PT1227810E - Tratamento do cancro por aumento dos níveis intracelulares de malonil-coa - Google Patents

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Descrição

"TRATAMENTO DO CANCRO POR AUMENTO DOS NÍVEIS INTRACELULARES DE MALQNIL-COA"

Revisão da arte relacionada

Diversos estudos demonstraram, surpreendentemente, altos níveis de expressão da sintase dos ácidos gordos (FAS, E.C. 2.3.1.85) no cancro da mama humano virulento (Alo, P. L., Visca, P., Marci, A., Mangoni, A., Botti, C. , e Di Tondo, U. A expressão da sintase dos ácidos gordos (FAS) como previsão da recidiva em doentes com carcinoma da mama de fase I., Câncer, 77: 474-482, 1996; Jensen, V., Ladekarl, M., Holm Nielsen, P., Melsen, F. , e Soerensen, F. B. 0 valor prognóstico da expressão e da actividade proliferativa do antigénio oncogénico 519 (0A- 519) detectada pelo anticorpo MIB-1 no cancro da mama sem nódulos., Journal of Pathology, 176: 343-352, 1995), bem como noutros cancros (Rashid, A. . , Pizer, E. S. , Moga, M. ,

Milgraum, L. Z., Zahurak, M. , Pastemack, G. R. , Kuhajda, F. P., e Hamilton, S. R. Expressão elevada da sintase dos ácidos gordos e aumento da actividade sintética dos ácidos gordos na neoplasia colorectal., American Journal of Pathology. 150: 201-208,1997; Pizer, E., Lax, S., Kuhajda, F., Pasternack, G., e Kurman, R. Expressão da sintase dos ácidos gordos no carcinoma do endométrio: correlação com a proliferação celular e com os receptores hormonais., Câncer. 83: 528-537, 1998) . A expressão da FAS também foi identificada no carcinoma da mama intraductal e lobular in si tu; lesões associadas com risco aumentado do desenvolvimento de cancro da mama infiltrante (Milgraum, L. Z., Witters, L. A. , Pasternack, G. R. , e Kuhajda, F. P. Os enzimas da via de síntese dos ácidos gordos apresentam uma expressão elevada no carcinoma da mama in situ., Clinicai Câncer Research. 3: 2115-2120, 1997). A FAS é a principal enzima de síntese da síntese dos ácidos gordos (síntese de 2 FA) que catalisa a condensação de malonil-CoA e acetil-CoA, dependente de NADPH, para produzir predominantemente o ácido gordo livre, saturado, com 16 átomos de carbono, palmitato (Wakil, S. Sintase dos ácidos gordos, uma enzima multifuncional proficiente., Biochemistry. 28: 4523-4530, 1989). Medições ex-vivo em tecido tumoral revelaram níveis elevados de síntese tanto de FAS como de ácidos gordos, indicando que o programa genético no seu todo, consistindo de 25 enzimas da hexoquinase à FAS, se encontra muito activo. Células cancerosas humanas cultivadas tratadas com inibidores da FAS, incluindo o produto fúngico, cerulenina, e o novo composto C75, demonstraram um rápido declínio na síntese de ácidos gordos, com redução subsequente da síntese de ADN e paragem do ciclo celular, culminando em apoptose (Pizer, E. S., Jackisch, C., Wood, F. D., Pasternack, G. R., Davidson, N. E., e Kuhajda, F. A inibição da síntese de ácidos gordos induz morte celular programada em células de cancro da mama humano., Câncer Research. 56: 2745-2747, 1996, Pizer, E. S., Chrest, F. J., DiGiuseppe, J. A., e Han, W. F. Inibidores farmacológicos da sintase dos ácidos gordos de mamífero suprimem a réplica do ADN e induzem apoptose em linhagens de células tumorais.. Câncer Research. 58: 4611-4615, 1998). A inibição farmacológica da actividade da sintase dos ácidos gordos de mamífero levou à inibição da replicação do ADN num período que não excede cerca de 90 minutos após a aplicação do fármaco. Estas observações sugeriram uma ligação bioquímica vital entre a síntese dos ácidos gordos e o crescimento de células cancerosas. Embora gerando muita atenção, a questão de como a inibição da sintase dos ácidos gordos desencadeava este fenómeno permaneceu desconhecida. É importante assinalar que estes efeitos ocorreram apesar 3 da presença de ácidos gordos exógenos no meio de cultura derivado de soro bovino fetal. Embora tenha sido possível desbloquear certas células do efeito citotóxico da cerulenina, em condições de cultura isentas de ácidos gordos, por adição de palmitato exógeno, a maioria das células cancerosas não foram desbloqueadas da inibição da síntese de ácidos gordos pelo produto final da via de síntese (dados não apresentados) (Pizer, E. S., Wood, F. D., Pasternack, G. R., e Kuhajda, F. P. Sintase dos ácidos gordos (FAS): Um alvo para antimetabolitos citotóxicos em células de leucemia promielocítica HL60., Câncer Research. 1996: 745-751, 1996). Assim, permaneceu por resolver se o efeito citotóxico da inibição da síntese dos ácidos gordos na maioria das células cancerosas resultava de uma míngua de produto final ou de algum outro mecanismo bioquímico.

Sumário da Invenção

De acordo com uma característica da invenção, estabelece-se a utilização de um inibidor de MCD, que provoca um aumento da malonil-CoA intracelular em células tumorais de um organismo, para a preparação de um medicamento para a inibição do crescimento de células tumorais no organismo.

De acordo com uma característica alternativa da invenção, estabelece-se a utilização de uma composição que causa um aumento da malonil-CoA intracelular em células tumorais de um organismo, em que o referido aumento da malonil-CoA intracelular está correlacionado com um aumento da síntese da malonil-CoA, para a preparação de um medicamento para a inibição do crescimento de células tumorais num organismo.

Esta invenção fornece um método para provocar a morte de células cancerosas por elevação aguda da malonil Coenzima A 4 (malonil-CoA) celular o que leva à apoptose. A elevação da malonil-CoA, induzida pela inibição da sintase dos ácidos gordos (FAS), está correlacionada tanto com a inibição da síntese dos ácidos gordos como também com a inibição da carnitina palmitoiltransferase-1 (CPT-1). Qualquer combinação de fármacos que produza um efeito fisiológico análogo pode esperar-se que conduza ao mesmo efeito em células tumorais susceptíveis. Por exemplo, a terapêutica combinada, com fármaco(s) que inibem a síntese dos ácidos gordos por inibição da acetil-CoA carboxilase (a primeira enzima na via de síntese dos ácidos gordos) e com fármaco(s) que inibem a CPT-1, pode esperar-se que induza apoptose em células tumorais. Por isso, esta invenção fornece um método qualquer para inibir sistemicamente a actividade da CPT-1 em células cancerosas, que inclui, mas não se limita â inibição directa da CPT-1 através de inibidores como pequenas moléculas, como é o etomoxir, bem como à inibição da CPT-1 que possa provocar o aumento do nível da malonil-CoA em células cancerosas.

Esta estratégia terapêutica conduzirá a novos agentes quimioterápicos para uma ampla variedade de cancros humanos. Adicionalmente, como esta ê uma nova via que conduz à apoptose e que não é partilhada por outros fármacos utilizados no cancro, pode prever-se que a indução de níveis elevados de malonil-CoA e/ou a inibição da CPT-1 poderão potenciar outros agentes terapêuticos geralmente utilizados no cancro. A invenção fornece um método para inibir o crescimento de células tumorais num organismo administrando ao organismo uma composição que causa um aumento da malonil-CoA intracelular em células tumorais do organismo. De preferência, a malonil-CoA intracelular, pelo menos nas 5 células tumorais do organismo, aumenta bruscamente (isto é, de forma brusca ou aguda), e de maior preferência, a malonil-CoA intracelular aumenta antes de qualquer aumento significativo da taxa de consumo da malonil-CoA. Tipicamente, a malonil-CoA intracelular em células do organismo aumenta até 3 horas após administração, e a malonil-CoA intracelular pode esperar-se que aumente antes de ocorrer inibição do crescimento das células.

De preferência, o aumento da malonil-CoA intracelular está correlacionado com a redução no consumo da malonil-CoA. Por exemplo, o aumento da malonil-CoA intracelular poderá estar correlacionado com redução da actividade intracelular da malonil-CoA descarboxilase (MCD) ou com actividade intracelular reduzida da sintase dos ácidos gordos; e, opcionalmente, a composição pode compreender um inibidor da MCD. Numa outra preferência, o aumento da malonil-CoA intracelular está correlacionado com o aumento da síntese da malonil-CoA e/ou o aumento da malonil-CoA intracelular está correlacionado com actividade intracelular aumentada da acetil-CoA carboxilase (ACC). A invenção fornece uma composição que compreende um agente seleccionado do grupo que consiste num activador da ACC, num inibidor da proteína quinase 5'-AMP-activada (AMPK), e/ou num inibidor da acil-CoA sintase. A composição pode compreender um inibidor da carnitina palmitoiltransferase-1 (CPT-1), que pode ser o etomoxir, administrado de preferência em combinação com um agente do grupo precedente. Alternativamente, um segundo agente quimioterápico é administrado ao organismo, sendo que o referido segundo agente quimioterápico não é inibidor da síntese dos ácidos gordos. 6

De preferência, o método fornecido por esta invenção é utilizado para tratar organismos que, antes da administração da composição, apresentam um nível de malonil-CoA intracelular em células tumorais pelo menos 2 vezes maior do que o nível de malonil-CoA normal em células não malignas. Com maior preferência, o método é utilizado para tratar organismos em que a taxa de síntese dos ácidos gordos nalgumas células do organismo é pelo menos 2 vezes acima da de células normais antes da administração da composição, e a administração da composição é citotóxica para essas células. De preferência, o organismo compreende células tumorais que apresentam taxas elevadas de síntese de ácidos gordos e o número de células dessas células tumorais é reduzido na sequência da administração da referida composição. De preferência, após o tratamento, o nível de malonil-CoA intracelular é aumentado e o nível de acetil-CoA intracelular e de CoA livre encontram-se reduzidos, relativamente aos níveis pré-tratamento.

