JP2002527476A

JP2002527476A - デカーシンを含む医薬組成物

Info

Publication number: JP2002527476A
Application number: JP2000576849A
Authority: JP
Inventors: セヨウンチョン; イクワンキム; キュンセオプアン; サンキキム
Original assignee: ビーネックスカンパニーリミテッド; セヨウンチョン; イクワンキム
Priority date: 1998-10-22
Filing date: 1999-10-21
Publication date: 2002-08-27
Anticipated expiration: 2019-10-21
Also published as: JP4153663B2; AU6370399A; KR100504405B1; EP1123097B1; KR20010080265A; CA2347750A1; ATE268175T1; WO2000023074A1; US6525089B1; DE69917796D1; CA2347750C; EP1123097A1; AU767663B2; DE69917796T2

Abstract

(57)【要約】【課題及び解決手段】本発明はデカーシンを含み、医薬上許容しうる担体を含む腎毒性抑制剤組成物に関する。また、本発明は腎毒性の抑制剤としてデカーシンを含み、医薬上許容しうる担体を含む抗腫瘍剤組成物又は糖尿病治療剤組成物に関する。さらに、本発明はデカーシンを活性成分として含み、医薬上許容しうる担体を含む癌細胞分化誘導剤組成物、特に、ヒトの白血病細胞の分化組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】

本発明はデカーシン及び医薬上許容しうる担体を含む医薬組成物に関する。

【０００２】

【背景技術】

各種疾患の予防または治療に用いられている多くの医薬組成物は、腎毒性（すな
わち、腎臓における毒性）を含む多様な毒性を有しているため、それらの臨床使
用においては相応の注意を払う必要がある。特に、抗腫瘍組成物や抗生剤組成物
は腎毒性等の副作用が非常に重篤であるために、臨床使用が著しく制限されてき
た。例えば、シスプラチンは睾丸、食道、胃、膀胱、前立腺、肺及び子宮頚部の
多様な腫瘍や骨肉腫、特に生殖器の腫瘍の治療に用いられる抗腫瘍剤である。し
かしながら、アレルギーを含む腎臓、耳、胃腸管及び骨髄に対する重篤な毒性が
報告されている。これらの中でも、腎毒性はシスプラチンを高用量で長期間使用
する場合に腎不全を起こすほど深刻であり、そのためシスプラチンの臨床使用は
多くの制限を受けている。このような状況下で、シスプラチンを用いる種々の腫
瘍の治療において骨髄、胃腸管、及び特に腎臓におけるシスプラチンの毒性を減
少させることは臨床上重要である。

【０００３】シスプラチン使用に伴う腎毒性の緩和をめざして集中的に研究がなされてきた。
現在、腎毒性を軽減させるための従来の方法には以下のようなものがある：第一
に、シスプラチンよりも毒性の低いプラチナ誘導体の合成があり、その一例がカ
ーボプラチンである。しかしながら、この腎毒性はシスプラチンより低いが、骨
髄毒性が非常に強い。別の方法としては、毒性を低下させるために排泄を促進さ
せることがある。この目的で、マンニトール又は高張性食塩水が併用投与される
。しかしながら、この方法はシスプラチンの半減期を短くするものであり、その
結果、抗腫瘍効果を低下させてしまう。第三の方法として、シスプラチンの毒性
を減少させるように、二経路化学療法(TRC)により解毒剤と共に抗腫瘍剤を投与
する方法がある。この目的で、次硝酸ビスマス又はセレニウムが併用投与される
。しかしながら、この方法は重金属の体内蓄積のような副作用をもたらすことが
考えられる。

【０００４】一方、ヒトの身体の正常細胞は全て、一定範囲までの増殖と、それに続く不可欠
な過程としての分化により形成される。このような増殖と分化の過程は遺伝子レ
ベルで調節されるものと考えられている。しかしながら、癌細胞は正常細胞とは
異なり、正常組織に由来するという事実にもかかわらず、何らかの分化を経るこ
となく無制限に増殖する未成熟な細胞から成る。その結果、癌細胞は細胞の代謝
、酵素パターン及び表面構造において正常細胞とは異なっている(Raymond W. Ru
ddon, Cancer : A disease of abnomal differentiation, Cancer Biology, 2nd
edition: 69, 1987)。

