DE60121303T2

DE60121303T2 - Mittel, wie nikotinamide oder cadpr zur behandlung von hautkrankheiten

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Publication number: DE60121303T2
Application number: DE60121303T
Authority: DE
Inventors: Ltd Dermipsor
Original assignee: Dermipsor Ltd
Current assignee: Dermipsor Ltd
Priority date: 2000-01-11
Filing date: 2001-01-09
Publication date: 2007-06-14
Anticipated expiration: 2021-01-10
Also published as: ES2267706T3; AU782558B2; IL133976A; WO2001051051A3; WO2001051051B1; AU2392901A; EP1259240B1; ATE332136T1; CA2396186A1; EP1259240A2; DK1259240T3; HK1051497A1; IL150706A0; IL133976A0; US20030032617A1; WO2001051051A2; EP1259240B8; DE60121303D1; CA2396186C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Mittels, die Verwendung einer Kombination.
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Zusammensetzungen für die Behandlung hyperproliferativer Krankheiten sowie für die Behandlung des Alterns der Epidermis, für die Verwendung von Mitteln für die Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzungen sowie für Verfahren zum Behandeln hyperproliferativer Krankheiten und des Alterns der Epidermis.
Für das normale Wachstum und die Differenzierung von Epidermiszellen sind eine Anzahl von Regulationsfaktoren einschließlich Vitamin D3, Vitamin A, eine Anzahl von Zytokinen und Wachstumsfaktoren sowie extra- und intrazelluläres freies Ca⁺² erforderlich. Gutartige und bösartige hyperproliferative Hautkrankheiten entstehen durch fehlerhafte Regulation des Wachstums und der Differenzierung von Epidermiszellen. Die fehlerhafte Regulierung kann dem Fehlen einer Reaktion oder dem Fehlen einer geeigneten Reaktion auf Regulationsfaktoren hin zuzuschreiben sein, oder sie kann nicht normalen Niveaus oder dem nicht normalen Funktionieren der Regulationsfaktoren selbst zuzuschreiben sein. Beispielsweise ist es allgemein bekannt, dass ein unangebrachtes Wachstum und eine unangebrachte Differenzierung durch aberrantes Signalisieren durch den Epidermiswachstumsfaktorrezeptor hervorgerufen werden. Diese Anormalität kann zur Entwicklung von Schuppenflechte, schuppenförmigen Zellkarzinomen und multiplen menschlichen Tumoren beitragen.
Vor Kurzem ist gezeigt worden, dass Nicotinamid (NA), ein Derivat des Vitamins B, Niacin, die Differenzierung von Insulin bildenden Zellen induzieren kann⁽¹⁾. Die erfolgreiche Behandlung und Verhinderung von insulinabhängiger Zuckerkrankheit mit NA ist in Tiermodellen⁽²⁾ aufgezeigt worden und die therapeutischen und vorbeugenden Wirkungen von NA auf die Zuckerkrankheit befinden sich nun in der Phase der internationalen klinischen Versuche⁽³⁾.
NA ist als schwacher Radikalfänger, Hemmer der Poly-ADP-Ribosesynthetase und induzierbaren Stickoxidsynthase in Pankreasinseln bekannt⁽⁴⁾. Es liegt ein einziger Bericht vor über die signifikante Rolle von NA bei der zellulären NAD-Regeneration nach durch Peroxid induzierter Depletion⁽⁵⁾. Jedoch sind alle die aufgezählten Wirkungen von NA nicht an menschlichen Epidermiszellen untersucht worden.
Es gibt verschiedene Berichte über eine erfolgreiche Behandlung der Schuppenflechte und anderer damit verbundener Hautkrankheiten beim Menschen auf die orale oder topische Behandlung mit Vitamin D3 und seine Analogen hin⁽⁶⁾.
Es ist allgemein bekannt, dass Ca⁺²-Signalisierwege bei der Differenzierung von Keratinozyten involviert sind. Vor kurzem wurde die cyclische ADP-Ribose (cADPR), bei der es sich um cyclisches Derivat von NAD+ handelt, als potente Ca⁺²-mobilisierende natürliche Verbindung in verschiedenen eukaryotischen Zellen entdeckt⁽⁷⁾. Jedoch ist die Wirkung von cADPR auf die Ca⁺²-Signalisierung in menschlichen Keratinozyten nicht studiert worden.
Vor Kurzem ist gezeigt worden, dass All-trans-Retinsäure (atRA), die ein Vitamin A-Metabolit ist, die Aktivierung der cADP-Ribosesynthese in LLC-PK₁-Nierenzellen durch Erhöhen der Aktivität von ADPR-Zyklase induziert, ohne die ADPR-Hydrolase zu beeinflussen⁽⁸⁾. Jedoch ist die Wirkung von atRA auf die cADPR-Synthese bei menschlichen Keratinozyten nicht untersucht worden.
DE-A-4 335 454 beschreibt eine geriatrische medizinische Zusammensetzung in Form einer Formulierung, die Ginsengextrakte enthält. Spezifisch enthält die Zusammensetzung neben sibirischem Ginsengextrakt koreanischen Ginsengextrakt und L-Carnitintartrat, auch eine Mischung von Vitaminen und Spurenelementen.
