CN113604573A - 一种使用至少八种脂肪酸代谢关键酶基因检测方法以及试剂盒 - Google Patents

一种使用至少八种脂肪酸代谢关键酶基因检测方法以及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种脂肪酸代谢关键酶基因检测方法以及试剂盒，具体涉及使用八种或十种脂肪酸代谢关键酶基因进行检测的方法。

Description

一种使用至少八种脂肪酸代谢关键酶基因检测方法以及试 剂盒
技术领域
本发明涉及基因检测领域，特别是涉及一种使用至少八种脂肪酸代谢关键酶基因检测方法以及试剂盒。
背景技术
代谢组学(Metabolomics/Metabonomics)是20世纪90年代末期发展起来的一门新兴学科，它是通过考察生物体系在遗传改变或受刺激或扰动后，其代谢产物的变化或其随时间的变化，来研究生物体系的一门科学。所谓代谢组(Metabolome)是基因组的下游产物也是最终产物，是一些参与生物体新陈代谢、维持生物体正常功能和生长发育的小分子化合物的集合，主要是相对分子质量小于1000的内源性小分子，这些内源性代谢小分子涉及糖代谢、能量代谢、脂代谢、氨基酸代谢、核酸代谢、辅酶代谢等。
正常状态下的生物体是一个完整的系统，生物体液、细胞和组织中的代谢物处于一个稳定的平衡状态。机体由于遗传或者后天原因发生了病理变化，这一平衡就被打破，代谢产物和代谢过程也产生了相应的变化。通过代谢组学分析了解小分子代谢在疾病过程中的变化，可以帮助人们寻找有关的生物标志物(biomarker)，可以辅助疾病的诊断，也可以帮助人们通过小分子物质本身涉及的代谢通路了解疾病的发病机制并为药物研发提供特异性的靶标。近年来，代谢组学在人类各类疾病的研究中在疾病的早期诊断中取得了诸多具有重大意义的研究成果，如心血管疾病、糖尿病和癌症，相关论文发表在学术期刊《Nature》、《Nature medicine》、《Journal of hepatology》和《Cancer research》上，展现了代谢小分子在人类疾病诊断中巨大的潜力与价值。
其中，脂肪酸代谢的研究越来越受到重视，脂肪酸是指一端含有一个羧基的长的脂肪族碳氢链，是机体主要能量来源之一。脂肪酸根据碳链的长短可分为短链、中链、长链脂肪酸；根据饱和度的不同可分为饱和、单不饱和、多不饱和脂肪酸。人和动物体内脂肪酸主要是长链脂肪酸，其来源一是机体自身合成，二是食物供给。脂肪酸在生命过程中具有非常重要的作用。研究表明，诸如高血压、血脂紊乱、肥胖、胰岛素抵抗、心脑血管疾病及肿瘤等多种疾病都与脂肪酸代谢异常有关。
目前，脂肪酸检测的分析方法多集中在气相色谱-质谱联用(GC-MS)方法，以及高效液相色谱与质谱联用(HPLC-MS)方法，然而上述方法具有定量不够准确，灵敏度欠佳，稳定性差、进样前需进行繁琐的预处理，费时、费力等缺点。临床医学上很多疾病和脂肪酸的变化有密切关系，机体器官生理和病理变化往往会引起体内脂肪酸成分的改变，检测机体中脂肪酸的水平，对研究不同条件下血脂代谢情况，诊断某种脂肪酸水平异常引起的疾病以及调整补充机体所需、改善营养疗效等方面具有重要意义。因此对脂肪酸代谢的检测对及时了解脂肪酸代谢疾病非常重要，更方便、快捷、准确的脂肪酸检测方法还有待研究者的进一步研究。
目前使用PCR等生物检测手段检测脂肪酸代谢的方法较少，一般均需要实验人员自行选择相关基因且需自行设计引物，而脂肪酸代谢通路基因较多，全部进行检测费时且成本高，选取部分基因又容易遗漏脂肪酸代谢检测的关键步骤，且自行设计的引物往往需要进行大量的检测及预实验才能找到合适的引物及实验条件，且目前市场上还没有相关的试剂盒。
异常代谢是人类癌症发展的标志，在癌症进展和化疗失败中起重要作用。各种实验和临床研究表明，脂肪酸代谢可能有利于肿瘤细胞生长和化疗失败，这表明异常代谢是癌细胞的独特脆弱性和癌症治疗的有希望的靶标。例如，脂肪细胞通过将脂肪酸转移到脂肪酸氧化(FAO)的高活化肿瘤细胞中来促进转移性细胞的增殖。研究癌细胞对脂肪酸代谢的依赖将为癌症患者提供潜在的个性化治疗，且通过脂肪酸代谢情况能够指示抗癌剂为肥胖患者结直肠癌的特异性、灵敏性的早期诊断和精准治疗提供指导方案，改善肥胖结直肠癌患者的预后。
发明内容
