört werden.
Beispielsweise umfasst beim Hausschwein das häufig verwendete und zur Blutentnahme mit geringer Menge dienende Blutentnahmeverfahren, ohne darauf beschränkt zu sein, die Blutentnahme aus der Ohrvene beim Schwein und die Blutentnahme aus der vorderen Hohlvene beim Schwein. Die Vollblutsammlung in großer Menge kann auch durch Tiertötung erhalten werden.
In der Beschreibung sind unter der Bezeichnung „alkoholbedingte Lebererkrankung“, auch alkoholtoxische Lebererkrankungen genannt, eine Reihe von durch kontinuierliche Einnahme von alkoholhaltigen Getränken oder Lebensmitteln verursachte Leberschäden zu verstehen. Diese Schäden können eine oder mehrere Leberschäden aus der Gruppe von Leberschäden sein, die alkoholbedingte Steatose (alcoholic steatosis), alkoholbedingte Fettleber, alkoholbedingte Steatohepatitis (alcoholic steatohepatitis), Leberzellballonierung (hepatocellular ballooning), alkoholbedingte Leberfibrose (alcoholic hepatic fibrosis) und alkoholbedingte Leberzirrhose (alcoholic hepatic cirrhosis) umfasst. Alkoholbedingte Lebererkrankungen können normalerweise von Fachärzten, Tierärzten oder klinischem Personal diagnostiziert werden. In einem bevorzugteren Ausführungsbeispiel handelt es sich bei der „alkoholbedingten Lebererkrankung“ um eine alkoholbedingte Steatose und/oder eine alkoholbedingte Fettleber.
Wie nachfolgend näher beschrieben wird, wird in der Erfindung eine alkoholbedingte Lebererkrankung mittels des von Lieber-DeCarli vorgeschlagenen herkömmlichen Mausmodells simuliert. Bei diesem herkömmlichen Tiermodell wird über einen längeren Zeitraum alkoholhaltige Flüssignahrung an die Versuchstiere verfüttert. Entsprechend der Gesamtenergie, die das Tier benötigt, wird eine Berechnung angestellt, die dafür sorgt, dass 36 % der Kohlenhydrate im Futter durch Alkohol ersetzt werden, um durch eine langfristige Alkoholaufnahme einen alkoholbedingten Leberschaden zu induzieren. Im Vergleich zum akuten Alkoholkonsum weist dieses experimentelle Tiermodell für die chronische Alkoholaufnahme zum menschlichen Alkoholkonsumverhalten eine besonders große Ähnlichkeit auf und insbesondere ist es das vorherrschende Fettleber-induzierte Tiermodell, das heutzutage verwendet wird.
Wie die nachfolgenden Beispiele zeigen, wurde beim Tiermodell erfolgreich eine alkoholbedingte Fettleber induziert. Eine Fettleber stellt eine abnorme Ansammlung von Triglyceridöl in den Leberzellen dar, was ein frühes pathologisches Zeichen für eine alkoholbedingte Lebererkrankung ist. Die alkoholhaltige Flüssignahrung wird auch als Folge von Störungen des Fettstoffwechsels im Körper angesehen. Wie im Beispiel 5 gezeigt ist, führt das Füttern von Mäusen mit alkoholhaltiger Flüssignahrung zur Erhöhungen der Aspartat-Aminotransferase (AST)-Werte und Alanin-Aminotransferase (ALT)-Werte im Serum, an denen die Schädigung der Leberfunktion zu erkennen ist. Ferner zeigt das Beispiel 7, dass die mit Alkohol durchgeführte Behandlung auch eine fettige Infiltration der Leber und histopathologische Veränderungen verursachen kann. Durch die Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung können hinsichtlich der Leberfunktionsparameter, der pathologischen Veränderungen von Lebergewebe und der Hepatomegalie erhebliche Verbesserungen erzielt werden. Dieses Ergebnis zeigt, dass die erfindungsgemäße Zusammensetzung bei alkoholbedingten Leberschäden eine Verbesserungsfunktion hat.
Langzeitkonsum von Alkohol kann zu einem Ungleichgewicht des Fettstoffwechsels im Körper führen, einschließlich einer verringerten Lipidoxidation und einer erhöhten Triglyceridsynthese, was wiederum zu erhöhtem Blutfett und einer Fettleber führt. Wie im Beispiel 4 gezeigt ist, führt das Füttern von Mäusen mit alkoholhaltiger Flüssignahrung zu einer signifikanten Erhöhung des Triglyceridgehalts (TG-Gehalt) der Leber. Durch die Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung, sowohl in niedriger als auch in mittlerer und hoher Dosierung, kann der TG-Gehalt der Leber signifikant reduziert werden. Durch die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann der Zustand der TG-Akkumulation der Leber wirksam verbessert werden. Dieses Ergebnis zeigt, dass die erfindungsgemäße Zusammensetzung bei einer alkoholbedingten Leberschädigung zu einer Verbesserung führt.
Im durch die Leber bewirkten Stoffwechselprozess von Alkohol entsteht eine große Menge an freien Radikalen, was wiederum oxidativen Stress erzeugt. Oxidativer Stress kann das antioxidative Abwehrsystem des Körpers stören, was zu einem Ungleichgewicht zwischen freien Radikalen und antioxidativer Kraft und zur Entstehung einer großen Menge an Lipidperoxiden und schließlich einer alkoholbedingten Lebererkrankung führt. Wie im Beispiel 6 gezeigt ist, führt das Füttern von Mäusen mit alkoholhaltiger Flüssignahrung zu einer signifikanten Reduzierung des Gesamtgehalts an Glutathion (GSH) in der Leber und zu einer signifikanten Erhöhung der Katalaseaktivität (CAT). Die signifikante Erhöhung der Katalaseaktivität kann eine kompensatorische Reaktion sein. Da beim Alkoholmetabolismus eine große Menge an Wasserstoffperoxid entsteht, ist es notwendig, dieses durch CAT-Enzyme zu entfernen. GSH ist ein wichtiges Antioxidans in der Zelle. Eine Abnahme des Gesamtbetrags von GSH bedeutet, dass Alkohol tatsächlich zu erhöhtem oxidativen Stress in den Leberzellen führt. Insgesamt verursacht langfristiger Alkoholkonsum bei Mäusen eine Störung des antioxidativen Abwehrsystems, was zu erhöhtem oxidativen Stress und nachfolgender Leberschädigung führt. Durch die Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung kann eine Verlangsamung der Ausbildung von oxidativem Stress bewirkt werden, um die Leber vor oxidativen Schäden zu schützen.
Dementsprechend richtet sich ein Aspekt der Erfindung auf eine hepatoprotektive Zusammensetzung, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass die Zusammensetzung eine von einem Säugetier stammende Vollblutsammlung mit einer therapeutisch wirksamen Menge und pharmakologisch oder ernährungsphysiologisch akzeptablen Hilfsstoffen umfasst. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung der Zusammensetzung zur Herstellung eines pharmazeutischen Produkts zur Prävention oder Behandlung von alkoholbedingten Lebererkrankungen bei einem Individuum.
In der vorliegenden Erfindung bedeutet die Bezeichnung „hepatoprotektiv“, dass durch die Zusammensetzung das Überleben und die Vitalität der Leberzellen gesichert oder aufrechterhalten oder die Leberfunktion aufrechterhalten oder wiederherstellt werden können oder bei durch langfristige Alkoholaufnahme verursachten Leberschäden eine Linderung oder eine Besserung erzielt werden kann. Die Bezeichnung „hepatoprotektiv“ beinhaltet die Prävention von alkoholbedingten Lebererkrankungen und/oder die Behandlung von bei einem Individuum aufgetretenen alkoholbedingten Lebererkrankungen. Dementsprechend umfasst die Bezeichnung „Prävention“ eine Verringerung der Schwere/des Ausmaßes einer alkoholbedingten Lebererkrankung oder eine Verringerung des Auftretens einer alkoholbedingten Lebererkrankung. Die Bezeichnung „Behandlung“ umfasst die Linderung nach dem Auftreten mindestens eines klinischen Symptoms einer alkoholbedingten Lebererkrankung. Die Bezeichnung „hepatoprotektiv“ sollte jedoch nicht in dem Sinne verstanden werden, dass damit stets ein 100 %iger Schutz vor einer alkoholbedingten Lebererkrankung gewährleistet wird, sondern dahingehend verstanden werden, dass die Fähigkeit gegeben ist, zumindest ein klinisches Symptom, das bei einer alkoholbedingten Lebererkrankung eines Individuums aufgetreten ist oder auftreten kann, signifikant zu reduzieren oder zu eliminieren.