WO-A-98 52 529 betrifft eine Hydratisierungszusammensetzung von hohem Niveau, dadurch gekennzeichnet, dass sie Folgendes umfasst:

a) 0,01 bis 50 Gewichtsprozent, bevorzugt 0,01 bis 10 Gewichtsprozent einer Vitamin B3-Verbindung;
b) 1% bis 99% einer Konditionierkomponente, die einen Hydratationsfaktor von mehr als 0, bevorzugt von mehr als 1,2, noch bevorzugter mehr als 1,5 aufweist.

EP-A-0 052 705 betrifft eine Zusammensetzung, die zum Reduzieren der Entzündungsläsionen von Akne vulgaris bei menschlichen Patienten, die derartige Entzündungsläsionen aufweisen, wirksam ist, gekennzeichnet durch einen Träger, der eine therapeutisch wirksame Menge von Nicotinsäure oder Nicotinamid enthält.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der überraschenden Entdeckung, dass Nicotinamid (NA) sowie cyclische Adenosindiphosphatribose (cADPR) die Differenzierung fördern und die Proliferation menschlicher Epidermiszellen in zwei Modellsystemen hemmen können: einem spontan immortalisierten menschlichen Keratinozyten, der „HaCat-Zelllinien" genannt worden ist, der als Modell für hochproliferative Epidermis, z.B. Schuppenflechtenepidermis⁽⁹⁾, verwendet werden kann; und für Wirkungen externer Modulatoren der Epidermisdifferenzierung⁽¹⁰⁾; und eine Epidermiskarzinomzelllinie, die „A431" genannt worden ist, die mutierte Allele von p53 trägt und als Modell für das Prüfen von antikarzinogenen Arzneimitteln dienen kann⁽¹¹⁾.
Die antiproliferativen Auswirkungen der Arzneimittel wurden an schnell proliferierenden menschlichen Keratinozyten, die „kultivierte menschliche Epidermalkeratinozyten" genannt wurden, aufgezeigt, die zum Erfassen der antiproliferativen Behandlung von Schuppenflechte verwendet werden⁽¹²⁾.
Die vorliegende Erfindung beruht des Weiteren auf der überraschenden Entdeckung, dass eine Zusammensetzung, die eine Mischung von NA und einem Metaboliten von Vitamin D3, bei dem es sich um das 1α, 25-Dihydroxyvitamin D3 handelt (im Folgenden: "1^α,25(OH)₂D₃" genannt) umfasst, wirksamer ist, die Differenzierung zu unterstützen und die Proliferation zu hemmen, als die Summe jeder einzelnen Wirkungen von NA und dem Vitamin-D3-Metaboliten, wenn sie getrennt verabreicht werden. Das bedeutet, dass die Kombination von Vitamin D3-Metabolit (1^α, 25(OH)₂D₃) und NA eine synergistische Wirkung auf die Differenzierung und Proliferation von menschlichen Epidermiszellen ausübt.
Die vorliegende Erfindung beruht des Weiteren auf der überraschenden Entdeckung, dass eine Zusammensetzung, die eine Mischung von All-trans-Retinsäure (atRA) (bei der es sich um einen Metaboliten von Vitamin A handelt), zusammen mit NA wirksamer ist, die Differenzierung zu fördern und die Proliferation von menschlichen Epidermiszellen zu hemmen als die Summe der Wirkungen jeder dieser Verbindungen getrennt, d.h. NA und atRA besitzen eine synergistische Wirkung bezüglich des Förderns der Differenzierung und des Hemmens der Proliferation menschlicher Epidermiszellen.
Die vorliegende Erfindung beruht des Weiteren auf überraschenden Entdeckungen, dass auf lange Zeit mit NA behandelte menschliche Keratinozyten gegen durch Wasserstoffperoxid induzierten oxidativen Stress äußerst widerstandsfähig sind, was darauf hinweist, dass NA als starkes Antioxidationsmittel und deshalb als potentielles Antialterungs- und antineoplastisches Schutzmittel der menschlichen Epidermiszellen dienen kann.
So bietet die vorliegende Erfindung durch eine Ausgestaltung eine Zusammensetzung für die Behandlung hyperproliferativer Epidermiskrankheiten und gegen das Altern der Epidermis umfassend einen Träger und einen aktiven Bestandteil oder ein aktives Mittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(i) Nicotinamid (NA);
(ii) cyclischer Adenosindiphosphat-Ribose (cADPR); und
(iii) einer Kombination von NA und cADPR.

Die Zusammensetzung kann ein Pharmazeutikum oder ein Kosmetikum sein.
Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung soll für die topische Anwendung sowie für die subkutane Verabreichung zusammen mit einem dermatologisch oder kosmetisch akzeptablen Träger verwendet werden und kann in Form von Creme, Lösung, Salbe, Lotion, Unguentum oder Fettunguentum vorliegen.
Die Zusammensetzung kann zum Steigern der antioxidativen Eigenschaften von Epidermiszellen, beispielsweise als antineoplastische oder Antialterungszusammensetzung verwendet werden.
