KR20000026684A

KR20000026684A - 데커신을 유효성분으로 포함하는 암세포 분화유도제 조성물

Info

Publication number: KR20000026684A
Application number: KR1019980044340A
Authority: KR
Inventors: 정세영; 김익환; 안경섭; 김상기
Original assignee: 정세영; 이영우; 김익환; 주식회사 메디카코리아
Priority date: 1998-10-22
Filing date: 1998-10-22
Publication date: 2000-05-15

Abstract

본 발명은 데커신(decursin)을 유효성분으로 포함하고 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암세포 분화유도제 조성물 특히, 인체 백혈병 암세포 분화유도제 조성물에 관한 것이다.

Description

데커신을 유효성분으로 포함하는 암세포 분화유도제 조성물

본 발명은 데커신(decursin)을 유효성분으로 포함하는 분화유도제 조성물에 관한 것이며, 더욱 상세하게는 데커신을 유효성분으로 포함하고 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암세포 분화유도제 조성물 특히, 인체 백혈병 암세포 분화유도제 조성물에 관한 것이다.

우리 신체의 정상조직의 모든 세포는 어느정도 증식을 이룬 뒤에는 반드시 분화라는 과정을 거쳐 정상적인 기능을 갖는 세포로 존재하게 되며 이런 증식과 분화는 이미 세포내에서 프로그램되어 있는 유전자 수준에서의 조절에 의한 것으로 알려져 있다. 그러나 암세포는 이러한 신체의 정상조직에서 유래하기는 하였으나 정상세포와는 달리 정상적인 분화를 이루지 못한 채 무제한적으로 증식만 계속하는 미성숙한 세포들로 이루어진 것이다. 따라서, 암세포는 그 대사나 효소형태(enzyme patterns), 세포 표면구조 등이 정상세포와는 다르게 나타나게 된다 (Raymond W. Ruddon, Cancer : A disease of abnormal differentiation, Cancer Biology, 2nd edition: 69, 1987).

상기 미분화된 암세포의 출현기전에 대해서는 아직 확실히 알려진 바는 없으나 그 주된 쟁점은 분화가 완료되었던 성숙세포(adult cell)가 비분화(dedifferentiation)된 것인지 또는 미분화(undifferentiation) 상태에 있던 세포들이 분화의 능력을 잃어버린 것인지 하는 점에 있다. 지금까지 보고된 바에 의하면 암세포로의 변형(transformation)은 증식능력을 가지고 있는 세포에서만 일어난다고 하며, 어떤 경로로의 단기의 운명이 결정되어진 세포의 분화는 비가역적인 반면 최종분화(terminal differentiation) 과정만은 가역적인 것으로 알려져 있다 (D. Yaffe, Cellullar aspects of muscle differentiation in vitro, In vitro current Topics in developmental biology, 4:39, 1969). Pierce 등(G.B. Pirce, Differentiation of normal and malignant cells, Fed. Proc. 29:1248, 1970)은 재생능력을 가지고 있는 정상조직 간세포가 악성종양의 근원이라는 주장을 하였는데 이는 지속적인 증식능을 가진 미분화 세포의 생성이라는 점에서는 암과 일치한다. 그러나 최근에 암세포에서 보여지는 이상(abnormality)이 완전히 비가역적인 것은 아니라는 것이 밝혀졌다. 그 대표적인 예가 분화유도제를 사용하여 암세포를 정상세포로 또는 그와 유사하게 분화유도시키는 방법으로서 백혈병(leukemia) 세포나 간세포(hepatocyte), 섬유아세포(fibroblast) 등에서 많이 시도되어지고 있다(Alphonse Krystosek and Leo Sachs, Control of lysozyme induction in the differentiation of myeloid leukemic cells, Cell, 9:675∼684, 1976; Shin-ichi Murao, M. Anne Gemmell, Michael F. Callaham, N. Leigh Anderson and Eliezer Huberman, Conntrol of macrophage cell differentiation in Human Promyelocytic U-937 leukemia cells by 1,25-dihydroxy vitamin D₃and phorbol-12 myristate-13-acetate, Cancer Research, 43:4989∼4996, 1983). 이는 기존의 세포독성을 기초로 하는 항암제들과는 달리 새로운 경로로의 치료를 시도하는 것으로서 그 의의가 크다고 할 수 있다. 더욱이 기존에 사용하던 항암제들 중에서도 세포독성을 나타내는 농도보다 저농도에서 세포의 분화유도작용이 있는 것들이 알려지고 있어 저농도 사용에 따라 심각한 항암제의 부작용을 줄일 수 있다는 점에서도 상당히 고무적인 것으로 받아들여진다.