De acordo com uma outra característica da invenção, é fornecida a utilização de (a) um inibidor da síntese dos ácidos gordos nas células tumorais de um organismo; e (b) um inibidor da oxidação dos ácidos gordos nas referidas células, na preparação de um medicamento para a inibição do crescimento de células tumorais no organismo. De preferência, o inibidor da oxidação dos ácidos gordos encontra-se incluído numa quantidade que não inibe significativamente a CPT-2. Com maior preferência, o inibidor da síntese dos ácidos gordos e o inibidor da oxidação dos ácidos gordos encontram-se incluídos em quantidades para atingir níveis de inibição que são pelo menos aproximadamente iguais ou superiores aos níveis das respectivas inibições observadas para doses citotóxicas de cerulenina. 7

Noutra concretização, esta invenção fornece um método de screening para auxiliar na detecção de composições que são selectivamente citotóxicas para células tumorais, que compreende a administração de uma composição alvo a uma célula que apresenta um nível de malonil-CoA intracelular elevado, a monitorização do nível de malonil-CoA intracelular na célula subsequentemente a esta administração, com um aumento abrupto da malonil-CoA intracelular a ser indicativo de citotoxicidade selectiva. De preferência, este método compreende ainda a comparação do tipo de alterações verificadas no nível de malonil-CoA intracelular na presença e na ausência de TOFA, em que as alterações menores no nível de malonil-CoA na presença de TOFA são indicativas de citotoxicidade selectiva.

Ainda numa outra concretização, esta invenção estabelece um método de screening para auxiliar na detecção de composições que são inibidoras do crescimento para células tumorais e que compreende a administração de uma composição alvo a uma linhagem de células derivadas de tumor e a monitorização da actividade da CPT-1 na célula subsequente a esta administração, em que uma redução de actividade da CPT-1 é indicativa de potencial de inibição do crescimento. De preferência, o método é executado quando a célula se encontra permeabilizada. Alternativamente, o método compreende ainda a monitorização da referida célula relativamente â apoptose, e a monitorização relativamente à apoptose pode compreender um método seleccionado do grupo que consiste na medição do potencial transmembrana mitocondrial, coloração com corantes vitais, monitorização da activação da caspase em células inteiras utilizando 8

Western blot e medição de citocromo C obtido de mitocôndrias utilizando Western blot.

Breve Descrição das Figuras A Figura 1 apresenta a via de síntese dos ácidos gordos e o efeito de vários inibidores da sintase dos ácidos gordos na síntese dos ácidos gordos e no crescimento das células tumorais. A Figura 2 apresenta os níveis de malonil-CoA sob diversas condições. A Figura 3 apresenta os resultados de ensaios clonogénicos (clonogenic assays) e ensaios de apoptose em células de cancro da mama tratadas com diversos inibidores. A Figura 4 apresenta diversos parâmetros em células tumorais e células de fígado. A Figura 5 apresenta os níveis de malonil-CoA em células tumorais e células de fígado. A Figura 6 apresenta a via da oxidação celular dos ácidos gordos. A CPT-1 regula a oxidação dos ácidos gordos na mitocôndria por controlo da passagem de derivados acil-CoA de cadeia longa, tal como palmitoil-CoA, através da membrana mitocondrial externa para o interior da mitocôndria, evitando assim o ciclo inútil de oxidação de ácidos gordos sintetizados endogenamente. A Figura 7 apresenta o efeito do Etomoxir sobre o crescimento de células MCF-7 com e sem C-75. 9 A Figura 8 apresenta o efeito da cerulenina sobre a oxidação de ácidos gordos era células MCF-7. A Figura 9 apresenta o efeito do Etomoxir, TOFA e cerulenina sobre a actividade da CPT-1. A Figura 10 apresenta o efeito do Etomoxir sobre a oxidação dos ácidos gordos em células MCF-7. A Figura 11 apresenta o efeito do Etomoxir sobre o crescimento das células MCF-7. A Figura 12 apresenta os resultados de ensaios clonogénicos com células MCF-7 tratadas tanto com Etomoxir como com TOFA. A Figura 13 apresenta o efeito do Etomoxir e/ou C-75 sobre o crescimento de células MCF-7.

Descrição Detalhada das Concretizações

Se a míngua de ácidos gordos mediou os efeitos citotóxicos da cerulenina e do C75, então, qualquer outro inibidor da síntese dos ácidos gordos de potência similar deveria produzir efeitos similares. Para testar este conceito, os inventores compararam os efeitos, em células cancerosas, da inibição da acetil-CoA carboxilase (ACC, E.C. 6.4.1.2), a enzima que limita a taxa de síntese de ácidos gordos, com os efeitos de inibidores da FAS. Os inventores descobriram que a inibição que a inibição da FAS conduz a níveis elevados de malonil-CoA que ocorrem num prazo de uma hora após o tratamento com C75. Estes níveis super fisiológicos de malonil-CoA, e não meramente os baixos níveis de ácidos 10 gordos endogenamente sintetizados, são responsáveis pela apoptose da célula do cancro da mama. Adicionalmente, esta é uma nova via que conduz à apoptose selectiva de células cancerosas. A Figura IA descreve em linhas gerais a porção da via de síntese dos ácidos gordos, que contém as enzimas alvo para os inibidores utilizados neste estudo. A inibição da sintase dos ácidos gordos resulta em níveis elevados de malonil-CoA o que contribui para a citotoxicidade em relação a células de cancro da mama (ref). Adicionalmente ao seu papel como substrato para a síntese dos ácidos gordos, a malonil-CoA é um potente inibidor da carnitina palmitoiltransferase-1 (CPT-1), a enzima limitadora da taxa de oxidação de ácidos gordos. A CPT-1 é uma proteína que integra a membrana externa da mitocôndria que realiza uma transesterificação de acil-CoA's com cadeia longa, gordas, com L-carnitina produzindo acilcarnitina. A acilcarnitina é transportada através das membranas mitocondriais onde é esterifiçado de novo para acil-CoA pela CPT-2.

Fisiologicamente, a actividade da CPT-1 é regulada através de inibição pela malonil-CoA, um substrato da síntese dos ácidos gordos. A malonil-CoA é o produto enzimático da acetil-CoA carboxilase (ACC, E.C. 6.4.1.2), a enzima que fixa a taxa de conversão da síntese dos ácidos gordos. Os níveis no citoplasma de malonil-CoA são mais elevados durante a síntese dos ácidos gordos devido â actividade aumentada da ACC. Os níveis elevados da malonil-CoA, por sua vez, inibem a CPT-1 e bloqueiam a entrada na mitocôndria de acil-CoA's de cadeia longa. Isto evita o ciclo inútil de síntese e oxidação simultânea de ácidos gordos. No músculo, que é essencialmente desprovido de FAS, a ACC e a malonil-CoA regulam a oxidação de ácidos gordos, 11 uma importante fonte de energia para o músculo cardíaco e para o músculo esquelético. O TOFA (ácido 5-(tetradeciloxi)-2-furóico) é um inibidor alostérico da acetil-CoA carboxilase (ACC, E.C. 6.4.1.2), que bloqueia a carboxilação da acetil-CoA para malonil-CoA. Uma vez esterificado para coenzima-A, a TOFA-CoA inibe alostericamente a ACC com um mecanismo similar ao das acil-CoA's de cadeia longa, os inibidores produto final fisiológicos da ACC (Halvorson, D. L. e McCune, S. A. Inibição da síntese dos ácidos gordos em adipócitos isolados por ácido 5-(tetradeciloxi)-2-furóico., Lipids. 19: 851-856, 1984). Tanto a cerulenina (Funabashi, H.,

Kawaguchi, A., Tomoda, H., Omura, S., Okuda, S., e Iwasaki, S. Site de ligação da cerulenina na sintetase dos ácidos gordos., J. Biochem. 105: 751-755, 1989) como o C75 (Pizer, et al. , 1998) são inibidores da FAS, evitando a condensação da malonil-CoA e da acetil-CoA com ácidos gordos. A cerulenina é um inibidor suicida, formando um produto de adição covalente com a FAS (Moche, M. , Schneider, G., Edwards, P., Dehesh, K. , e Lindqvist, Y. Estrutura do complexo entre o antibiótico cerulenina e o seu alvo, proteína sintase portadora de beta-cetoacilo., J Biol Chem. 274: 6031-6034, 1999), enquanto o C75 é provavelmente um inibidor que se liga lentamente (Kuhajda, F. P., Pizer E. S., Mani, N. S., Pinn, M. L. , Han W. F. , Chrest F. J. , e CA. T., Síntese e actividade anti-tumor de um novo inibidor da sintase dos ácidos gordos, Proceeding of the American Association for Câncer Research, 40: 121, 1999). Utilizando o TOFA, os inventores alcançaram uma inibição da síntese de ácidos gordos em linhagens de células do cancro da mama humano comparável à inibição pela cerulenina ou pelo C75. No entanto, surpreendentemente, o TOFA foi essencialmente não citotóxico em ensaios clonogénicos de células de cancro 12 da mama humano. Estes dados indicam que a míngua de ácidos gordos não é uma fonte principal de citotoxicidade para células cancerosas em culturas suplementadas com soro. Um efeito alternativo da inibição da FAS (níveis elevados do substrato, malonil-CoA, resultantes especificamente da inibição da FAS) parece mediar a citotoxicidade da cerulenina e do C75. A malonil-CoA, o produto enzimático da acetil-CoA carboxilase (ACC, E.C. 6.4.1.2), é uma molécula reguladora fundamental no metabolismo celular. Adicionalmente ao seu papel como um substrato na sintase dos ácidos gordos, a malonil-CoA regula a β-oxidação dos ácidos gordos através da sua interacção com a carnitina palmitoiltransferase-1 (CPT-l) na membrana externa das mitocôndrias. A carnitina palmitoiltransferase-1 (CPT-l) é a enzima limitadora da taxa de oxidação dos ácidos gordos na mitocôndria (ver Figura 6). É uma proteína integrante da membrana externa da mitocôndria que realiza uma transesterificação das acil-CoA's gordas, de cadeia longa, com a L-carnitina produzindo acilcarnitina. A acilcarnitina é transportada através das membranas mitocondriais onde é esterificada de volta a acil-CoA pela CPT-2.

