KR20020060737A - 암세포를 선택적으로 사멸시키기 위한 수단으로서의세포내 조효소 ａ 농도의 감소 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유리 세포 조효소 A(CoA)의 급감에 의하여 암세포의 성장을 저해하거나 암세포를 사멸시키는 방법을 기재하고 있다. 본 발명은 CoA의 이용 증가 및/또는 합성 감소에 의하여 암세포 중의 CoA를 선택적으로 감소시키는 방법을 포함하고 있다. 본 명세서에 나타난 바와 같이, 유리 CoA의 감소는 지방산 합성 효소 (FAS)를 저해함으로써 수행될 수 있다. 또한, 본 발명은 FAS 저해에 더하여 또는 FAS 저해 대신에 중개 작용에 의하여 유리 세포 조효소 A의 감소시키는 것을 포함한다.

Description

암세포를 선택적으로 사멸시키기 위한 수단으로서의 세포내 조효소 Ａ 농도의 감소 방법{DEPLETION OF CELLULAR COENZYME-A LEVELS AS A MEANS TO SELECTIVELY KILL CANCER CELLS}

다수의 연구들은 인간의 치명적인 유방암(Alo, P. L., Visca, P., Marci, A., Mangoni, A., Botti, C., and Di Tondo, U. Expression of fatty acid synthase(Fas0 as a predictor of recurrence in stage Ⅰ breast carcinoma patients., Cancer. 77 :474-482, 1996; Jensen, V., Ladekarl, M., Holm-Nielsen, P., Melsen, F., and Soerensen, F. B. The prognostic value of oncogenic antigen 519 (OA-519) expression and proliferative activity detected by antibody MIB-1 in node0negative breast cancer., Journal of Pathology. 176 :343-352, 1995) 뿐만 아니라 기타의 암(Rashid, A., Pizer, E. S., Moga, M., Milgraum, L. Z., Zahurak, M., Pasternack, G. R., Kuhajda, F. P. and Hamilton, S. R. Elevated expression of fatty acid synthase and fatty acid synthetic activity in colorectal neoplasia., American Journal of Pathology. 150 :201-208, 1997; Pizer, E., Lax, S., Kuhajda, F., Pasternack, G., and Kurman, R. Fatty acid synthase expression in endometrial carcinoma: correlation with cell proliferation and hormone receptors., Cancer. 83 :528-537, 1998) 중에서매우 고농도의 지방산 합성 효소의 발현(FAS, E.C.2.3.1.85)을 밝혀내기에 이르렀다. FAS 발현은 장관내(腸管內) 및 소엽성 유방암 발암 물질, 침투성 유방암의 진행에 대한 위험성의 증가와 관련된 병변(病變)(Milgraum, L. Z., Witters, L. A., Pasternack, G. R., and Kuhajda, F. P. Enxymes of the fatty acid synthesis pathway are highly expressed in in situ breast carcinoma., Clinical Cancer Research. 3 :2115-2120, 1997) 중에서도 역시 확인되어 왔다. FAS는 말로닐-CoA 및 아세틸-CoA의 NADPH 의존 축합을 촉매하여 주로 탄소 원자 수가 16개인 포화 유리 지방산인 팔미트산염을 생성하는 지방산 합성(FA 합성)의 주요 합성 효소이다(Wakil, S. Fatty acid synthase, a proficient multifunctional enzyme., Biochemistry. 28 :4523-4530, 1989). 생체외에서 종양 조직의 측정 결과, 고농도의 FAS 및 FA 양자의 합성은 헥소키나아제로부터 FAS까지 25개의 어떤 효소로 이루어져 있는 전체 유전자 프로그램이 매우 활성임을 나타낸다는 것이 밝혀지기에 이르렀다(Rashid,et al., 1997).

