KR20090130151A

KR20090130151A - 세포내 말로닐 ＣｏＡ의 수준을 증가시킴에 의한 암의 치료 방법

Info

Publication number: KR20090130151A
Application number: KR1020097024726A
Authority: KR
Inventors: 엘른 에스 피저; 크라이그 에이 타운센드; 프란시스 피 쿠하자
Original assignee: 더 존스 홉킨스 유니버시티
Priority date: 1999-11-12
Filing date: 2000-11-13
Publication date: 2009-12-17
Also published as: EP1227810B1; EP1227810A1; AU2009227836A1; DE60028996D1; DK1227810T3; DE60028996T2; KR20070106648A; EP1227810B8; US20020187534A1; KR20090031957A; AU784495B2; ATE330598T1; WO2001034145A1; ES2267587T3; CA2391277A1; PT1227810E; JP2003513920A; AU2006203005A1; KR20020060736A; AU1600701A

Abstract

본 발명은 에이폽토시스를 일으키는 세포성 말로닐 조효소 A(말로닐 CoA)를 급격하게 증가시켜 암 세포를 사멸시키는 방법에 관한 것이다. 말로닐 CoA의 증가는 지방산 합성 효소(FAS)의 저해, 또는 지방산 대사의 기타 조작에 의해 유도될 수 있다. 대안으로, 종양 세포의 성장은 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라제-1(CPT-1)의 저해와 함께 FAS 저해에 의해 저해될 수 있다. 아세틸 CoA 카르복실라제(지방산 합성 경로의 제1 효소)를 저해하는 약물(들)과 CPT-1을 저해하는 약물(들), 예를 들어 에토모시르의 병용 요법이 종양 세포에서 에이폽토시스를 유도할 것이라 예상할 수 있다.

Description

세포내 말로닐 ＣｏＡ의 수준을 증가시킴에 의한 암의 치료 방법{TREATING CANCER BY INCREASING INTRACELLULAR MALONYL COA LEVELS}

본 발명은 에이폽토시스에 이르게 하는 세포성 말로닐 조효소 A(말로닐 CoA)를 급격하게 증가시켜 암 세포를 사멸시키는 방법에 관한 것이다.

다수의 연구는 놀랍게도 악성 인간 유방암[Alo, P. L., Visca, P., Marci, A., Mangoni, A., Botti, C., and Di Tondo, U. Expression of fatty acid synthase[FASO as a predictor of recurrence in stage I breast carcinoma patients., Cancer. 77: 474-482, 1996; Jensen, V., Ladekarl, M., Holm-Nielsen, P., Melsen, F., and Soerensen, F. B. The prognostic value of oncogenic antigen 519(OA-519) expression and proliferative activity detected by antibody MIB-1 in node-negative breast cancer., Journal of Pathology. 176: 343-352, 1995] 뿐만 아니라, 기타 암[Rashid, A., Pizer, E. S., Moga, M., Milgraum, L. Z., Zahurak, M., Pasternack, G. R,. Kuhajda, F. P., and Hamilton, S. R. Elevated expression of fatty acid synthase and fatty acid synthetic activity in colorectal neoplasia., American Journal of Pathology. 150:201-208, 1997; Pizer, E., Lax, S., Kuhajda, F., Pasternack, G., and Kurman, R. Fatty acid synthase expression in endometrial carcinoma: correlation with cell poliferation and hormone receptors., Cancer. 83:528-537, 1998]에서 높은 수준의 지방산 합성 효소(synthase) 발현(FAS, E.C. 2.3.1.85)에 대하여 설명하고 있다. FAS 발현은 또한 도관내, 및 소엽의 상피내 유방 암종; 침윤성 유방암 진행의 위험 증가와 관련된 병소에서 확인되었다[Milgraum, L. Z., Witters, L. A., Pasternack, G. R., and Kuhajda, F. P. Enzymes of the fatty acid synthesis pathway are highly expressed in in situ breast carcinoma., Clinical Cancer Research. 3:2115-2120, 1997]. FAS는 지방산 합성(FA 합성)의 주된 합성 효소로서, 말로닐-CoA 및 아세틸-CoA의 NADPH 의존적 축합을 촉매하여 16-탄소 포화 유리 지방산인 팔미테이트를 우세하게 생산한다[Wakil, S. Fatty acid synthase, a proficient multifunctional enzyme., Biochemistry. 28:4523-4530, 1989]. 종양 조직 내에서의 생체외 측정 결과, 높은 수준의 FAS 및 FA 합성은 헥소키나제로부터 FAS까지 일부 25개 효소로 이루어진 전체 유전자 프로그램이 매우 활성임을 의미한다는 사실이 밝혀졌다.

진균 산물, 세룰레닌 및 신규 화합물 C75를 비롯한 FAS 저해제로 처리한 배양된 인간 암 세포는 FA 합성 시 신속하게 감소한 뒤, DNA 합성 및 세포 주기 정지 시 감소하고, 에이폽토시스(apoptosis)가 일어난다[Pizer, E. S. Jackisch, C., Wood, F. D., Pasternack, G. R., Davidson, N. E., and Kuhajda, F. Inhibition of fatty acid synthesis induces programmed cell death in human breast cancer cells., Cancer Research. 56:2745-2747, 1996, Pizer, E. S., Chrest, F. J., DiGiuseppe, J. A., and Han, W. F. Pharmacological inhibitors of mammalian fatty acid synthase suppress DNA replication and induce apoptosis in tumor cell lines., Cancer Research. 58:4611-4615, 1998]. 포유류 지방산 합성 효소 활성의 약리학적 저해는 약물 적용 후 약 90분 이내에 DNA 복제를 저해하게 된다. 이러한 발견은 FA 합성 및 암 세포 성장 사이에 생명 유지에 필수적인 생화학적 연관이 있음을 암시하였다. 어떻게 지방산 합성 효소의 저해가 이 현상을 일으키는지 하는 문제는 지대한 관심을 불러일으키고 있지만, 아직 의문으로 남아있다. 태아 소의 혈청으로부터 유래된 배양 배지 중 외인성 지방산의 존재 하에서도 이러한 효과가 일어났다는 것은 중요하다. 외인성 팔미테이트의 첨가에 의해 지방산이 없는 배양 조건 하에서 특정 세포에 대한 세룰레닌의 세포독성 효과를 구제할 수 있지만, 대부분의 암 세포는 경로의 최종 생성물에 의한 FA 합성 저해로부터 구제되지 않았다(데이터는 제시되지 않음)[Pizer, E. S., Wood, F. D., Pasternack, G. R., and Kuhajda, F. P. Fatty acid synthase (FAS): A target for cytotoxic antimetabolites in HL60 promyelocytic leukemia cells., Cancer Research. 1996: 745-751, 1996]. 따라서, 대부분의 암 세포에 대한 FA 합성 저해의 세포독성 효과가 최종 생성물 고갈에 의한 것인지, 또는 어떤 다른 생화학적 메커니즘에 의한 것인지는 풀리지 않았다.

본 발명은 에이폽토시스에 이르게 하는 세포성 말로닐 조효소 A(말로닐 CoA)를 급격하게 증가시켜 암 세포를 사멸시키는 방법에 관한 것이다. 지방산 합성 효소(FAS)의 저해에 의해 유도된 말로닐 CoA의 증가는 지방산 합성의 저해 및 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라제-1(CPT-1)의 저해와 관련이 있다. 유사한 생리학적 효과를 일으키는 약물의 임의의 병용이 감수성이 있는 종양 세포에 대하여 동일한 효과를 가져올 것이라 예상할 수 있다. 예를 들어, 아세틸 CoA 카르복실라제(지방산 합성 경로의 첫번째 효소)를 저해함으로써, 지방산 합성을 저해하는 약물(들)과 CPT-1을 저해하는 약물(들)과의 병용 요법이 종양 세포에서 에이폽토시스를 유발할 것이라 예상할 수 있다. 따라서, 본 발명은 비제한적으로 에토모시르(etomoxir)와 같은 소분자 저해제를 통한 CPT-1의 직접적인 저해 뿐 아니라 암 세포 중 말로닐 CoA의 수준 증가에 부수하여 일어나는 CPT-1 저해를 포함하는, 암 세포에서 CPT-1의 활성을 전신적으로 저해하는 임의의 방법을 포함한다.

이 치료법은 광범위한 부류의 인간 암에 대한 신규의 화학요법제에 이르게 할 것이다. 또한, 이것은 기타 암 약물들과 공유되지 않는 에이폽토시스에 이르는 신규의 경로에 관한 것이므로, 높은 수준의 말로닐 CoA 유도 및/또는 CPT-1 저해가 기타 통상적으로 이용되는 암 치료제의 약효를 증가시킬 수 있음을 예상할 수 있다.

한 구체예에서, 본 발명은 유기체의 종양 세포에서 세포내 말로닐 CoA를 증 가시키는 조성물을 유기체에 투여함으로써 유기체에서 종양 세포의 성장을 저해하는 방법을 제공한다. 적어도 유기체의 종양 세포에서 세포내 말로닐 CoA가 갑자기(즉, 단시간에 또는 급격하게) 증가하는 것이 바람직하고, 말로닐 CoA의 소비 속도가 유의적으로 증가되기 전에 세포내 말로닐 CoA가 증가되는 것이 더욱 바람직하다. 통상적으로, 유기체의 세포 중 세포내 말로닐 CoA는 투여 3시간 내에 증가하고, 세포내 말로닐 CoA는 세포의 성장 저해 이전에 증가될 것으로 예상할 수 있다.