실제로 급성 전골수세포 백혈병(acute promyelocytic leukemia, APL)의 경우에는 기존에는 도우노마이신(daunomycin)을 이용한 다제병용요법이 주로 시행되어 왔으나 최근에는 분화유도제로 알려진 활성형 비타민 A를 임상에서도 사용하는 것으로 알려졌다. 1988년 11월 미국의 혈액학회지에 따르면 22례의 APL에 레티노인산을 다량으로 내복시킨 결과 96%가 완전히 관해된 것으로 보고되었다. 이 후 미국, 프랑스, 일본 등지에서도 많은 기관들이 이 치료법에 참가하여 평균 80% 이상의 관해율에 관해에 이르는 일수도 평균 29일 정도로서 경이적인 치료효과를 인정받았다. 더욱이 부작용은 피부의 건조나 위장장애 등으로 다른 항암제에 비해서는 경미한 편이었다. 이로서 분화유도제의 항암제로서의 잇점은 상당히 인정받은 것이다.

즉, 종래의 항암요법제들은 주로 그 작용기전이 DNA의 복제를 억제하거나 세포내 대사와 생합성을 감소하거나 자유라디칼(free radical)을 생성시키는 등 세포독성을 주로하는 것들로서 증식이 빠른 암세포에 작용해 세포를 죽이는 것을 목적으로 하고 있으므로 상당히 고용량의 약물이 필요하게 되어 신체내의 골수를 비롯한 세포증식이 빠른 부위와 항암제의 복용과 대사, 배설에 사용되어지는 위장관, 간장, 신장, 심혈관계 등이 많은 타격을 받게 된다. 이에 따라 치료 목적외의 심각한 부작용에 의해 환자들의 고통이 커 실제적으로 항암제의 투여가 많은 제약을 받고 있다. 따라서, 세포독성이외의 독성이 적은 새로운 기전 즉, 암세포 분화유도기전의 항암제 개발이 요구되어 지고 있다.

최근 세포독성이 비교적 적은 항암제로서 한국산 참당귀로부터 분리한 데커신(decursin)이 세포독성과 함께 세포내 신호전달을 활성화시키는 것으로 보고된 바 있으나(Ahn et al. Decursin, a cytotoxic agent and protein kinase C activator from the root of Angelica gigas Nakai. Planta Medica, 62, 7-9, 1996), 상기 데커신이 암세포 분화능력이 있는지에 대하여는 전혀 언급된 바 없다.

이에, 본 발명자들은 종래의 기전과 상이한 기전 즉, 암세포의 분화를 효과적으로 유도할 수 있는 암세포 분화유도제를 개발하고자 연구를 거듭한 결과, 종래에 세포독성이 있다고 알려진 바 있는 당귀의 성분중 하나인 데커신이 우수한 암세포 분화효과를 가진다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 데커신을 유효성분으로 포함하고 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암세포 분화유도제 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 데커신을 유효성분으로 포함하고 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 인체 백혈병 암세포(human leukemia cell) 분화유도제 조성물을 제공하는 것을 포함한다.

본 발명은 암세포 분화유도제 성분으로서 데커신을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

데커신은 당귀에서 추출되는 성분으로서 1966년 일본에서 최초로 바디나물(Angelica decursiva Fr. et Sav.)에서 분리된 천연물질이며 데커신이 한국산 당귀(Angelica gigas Nakai)에 데커신이 다량 함유되어 있다는 것은 1967년과 1969년(J. Pharm. Soc. Korea, 11, 22-26, 1967 및 13, 47-50, 1969) 밝혀졌으며 그 밖의 식물로는 기름나물(Peucedanum terebinthaceum Fisher et Turcz.)의 과실에서도 분리된 바 있다(한국약학회지 30(2), 73-78, 1986). 데커신의 약리작용에 대해서는 본 발명자들에 의해서 1993년 데커신이 약 10ppm 이상의 농도에서 자궁암, 백혈병, 간암 또는 대장암 세포주들에 대한 독성이 확인된 바 있다(한국특허 출원번호 93-17935).

본 발명에 따른 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 및/또는 첨가제를 포함할 수 있으며, 다양한 형태의 제형으로 제제화될 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 조성물은 락토오스, 전분 등의 부형제, 마그네슘 스테이레이트 등의 윤활제, 유화제, 현탁화제, 등장화제 등을 포함할 수 있으며, 경우에 따라 감미제 및/또는 향미제를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 조성물은 경구용 또는 비경구용 제형으로 제제화할 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 조성물은 통상의 정제, 캅셀제, 액제 등의 경구제형의 형태로 제제화될 수 있으며, 정맥주사, 복강주사, 피하주사 등의 비경구 제형의 형태로 제제화될 수 있다.