진균 생성물, 세룰레닌 및 신규 화합물인 C75를 비롯한 FAS의 저해제로 처리된 인간의 배양 암세포는 FA 합성의 급격한 감퇴, 후속되는 DNA 합성의 감소 및 세포 주기의 중지를 나타내고, 세포 소멸의 최고조에 이르렀다(Pizer, E. S., Jackisch, C., Wood, F. D., Pasternack, G. R., Davidson, N. E., and Kuhajda, F. Inhibition of fatty acid synthesis induces programmed cell death in human breast cancer cells., Cancer Research. 56 :2745-2747, 1996, Pizer, E. S., Chrest, F. J., DiGiuseppe, J. A., and Han, W. F. Pharmacological inhibitorsof mammalian fatty acid synthase suppress DNA replication and induce apoptosis in tumor cell lines., Cancer Research. 58 :4611-4615, 1998). 포유류의 지방산 합성 효소 활성의 약리학적 저해는 약물 투여 후 약 90분 이내에 DNA 복제의 저해를 일으킨다. 이들 발견은 FA 합성 및 암세포 성장 사이에 매우 중요한 생화학적 연관이 있음을 암시하였다. 지대한 관심을 일으키고 있지만, 지방산 합성 효소의 저해가 어떻게 이러한 현상을 유발하는지에 관한 의문은 아직 알려져 있지 않은 채로 있다. 중요한 것은 소 태아의 혈청으로부터 유래된 배양 배지내에 외인성 지방산이 존재함에도 불구하고 이들 효과가 일어났다는 것이다. 지방산이 없는 배양 조건에서 외인성 팔미트산염의 첨가에 의하여 특정 세포에 대한 세룰레닌의 세포 독성 효과를 구제시키는 것이 가능하였지만, 대부분의 암 세포들은 상기 경로의 최종 산물에 의하여 FA 합성 저해로부터 구제되지 않았다(데이터는 제시되지 않음)(Pizer, E. S., Wood, F. D., Pasternack, G. R., and Kuhajda, F. P. Fatty acid synthase(FAS): A target for cytotoxic antimetabolities in HL60 promyelocytic leukemia cells., Cancer research. 1996 : 745-751, 1996). 따라서, 대부분의 암세포에 대한 FA 합성 저해의 세포 독성 효과가 최종 산물의 고갈에 의한 것인지 또는 어떤 다른 생화학적 메카니즘으로부터 기인한 것인지는 해결된 바가 없다.

도 1은 지방산 합성 경로, 및 지방산 합성 및 종양 세포 성장에 대한 다양한 지방산 합성 효소 저해제의 효과를 나타낸다.

도 2는 다양한 조건하에서의 말로닐 CoA를 나타낸다.

도 3은 다양한 저해제로 처리한 유방암 세포에 대한 클론원성(clonogenic) 분석 및 세포 소멸 분석의 결과를 나타낸다.

도 4는 종양 세포 및 간세포 중의 다양한 변수를 나타낸다.

도 5는 종양 세포 및 간세포 중의 말로닐 CoA를 나타낸다.

발명의 상세한 설명

지방산 고갈이 세룰레닌 및 C75의 세포 독성 표과를 매개하였다면, 이어서 유사한 효능이 있는 어떤 다른 FA 합성 저해제가 유사한 효과를 생성하여야 할 것이다. 이 착상을 시험하기 위하여, 본 발명자들은 암세포 중에서 지방산 합성 속도 제한 효소인 아세틸 CoA 카복실라아제(ACC, E.C. 6.4.1.2)의 저해 효과를 FAS 저해제의 효과와 비교하였다. 본 발명자들은 FAS의 저해가 C75 처리 후 30분 이내에 고농도의 말로닐 CoA에 이르게 한다는 것을 밝혀내기에 이르렀다. 말로닐 CoA의 초생리학적인(superphysiological) 농도(내인적으로 합성된 지방산의 낮은 농도가 아님)는 유방암 세포의 세포 소멸에 의한 것이다. 또한, 이것은 암세포의 선택적인 세포 소멸을 일으키는 신규의 경로이다.