【０００５】このような未分化の癌細胞の発生メカニズムは未だ報告されていない。しかしな
がら、癌細胞の発生に関する主たる論争は、分化が完了した成熟細胞が脱分化す
るのか、或いは未分化の細胞が分化の能力を失うのか、いずれなのかという点に
集中している。これまでの報告によると、癌細胞への形質転換は増殖能力を有す
る正常細胞にのみ起きる；一定経路への短期の運命がすでにプログラムされてい
る細胞の分化は非可逆的な一方で、その最終的分化は可逆的である (D. Yaffe,
Cellullar aspects of muscle differentiation in vitro, In vitro current T
opics in developmental biology, 4:39, 1969)。

【０００６】 Pierceらは再生能力を有する正常組織の幹細胞が悪性腫瘍の根源であると報告し
た(G. B. Pirce, Differentiation of normal and malignant cells, Fed. Proc
. 29: 1248, 1970)。幹細胞は持続的な増殖能を有する未分化細胞の生成物であ
るという意味では癌細胞と一致する。しかしながら、最近の研究から癌細胞の異
常性が完全に非可逆的というわけではないことが明らかになった。白血病、肝細
胞及び腺維芽細胞にしばしば用いられる従来の方法は、分化誘導剤を用いて癌細
胞に分化を誘導し正常細胞又はそれに類似の細胞にするものである(Alphonse Kr
ystosek and Leo Sachs, Control of lysozyme induction in the differentiat
ion of myeloid leukemia cells, Cell, 9: 675〜684, 1976; Shinichi Murao,
M. Anne Gemmell, Michael F. Callaham, N. Leigh Anderson and Eliezer Hube
rman, Control of macrophage cell differentiation in human promyelocytic
U-937 leukemia cells by 1,25-dihydroxy vitamin D₃ and phorbol-12 myrista
te-13-acetate, Cancer Research, 43:4989-4996, 1983)。この方法は従来の細
胞毒性メカニズムに基づく抗腫瘍剤とは異なり、新しい経路での腫瘍治療を試み
るものとして意義がある。さらに、従来の抗腫瘍剤のあるものは細胞毒性を示す
濃度よりも低濃度で分化誘導作用を示すことが報告されており、これは非常に低
濃度での使用により抗腫瘍剤の副作用を軽減できるという意味において非常に励
みになることとして受け止められる。

【０００７】実際に、従来はダウノマイシンを用いた多剤併用療法が主に行われてきた急性前
骨髄球白血病(APL)に、分化誘導剤として知られる活性形ビタミンAが臨床で用い
られている。1988年11月発行の米国血液学会紙によると、22名のAPL患者にレチ
ノイン酸を多量に投与したところ、96%が完全緩解したことが報告されている。
その後、米国、フランス、日本等でも多くの医療機関がこの方法を採用し、29日
の平均緩解日数で80%以上の平均緩解率が得られた。さらに、皮膚の乾燥や胃障
害を含む副作用が見られたが、その深刻さは他の抗腫瘍剤に比べて軽かった。そ
のため、分化誘導剤は有益な抗腫瘍剤として世界中の医療界から認知されている
と言うことができる。

【０００８】従来の抗腫瘍剤において治療上の作用様式は、DNA複製の阻害、細胞内代謝や生
合成の低下、又はフリーラジカルの生成により増殖の早い癌細胞を殺傷する細胞
毒性に関係している。そのため、非常に高用量の抗腫瘍剤が必要とされてきた。
この場合、骨髄のような細胞増殖がかなり速い種々の器官や、胃腸管、肝臓、腎
臓及び心血管組織のような抗腫瘍剤が代謝及び排泄される器官で副作用が予想さ
れる。実際、そのような深刻な副作用のためにこれらの抗腫瘍剤の投与は著しく
制限される。従って、毒性の低い新規の抗腫瘍剤、すなわち、癌細胞の分化誘導
作用を有する抗腫瘍剤の開発が強く求められている。

【０００９】デカーシンは1966年に日本で最初にAngelica decursiva(Fr. Et Sav.)から単離
された天然産物である。韓国産トウキ(Angelica gigas Nakai)にデカーシンが多
量に含まれていることが1976年及び1969年に報告された(J. Pharm. Soc. Korea,
11: 22-26, 1967 及び 13: 47-50, 1969)。さらに、デカーシンはPeucedanum t
erebinthaceum(Fisher et Turcz.)の果実からも単離された(Korea Pharmacolpgy
Journal 30(2), 73-78, 1986)。デカーシンの薬理作用に関しては、1993年に本
発明者らはデカーシンが 10 ppm以上の濃度で子宮癌、白血病、肝臓癌又は大腸
癌の種々の細胞系で毒性を有することを見出した(韓国特許出願第93-17935号参
照)。

【００１０】

【発明の開示】

本発明者らは長期間、鋭意研究を重ねた結果、デカーシンの様々な用途を発見し
本発明を完成させるに至った。本発明の目的は、デカーシンを活性成分として含み、医薬上許容しうる担体を含
む、腎毒性抑制剤組成物を提供することにある。