본 발명의 양태로서, 세포내 말로닐 CoA의 증가는 말로닐 CoA의 소비 감소와 연관되어 있다. 예를 들어, 세포내 말로닐 CoA의 증가는 말로닐 CoA 디카르복실라제(MCD)의 세포내 활성 감소 또는 지방산 합성 효소의 세포내 활성 감소와 관련될 수 있고; 선택적으로 조성물은 MCD 저해제를 포함할 수 있다. 기타 바람직한 양태로서, 세포내 말로닐 CoA의 증가는 말로닐 CoA의 합성 증가와 연관되어 있고/있거나, 세포내 말로닐 CoA의 증가는 아세틸-CoA 카르복실라제(ACC)의 증가된 세포내 활성과 연관되어 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 조성물은 ACC의 활성화제, 시트레이트 합성 효소의 활성화제, 5'-AMP-활성화 단백질 키나제(AMPK)의 저해제 및/또는 아실 CoA 합성 효소의 저해제로 이루어진 군 중에서 선택된 약제를 포함한다. 본 발명의 다른 양태로서, 조성물은 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라제-1(CPT-1) 저해제를 포함하는데, 이것은 에토모시르일 수 있으며, 전술한 군 중에서 선택된 약제와 함께 투여되는 것이 바람직하다. 본 발명의 방법의 또다른 구체예에서는, 제2 화학요법제를 유기체에 투여하는데, 상기 제2 화학요법제는 지방산 합성을 저해하지 않는다.

본 발명의 방법은, 조성물 투여 전 비악성 세포 내의 정상 말로닐 CoA 수준의 2배 이상인 종양 세포 내의 세포내 말로닐 CoA 수준을 가지는 유기체를 치료하는 데 사용하는 것이 바람직하다. 이 방법은 조성물의 투여 이전에 유기체의 일부 세포에서의 지방산 합성 속도가 정상 세포의 적어도 2배 이상인 유기체를 치료하는 데 사용되며, 이 조성물의 투여는 이들 세포에 대하여 세포독성인 것이 더욱 바람직하다. 유기체는 증가된 지방산 합성 속도를 가진 종양 세포를 포함하고, 상기 종양 세포의 세포수는 상기 조성물의 투여 이후에 감소되는 것이 바람직하다. 치료 후, 세포내 말로닐 CoA의 수준은 증가되고, 세포내 아세틸 CoA의 수준 및 세포내 유리 CoA의 수준은 치료전 수준에 비해 감소되는 것이 바람직하다.

다른 구체예에서, 본 발명은 종양 세포에 (a) 상기 세포 내에서의 지방산 합성 저해제; 및 (b) 상기 세포 내에서의 지방산 산화 저해제를 투여하는 단계를 포함하는, 유기체 내에서 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 지방산 산화 저해제는 CPT-2를 유의적으로 저해하지 않는 양으로 투여하는 것이 바람직하다. 지방산 합성 저해제 및 지방산 산화 저해제는 세룰레닌의 세포독성 용량에 대하여 관찰된 각각의 저해 수준과 적어도 거의 동일하거나 그 이상의 저해 수준을 얻는 양으로 투여되는 것이 더욱 바람직하다.

또다른 구체예에서, 본 발명은 증가된 세포내 말로닐 CoA 수준을 가지는 세포에 목적 조성물을 투여하는 단계, 투여 후 세포에서 세포내 말로닐 CoA를 모니터링하는 단계를 포함하는, 종양 세포에 대하여 선택적인 세포독성을 가지는 조성물의 검색을 돕는 선별 방법을 제공하며, 세포내 말로닐 CoA의 급격한 증가는 선택적 인 세포독성을 의미한다. 본 방법은 TOFA의 부재 및 존재 하에 세포내 말로닐 CoA 수준의 변화 양상을 비교하는 단계를 추가로 포함하는데, 여기서 TOFA의 존재 하에서 말로닐 CoA 수준의 감소된 변화는 선택적인 세포독성을 의미한다.

또다른 구체예로서, 본 발명은 종양이 유래된 세포주에 목적 조성물을 투여하는 단계 및 투여 이후에 세포 내에서 CPT-1 활성을 모니터링하는 단계를 포함하는, 종양 세포에 대하여 성장을 저해하는 조성물의 검색을 돕는 선별 방법을 제공하며, 여기서 CPT-1 활성의 감소는 성장 저해 가능성을 암시한다. 이 방법은 세포가 투과가능한 경우에 수행되는 것이 바람직하다. 대안적으로, 이 방법은 에이폽토시스에 대하여 상기 세포를 모니터링하는 단계를 포함하고, 에이폽토시스에 대한 모니터링은 미토콘드리아 막투과 전위(transmembrane potential)를 측정하는 것, 생체 염료(vital dye)로 염색하는 것, 웨스턴 블롯을 사용하여 전체 세포 중에서의 카스파제 활성화를 모니터링하는 것 및 웨스턴 블롯을 사용하여 미토콘드리아로부터 만들어진 사이토크롬 C를 측정하는 것으로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법을 포함할 수 있다.

지방산 고갈이 세룰레닌 및 C75의 세포독성 효과를 매개한다면, 유사한 효능을 가진 임의의 다른 FA 합성 저해제는 유사한 효과를 가져올 것이다. 이 이론을 시험하기 위하여, 본 발명자들은 지방산 합성의 속도 제한 효소인 아세틸-CoA 카르복실라제(ACC, E.C. 6.4.1.2)의 저해가 암 세포에 미치는 효과와 FAS 저해제의 효과를 비교하였다. 본 발명자들은 FAS의 저해가 C75 처리 후 1시간 이내에 일어나는 높은 수준의 말로닐-CoA를 유도한다는 사실을 발견하였다. 단순히 낮은 수준의 내인적으로 합성된 지방산이 아닌, 말로닐-CoA의 이러한 초생리학적인(superphysiological) 수준은 유방암 세포의 에이폽토시스를 담당한다. 또한, 이것은 암 세포의 선택적인 에이폽토시스를 야기하는 신규한 경로이다.

도 1A는 이 연구에 사용된 저해제의 표적 효소를 포함하는 FA 합성 경로 중 일부의 개요도이다. 지방산 합성 효소의 저해로 인간 유방암 세포에 대한 세포독성에 기여하는 높은 수준의 말로닐-CoA가 생성된다(참조 문헌). 지방산 합성에 대한 기질로서의 역할 이외에, 말로닐-CoA는 지방산 산화의 속도 제한 효소인 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라제-1(CPT-1)의 강력한 저해제이다. CPT-1은, 장쇄 지방 아실 CoA를 L-카르니틴으로 트랜스-에스테르화시켜 아실카르니틴을 생성하는 미토콘드리아의 중요 외막 단백질이다. 아실카르니틴은 CPT-2에 의해 아실-CoA로의 역에스테르화가 일어나는 미토콘드리아 막을 가로질러 수송된다. 생리학적으로, CPT-1 활성은 지방산 합성의 기질인 말로닐-CoA의 저해를 통해 조절된다. 말로닐-CoA는 지방산 합성 속도를 결정하는 효소(pace-setting enzyme)인 아세틸-CoA 카르복실라제(ACC, E.C. 6.4.1.2)의 효소 생성물이다. 세포질 말로닐-CoA 수준은 ACC의 활성 증가에 기인하여 지방산 합성 중 높아진다. 높은 수준의 말로닐-CoA는 차례로 CPT-1을 저해하고, 미토콘드리아 내로 장쇄 아실-CoA의 진입을 차단한다. 이것은 동시에 지방산 합성 및 산화의 불필요한 주기를 방지한다. FAS가 실질적으로 결여된 근육에서, ACC 및 말로닐-CoA는 심근 및 골격근의 중요한 에너지 공급원인 지방산 산화를 조절한다.

TOFA(5-(테트라데실옥시)-2-푸로산)는 아세틸-CoA 카르복실라제(ACC, E.C. 6.4.1.2)의 알로스테릭 저해제로, 아세틸-CoA에서 말로닐-CoA로의 카르복실화를 차단한다. 조효소-A로 일단 에스테르화되면, TOFA-CoA는 ACC의 생리학적 최종 생성물 저해제인 장쇄 아실-CoA와 유사한 메커니즘으로 ACC를 알로스테릭 저해한다[Halvorson, D. L. and McCune, S. A. Inhibition of fatty acid synthesis in isolated adipocytes by 5-(tetradecyloxy)-2-furoic acid., Lipids. 19: 851-856, 1984]. 세룰레닌[Funabashi, H., Kawaguchi, A. Tomoda, H., Omura, S., Okuda, S., and Iwasaki, S. Binding site of cerulenin in fatty acid synthetase., J. Biochem. 105: 751-755, 1989] 및 C75[Pizer, et al., 1998] 양자는 FAS의 저해제로서, 말로닐-CoA 및 아세틸-CoA에서 지방산으로의 축합을 방지한다. 세룰레닌은 자살 저해제로서, FAS와 공유 부가물을 생성하는 반면[Moche, M., Schneider, G., Edwards, P., Dehesh, K., and Lindqvist, Y. Structure of the complex between the antibiotic cerulenin and its target, beta-ketoacyl carrier protein synthase., J Biol Chem. 274: 6031-6034, 1999], C75는 느린 결합 저해제일 가능성이 있다[Kuhajda, F. P., Pizer E. S., Mani, N. S., Pinn, M. L., Han W. F., Chrest F. J., and CA. T., Synthesis and anti-tumor activity of a novel inhibitor of fatty acid synthase, Proceeding of the American Association for Cancer Research, 40:121, 1999]. TOFA를 사용하여, 본 발명자들은 세룰레닌 또는 C75에 의한 저해에 필적할 만한, 인간 유방암 세포주에서의 FA 합성 저해를 얻었다. 그러나, 놀랍게도 TOFA는 인간 유방암 세포의 클론원성 분석(clonogenic assay)에서 본질적으로 세포 비독성이었다. 이들 데이터는, 지방산 고갈이 혈청 보충 배양물에서 암 세포에 대한 세포독성의 주된 원인이 아님을 의미한다. FAS 저해의 다른 효과(특이적으로 FAS의 저해 결과인, 높은 수준의 기질, 말로닐-CoA)는 세룰레닌 및 C75의 세포독성을 매개하는 것으로 보인다.