도 1A는 본 연구에서 사용된 저해제의 목적 효소를 포함하는 FA 합성 경로의 일부의 개략도 이다. TOFA(5-(테트라데실옥시)-2-푸로산)은 아세틸 CoA 카복실라아제(ACC, E.C. 6.4.1.2)의 알로스테릭 저해제로서, 아세틸 CoA가 말로닐 CoA로 카복실화하는 것을 차단한다. 일단 조효소 A로 에스테르화되면, TOFA-CoA는 ACC의 생리학적인 최종 생성물의 저해제인 장쇄 아실 CoA와 유사한 메카니즘으로 알로스테릭하게 ACC를 저해한다(Halvorson, D. L. anc McCune, S. A. Inhibiton of fatty acid synthesis in isolated adipocytes by 5-(tetradecyloxy)-2-furoic acid., Lipids. 19 : 851-856, 1984). 세룰레닌(Funabashi, H., Kawaguchi, A., Tomoda, H., Omura, S., Okuda, S., and Iwasaki, S. Binding site of cerulenin in fatty acid synthetase., J. Biochem. 105 : 751-755, 1989) 및 C75(Pizer, etal., 1998) 양자는 FAS의 저해제로서, 말로닐 CoA와 아세틸 CoA가 지방산으로 축합되는 것을예방한다. 세룰레닌은 자멸 저해제로서, FAS와 공유 결합 부가 생성물(covalent adduct)을 형성하는 반면(Moche, M., Schneider, G., Edwards, P., Dehesh, K., and Lindqvist, Y. Structure of the complex between the antibiotic cerulenin and its target, beta-ketoacyl carrier protein synthase., J Biol Chem. 274 : 6031-6034, 1999), C75는 서행성(徐行性) 결합 저해제인 것 같다(Kuhajda FP, Pizer ES, Mani NS, Pinn ML, Han WF, Chrest FJ., and CA, T. Synthesis and anit-tumor activity of a novel inhibitor of fatty acid synthase., Proceeding of the American Association for Cancer Research. 40 : 121, 1999). 본 발명자들은 TOFA를 이용하여 세룰레닌 또는 C75에 의한 저해애 필적할 만한 인간의 유방암 세포주에서 FA 합성 저해를 달성하였다. 세룰레닌 또는 C75에 의한 저해와 비교될 수 있다. 그러나, 놀랍게도 TOFA는 본질적으로 인간의 유방암 세포에 대하여 비독성이었다. 이들 데이터는 지방산 고갈이 혈청이 보충된 배양물내의 암세포에 대한 세포 독성의 주요 원인이 아니라는 것을 나타낸다. FAS 저해의 또 하나의 효과로서, FAS 저해로부터 특이적으로 발생하는 고농도의 기질인 말로닐 CoA의 생성은 세룰레닌과 C75의 세포 독성을 매개하는 것으로 보인다.

아세틸 CoA 카복실라아제(ACC, E.C. 6.4.1.2)의 효소적 산물인 말로닐 CoA는 세포 대사에서 중요한 조절 분자이다. 말로닐 CoA는 지방산 합성 중에서 기질로서의 역할 외에도, 미토콘드리아의 외막에서 카르니틴 팔미노일트랜스페라아제-1(CPT-1)과의 상호작용을 통하여 지방산의 β-산화를 조절한다. CPT-1은 팔미토일 CoA와 같은 장쇄 아실 CoA 유도체의 미토콘드리아 외막 통과를 조절함으로써 미토콘드리아에서 지방산의 β-산화를 조절한다. 생리학적으로, 세포질의 말로닐 CoA 농도는 지방산 합성 도중에 더 높다. 말로닐 CoA의 더 높은 안정된 상태의 농도는 장쇄 아실 CoA가 미토콘드리아로 진입하는 것을 차단하여 내인적으로 합성된 지방산을 산화시키는 무익한 사이클을 예방한다.

조효소 A는 에너지 생산, 지질 생합성 및 에너지 조절에 관련된 세포 과정을 위한 주요 보조 인자이다. 예를 들면, 아세틸 CoA와 말로닐 CoA는 지방산과 콜레스테롤 합성을 위한 기질이다. 모든 지방산은 세포 구조로 혼입되거나 에너지를 위하여 미토콘드리아에서 산화되기 전에 CoA로 에스테르화되어야 한다. 숙시닐 CoA는 TCA 사이클의 중간 산물이다. 따라서, CoA의 적절한 공급의 유지는 세포 생존을 위하여 매우 중요하다.