Muitos tipos de células cancerosas apresentam níveis elevados de síntese de ácidos gordos. Como seria de esperar, células com níveis elevados de síntese de ácidos gordos apresentam níveis elevados de malonil-CoA no estado estacionário, pelo menos seis vezes os níveis em células normais (ver Exemplo 6) . O tratamento de células tumorais com inibidores da FAS aumentará de forma selectiva e abrupta os níveis de malonil-CoA para níveis super fisiológicos em células cancerosas. Este estratagema aumenta os níveis de malonil-CoA tanto bloqueando a 13 utilização de malonil-CoA como um substrato na síntese dos ácidos gordos como concomitantemente estimulando a síntese da malonil-CoA ao reduzir a inibição da ACC, pela acil-CoA gorda (Figura IA) . Uma vez que a FAS é preferencialmente expressa em células cancerosas, a elevação da malonil-CoA encontra-se largamente restringida às células tumorais. Isto conduz à apoptose das células cancerosas e a que os tecidos normais sejam poupados como ocorre em xenoenxertos de cancros humanos tratados com inibidores da FAS (Ver Exemplo 5). A CPT-1 apresenta duas isoformas, tipo fígado (L-CPT-1) e tipo músculo (M-CPT-1) (Swanson, S. T., Foster, D. W. , McGarry, J. D. e Brown, N. F. Papel dos domínios N- e C-terminal das isoformas da carnitina palmitoiltransferase I na sensibilidade das enzimas à malonil-CoA: perspectivas a partir da expressão de proteínas quiméricas e da mutação de resíduos de histidina conservados., Biochem. J. 335: 513-519, 1998). Estas isoformas apresentam propriedades cinéticas totalmente diferentes nos seus para a carnitina (500 μΜ para a M-CPT-1 e ~30 μΜ para a L-CPT-1) e sensibilidade à inibição da malonil-CoA (M-CPT-1 é 100 vezes tnais sensível, Κτ =0,07 μΜ versus 7 μΜ) . Enquanto o site de regulação da malonil-CoA se situa na região N-terminal, o site exacto de ligação não foi ainda elucidado (Swanson, et al. , 1998). É importante salientar que o etomoxir, um inibidor covalente da CPT-1, aqui utilizado como um exemplo de inibidor da CPT-1, se liga num site diferente do da malonil-CoA. A CPT-1 não foi estudada em células cancerosas humanas. Por isso, a isoforma expressa nas células cancerosas humanas é desconhecida. Conceptualmente, a isoforma do fígado deveria ser expressa em tumores de diferenciação epitelial que 14 inclui todos os carcinomas, enquanto a isoforma do músculo seria expressa em tumores não epiteliais, tais como os sarcomas. No entanto, estudos das isoformas de fígado e de músculo da ACC constataram que qualquer das ou ambas as isoformas podem ser expressas em células do cancro da mama humano (Witters, L. , Widmer, J. , King, A., Fassihi, K. e Kuhadja, F. Identificação das isozimas da acetil-CoA carboxilase humana em tecido e em células de cancro da mama., International Journal of Biochemistry. 26: 589-594, 1994) . De forma semelhante, as células de carcinoma humano poderão ter a capacidade de expressar qualquer ou ambas as isoformas da CPT-1.

Recentemente, mostrou-se que a inibição da CPT-1 sensibilizava as células para a apoptose induzida por ácidos gordos (Paumen, M. B. , Ishida, Y. , Muramatsu, M. , Yamamoto, M. e Honj o, T. A inibição da carnitina palmitoiltransferase-1 aumenta a síntese de esfingolípidos e a apoptose induzida por palmitato., J. Biol. Chem. 272: 3324-3329, 1997). Além disso, níveis aumentados de malonil-CoA induzidos pela inibição da sintase dos ácidos gordos (FAS) são citotóxicos para células de cancro humano (ver Exemplos 4 e 5) . Tomados em conjunto, estes dados sugerem que as células de cancro humano são susceptíveis â indução de apoptose pela via de alterações ao metabolismo dos ácidos gordos. Também se mostrou que a CPT-1 interage directamente com a BCL-2, a proteína anti-apoptose, na membrana mitocondrial externa (Paumen, Μ. B., Ishisa, Y. , Han, H., Muramatsu, M., Eguchi, Y., Tsujimoto, Y. e Honjo, T. Interacção directa da proteína da membrana mitocondrial carnitina palmitoiltransferase-1 com a BCL-2, Biochem Biophys Res Commun. 231: 523-525, 1997). Potencialmente, a interacção da CPT-1 com a BCL-2 pode proporcionar um 15 mecanismo "down-stream" que conduza à apoptose por modulação dos efeitos anti-apoptose da BCL-2.

Adicionalmente ao seu papel como um substrato da FAS, a malonil-CoA actua na membrana mitocondrial externa para regular a oxidação dos ácidos gordos por inibição da carnitina palmitoiltransferase-1 (CPT-1). Foi mostrado que a inibição da CPT-1 sensibiliza as células para a apoptose induzida por ácidos gordos; a CPT-1 pode também interferir directamente com a BCL-2, a proteína anti-apoptose, nas mitocôndrias. A inibição da FAS conduz a níveis elevados de malonil-CoA inibindo a CPT-1 que induz a apoptose das células cancerosas. Como a maior parte das células normais proliferativas e não proliferativas não possuem níveis elevados de FAS, não serão afectadas por esta estratégia terapêutica.

Os níveis de malonil-CoA podem ser manipulados utilizando uma variedade de métodos e de enzimas alvo. Os Exemplos demonstram elevação dos níveis da malonil-CoA através de uma utilização reduzida e simultaneamente através de uma produção aumentada. A elevação aguda dos níveis de malonil-CoA levou à destruição selectiva das células cancerosas por via de apoptose deixando as células normais sem serem afectadas. Os métodos para induzir a apoptose, de acordo com esta invenção, cabem em duas categorias principais: indução directa de um aumento agudo da malonil-CoA (por exemplo, por inibição da FAS) e utilização de terapêutica combinada para inibir quer a oxidação dos ácidos gordos quer a síntese dos ácidos gordos (por exemplo, através de um modo de inibição não FAS) . Esta estratégia terapêutica identifica novos alvos potenciais e estratégias para quimioterapia do cancro baseados em alterações do metabolismo dos ácidos gordos. 16 A oxidação dos ácidos gordos pode ser inibida por via da inibição da CPT-1, directamente por agentes inibidores, tal como o etomoxir. Também se podem desenvolver inibidores específicos para as isoformas de CPT-1. Alternativamente, poderiam manipular-se os níveis de carnitina para reduzir a actividade da CPT-1 reduzindo o seu substrato. Também, se podem reduzir os níveis de expressão da CPT-1 quer por manipulação genética quer por redução dos ácidos gordos exógenos. 0 Exemplo 7 abaixo é um exemplo do método de inibição directa da CPT-1, utilizando etomoxir em células de cancro da mama humano.

Outras estratégias para inibir a síntese e a oxidação dos ácidos gordos incluem qualquer método para aumentar os níveis de malonil-CoA por aumento da síntese, diminuição da degradação ou preferencialmente por ambos. Os níveis de malonil-CoA podem ser manipulados, utilizando uma variedade de métodos e enzimas alvo. Os Exemplos 4-5 demonstram uma elevação dos níveis de malonil-CoA através de uma utilização reduzida e simultaneamente de uma produção aumentada. Um aumento agudo dos níveis de malonil-CoA conduz à destruição selectiva das células cancerosas via apoptose deixando as células normais sem serem afectadas. Outros exemplos demonstram vias adicionais para causar inibição do crescimento ou morte de células cancerosas.

De preferência, a manipulação do metabolismo dos ácidos gordos, de acordo com esta invenção, é realizada por administração de uma composição (ou de múltiplas composições) a um organismo com necessidade da(s) mesma(s). A composição administrada ao organismo conterá um agente com pelo menos um efeito biológico nas vias metabólicas dos ácidos gordos, por exemplo aumentando os níveis 17 intracelulares de malonil-CoA. Tipicamente, o organismo será um mamífero, tal como ratinho, rato, coelho, cobaia, gato, cão, cavalo, vaca, ovelha, cabra, porco ou um primata, tal como chimpanzé, babuíno, ou de preferência um homem. Habitualmente, o organismo conterá células neoplásicas (malignas). 0 método desta invenção é direccionado para afectar selectivamente as células malignas e para ter menor efeito (ou de preferência nenhum efeito) sobre as células normais (não malignas). O agente, na composição administrada ao organismo, elevará, de preferência, os níveis intracelulares de malonil-CoA em pelo menos uma porção das células malignas no organismo. De preferência, o nível de malonil-CoA será aumentado pelo menos para o dobro, de maior preferência para 5 vezes mais. De preferência, o agente elevará a concentração intracelular da malonil-CoA nas células malignas para um nível mais elevado que o nível nas células normais circundantes.