Bei Verwendung für die Behandlung alternder Epidermis kann die erfindungsgemäße kosmetische Zusammensetzung als irgendeine kosmetische Zubereitung des Stands der Technik zusammen mit einem kosmetisch akzeptablen Träger verabreicht werden.
Die Konzentration an Nicotinamid in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung sollte 0,5 mM bis 20 mM; bevorzugt 1 mM bis 10 mM; am bevorzugtesten 2,5 mM bis 5 mM betragen.
Die Konzentration des cADPR in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung sollte 1 μM bis 100 μM; bevorzugt 10 μM bis 50 μM, am bevorzugtesten 25 μM bis 50 μM betragen.
Wo die Zusammensetzung der Möglichkeit (iii) entsprechend eine Kombination von NA und cADPR umfasst, sollte das Verhältnis zwischen den beiden 100:1 bis 200:1 (Gew./Gew.) betragen, wobei die Endkonzentration an Nicotinamid 2,5 mM bis 5 mM und die Endkonzentration an cADPR 25 μM bis 50 μM betragen sollte.
In einer Ausführungsform der Erfindung, die auf der synergistischen Aktivität von NA und einem Metaboliten von Vitamin D3 beruht, umfasst die erfindungsgemäße Zusammensetzung eine Mischung von NA und Vitamin D3-Metabolit. Bevorzugt ist der Vitamin D3-Metabolit 1α,25-Dihydroxyvitamin D3. Die Konzentration des NA in der Mischung sollte innerhalb der Bereiche wie oben definiert liegen. Das Verhältnis von NA zu D3 sollte 5000:1 bis 500.000:1 betragen, wobei die Endkonzentration des Metaboliten-Vitamin D3 0,01 μM bis 1 μM betragen sollte. Andere geeignete Metabolite von Vitamin D3 können 25-Hydroxycholecalciferol (25 OH D3) und 24 R-25-Dihydroxycholecalciferol (24R, 25(OH)₂D3) sein.
In einer zweiten Ausführungsform, die auf der überraschenden synergistischen Wirkung von NA und Vitamin A-Metabolit (atRA) beruht, betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung umfassend NA in Konzentrationsbereichen wie oben definiert und einen Metaboliten von Vitamin A, bevorzugt atRA. Die Endkonzentration an atRA sollte 0,1 nM bis 10 nM betragen. Das Verhältnis von NA zu atRA sollte 5 × 10⁵:1 bis 25 × 10⁷ : 1 betragen.
Der Begriff „hyperproliferative Epidermiskrankheiten" bezieht sich auf Krankheiten, die durch ein höheres als normales Niveau an Proliferation von Epidermiszellen und gewöhnlich auch durch eine anormale Differenzierung gekennzeichnet sind.
Die hyperproliferativen Epidermiskrankheiten können bösartig sein; und Beispiele derartiger bösartiger Krankheiten sind Plattenepitelkarzinome (SCC), Basalzellenkarzinome (BCC) und sonstige nichtmelanome Hautkarzinoma (NMSC).
Im Falle einer anderen Möglichkeit können hyperproliferative Krankheiten gutartige Krankheiten sein, wie beispielsweise: Schuppenflechte, gewöhnliche Warzen, Keratoakanthome, seborrhoische Keratose sowie andere gutartige Hautkrankheiten wie Seborrhoe oder Ichthyose.
Der Begriff „Altern der Epidermis" betrifft alle Symptome, die mit dem physiologischen Altern verbunden sind, wie Runzeln, Verlust an Elastizität, reduzierter Metabolismus, Trockenheit, Rauigkeit, Brennen und Atrophie der Haut, Juckreiz, Heperpilosität und Haarausfall.
Der Begriff „Behandlung, wie er oben definiert ist, betrifft entweder das Mildern der negativen Auswirkungen der Krankheit, welche Milderung beispielsweise durch eine Reduzierung der Proliferationsrate, verbesserte Differenzierung oder Kombination der beiden; durch vollständige Eliminierung der nicht normalen Proliferation und Differenzierung der Epidermiszellen bei der erkrankten Person oder alternativ durch Verhindern der nichtnormalen Differenzierung und/oder höher als normalen Proliferation, bevor sie aufgetreten ist, manifestiert werden kann. Die Behandlung des kosmetischen Aspekts kann auch die Verhinderung von Anzeichens des Alterns umfassen, bevor sie auftreten. Insbesondere können die erfindungsgemäßen Verbindungen als Antialterungs- und antineoplastische Zusammensetzungen verwendet werden.
In einer anderen Ausgestaltung betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Mittels ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(i) Nicotinamid (NA)
(ii) cyclischer Adenosindiphosphatribose (cADPR); und
(iii) einer Kombination von NA und cADPR

In noch einer anderen Ausgestaltung betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von hyperproliferativen Epidermiskrankheiten oder zur Behandlung des Alterns der Epidermis umfassend: das Aufbringen auf die Haut eines Individuums, der eine derartige Behandlung benötigt, einer therapeutisch wirksamen Menge eines Mittels ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

Der Begriff „eine therapeutisch wirksame Menge", wie er oben definiert ist, betrifft eine Menge, die auf messbare Weise entweder die Differenzierung der Epidermiszellen, wie beispielsweise durch indirekte Immunfluoreszenzanalyse von Keratin 10 und der Involucrinexpression bestimmt; durch Bestimmen des Niveaus der verhornten Umhüllungsbildung⁽¹³⁾ verbessert. Alternativ ist die Menge eine Menge, die in messbarem Maße die Proliferation der Zellen reduzieren kann, wie durch Messen der Aktivität von Mitochondriendehydrogenaseenzymen lebender Zellen (MTT-Assay)⁽¹⁴⁾ und durch Zählen des Basalzellenniveaus⁽¹⁵⁾ angezeigt.
Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren ein Verfahren zum Hemmen der Hyperproliferation von Epidermiszellen umfassend das Kontaktieren der Zellen mit einer wirksamen Menge eines Mittels ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(i) Nicotinamid (NA);
(ii) cyclischer Adenosindiphosphatribose (cADPR); und
(iii) einer Kombination von NA und cADPR

Die Zellen können maligne Epidermiszellen, wie beispielsweise Plattenepithelkarzinome (SCC), Basalzellenkarzinome (BCC) oder sonstige nichtmelanome Hautkarzinoma (NMSC) sein oder alternativ können sie hyperproliferative gutartige Zellen wie menschliche Keratinozyten der Schuppenflechtenhaut und Keratinozyten von Keratoacanthom, gewöhnlichen Warzen oder seborrhoischen Keratoseläsionen sein. Die Zellen können auch von anderen gutartigen Hautkrankheiten wie Ichthyose stammen.
Die Zellen können auch Epidermiszellen mit Symptomen der Hautalterung (Trockenheit, Rauheit, Brennen und Atrophie der Haut, Jucken, Überempfindlichkeit gegen Kälte, Runzeln, Heperpilosität, Haarausfall) sein, wenn die Epidermiszellen im natürlichen oder durch oxidativen Stress induzierten Alterungsvorgang involviert sind. Alternativ können die Zellen Hautzellen sein, die eine erhöhte Empfindlichkeit gegen oxidative Verletzung (Zellen mit einer Prädisposition zum Auslösen von Tumoren) sein.
Die Erfindung betrifft des Weiteren ein Verfahren zum Erhöhen der antioxidativen Eigenschaften von Epidermiszellen, umfassend das Kontaktieren der Zellen mit einer wirksamen Menge NA.
Um die Erfindung zu verstehen und zu sehen, wie sie in der Praxis durchgeführt werden kann, wird nun eine bevorzugte Ausführungsform ausschließlich durch nicht einschränkende Beispiele unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen beschrieben, wobei:
1A die Wirkung von NA auf die HaCat- und A431-Zellproliferation zeigt;
1B die antiproliferative Wirkung von NA auf gezüchtete menschliche Epidermiskeratinozyten zeigt;
2 die Wirkung von D3-Metabolit (Ia 25 (OH)₂D3) auf die HaCat- und A431-Zellproliferation zeigt;
3 die Wirkung von cADPR auf die HaCat- und A431-Zellproliferation zeigt;
4 die Wirkung von Vitamin A-Metabolit (atRA) auf die HaCat- und A431-Zellproliferation zeigt;
5A die Wirkung einer Kombination von NA und D3-Metabolit (1α 25(OH)₂D3) auf die HaCat-Zelllinienproliferation zeigt;
5B die kombinierte Wirkung von NA und D3-Metabolit (1α 25(OH)₂D3) auf die HaCat-Zelllinienproliferation minus der Wirkung jeder dieser Verbindungen einzeln genommen (Synergismus) zeigt;
6A die Wirkung einer Kombination von NA und D3-Metabolit (1α 25(OH)₂D3) auf die A431-Zelllinienproliferation zeigt;
6B die kombinierte Wirkung von NA und D3-Metabolit (1α 25(OH)₂D3) auf die A431-Zelllinienproliferation minus der Wirkung jeder dieser Verbindungen einzeln genommen (Synergismus) zeigt;
7A die Wirkung einer Kombination von NA und cADPR auf die HaCat-Zelllinienproliferation zeigt;
7B die kombinierte Wirkung von NA und cADPR auf die HaCat-Zelllinienproliferation minus der Wirkung jeder dieser Verbindungen einzeln genommen (Synergismus) zeigt;
8A die Wirkung einer Kombination von NA und cADPR auf die A431-Zelllinienproliferation zeigt;
8B die kombinierte Wirkung von NA und cADPR auf die A431-Zelllinienproliferation minus der Wirkung jeder dieser Verbindungen einzeln genommen (Synergismus) zeigt;
9A die Wirkung einer Kombination von NA und Vitamin A-Metabolismus (atRA) auf die HaCat-Zelllinienproliferation zeigt;
9B die kombinierte Wirkung von NA und Vitamin A-Metabolit (atRA) auf die HaCat-Zelllinienproliferation minus der Wirkung jeder dieser Verbindungen einzeln genommen (Synergismus) zeigt;
10A die Wirkung einer Kombination von NA und Vitamin A-Metabolismus (atRA) auf die A431-Zelllinienproliferation zeigt;
10B die kombinierte Wirkung von NA und Vitamin A-Metabolit (atRA) auf die A431-Zelllinienproliferation minus der Wirkung jeder dieser Verbindungen einzeln genommen (Synergismus) zeigt;
11 die Wirkung von NA auf die Involucrin- und Keratin k10-Expression in HaCat-Zellen zeigt;
12 die Wirkung von NA auf die Basal- und verhornte Umhüllungszellenexpression in der HaCat-Zelllinie zeigt;
13 die Wirkung von NA auf das Apoptose-Niveau in HaCat- und A431-Zelllinien zeigt; und
14 die Wirkung die Widerstandsfähigkeit von HaCat-Zellen, die über eine lange Zeitspanne mit NA behandelt worden sind, gegen oxidativen Stress, der durch Wasserstoffperoxid (H₂O₂) induziert wird, zeigt.