Die vorerwähnte Vollblutsammlung kann mit pharmakologisch oder ernährungsphysiologisch akzeptablen Hilfsstoffen zur Herstellung der erfindungsgemäßen hepatoprotektiven Zusammensetzung formuliert werden. Unter einem „pharmakologisch oder ernährungsphysiologisch akzeptablen Hilfsstoff“ ist eine inerte Substanz zu verstehen, die als Träger für die Vollblutsammlung verwendet wird, welche für das verabreichte Individuum nicht toxisch, reizend, pyrogen, antigen und hämolytisch ist und keine wesentliche pharmakologische Aktivität besitzt und die vorteilhaften Wirkungen der Vollblutsammlung nicht behindert. Diese Hilfsstoffe umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Lösungsmittel, Tenside, Sprengmittel, Bindemittel, Verdünnungsmittel, Gleitmittel, Stabilisatoren, Antioxidantien, Geschmacksstoffe, Süßstoffe, Farbstoffe, Absorptionsförderer, Weichmacher, pH-Einstellmittel, osmotische Mittel, Verdickungsmittel usw. Sämtliche in der Erfindung verwendete „pharmakologisch oder ernährungsphysiologisch akzeptablen Hilfsstoffe“ sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt (siehe Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed. (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975; Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; und Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 1999)).
Die hier offenbarte hepatoprotektive Zusammensetzung kann einem Individuum über jeden geeigneten Weg verabreicht werden, um zu ermöglichen, dass die hepatoprotektive Zusammensetzung mit den Zielzellen oder dem Zielgewebe in Kontakt gebracht werden kann. Die Verabreichung umfasst, ohne darauf beschränkt zu sein, eine lokale Verabreichung, eine gastrointestinale Verabreichung oder eine parenterale Verabreichung, wie z. B. eine orale Verabreichung, intravenöse Verabreichung, subkutane Verabreichung, intratumorale Verabreichung, intramuskuläre Verabreichung, intraperitoneale Verabreichung, transdermale Verabreichung, intraspinale Verabreichung oder intrazerebrale Verabreichung. Die Verabreichung kann schnell erfolgen, beispielsweise durch Injektion. Die Verabreichung kann auch eine gewisse Zeit dauern, beispielsweise durch langsame Infusion oder Verabreichung einer Formulierung mit verzögerter Freisetzung. In der Erfindung umfasst die Bezeichnung „Individuum“ Menschen und nicht-menschliche Säugetiere. Nicht-menschliche Säugetiere umfassen Nutztiere, Haustiere, Labortiere und nicht-menschliche Primaten. Zu den nicht-menschlichen Individuen gehören auch, ohne darauf beschränkt zu sein, Pferde, Rinder, Schweine, Ziegen, Hunde, Katzen, Mäuse, Ratten, Meerschweinchen, Rennmäuse, Hamster, Kaninchen, Schimpansen und Rhesusaffen. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel sind die Individuen Menschen, insbesondere humane Patienten, die an einer alkoholbedingten Lebererkrankung leiden oder bei denen die Gefahr besteht, eine alkoholbedingte Lebererkrankung zu entwickeln, wie beispielsweise Patienten mit einer alkoholbedingten Fettleber.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird die hepatoprotektive Zusammensetzung zur oralen Verabreichung zubereitet. Die Vollblutsammlung kann mit geeigneten Hilfsstoffen formuliert und in Form von Lutschtabletten und Pillen hergestellt oder in feste oder weiche Kapseln eingekapselt werden. Zum Beispiel können die Hilfsstoffe aus der Gruppe von Substanzen ausgewählt sein, die Maltodextrin, Stärke, Stärkesirup, Lactose, Mannit, Sorbit, Saccharose, Glucose, Akaziengummi, Gelatine, Calciumphosphat, Hydroxypropylmethylcellulose, mikrokristalline Cellulose, Calciumsulfatdihydrat, Calciumlactattrihydrat, Glycin, Kaolin, Calciumhydroxid, Talk, Alginat, Stearate, Natriumstearylfumarat, hydrierte Pflanzenöle, höhere Fettsäuren und ihre Alkali- und Erdalkalimetallsalze, Glycerin, Wachs, Borsäure, Natriumbenzoat, Natriumacetat, Natriumchlorid, Leucin, Polyethylenglykol, Polyvinylpyrrolidon, Methoxypolyethylenglykol, Natriumoleat, Glyceryl-n-docosanoat, Natriumlaurylsulfat und kolloidales Siliciumdioxid umfasst.
Bei der Vollblutsammlung der erfindungsgemäßen hepatoprotektiven Zusammensetzung wird einem Individuum eine therapeutisch wirksame Menge verabreicht, um die biologische oder medizinische Reaktion in Zellen, Geweben, Systemen, Tieren oder Menschen, die von Fachärzten, Tierärzten, Forschern oder anderem klinischen Personal angestrebt wird, auszulösen und dadurch den Zustand oder die Symptome des Individuums zu stabilisieren, zu verbessern oder zu lindern, genauer gesagt, um bei dem jeweiligen Individuum eine Verbesserung in Bezug auf die Leberfunktionsindikatoren, einen Rückgang der Hepatomegalie, eine Verringerung der Ansammlung von Triglyceriden in der Leber und eine Verbesserung in Bezug auf die Lebersteatose zu erreichen bzw. zu bewirken. Obwohl normalerweise die therapeutisch wirksame Menge anhand des beim Patienten im Vergleich zur Verabreichung einer ähnlichen, aber nicht die erfindungsgemäße Zusammensetzung der Vollblutsammlung (nämlich die Kontrollgruppe) enthaltenden Bedingung zu beobachtenden Effekts bestimmt wird, wird hier jedoch die tatsächliche Dosierung basierend auf dem gewählten spezifischen Verabreichungsweg berechnet. Eine Feinkalkulation zur Bestimmung der richtigen Dosierung kann in üblicher Weise von Fachleuten auf diesem Gebiet vorgenommen werden. Im Fall einer oralen Dosierungsform ist es bevorzugt, einer Person eine tägliche, wöchentliche oder zweimal wöchentliche Dosis zwischen 0,1 mg pro kg Körpergewicht bis zu 100 mg pro kg Körpergewicht zu verabreichen. Besonders bevorzugt ist eine Dosis zwischen 1 mg/kg Körpergewicht bis zu 50 mg/kg Körpergewicht, z. B. 10 mg/kg Körpergewicht bis zu 25 mg/kg Körpergewicht.
In einem konkreten Ausführungsbeispiel kann die erfindungsgemäße hepatoprotektive Zusammensetzung zusätzlich weitere für die Leber vorteilhafte Wirkstoffe enthalten, um so zusammen zu gesundheitsfördernden Nahrungsmitteln und Medikamenten, die für die Einnahme durch das Individuum geeignet, sicher und wirksam sind, formuliert zu werden. In einem anderen konkreten Ausführungsbeispiel besteht die erfindungsgemäße hepatoprotektive Zusammensetzung primär aus der zuvor beschrieben Vollblutsammlung und den zuvor beschrieben akzeptablen Hilfsstoffen. Hier ist unter dem Ausdruck „bestehen ... primär aus“ zu verstehen, dass die angegebenen Kombinationen der Inhaltsstoffe andere nicht angegebene Bestandteile, die die Eigenschaften und Funktionen der Vollblutsammlung nicht beeinflussen, nicht ausschließen. In einem anderen konkreten Ausführungsbeispiel besteht die erfindungsgemäße hepatoprotektive Zusammensetzung nur aus der zuvor beschriebenen Vollblutsammlung und den zuvor beschriebenen pharmakologisch oder ernährungsphysiologisch akzeptablen Hilfsstoffen.
Die folgenden Ausführungsbeispiele dienen nur der Veranschaulichung der Erfindung und sollen nicht die Schutzansprüche beschränken. Die für jedes Ausführungsbeispiel dargestellten Versuchsergebnisse sind als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben.
Zubereitungsbeispiel 1: Zubereitung von lyophilisiertem Vollblut
500 ml Vollblut wurde von LDY-Schweinen gewonnen, die von der Taiwan Sugar Corporation gezüchtet wurden. Das Vollblut wurde in eine leere Flasche mit 75 ml Säure-Citrat-Dextrose-Lösung A (anticoagulant Acid Citrate Dextrose solution-A: ACD-A) und 3 ml Gentamicin abgefüllt und bei niedriger Temperatur gelagert. Das Schweine-Vollblut wurde in mehrere Glasflaschen (125 ml/Flasche) zur Lyophilisierung verteilt abgefüllt und 24 Stunden bei -80 °C eingefroren. Anschließend wurde an diesem ein Gefriertrocknungsverfahren durchgeführt, um lyophilisiertes Vollblut zu erhalten.
Ausführungsbeispiel 1: Tiermodell einer alkoholbedingten Lebererkrankung