아세틸-CoA 카르복실라제(ACC, E.C. 6.4.1.2)의 효소적 생성물인 말로닐-CoA는 세포내 대사에서 중요한 조절 분자이다. 지방산 합성에서 기질로서의 역할 이외에, 말로닐-CoA는 미토콘드리아의 외막에서 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라제-1(CPT-1)과의 상호작용을 통해 지방산의 β-산화를 조절한다. 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라제(CTP-1)는 미토콘드리아 지방산 산화의 속도 제한 효소이다(도 6 참조). 이것은 장쇄 지방 아실 CoA에서 L-카르니틴으로의 트랜스-에스테르화를 수행하여 아실카르니틴을 생성하는 미토콘드리아의 중요 외막 단백질이다. 아실카르니틴은 CPT-2에 의해 아실-CoA로 역에스테르화되는 미토콘드리아 막을 가로질러 수송된다.

여러 유형의 종양 세포는 높은 수준의 지방산 합성을 특징으로 한다. 예상되는 바와 같이, 높은 수준의 지방산 합성을 가진 세포는 정상 세포 수준의 적어도 6배의, 높은 정상 상태(steady state) 말로닐-CoA 수준을 가진다(실시예 6 참조). FAS 저해제를 사용한 종양 세포의 치료는 암 세포에서 말로닐-CoA의 수준을 초생리학적 수준까지 선택적이고, 급격하게 증가시킨다. 이것은 지방산 합성에서 기질로서의 말로닐-CoA의 이용을 차단하고, 동시에 ACC의 지방 아실-CoA 저해를 감소시킴으로써 말로닐-CoA 합성을 자극하여 말로닐-CoA 수준을 증가시킨다(도 1A 참조). FAS가 암 세포 내에서 우세하게 발현되기 때문에, 말로닐-CoA 증가는 대개 종양 세 포로 제한된다. 이것은 FAS 저해제로 처리한 인간 암 이종이식편에서 일어나는 것과 같이 암 세포 에이폽토시스를 일으키지만, 정상 조직에서는 잘 일으키지 않는다(실시예 5 참조).

CPT-1은 2가지 이소형태, 간-형(L-CPT-1) 및 근육-형(M-CPT-1)을 가진다[Swanson, S. T., Foster, D. W., McGarry, J. D., and Brown, N. F. Roles of the N- and C-terminal domains of carnitine pamitoyltransferase I isoforms in malonyl-CoA sensitivity of the enzyme: insights from expression of chimaeric proteins and mutation of conserved histidine residues., Biochem. J. 335:513-519, 1998]. 이들 이소형태는 카르니틴에 대한 이들의 K_m(M-CPT-1에 대해서는 500 μM 및 L-CPT-1에 대해서는 ∼30 μM)및 말로닐-CoA 저해에 대한 감도(M-CPT-1이 100배 더 민감함, K_I = 0.07 μM 대 7 μM)에서 광범위하게 상이한 동력학적 특성을 가진다. 말로닐-CoA의 조절 부위가 N-말단 영역에 존재하는 반면, 정확한 결합 부위는 밝혀지지 않았다[Swanson, et al., 1998]. 중요한 것은 예시적인 CPT-1 저해제로서 본 명세서에 사용된 CPT-1의 공유 저해제인 에토모시르가 말로닐-CoA의 부위와 다른 부위에서 결합한다는 점이다.

CPT-1은 인간 암 세포에서 연구되지 않았다. 따라서, 인간 암 세포에서 발현된 이소형태는 알려져 있지 않다. 개념적으로, 간 이소형태는 모든 암종을 포함하는 상피 분화된 종양에서 발현되는 반면, 근육 이소형태는 육종과 같은 비-상피성 종양에서 발현될 것이다. 그러나, ACC 간 및 근육 이소형태의 연구 결과, 이소형태 중 어느 하나 또는 둘 다는 인간 유방암 세포에서 발현될 수 있다[Witters, L., Widmer, J., King, A., Fassihi, K., and Kuhajda, F. Identification of human acetyl-CoA carboxylase isozymes in tissue and in breast cancer cells., International Journal of Biochemistry, 26: 589-594, 1994]. 유사하게, 인간 암종 세포는 CPT-1 이소형태 중 어느 하나 또는 둘 다를 발현하는 능력을 가질 수 있다.

최근, CPT-1의 저해가 지방산에 의해 유도된 에이폽토시스에 대해 세포를 민감하게 만든다는 것이 밝혀졌다[Paumen, M. B., Ishida, Y., Muramatsu, M., Yamamoto, M., and Honjo, T. Inhibition of carnitine palmitoyltransferase I augments sphingolipid synthesis and palmitate-induced apoptosis., J. Biol. Chem. 272:3324-3329, 1997]. 더욱이, 지방산 합성 효소(FAS) 저해에 의해 유도되는 증가된 말로닐-CoA 수준은 인간 암 세포에 대해 세포독성이다(실시예 4 및 5 참조). 종합하면, 이들 데이터는, 인간 암 세포가 지방산 대사에서 변이(alteration)에 의한 에이폽토시스의 유도에 대해 감수성을 가진다는 것을 의미한다. CPT-1은 미토콘드리아 외막에서 항-에이폽토시스 단백질인 BCL-2와 직접적으로 상호작용하는 것으로 나타났다[Paumen, M. B., Ishisa, Y., Han, H., Muramatsu, M., Eguchi, Y., Tsujimoto, Y., and Honjo, T. Direct interaction of the mitochondrial membrane protein carnitine palmitoyltransferase I with Bcl-2, Biochem Biophys Res Commun. 231:523-525, 1997]. CPT-1과 BCL-2의 상호작용은 BCL-2의 항-에이폽토시스 효과를 조절함으로써, 에이폽토시스에 이르는 하류(down-stream) 메커니즘 을 제공할 가능성이 있다.

FAS에 대한 기질로서의 역할 이외에, 말로닐-CoA는 미토콘드리아 외막에서 작용하여 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라제 1(CPT-1)의 저해에 의해 지방산 산화를 조절한다. CPT-1의 저해는 세포를 지방산에 의해 유도된 에이폽토시스에 민감하게 만드는 것으로 나타났고; CPT-1은 미토콘드리아에서 항-에이폽토시스 단백질인 BCL-2와 직접 상호작용할 수 있다. FAS 저해는 암 세포 에이폽토시스를 유발하는 CPT-1을 저해하는 높은 수준의 말로닐-CoA를 유도한다. 대부분의 증식하는 정상 세포 및 비증식하는 정상 세포는 높은 수준의 FAS를 가지지 않기 때문에, 이러한 치료 기법에 의해 영향을 받지 않을 것이다.

말로닐 CoA 수준은 표적 효소 및 다양한 방법을 사용하여 조작할 수 있다. 실시예는 이용 감소와 동시에 생산 증가를 통한 말로닐 CoA 수준의 증가를 설명하고 있다. 말로닐 CoA 수준의 급격한 증가는 에이폽토시스에 의해 암 세포를 선택적으로 파괴시키지만 정상 세포에는 영향을 미치지 않는다. 본 발명에 따라 에이폽토시스를 유도하는 방법은 두 가지 광범위한 카테고리에 속한다: 말로닐-CoA의 급격한 증가의 직접적인 유도(예를 들어, FAS 저해에 의함) 및 지방산 산화와 지방산 합성을 저해하는 병용 요법의 사용(예를 들어, 비-FAS-저해 양상을 통함). 이러한 치료 기법으로 지방산 대사의 변이에 기초한 암 화학요법에 대한 새로운 표적 및 기법의 가능성을 확인한다.

지방산 산화는 에토모시르와 같은 저해제에 의한 직접적인 CPT-1 저해를 통해 저해될 수 있다. CPT-1 이소형태에 대한 특정 저해제도 개발될 수 있다. 대안적 으로, 기질을 감소시킴으로써 카르니틴의 수준을 조작하여 CPT-1 활성을 감소시킬 수 있다. 또한, 외인성 지방산을 감소시키거나, 또는 유전자 조작을 통해 CPT-1 발현 수준을 감소시킬 수 있다. 하기 실시예 7은 인간 유방암 세포에서 에토모시르를 사용하여 CPT-1을 직접적으로 저해하는 방법 중 한 가지 예이다.

지방산 합성 및 산화를 저해하는 다른 기법은 합성 증가, 분해 감소, 바람직하게는 양자로부터 말로닐-CoA 수준을 증가시키는 임의의 방법을 포함한다. 말로닐 CoA 수준은 다양한 방법 및 표적 효소를 사용하여 조작할 수 있다. 실시예 4∼5는 이용 감소와 동시에 생산 증가를 통해 말로닐-CoA 수준의 증가를 설명한다. 말로닐-CoA 수준의 급격한 증가는 정상 세포에 영향을 주지 않으면서, 에이폽토시스를 통한 암 세포의 선택적 파괴를 유발한다. 기타 실시예는 암 세포 성장 저해 및 사멸을 일으키는 다른 방법을 설명한다.

본 발명에 따른 지방산 대사의 조작은 이를 필요로 하는 유기체에게 조성물(또는 다수의 조성물)을 투여함으로써 이루어진다. 유기체에 투여되는 조성물은, 예를 들어, 세포내 말로닐-CoA 수준을 증가시킴으로써, 지방산 대사 경로에 대해 하나 이상의 생물학적 효과를 가지는 약제를 함유할 것이다. 일반적으로, 유기체는 포유류(예, 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그, 고양이, 개, 말, 소, 양, 염소, 돼지) 또는 영장류(예를 들어, 침팬지, 개코원숭이, 바람직하게는 사람)일 것이다. 일반적으로, 유기체는 신생물 (악성) 세포를 함유할 수 있다. 본 발명의 방법은 악성 세포에 선택적으로 영향을 주고, 정상 (비-악성) 세포에 대해 더 적은 효과를 보이는(또는 더욱 바람직하게는 어떠한 효과도 미치지 않는) 것을 목표로 한다.

유기체에 투여된 조성물 중의 약제는 유기체 중 악성 세포의 적어도 일부에서 세포내 말로닐 CoA 수준을 증가시키는 것이 바람직하다. 말로닐 CoA 수준은 2배 이상 증가되는 것이 바람직하고, 5배 이상 증가되는 것이 더욱 바람직하다. 약제는 악성 세포 내의 세포내 말로닐-CoA 농도를 주위 정상 세포 내의 수준보다 높은 수준으로 증가시키는 것이 바람직하다.