【００１１】本発明の他の目的は、腎毒性抑制剤としてのデカーシン、抗腫瘍剤及び医薬上許
容しうる担体を含む、抗腫瘍剤組成物を提供することにある。本発明のさらに他の目的は、腎毒性抑制剤としてのデカーシン、糖尿病治療剤及
び医薬上許容しうる担体を含む、糖尿病治療剤組成物を提供することにある。本発明のさらに他の目的は、デカーシンを活性成分として含み、医薬上許容しう
る担体を含む癌細胞分化誘導剤組成物を提供することにある。

【００１２】

【発明の実施の形態】

本発明は、デカーシンを含む医薬組成物に関する。本発明によれば、腎毒性抑制剤としてデカーシンを含む医薬組成物は、本医薬に
伴う腎毒性を効果的に抑制することができる。特に、下記の実施例中に見ること
ができるように、デカーシンは代表的な抗腫瘍剤であるシスプラチンの腎毒性を
効果的に抑制することができ、同様に代表的な糖尿病の誘発物質であるアロキサ
ンによる腎毒性も効果的に抑制することができる。

【００１３】従って、本発明の医薬組成物はデカーシンを活性成分として含む腎毒性抑制剤組
成物の形態でもよい。さらに、本発明の医薬組成物は、腎毒性抑制剤としてデカーシンを含む抗腫瘍組
成物の形態でもよい。この場合、抗腫瘍剤１モルに対して１〜５モルのデカーシ
ンを使用してもよく、抗腫瘍剤の例としてシスプラチンを挙げることができる。
さらに、本発明の医薬組成物は、腎毒性抑制剤としてデカーシンを含む糖尿病治
療剤組成物の形態でもよい。この場合、糖尿病治療剤１モルに対して0.2〜10モ
ルのデカーシンを使用してもよい。

【００１４】腎毒性抑制剤としてデカーシンを含む本発明の医薬組成物の用量は目的により変
化させることができる。本組成物は体重１kg当たり１〜500 mgの用量で投与する
ことができる。

【００１５】デカーシンによる腎毒性抑制作用のメカニズムは未だ明らかではないが、デカー
シンの強力な抗酸化作用によるスカベンジャー効果によってもたらされるものと
考えられる。例えば、シスプラチンの腎毒性は体内中に既に分配されたシスプラ
チンが速やかに排泄される際に腎臓の近位尿細管に吸収された後に化学走性によ
り好中球が誘導及び刺激されて、その結果、好中球から分泌される酸素ラジカル
が周囲の正常組織に損傷を与えるという典型的な炎症過程として説明することが
できる。従って、フリーラジカルに対するスカベンジャーとして作用する抗酸化
剤がシスプラチンの腎毒性を軽減させるものと考えられる。しかしながら、この
目的には以下の必要条件が挙げられる。第一に、上記の過程中で抗酸化剤が体内
に適切に分配されなければならない。第二に、癌細胞が抗酸化剤を吸収し自らを
保護することがないように、上記の抗酸化剤は体内で生産され腎臓を含む身体全
組織で必要とされる生体物質であってはならない。第三に、上記の抗酸化剤は容
易に代謝を受けて不活性化されたり肝臓に強い親和性を持っていてはならない。
なぜならばそれにより腎臓への分配が遅れたり分配量が低下したりするためであ
る。言い換えれば、デカーシンはフリーラジカルのスカベンジャーとして有効に
作用するための上記の三つの要件を備えており、よって有効に腎毒性を抑制する
ものと考えられる。

【００１６】次に、癌細胞の分化誘導剤としてデカーシンを含む本発明の医薬組成物は目的に
よってその用量を変化させることができる。本医薬組成物は体重１kg当たり１〜
300 mgの用量で投与することができる。

【００１７】活性成分としてデカーシンを含む本発明の組成物は、癌細胞の分化を効果的に誘
導することができる。特に、下記の実施例中に見ることができるように、デカー
シンはヒトの白血病細胞の分化を効果的に誘導することができる。言い換えれば
、デカーシンが細胞毒性を誘導する濃度よりはるかに低い濃度で癌細胞、特にヒ
トの白血病細胞の分化を誘導できるために、本発明の組成物は新規の抗腫瘍組成
物として使用することができる。