Sechs Wochen alte männliche C57BL/6J (B6) -Mäuse (BioLASCO Taiwan Co., Ltd.) wurden bis zu einem Alter von 10 Wochen mit normaler Kaunahrung (chew diet) gezüchtet. Die Raumtemperatur der Fütterungsumgebung für die Mäuse wurde bei 22 °C ± 2 °C gehalten, der Hell-Dunkel-Zyklus betrug jeweils 12 Stunden und die Mäuse konnten Trinkwasser und Futter ad libitum beziehen. Die Körpergewichte wurden einmal pro Woche aufgezeichnet. Anschließend wurde ein Versuchsmodus von durch eine alkoholbedingte Fettleber verursachten Schäden ausgeführt, die durch alkoholhaltige Flüssignahrung induziert wurde. Vor dem Experiment wurden die C57BL/6J (B6) -Mäuse zufällig in 5 Gruppen eingeteilt. Beim Test wurde in der ersten Woche der Alkoholgehalt in der alkoholhaltigen Flüssignahrung allmählich erhöht, um die Versuchstiere an die alkoholhaltige Flüssignahrung zu gewöhnen. In der nachfolgenden Tabelle 1 sind die Versuchsgruppen aufgeführt: Tabelle 1: Versuchsgruppe

Gruppe	ad libitum	Gavage (Sondenernährung)
C-Gruppe (Kontrollgruppe)	normale Flüssignahrung	deionisiertes Wasser
TO-Gruppe (Gruppe mit alkoholinduzierter Leberschädigung)	alkoholhaltige Flüssignahrung	deionisiertes Wasser
T2,5-Gruppe	alkoholhaltige Flüssignahrung	2,5 mg/kg Körpergewicht lyophilisiertes Pulver des Zubereitungsbeispiels 1
T6,25-Gruppe	alkoholhaltige Flüssignahrung	6,25 mg/kg Körpergewicht lyophilisiertes Pulver des Zubereitungsbeispiels 1
T12,5-Gruppe	alkoholhaltige Flüssignahrung	12,5 mg/kg Körpergewicht lyophilisiertes Pulver des Zubereitungsbeispiels 1