적합한 약제는 다수의 방법 중 임의의 방법에 의해 말로닐 CoA 수준을 증가시킬 것이다(하기 열거된 대안적인 메커니즘 참조). 바람직한 약제는 통상적으로 말로닐 CoA 수준의 갑작스럽거나 급격한 증가를 유발한다. 일부 구체예에서, 2가지 이상의 약제가 투여되고, 이들 약제 중 일부 또는 전부가 상이한 메커니즘에 의해 말로닐 CoA 수준에 영향을 줄 수 있다. 대안적으로, 약제의 병용은 지방산 합성을 감소시키는 동시에 지방산 산화를 감소시키는 데 사용될 수 있다. 지방산 합성 및 산화의 수준은, 세룰레닌을 사용한 세포독성 처리에 의해 얻어진 것과 필적할 만한 수준으로 감소되는 것이 바람직하다. 하기 목록 중 임의의 방식으로 작용하는 약제는 본 발명의 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다. 하기 활성에 대한 분석은 문헌에서 찾을 수 있고, 특정 약제가 이들 활성 중 하나를 나타내는가 여부의 측정은 당업계의 통상의 지식 범위 내이다.

말로닐-CoA 생산의 증가:

아세틸-CoA 카르복실라제(ACC) 작동제: ACC 활성을 증가시키거나, ACC 저해를 감소시키거나, 활성 ACC 효소의 질량을 증가시키는 약제는 말로닐-CoA의 수준을 증가시킬 것이다.

5'-AMP 단백질 키나제 작동제: 5'-AMP 단백질 키나제는 인산화에 의해 ACC를 저해하여 말로닐-CoA를 급격하게 감소시킨다. 이들 키나제의 저해제는 ACC 저해를 감소시킴으로써 말로닐-CoA의 수준을 급격하게 증가시킬 것이다.

시트레이트 합성 효소 작동제: 미토콘드리아 시트레이트의 증가는 지방산 합성에 대한 기질을 제공하고, 시트레이트 또한 말로닐-CoA 합성을 증가시키는 ACC의 "피드-포워드(feed-forward)" 활성화제로서 작용한다.

아실-CoA 합성 효소 작동제: 아실-CoA 합성 효소의 저해는 세포내 지방 아실-CoA 농도를 감소시켜 ACC의 저해를 감소시킬 것이다. 이것은 ACC 활성 및 말로닐-CoA 수준을 증가시킬 것이다.

말로닐-CoA 이용의 감소:

말로닐-CoA 디카르복실라제(MCD) 작동제: 이 효소는 역으로 말로닐-CoA로부터 아세틸-CoA로의 ATP-의존적 디카르복실화를 촉매한다. MCD의 저해는 말로닐-CoA 수준을 급격하게 증가시킨다.

동시에 말로닐-CoA 이용의 감소 및 생산의 증가:

지방산 합성 효소(FAS) 작동제: FAS의 저해는 말로닐-CoA가 지방산으로 혼입되는 것을 차단함으로써 말로닐-CoA의 이용을 감소시키게 된다. FAS 저해는 또한 ACC를 활성화시키는 지방 아실-CoA 수준을 감소시킨다. FAS 저해제의 예는 미국 특허 제5,759,837호 및 제5,981,575호에 기재된 바와 같이 얻을 수 있으며, 이는 본 명세서에 참고 인용된다.

지방산 대사를 변화시키는 이들 기법, 특히 말로닐-CoA 수준을 급격하게 증 가시키는 기법은 암 세포의 에이폽토시스를 증가시키는 기타 약제와 함께 또는 복합적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물 중 하나 이상의 약제는 FAS를 저해시키지 않는 메커니즘에 의해 말로닐-CoA의 수준을 증가시킨다.

성분의 투여

본 발명의 치료제는 약제 및 약학적 허용 담체를 함유하는 약학 조성물로 제형화되는 것이 바람직하다. 이 약학 조성물은, 기타 성분들이 이 치료가 무효가 될 정도로 본 발명에 따른 약제의 유효성을 감소시키지 않는 한, 기타 성분들을 함유할 수 있다. 약학적 허용 담체는 잘 알려져 있으며, 약학 분야의 당업자는 특정 투여 경로에 적합한 담체를 용이하게 선택할 수 있다. 예로서 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985]을 참조한다.

본 발명의 임의의 약제를 함유하는 약학 조성물은, 약물의 선택에 의해 요구되는 바에 따라, 비경구(피하, 근육내, 정맥내, 복강내, 흉막내, 소포내 또는 포막내), 국소, 경구, 직장 또는 비강 경로로 투여될 수 있다. 약학적 허용 담체 중 활성제의 농도는, 투여 시점에서 허용가능한 독성 수준을 초과하지 않는 한, 0.01 mM∼1 M 또는 그 이상일 수 있다.

치료의 용량 및 지속시간은 약물의 치료 계수, 질병의 유형, 환자의 연령, 환자의 체중 및 독성에 대한 허용 정도를 비롯한 다양한 인자에 따라 달라질 수 있다. 용량은 일반적으로 약 0.1 ㎍/㎖∼약 100 ㎍/㎖의 혈청 농도를 얻을 수 있도록 선택될 것이다. 초기 용량 수준은 시험관내 모델(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음) 및 생체내 모델 및 임상 시험에서 유효한 것을 밝혀진 주변 농도(최대 허용 수준 이하)를 얻을 수 있는 이들의 능력에 기초하여 선택될 것이다. 표준 임상 기법에 있어서, 화학요법을 개개의 환자에 대하여 조절하고, 화학요법제의 전신 농도를 규칙적으로 모니터링하는 것이 바람직하다. 특정 약물에 대한 용량 및 특정 환자에 대한 치료 지속시간은 상기 인자에 비추어 표준 약리학적 접근법을 사용하여 숙련된 임상의에 의해 결정될 수 있다. 치료에 대한 반응은 본 발명에 따른 약제의 혈중 또는 체액 농도 분석, 관련 조직에서의 이 약제의 활성 또는 수준 측정, 또는 환자의 질병 상태를 모니터링함으로써 모니터링될 수 있다. 숙련된 임상의는 이들 측정에 의해 밝혀진, 치료에 대한 반응에 기초하여 치료의 용량 및 지속시간을 조정할 것이다.

본 발명의 더욱 완전한 이해를 위하여, 다수의 실시예를 하기에 제시한다. 그러나, 본 발명의 범위는 단지 예시의 목적으로, 이들 실시예에 개시된 특정 구체예에 제한되지 않는다.

실시예 1

세포내 FAS의 시험관내 저해

TOFA, 세룰레닌 및 C75 모두는 인간 유방암 세포에서 지방산 합성을 저해하였다. 인간 유방암 세포주, SKBR3 및 MCF7은 10% 태아 소 혈청을 함유한 RPMI 내에서 유지되었다. 세포는 마이코플라스마 감염에 대하여 주기적으로 선별하였다(Gen-probe). 모든 저해제는 DMSO 중 5 mg/㎖ 원액(stock solution)으로서 첨가하였다. 지방산 합성 활성 측정에 있어서, 24개의 웰 플레이트 중 5 x 10⁴ 세포수/웰을 약물 에 노출시킨 후 [U-¹⁴C]-아세테이트로 펄스(pulse) 표지하고, 지질을 추출하여, 전술한 바와 같이 정량하였다[Pizer, et al., 1988]. MCF7 세포에 있어서, 경로 활성은 저해제 노출 2시간 후에 측정하였다. SKBR3 세포는 FAS 저해제에 대하여 더 느린 반응을 보여주었는데, 이는 이들의 극도로 높은 FAS 함량에 기인할 가능성이 있으므로, 경로 활성은 저해제 노출 6시간 후에 측정하였다.

유방암 세포주, SKBR3 및 MCF7을 FA 합성 저해제에 노출시킨 후 2시간 동안 표지하는 표준 펄스 표지화 실험에서, TOFA, C75 및 세룰레닌 모두는 지질로 [U-¹⁴C]-아세테이트가 혼입되는 것을 유사한 정도로 저해하였다(도 1B 및 D). 수차례의 유사 실험에서(도시하지 않음), TOFA는 시험된 모든 세포주에서 1∼5 ㎍/㎖ 용량 범위에서 FA 합성을 최대로 저해하였고, 세룰레닌 및 C75는 10 ㎍/㎖ 범위에서 FA 합성을 최대로 저해하였다.

실시예 2

세포 성장에 대한 동일한 저해제의 효과

TOFA, 세룰레닌 및 C75 모두는 인간 유방암 세포에서 지방산 합성을 저해하였으나, 차별적인 세포독성을 나타내었다. 세포 및 저해제는 실시예 1에 대하여 기재한 바와 동일하였다. 클론원성 분석에 있어서, 4 x 10⁵ 개의 세포를 첨가된 저해제와 함께 전술한 농도로 6시간 동안 25 cm³ 플라스크에 플레이팅하였다. 동일한 개수의 처리된 세포 및 대조군을 60 mm 디쉬에서 플레이팅하였다. 클론은 염색하고, 7∼10일 후에 계수하였다.

모든 저해제가 FA 합성을 유사한 정도로 감소시켰지만, 클론원성 분석으로 측정한 바와 같이, TOFA는 ACC 저해를 위한 용량 범위에서 암 세포 성장에 비독성이거나 자극성인 반면, 세룰레닌 및 C75는 FAS 저해를 위한 용량 범위에서 유의적인 세포독성을 나타내었다(도 1C 및 E). ACC 및 FAS 저해의 세포독성 효과 간의 이러한 큰 차이는, 지방산 생산의 급격한 감소 그 자체가 FAS 저해 이후 세포 손상의 주된 원인이 아니라는 것을 보여준다.