【００１８】デカーシンを含む本発明の医薬組成物は、医薬上許容しうる担体、賦形剤及び／
又は添加剤を用いた種々の投与形態に処方することができる。より詳しく言えば
、本発明の医薬組成物はラクトース、澱粉等の賦形剤、ステアリン酸マグネシウ
ム等の潤滑剤、乳化剤、懸濁化剤及び等張化剤を含むことができ、必要ならば甘
味料及び／又は香料を含むこともできる。さらに、本発明の医薬組成物は経口用
又は末梢用投与形態に処方することができる。経口用投与形態としては錠剤、カ
プセル剤及び液剤が挙げられ、末梢用投与形態としては静脈内注射、腹腔内注射
及び皮下注射が挙げられる。

【００１９】本発明を以下の実施例を通じてより詳しく説明するが、それらの実施例は本発明
の範囲を制限するるものではない。

【００２０】

【実施例】実施例１：シスプラチン使用に伴う腎毒性に対するデカーシンの効果体重減少、腎毒性及び肝毒性のようなシスプラチン使用に伴う副作用に対するデ
カーシンの抑制効果を測定するために、シスプラチン及びデカーシンの混合物を
正常SDラットに投与量、投与時期及び投与回数を変えて投与した。詳細な試験方
法を以下に要約する。血中の腎毒性指標としてBUN(血中尿素窒素)及びクレアチ
ニン、肝毒性指標としてsGPT、尿潜血、ビリルビン、ウロビリノーゲン、ケトン
、蛋白、ナイトライト、グルコース、pH及び比重を以下のように測定した。

【００２１】 (1) BUNの測定 BUN値は、BUN測定用キット(ヨンドン製薬、韓国)を用いて以下の手順で測定した
。ウレアーゼ 0.1 mlをバッファー溶液 20 ml加え酵素バッファー溶液を得た。こ
の溶液を２本の試験管にそれぞれ加え、一方の試験管には試験する血清サンプル
0.02 mlを加え、もう一方の試験管には対照として基準溶液（ウレア-N 60 mg/1
00 mlを含む）0.02 mlを加えた。これら２本の試験管を37℃で15分間インキュベ
ートした。その後、各試験管に発色溶液２mlを加え、37℃で再び５分間インキュ
ベートした。570 nmの吸光度を測定し、BUNの量を測定した。

【００２２】 (2) クレアチニンの測定クレアチニン値は、クレアチニン測定用キット(ヨンドン製薬、韓国)を用いて以
下の手順で測定した。試験する血清サンプル 0.5 mlにタングステン溶液４mlを加え、激しく撹拌した
後10分間放置した。その後、この混合液を1500xgで10分間遠心し、上澄を分離し
た。上澄、クレアチニン基準溶液及び蒸留水(ブランク試験用)をそれぞれ３mlず
つ別々の試験管に入れ、それぞれにピクレート溶液各１mlを加えた。その後、各
試験管に1.4N NaOH 0.5 mlを加えて撹拌し、正確に15分後に515 nmの吸光度を測
定した。

【００２３】 (3) sGPTの測定 sGPT値は、sGPT測定用キット(ヨンドン製薬、韓国)を用いて以下の手順で測定し
た。 GPT基質溶液（各１ml）を37℃で３分間インキュベートした。この基質溶液に血
清サンプル0.2 mlを加え、再び37℃で30分間インキュベートした。この培養溶液
に2,4-ジニトロフェノール１mlを加えて20分間放置した後、0.4N NaOH 10 mlを
加えてよく撹拌した。505 nmの吸光度を測定した。

【００２４】 (4) 尿検査尿検査は尿テストストリップ(Gen 9；ヨンドン製薬、韓国)を用いて以下の手順
で行った。ラットから尿を回収後直ちにテストストリップにその尿をつけ、１分以内に色を
観察した。

【００２５】この実験では、全部で10匹の雄SD系ラット(体重200g)を使用した。動物を各４匹
ずつの２群に分け、残り２匹のうち１匹を対照(シスプラチンのみを 5.8 mg/kgの
用量で腹腔内に注射した群) として選び、他の１匹を正常群(薬剤投与をしない
群)とした。第一群(前投与群)にはシスプラチン(5.8 mg/kg)を腹腔内投与する48
時間前、24時間前及び１時間前の３回、腹腔内にシスプラチンをデカーシン対シ
スプラチンが3:1のモル比となる17.4 mg/kgの用量で投与した。第二群(後投与群
)にはデカーシン(17.4 mg/kg)を腹腔内投与した１時間後、24時間後及び48時間
後の３回、腹腔内にシスプラチンをデカーシン対シスプラチンが3:1のモル比と
なる5.8 mg/kgの用量で投与した。試験の開始時(０日)にラットの体重を測定し
た。投与の４日後にラットを屠殺し、体重を測定した。尿検査はシスプラチンを
投与した後から実施し、シスプラチンにより誘導される腎毒性を観察した。試験
開始から４日後に全てのラットを屠殺した。採取した血液を30分間放置し血清を
分離した。分離された血清を用いて、上記の方法により腎毒性の指標であるBUN
及びクレアチニン値と肝毒性の指標であるsGPT値を測定した。結果を以下の表１
〜３に示す。