GENAU BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
VERSUCHSVERFAHREN
A. Zellkultur
Die immortalisierten menschlichen Keratinozyt-HaCat-Zellen wurden routinemäßig in Kolben von 75 cm³ unter Anwendung des minimal essentiellen Eagle-Mediums (MED-EAGLE), das mit 5% fötalem Kalbserum (FCS) und 1% Antibiotika (Penicillin 20 μm/ml; Streptomycin 20 μg/ml und Nystatin 2,5 μm/ml) ergänzt worden war, bei 37°C in 95% Luft/5% CO₂ kultiviert. Das Medium wurde alle 3–4 Tage gewechselt. In einigen Versuchen wurden HaCat-Zellen, die 6 Monate lang in routinemäßig verwendetem Medium gezüchtet wurden, das mit 10 mM NA oder 20 mM NA (Langzeitkultur von HaCat-Zellen mit NA) ergänzt worden war, verwendet.
Menschliche Epidermiskeratinozyten (Durchgänge 3–6), die aus der normalen Gesichtsliftingchirurgie stammten, wurden in serumfreiem KGM^®-2 BulletKit^® Cc-3107 (Clonetics, USA) Medium mit geringem Kalziumgehalt für die beschleunigte Proliferation der Keratinozyten kultiviert. Die Epidermiskarzinom-A431-Zelllinie wurde in DMEM-Medium kultiviert, das mit 10% FKS und Antibiotika ergänzt worden war.
B. Reagenzien
Nicotinamid (NA); cyclische Adenosindisphosphatribose (cADPR); Calcitriol (1α, 25-Dihydroxy-Vitamin D3); All-trans-Retinsäure (atRA; Vitamin A-Säure: Tretinoin): 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT): Propidiumiodid; Dimethylsulfoxid (DMSO); Rinderserumalbumin (RSA): Saccharose: Trinatriumcitrat; Igepal CA-630 (NP-40); Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan; Trypsin; Trypsininhibitor; Ribonuklease A; Spermintetrahydrochlorid: Natriumdodecylsulfat (SDS); β-Mercaptoethanol und Wasserstoffperoxid (H₂O₂) wurden von Sigma (USA) erhalten. Minimales essentielles Eagle-Medium (MEM-EAGLE); 2 MEM-Antibiotika; fötales Kalbsserum (FKS); L-Glutamin; mit Phosphat gepufferte physiologische Kochsalzlösung nach Dulbecco (PBS); Trypsin 0,05%-ige EDTA-Lösung (1:000) wurden von Biological Industries (Israel) erhalten. Keratinozyte Growth Medium^®-2 Bullte Kit^® CC-3107 (für die beschleunigte Proliferation) wurde von BioWhittaker, Inc., einem Cambrex-Unternehmen, Clonetics, (USA) erhalten. Antihumanes Zytokeratin 10 (NCL-CK10) und Involucrin (NCL-INV) von monoklonalen Mausantikörpern wurden von Novocastra Laboratories Ltd. (Großbritannien) erhalten und Cy^WZ doppelt konjugiertes Ziegenantimaus-IG von Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc. (USA). HaCat- und A431-Zellen wurden in Gewebekulturkolben von 25 cm³ oder 75 cm³ (Corning, USA) propagiert und Gewebekulturplatten mit 24 bzw. 96 Vertiefungen (Corning, USA) wurden zum Inkubieren der Zellen mit verschiedenen Dosen von NA (1–50 mM/l), cADPR (1–50 MikroM), Vitamin D3 (1–10000 nM) und atRA (0,1–10000 nM) verwendet.
C. Proliferationsassays
C1 MTT-Verfahren
Die Lebensfähigkeit/Proliferation von HaCat- und A431-Zellen und kultivierten menschlichen Epidermiskeratinozyten auf die Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen von Nicotinamid als solchem und in Kombination mit cADPR, Vitamin D3- und A-Metaboliten hin wurde durch MTT-Assay (Mosmann, T: Colorimetrisches Schnellassay für Zellwachstum und Überleben: Anwendungsassays auf die Proliferation und Zytotoxizität, J. Immunol Meth., 65: 55–63, (1983)) in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen bestimmt. Kurz gesagt wurde eine gleiche Anzahl der Zellen in jeder Vertiefung als Kultur angesetzt und nach 24 h Inkubation wurde NA als solches oder in verschiedenen Kombinationen (NA und cADPR; NA mit D3; NA mit Vitamin A) in den verschiedenen Endkonzentrationen hinzugegeben. Nach einer Inkubation von 72 h wurden 20 μl 5 mg/ml MTT in mit Phosphat gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS) ohne C⁺² und Mg⁺² in jede Vertiefung eingegeben. Die Platten wurden dann in einen Brutschrank eingegeben, CO₂ und MTT wurden zu unlöslichen MTT-Formazankristallen durch Mitochondriendehydrogenasen im Laufe von 3,5 h umgewandelt. Das Medium wurde entfernt und die Formazankristalle wurden in 0,2 ml DMSO gelöst. Die Menge an Formazan wurde in einem ELISR-Leser bei 550 nm quantifiziert. Die Hintergrundwerte bei 650 nm wurden abgezogen. Die Daten sind das Ergebnis von drei unabhängigen Versuchen.