실시예 3

말로닐-CoA의 측정

이들 두 가지 효소를 저해할 때 예상되는 결과에서 가장 명백한 차이점은, 말로닐-CoA 수준이 ACC 저해 이후에는 감소되지만, FAS 저해 이후에는 증가된다는 것이었다. 진핵생물에서는 이전에 연구된 바가 없었지만, 이. 콜라이(E. Coli)에서의 최근 데이터는 세룰레닌에 대한 노출에 따라 말로닐-CoA 수준이 증가됨을 보여주었다[Chohnan, et al., 1997, "Changes in the size and composition of intracellular pools of non-esterified coenzyme A and coenzyme A thioesters in aerobic and facultatively anaerobic bacteria," Applied and Environmental Microbiology, 63:555-560]. 말로닐-CoA 수준은 실시예 2에 기재된 조건 하에서 TOFA에 의해 저해되고, FAS 저해된 세포에서 측정하였다.

말로닐-CoA 수준은 Corkey 등의 문헌 [1988, "Analysis of acyl-coenzyme A ester in biological samples, "Methods in Enzymology, 166:55-70]의 HPLC 방법을 사용하여 MCF-7 세포에서 측정하였다. 간략하게, 24개 웰 플레이트 내의 2.5 x 10⁵ 세포수/웰을 다양한 약물 처리 후 4℃에서 10% TCA 1.2 ㎖에 노출시켰다. 펠릿 중량을 기록하고, 상청액은 에테르 1.2 ㎖로 6회 세척한 후, 25℃에서 진공 원심분리기를 사용하여 건조될 때까지 감소시켰다. 조효소-A 에스테르를 분리한 후, 밀레니엄³² 소프트웨어(조효소-A에 대한 최대 흡광도로서 254 nm를 모니터링함)를 구동하는 워터 HPLC 시스템을 사용하여 5 μ 수펠코 C18 컬럼 상에서 역상 HPLC에 의해 정량하였다. 하기 구배 및 완충액을 사용하였다: 완충액 A: 0.1 M 인산칼륨, pH 5.0, 완충액 B: 0.1 M 인산칼륨, pH 5.0(40% 아세토니트릴 함유). 0.4 ㎖/분에서 92% A, 8% B를 사용하여 20분간 등용매 전개시킨 후, 유량을 1분 동안 0.8 ㎖/분으로 증가시켰고, 직후 10% B로의 선형 구배를 24분까지 전개시킨 후, 50분까지 10% B로 유지하였고, 55분에 선형 구배를 100% B로 전개시키고, 60분에 종료하였다. 하기 조효소-A 에스테르(시그마)를 표준물질로서 전개시켰다: 말로닐-CoA, 아세틸-CoA, 글루타티온-CoA, 숙시닐-CoA, HMG-CoA 및 유리 CoA. 샘플과 표준물질을 완충액 A 50 ㎕에 용해시켰다. 조효소-A 에스테르는 다음과 같이 순차적으로 용출하였다: 말로닐-CoA, 글루타티온-CoA, 유리 CoA, 숙시닐-CoA, HMG-CoA 및 아세틸-CoA. 조효소-A 에스테르의 정량화는 밀레니엄³²소프트웨어로 수행하였다.

약물 처리된 세포로부터의 산 가용성 추출물의 역상 HPLC에 의해 MCF-7 세포 중 조효소-A 유도체를 직접 측정한 결과, 세룰레닌 및 C75 양자는 말로닐-CoA 수준을 급속히 증가시키는 반면, TOFA는 말로닐-CoA 수준을 감소시킨다는 것을 확인하 였다. 도 2A는 세포 대사에서 중요한 조효소-A 유도체의 분리 및 동정을 입증하는 대표적인 크로마토그래피이다. 말로닐-CoA는 이들 중 제1 용리물(elute)이며, 컬럼 체류 시간은 19∼22분이다. 도 2B에서의 크로마토그래피의 오버레이는, 세룰레닌 처리가 대조군에 비해 말로닐-CoA의 현저한 증가를 유도하는 반면, TOFA는 유의적인 감소를 유발하였음을 보여준다. 말로닐-CoA의 화학적 동일성은 표준 물질을 사용한 샘플 스파이킹(spiking)에 의해 각각 확인되었다(도시하지 않음).

말로닐-CoA 수준은 FAS 저해로 인해 현저히 증가되었으며, TOFA에 의해 감소되었다. 도 2C의 다수의 실험 분석 결과는, 10 ㎍/㎖에서 C75 또는 세룰레닌에 대한 1시간의 노출 후, 말로닐-CoA 수준이 대조군에 비해 각각 370% 및 930% 증가되었지만, TOFA 처리(20 ㎍/㎖)는 말로닐-CoA 수준을 60% 감소시켰다. 말로닐-CoA 수준을 최대 감소시키는 데 필요한 TOFA의 농도는 도 1B 및 1D의 경로 저해를 위한 용량에 비해 4배 더 높았다. 그러나, CoA 유도체의 추출을 위한 최적 배양물은 제시된 생존력 분석 및 기타 생화학적 분석에 사용된 배양물에 비해 세포 밀도가 5배 더 높았다.

FAS 저해 이후 말로닐-CoA의 현저한 증가는 ACC 활성 증가를 일으키는 ACC의 장쇄 지방 아실-CoA 저해의 감소에 부분적으로 기인할 수 있다(도 1A). 더욱이, 세룰레닌에 의해 유도된 말로닐-CoA 수준의 증가는 처리 30분 이내에(대조군에 비해 930 +/- 15% 증가, 도시하지 않음), FA 합성 저해의 시간 프레임 내에, 그리고 DNA 합성 저해 시작 이전 또는 초기 에이폽토시스에서 일어났다. 따라서, 높은 수준의 말로닐-CoA는 FAS 저해제의 특징적인 효과로, 에이폽토시스를 비롯한 기타 세포성 반응에 일시적으로 선행하였다.

높은 수준의 말로닐-CoA를 유도하는 세룰레닌 또는 C75의 수준은 클론원성 분석, 및 메로시아닌(merocyanin) 450 염색법을 이용하는 에이폽토시스의 유세포측정 분석에 의해 측정되는 바와 같이 인간 유방암 세포에 대하여 세포독성을 가진다. FAS 저해는, FAS 저해를 통해 말로닐-CoA의 소비를 저해하는 동시에 ACC 활성에 대한 장쇄 아실-CoA의 저해 효과를 감소시켜 합성을 자극함으로써 높은 수준의 말로닐-CoA를 유도하게 된다.

실시예 4

FAS 저해의 TOFA 구제

FAS 저해의 TOFA 구제(rescue)는 높은 수준의 말로닐-CoA가 암세포 세포독성을 담당한다는 것을 설명한다. FAS 저해로부터 증가된 수준의 말로닐-CoA가 세포독성을 담당한다면, TOFA를 사용하여 말로닐-CoA 축적을 감소시킴으로써 FAS 저해로부터 세포를 구제하는 것이 가능하다. TOFA 및 세룰레닌을 SKBR3 세포에 함께 투여하면(도 3A), 실시예 2에 기재된 바와 같이 실시된 클론원성 분석에서 세룰레닌 단독의 세포독성 효과가 차단되었다. MCF7 세포에서(도 3C), TOFA는 유사한 실험 조건 하에서 세룰레닌 및 C75 양자를 적절히 구제하였다.

SKBR3 세포(도 3B) 및 MCF7(도 3D)의 대표적인 유세포 측정 분석은 이러한 발견을 입증하였는데, 이는 TOFA가 세룰레닌에 의해 유도된 에이폽토시스로부터 세포를 구제하기 때문이었다. 에이폽토시스는 아르곤과 크립톤 레이져가 장착된 FACStar^Plus 유세포측정기를 사용하여 다중파라미터 유세포측정법에 의해 측정되었다(Becton Dickinson). 에이폽토시스는, 배양물로부터 세포에 직접 첨가되는 메로시아닌 540 염색법(시그마)을 사용하여 정량되었는데, 이 방법은 에이폽토시스에서 초기에 일어나는 변화된 혈장막 인지질 패킹을 검출한다[Pizer, et al., 1998; Mower, et al., 1994, "Decreased membrane phospholipid packing and decreased cell size precede DNA cleavage in mature mouse B cell apoptosis, J. Immunol., 152:4832-4842]. 일부 실험에서, 에이폽토시스의 크로마틴 구조 변화는 LDS-751(Exciton)을 사용한 감소된 염색으로서 동시에 측정되었다[Frey, et al., 1995, "Nucleic acid dyes for detection of apoptosis in live cells," Cytometry, 21:265-274]. 메로시아닌 540[10 ㎍/㎖]을 수 중의 1 mg/㎖ 원액으로서 첨가하였다. 세포는 DMSO 중 1 mM 원액으로부터 최종 농도 100 nM에서 LDS-751로 염색하였다. 메로시아닌 540-양성 세포는 적색 형광의 증가에 의해 표시되었고, 메로시아닌 540-음성 세포에 비해 0.5∼2 로그, 575 +/- 20 nm에서 수집되었다. 유사하게, LDS-751 딤(dim) 세포는 정상 세포에 비해 0.5∼1.5 로그의 형광 감소를 나타냈으며, DF20 밴드 패스 필터를 사용하여 660 nm에서 수집되었다. 데이터를 수집하고, 셀퀘스트(CellQuest) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다(Becton Dickinson).

이들 실험에서, 모든 LDS-751 딤 세포는 메로시아닌 540 브라이트(bright)였지만, LDS-751 딤이 아닌 메로시아닌 540 브라이트 세포의 집단이 검출되었다. 모든 메로시아닌 540 브라이트 세포는 에이폽토시스된 것으로 분류되었다. 또한, 이 들 실험으로서 세룰레닌(>85% 에이폽토시스; 클론원성의 70% 감소)과 TOFA(에이폽토시스 <5% 증가; 클론원성의 감소 없음) 사이의 상이한 세포독성을 확인하였다. 종합하면, 이 연구는 높은 말로닐-CoA 수준이 암 세포에 대한 FAS 저해제의 세포독성 효과에 있어 중요한 역할을 한다는 사실을 보여준다.