각종 암세포는 지방산을 고농도로 합성한다. 예상된 바와 같이, 고농도의 지방산을 함유하는 세포는 말로닐 CoA의 농도가 정상 세포 농도의 적어도 6배인 높은 정상 상태의 농도를 갖는다(실시예 6 참고). 유리 CoA의 이용 가능한 공급을 감소하기 위하여, 종양 세포를 FAS의 저해제로 처리함으로써 종양 세포의 세포내 말로닐 CoA 농도는 초생리학적인 농도로 급격하게 그리고 선택적으로 증가될 수 있다. 이 계획은 지방산 합성에서 말로닐 CoA를 기질로 사용하는 것을 차단함과 동시에 ACC의 지방 아실 CoA 저해를 완화시켜 말로닐 CoA 합성을 자극함으로써 말로닐 CoA의 농도를 증가시킨다(도 1A). FAS는 암세포에서 선택적으로 발현되기 때문에, 말로닐 CoA의 상승은 종양 세포에 매우 한정된다. 이것은 FAS 저해제로 처리된 인간의 암 이종이식편에서 일어나는 것과 같이 암세포의 세포 소멸 및 정상 조직의 보호를 일으킨다(실시예 5 참고). 말로닐 CoA 농도가 급격하게 증가함으로써, 적절한 유리 CoA는 세포 사멸을 일으키는 것 이외의 다른 세포 과정에 이용될 수 없다.

유리 CoA 농도는 각종 방법과 목적 효소를 이용하여 조작될 수도 있다. 상기 예들은 유리 CoA의 감소가 말로닐 CoA의 이용 감소 및 이와 동시에 일어나는 말로닐 CoA의 생성 증가를 통한 말로닐 CoA 농도의 증가와 관련된다는 것을 나타낸다. [U-¹⁴C] 아세테이트로 대사 표지(metabolic labeling)를 이용한 흔적은 인간의 암세포에서 고농도의 지방산을 합성한다는 것을 증명한다(Kuhajda, F. P., Jenner, K., Wood, F. D., Hennigar, R. A., Jacobs, L. B., Dick, J. D., and Pasternack, G. R. Fatty acid synthesis: a potential selective target for antineoplastic therapy., Proceedings of National Academy of Science. 91: 6379-6383, 1994; Rashid, A., Pizer, E. S., Moga, M., Milgraum, L. Z., Zahurak, M., Pasternack, G. R., Kuhajda, F. P., and Hamilton, S. R. Elevated expression of fatty acid synthase and fatty acid synthetic activity in colorectal neoplasia., American Journal of Pathology. 150 : 201-208, 1997). 인간의 암세포 중에서 이러한 고농도의 지방산 합성은 말로닐 CoA의 선택적인 조작을 가능하게 하여 세포 소멸을 유발한다. 말로닐 CoA 농도의 급증은 세포 소멸을 통하여 암세포의 선택적인 파괴를 일으키고 정상 세포들에는 영향을 주지 않는다. 이러한 치료법은 말로닐 CoA 농도의 변화에 기초하는 암의 화학 요법을 위한 가능성 있는 신규의 목적 및 방법이다.