针对上述急需解决的技术问题，本发明的发明人经过多年对脂肪酸代谢的通路(脂肪酸氧化分解)的研究，综合文献并多次实验，找到脂肪酸代谢的关键基因，选择肉碱脂酰转移酶、脂酰CoA合成酶、脂酰CoA脱氢酶、烯酰CoA水化酶、β-酮硫解酶为关键检测基因，即通过上述五个基因就能够检测出脂肪酸代谢水平，而不需要检测脂肪酸代谢的所有基因。对上述基因组合进行PCR检测，检测结果可靠准确，方便快捷。
本发明的第一方面提供了一种脂肪酸代谢水平的检测方法，所述方法通过检测脂肪酸代谢关键酶基因来指示脂肪酸代谢水平，所述脂肪酸代谢关键酶基因由肉碱脂酰转移酶、脂酰CoA合成酶、脂酰CoA脱氢酶、烯酰CoA水化酶、β-酮硫解酶组成，其中肉碱脂酰转移酶为CPT1a、CPT1b和CPT2，脂酰CoA合成酶为ACSL1，脂酰CoA脱氢酶为ACADVL和ACADM，烯酰CoA水化酶为ECH1，β-酮硫解酶为HADHA。
优选的，所述方法还可以进一步检测肉碱脂酰转移酶CPT1c以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH。
在第二个方面中，本发明提供了一种检测脂肪酸代谢水平的试剂盒，所述试剂盒中含有检测脂肪酸代谢关键酶基因的试剂，所述试剂用以指示脂肪酸代谢水平，所述脂肪酸代谢关键酶基因由肉碱脂酰转移酶、脂酰CoA合成酶、脂酰CoA脱氢酶、烯酰CoA水化酶、β-酮硫解酶组成，其中肉碱脂酰转移酶为CPT1a、CPT1b和CPT2，脂酰CoA合成酶为ACSL1，脂酰CoA脱氢酶为ACADVL和ACADM，烯酰CoA水化酶为ECH1，β-酮硫解酶为HADHA。
优选的，所述试剂盒中进一步含有检测肉碱脂酰转移酶CPT1c以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH的试剂。所述试剂盒为PCR试剂盒，所述试剂盒中含有PCR检测所必需的试剂。
进一步的，所述检测脂肪酸代谢关键酶基因基因的试剂为PCR检测引物，所述引物如下：
①肉碱脂酰转移酶(carnitine acyl transferase)，CPT
CPT1a：
Forward:CTCAGTGGGAGCGACTCTTCA
Reverse:GGCCTCTGTGGTACACGACAA
CPT1b：
Forward:TGGTGGGCAACTAACTATGTGA
Reverse:TCCAGTTTGCGGCGATACAT
CPT2：
Forward:ATGACAGCCAGTTCAGGAAGACA
Reverse:TAAAACGACAGAGTCTCGAGCAG
②脂酰CoA合成酶(acyl-CoA synthetase)
ACSL1：
Forward:AGTGGAACTACAGGCAACCC
Reverse:CAGCACATCATCTGTGGAAGC
③脂酰CoA脱氢酶(acyl CoA dehydrogenase)
ACADVL:
Forward:GCCAAGCTGGTGAAACACAA
Reverse:TCCGAGTTGCAGCCTCAATG
ACADM:
Forward:AGAACCAGACCTACAGTCGCA
Reverse:TGAGCCTAGCGAGTTCAACC
④烯酰CoA水化酶(enoyl CoA hydratase)
ECH1:
Forward:CTGTCATTGAGAAGTGCCCCAA
Reverse:AGCAGCCAAGCCCATATCTAC
⑤β-酮硫解酶(beta-ketothiolase deficiency,BDK)
HADHA:product size 249bp
Forward:AGGACCTCGGTGTAAAGCAC
Reverse:TAGTGCATGCCGATCACCTTC。
进一步的，所述检测肉碱脂酰转移酶CPT1c以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH的试剂为PCR检测引物，所述引物如下：
CPT1c
Forward:CTACAGCGCTGGCAAATGAC
Forward:GACGTACAGAAAATCCTGCATCA
GAPDH
Forward:TTCACCACCATGGAGAAGGC
Reverse：GGCATGGACTGTGGTCATGA
在第三个方面中，本发明提供了所述试剂盒在制备脂肪酸代谢水平的检测试剂盒中用途。
优选的，所述脂肪酸代谢水平可指示使用抗癌药治疗癌症的预后情况。所述抗癌药为EZH2抑制剂治疗。
所述癌症为结直肠癌。
优选的，上述方法和试剂盒可检测人或鼠的脂肪酸代谢关键酶基因。