【００２６】

【表１】

【００２７】表１に示すように、シスプラチン投与群は腎毒性の指標であるBUN及びクレアチ
ニン値がそれぞれ69.5 mg/dl及び3.68 mg/dlと測定され、深刻な腎毒性が示され
た。それに対して、デカーシンを投与した群においてはBUN値が、前投与群では1
7.5±2.8 mg/dl(正常値は20未満)、後投与群では55.2±2.1 mg/dlであった。前
投与群のBUN値は完全に正常値まで回復したが、後投与群では腎毒性が若干緩和
されたものの、正常値とは有意の差が見られた。

【００２８】クレアチニン値は前投与群では0.74±0.29 mg/dl(正常値は１未満)で、正常レベ
ルに完全に回復した。それに対して、後投与群でのクレアチニン値は2.08±0.52
mg/dlであり、シスプラチンを投与した対照群に比べると約40%の腎毒性低下が
見られた。

【００２９】さらに、デカーシン投与後の腎毒性の軽減が、シスプラチンの蓄積が腎臓から肝
臓に移動したことによるものかどうかを見るために、血中sGPT値の変化を観察し
た。前投与群及び後投与群のいずれも、それぞれ、10.8±4.9及び19.0±5.3とい
う正常値を示した。その結果、シスプラチンの投与で肝毒性は現れなかったこと
が明らかとなり、これは他の文献で公表されている結果に一致する。

【００３０】

【表２】

【００３１】上記の表２で確認されるように、対照群では尿中潜血、ビリルビン、ウロビリノ
ーゲン、ケトン、蛋白、グルコース及び比重等の種々のパラメーターで顕著な増
加が見られた。それに対して、前投与群では上記パラメーターは正常レベルに低
下していた。しかしながら、後投与群における腎毒性はシスプラチン投与群に比
べてパラメーターによっては軽減しているといえる。

【００３２】

【表３】

【００３３】上記の表３から確認されるように、デカーシンを１時間、24時間、48時間に３回
投与した前投与群及び後投与群の両方で体重は減少した。しかしながら、シスプ
ラチン単独投与群よりも体重減少幅は少なかった。

【００３４】上記の結果から、シスプラチン投与前１時間、24時間、48時間にデカーシンをラ
ットに投与すると、肝毒性を誘導することなく腎毒性活性を効果的に抑制したこ
とが示されている。

【００３５】実施例２. 糖尿病合併症に伴う腎不全を抑制するデカーシンの効果 ICR系マウスにアロキサン(75mg/kg, 静脈注射)を投与した２日後に空腹時の血糖
を測定し高血糖マウスを選別した。高血糖マウスを二群に分け、一群には生理食
塩水を、もう一方の群にはデカーシンを50 mg/kgの用量で10日間経口投与した。
アロキサン非投与群にも生理食塩水を10日間経口投与した。定期的に尿検査と共
に体重も測定した。血清及び腎臓を単離するためにマウスをエーテルで軽く麻酔
して開腹した。血液サンプルを心臓から採取し血清を分離した。腎臓は0.9% NaC
lで灌流し血液を除去した後に単離した。次いで右側の腎臓の重さを測定した。
さらに、腎臓組織中の蛋白量を測定するために、牛血清アルブミンを標準物質と
して Bio-Rad プロテインアッセイキットを使用してBradford法でこれらの組織
をアッセイした。腎臓組織中の MDA測定には、10%の腎臓組織ホモジネート溶液
0.5 mlに10%ソジウムドデシルスルフェート 0.4 mlを加え、37℃の水浴中に30分
間置いた。次いで0.1N-HCl (2 ml)及び 0.67% TBA (1 ml)を加え、この混合液を
ボルテックスにかけ、沸騰水浴中に30分間置いた。さらにこの混合液を氷浴中で
２〜３分間冷却して反応を停止させた。次いで、n-ブタノールを２ml加えてよく
攪拌した後、3000 rpmで10分間遠心分離した。上澄を回収して 532 nmの吸光度
を測定した。標準物質としては10μg/mlテトラエトキシプロパン(TEP)を使用し
た。血清中の MDAを測定するために、血清0.5 mlに0.8%チオバルビツール酸(TBA
)を加え、沸騰水浴中に30分間置いた。さらに氷浴上で２〜３分間冷却して反応
を停止させた。上澄を回収して、532 nmの吸光度を測定した。標準物質としては
10μg/ml TEPを使用した。