D. Differenzierungsassays
D1 Verhornte Umhüllungsbildung
Die verhornte Zellumhüllungsbildung (Sun T-T, Green, H: Differenzierung von Epidermiskeratinozyten in Zellkultur: Bildung von verhornter Umhüllung, Cell, 9: 511–521, 1976) wurde als Maß später Differenzierungsvorgänge in HaCat-Zellen, die mit Nicotinamid behandelt worden waren, bestimmt. Kurz gesagt, wurden Zellen in Gewebekulturplatten mit 24 Vertiefungen als Kultur angesetzt und nach der Anheftung (24 h) verschiedenen Konzentration von NA (0,4, 10, 15 und 20 mM) 96 h lang ausgesetzt. Die Zellen wurden abgelöst und erneut in Medium suspendiert. Das Zählen der gesamten und Basal- (kleinen, runden) Zellen wurde mit Hilfe eines Hämozytometers in aliquoten Tetraplicatanteilen durchgeführt. Die verbleibenden Zellen wurden abgeschleudert, mit 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,4), das mit 1 β-Mercaptoethanol und 1% SDS ergänzt worden war, 10 min lang behandelt und die verhornten Umhüllungszellen wurden unter Anwendung des Hämozytomers in aliquoten Tetraplikatanteilen gezählt. Die Ergebnisse von drei unabhängigen Versuchen wurden vorgelegt.
D2 Indirekte Immunfluoreszenz
Die Wirkungen von NA auf die frühen (Keratin k10-Expression) und späten (Involucrinexpression) Differenzierungsvorgänge an HaCat-Zellen wurden durch indirekte Immunfluoreszenz beurteilt. Kurz gesagt wurden 2 × 10⁴ Zellen/ml auf Glasdeckelgläsern in Petrischalen mit 0, 5, 10 und 20 mM NA als Kultur angesetzt. Nach einer Inkubation von 72 h wurden die Zellen auf den Glasdeckelgläsern mit PBS gewaschen durch eiskaltes Methanol:Aceton (1:1) fixiert und bei –20°C 10 Minuten lang inkubiert. Die fixierten Zellen wurden in PBS gewaschen und mit Blockierpuffermittel (1% RSA in PBS) 10 Minuten lang inkubiert, um die nichtspezifische Absorption der primären Antikörper auf den Deckelgläsern zu minimieren. Um die Keratin 10-Expression zu erfassen, wurde monoklonaler antimenschlicher Mausantikörper in einer endgültigen Verdünnung von 1/50 verwendet. Die Involucrinexpression wurde durch antihumanen Involucrin-Mausmonoklonalantikörper in einer endgültigen Verdünnung von 1/100 erfasst. Nach dem Blockieren wurden die Zellen mit den oben erwähnten Antikörpern 1 h lang bei 37°C in einer befeuchteten Kammer inkubiert. Die erschöpfend mit PBS gewaschene Zellen wurden mit Cy^WZ doppeltkonjugiertem Ziegenantimaus-IG in einer endgültigen Verdünnung von 1/50 30 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Objektträger wurden unter einem Zeiss-Mikroskop (Axioskop-2), das mit einer Epifluoreszenzoptik und den entsprechenden Filtern zum Vermeiden der Kreuzkanalkontamination ausgestattet war, in Augenschein genommen. Das Niveau der Keratin 10- und Involucrinexpression wurde durch Zählen der positiven Zellen im Vergleich mit der gesamten Zellzahl schätzungsweise bestimmt. Auf jedem Objektträger wurden mindestens 500–1000 gescored. Die Daten sind der Mittelwert von 3 unabhängigen Versuchen.