对比现有技术，本发明的有益效果在于：
(1)目前商品化的RT-PCR的引物有Taqman标签的引物，但这类引物成本(售价)较高，Taqman引物需要专门的PCR仪器，或者专门的通道，使用不方便。本技术方案在多次实验中，成功发现了q-PCR效果较好，产物单一且稳定的脂质代谢关键酶的q-PCR引物，降低了成本提高了检测效率。
(2)本技术方案里包含了脂肪酸代谢中多个限速酶(关键基因)，可以帮助快速检测多个基因，而不需要从引物设计网站上设计的引物需要反复做预实验，避免产物不单一，PCR不稳定，需要重复实验的情况；
(3)尽管现在基因测序技术已经较为普遍，但是由于探针的结合问题，测序的结果往往不能覆盖研究人员想关注的所有基因，因此，需要RT-PCR进一步对这些感兴趣的关键基因进行检测。本发明包含的PCR产物可应用于不同的细胞提取的RNA进行RT-PCR检测。
需要明确的是，此处仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或更多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1：PCR反应条件
图2：qPCR产物琼脂糖凝胶电泳
图3：GSK126处理MC38细胞系48h后脂肪酸β氧化关键酶基因的变化
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1脂肪酸代谢的通路关键基因PCR检测(八基因)
一种脂肪酸代谢水平的检测方法，所述方法通过检测八个脂肪酸代谢关键酶基因来指示脂肪酸代谢水平，所述脂肪酸代谢关键酶基因由肉碱脂酰转移酶、脂酰CoA合成酶、脂酰CoA脱氢酶、烯酰CoA水化酶、β-酮硫解酶组成，其中肉碱脂酰转移酶为CPT1a、CPT1b和CPT2，脂酰CoA合成酶为ACSL1，脂酰CoA脱氢酶为ACADVL和ACADM，烯酰CoA水化酶为ECH1，β-酮硫解酶为HADHA。
所述检测方法为PCR法，涉及相关引物如下：
所述引物如下：
①肉碱脂酰转移酶(carnitine acyl transferase)，CPT
CPT1a：
Forward:CTCAGTGGGAGCGACTCTTCA
Reverse:GGCCTCTGTGGTACACGACAA
CPT1b：
Forward:TGGTGGGCAACTAACTATGTGA
Reverse:TCCAGTTTGCGGCGATACAT
CPT2：
Forward:ATGACAGCCAGTTCAGGAAGACA
Reverse:TAAAACGACAGAGTCTCGAGCAG
②脂酰CoA合成酶(acyl-CoA synthetase)
ACSL1：
Forward:AGTGGAACTACAGGCAACCC
Reverse:CAGCACATCATCTGTGGAAGC
③脂酰CoA脱氢酶(acyl CoA dehydrogenase)
ACADVL:
Forward:GCCAAGCTGGTGAAACACAA
Reverse:TCCGAGTTGCAGCCTCAATG
ACADM:
Forward:AGAACCAGACCTACAGTCGCA
Reverse:TGAGCCTAGCGAGTTCAACC
④烯酰CoA水化酶(enoyl CoA hydratase)
ECH1:
Forward:CTGTCATTGAGAAGTGCCCCAA
Reverse:AGCAGCCAAGCCCATATCTAC
⑤β-酮硫解酶(beta-ketothiolase deficiency,BDK)
HADHA:product size 249bp
Forward:AGGACCTCGGTGTAAAGCAC
Reverse:TAGTGCATGCCGATCACCTTC。
PCR反应条件如图1所示，qPCR产物琼脂糖凝胶电泳如图2所示，结果显示，所述引物组合能够扩增出目的基因，且互相不干扰，检测效果良好。
实施例2脂肪酸代谢的通路关键基因PCR检测(十个基因)
一种脂肪酸代谢水平的检测方法，所述方法通过检测脂肪酸代谢关键酶基因来指示脂肪酸代谢水平，所述脂肪酸代谢关键酶基因由肉碱脂酰转移酶、脂酰CoA合成酶、脂酰CoA脱氢酶、烯酰CoA水化酶、β-酮硫解酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶组成，其中肉碱脂酰转移酶为CPT1a、CPT1b、CPT2和CPT1c，脂酰CoA合成酶为ACSL1，脂酰CoA脱氢酶为ACADVL和ACADM，烯酰CoA水化酶为ECH1，β-酮硫解酶为HADHA，甘油醛-3-磷酸脱氢酶为GAPDH。