【００３６】マウスにデカーシンを50 mg/kgの用量で10日連続で経口投与した。腎不全の指標
である血中BUN及びMDAMDA等の種々のパラメーターを測定し、尿検査を実施した
。腎臓組織を単離してMDA値を測定したところ（表４）、アロキサン単独投与群
で17.4±3.7 mg/dlであったBUN値がデカーシン投与により正常レベル（4.8±0.6
mg/dl）に回復した。アロキサン単独投与群のMDA値は0.51±0.07であったもの
が、デカーシン投与により0.36±0.03に低下し、これは正常対照群と同等であっ
た。よって、腎臓損傷が完全に回復されたことがわかった。臨床的には血中及び
腎臓組織中の両方のMDA値が低下することが合理的かつ望ましいものであるため
、腎臓組織中のMDA値を測定した。その結果、アロキサン単独投与群で13.24±5.
93であった腎臓組織中のMDA値が、デカーシン投与により5.63±0.99に低下し、
これは正常対照群(8.44±1.01)よりも低い数値であった。従って、デカーシンが
腎臓組織保護において非常に有効であることが明らかになった。

【００３７】

【表４】

【００３８】上記の表５から確認されるように、尿検査においてもアロキサン投与により潜血
、ビリルビン、ウロビリノーゲン及びグルコースの排泄量が著しく増加し、同時
に比重も著しく増加したことが示された。それに対して、デカーシンを投与した
群では全てのパラメーターが正常値に近かった。この結果は血中BUN及びMDAの検
査結果と一致した。アロキサン単独投与群の体重減少は著しく鈍化した。

【００３９】

【表５】

【００４０】実施例３. デカーシンの細胞分化誘導活性韓国細胞株銀行から分譲されたU-937細胞を、10%ウシ胎児血清(FBS)を加えたRPM
I 1640培地(シグマ社、R-6504)中で培養した。５日毎に、70%ずつ培地を交換し
た。U-937細胞を細胞培養ディッシュ中に２×10⁵細胞/mlの濃度で接種した。次
いで、このディッシュにデカーシンを10^-8〜10^-6Mの濃度で加え、細胞を４日間
培養した。トリパンブルー排除試験を行い血球計を用いて生存細胞を計数し、癌
細胞増殖阻害パーセントを算出した。次いで、培地中で種々の量のデカーシンを
含む10^-2M希釈エタノール溶液で処理して分化を誘導した。 U-937細胞を細胞培養ディッシュ上に 10^-7M デカーシンを含む培地中２×10⁵細
胞/mlの濃度で接種し、37℃、5% CO₂インキュベイター中でインキュベートした
。

【００４１】ニトロブルーテトラゾリウム(NBT)還元試験では、細胞溶液（約１×10⁶細胞/ml
）をよく攪拌した後、2000 rpmで５分間遠心分離しペレットとした。このペレッ
トを0.5 mlの培地に懸濁させ、10^-6M ホルミル−メチオニンロイシンフェニ
ルアラニン(fMLP)及び NBT 1.0mg/DPBSml (1:9)を含む混合溶液 (0.5 ml)を加え
た。この混合液を37℃で30分間インキュベートした。氷浴中で反応を停止させ、
2000 rpmで５分間遠心分離した。上澄を除去した後、200μlのDPBSを加えた。こ
の溶液を軽く振とうした後、顕微鏡下で調べて最低200個以上を観察した。NBT(+
)細胞の数を%で示した。

【００４２】食菌作用試験では、10⁶個の細胞をよく攪拌した後、2000 rpmで５分間遠心分離
してペレットとした。ポリスチレン粒子中 0.2% 無血清培地溶液 1 mlをペレッ
トに加え、振とうして37℃で４時間インキュベートした。リン酸緩衝生理食塩水
(PBS)で３回洗浄した後、細胞ペレットを回収し、約200μlのDPBSを加えた。こ
の溶液を軽く振とうした後、顕微鏡下で調べて最低200個以上を観察した。粒子
を含む細胞の数を%で示した。