본 발명에 따른 유리 조효소 A 농도의 조작은 이를 요하는 유기체에 상기 조성물(또는 다수의 조성물들)을 투여함으로써 수행되는 것이 좋다. 유기체에 투여되는 조성물은 유리 CoA의 이용 가능한 공급을 감소시키는 생물학적 효과가 있는 약제를 포함할 수도 있다. CoA의 생합성을 방해하는 약제 또는 CoA 에스테르에 혼입되어 유리 CoA 풀(pool)을 감소시키는 약제는 단독으로 또는 본 발명의 다른 약제와 병행하여 사용될 수도 있다. 양호한 약제는 세포내 말로닐 CoA 농도를 증가시키는 데에 적어도 부분적으로 효과가 있다. 일반적으로, 유기체는 포유류, 예를 들어 마우스, 레트, 토끼, 기니 피그, 고양이, 개, 말, 소, 양, 염소, 돼지 또는 침팬치, 개코 원숭이 또는 바람직하게는 인간과 같은 영장류가 될 것이다. 일반적으로, 상기 유기체는 종양 (악성) 세포를 함유할 것이다. 본 발명의 방법은 악성 세포에 대하여 선택적으로 영향을 미치고 정상(비악성) 세포에는 덜 효과가 있다(효과가 없는 것이 더 좋다).

상기 유기체에게 투여되는 조성물 중에서 약제는 유기체의 악성 세포 중 적어도 일부분 중에서 세포내 말로닐 CoA 농도를 증가시키는 것이 좋다. 말로닐 CoA 농도는 적어도 2배 이상이 증가하는 것이 좋고, 적어도 5배 증가하는 것이 더 좋다. 상기 약제는 악성 세포 중에서 주변의 정상 세포 농도보다 더 고농도로 세포내 말로닐 CoA 농도를 증가시키게 된다. 적절한 약제는 임의의 각종 방법에 의하여 말로닐 CoA 농도를 증가시킬 수 있다(하기의 다른 메카니즘들 참고). 어떤 실시 상태에 있어서, 2종 또는 그 이상의 약제들이 투여되고, 이들 약제의 일부 또는 모두가 상이한 메카니즘에 의해 말로닐 CoA 농도에 영향을 미칠 수도 있다. 아래에 기재된 실시 상태에 의하여 작용하는 약제는 본 발명의 조성물 중에 사용될 수 있다. 하기활성에 대한 분석은 문헌에서 이용될 수 있고, 특정 약제가 이들 활성 중에 하나를 나타내는지 여부의 결정은 본 기술 분야의 숙련자에 의한다.

암 치료를 위하여 유리 CoA를 급감시키는 방법.

유리 CoA 농도의 급격한(즉, 갑작스러운 또는 급경사의) 감소는 세포 소멸을 통하여 암세포의 선택적인 파괴를 초래한다. 이 치료법은 유리 CoA 농도의 변화와 대등하게 암세포에서 선택적으로 일어나는 말로닐 CoA 농도의 변화에 기초한 암 화학 요법을 위한 가능성 있는 신규 목적 및 방법이다.

말로닐 CoA 생성을 증가시키기 위한 약제

아세틸 CoA 카복실라아제(ACC) 작용제: ACC 활성을 증가시키거나 ACC 저해를 감소시키거나 활성 ACC 효소의 양을 증가시키는 약제는 말로닐 CoA의 농도를 증가시키게 된다.

5' c-AMP 단백질 키나아제 작용제: 5' c-AMP 단백질 키나아제는 인산화에 의하여 ACC를 저해하여 말로닐 CoA의 급감을 초래한다. 이 키나아제의 저해제는 ACC의 저해를 감소시킴으로써 말로닐 CoA의 농도를 급증시키게 된다.

시트르산염 합성 효소 작용제: 미토콘드리아의 시트르산염 증가는 지방산 합성을 위한 기질을 제공할 것이고 또한 시트르산염은 말로닐 CoA 합성을 증가시키는 ACC의 "앞먹임(feed-forward)" 활성제로 작용한다.

아실 CoA 합성 효소 작용제: 아실 CoA 합성 효소의 저해는 세포의 지방 아실 CoA 농도를 감소시켜서 ACC의 저해를 감소시키게 된다. 이것은 ACC 활성 및 말로닐 CoA 농도를 증가시키게 된다.

말로닐 CoA 이용을 감소시키는 약제

말로닐 CoA 디카복실라아제(MCD) 작용제: 이 효소는 말로닐 CoA가 역으로 아세틸 CoA로 되는 ATP 의존 디카복실화를 촉매한다. MCD의 저해는 말로닐 CoA의 농도를 급증시킨다.