본 발명에 따른 의약조성물은 목적에 따라 그 투여량을 변경시켜 사용할 수 있으며, 체중 Kg 당 1 내지 300 mg 의 용량으로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 분화유도제 성분으로서 데커신을 포함하는 암세포 분화유도제 조성물은 암세포의 분화를 효과적으로 유도할 수 있다. 특히, 데커신은 하기 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이 인체 백혈병 암세포(human leukemia cell)의 분화를 효과적으로 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 기존에 확인된 데커신의 세포독성을 나타내는 농도보다 훨씬 낮은 농도에서 데커신이 암세포, 특히 인체 백혈병 암세포(human leukemia cell)의 분화유도 효능이 있으므로, 데커신의 암세포 분화유도 기전을 이용한 새로운 암치료제로서 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

실시예 1. 데커신의 세포분화유도활성 시험

한국세포주 은행에서 분양받은 U-937은 RPMI 1640배지(시그마사, R-6504)를 사용하여 배양하였으며 10% 훼이탈 소 혈청 (fatal bovine serum, FBS)를 가하였다. 5일에 한번정도 70%씩 배지를 교환해 주었다. U-937 cell을 세포배양판(cell culture dish)에 2×10⁵cell/ml 농도로 시딩(seeding)한 다음 데커신을 농도 10^-8-10^-6M로 하여 CO₂인큐베이터에서 4일간 배양한 후에 트리판 블루 익스클루젼 시험(Trypan blue exclusion test)을 하여 염색되지 않은 세포의 수를 헤마사이토미터(hemacytometer)로 측정하여 암세포증식억제효과의 %를 산출하였다. 한편, 분화유도 물질의 처리로서는 데커신을 10^-2M로 에탄올 용액을 만들어 처리시에 배지에 희석하여 사용하였는데 이때 U-937 cell을 세포배양판에 2×10⁵cells/ml 농도로 접종한 다음 데커신 10^-7M을 처리하여 37℃, 5% CO₂인큐베이터에서 배양하였다.

니트로블루 테트라졸리움 (nitroblue tetrazolium, NBT) 환원시험에서는 1×10⁶cell/ml 정도 되도록 세포액을 잘 교반한 다음 2000rpm에서 5분간 원심분리하여 펠렛을 모은 다음 0.5ml의 배지에 현탁시키고, 포르밀-메싸이오닌 류신 페닐알라닌 (formyl-methionine leucine phenylalanine, fMLP) 10^-6M 용액과 NBT 1.0mg/DPBSml를 1:9로 혼합한 용액 0.5ml을 가하였다. 37℃ 에서 30분간 배양시킨 후 얼음수조(ice bath)에서 반응을 중지시키고 2000rpm에서 5분간 원심분리시킨 다음 상등액을 제거한 후 200㎕의 DPBS를 가하였다. 가볍게 흔들어준 다음 현미경으로 검정하여 최소 200개 이상을 관찰하여 NBT(+) 세포의 수를 %로 나타내었다.

식세포 작용(Phagocytosis) 시험에서는 10⁶cell 정도의 세포액을 잘 교반한 다음 2000rpm에서 5분간 원심분리하여 펠렛을 모은 다음 폴리스티렌 입자 0.2%/무혈청(serum free medium) 용액을 1ml 가한 다음 흔들어 주고 37℃에서 4시간 배양하였다. 인산 완충 생리식염수 (phosphate buffered saline, PBS)로 3회 이상 세척한 후 세포펠렛을 얻어 200㎕정도의 DPBS를 가하였다. 가볍게 흔들어 준 다음 현미경으로 검정하여 최소 200개 이상을 관찰하여 입자를 함유한 세포의 수를 %로 나타내었다.