【００４３】エステラーゼ活性試験におけるα-ナフチルアセテートエステラーゼ活性を測定
するために、U-937細胞の培養溶液を2000 rpmで５分間遠心してペレットとし、
次いで 100μlの PBS を加えて細胞濃縮液を調製した。この細胞溶液をスライド
ガラス上に一滴置き、１時間以上乾燥させた。次いで 40 mlの脱イオン水を37℃
に予め加温しておいた。1 mlの硝酸ナトリウム溶液を 1 mlのファーストブルーB
Bベース溶液と混合し、２分間放置した。この混合液が濃い茶色と黄色に変わっ
た後に、予め加温しておいた脱イオン水 40 mlに加えた。5 mlの TRIZMAL TM 7.
6バッファー溶液(シグマ社、870-2)及び 1 mlのα-ナフチルアセテート溶液を加
え、得られた溶液が緑色に変わった後、ペトリディシュに注いだ。スライドガラ
ス上の細胞を室温でクエン酸塩−アセトン−ホルムアルデヒト溶液 (CAF 溶液)
で固定した。予め調製した溶液中に細胞を浸し、37℃の暗所で30分間インキュベ
ートした。細胞を脱イオン水で２分以上かけて完全に洗浄した後にヘマトキシリ
ン溶液で２分間対比染色し、水道水で洗浄した後、風乾した。完全に乾いた後、
細胞を顕微鏡で観察し、黒く見える細胞を計数した。

【００４４】ナフトール AS-D クロロアセテートエステラーゼ活性を測定するため、U-937細
胞の培養溶液を2000 rpmで５分間遠心分離してペレットとした後、100μlのPBS
を加えて細胞濃縮溶液を調製した。スライドガラス上に細胞溶液を一滴置き１時
間以上乾燥させた。次いで 40 mlの脱イオン水を37℃に予め加温しておいた。1
mlの硝酸ナトリウム溶液を 1 mlのファーストレッドバイオレットLBベース溶液
と混合し、２分間放置した。この混合液を予め加温しておいた脱イオン水 40 ml
に加えた。5 mlの TRIZMAL TM 6.3バッファー溶液(シグマ社、T-3128)及び 1 ml
のナフトール AS-D クロロアセテート溶液を加え、得られた溶液が赤色に変わっ
た後、ペトリディシュに注いだ。スライドガラス上の細胞を室温でクエン酸塩−
アセトン−ホルムアルデヒト溶液 (CAF 溶液)で固定した。予め調製した溶液中
に細胞を浸し、37℃の暗所で30分間インキュベートした。細胞を脱イオン水で２
分以上かけて完全に洗浄した後にヘマトキシリン溶液で２分間対比染色し、水道
水で洗浄した後、風乾した。完全に乾いた後、細胞を顕微鏡で観察し、赤く見え
る細胞を計数して%で示した。

【００４５】 (1) 成長抑制試験下記の表６から確認されるように、デカーシンの U-937細胞に対する96時間後の
成長抑制率を測定したところ、デカーシンは10^-7〜10^-6Mの濃度で30-50%の抑制
効果を示した。

【００４６】

【表６】

【００４７】 (2) NBT還元試験分化した白血球細胞が刺激によりスーパーオキシドアニオンを生成できるという
事実を利用して分化を調べた。上記細胞を10^-7Mのデカーシン又はビタミンD₃で
処理し４日間インキュベートした。スーパーオキシドと反応させた培養混合液を
還元し沈殿物を形成させた。次いで沈殿にNBTを加えた(表７)。下記の表７で確
認されるように、対照群では NBTの還元能を示した陽性細胞が 14% であったの
に対して、10^-7M ビタミンD₃及び同じ濃度のデカーシンで処理した場合、それぞ
れ 39%及び 43%に陽性細胞が増加した。

【００４８】

【表７】

【００４９】 (3) 食菌作用試験 U-937細胞を10^-7Mのデカーシン又はビタミンD₃で処理し、４日間インキュベート
した。U-937細胞の分化による機能の変化を評価することを目的とする食菌作用
試験の結果を下記の表８に示す。下記の表８で確認できるように、対照群の約５
%が食菌作用活性を示したのに対して、同じ濃度のビタミンD₃及びデカーシンで
処理した細胞ではそれぞれ25.8%、及び 28.6%に増加した。

【００５０】

【表８】

【００５１】 (4) エステラーゼ活性試験顆粒球類似細胞に分化すると発現するナフトールAS-Dクロロアセテートエステラ
ーゼ及びマクロファージ類似細胞に分化すると発現するα-ナフチルアセテート
エステラーゼの酵素活性試験の結果を表９に示す。表９から確認されるように、
ナフトールAS-Dクロロアセテートエステラーゼ活性を示す細胞は全薬剤群とも見
られなかった。しかしながら、対照群で約10％の細胞がα-ナフチルアセテート
エステラーゼ活性を示し、ビタミンD₃処理群では80%、デカーシン処理群では83%
がそれぞれα-ナフチルアセテートエステラーゼ活性を示すことが明らかとなっ
た。すなわち、細胞がデカーシンの作用によりマクロファージ類似細胞に分化し
たものと考えられる。