D3 DNA-Markierung und Durchflusszytometrieanalyse
HaCat- und A431-Zellen wurden in Gewebekulturkolben von 25 cm³ als Kultur angesetzt und 72 h lang mit 0, 5, 10 und 20 mM NA inkubiert. Zellen, die mit 5% Ethanol behandelt worden waren, dienten als positive Kontrolle von Apoptose. Die Kerne für die Durchflusszytometrieanalyse von DNA wurden durch ein Detergenz-Trypsinverfahren mit Propidiumiodid (Lars L Rindelov: A detergent trypsin method for the preparation of nuclei for FACS DNA analysis (Eine Detergenz-Trypsinmethode für die Herstellung von Kernen für die FACS DNA-Analyse), Zytometry 3 (5) 323–327, 1983) zubereitet. Kurz gesagt wurden die Zellen (10⁶ pro Reagenzröhre) mit PBS gewaschen. Das Zellgranulat wurde erneut in 40 μl Citratpuffer (pH-Wert 7,6), der mit 250 mM Saccharose, 40 mM Trinatriumcitrat und 5% DMSO ergänzt worden war, suspendiert. Dann wurden die erneut suspendierten Zellen in 450 μl Lösung mit Trypsin (0,15 mg/ml, pH-Wert 7,6) 10 Minuten lang inkubiert. Auf die nächste 10 Minuten lange Inkubation mit Trypsininhibitor und Ribonuklease A wurde die Fluorchromlösung, die Propidiumiodid 100 μg/ml enthielt, den Kernen zugegeben. Die Reagenzgläser wurden vor der Durchflusszytometrieanalyse ins Dunkle gestellt. Die Durchflusszytometrieanalyse wurde in durch Fluoreszenz aktivierten Zellsortiervorrichtungen (FACScan; Becton Dickinson, CA) durchgeführt und das Apoptoseniveau wurde unter Anwendung des Cell Quest Programms von Becton Dickonson bestimmt. Jeder Versuch wurde dreimal wiederholt.
E. Statistische Analyse
Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± Standardabweichung vom Mittelwert (Mittelwert ± SD) vorgelegt. Die statistische Signifikanz (P < 0,05) wurde durch den Student-t-Test abgeleitet.
Beispiel 1 Wirkung von NA auf die Epidermiszellproliferation
2 × 10⁴/ml immortalisierte menschliche Keratinozyt-HaCat-Zellen, kultivierte menschliche Epidermiskeratinozyten und 5 × 10³/ml Plattenepithelkarzinom-A431-Zellen wurden mit verschiedenen Mengen NA für eine Zeitspanne von 72 Stunden inkubiert. Die Proliferation wurde durch das MTT-Verfahren, wie in Abschnitt der Versuchsverfahren beschrieben, schätzungsweise bestimmt und als Prozentsatz der Kontrolle (unbehandelten Zellen) ausgedrückt.
Die Ergebnisse sind in 1A und 1B gezeigt, die zeigen, dass sowohl die HaCat-, A431- und kultivierte menschliche Epidermiskeratinozyten Zellproliferation durch NA signifikant gehemmt wurde.
Beispiel II Wirkung von cADPR-Vitamin D3-Metabolit und Vitamin A-Metabolit auf die Zellproliferation
Zellen wie in Beispiel 1 beschrieben wurden mit verschiedenen Mengen cADPR 72 Stunden lang inkubiert.
Wie in 3 zu sehen ist, waren 25 und 50 μM cADPR beim Hemmen der Proliferation wirksam.
Die Wirkungen von Vitamin D3-Metabolit (1α 25 (OH)₂D3) und Vitamin A-Metabolit (atRA) auf die Zellproliferation wurden bestimmt. Zellen wurden wie oben mit verschiedenen Mengen von Vitamin D3-Metabolit und Vitamin A-Metabolit inkubiert und die Ergebnisse sind jeweils in 2 und 4 gezeigt.
Wie zu sehen ist, wirken sich in den untersuchten Konzentrationen weder der Vitamin D3-Metabolit noch der Vitamin A-Metabolit als solchen auf die Proliferation der HaCat- und A431-Zelllinie aus.
Beispiel 3 Synergistische Wirkungen von NA und einem Vitamin D3-Metaboliten
HaCat-Zellen und A431-Zellen wurden getrennt mit D3-Metabolit und dem D3-Metabolit zusammen mit NA (5A bzw. 6A) für eine Zeitspanne von 72 Stunden inkubiert.
Die Wirkung jedes D3-Metaboliten und von NA einzeln wurde von der kombinierten Wirkung von NA zusammen mit dem D3-Metaboliten in den HaCat-Zellen (5B) und A431-Zellen (6B) abgeleitet.
Wie zu sehen ist, war die kombinierte Wirkung von NA und D3-Metabolit höher als die Summe jeder dieser Wirkungen einzeln betrachtet, in einer Menge von über 12% bei einer Konzentration von 100 nM D3 und 5 mM NA bezüglich HaCat-Zellen und über 20% Synergismus für 10 nM D3-Metabolit und 5 mM NA bei A431-Zellen.
Beispiel 4 Synergistische Wirkung von cADPR und NA
2 × 10⁴/ml HaCat-Zellen und 5 × 10³/ml Plattenepithelkarzinom-A431-Zellen wurden mit NA in einer Konzentration von 5 mM bzw. 2,5 mM inkubiert, wobei die Menge von cADPR (25–50 μm) variiert wurde, und die Ergebnisse sind in 7 bzw. 8 gezeigt.
Wie aus 7A zu sehen ist, zeigten 50 μM cADPR und 5 mM NA eine synergistische Wirkung von mehr als 20% bezüglich der Hemmung der Proliferation im Vergleich mit der Wirkung jeder dieser Mittel in dieser Konzentration als solcher mit Bezug auf HaCat-Zellen und 25 μM cADPR und 2,5 mM NA zeigten einen Synergismus von mehr als 16% bezüglich des Hemmens der Proliferation von A431-Zellen im Vergleich mit der Hemmung jeder dieser Komponenten als solchen.