동시에 일어나는 말로닐 CoA의 이용 감소 및 생성 증가

지방산 합성 효소(FAS) 작용제: FAS의 저해는 말로닐 CoA가 지방산으로 혼입되는 것을 차단함으로써 말로닐 CoA의 이용 감소를 초래한다. 또한, FAS 저해는 ACC를 활성화하는 지방 아실 CoA 농도의 감소를 초래한다. 대표적인 FAS 저해제는 본 명세서에 참고로 포함시킨 미국 특허 제5,759,837호 및 제5,981,575호에 기재된 바와 같이 얻어질 수 있다.

말로닐 CoA 농도를 급격하게 증가시키기 위한 이들 방법은 암세포의 세포 소멸을 향상시키기 위하여 병행하여 또는 다른 약제와 병행하여 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물 중에 적어도 하나의 약제는 FAS를 저해하는 것 이외의 메카니즘에 의하여 말로닐 CoA의 농도를 증가시킨다.

CoA 합성 감소

판토테나이트 키나아제(PanK) 작용제: 이 효소는 조효소 A 합성의 첫 단계인 판토텐산의 ATP 의존 인산화 단계를 촉매하고, 이것의 활성 감소는 CoA의 총량을 감소시켜 결과적으로 이용 가능한 유리 CoA를 감소시킬 것이 예상될 수 있다.

포스포판토테노일시스테인 합성 효소 작용제: 이 효소는 조효소 A 합성의 두 번째 단계인 시스테인을 4-포스포판토텐산에 ATP 의존 첨가하여 4-포스포판토테노일-L-시스테인을 형성하는 단계를 촉매하고, 이것의 활성 감소는 CoA의 총량을 감소시켜 결과적으로 이용 가능한 유리 CoA를 감소시킬 것이 예상될 수 있다.

포스포판토테노일시스테인 디카복실라아제 작용제: 이 효소는 조효소 CoA 합성의 세 번째 단계인 4-포스포판토테노일-L-시스테인으로부터 시스테인의 알파 카복실기를 제거하여 4-포스포판테인을 형성하는 단계를 촉매하고, 이것의 활성 감소는 CoA의 총량을 감소시켜 결과적으로 이용 가능한 유리 CoA를 감소시킬 것이 예상될 수 있다.

포스포판토테인 아데닐릴트랜스페라아제(디포스포 CoA 피로포스포릴라아제라고도 함) 작용제: 이 효소는 조효소 A 합성의 네 번째 단계인 4-포스포판토테인에 아데닌을 첨가하여 ATP를 소비하고 디포스포 CoA 및 피로포스페이트를 생성하는 단계를 촉매한다. CoA 합성의 최종단계인 디포스포 CoA의 CoA로의 ATP 의존 인산화는 디포스포 CoA 키나아제에 의하여 수행되고, 이것은 아마도 포스포판토테인 아데닐릴트랜스페라아제 효소의 추가의 촉매 활성인 것 같다. PanK, 포스포판토테노일시스테인 합성 효소, 포스포판토테노일시스테인 디카복실라아제 또는 포스포판토테인 아데닐릴트랜스페라아제의 저해는 유리 CoA를 감소시키게 된다.

세포 CoA의 안정한 CoA 에스테르형으로의 제거

특정한 합성 약제는 세포에 의하여 섭취되고 다양한 세포 효소에 의하여 CoA와 함께 에스테르화되어 안정한 CoA 에스테르를 형성한다. 이들 약제의 직접적인 효과는 CoA를 안정한 CoA 에스테르에 혼합함으로써 유리 CoA를 감소시키는 것이다. 이들 CoA 에스테르는 세포내에서 그 밖의 생물학적인 활성을 가지거나 가지지 않을수 있다. 이들 합성 약제의 2가지 예에는 TOFA와 에토모시르가 있다. 종양 세포에 이들 약제를 충분히 많은 양으로 투여하는 경우 충분한 CoA를 안정한 CoA 에스테르의 형태로 제거시켜서 유리 CoA를 기능적으로 유효한 양까지 감소시키게 된다.