【００５２】

【表９】

【００５３】上記の結果から、デカーシンが癌細胞の分化誘導において有効であることが確認
された。より詳しく言えば、ヒト由来のU-937細胞におけるデカーシン及びビタ
ミンD₃の細胞毒性を10^-8M〜10^-6Mの濃度で測定した結果として、937細胞は非常
に高い細胞毒性を示した。5×10^-7M及び10^-6Mの濃度ではデカーシンがビタミンD ₃ よりも高い細胞毒性を示した。約83%の細胞毒性を示す濃度である10^-7Mのデカ
ーシンについてU-937細胞に対する分化誘導活性を調べるため、ビタミンD₃を比
較物質として４日間細胞をデカーシンで処理した。NBT還元試験及び食菌作用試
験を行った後、10^-7Mのデカーシンは還元試験及び食菌作用試験の両方でビタミ
ンD₃よりも強い分化作用を示し、その際の細胞はマクロファージ類似細胞に分化
した。従って、デカーシンは癌細胞の分化を有効に誘導することが確認された。

【００５４】実施例４. デカーシンの正常細胞における毒性試験デカーシンの正常細胞における細胞毒性を測定するために、3%ウシ胎児血清 (FB
S)、ペニシリン(100 U/ml)及びストレプトマイシン(100μg/ml)を含む培地−199
で3−4日毎に継代培養した。その後、細胞をトリプシンで処理し細胞懸濁液を調
製した。この細胞懸濁液 1 mlを24ウェルプレートに 2×10⁵細胞/mlの濃度で接
種し、一日間培地に接触させた。上澄を除去した後、適当な濃度でデカーシン 1
mlを細胞培養液に加え、３日間インキュベートした後に細胞数を数えた。その
結果を下記の表10に示した。表10に確認されるように、正常細胞(LLC-PK1)にお
ける細胞毒性は10^-6Mまで見られなかった。

【表１０】

【００５５】

【発明の効果】

上述したように、デカーシンは腎毒性を軽減させる効果的な腎毒性抑制剤である
。特に、デカーシンは抗腫瘍組成物又は糖尿病治療剤組成物において効果的に使
用することができる。さらに、デカーシンは効果的に癌細胞の分化を誘導する癌
細胞分化誘導剤として、特にヒトの白血病細胞の分化誘導剤としてヒトの白血病
の治療に使用することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 35/02 Ａ６１Ｐ 35/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者チョンセヨウン大韓民国ソウル 138−160 ソンパ−クガラク−ドンヒョースンヴィラ３ −302 (72)発明者キムイクワン大韓民国ソウル 143−210 クワンイーン−ククワンヤン−ドン 484 ヒュンダイアパートメント 301−1205 (72)発明者アンキュンセオプ大韓民国デジョン 305−333 ユースン −クエオウン−ドン（番地なし）ハンビットアパートメント 119−202 (72)発明者キムサンキ大韓民国ソウル 156−775 ドンヤク− クサダン３−ドンダエリムアパートメント１−208 Ｆターム(参考） 4C084 AA19 MA02 NA06 ZB26 ZB27 ZC35 4C086 AA01 HA12 MA02 NA06 ZB26 ZB27 ZC35 4C088 AB40 BA08 MA02 NA06 ZB26 ZB27 ZC35

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】デカーシン(decursin)を活性成分として含み、医薬上許容しうる
担体を含む腎毒性抑制剤組成物。
【請求項２】 (a)腎毒性抑制剤としてのデカーシン、(b)抗腫瘍剤、及び(c)医
薬上許容しうる担体を含む抗腫瘍組成物。
【請求項３】デカーシン対抗腫瘍剤のモル比が１〜５対１である請求項２に記
載の組成物。
【請求項４】抗腫瘍剤がシスプラチンである請求項２又は３に記載の組成物。
【請求項５】 (a)腎毒性抑制剤としてのデカーシン、(b)糖尿病治療剤、及び(c
)医薬上許容しうる担体を含む糖尿病治療剤組成物。
【請求項６】デカーシン対糖尿病治療剤のモル比が0.2〜10対１である請求項
５に記載の組成物。
【請求項７】デカーシンを活性成分として含み、医薬上許容しうる担体を含む
癌細胞分化誘導剤組成物。
【請求項８】分化される癌細胞がヒト白血病細胞である請求項７に記載の組成
物。