Agentes adequados poderão elevar os níveis de malonil-CoA por um qualquer de diversos métodos (ver mecanismos alternativos listados abaixo). Os agentes preferidos induzem, tipicamente, um aumento repentino ou abrupto do nível de malonil-CoA. Nalgumas concretizações, são administrados dois ou mais agentes e alguns desses agentes ou todos poderão afectar o nível de malonil-CoA por um mecanismo diferente. Alternativamente, poderá ser utilizada uma combinação de agentes para reduzir a síntese dos ácidos gordos e simultaneamente reduzir a oxidação dos ácidos gordos. De preferência, os níveis de síntese e de oxidação dos ácidos gordos serão reduzidos para níveis comparáveis aos alcançados com tratamento citotóxico com cerulenina. Nas composições e métodos desta invenção, poderão ser 18 utilizados agentes, actuando por qualquer dos modos da lista seguinte. Ensaios para as actividades seguintes estão disponíveis na literatura e a determinação de se um agente específico apresenta uma destas actividades encontra-se no âmbito da perícia na arte.

Aumentando a produção de malonil-CoA:

Efectores de acetil-CoA carboxilase (ACC): Agentes que aumentam a actividade da ACC, reduzem a inibição da ACC ou aumentam a massa de enzima ACC activa conduzirão a níveis aumentados de malonil-CoA.

Efectores da 5'-AMP proteína quinase: A 5'-AMP proteína quinase inibe a ACC por fosforilação, conduzindo a uma redução aguda da malonil-CoA. Os inibidores desta quinase conduziriam a níveis correspondentes a um aumento agudo da malonil-CoA por desbloqueamento da inibição da ACC.

Efectores da sintase do citrato: 0 aumento do citrato mitocondrial forneceria substrato para a síntese dos ácidos gordos, e o citrato também actua como um activador "feed-forward" da ACC causando um aumento da síntese da malonil-CoA.

Efectores da acil-CoA sintase: A inibição da acil-CoA sintase reduziria a concentração celular de acil-CoA gorda desbloqueando a inibição da ACC. Isto resultaria em actividade da ACC aumentada e níveis aumentados da malonil-

CoA. 19

Reduzindo a utilização da malonil-CoA:

Efectores da malonil-CoA descarboxilase (MCD): Esta enzima catalisa uma descarboxilação ATP dependente da malonil-CoA de volta a acetil-CoA. A inibição da MCD provocaria um aumento agudo dos níveis da malonil-CoA.

Diminuição da utilização e aumento da produção da malonil-CoA, simultâneos;

Efectores da sintase dos ácidos gordos (FAS): A inibição da FAS conduz a uma utilização diminuída da malonil-CoA por bloqueamento da sua incorporação em ácidos gordos. A inibição da FAS também conduz a níveis reduzidos de acil-CoA gorda que activarão a ACC. Inibidores da FAS representativos podem ser obtidos tal como descrito nas Patentes U.S. nos 5,759,837 e 5,981,575.

Estas estratégias para modificar o metabolismo dos ácidos gordos e, especialmente, para aumento agudo dos níveis da malonil-CoA podem ser utilizadas em conjunto ou em concertação com outros fármacos para intensificar a apoptose de células cancerosas. De preferência, pelo menos um agente nas composições desta invenção aumenta o nível da malonil-CoA por um mecanismo distinto da inibição da FAS.

ADMINISTRAÇÃO DOS COMPONENTES

Os agentes terapêuticos de acordo com esta invenção são preferencialmente formulados em composições farmacêuticas contendo o agente e um veículo farmacêuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode conter outros componentes desde que os outros componentes não reduzam a eficácia do agente, de acordo com esta invenção, a tal ponto que a 20 terapêutica seja negada. Os veículos farmacêuticaraente aceitáveis são bem conhecidos, e um perito na arte farmacêutica pode facilmente seleccionar veículos adequados para vias de administração específicas (ver por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton. PA, 1985).

As composições farmacêuticas, contendo qualquer dos agentes desta invenção, podem ser administradas por via parenteral (subcutânea, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intrapleural, intravesicular ou intratecal), tópica, oral, rectal ou nasal, como necessário em função do fármaco escolhido. As concentrações do agente activo em veículos farmacêuticamente aceitáveis podem ser de 0,01 a 1 M ou mais, desde que a concentração não exceda um nível aceitável de toxicidade no local de administração.

As doses e a duração da terapêutica dependerão de uma variedade de factores, incluindo o índice terapêutico dos fármacos, o tipo de doença, a idade do doente, o peso do doente e a tolerância à toxicidade. A dose será geralmente escolhida para se alcançarem concentrações séricas desde cerca de 0,1 pg/ml a cerca de 100 pg /ml. De preferência, os níveis da dose inicial serão seleccionados com base na sua capacidade para alcançar concentrações ambientes, que se tenham mostrado eficazes em modelos in-vitro, tais como os aqui descritos, e em modelos in-vivo e em ensaios clínicos, até aos níveis máximos tolerados. A prática clínica corrente prefere que a quimioterapia seja adaptada ao doente individual e que a concentração sistémica do agente de quimioterapia seja monitorizada regularmente. A dose de um fármaco específico e a duração da terapêutica para um dado doente podem ser determinadas pelo médico especialista, utilizando abordagens farmacológicas 21

Standard, tendo em consideração os factores acima referidos. A resposta ao tratamento poderá ser monitorizada por análise aos níveis no sangue ou nos fluidos corporais do agente, de acordo com esta invenção, por medição da actividade do agente ou dos seus níveis em tecidos relevantes ou por monitorização do estado da doença no doente. O médico especialista ajustará a dose e a duração da terapêutica com base na resposta ao tratamento revelada por estas medições.

EXEMPLOS

Para facilitar um entendimento mais completo da invenção, são apresentados abaixo diversos Exemplos. No entanto, o âmbito da invenção não se encontra limitado a concretizações específicas, reveladas nestes Exemplos, que têm apenas um objectivo de ilustração.

Exemplo 1. Inibição da FAS em células in vitro TOFA, Cerulenina, e C75 todos inibem a sintase dos ácidos gordos em células de cancro da mama humano. As linhagens de células de cancro da mama humano, SKBR3 e MCF7 foram mantidas em RPMI com 10% de soro bovino fetal. As células foram testadas periodicamente relativamente à contaminação com Micoplasma (Gen-probe). Todos os inibidores foram adicionados como soluções stock 5 mg/ml em DIVISO. Para determinações de actividade de síntese de ácidos gordos, 5xl04 células/poço, em placas de 24 poços, foram marcadas "pulse" com [U-14C] -acetato após exposição a fármaco e os lípidos foram extraídos e quantificados, tal como descrito anteriormente (Pizer, et al. , 1988) . Para as células MCF7, a actividade da via de síntese foi determinada após 2 horas de exposição a inibidor. As células SKBR3 demonstraram uma 22 resposta mais lenta aos inibidores da FAS, possivelmente devido ao seu teor de FAS extremamente elevado, sendo, por isso, a actividade da via de síntese determinada após 6 horas de exposição ao inibidor.

Em estudos Standard de marcação "pulse" em que as linhagens de células de cancro da mama, SKBR3 e MCF7, foram marcadas durante 2 horas, após exposição aos inibidores da síntese dos ácidos gordos, TOFA, C75, e cerulenina todos inibiram a incorporação de [U14C-acetato] em lípidos numa extensão similar (Figura 1B e D) . Em numerosos estudos similares (não apresentados) , o TOFA apresentou uma inibição máxima da síntese dos ácidos gordos no intervalo de dose de 1 a 5 pg/ml em todas as linhagens de células testadas, e a cerulenina e o C75 apresentaram uma inibição máxima da síntese dos ácidos gordos à volta dos 10 pg/ml.

Exemplo 2. Efeito dos mesmos inibidores sobre o crescimento celular TOFA, Cerulenina, e C75 todos inibiram a síntese dos ácidos gordos em células de cancro da mama humano, mas apresentaram citotoxicidade diferenciada. As células e os inibidores foram como os descritos para o Exemplo 1. Para os ensaios clonogénicos, 4xl05 células foram colocadas em placa em frascos de 25 cm3 com inibidores adicionados durante 6 horas nas concentrações constantes de lista. Números iguais de células tratadas e de controlos foram colocadas em placa em pratos de 60 mm. Os clones foram corados e contados após 7 a 10 dias.

Embora todos os inibidores tenham reduzido a síntese dos ácidos gordos em grau semelhante, o TOFA foi não tóxico ou estimulador do crescimento da célula de cancro no intervalo 23 de dose para inibição da ACC, tal como medido por ensaios clonogénicos, enquanto a cerulenina e o C75 foram significativamente citotóxicos no intervalo de dose para inibição da FAS (Figura 1C e E). A diferença profunda entre os efeitos citotóxicos da inibição da ACC e da FAS demonstra que a redução aguda da produção de ácidos gordos de per si não é a principal fonte de lesão da célula após inibição da FAS.

Exemplo 3. Medição da malonil-CoA. A diferença mais óbvia nos resultados esperados da inibição destas duas enzimas era que os níveis de malonil-CoA deveriam cair após inibição da ACC, mas deveriam aumentar após inibição da FAS. Embora não investigados anteriormente em eucariotas, dados recentes em E. coli demonstraram níveis elevados de malonil-CoA resultantes da exposição a cerulenina (Chohnan, et al., 1997, "Alterações na dimensão e composição dos pools intracelulares de coenzima A não esterificada e de tioésteres de coenzima A em bactérias aeróbicas e facultativamente anaeróbicas" Applied and Environmental Microbiology, 63: 555-560). Os níveis de malonil-CoA foram medidos em células sujeitas a inibição da FAS e a inibição pelo TOFA sob condições descritas no Exemplo 2.