Beispiel 5 Synergistische Wirkung einer Kombination von NA und Vitamin A-Metabolit auf Epidermiszellea
HaCat-Zellen und A431-Zellen wurden mit NA in einer Menge von 5 mM bzw. 2,5 mM und verschiedenen Konzentration von atRA (0,1 nM–1 μM) inkubiert und die Ergebnisse sind in 9 bzw. 10 gezeigt.
Wie in 9B und 10B zu sehen ist, zeigte die Wirkung der Kombination einen Synergismus von mehr als 25% bei einer Konzentration von 0,1 μM atRA auf A431-Zellen (10B) und einen Synergismus von mehr als 20% bei einer Konzentration von 10 μM atRA (auf HaCat-Zellen) (9B) über der Wirkung, die für jedes der einzelnen Mittel Vitamin A und NA in den gleichen Mengen getrennt genommen erreicht worden ist.
Beispiel 6 Wirkung von NA auf die Zelldifferenzierung und Apoptose
Die Wirkung von NA auf die Differenzierung wurde durch die verhornte Umhüllungsbildung, wie in D1 beschrieben, und die indirekte Immunofluoreszenz von Keratin k10 und Involucrin, wie in D2 beschrieben, bestimmt und die Ergebnisse sind in 11 bzw. 12 gezeigt.
Wie zu sehen ist, stimulierte die NA-Behandlung sowohl die Expression von Keratin 10 (K10) Involucrin, bei denen es sich um Marker früher und später Differenzierungsvorgänge der Epidermiszellen handelt.
NA änderte auch das Verhältnis zwischen der Menge an Zellen und verhornten Umhüllungszellen, so dass ein höherer Anteil von getesteten Zellen verhornte Umhüllungszellen waren, die differenziertere Zellen sind, wie in 12 zu sehen ist.
Schließlich zeigt 13, dass NA in Mengen von 30 mM bei A431-Zellen und 50 mM bei HaCat-Zellen für die Zellen zytotoxisch wird, wie durch das Niveau an Apoptose bestimmt. Das bedeutet, dass die Wirkung von NA auf die Zellproliferation, wie beispielsweise in 1 ausgedrückt ist, in einer Konzentration von NA manifestiert wird, die unterhalb der Konzentrationen liegt, die für Zellen toxisch sind.
Beispiel 7 Widerstandsfähigkeit von HaCat-Zellen, die über lange Zeit mit NA (10 mM) kultiviert werden, gegen durch Wasserstoffperoxid induzierten oxidativen Stress
2 × 10⁴/ml immortalisierte menschliche Keratinozyt-HaCat-Zellen, die routinemäßig kultiviert wurden, oder die gleiche Menge HaCat-Zellen, die mit 10 mM NA 6 Monate lang kultiviert wurden, wurden mit steigenden Konzentrationen an Wasserstoffperoxid für eine Zeit von 24 Stunden inkubiert. Die Zytotoxizität wurde durch das MTT-Verfahren, wie in Abschnitt C der „Versuchsverfahren" beschrieben, schätzungsweise bestimmt und als Prozentsatz im Vergleich mit den Kontrollen (unbehandelten Zellen) ausgedrückt.
Die Ergebnisse sind in 14 gezeigt, was zeigt, dass nur HaCat-Zellen, die routinemäßig (ohne NA-Ergänzung) kultiviert wurden, durch Wasserstoffperoxid signifikant beschädigt wurden. Diese Daten zeigen, dass die Langzeitbehandlung mit NA die antioxidativen Eigenschaften menschlicher Epidermiszellen erhöhen kann.
LITERATURANGABEN

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13. Sun T-T, Green, H.: Differentiation of the epidermal keratinozyte in cell culture: formation of cornified envelope, Cell, 9: 511–521, (1976).
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15. Sun T-T, Green, H.: Differentiation of the epidermal keratinozyte in cell culture: formation of cornified envelope, Cell, 9: 511–521 (1976).

Claims

Verwendung eines Mittels, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus (i) Nikotinamid (NA); (ii) zyklischer Adenosindiphosphat-Ribose (cADPR); und (iii) einer Kombination aus NA und cADPR für die Herstellung einer Mischung zur Behandlung von Psoriasis, Ichthyosis oder malignen hyperproliferativen Epidermiskrankheiten.
Verwendung einer Kombination aus NA und wenigstens einem Vitamin-D3-Metabolit für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Psoriasis, Ichthyosis oder malignen hyperproliferativen Epidermiskrankheiten.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei der Metabolit des Vitamins D3 1α,25 Dihydroxyvitamin D3 ist.
Verwendung einer Kombination aus NA und Vitamin-A-Metabolit zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Psoriasis, Ichthyosis oder malignen hyperproliferativen Epidermiskrankheiten.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei der Vitamin-A-Metabolit All-Trans-Retinol-Säure (atRA) ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die maligne Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Plattenepithelkarzinom (SCC), Basalzellenkarzinom (BCC) und sonstigen nicht-melanomen Hautkarzinoma (NMSC).