Bei der obigen alkoholhaltigen Flüssignahrung handelt es sich um Lieber-DeCarli Regular Liquid Diet Ethanol (bezogen von Dytes Inc., Philadelphia, USA; Produktcode #710260, mit 5,11 % Ethanol). Bei der obigen normalen Flüssignahrung handelt es sich um Lieber-DeCarli Regular Liquid Diet Control (bezogen von Dytes Inc., Philadelphia, USA; Produktcode #710027). Die Kaloriendichte beträgt bei beiden 1,0 kcal/ml. Die Fütterung sah vor, dass die Tiere Wasser und Futter ad libitum beziehen konnten. Ab Versuchsbeginn wurde allen Tieren täglich um 10 Uhr morgens deionisiertes Wasser oder das durch das Zubereitungsbeispiel 1 gewonnene lyophilisierte Vollblut über einen Zeitraum von 4 Wochen oral verabreicht. Frische Flüssignahrung wurde täglich um 4 Uhr nachmittags gewechselt und dabei wurde die Nahrungsaufnahme aufgezeichnet. Die Veränderungen des Körpergewichts der Mäuse wurden alle zwei Tage überwacht.
Die Mäuse wurden für 4 Wochen gezüchtet und dann gewogen und getötet. Die Blutentnahme wurde retrobulbär oder durch Herzpunktion durchgeführt. Es wurde eine Trennung des Serums durchgeführt, um die biochemischen Indikatoren für Blutfett und Leber zu untersuchen: Triglyceride, Cholesterin, Alanin-Aminotransferase (ALT) und Aspartat-Aminotransferase (AST). Zur Entnahme der Leberproben wurde die Bauchhöhle aufgeschnitten. Nach dem Wiegen wurde das Verhältnis von Lebergewicht zu Körpergewicht verglichen. Der größere rechte Leberlappen wurde in Würfel von etwa 1 cm großen Gewebeblöckchen geschnitten und dann in 10 %-igem neutralem Formalin fixiert. Nach dem Schneiden und der Einbettung in Paraffin wurde zur histopathologischen Beobachtung eine HE-Färbung durchgeführt. Der Rest der Leber wurde je nach anatomischer Lokalisation in sechs Teile aufgeteilt, um jeweils den Gehalt der antioxidativen Inhaltsstoffe wie Glutathion (GSH), die CAT-Enzymaktivität sowie die Veränderung des Triglycerid- und Cholesterolgehalts der Leber zu untersuchen.
Ausführungsbeispiel 1: Veränderungen des Körpergewichts bei Mäusen

Das durchschnittliche Anfangsgewicht von zehn Wochen alten Mäusen beträgt etwa 25 Gramm. Nach einer Anpassungsperiode von einer Woche nahm bei jeder Gruppe von Mäusen das Körpergewicht um etwa 1 Gramm bis 2 Gramm zu. Das Durchschnittsgewicht beträgt etwa 26 Gramm bis 27 Gramm. In der Versuchsperiode war bei den Mäusen eine Abnahme der Nahrungsaufnahme zu beobachten, da in der alkoholhaltigen Flüssignahrung die Alkoholkonzentration bis zu 5,1 % betrug. Daher wurde für die Kontrollgruppe die Paarfütterung (pair-feeding) angewendet. Nach einer Woche nahm in jeder Gruppe das Körpergewicht der Mäuse um etwa 2 Gramm bis 3 Gramm ab. Das Durchschnittsgewicht betrug etwa 23 Gramm bis 24 Gramm. Danach wurden in jeder Gruppe die Gewichte bzw. Endgewichte in der zweiten und dritten Woche auf gleichem Niveau gehalten. Zwischen den Gruppen gab es keinen signifikanten Unterschied (p> 0,05). Tabelle 2: Veränderungen des Körpergewichts

Gruppe	Anzahl der Proben	Gewicht (g)
Gruppe	Anzahl der Proben	Anfangsge wicht	Woche 0	Woche 1	Woche 2	Woche 3	Endgewicht
C	11	24,9±1,8	27,4±2,0	23,5±2,5	24,1±2,1	25,6±2,1	26,5±1,6
T0	7	24,8±0,8	26,4±1,1	23,1±1,2	23,1±1,9	26,7±1,3	26,8±2,1
T2,5	9	25,0±0,9	26,7±1,4	24,7±1,5	25,6±1,6	26,5±1,9	26,4±2,2
T6,25	11	25,0±1,1	26,1±1,1	23,8±2,3	24,3±1,4	24,7±3,1	25,8±2,5
T12,5	11	25,1±1,3	27,0±1,3	24,5±1,9	24,5±1,7	25,7±1,1	25,5±1,2

Ausführungsbeispiel 3: Gewebegewicht von Mäusen

Bei allen Gruppen von Mäusen gab es keinen signifikanten Unterschied (p> 0,05) zwischen dem absoluten Gewicht und dem relativen Gewicht in Bezug auf Herz, Milz, Lunge, Niere und im epididymalen weißen Fettgewebe (eWAT). In Bezug auf das absolute Gewicht und das relative Gewicht der Leber zeigte sich jedoch, dass dieses bei der alkoholinduzierten Leberschadengruppe (TO-Gruppe) signifikant größer als bei der Kontrollgruppe (C-Gruppe) war, d. h. bei den Mäusen der alkoholinduzierten Leberschadengruppe (TO-Gruppe) kam offenkundig Hepatomegalie vor (p> 0,05). Nach der Verabreichung von Testproben verschiedener Dosierungen konnte ein signifikanter Rückgang der Hepatomegalie erreicht werden, insbesondere bei den Mäusen (T12,5-Gruppe), bei denen eine hohe Dosierung des durch das Zubereitungsbeispiel 1 gewonnenen lyophilisierten Vollbluts verabreicht wurde (p> 0,05). Tabelle 3: Absolutes Gewicht der Gewebe