Os níveis de malonil-CoA foram medidos em células MCF-7, utilizando o método de HPLC de Corkey, et al. (1988, "Análise de ésteres de acil-coenzima A em amostras biológicas," Methods in Enzymology, 166: 55-70). Resumidamente, 2,5xlOs células/poço em placas de 24 poços foram sujeitas a 1,2 ml de 10% TCA a 4°C, após diversos tratamentos com fármacos. A massa da pélete foi registada e o sobrenadante foi lavado 6 vezes com 1,2 ml de éter e 24 levado à secura utilizando centrifugação no vácuo a 25° C. Os ésteres de coenzima-A foram separados e quantificados utilizando HPLC de fase reversa numa coluna Supelco C18 de 5 μ com um sistema HPLC Waters correndo software Millenium32 monitorizando 254 nm como a absorvância máxima para a coenzima-A. Foram utilizados os seguintes gradientes e tampões: Tampão A: 0,1 M fosfato de potássio, pH 5,0, Tampão B: 0,1 M fosfato de potássio, pH 5,0, com 40% acetonitrilo. Depois de uma passagem isocrática, 20 min. , com 92% A, 8% B a 0,4 ml/min, o fluxo foi aumentado para 0,8 ml/min, no intervalo de um minuto, após o que se utilizou um gradiente linear até 10% B até aos 24 min. , depois manteve-se a 10% B até aos 50 min., altura em que se utilizou um gradiente linear até 10 0% B até aos 55 min. , completando-se aos 60 min. Os seguintes ésteres de coenzima-A (Sigma) foram utilizados como standards: malonil-CoA, acetil-CoA, glutationa-CoA, succinil-CoA, HMG-CoA, e CoA livre. As amostras e os standards foram dissolvidos em 50 μΐ de tampão A. Os ésteres de coenzima-A foram eluídos sequencialmente como segue: malonil-CoA, glutationa-CoA, CoA livre, succinil-CoA, HMG-CoA e acetil-CoA. A determinação quantitativa dos ésteres de coenzima-A foi realizada pelo software Millenium32.

Medição directa de derivados de coenzima-A em células MCF-7 através de HPLC de fase reversa de extractos solúveis em ácido, de células tratadas com fármaco, confirmaram que tanto a cerulenina como o C75 causaram um rápido aumento dos níveis de malonil-CoA enquanto o TOFA reduziu os níveis de malonil-CoA. A Figura 2A é um cromatograma representativo que demonstra a separação e identificação de derivados da coenzima-A, que são importantes no metabolismo celular. Destes, a malonil-CoA é o primeiro a eluir, com um tempo de retenção na coluna de 19-22 minutos. A 25 sobreposição de cromatogramas na Figura 2B mostra que o tratamento com cerulenina conduziu a um aumento acentuado da malonil-CoA em relação ao controlo, enquanto o TOFA causou uma redução significativa. A identidade química da malonil-CoA foi confirmada independentemente juntando standards às amostras (não apresentado).

Os níveis de malonil-CoA foram marcadamente aumentados com inibição da FAS e reduzidos pelo TOFA. A análise de ensaios múltiplos na Figura 2C demonstrou que após uma exposição de 1 hora à cerulenina ou ao C75, a 10 pg/ml, os níveis de malonil-CoA aumentaram de 930% e 370% respectivamente, sobre os controlos, enquanto o tratamento com TOFA (2 0 yg/ml) conduziu a uma redução de 60% dos níveis de malonil-CoA. A concentração de TOFA requerida para uma redução máxima dos níveis de malonil-CoA foi 4 vezes mais elevada do que a dose para inibição da via de síntese nas Figuras 1B e D. No entanto, culturas optimizadas para a extracção de derivados da CoA tinham uma densidade celular 5 vezes superior ao das culturas utilizadas nos outros ensaios bioquímicos e de viabilidade apresentados. O aumento assinalável na malonil-CoA após inibição da FAS pode ser atribuído em parte ao desbloqueamento da inibição da ACC pela acil-CoA gorda de cadeia longa, conduzindo a um aumento na actividade da ACC (Figura IA) . Além disso, o aumento dos níveis de malonil-CoA induzidos pela cerulenina ocorreram nos 30 minutos após o tratamento (930 +/- 15% de aumento sobre o controlo, não apresentado) , no intervalo temporal de inibição da síntese dos ácidos gordos e bem antes do início da inibição da síntese do ADN ou de episódios iniciais de apoptose. Assim, os níveis elevados de malonil-CoA eram um efeito característico dos inibidores 26 da FAS e precederam temporalmente as outras respostas celulares, incluindo a apoptose.

Os níveis de cerulenina ou de C75 que induzem níveis elevados de malonil-CoA são citotóxicos para células de cancro da mama humano, tal como medido por ensaios clonogénicos e análise citométrica de fluxo da apoptose, utilizando coloração com merocianina 450. A inibição da FAS causa níveis elevados de malonil-CoA por inibição do seu consumo através de inibição da FAS, com estimulação concomitante da síntese por desbloqueamento do efeito inibidor da actividade da ACC pelas acil-CoA's de cadeia longa (Figura 2).

Exemplo 4. Recuperação com TOFA da inibição da FAS A recuperação com TOFA da inibição da FAS demonstra que os altos níveis de malonil-CoA são responsáveis pela citotoxicidade das células cancerosas. Se os níveis elevados de malonil-CoA resultantes da inibição da FAS fossem responsáveis pela citotoxicidade, então deveria ser possível recuperar células da inibição da FAS com TOFA, por redução da acumulação da malonil-CoA. A co-administração de TOFA e cerulenina a células SKBR3 (Figura 3A) anulou o efeito citotóxico da cerulenina de per si em ensaios clonogénicos, realizados como descrito no Exemplo 2. Em células MCF7 (Figura 3C) , o TOFA produziu uma modesta recuperação quer dos efeitos da cerulenina quer do C75, sob condições experimentais similares.

Análises citométricas de fluxo representativas de células SKBR3 (Figura 3B) e MCF7 (Figura 3D) consubstanciaram estas conclusões, uma vez que o TOFA recuperou células de apoptose induzida por cerulenina. A apoptose foi medida por 27 citometria de fluxo de parâmetros múltiplos, utilizando um citómetro de fluxo FACStarplus equipado com lasers de ãrgon e crípton (Becton Dickinson). A apoptose foi quantificada, utilizando coloração com merocianina 540 (Sigma), que detecta alterações no "packing" dos fosfolípidos da membrana do plasma que ocorrem numa fase inicial da apoptose, adicionada directamente a células de cultura (Pizer, et al. , 1998; Mower, et al. , 1994, "A redução do "packing" dos fosfolípidos da membrana e a diminuição da dimensão da célula precedem a clivagem do ADN na apoptose de células B maduras de ratinhos, J. Immunol., 152:4832- 4842). Nalguns estudos, alterações de conformação da cromatina na apoptose foram medidas simultaneamente com diminuição da coloração LDS-751 (Exciton) (Frey, et al., 1995, "Corantes de ácido nucleico para detecção de apoptose em células vivas," Cytometry, 21:265-274). A merocianina 540 [10 pg/ml] foi adicionada como uma solução stock em· água 1 mg/ml. As células foram coradas com LDS-751 numa concentração final de 100 nM a partir de 1 mM stock em DMSO. As células positivas para merocianina 540 foram marcadas por um aumento da fluorescência no vermelho, registada a 575 + /-20 nm, 0,5 a 2 logs acima das células negativas para merocianina 540. De modo similar, as células LDS-751 não brilhantes (demonstraram uma redução na fluorescência de 0,5 a 1,5 logs relativamente às células normais, registada a 660 nm com um filtro passa banda DF20. Os dados foram registados e analisados utilizando software CellQuest (Becton Dickinson).

Nestes estudos, todas as células não brilhantes LDS-751 eram brilhantes (bright) para merocianina 540, no entanto foi detectada uma população de células brilhantes para merocianina 540 que ainda não eram não brilhantes para LDS-751. Todas as células brilhantes para merocianina 540 foram 28 classificadas como apoptóticas. Estes ensaios também confirmaram a citotoxicidade diferenciada do TOFA (<5% de aumento da apoptose; nenhuma redução na clonogenicidade) comparada com a da cerulenina (>85% de apoptose; 70% de redução na clonogenicidade). Tomados em conjunto, estes estudos mostram que níveis elevados de malonil-CoA têm um papel no efeito citotóxico dos inibidores da FAS em células cancerosas.

Exemplo 5. Efeito de inibidores da FAS sobre o crescimento da célula tumoral in vivo

Para determinar se os efeitos da inibição da FAS observados in vitro se aplicariam a uma situação in vivo, requerendo actividade sistémica, testou-se o C75 contra xenoenxertos MCF-7 subcutâneos em ratinhos nude atímicos, para quantificar os efeitos sobre a sintase dos ácidos gordos e sobre o crescimento de um tumor sólido instalado. Estudos anteriores demonstraram eficácia local da cerulenina contra um xenoenxerto de cancro humano (Pizer, et al. , 1996, "Inibição da síntese dos ácidos gordos atrasa a progressão da doença num modelo de cancro do ovário, "Câncer Res., 56: 1189-1193) , mas foram limitados pela falha da cerulenina em actuar sistemicamente. As respostas similares de células de cancro da mama à cerulenina e ao C75 in vitro sugeriram que o C75 poderia ser eficaz in vivo contra células de cancro da mama de xenoenxerto.