에스터라제(estrase) 활성시험중 α-나프틸 아세테이트 에스터라제 활성측정에서는 U-937의 세포배약액을 2000rpm에서 5분간 원심분리하여 세포 펠렛을 얻은 다음 100㎕의 PBS를 가해 세포농축액을 만들었다. 슬라이드 글라스에 세포액을 한방울 가하여 1시간 이상 건조시킨후 40ml 탈이온수를 37℃로 미리 가온시켜 놓은후 소듐 나이트레이트 용액 1ml 과 훼스트 블루 BB 기제 용액 (Fast Blue BB Base Solution) 1ml 을 섞은후 2분간 방치후 갈색이 짙은 노랑으로 변한후 미리 가온한40ml 탈이온수에 가하였다. 5ml의 TRIZMAL TM 7.6 완충용액 (시그마사 870-2) 과 1ml a-나프틸 아세테이트 용액을 가해 녹색으로 액이 변한 후 페트리디쉬에 액을 부었다. 슬라이드 글라스의 세포를 상온의 시트레이트-아세톤-포름알데히드 용액 (Citrate-Acetone-Formaldehyde, CAF 용액)으로 고정후 앞의 액에 담가 30분간 37 ℃의 암소에서 배양하였다. 탈이온수로 2분 이상 완전히 세척한 다음 헤마톡시린(Hematoxylin) 용액으로 2분간 역염색(counterstain)하고 수도수로 세척한후 공기중에서 건조시켰다. 완전히 마른후 현미경으로 관찰하여 검게 보이는 세포의 수를 세어 %내었다.

나프톨 AS-D 클로로아세테이트 에스터라제 (Naphthol AS-D Chloroacetate esterase) 활성측정에서는 U-937의 세포배양액을 2000rpm에서 5분간 원심분리하여 세포 펠렛을 얻은 다음 100㎕의 PBS를 가해 세포농축액을 만들었다. 슬라이드 글라스에 세포액을 한방울 가하여 1시간 이상 건조시킨후 40ml 탈이온수를 37℃로 미리 가온시켜 놓은후 소듐 나이트레이트 용액 1ml 과 훼스트 레드 바이올렛 LB 기제 용액 (Fast Red Violet LB Base Solution) 1ml 을 섞은후 2분간 방치후 미리 가온한 40ml 탈이온수에 가하였다. 5ml의 TRIZMAL TM 6.3 완충용액 (시그마사 T-3128)과 1ml 나프톨 AS-D 클로로아세테이트 용액(naphthol AS-D chloroacetate solution)을 가해 붉게 액이 변한후 페트리 디쉬에 액을 부었다. 슬라이드 글라스의 세포를 상온의 시트레이트-아세톤-포름알데히드 용액으로 고정후 앞의 액에 담가 30분간 37 ℃의 암소에서 배양하였다. 탈이온수로 2분 이상 완전히 세척한 다음 헤마톡시린 용액으로 2분간 역염색(counterstain)하고 수도수로 세척한후 공기중에서 건조시켰다. 완전히 마른후 현미경으로 관찰하여 붉게 보이는 세포의 수를 세어 %내었다.

(1) 성장억제 시험

하기 표1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 데커신의 U-937에 대한 96시간 이후의 성장억제율을 측정한 결과,10^-7-10^-6M에서 30-50%의 세포성장저해 효과가 있었으며 5×10^-7M과 10^-6M에서는 비타민 D₃보다 효과가 더 좋았다.

성장억제 시험결과

농도	성장억제율 (%)
농도	비타민 D₃	데커신
1x10^-6M5x10^-7M1x10^-7M5x10^-8M1x10^-8M	54.0±6.748.0±6.042.5±6.433.5±0.726.0±5.7	52.0±2.848.0±7.142.0±6.435.5±7.431.0±7.8

(2) NBT 환원시험

분화된 백혈구 세포가 자극에 의해 슈퍼옥사이드 음이온을 생성할 수 있음을 이용하여 분화의 여부를 보고자 하였다. 데커신 10^-7M과 비타민 D₃10^-7M을 처리하고 4일간 배양한 후 슈퍼옥사이드와 반응하면 환원되어 침전물을 형성하는 NBT를 가하여 실험한 결과는 하기 표2와 같다. 하기 표2에서 확인할 수 있는 바와 같이, NBT 환원능을 보인 양성 세포(positive cell)가 미처리군(control)의 경우 14%인데 비해 비타민 D₃10^-7M을 처리한 경우 39%로 NBT 양성 세포가 증가되었으며, 데커신을 같은 농도로 처리한 경우 43%의 양성세포를 보였다.

NBT 환원시험결과

농도	미처리군	데커신	비타민 D₃
1x10^-7M	14.2 ± 2.1	43.1 ± 4.0	39.0 ± 2.1

(3) 식세포작용 시험

데커신 10^-7M과 비타민 D₃10^-7M을 처리하고 4일을 배양한 후 U-937의 분화에 따른 기능의 변화를 보기 위해 식세포 작용능을 측정한 결과는 하기 표3과 같다. 하기 표3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 미처리의 세포에서는 5%정도의 세포에서 식세포 작용능을 보였으며, 비타민 D₃10^-7M을 처리한 경우에는 25.8%, 데커신 10^-7M을 처리한 경우에는 28.6%의 식세포 작용능을 보였다.