상기 성분의 투여

본 발명에 따른 치료제는 상기 약제 및 약학적 허용 담체를 함유하는 약학 조성물로 제제되는 것이 좋다. 상기 약학 조성물은 기타의 성분이 본 치료를 무효로 할 정도로 본 발명에 따르는 약제의 효율성을 감소시키지 않는 경우에 한하여 기타의 성분을 함유할 수 있다. 약학적 허용 담체는 잘 알려져 있으며, 본 기술 분야의 숙련자들은 특정한 투여 경로에 적합한 담체를 쉽게 선택할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985).

본 발명의 임의의 약제를 함유하는 약학 조성물은 약물의 선택에 의한 필요에 따라 비경구(피하, 근육내, 정맥내, 복강내, 흉막내, 소포내 또는 경막내), 국소, 경구, 직장 또는 비강 경로에 의하여 투여될 수 있다. 약학적 허용 담체 중의 활성 약제의 농도는, 그 농도가 투여 시점에 허용 가능한 독성 농도를 초과하지 않는 한 0.01 mM 내지 1 M의 범위를 가질 수 있다.

투여량 및 치료 기간은 약물의 치료 지침, 질병 종류, 환자의 연령, 환자의 체중 및 독성에 대한 내성을 비롯한 다양한 인자에 의존할 것이다. 일반적으로 투여량은 혈청 농도가 약 0.1 ㎍/ml 내지 약 100 ㎍/ml이 되도록 선택될 것이다. 초기 투여량 농도는 생체내 모델 및 임상 시험 중의 최대로 허용되는 농도 이하에서,본 명세서에 기재된 것과 같이 생체외 모델에서 유효한 것으로 나타나는 주변 농도를 달성하는 이들의 효능에 기초하여 선택될 것이다. 표준 임상 과정은 화학 요법이 개개의 환자에게 맞추어 조절되고 화학 요법제의 전신 농도가 규칙적으로 모니터되는 것이 좋다. 특정 환자를 위한 특정 약물의 투여량 및 치료 기간은 상기 인자들의 관점에서 표준 약리학적 접근을 사용하여 숙련된 임상의에 의하여 결정될 수 있다. 치료에 대한 반응은 본 발명에 따른 약제의 혈액 또는 체액 농도 중의 분석, 관련 조직에서 상기 약제의 활성이나 농도 측정 또는 환자의 질병 상태 조사에 의하여 모니터될 수 있다. 숙련된 임상의는 이들 측정에 의하여 나타난 치료에 대한 반응에 기초하여 투여량 및 치료 기간을 조절할 것이다.

발명의 개요

본 발명은 유리 세포 조효소 A(CoA)를 급감시킴으로써 암세포의 성장을 저해하거나 암세포를 사멸시키는 방법을 기재하고 있다. 본 발명은 CoA의 이용 증가 및/또는 합성 감소에 의하여 암세포 중의 CoA를 선택적으로 감소시키는 몇 가지 방법을 포함한다.

이 치료법은 다양한 인간의 암에 대한 신규의 화학 요법제에 이르게 할 것이다. 또한, 이것은 기타의 암 약물류에 의하여 공유되지 않는 세포 소멸에 이르게 하는 신규의 경로에 관한 것이므로, 이러한 치료법은 일반적으로 이용되는 기타의 암 치료제의 약효를 증가시킬 수도 있다.

한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명은 유기체의 암세포 중에서 세포내 유리 조효소 A의 급감을 일으키는 조성물을 유기체에게 투여하는 것을 특징으로 하는, 유기체의 종양 세포의 성장을 저해하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 조성물의 투여시, 유기체의 세포 중의 세포내 말로닐 CoA는 투여 후 3 시간 이내에 급증하는 것이 좋다. 세포내 말로닐 CoA는 세포의 성장 저해 전에 증가할 것이 예상되며, 세포내 말로닐 CoA의 증가는 말로닐 CoA의 소비 감소와 관련되는 것이 좋다. 세포내 말로닐 CoA의 증가는 말로닐 CoA의 소비율 증가 전에 일어나는 것이 좋다. 하나의 실시 상태에 있어서, 세포내 말로닐 CoA의 증가는 말로닐 CoA 디카복실라아제(MCD)의 세포내 활성 감소 또는 지방산 합성 효소의 세포내 활성 감소와 관련되고, 상기 조성물은 MCD의 저해제를 포함할 수도 있다. 또 하나의 실시 상태에 있어서, 세포내 말로닐 CoA의 증가는 말로닐 CoA의 합성 증가와 관련된다.