Foram utilizados xenoenxertos subcutâneos, no flanco, de linhagem de células de cancro da mama humano MCF-7 em ratinhos nu/nu fêmea (Harlan) para estudar os efeitos anti-tumor do C75 in vivo. Todos os estudos animais cumpriram as "guidelines" institucionais sobre cuidados com animais. 29

Todos os ratinhos receberam uma pélete de estrogénio subcutânea de libertação prolongada 90-dias (Innovative Research), no flanco anterior, 7 dias antes da inoculação do tumor. Foram xenoenxertadas 107 células de MCF-7 de cultura em DMEM suplementada com 10% FBS e insulina 10 pg/ml. O tratamento começou quando se desenvolveram tumores mensuráveis cerca de 10 dias após a inoculação. Onze ratinhos (divididos em dois estudos separados com 5 e 6 ratinhos cada) foram tratados intraperitonealmente com doses semanais de C75 a 30 mg/kg em 0,1 ml de RPMI. A dose foi baseada numa determinação LDi0 em dose única de 4 0 mg/kg em ratinhos BALB/c; 3 0 mg/kg foi bem tolerado em ratinhos nude "outbread". Onze ratinhos de controlo (divididos do mesmo modo que os grupos de tratamento) receberam apenas RPMI. 0 volume do tumor foi medido com compasso de calibre a três dimensões. O ensaio foi terminado quando os controlos atingiram o "endpoint" sub-rogado.

Num estudo paralelo para determinar a actividade da sintase dos ácidos gordos em tumores tratados e de controlo, um grupo de ratinhos xenoenxertados com MCF-7 foram tratados com C75 ou veículo nas doses acima indicadas e sacrificados após 3 horas. Os tecidos de tumor e de fígado foram marcados ex vivo com [U14C] acetato, os lípidos foram extraídos e objecto de contagem como descrito (Pizer, et al, 1996) .

Num estudo paralelo adicional, para examinar histologicamente tumores tratados e de controlo, foram sacrificados, 6 horas após o tratamento, 6 ratinhos tratados com C75 e 6 ratinhos com veículo de controlo. Os 30 tecidos de tumor e os normais foram fixados em formalina tamponada neutra, processados para histologia de rotina, tendo-se realizado análise imuno-histoquímica relativamente à FAS. A análise imuno-histoquímica relativamente à FAS foi realizada nos xenoenxertos MCF-7, utilizando um anticorpo anti-FAS monoclonal de ratinho (Alo, et al., 1996) a 1:2000 no "Dako Imunostainer" usando o kit de detecção LSAB2, A actividade da via de síntese dos ácidos gordos em tecidos de ratinhos com xenoenxerto foi determinada por marcação "pulse" ex vivo com [U14C]-acetato. Os xenoenxertos de tumor apresentavam 10 vezes maior actividade de síntese de ácidos gordos do que o fígado, assinalando a diferença na actividade da via de síntese entre tecidos benignos e malignos (Figura 4A) . A expressão da FAS no xenoenxerto MCF-7 apresentou paralelismo com o nível elevado de síntese de ácidos gordos (Figura 4B). Injecções intraperitoneais de C75 a 30 mg/kg reduziram a síntese de ácidos gordos em fígado marcado ex vivo em 76% e nos xenoenxertos MCF-7 em 70% no intervalo de 3 horas (Figura 4A) . Estas alterações na síntese dos ácidos gordos precederam a evidência histológica de citotoxicidade no xenoenxerto, que se tornou evidente 6 horas após o tratamento (Figuras 4C e 4D) . Os xenoenxertos tratados com C75 apresentaram numerosos corpos apoptóticos espalhados por todo o tecido do tumor, os quais não foram observados em tumores tratados com veículo. A análise histológica do fígado e de outros tecidos do hospedeiro após tratamento com C75 não apresentaram evidência de qualquer toxicidade de curto ou longo prazo (não apresentado). O tratamento dos xenoenxertos com C75 leva à citotoxicidade e à redução no crescimento do tumor sem dano para os tecidos normais. Histologia do tumor 6 horas após uma dose 31 de 30 mg/kg de C75 demonstra citotoxicidade significativa quando comparada com o controlo tumor (Figuras 4C e 4D, pré-impressão anexa). Note-se a evidência de corpos apoptóticos no xenoenxerto tratado com C75 enquanto o exame do fígado e de outros órgãos não apresenta evidência de danos nos tecidos (dados não apresentados). O tratamento semanal intraperitoneal com C75 retardou o crescimento de tumores MCF-7 subcutâneos estabelecidos, quando comparados com controlos com veículo, demonstrando um efeito sistémico anti-tumor (Figura 4E) . Após 32 dias de tratamentos semanais, verificava-se uma diferença superior a oito vezes no crescimento dos tumores no grupo de tratamento quando comparado com os controlos com veículo. À semelhança da cerulenina, a perda de peso transiente reversível foi a única toxicidade notada (Pizer, et al., 1996). A actividade farmacológica sistémica do C75 forneceu a primeira análise do resultado do tratamento sistémico com um inibidor da FAS. O efeito anti-tumor significativo do C75, em xenoenxerto de cancro da mama humano, para o estabelecimento de níveis fisiológicos dos ácidos gordos do ambiente foi similar ao resultado in vitro, em cultura suplementada com soro, e era consistente com um mecanismo citotóxico independente da míngua de ácidos gordos.

Exemplo 6. Células de cancro humano apresentam níveis elevados de malonil-CoA, no estado estacionário, in vivo. O resultado no Exemplo 5 sugeriu que a acumulação da malonil-CoA poderá não ser um problema significativo em tecidos normais, possivelmente porque a actividade da via de síntese dos ácidos gordos é normalmente baixa, mesmo em órgãos lipogénicos, como o fígado. É de interesse adicional que, enquanto a malonil-CoA foi o conjugado da CoA de baixo 32 peso molecular predominantemente detectado nestes ensaios, em células de cancro da mama, outros estudos reportaram predominantemente succinil-CoA e acetil-CoA em hepatocitos de cultura (Corkey, 1988) . O nível elevado de malonil-CoA nos tecidos de tumor reflecte o nível elevado da síntese dos ácidos gordos nas células tumorais comparado com o do fígado (Pízer, et al., 1996).

Utilizando o modelo do xenoenxerto do cancro da mama humano MCF7, do Exemplo 5, os níveis de malonil-CoA foram medidos no xenoenxerto de tumor e no fígado do mesmo animal, utilizando cromatografia líquida de alta performance. A Figura 3 abaixo mostra níveis elevados de malonil-CoA no tecido de tumor comparado com o fígado. Adicionalmente, a distribuição de outros derivados da CoA encontra-se marcadamente alterada. Por exemplo, enquanto o fígado apresenta cerca de 10 vezes menos malonil-CoA comparado com o xenoenxerto, tem níveis cerca de 10 vezes mais elevados de acetil-CoA, e níveis mais elevados de outros derivados da CoA, particularmente da succinil-CoA. As diferenças nos perfis dos derivados da CoA podem ser indicativas de maiores diferenças no metabolismo da energia entre as células de cancro e os hepatocitos.

Exemplo 7. Inibição do Crescimento Celular por Inibidores da CPT-1 A carnitina palmitoiltransferase-1 é inibida pelo etomoxir (Paumen, Μ. B., Ishida, Y., Muramatsu, M. , Yamamoto, M., e Honjo, T. A inibição da carnitina palmitoiltransferase I aumenta a síntese de esfingolípidos e apoptose induzida por palmitato., J. Biol. Chem. 272: 3324-3329, 1997; Ratheiser, K. , Schneeweib, B., Waldhausl, W. , Fasching, P., Korn, A., Nowotny, P., Rohac, M., e Wolf, Η. P.O. A inibição da 33 carnitina palmitoiltransferase I pelo etomoxir reduz a produção hepática de glucose e os lípidos do plasma na diabetes mellitus não insulinodependente. , Metabolism. 40: 1185-1190, 1991).

Etomoxir

320,74 A Figura 7A ilustra que o etomoxir sozinho causou um efeito inibidor do crescimento significativo superior ao do C75. O C75 inibe indirectamente a CPT-1 por aumento da malonil-CoA. A Figura 7B mostra que a inibição do crescimento de células MCF-7 pelo etomoxir é aditiva com a do C75. Na figura 7A, o etomoxir produz uma inibição do crescimento de células MCF-7, dose dependente, mais de 72 h superior à do C75 a 5 pg/ml, Na figura 7B, o etomoxir e o C75 apresentam um efeito inibidor do crescimento superior ao de qualquer um deles isolado. 5xl04 células de MCF-7 foram colocadas em placa em placas de 24 poços e tratadas com inibidores às concentrações indicadas na figura, 18 h após a colocação em placa. As células são fixadas com etanol, coradas com violeta de cristal, solubilizadas com SDS e lidas a 490. É importante notar, que a concentração de etomoxir é similar à utilizada em hepatocitos isolados para inibir a CPT-1; efeitos não específicos foram identificados a doses >400 M in vitro (Paumen, et al, 1997). Quando combinados, o etomoxir e o C75 produziram um efeito inibidor do crescimento aditivo. Uma vez que a malonil-CoA e o etomoxir são ambos inibidores da CPT-1 e possuem diferentes sites de 34 ligação à CPT-1, o efeito potenciador do etomoxir e do C75 não é surpreendente. O etomoxir foi utilizado para tratar a diabetes no homem sem toxicidade ou perda de peso significativas (Ratheiser, et al., 1991). Com esta história, a CPT-1 pode proporcionar um meio para levar este trabalho mais rapidamente para a clínica.

Exemplo 8. A Cerulenina Inibe a Oxidação dos Ácidos Gordos.

Uma vez que se mostrou que níveis aumentados de malonil-CoA, resultantes da inibição da FAS, são citotóxicos em células de cancro da mama humano, pensámos determinar se a inibição da CPT-1 pela malonil-CoA também tinha um papel no mecanismo da morte das células cancerosas.