所述检测方法为PCR法，涉及相关引物如下：
所述引物如下：
①肉碱脂酰转移酶(carnitine acyl transferase)，CPT
CPT1a：
Forward:CTCAGTGGGAGCGACTCTTCA
Reverse:GGCCTCTGTGGTACACGACAA
CPT1b：
Forward:TGGTGGGCAACTAACTATGTGA
Reverse:TCCAGTTTGCGGCGATACAT
CPT2：
Forward:ATGACAGCCAGTTCAGGAAGACA
Reverse:TAAAACGACAGAGTCTCGAGCAG
CPT1c
Forward:CTACAGCGCTGGCAAATGAC
Forward:GACGTACAGAAAATCCTGCATCA
②脂酰CoA合成酶(acyl-CoA synthetase)
ACSL1：
Forward:AGTGGAACTACAGGCAACCC
Reverse:CAGCACATCATCTGTGGAAGC
③脂酰CoA脱氢酶(acyl CoA dehydrogenase)
ACADVL:
Forward:GCCAAGCTGGTGAAACACAA
Reverse:TCCGAGTTGCAGCCTCAATG
ACADM:
Forward:AGAACCAGACCTACAGTCGCA
Reverse:TGAGCCTAGCGAGTTCAACC
④烯酰CoA水化酶(enoyl CoA hydratase)
ECH1:
Forward:CTGTCATTGAGAAGTGCCCCAA
Reverse:AGCAGCCAAGCCCATATCTAC
⑤β-酮硫解酶(beta-ketothiolase deficiency,BDK)
HADHA:product size 249bp
Forward:AGGACCTCGGTGTAAAGCAC
Reverse:TAGTGCATGCCGATCACCTTC。
⑥甘油醛-3-磷酸脱氢酶
GAPDH
Forward:TTCACCACCATGGAGAAGGC
Reverse：GGCATGGACTGTGGTCATGA
PCR反应条件如图1所示，qPCR产物琼脂糖凝胶电泳如图2所示，结果显示，所述引物组合能够扩增出目的基因，且互相不干扰，检测效果良好。实施例3使用实施例1-2的检测试剂盒检测肿瘤细胞的脂代谢。
以实施例1的八基因检测试剂盒检测肿瘤细胞的脂代谢，实施例2的试剂盒可实现相同效果。
实验显示，表观遗传调控因子EZH2的小分子抑制剂GSK126可以调控肿瘤细胞的脂代谢。GSK126以浓度梯度依赖的方式影响小鼠结直肠癌细胞系MC38的增殖情况。结果提示5μM的GSK126对肿瘤细胞增殖并没有明显的抑制作用，同时通过GraphPad Prism8计算出GSK126对MC38细胞系的IC50约为20μM。因此，选用上述两种浓度分别处理MC38细胞系48h后对脂肪酸β氧化(FAO)通路上的关键酶基因进行qPCR验证，发现两种浓度的GSK126可以不同程度的影响FAO关键酶基因的表达(见图3)。
可见使用本申请脂肪酸代谢试剂盒，能够指示目标需求下脂肪酸的代谢水平的检测，也可用于肿瘤细胞代谢细胞癌变过程的代谢模式研究。代谢水平的改变对结直肠癌的发生发展有着重要的作用。其中，通过抑制脂肪酸氧化代谢过程中的关键酶基因可以抑制肿瘤的发生发展及其对对化疗药物敏感性。
通过使用IC50浓度下的GSK126处理结直肠癌小鼠细胞MC38观察到脂肪酸氧化通路中大部分的关键酶基因都被抑制，从而说明GSK126可以通过抑制脂肪酸的氧化发挥抗肿瘤的作用。使用实施例1-2的关键酶基因检测试剂盒和方法检测在结直肠癌治疗前后的代谢水平，当这些关键酶基因的处于被抑制的状态时，表明结直肠癌治疗预后效果良好，而当关键酶基因表达增加时，则表明结直肠癌治疗预后效果不佳。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种脂肪酸代谢水平的检测方法，其特征在于，所述方法通过检测脂肪酸代谢关键酶基因来指示脂肪酸代谢水平，所述脂肪酸代谢关键酶基因由肉碱脂酰转移酶、脂酰CoA合成酶、脂酰CoA脱氢酶、烯酰CoA水化酶、β-酮硫解酶组成，其中肉碱脂酰转移酶为CPT1a、CPT1b和CPT2，脂酰CoA合成酶为ACSL1，脂酰CoA脱氢酶为ACADVL和ACADM，烯酰CoA水化酶为ECH1，β-酮硫解酶为HADHA。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，还可以进一步检测肉碱脂酰转移酶CPT1c以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH。