Gruppe	Anzahl der Proben	Leber	Herz	Milz	Lunge	Niere	eWAT
Gruppe	Anzahl der Proben			Gewicht (g)
C T0	11 7	0,98±0,08 1,09±0,08	0,12±0,01 0,12±0,01	0,06±0,01 0,05±0,02	0,14±0,01 0,14±0,01	0,29±0,03 0,30±0,02	0,58±0,15 0,45±0,13
T2,5	9	1,00±0,15	0,11±0,02	0,05±0,01	0,14±0,02	0,30±0,04	0,59±0,20
T6,25	11	0,97±0,10	0,11±0,02	0,05±0,01	0,14±0,01	0,30±0,02	0,52±0,27
T12,5	11	0,94±0,11	0,11±0,01	0,05±0,01	0,13±0,01	0,30±0,03	0,49±0,16

Tabelle 4: Relatives Gewicht der Gewebe

Gruppe	Anzahl der Proben	Leber	Herz	Milz	Lunge	Niere	eWAT
Gruppe	Anzahl der Proben		g/100 g Körpergewicht
C	11	3,86±0,25	0,47±0,04	0,23±0,02	0,55±0,05	1,16±0,08	2,26±0,52
T0	7	4,48±0,51	0,50±0,07	0,22±0,05	0,57±0,04	1,23±0,10	1,81±0,42
T2,5	9	4,08±0,51	0,46±0,05	0,21±0,04	0,58±0,05	1,22±0,10	2,39±0,75
T6,25	11	4,15±0,36	0,47±0,10	0,23±0,05	0,60±0,10	1,29±0,20	2,12±1,02
T12,5	11	3,97±0,40	0,48±0,05	0,19±0,07	0,56±0,05	1,26±0,13	2,06±0,65

Ausführungsbeispiel 4: Triglycerid- und Cholesterolgehalt im Serum und in der Leber
Messung des Serumtriglyceridgehalts (TG)
Für die Messung wurde ein handelsüblicher Reagenzsatz (Randox Laboratories Ltd., UK, Nummer TR418) verwendet. Von der Standardlösung, nachdem bei ihr eine Serienverdünnung (12,5 bis 200 mg/dl) durchgeführt wurde, und von der im Ausführungsbeispiel 1 erhaltenen Serumprobe, nachdem bei ihr in geeigneter Weise eine Verdünnung durchgeführt wurde, werden jeweils 10 Mikroliter entnommen und in eine flache 96-Well-Kulturschale eingesetzt und mit 200 Mikroliter Reagenz versetzt. Die Reaktion wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Extinktion bei 500 nm wurde gemessen. Anhand der Extinktion der Standardlösung wurde nach der Serienverdünnung eine Standardkurve erstellt. Die Extinktionswerte der Serumproben wurden in die Standard kurve eingetragen, um den Serumtriglyceridgehalt zu berechnen.
Messung des Serumcholesteringehalts
Für die Messung wurde ein handelsüblicher Reagenzsatz (Randox Laboratories Ltd., UK, Nummer CH280) verwendet. Von der Standardlösung, nachdem bei ihr eine Serienverdünnung (12,5 mg/dl bis 200 mg/dl) durchgeführt wurde, und von der im Ausführungsbeispiel 1 erhaltenen Serumprobe, nachdem bei ihr in geeigneter Weise eine Verdünnung durchgeführt wurde, werden jeweils 10 Mikroliter entnommen und in eine flache 96-Well-Kulturschale eingesetzt und mit 250 Mikroliter Reagenz versetzt. Die Reaktion wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Extinktion bei 500 nm wurde gemessen. Anhand der Extinktion der Standardlösung wurde, nachdem bei ihr eine Serienverdünnung durchgeführt wurde, eine Standardkurve erstellt. Die Extinktionswerte der Serumproben wurden in die Standardkurve eingetragen, um den Serumcholesteringehalt zu berechnen.
Zubereitung von Leberlipidextrakt
Das von Fitch et al. vorgeschlagene Lipidextraktionsverfahren (Folch et al., 1957, J. Biol. Chem. 226: 497 - 509 (1957)) wurde dafür verwendet. 0,1 g der im Ausführungsbeispiel 1 erhaltenen Leber wurde in eine Probenglasflasche gegeben und mit einer kleinen Menge Extraktionslösung (CHCl₃ : MeOH = 2 : 1) versetzt und dann mittels eines Homogenisators zermahlen, danach durch ein Filterpapier gefiltert und anschließend mittels einer Messflasche durch die Extraktionslösung auf eine Menge von 10 ml gebracht.
Messung des Lebertriglyceridgehalts
50 Mikroliter Leberextrakt wurden in ein Glasteströhrchen gegeben und dann zur vollständigen Verdampfung des Lösungsmittels in einem Abzug gelagert. Anschließend wurde für die Analyse ein handelsüblicher Reagenzsatz (Randox Laboratories Ltd., UK, Nummer TR418) in der gleichen Weise wie bei den Serumtriglyceriden verwendet.
Messung des Lebercholesteringehalts
100 Mikroliter Leberlipidextrakt wurden in ein Glasteströhrchen gegeben und dann zur vollständigen Verdampfung des Lösungsmittels in einem Abzug gelagert und dann mit 10 Mikroliter Triton X-100 versetzt. Anschließend wurde für die Analyse ein handelsüblicher Reagenzsatz (Randox Laboratories Ltd., UK, Nummer CH280) in der gleichen Weise wie beim Serumcholesterin verwendet.