식세포작용 시험결과

농도	미처리군	데커신	비타민 D₃
1x10^-7M	4.8 ± 0.8	28.6 ± 1.2	25.8 ± 1.3

(4) 에스터라제 활성시험

그래뉼로사이트 유사 세포 (Granulocyte like cell)로 분화되면 발현되는 효소인 나프톨 AS-D 클로로아세테이트 에스터라제와 마크로파지 유사 세포 (macrophage like cell)로 분화되면 발현되는 효소인 α-나프틸 아세테이트 에스터라제의 활성을 측정한 결과는 다음 표 4와 같다. 하기 표4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 나프톨 AS-D 클로로아세테이트 에스터라제의 활성은 모두 0.0%의 활성을 보인 반면 α- 나프틸 아세테이트 에스터라제의 경우는 미처리군에서는 10%내외에서 효소의 활성을 나타내었으나 비타민 D₃10^-7M의 처리군에서는 80%내외, 데커신 처리군에서는 83%정도의 활성을 보여 마크로파지 유사 세포로 분화된 것으로 생각된다.

에스터라제 활성시험결과

효소	활성 (%)
효소	대조군(Control)	비타민 D₃	데커신
α-나프틸 아세테이트 에스터라제나프톨 AS-D 클로로아세테이트 에스터라제	10.5 ±0.70.0	79.3 ±4.50.0	83.3 ±3.00.0

상기의 결과로부터 데커신이 암세포 분화유도제로서의 효능을 가짐을 확인할 수 있다. 즉, 데커신과 비타민 D₃를 이용해 인체유래의 U-937에 대해 세포독성을 10^-8M∼10^-6M 농도에서 측정해 본 결과 높은 세포독성을 보였으며, 5×10^-7M과 10^-6M에서는 데커신이 비타민 D₃보다 더 높은 세포독성을 나타내었다. 33% 정도의 세포독성을 나타내는 데커신 10^-7M에 대해 U-937에 대한 세포분화유도작용이 있는지를 알아보기 위해, 활성형 비타민 D₃를 비교물질로 하여 4일간 처리시킨 후 NBT 환원시험, 식세포작성시험을 수행하였으며, 그 결과 데커신 10^-7M이 NBT 환원시험, 식세포작성시험에서 비타민 D₃보다 약간씩 더 강한 분화능을 보였고, 그 분화는 마크로파지 유사 세포로 분화되었다. 따라서 데거신이 효과적인 암세포 분화유도제로서의 효능을 가짐을 확인할 수 있다.

실시예 2. 데커신의 정상세포에 대한 독성시험

데커신의 정상세포에 대한 독성여부는 배지 3% 훼이탈 소혈청 (fatal bovine serum, FBS), 페니실린 (100U/ml)과 스트렙토마이신 (100㎍/ml)이 포함된 배지-199 를 이용해 3-4일 마다 계대배양후 트립신을 처리해 세포부유액을 만들어 24 웰(well)에 2×10⁵cell/ml 농도로 1ml를 시딩(seeding)후 하루동안 부착시킨후 상등액 제거하고 농도별로 만든 데커신 1ml를 가해 3일간 배양후 세포수를 세었다. 그 결과는 표5와 같다. 하기 표5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 정상세포인 LLC-PK1에 대한 독성은 10^-6M 까지는 없는 것으로 나타났다.

정상세포에 대한 세포독성 시험결과

농도	성장 억제율 (%)
농도	비타민 D₃	데커신
1x10^-6M5x10^-7M1x10^-7M5x10^-8M1x10^-8M	9.0 ±0.74.0 ±0.14.0 ±0.20.0 ±0.00.0 ±0.0	0.0 ±0.00.0 ±0.00.0 ±0.00.0 ±0.00.0 ±0.0

상기에서 확인할 수 있는 바와 같이, 데커신은 효과적으로 암세포의 분화를 유도할 수 있는 암세포 분화유도체이며, 특히, 데커신은 인체 백혈병 암세포(human leukemia cell) 의 분화를 유도할 수 있어 인체 백혈병 암세포의 분화유도제로서 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

데커신(decursin)을 유효성분으로 포함하고 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암세포 분화유도제 조성물.
제1항에 있어서, 암세포가 인체 백혈병 암세포(human leukemia cell)인 것을 특징으로 하는 분화유도제 조성물.