실시예 5

생체내에서 종양 세포 성장에 대한 FAS 저해제의 효과

시험관내에서 관찰되는 FAS 저해의 효과가 전신적 활성을 필요로 하는 생체내 조건에서도 실현될 수 있는가 여부를 결정하기 위하여, C75를 흉선을 제거한 누드 마우스 내에서 MCF-7 피하 이종이식편에 대하여 시험하여, 확립된 고형 종양의 성장 및 FA 합성에 대한 C75의 효과를 정량하였다. 이전의 연구들은 인간 암 이종이식편에 대한 세룰레닌의 국소적 유효성을 보여주고 있으나[Pizer, et al., 1996, "Inhibition of fatty acid synthesis delays disease progression in a xenograft model of ovarian cancer," Cancer Res., 56: 1189-1193], 세룰레닌이 전신적으로 작용하지 않음으로 인해 제한되었다. 시험관내에서 세룰레닌 및 C75에 대한 유방암 세포의 유사한 반응은, C75가 이종이식된 유방암 세포에 대하여 생체내에서 유효할 수 있음을 암시하였다.

nu/nu 암컷 마우스(Harlan) 중에서 인간 유방암 세포주, MCF-7의 피하 측부(flank) 이종이식편을 사용하여 생체내에서 C75의 항-종양 효과를 연구하였다. 모든 동물 실험은 동물 관리 기준을 준수하였다. 종양 접종 7일 전, 모든 마우스의 전측부(anterior flank)에 90일간 서서히 방출되는 피하 에스트로겐 펠 릿(Innovative Research)을 투여하였다. 10⁷개의 MCF-7 세포는 10% FBS 및 인슐린 10 ㎍/㎖를 보충한 DMEM 중의 배양물로부터 이종이식하였다.

접종 약 10일 후 측정가능한 종양이 생겼을 때 치료를 시작하였다. 11마리의 마우스(각각 5마리와 6마리 2개의 개별 실험군으로 나뉨)에 0.1 ㎖ RPMI 중 30 mg/kg의 C75를 주1회 용량으로 복강내 처리하였다. 투약은 BALB/c 마우스에서 40 mg/kg의 단일 용량 LD₁₀ 측정치를 기초로 하였고; 30 mg/kg은 이계교배된 누드 마우스에서 잘 허용되었다. 11마리의 대조군 마우스(처리군과 동일한 방식으로 나뉨)에는 RPMI만을 투여하였다. 종양 부피는 칼리퍼를 사용하여 3가지 치수로 측정되었다. 실험은, 대조군이 대리(surrogate) 종말점에 도달하였을 때 종료하였다.

처리군 및 대조군 종양에서의 지방산 합성 활성을 측정하기 위한 대비 실험에서, MCF-7 이종이식된 마우스 군을 전술한 용량의 C75 또는 비히클로 처리하였고, 3시간 후 치사시켰다. 종양과 간 조직은 [U¹⁴-C] 아세테이트를 사용하여 생체외에서 표지하였고, 지질을 추출하여, 문헌 [Pizer, et al, 1996]에 기재된 방식으로 계수하였다.

처리 및 미처리 종양을 조직학적으로 검사하는 추가의 대비 실험에서, 6마리의 C75 처리 마우스 및 6마리의 비히클 대조군 마우스를 처리 6시간 후에 치사시켰다. 종양 및 정상 조직을 중성-완충 포르말린 중에 고정시키고, 통상의 조직학적 처리를 하여, FAS에 대한 면역화학분석을 실시하였다. FAS에 대한 면역화학분석은 LSAB2 검출 키트를 사용하는 다코 이뮤노스테이너(Dako Immunostainer) 상에서 1:2000으로 마우스 모노클로날 항-FAS 항체(Alo, et al., 1996)를 사용하여 MCF-7 이종이식편에서 수행하였다.

이종이식된 마우스의 조직에서의 지방산 합성 경로 활성은 [U¹⁴C]-아세테이트로 생체외 펄스 표지화하여 측정하였다. 종양 이종이식편은 간에 비해 FA 합성 활성이 10배 높았고, 양성 및 악성 조직간의 경로 활성에 차이가 컸다(도 4A). MCF-7 이종이식편 중의 FAS 발현은 높은 수준의 FA 합성 활성에 대응하였다(도 4B). 30 mg/kg으로 C75를 복강내 투여하면 3시간 이내에 생체외 표지된 간에서, 그리고 MCF-7 이종이식편에서 지방산 합성이 각각 76% 및 70%까지 감소하였다(도 4A). FA 합성에서의 이러한 변화는 이종이식편에서 세포독성의 조직학적 증거에 선행하였는데, 후자는 처리 6시간 후 명백해졌다(도 4C 및 4D). C75로 처리된 이종이식편은 종양 조직에서 다수의 에이폽토시스체(apoptotic body)를 보여주었는데, 이것은 비히클로 처리된 종양에서는 관찰되지 않았다. C75 처리 후 간과 기타 숙주 조직의 조직학적 분석 결과, 임의의 단기간 또는 장기간 독성에 대한 어떠한 증거도 없었다(도시되지 않음).

이종이식편의 C75 처리는 정상 조직에 손상을 주지 않으면서 종양 성장을 감소시키고 세포독성을 유발한다. 30 mg/kg 용량의 C75 처리 6시간 후 종양 조직학은 대조 종양에 비해 유의성 있는 수준의 세포독성을 나타낸다(도 4C 및 4D, 첨부된 예비인쇄물). C75 처리된 이종이식편에서 에이폽토시스체의 증거가 나타났지만, 간과 기타 장기를 검사한 결과, 어떠한 조직 손상의 증거도 없었음에 주목한다(데이 터는 제시되지 않음). C75의 주1회 복강내 처리는 비히클 대조군에 비해 확립된 피하 MCF-7 종양의 성장을 지체시켰는데, 이것은 전신적인 항-종양 효과를 입증하였다(도 4E). 32일간의 주1회 치료 후, 비히클 대조군에 비해 치료군에서 종양의 성장에 8배 이상의 차가 있었다. 세룰레닌과 유사하게, 일시적인 가역적 체중 감소가 유일한 독성으로 기록되었다(Pizer, et al., 1996).

C75의 전신적 약리 활성은 전신적인 FAS 저해제 처리 결과에 대한 첫번째 분석을 제공하였다. 생리학적 수준의 주변 지방산 조건에서 인간 유방암 이종이식편에 대한 C75의 유의성 있는 항-종양 효과는 혈청 보충 배지에서의 시험관내 결과와 유사하였고, 지방산 고갈과는 독립적인 세포독성 메커니즘과 일치하였다.

실시예 6

생체내에서 높은 정상 상태 말로닐-CoA 수준을 가진 인간 암 세포

실시예 5의 결과는 말로닐-CoA 축적이 정상 조직에서 심각한 문제를 일으키지 않을 것임을 암시하였는데, 그 이유는 간과 같은 지질원성 장기에서조차 FA 합성 경로 활성이 낮기 때문일 가능성이 있다. 말로닐-CoA는 이 실험의 유방암 세포에서 검출된 다량의 저분자량 CoA 접합체였지만, 기타 연구들은 배양된 간세포에서 다량의 숙시닐-CoA 및 아세틸-CoA를 보고하였음에 더욱 주목한다. 종양 조직 내 높은 수준의 말로닐-CoA는 간에 비해 종양 세포에서 높은 수준의 지방산 합성을 반영한다(Pizer, et al., 1996).

실시예 5의 MCF-7 인간 유방암 이종이식 모델을 사용하여, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 동일한 동물로부터의 종양 이종이식편 및 간에서 말로닐-CoA 수 준을 측정하였다. 이하 도 3은 간에 비해 종양 조직에서 말로닐-CoA의 수준이 높다는 것을 보여준다. 또한, 기타 CoA 유도체의 분포가 현저히 변화된다. 예를 들어, 간은 이종이식편에 비해 말로닐-CoA가 약 10배 적은 반면, 아세틸-CoA가 약 10배 많았고, 기타 CoA 유도체, 특히 숙시닐-CoA의 수준이 높았다. CoA 유도체 양상의 차이는 암 세포 및 간세포에 있어서 에너지 대사의 큰 차이를 의미할 수 있다.

실시예 7

CPT -1 저해제에 의한 세포 성장 저해

카르니틴 팔미토일트랜스퍼라제-1은 에토모시르에 의해 저해된다[Paumen, M. B., Ishida, Y., Muramatsu, M., Yamamoto, M., and Honjo, T. Inhibition of carnitine palmitoyltrasferase I augments sphingolipid synthesis and palmitate-induced apoptosis., J. Biol. Chem. 272: 3324-3329, 1997; Ratheiser, K., Schneeweib, B., Waldhausl, W., Fasching, P., Korn, A., Nowotny, P., Rohac, M., and Wolf, H. P. O. Inhibiton of etomoxir of carnitine palmitoyltransferase I reduces hepatic glucose production and plasma lipids in non-insulin-dependent diabetes mellitus., Metabolism. 40:1185-1190, 1991].

에토모시르

320.74

도 7A는 에토모시르가 단독으로 C75nm에 비해 유의성 있는 성장 저해 효과를 유발한다는 것을 예시한다. C75는 말로닐-CoA를 증가시킴으로써 CPT-1을 간접적으 로 저해한다. 도 7B는 MCF-7 세포의 성장의 에토모시르 저해가 C75와 상가적임을 보여준다. 패널 7A에서, 에토모시르는 72시간에 걸쳐 5 ㎍/㎖의 C75에 비해 더욱 큰 MCF-7 세포의 용량 의존적 성장 저해를 산출한다. 패널 7B에서, 에토모시르 및 C75는 어느 것 하나의 단독 투여에 비해 더욱 증가된 성장 저해 효과를 가진다. 5 x 10⁴개의 MCF-7 세포를 24-웰 플레이트에 플레이팅하고, 플레이팅 18시간 후 도면에 도시된 농도에서 억제제로 처리하였다. 세포를 에탄올로 고정하고, 크리스탈 바이올렛으로 염색하여, SDS로 가용화한 후, 490에서 판독하였다. 에토모시르의 농도는 분리된 간세포에서 CPT-1을 저해하기 위하여 사용된 농도와 유사하며; 비특이적 효과는 시험관내에서 400 μM 이상의 용량에서 확인되었다는 점이 중요하다(Paumen, et al., 1997). 병용되는 경우, 에토모시르 및 C75는 상가적인 성장 저해 효과를 산출하였다. 말로닐-CoA 및 에토모시르는 모두 CPT-1 저해제이고, CPT-1 상에 상이한 결합 부위를 가지므로, 에토모시르 및 C75의 증강된 효과는 놀라운 것이 아니다. 에토모시르는 인간에서 유의성 있는 독성이나 체중 감소없이 당뇨병을 치료하는 데 사용되어 왔다(Ratheiser, et al., 1991). 이러한 내력으로 인해, CPT-1은 이러한 성과를 더욱 신속하게 임상으로 적용시키는 수단을 제공할 수 있다.