As células de cancro da mama humano MCF-7 foram tratadas com cerulenina, um inibidor da FAS conhecido, para determinar se a cerulenina causa diminuição da oxidação dos ácidos gordos a doses conhecidas como induzindo apoptose em células MCF-7, mas antes de a própria apoptose ter início. A oxidação dos ácidos gordos foi medida por captura e contagem do 14C02 libertado na oxidação de [14C] -palmitato numa base. 1 x 10s células de MCF-7 foram colocadas em placa em frascos T-25 em triplicado e incubadas durante a noite a 37°C. 0 composto teste (cerulenina) foi então adicionado como indicado diluído a partir de solução stock 5 mg/ml em DMSO. Após 2 horas, o meio com fármacos foi removido e as células foram pré-incubadas durante 30 minutos com 1,5 ml do seguinte tampão: 114 mM NaCl, 4,7 mM KC1, 1,2 mM KH2P04, 1,2 mM MgS04, glucose 11 mM. Após a pré-incubação, foram adicionados 200 μΐ do tampão do ensaio contendo: 114 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM KH2P04, 1,2 mM MgS04, glucose 11 35 mM, 2,5 mM palmitato (contendo 100 pCi de [1-14C]palmitato) ligado a albumina, 0,4 mM L-carnitina e as células foram incubadas a 37°C durante 2 horas. A seguir à incubação, adicionaram-se 400 μΐ de hidrocloreto de benzotónio ao poço central para recolher o 14C02 libertado. A reacção foi imediatamente interrompida por adição âs células de 500 μΐ de ácido perclõrico a 7%. Os frascos com poços foram então incubados durante 2 horas a 37°C após o que o hidrocloreto de benzotónio foi removido e objecto de contagem relativamente ao 14C. Os testes em branco foram preparados por adição às células de 500 μΐ de ácido perclórico a 7% antes da incubação com o tampão do ensaio durante 2 horas. A Figura 8 mostra a oxidação dos ácidos gordos em células MCF-7 tratadas com cerulenina nas doses indicadas durante 2 horas, muito antes do início da apoptose neste sistema. A cerulenina causa uma inibição da oxidação dos ácidos gordos em células MCF-7 sensível à dose. A uma dose de 10 \xq/ml, que é conhecida por causar um aumento de quase nove vezes na malonil-CoA e > 50% de redução na síntese de ácidos gordos num período de até 2 horas, a cerulenina causa aproximadamente uma redução de 50% na oxidação dos ácidos gordos comparada com o controlo (p=0,0007; t-teste bilateral)

Exemplo 9. Inibição da Carnitina Palmitoiltransferase-1. A cerulenina é conhecida por induzir um aumento dos níveis de malonil-CoA em células quando a sintase dos ácidos gordos (FAS) é inibida, e a malonil-CoA é conhecida por inibir a oxidação dos ácidos gordos através do seu efeito sobre a carnitina palmitoiltransferase-1 (CPT-1). A CPT-1 medeia a transferência de ácidos gordos de cadeia longa 36 para o interior das mitocôndria para β-oxidação. Executa uma trans-esterificação das acil-CoA's gordas de cadeia longa com L-carnitina produzindo acilcarnitina. Através desta reacção, a L-carnitina, solúvel em água, torna-se organicamente solúvel após esterificação do ácido gordo. Para testar se a redução induzida por cerulenina na oxidação de ácidos gordos é devida a um aumento de malonil-CoA ou a uma inibição directa da CPT-1 pela cerulenina, a cerulenina foi comparada com outros compostos inibidores num ensaio de CPT-1 em células MCF-7.

Ensaio de Carnitina Palmitoiltransferase-1 (CPT-1): As células de MCF-7 foram colocadas em placa em RPMI 1640 com 10% de soro fetal bovino com 1 x 106 células em placas de seis poços em triplicado. Após a incubação a 37°C durante a noite, o meio foi removido e substituído por 700 μΐ do meio de ensaio consistindo de: 50 mM imidazole, 70 mM KC1, 80 mM sacarose, 1 mM EGTA, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1 mM KCN, 1 mM ATP, 0,1% albumina de soro bovino isenta de ácidos gordos, 70 μΜ palmitoil-CoA, 0,25 pCi [metil-14C]L-carnitina, 40 pg digitonina com ou sem 20 μΜ malonil-CoA ou outros inibidores indicados.

Após incubação durante 3 ou 6 minutos a 37°C, a reacção foi interrompida por adição de 500 μΐ de ácido perclórico 4 M gelado. As células foram então colhidas e centrifugadas a 10000 x g durante 5 min. A pélete foi lavada com 500 μΐ de ácido perclórico gelado e -novamente centrifugada. A pélete resultante foi novamente colocada em suspensão em 800 μΐ de dH20 e extraída com 150 μΐ de butanol. A fase do butanol foi objecto de contagem por cintilação líquida e representa o derivado acilcarnitina. A Figura 9 mostra o efeito de três compostos sobre a CPT-1: 37 o Etomoxir (um conhecido inibidor da CPT-1), TOFA (conhecido por inibir a síntese dos ácidos gordos através da inibição da acetil-CoA carboxilase, uma enzima na via da síntese dos ácidos gordos) e a cerulenina. A Figura 9 mostra que a cerulenina não inibe directamente a CPT-1 em células MCF-7. De facto, a 10 pg/ml, a cerulenina provoca um ligeiro aumento, mas estatisticamente não significativo, da actividade da CPT-1 acima do controlo, veículo. Assim, a redução da oxidação dos ácidos gordos, induzida pela cerulenina, é provavelmente devida ao aumento concomitante da malonil-CoA em vez de provir de um efeito directo da cerulenina sobre a CPT-1.

Exemplo 10. Efeito da Inibição da CPT-1 sobre o Crescimento Celular.

Uma vez que a cerulenina causa um aumento da malonil-CoA e um decréscimo da oxidação dos ácidos gordos, conceberam-se testes para verificar se a inibição da CPT-1 se encontrava envolvida no desencadear da apoptose. Para esse efeito, as células MCF-7 foram tratadas com etomoxir, um conhecido inibidor directo da CPT-1, e a oxidação dos ácidos gordos pelas células foi medida, como descrito no Exemplo 8. A Figura 10 mostra que o etomoxir causa inibição da oxidação dos ácidos gordos em células MCF-7.

Numa dose de 5 0 pg/ml a oxidação dos ácidos gordos é reduzida em >50% sobre o controlo (p=0,012; t-teste bilateral). (A Figura 9 demonstra que o Etomoxir inibe directamente a CPT-1, com uma dose de 10 yg/ml a causar uma redução de 75% na actividade da CPT-1, p=0,023; t-teste bilateral.) 38

Ensaio de inibição do crescimento celular: Embora o Etomoxir seja um potente inibidor da CPT-1, quando as células MCF-7 são tratadas com doses de Etomoxir conhecidas por inibirem a CPT-1 e a oxidação dos ácidos gordos, não se verifica inibição significativa do crescimento nem citotoxicidade. As células MCF-7 foram colocadas em placa em placas de 24 poços 5xl04 células por poço em RPMI 164 0 com 10% de soro fetal bovino (Hyclone). Após incubação a 37 °C, durante a noite, o Etomoxir foi adicionado de soluções stock 5 mg/ml em DMSO. A concentração final de DMSO nas culturas foi de ou inferior a 0,2%. Após 48 ou 72 h, o meio foi retirado, e os poços foram lavados três vezes com solução salina tamponada de Hank. Os poços foram corados com violeta de cristal, depois secos e solubilizados em 10% SDS. Alíquotas de 100 μΐ foram transferidas para uma placa com 96 poços e lidas num leitor de placas Molecular Dynamics a 4 90 nm. Os dados são apresentados como unidades de absorvância com barras de erro que mostram o erro padrão da média. A estatística e os gráficos foram produzidos em Prism 2.0 (Graph Pad). A Figura 11 mostra o efeito do Etomoxir na inibição do crescimento em células MCF7. Sõ a dosagem de 200 pg/ml causou uma redução significativa no crescimento (p=0,006, t-teste bilateral). Assim, a inibição da CPT-1 por si só é significativamente inibidora do crescimento das células de cancro da mama humano.

No entanto, durante o tratamento com cerulenina, a CPT-1 é inibida e a oxidação dos ácidos gordos é reduzida durante a inibição da síntese dos ácidos gordos; isto é uma resposta não fisiológica. Fisiologicamente, quando a síntese dos 39 ácidos gordos é reduzida, os níveis de malonil-CoA caiem, aliviando a inibição da CPT-1 e causando um aumento na oxidação dos ácidos gordos. Assim, é possível que a inibição da CPT-1 também induza citotoxicidade em condições de inibição da síntese dos ácidos gordos.

Exemplo 11. Efeitos Citotóxicos da Inibição da CPT-1 e da Inibição da Síntese dos Ácidos Gordos em Combinação. 0 TOFA é um inibidor da acetil-CoA carboxilase (ACC), a enzima limitadora da taxa na síntese dos ácidos gordos. A inibição da ACC pelo TOFA causa uma redução na malonil-CoA e inibição subsequente da síntese dos ácidos gordos. Embora quer o TOFA quer a cerulenina causem inibição da síntese dos ácidos gordos, a cerulenina inibe a FAS o que conduz a um aumento na malonil-CoA enquanto o TOFA inibe a ACC que causa um decréscimo na malonil-CoA.

Neste Exemplo, as células foram tratadas com TOFA para inibir a síntese dos ácidos gordos e Etomoxir para inibir a oxidação dos ácidos gordos. O efeito desta inibição combinada sobre a citotoxicidade foi medido num ensaio clonogénico.