Die Testergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 5 zusammengefasst. Tabelle 5: Triglycerid- und Cholesterolgehalt im Serum und in der Leber

Gruppe	Anzahl der Proben	Triglyceride			Cholesterin
		mg/dl	mg/g	mg/	mg/dl	mg/g	mg/
		Serum	Lebergewicht	Gesamtlebergewicht	Serum	Lebergewicht	Gesamtlebergewicht
C	11	50,3±15,5	6,63±2,50	6,44±2,16	98,4±20,9	2,19±0,64	2,14±0,62
T0	7	69,5±24,3	13,23±2,69	14,47±3,21	88,7± 7,4	2,33±0,44	2,57±0,60
T2,5	9	68,0±32,1	9,42±1,6	9,49±2,74	91,6±7,1	2,10±0,25	2,08±0,31
T6,25	11	52,1±17,1	11,09±3,85	10,64±3,47	82,4±23,4	2,22±0,32	2,14±0,31
T12,5	11	58,4±15,4	8,99±2,48	8,48±2,61	92,2±10,3	2,25±0,37	2,12±0,49

Aus Tabelle 5 geht hervor, dass eine Behandlung mit Alkohol (TO-Gruppe) zu einer Erhöhung des Triglyceridgehalts (TG-Gehalt) im Serum der Mäuse führt. Durch die Verabreichung des im Zubereitungsbeispiel 1 erhaltenen lyophilisierten Vollbluts (T6,25 und T12,5-Gruppe) in mittlerer und hoher Dosierung kann durch die bei Blutfetterhöhung erreichte Verbesserung ein vorteilhafter Effekt erzielt werden. Ferner führt eine Behandlung mit Alkohol (TO-Gruppe) signifikant zur Ansammlung einer großen Menge an Triglyceriden (TG) in der Mausleber (p <0,05), was darauf hinweist, dass im vorliegenden Ausführungsbeispiel eine Behandlung mit Alkohol tatsächlich eine Fettleber bei Mäusen verursacht. Durch die Verabreichung des im Zubereitungsbeispiel 1 erhaltenen lyophilisierten Vollbluts mit verschiedenen Dosierungen kann der vorteilhafte Effekt erzielt werden, dass in Bezug auf die Lebertriglyceride (TG) eine erhebliche Verbesserung erreicht wird (p <0,05). Dies zeigt, dass das im Zubereitungsbeispiel 1 erhaltene lyophilisierte Vollblut die Fähigkeit hat, bei einer Fettleber eine Verbesserung herbeizuführen. In Bezug auf den Cholesteringehalt im Serum und in der Leber der Mäuse jeder Gruppe gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen (p> 0,05).
Ausführungsbeispiel 5: Enzymaktivität von Aspartat-Aminotransferase (AST) und Alanin-Aminotransferase (ALT) im Serum
Im vorliegenden Ausführungsbeispiel wurden die AST-Enzymaktivität und die ALT-Enzymaktivität im Serum, die im Ausführungsbeispiel 1 erhalten wurden, als Indikatoren für Leberschädigung verwendet, um die Verbesserungswirkung des durch das Zubereitungsbeispiel 1 erhaltenen lyophilisierten Vollbluts auf die alkoholinduzierte Leberschädigung zu beurteilen. Für den Leberfunktionstest von AST (oder GOT) und ALT (oder GPT) wurden handelsübliche Reagenzsätze (Randox Laboratories Ltd., UK, Nummer AL1268 und AS1267) verwendet. Das Testprinzip basierte auf dem von Reitman und Frankel et al. vorgeschlagenen Verfahren (Reitman, S., and Frankel, A., 1957, Am. J. Clin. Pathol. 28(1): 56-63) und auf dem von der International Federation of Clinical Chemistry vorgeschlagenen Standardverfahren (International Federation of Clinical Chemistry (IFCC). 1986. J. Clin. Chem. Biochem. 24: 481-495; und International Federation of Clinical Chemistry (IFCC). 1986. J. Clin. Chem. Biochem. 24: 497-510).

Die Testergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 6 zusammengefasst. Tabelle 6: AST/ALT-Enzymaktivität im Serum

Gruppe	Anzahl der Proben	Einheit/Liter (E/l)
Gruppe	Anzahl der Proben	AST	ALT
C	11	40,0±9,2	26,8±8,3
T0	7	59,9±19,2	36,8±13,2
T2,5	9	56,5±12,2	29,8±6,8
T6,25	11	49,3±15,3	27,8±8,6
T12,5	11	55,2±12,8	29,8±6,4

Aus Tabelle 6 geht hervor, dass eine Behandlung mit Alkohol (TO-Gruppe) zu einer Erhöhung der AST-Enzymaktivität und der ALT-Enzymaktivität im Serum der Mäuse führt (p <0,05). Durch die Verabreichung des im Zubereitungsbeispiel 1 erhaltenen lyophilisierten Vollbluts kann die ALT-Enzymaktivität, insbesondere bei der T6,25-Gruppe, signifikant reduziert werden. Dies zeigt, dass im Falle einer alkoholinduzierten chronischen Leberschädigung das im Zubereitungsbeispiel 1 erhaltene lyophilisierte Vollblut die Fähigkeit hat, die Leberfunktion zu schützen.
Ausführungsbeispiel 6: Test der antioxidativen Enzymaktivität der Leber
Etwa 0,1 Gramm der in Ausführungsbeispiel 1 erhaltenen frischen Leber wurde entnommen und in einem homogenisierten eiskalten Puffer (0,01 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,4, mit 1,15 % KCl) homogenisiert, um die Leber mit einem Gewebehomogenisator zu homogenisieren. Nach dem Filtern mit dem Gazefilter wurde diese mit einem Puffer auf 10 % (w/v) eingestellt, anschließend wurde diese bei 4 ° C bei 1000xg für 30 Minuten zentrifugiert, um für die Analyse ein homogenisiertes Lebergewebe zu erhalten. Nach geeigneten Verdünnungen wurden jeweils 10 Mikroliter der Standardlösung der verdünnten Probe und 10 Mikroliter der Standardlösung der Reihenverdünnungen von Rinderserumalbumin (Firma Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) getrennt in eine 96-Loch-Mikrotiterplatte für einen enzymgekoppelten Immunadsorptionstest eingespritzt, anschließend wurde ein Reagenz für die Proteinanalyse (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, California, U.S.A.) zugegeben und für 5 Minuten bei Raumtemperatur reagieren gelassen, anschließend wurde die Extinktion bei dem Wert 595 nm durch einen Leser für den enzymgekoppelten Immunadsorptionstest gemessen. Die Proteinkonzentration jeder hepatischen Homogenatprobe wurde gemäß einer Standardkurve berechnet.
Für den Test des gesamten Leberglutathiongehalts (GSH) und der CAT-Enzymaktivität wurden handelsübliche Reagenzsätze (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, Ml United States, Nummer #703002 und #707002) verwendet.