실시예 8

지방산 산화의 세룰레닌 저해

FAS 저해로부터 얻어지는 높은 수준의 말로닐-CoA는 인간 유방암 세포에서 세포독성인 것으로 나타났으므로, 본 발명자들은 말로닐-CoA에 의한 CPT-1의 저해가 암세포 사멸의 메커니즘에서도 역할을 할 것인가를 알아보기로 하였다.

MCF-7 인간 유방암 세포를 공지된 FAS 저해제인 세룰레닌으로 처리하여, 세룰레닌이 MCF-7 세포에서 에이폽토시스를 유도하는 것으로 알려져 있지만 실제 에이폽토시스의 시작 이전의 용량에서 지방산 산화를 감소시키는가 여부를 측정하였다. 지방산 산화는 염기 중에서 [¹⁴C]팔미테이트의 산화로부터 방출된 ¹⁴CO₂를 포집하여 계수함으로써 측정하였다.

1 x 10⁶ 개의 MCF-7 세포를 T25 플라스크 내에, 3개로 플레이팅하고, 37℃에서 밤새 항온처리하였다. 이어서, 지시한 바와 같이 DMSO 중 5 mg/㎖ 원액으로부터 희석한 시험 화합물(세룰레닌)을 첨가하였다. 2시간 후, 약물이 함유된 배지를 제거하고, 세포를 하기 완충액 1.5 ㎖로 30분 동안 예비배양하였다: 114 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM KH₂PO₄, 1.2 mM MgSO₄, 글루코즈 11 mM. 예비배양 후, 114 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM KH₂PO₄, 1.2 mM MgSO₄, 글루코즈 11 mM, 알부민에 결합된 2.5 mM 팔미테이트(100 μCi의 [1-¹⁴C]팔미테이트를 함유함), 0.4 mM L-카르니틴을 함유하는 분석 완충액 200 ㎕를 첨가하고: 세포를 2시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 항온처리 후, 400 ㎕의 벤조토늄 염산염을 중앙 웰에 첨가하고 방출된 ¹⁴CO₂를 수집하였다. 즉시, 7% 과염소산 500 ㎕를 세포에 첨가하여 반응을 중단시켰다. 이어서, 세포가 함유된 플라스크를 37℃에서 2시간 동안 항온처리한 후, 벤조토늄 염산염을 제거하여, ¹⁴C에 대하여 계수하였다. 분석 완충액으로 2시간 항온처리하기 전에 7% 과염소산 500 ㎕를 세포에 첨가하여 블랭크를 제조하였다.

도 8은 이 시스템에서 에이폽토시스 시작 이전에 2시간 동안 지시된 용량의 세룰레닌으로 처리한 MCF-7 세포에서의 지방산 산화를 보여준다.

세룰레닌은 MCF-7 세포에서 지방산 산화의 용량-반응적 저해를 일으킨다. 2시간 내에 지방산 합성을 >50% 감소시키고 말로닐-CoA를 거의 9배 증가시키는 것으로 알려진 10 ㎍/㎖의 용량에서, 세룰레닌은 대조군에 비해 지방산 산화를 약 50% 감소시켰다(p=0.0007; 2-테일드(tailed) t-테스트).

실시예 9

카르니틴 팔미토일트랜스퍼라제-1의 저해

세룰레닌은 지방산 합성 효소(FAS)가 저해되는 경우 세포에서 말로닐 CoA 수준을 증가시키는 것으로 알려져 있고, 말로닐 CoA는 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라제-1(CPT-1)에 대한 이것의 영향을 통해 지방산 산화를 저해하는 것으로 알려져 있다. CPT-1은 β-산화에 있어서 미토콘드리아 내로의 장쇄 지방산의 이동을 매개한다. 이것은, 장쇄 지방 아실 CoA의 L-카르니틴으로의 트랜스-에스테르화를 수행하여, 아실카르니틴을 생성한다. 이 반응을 통해, 수용성 L-카르니틴은 지방산으로의 에스테르화 이후에 유기 용해성으로 된다. 지방산 산화에서 세룰레닌에 의해 유도된 감소가 말로닐 CoA 증가에 기인하는가 또는 CPT-1에 대한 세룰레닌의 직접적인 저해에 의한 것인가의 여부를 시험하기 위하여, 세룰레닌을 MCF-7 세포에서의 CPT-1 분석에서 기타 저해 화합물과 비교하였다.

카르니틴 팔미토일트랜스퍼라제-1(CPT-1) 분석: MCF-7 세포를 6-웰 플레이트에서 1 x 10⁶세포수로 10% 태아 소 혈청을 함유하는 RPMI 1640 중에, 3개로 플레이팅하였다. 37℃에서 밤새 항온처리한 후, 배지를 제거하고 하기 성분으로 이루어진 분석 배지 700 ㎕로 대체하였다: 20 μM 말로닐-CoA 또는 기타 지시된 저해제를 함유하거나 함유하지 않는, 50 mM 이미다졸, 70 mM KCl, 80 mM 수크로즈, 1 mM EGTA, 2 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 1 mM KCN, 1 mM ATP, 0.1% 무지방산 소혈청 알부민, 70 μM 팔미토일-CoA, 0.25 μCi[메틸-¹⁴C]L-카르니틴, 40 ㎍ 디기토닌.

37℃에서 3분 또는 6분간 항온처리한 후, 빙냉 4 M 과염소산 500 ㎕를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 이어서, 세포를 수거하고, 10,000 x g에서 5분간 원심분리시켰다. 펠릿을 빙냉 과염소산 500 ㎕로 세척하고, 다시 원심분리시켰다. 생성된 펠릿을 dH₂O 800 ㎕ 중에 재현탁하고, 부탄올 150 ㎕로 추출하였다. 부탄올상을 액체 섬광법에 의해 측정하고, 아실카르니틴 유도체로 나타낸다.

도 9는 CPT-1에 대한 3가지 화합물의 효과를 도시한다: 에토모시르(공지된 CPT-1 저해제), TOFA(지방산 합성 경로의 효소인 아세틸 CoA 카르복실라제를 저해함으로써 지방산 합성을 저해하는 것으로 알려져 있음) 및 세룰레닌.

도 9는 세룰레닌이 MCF-7 세포에서 CPT-1을 직접적으로 저해하지 아니함을 나타낸다. 사실상, 10 ㎍/㎖의 농도에서 세룰레닌은 비히클 대조군에 비해 CPT-1 활성을 통계적으로 유의성있는 정도가 아닌, 미약하게 증가시킨다. 따라서, 세룰레닌에 의한 지방산 산화 감소는 CPT-1에 대한 세룰레닌의 직접적인 효과에 기인하기 보다는, 말로닐-CoA의 동반 상승에 기인하는 것 같다.

실시예 10

세포 성장에 대한 CPT-1 저해 효과

세룰레닌은 말로닐-CoA의 증가 및 지방산 산화의 감소를 유발하므로, 시험은 CPT-1 저해가 에이폽토시스를 유발하는데 관여하는가 여부를 알기 위하여 설계되었다. 이 목적을 위하여, MCF-7 세포를 CPT-1의 공지된 직접 저해제인 에토모시르로 처리하고, 세포에 의한 지방산 산화를 실시예 8에 기재된 바와 같이 측정하였다. 도 10은 에토모시르가 MCF-7 세포에서 지방산 산화를 저해한다는 것을 나타낸다.

50 ㎍/㎖의 용량에서, 지방산 산화는 대조군에 비해 >50% 감소된다(p=0.012; 2-테일드 t-테스트)(도 9는 에토모시르가 CPT-1을 직접 저해함을 나타내는데, 10 ㎍/㎖의 용량에서 CPT-1 활성을 75% 감소시킨다, p=0.023; 2-테일드 t-테스트).

세포 성장 저해 분석: 에토모시르가 CPT-1의 강력한 저해제이지만, MCF-7 세포를 CPT-1과 지방산 산화를 저해하는 것으로 알려진 용량의 에토모시르로 처리하는 경우, 유의성 있는 성장 저해나 세포독성은 없다. MCF-7 세포는, 10% 태아 소 혈청을 함유하는 RPMI 1640(Hyclone) 중에 웰당 5 x 10⁴ 세포수로 24 웰 플레이트에 플레이팅하였다. 밤새 37℃에서 항온처리한 후, 에토모시르를 DMSO 중 원액 5 mg/ ㎖로부터 첨가하였다. 배양물 중 최종 DMSO 농도는 0.2 % 이하였다. 48시간 또는 72시간 후, 배지를 제거하고, 웰을 행크의 완충 염수로 3회 세척하였다. 웰을 크리스탈 바이올렛으로 염색한 뒤 건조시켜, 10% SDS 중에서 가용화시켰다. 100 ㎕ 분취량을 96-웰 플레이트에 옮기고, 몰레큘라 다이나믹스(Molecular Dynamics) 플레이트 판독기 상에서 490 nm로 판독하였다. 데이터는 흡광 유닛으로서 제시되며, 오차 바(bar)는 평균의 표준 오차를 의미한다. 통계학 및 도표화는 프리즘 2.0에서 수행되었다(Graph Pad).