Ensaio Clcínogénico: Após incubação a 3 7°C, durante a noite, lxl O6 células MCF7 foram expostas a fármacos, tal como indicado, durante 6 h, lavadas, removidas por digestão com tripsina, contadas e colocadas em placa a 1000 ou 500 células/ placa de 60 mm, em triplicado. As colónias foram coradas com violeta de cristal e contadas 4-6 dias após a colocação em placa. Os controlos consistiram de células incubadas com DMSO sem fármacos. As barras de erro representam o erro padrão da média. 40 A Figura 12 mostra um ensaio clonogénico com células MCF-7 tratadas tanto Etomoxir como com TOFA. O tratamento das células com TOFA a 5 μg/ml não é significativamente citotóxico; isto é semelhante aos nossos estudos publicados anteriormente (ref). A Figura 9 também mostra que o TOFA não causa inibição da CPT-1, nem o TOFA causa alterações significativas na oxidação dos ácidos gordos (dados não apresentados). 0 tratamento com Etomoxir também não é significativamente citotóxico complementando os estudos de inibição do crescimento da Figura 11. No entanto, a combinação do TOFA e do Etomoxir é significativamente mais citotóxica que o TOFA por si só (p=0,004, t-teste bilateral) ou o Etomoxir por si só (p=0,002, t-teste bilateral).

Estes dados indicam que a inibição da CPT-1 é tóxica para células de cancro durante a inibição da síntese dos ácidos gordos. Por isso, inibidores da CPT-1 poderiam ser utilizados em conjunto com inibidores da síntese dos ácidos gordos para aumentar o efeito anti-tumor.

Exemplo 12. Efeitos aditivos sobre a Citotoxicidade de um Inibidor da Sintase dos Ácidos Gordos e de um Inibidor da CPT-1.

Em ensaios de inibição do crescimento, utilizando o processo descrito no Exemplo C, as células MCF-7 foram tratadas com C75, um inibidor da FAS, isolado ou com Etomoxir, e analisadas 48 horas após o tratamento. Quer o Etomoxir quer o C75 causaram inibições do crescimento significativas em relação ao controlo (p=0,0001, p=0,005, t-teste bilateral). A Figura 13 abaixo mostra que o 41 etomoxir pode também reforçar o efeito citotóxico da inibição da FAS. A combinação de Etomoxir e C75 causou uma inibição do crescimento mais significativa do que o Etomoxir isolado (p=0,004, t-teste bilateral) e uma tendência forte para uma inibição do crescimento aumentada em relação ao C75 isolado (p=0,054 t-teste bilateral). Estes dados sugerem que a inibição da CPT-1 poderá também reforçar o efeito anti-tumor dos inibidores da FAS.

Com objectivos de clareza de entendimento, a invenção em apreço foi descrita com algum detalhe através de ilustração e exemplo em conjunto com concretizações específicas, embora outros aspectos, vantagens e modificações se tornem perceptíveis para os peritos na arte a que a invenção pertence. A descrição precedente e os exemplos têm como intenção ilustrar, mas não limitar o âmbito da invenção. Modificações dos modos de executar a invenção, acima descritos, que sejam perceptíveis para pessoas que sejam peritos em medicina, bioquímica, farmacologia, e/ou áreas relacionadas, pretende-se que estejam no âmbito da invenção, que é apenas limitada pelas reivindicações apensas.

Todas as publicações e pedidos de patente mencionados nesta especificação são indicativos do nível de perícia dos peritos na arte a que esta invenção pertence.

Lisboa, 21 de Setembro de 2006

Claims (27)

1 Reivindicações 1. A utilização de um inibidor da MCD (malonil-CoA descarboxilase), o qual causa um aumento da malonil-CoA intracelular em células tumorais dum organismo, na preparação de um medicamento para a inibição do crescimento de células tumorais no organismo.

2. A utilização de uma composição, a qual causa um aumento da malonil-CoA intracelular em células tumorais dum organismo, em que o referido aumento da malonil-CoA intracelular se encontra correlacionado com um aumento da síntese da malonil-CoA, na preparação de um medicamento para a inibição do crescimento de células tumorais no organismo.

3. A utilização da reivindicação 1 ou 2, em que o referido aumento da malonil-CoA intracelular se encontra correlacionado com um aumento da actividade intracelular da acetil-CoA carboxilase (ACC).

4. A utilização da reivindicação 2 ou 3, em que a referida composição compreende um agente seleccionado de entre o grupo consistindo de um activador da ACC, um inibidor da 5'-AMP-activada proteína quinase (AMPK) e/ou um inibidor da acil-CoA sintase.

5. A utilização de qualquer reivindicação acima indicada, em que o referido aumento da malonil-CoA intracelular nas células do referido organismo ocorre de forma abrupta.

6. A utilização de qualquer reivindicação acima indicada, em que o referido aumento da malonil-CoA intracelular se 2 verifica antes de qualquer aumento significativo da taxa de consumo da malonil-CoA.

7. A utilização de qualquer reivindicação acima indicada, em que o referido aumento da malonil-CoA intracelular em células do referido organismo ocorre no intervalo de 3 horas após a referida administração.

8. A utilização de qualquer reivindicação acima indicada, em que o referido aumento da malonil-CoA intracelular ocorre antes da inibição do crescimento das células.

9. A utilização de qualquer reivindicação acima indicada, em que o referido aumento da malonil-CoA intracelular se encontra correlacionado com um consumo reduzido de malonil-CoA.

10. A utilização de qualquer reivindicação acima indicada, em que o referido aumento da malonil-CoA intracelular se encontra correlacionado com uma actividade intracelular reduzida da sintase dos ácidos gordos.

11. A utilização de qualquer reivindicação acima indicada, em que um segundo agente quimioterápico é administrado ao organismo, sendo o referido segundo agente quimioterápico um não inibidor da síntese dos ácidos gordos.

12. A utilização de qualquer reivindicação acima indicada, em que o referido medicamento se destina ao tratamento de células tumorais em que o nível de malonil-CoA intracelular em células tumorais antes da administração da referida composição se encontra pelo menos duas vezes acima do nível normal de malonil-CoA em células não malignas. 3

13. A utilização de qualquer reivindicação acima indicada, em que após administração do referido medicamento o nível de malonil-CoA intracelular se encontra elevado e os níveis intracelulares de acetil-CoA e CoA livre se encontram reduzidos, relativamente aos níveis pré-tratamento.

14. A utilização de qualquer reivindicação acima indicada, em que o referido medicamento se destina ao tratamento de células tumorais em que a taxa de síntese de ácidos gordos nalgumas células do referido organismo se encontra pelo menos 2 vezes acima do normal antes da administração da referida composição, e a administração da referida composição é citotóxica para as referidas células.

15. A utilização de qualquer reivindicação acima indicada, em que o referido medicamento se destina ao tratamento de células tumorais e em que o referido organismo compreende células tumorais com taxas elevadas de síntese de ácidos gordos e o número de células das referidas células tumorais é reduzido subsequentemente à administração da referida composição.

16. A utilização de qualquer reivindicação acima indicada, em que a referida composição compreende ainda um inibidor da carnitina palmitoiltransferase-1 (CPT-1).

17. A utilização da reivindicação 16, em que o referido inibidor da CPT-1 é o etomoxir.

18. A utilização de a) um inibidor da síntese dos ácidos gordos em células tumorais de um organismo; e 4 b) ura inibidor da oxidação dos ácidos gordos nas referidas células.

19. A utilização da reivindicação 18, em que o referido inibidor da oxidação dos ácidos gordos é administrado numa quantidade que não inibe significativamente a CPT-2.

20. A utilização da reivindicação 18, em que o referido inibidor da síntese dos ácidos gordos e o referido inibidor da oxidação dos ácidos gordos são administrados em quantidades para alcançarem níveis similares das respectivas inibições, tal como observado para doses citotóxicas de cerulenina.

21. Um método de screening para assistir na detecção de composições que sejam selectivamente citotóxicas para células tumorais, compreendendo a administração de uma composição alvo a uma célula que tenha um nível elevado de malonil-CoA intracelular, a monitorização da malonil-CoA intracelular na referida célula subsequentemente à referida administração e a comparação do padrão das alterações do nível de malonil-CoA intracelular, em que um aumento abrupto na malonil-CoA intracelular é indicativo de citotoxicidade selectiva.

22. 0 método da reivindicação 21, em que as referidas alterações do nível de malonil-CoA intracelular são medidas na presença ou ausência de ácido 5-(tetradeciloxi)-2-furóico (TOFA).

23. 0 método da reivindicação 21, em que a referida célula é de uma linhagem de células derivadas de tumores, se monitoriza a actividade da CPT-1 na referida célula subsequentemente â referida administração, em que um 5 decréscimo de actividade de CPT-1 é indicativo de potencial de inibição do crescimento.

24. O método da reivindicação 23, em que a referida célula é permeabilizada.

25. O método da reivindicação 23, compreendendo ainda uma monitorização da referida célula quanto à apoptose.

26. O método da reivindicação 25, em que a monitorização quanto à apoptose compreende um método seleccionado do grupo que consiste na medição do potencial transmembrana mitocondrial, na coloração com corantes vitais, na monitorização da activação da caspase em células inteiras, utilizando Western blot e na medição do citocromo C preparado a partir mitocôndria utilizando Western blot.

27. Um produto para administração a um organismo que tenha células tumorais, sendo que o produto contém: a) Um inibidor da síntese dos ácidos gordos; e b) Um inibidor da oxidação dos ácidos gordos para utilização na inibição do crescimento de células tumorais no organismo. Lisboa, 21 de Setembro de 2006 2 Um método para provocar a morte de células cancerosas por elevação aguda da malonil Coenzima A (malonil-CoA) celular o que conduz à apoptose. A elevação da malonil-CoA pode ser induzida por inibição da sintase dos ácidos gordos (FAS), ou por outra manipulação do metabolismo dos ácidos gordos. Alternativamente, o crescimento de células tumorais pode ser inibido por inibição da FAS em conjunto com inibição da carnitina palmitoiltransferase-1 (CPT-1). Pode esperar-se que uma terapêutica combinada de fármaco(s) que inibam a síntese dos ácidos gordos por inibição da acetil-CoA carboxilase (a primeira enzima na via de síntese dos ácidos gordos) e de fármaeo(s) que inibam a CPT-1, por exemplo o etomoxir, induza apoptose em células tumorais.