Die Testergebnisse sind in den nachfolgenden Tabellen 7 und 8 zusammengefasst. Tabelle 7: Leberglutathiongehalt (GSH)

Gruppe	Anzahl der Proben	gesamter Leberglutathiongehalt
Gruppe	Anzahl der Proben	nmol/mg Protein	µmοl/g Lebergewicht	µmol/ Gesamtlebergewicht
C	11	31,2±14,7	6,14±1,77	6,11±1,99
T0	7	20,5±4,1	5,02±0,99	5,49±1,24
T2,5	9	20,9±3,2	5,55±1,12	5,42±0,71
T6,25	11	22,2±3,6	5,54±0,74	5,34±0,79
T12,5	11	22,3±5,3	5,87±1,24	5,48±1,34

Aus Tabelle 7 geht hervor, dass der gesamte Leberglutathiongehalt reduziertes Glutathion (GSH) und oxidiertes Glutathion-Disulfid (GSSG) enthält, wobei eine Behandlung mit Alkohol (TO-Gruppe) zu einer signifikanten Abnahme des gesamten Leberglutathiongehalts führt (p <0,05). Das Glutathion ist das wichtigste Antioxidationsmittel in den Zellen. Eine Behandlung mit Alkohol führt zu einer Abnahme des gesamten Leberglutathiongehalts, was darauf hindeutet, dass Alkohol tatsächlich einen Anstieg des oxidativen Stresses in den Leberzellen verursacht. Durch die Verabreichung des im Zubereitungsbeispiel 1 erhaltenen lyophilisierten Vollbluts in mittlerer und hoher Dosierung wird der gesamte Leberglutathiongehalt erhöht. Dies zeigt, dass das im Zubereitungsbeispiel 1 erhaltene lyophilisierte Vollblut die Fähigkeit hat, den oxidativen Stress zu reduzieren und die Leber vor oxidativen Schäden zu schützen. Tabelle 8: CAT-Enzymaktivität in der Leber

Gruppe	Anzahl der Proben	CAT-Enzymaktivität
Gruppe	Anzahl der Proben	nmol/(min*mg) Protein	mmole/(min*g) Lebergewicht	mmole/(min*g) Gesamtlebergewicht
C	11	429,7±164,0	87,4±26,3	85,1±22,7
T0	7	599,4±157,7	148,0±4,44	161,0±47,2
T2,5	8	601,1±227,6	155,7±53,2	159,0±65,2
T6,25	11	549,0±217,6	135,7±49,8	132,5±55,4
T12,5	11	499,2±168,8	131,2±43,0	122,9±44,1

Die Katalase (CAT) ist eines der wichtigsten antioxidativen Enzyme in den Zellen. Ihre Hauptfunktion besteht in der Umwandlung von intrazellulärem Wasserstoffperoxid in Wasser und Sauerstoff. Aus Tabelle 8 geht hervor, dass eine Behandlung mit Alkohol (TO-Gruppe) zu einer signifikanten Erhöhung der CAT-Enzymaktivität (p <0,05) in der Leber der Mäuse führt (p <0,05). Im Stoffwechselprozess des Alkohols wird eine große Menge an Wasserstoffperoxid erzeugt, das durch Katalase entfernt werden muss. Die CAT-Enzymaktivität ist bei den Mäusen der in der mit Alkohol behandelten Gruppe am höchsten. Dies kann eine kompensatorische Reaktion von Leberzellen unter oxidativem Stress sein, um eine große Anzahl von CAT-Genexpressionen zu fördern und dadurch eine große Menge an Wasserstoffperoxid zu entfernen. Durch die Verabreichung des im Zubereitungsbeispiel 1 erhaltenen lyophilisierten Vollbluts (T6,25-Gruppe und T12,5-Gruppe) in mittlerer und hoher Dosierung wird die CAT-Enzymaktivität reduziert. Dies zeigt, dass das im Zubereitungsbeispiel 1 erhaltene lyophilisierte Vollblut die Fähigkeit hat, die Produktion von Wasserstoffperoxid in der Leber zu hemmen und dadurch die Rückkoppelwirkung der durch die kompensatorische Reaktion verursachten großen Anzahl von CAT-Genexpressionen zu verlangsamen.
Ausführungsbeispiel 7: Pathologische Schnitte des Lebergewebes
Beim im Ausführungsbeispiel 1 erhaltenen Lebergewebe wurde das Dehydratations- und Transparenzverfahren mit verschiedenen Konzentrationen von Ethanol (30 %, 50 %, 70 %, 95 %, 99,5 %) und Xylol durchgeführt. Xylol wurde anschließend durch eine heiße Paraffinlösung ersetzt. Schließlich wurde das Gewebe in der Paraffinlösung eingebettet. Die fertige Paraffinprobe wurde unter Verwendung eines Mikrotoms in 5 µm dicke kontinuierliche Paraffinschnitte geschnitten. Die geschnittenen Scheiben wurden auf einen sauberen Glasobjektträger geklebt und für die anschließende pathologische Färbung bei 37 ° C getrocknet.
Um die Veränderungen der chronischen Leberschädigung, wie z. B. Schäden an Leberzellen, Fettansammlung und Nekrose, zu beobachten, wurde am Lebergewebe zur Bewertung der Leberfettansammlung eine HE-Färbung durchgeführt. Die Gewebeschnitte wurden zur Entparaffinierung 30 Minuten lang in Xylol gestellt und dann 30 Minuten lang zur Rehydration in 99,5 %-iges, 95 %-iges, 70 %-iges, 50 %-iges und 30 %-iges Ethanol gestellt. Anschließend wurden diese in destilliertem Wasser für 10 Minuten eingeweicht. Dadurch konnten sie gefärbt werden. Die Zellkerne wurden zur Färbung zuerst für 30 Sekunden in Hämatoxylin eingeweicht und mehrere Minuten mit destilliertem Wasser gewaschen und dann für 2 bis 5 Minuten mit Eosin gefärbt und mehrere Minuten mit destilliertem Wasser gewaschen. Nach dem Färbeverfahren wurde ein Dehydratisierungsverfahren durchgeführt. Dabei wurden diese jeweils für 30 Sekunden nacheinander zweimal in 50 %-iges, 70 %-iges, 95 %-iges und 100 %-iges Ethanol gestellt. Anschließend wurde an diesen zweimal das Transparenzverfahren mit Xylol durchgeführt. Schließlich wurden diese mit einem Versiegelungsklebstoff versiegelt. Die Bilder der gefärbten pathologischen Schnitte sind in 1 dargestellt.
1 zeigt, dass der Lebergewebeschnitt der Mäuse der Kontrollgruppe eine intakte Struktur aufweist, bei der eine klare Grenze zwischen den Zellen vorhanden ist und die innere Struktur der Zellen keine Verunreinigungen oder Vakuolen aufweist. Die Leberzellen in der mit Alkohol behandelten Gruppe (TO-Gruppe) zeigten offensichtliche pathologische Veränderungen, wie z. B. Ballondegeneration (ballooning degeneration) und Ansammlung von Fetttröpfchen (fatty droplet), die helle Tröpfchen aufwiesen und bei denen die Grenzen zwischen den Zellen verschwommen waren. Nach der Verabreichung des im Zubereitungsbeispiel 1 erhaltenen lyophilisierten Vollbluts ließ sich eine signifikante Verbesserung bei den pathologischen Leberveränderungen erreichen, insbesondere nahm die Anzahl und Größe der Vesikel der Fetttröpfchen signifikant ab (T2,5-Gruppe, T6,25-Gruppe und T12,5-Gruppe). Die Ergebnisse des vorliegenden Ausführungsbeispiels zeigen, dass das lyophilisierte Vollblut des Zubereitungsbeispiels 1 die Fähigkeit hat, bei Lebersteatose eine Verbesserung herbeizuführen.
Die vorstehende Beschreibung stellt nur bevorzugte Ausführungsbeispiele der Erfindung dar und soll nicht die Schutzansprüche beschränken. Alle gleichwertigen Änderungen und Modifikationen, die gemäß der Beschreibung und den Zeichnungen der Erfindung von einem Fachmann auf diesem Gebiet ausgehend von der Beschreibung in naheliegender Weise vorgenommen werden können, fallen in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung der erfindungsgemäßen hepatoprotektiven Zusammensetzung zur Behandlung einer alkoholbedingten Lebererkrankung. Diesbezüglich wird auf die Rechtsprechung des Bundesgerichtshofes verwiesen, gemäß welcher die Eintragung eines Gebrauchsmusters für die Verwendung von Stoffen im Rahmen einer medizinischen Indikation möglich ist (BGH X ZB 7/03, Beschluss vom 5.10.2005, veröffentlicht in der Online-Datenbank des BGH).
Zusammenfassend betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, durch die die Leber vor einer alkoholbedingten Lebererkrankung geschützt wird, und deren Anwendungen für Medikamente und gesundheitsfördernde Nahrungsmittelprodukte. Die Zusammensetzung umfasst eine von Säugetieren stammende Vollblutsammlung mit einer therapeutisch wirksamen Menge und pharmakologisch oder ernährungsphysiologisch akzeptablen Hilfsstoffen. Vorzugsweise stammt die Vollblutsammlung von echten Schweinen, beispielsweise Hausschweinen (Sus scrofa domestica). Die vorliegende Erfindung eignet sich zur Prävention oder Behandlung einer alkoholbedingten Lebererkrankung, beispielsweise zur Prävention oder Behandlung der alkoholbedingten Steatose und alkoholbedingten Fettleber.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