3.一种检测脂肪酸代谢水平的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有检测脂肪酸代谢关键酶基因的试剂，所述试剂用以指示脂肪酸代谢水平，所述脂肪酸代谢关键酶基因由肉碱脂酰转移酶、脂酰CoA合成酶、脂酰CoA脱氢酶、烯酰CoA水化酶、β-酮硫解酶组成，其中肉碱脂酰转移酶为CPT1a、CPT1b和CPT2，脂酰CoA合成酶为ACSL1，脂酰CoA脱氢酶为ACADVL和ACADM，烯酰CoA水化酶为ECH1，β-酮硫解酶为HADHA。
4.根据权利要求3所述试剂盒，所述试剂盒中进一步含有检测肉碱脂酰转移酶CPT1c以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH的试剂。
5.根据权利要求3或4所述试剂盒，其特征在于，其特征在于，所述试剂盒为PCR试剂盒，所述试剂盒中含有PCR检测所必需的试剂。
6.根据权利要求3或4所述试剂盒，其特征在于，所述检测脂肪酸代谢关键酶基因基因的试剂为PCR检测引物，所述引物如下：
①肉碱脂酰转移酶(carnitine acyl transferase)，CPT
CPT1a：
Forward:CTCAGTGGGAGCGACTCTTCA
Reverse:GGCCTCTGTGGTACACGACAA
CPT1b：
Forward:TGGTGGGCAACTAACTATGTGA
Reverse:TCCAGTTTGCGGCGATACAT
CPT2：
Forward:ATGACAGCCAGTTCAGGAAGACA
Reverse:TAAAACGACAGAGTCTCGAGCAG
②脂酰CoA合成酶(acyl-CoA synthetase)
ACSL1：
Forward:AGTGGAACTACAGGCAACCC
Reverse:CAGCACATCATCTGTGGAAGC
③脂酰CoA脱氢酶(acyl CoA dehydrogenase)
ACADVL:
Forward:GCCAAGCTGGTGAAACACAA
Reverse:TCCGAGTTGCAGCCTCAATG
ACADM:
Forward:AGAACCAGACCTACAGTCGCA
Reverse:TGAGCCTAGCGAGTTCAACC
④烯酰CoA水化酶(enoyl CoA hydratase)
ECH1:
Forward:CTGTCATTGAGAAGTGCCCCAA
Reverse:AGCAGCCAAGCCCATATCTAC
⑤β-酮硫解酶(beta-ketothiolase deficiency,BDK)
HADHA:product size 249bp
Forward:AGGACCTCGGTGTAAAGCAC
Reverse:TAGTGCATGCCGATCACCTTC。
7.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述检测肉碱脂酰转移酶CPT1c以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH的试剂为PCR检测引物，所述引物如下：
CPT1c
Forward:CTACAGCGCTGGCAAATGAC
Forward:GACGTACAGAAAATCCTGCATCA
GAPDH
Forward:TTCACCACCATGGAGAAGGC
Reverse：GGCATGGACTGTGGTCATGA。
8.根据权利要求3-7所述试剂盒在制备脂肪酸代谢水平的检测试剂盒中用途。
9.根据权利要求8所述用途，其特征在于，所述脂肪酸代谢水平可指示使用抗癌药治疗癌症的预后情况。
10.根据权利要求9所述用途，其特征在于，所述抗癌药为EZH2抑制剂治疗。
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