도 11은 MCF-7 세포내에서 성장 저해에 대한 엑토모시르의 효과를 나타낸다.

단지 200 ㎍/㎖의 용량이 성장에서 유의성 있는 감소를 유발하였다(p=0.006, 2-테일드 t-테스트). 따라서, CPT-1 저해는 단독으로 인간 유방암 세포에 대해 유의적으로 성장을 저해한다.

그러나, 세룰레닌 처리시에 CPT-1은 저해되고, 지방산 산화는 지방산 합성 저해시에 감소되는데; 이것은 비생리학적 반응이다. 생리학적으로, 지방산 합성이 감소되면, 말로닐-CoA 수준은 저하되고, 지방산 산화를 증가시키는 CPT-1의 저해가 감소된다. 그러므로, CPT-1 저해는 또한 지방산 합성 저해 조건 하에서 세포독성을 유도한다.

실시예 11

CPT-1 저해 및 지방산 합성 저해 조합의 세포독성 효과

TOFA는 지방산 합성에서 속도 제한 효소인 아세틸-CoA 카르복실라제(ACC)의 저해제이다. ACC의 TOFA 저해는 말로닐-CoA를 감소시키고, 이어서 지방산 합성을 저해한다. TOFA 및 세룰레닌 양자는 지방산 합성을 저해시키고, 세룰레닌은 말로닐-CoA를 증가시키는 FAS를 저해하는 반면, TOFA는 말로닐-CoA를 감소시키는 ACC를 저해한다.

이 실시예에서, 세포를 TOFA로 처리하여 지방산 합성을 저해하고, 에토모시르로 처리하여 지방산 산화를 저해한다. 세포독성에 대한 이러한 조합된 저해 효과는 클론원성 분석에서 측정되었다.

클론원성 분석: 37℃에서 밤새 항온처리한 후, 1 x 10⁶개의 MCF-7 세포를 지시된 바와 같은 약물에 6시간 동안 노출시키고, 세척하고, 트립신 분해에 의해 분리하고, 계수하고, 1000 또는 500 세포수/60-mm 플레이트에서 3개로 플레이팅하였다. 콜로니를 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 플레이팅한 후 4∼6일에 계수하였다. 세포로 이루어진 대조군을 약물 없이 DMSO로 항온처리하였다. 오차 바는 평균의 표준 오차를 나타낸다.

실시예 12는 에토모시르 및 TOFA로 처리한 MCF-7 세포를 사용한 클론원성 분석을 나타낸다.

세포를 5 ㎍/㎖의 TOFA로 처리하는 것은 유의성있는 정도의 세포독성을 나타내지 않는데; 이것은 이전에 개시된 우리의 연구와 유사하다(참조 문헌). 도 9는 또한 TOFA가 CPT-1 저해를 일으키지 아니하며, 지방산 산화에서 유의성 있는 변화를 일으키지 아니함을 보여준다(데이터는 제시되지 아니함). 에토모시르 처리 또한 유의성있는 정도로 세포독성을 가지지 아니하는데, 이는 도 11의 성장 저해 연구에 의해 부연설명된다. 그러나, TOFA 및 에토모시르의 병용은 TOFA 단독(p=0.004, 2-테일드 t-테스트) 또는 에토모시르 단독(p=0.002, 2-테일드 t-테스트)에 비해 유의성 있는 정도로 세포독성이 크다.

이들 데이터는, CPT-1 저해가 지방산 합성 저해시에 암 세포에 대해 독성임을 의미한다. 따라서, CPT-1 저해제는 지방산 합성 저해제와 함께 사용되어 항-종양 반응을 증가시킬 수 있다.

실시예 12

지방산 합성 효소 저해제와 CPT-1 저해제의 세포독성에 대한 상가적 효과

실시예 C에 기재된 방법을 사용하는 성장 저해 분석에서, MCF-7 세포를 FAS 저해제인 C75를 단독으로 또는 에토모시르와 함께 처리하고 처리 48시간 후 분석하였다. 에토모시르 및 C75 양자는 대조군에 비해 유의성있는 성장 저해를 유발하였다(p=0.0001, p=0.005, 2-테일드 t-테스트). 이하 도 13은 에토모시르가 FAS 저해의 세포독성 효과를 또한 증진시킬 수 있음을 나타낸다.

에토모시르와 C75의 병용으로 인해 에토모시르 단독에 비해 한층 유의성 있는 성장 저해(p=0.004, 2-테일드 t-테스트) 및 C75 단독에 비해 더욱 증가된 성장 저해를 향한 강력한 성향이 나타났다(p=0.054, 2-테일드 t-테스트). 이들 데이터는 CPT-1 저해가 FAS 저해제의 항-종양 효과를 향상시킬 수 있음을 암시한다.

이해를 명확하게 하기 위하여, 전술한 발명은 특정 구체예와 관련된 실시예 및 예시에 의해 더욱 구체적으로 설명되지만, 이점과 개질은 본 발명이 속한 기술 분야의 당업자에게 명백할 것이다. 전술한 설명과 실시예는 예시의 목적일 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 의약, 생화학, 약학 및/또는 관련 분야의 당업자에게 명백한 본 발명을 실시하기 위한 전술한 양태의 변경은 첨부된 특허청구범위에 의해서만 정해지는 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 해석되어야 한다.

본 명세서에 언급한 모든 공보와 특허 출원은 본 발명이 속한 기술 분야의 당업자의 기술 수준을 의미한다. 모든 공보와 특허 출원은, 이들 각각이 참고로 포함되는 구체적이고 개별적으로 기재되어 있는 한도내에서 본 명세서에 참고로 인용된다.

도 1은 지방산 합성 경로, 및 지방산 합성 및 종양 세포 성장에 대한 다양한 지방산 합성 효소 저해제의 효과를 도시한다.

도 2는 다양한 조건 하에서의 말로닐 CoA 수준을 도시한다.

도 3은 다양한 저해제로 처리한 유방암 세포에 대한 클론원성 분석 및 에이폽토시스 분석 결과를 도시한다.

도 4는 종양 세포 및 간 세포에서의 다양한 파라미터를 도시한다.

도 5는 종양 세포 및 간 세포에서의 말로닐 CoA 수준을 도시한다.

도 6은 지방산의 세포내 산화 경로를 도시한다. CPT-1은, 팔미토일 CoA와 같은 장쇄 아실 CoA 유도체의 미토콘드리아 외막을 통한 미토콘드리아 내로의 통로를 조절함으로써 미토콘드리아 내의 지방산 산화를 조절하여, 내인적으로 합성된 지방산을 산화하는 불필요한 주기를 방지한다.

도 7은 C-75가 있거나 없는 MCF-7 세포의 성장에 대한 에토모시르의 효과를 도시한다.

도 8은 MCF-7 세포 내 지방산 산화에 대한 세룰레닌의 효과를 도시한다.

도 9는 CPT-1 활성에 대한 에토모시르, TOFA 및 세룰레닌의 효과를 도시한다.

도 10은 MCF-7 세포 내 지방산 산화에 대한 에토모시르의 효과를 도시한다.

도 11은 MCF-7 세포의 성장에 대한 에토모시르의 효과를 도시한다.

도 12는 에토모시르 및 TOFA 둘 다로 처리한 MCF-7 세포를 사용한 클론원성 분석 결과를 도시한다.

도 13은 MCF-7 세포의 성장에 대한 에토모시르 및/또는 C-75의 효과를 도시한다.

Claims

유기체 내의 종양 세포의 성장을 저해하기 위한 조성물로서, 상기 유기체의 종양 세포에서 세포내 말로닐 CoA를 증가시키는 말로닐-CoA 디카르복실라제(MCD)의 저해제를 포함하는 것인 조성물.
유기체 내의 종양 세포의 성장을 저해하기 위한 조성물로서, 상기 유기체의 종양 세포에서 세포내 말로닐 CoA를 증가시키기 위한 약제를 포함하며, 상기 세포내 말로닐 CoA의 증가는 말로닐 CoA의 합성 증가와 관련되는 것인 조성물.
제2항에 있어서, 상기 조성물은 아세틸-CoA 카르복실라제(ACC)의 활성화제, 5'-AMP-활성화 단백질 키나제(AMPK)의 저해제, 아실 CoA 합성효소(synthase)의 저해제 및 이들의 조합으로 이루어진 군 중에서 선택되는 제제를 포함하는 것인 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유기체의 세포에서 세포내 말로닐 CoA는 투여 3시간 내에 증가하는 것인 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세포내 말로닐 CoA의 증가가 말로닐 CoA의 소비 속도의 증가보다 더 빠르게 증가하는 것인 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세포내 말로닐 CoA는 세포의 성장 저해 이전에 증가하는 것인 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세포내 말로닐 CoA의 증가는 지방산 합성효소의 세포내 활성 감소와 관련되는 것인 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 지방산 합성을 저해하지 않는 제2 화학요법제를 유기체에 투여하는 것인 조성물.
제2항에 있어서, 상기 약제는 종양 세포 치료용이며, 상기 조성물 투여 전 종양 세포에서의 세포내 말로닐 CoA 수준은 비-악성 세포에서의 정상 말로닐 CoA 수준의 2배 이상인 것인 조성물.
제2항에 있어서, 상기 약제의 투여 후, 세포내 말로닐 CoA 수준은 증가하며, 세포내 아세틸 CoA 및 유리 CoA 수준은 치료전 수준에 비해 감소하는 것인 조성물.
제2항에 있어서, 상기 약제는 종양 세포 치료용이며, 상기 유기체의 일부 세포에서의 지방산 합성 속도는 상기 조성물 투여 전 정상 속도의 2배 이상이고, 상기 조성물의 투여는 상기 세포에 세포독성인 것인 조성물.
제2항에 있어서, 상기 약제는 종양 세포 치료용이며, 상기 유기체는 지방산 합성 속도가 증가된 종양 세포를 포함하고, 상기 종양 세포의 세포수는 상기 약제의 투여 후 감소하는 것인 조성물.