M. H. P., Lieber, C. S., DeCarli, L. M., French, S. W., Lindros, K. O., Jarvelainen, H., Bode, C., Parlesak, A., and Bode, J. C. (2001). Models of alcoholic liver disease in rodents: a critical evaluation. Alcohol Clin. Exp. Res. 25, 254S-261S) [0006]
(siehe Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed. (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975; Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; und Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 1999)) [0021]
Fitch et al. vorgeschlagene Lipidextraktionsverfahren (Folch et al., 1957, J. Biol. Chem. 226: 497 - 509 (1957)) [0035]
Reitman und Frankel et al. vorgeschlagenen Verfahren (Reitman, S., and Frankel, A., 1957, Am. J. Clin. Pathol. 28(1): 56-63) und auf dem von der International Federation of Clinical Chemistry vorgeschlagenen Standardverfahren (International Federation of Clinical Chemistry (IFCC). 1986. J. Clin. Chem. Biochem. 24: 481-495; und International Federation of Clinical Chemistry (IFCC). 1986. J. Clin. Chem. Biochem. 24: 497-510) [0040]

Claims

Eine hepatoprotektive Zusammensetzung, umfassend eine von einem Säugetier stammende Vollblutsammlung mit einer therapeutisch wirksamen Menge und pharmakologisch oder ernährungsphysiologisch akzeptablen Hilfsstoffen.
Hepatoprotektive Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei der die Vollblutsammlung von echten Schweinen (Suidae) stammt.
Hepatoprotektive Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die Vollblutsammlung von Tieren der Schweinegattung (Sus sp.) stammt.
Hepatoprotektive Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die Vollblutsammlung von Hausschweinen (Sus scrofa domestica) stammt.
Hepatoprotektive Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die Vollblutsammlung in Form eines lyophilisierten Pulvers vorliegt.
Hepatoprotektive Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei diese in Form einer oral verabreichbaren Zubereitung vorliegt.
Hepatoprotektive Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die pharmakologisch oder ernährungsphysiologisch akzeptablen Hilfsstoffe aus der Gruppe von Hilfsstoffen ausgewählt sind, die Lösungsmittel, Tenside, Sprengmittel, Bindemittel, Verdünnungsmittel, Gleitmittel, Stabilisatoren, Antioxidantien, Geschmacksstoffe, Süßstoffe, Farbstoffe, Absorptionsförderer, Weichmacher, pH-Einstellmittel, osmotische Mittel und Verdickungsmittel umfasst.
Hepatoprotektive Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der pharmakologisch oder ernährungsphysiologisch akzeptable Hilfsstoffe aus der Gruppe von Substanzen ausgewählt sind, die Maltodextrin, Stärke, Stärkesirup, Lactose, Mannit, Sorbit, Saccharose, Glucose, Akaziengummi, Gelatine, Calciumphosphat, Hydroxypropylmethylcellulose, mikrokristalline Cellulose, Calciumsulfatdihydrat, Calciumlactattrihydrat, Glycin, Kaolin, Calciumhydroxid, Talk, Alginat, Stearate, Natriumstearylfumarat, hydrierte Pflanzenöle, höhere Fettsäuren und ihre Alkali- und Erdalkalimetallsalze, Glycerin, Wachs, Borsäure, Natriumbenzoat, Natriumacetat, Natriumchlorid, Leucin, Polyethylenglykol, Polyvinylpyrrolidon, Methoxypolyethylenglykol, Natriumoleat, Glyceryl-n-docosanoat, Natriumlaurylsulfat und kolloidales Siliciumdioxid umfasst.