또 하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명은 유기체의 암세포 중에서 유리 조효소 A의 급감을 일으키는 조성물을 유기체에 투여하는 것을 특징으로 하는, 유기체의 종양 세포의 성장을 저해하는 방법을 제공하며, 세포내 말로닐 CoA의 증가는 아세틸 CoA 카복실라아제(ACC)의 세포내 활성 증가와 관련되어 있다. 또한, 상기 조성물은 ACC의 활성제, 시트르산염 합성 효소의 활성제, 5'-AMP-활성화된 단백질 키나아제(AMPK)의 저해제 및/또는 아실 CoA 합성 효소의 저해제를 포함할 수 있다. 양호한 실시 상태에 있어서, 제2의 화학 요법제가 유기체에 투여될 수도 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 조성물을 투여하기 전의 세포내 말로닐 CoA 농도는 상기 비악성(非惡性) 세포 중의 정상적인 말로닐 CoA 농도의 적어도 2배 이상이 되는 것이 좋다. 일반적으로, 처리 전 농도에 비하여 말로닐 CoA의 세포내 농도는 증가하고 아세틸 CoA 및 유리 CoA의 세포내 농도는 감소한다. 유기체의 일부 세포에서 지방산 합성률은 조성물을 투여하기 전인 정상의 적어도 2배 이상이고, 상기 조성물의 투여는 상기 세포에 대하여 세포 독성이 있다. 세포내 유리 조효소 A 농도의 감소는 조효소 A가 감소된 세포의 세포 소멸과 관련되는 것으로 예상될 수 있다.

본 발명 방법의 양호한 실시 상태에 있어서, 상기 조성물은 판토테네이트 키나아제 저해제, 포스포판토테노일시스테인 합성 효소 저해제, 포스포판토테노일 시스테인 디카복실라아제 저해제 및/또는 포스포판토테인 아데닐릴트랜스페라아제 저해제를 포함한다. 또 하나의 양호한 실시 상태에 있어서, 상기 조성물은 CoA로 에스테르화될 수 있는 기질을 포함한다. 일반적으로, 본 발명에 따라 처리되는 유기체는 지방산 합성 속도를 증가시켰던 종양 세포를 포함하고, 상기 종양 세포의 세포 수는 상기 조성물의 투여 후에 감소한다.

또 하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명은 목적 조성물을 목적 세포에 투여하는 단계 및 투여 후 상기 세포에서 유리 조효소 A 및/또는 유도된 조효소 A의 세포내 농도를 모니터하는 단계를 포함하고, 상기 세포내 유리 조효소 A의 급감은 선택적인 세포 독성을 나타내는 것인, 종양 세포에 대하여 선택적으로 세포 독성이 있는 조성물을 검출하는 스크리닝법을 제공한다.

이 외의 또 다른 실시 상태에 있어서, 본 발명은 말로닐 CoA의 생성을 제한하기에 충분한 ACC 저해제의 존재 및 부재하에 목적 세포에 목적 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 세포 독성의 차이는 유리 조효소 A 및/또는 유도된 조효소 A의 세포내 농도의 효과로부터 유발된 세포 독성 활성을 나타내는 것인, 종양 세포에 대하여 선택적으로 세포 독성이 있는 조성물을 분류하는 스크리닝법을 제공한다.

본 발명의 보다 완전한 이해를 용이하게 위하여, 많은 실시예를 아래에 제시하였다. 그러나, 본 발명의 범위는 이들 실시예에 기재된 특정 실시 상태에 한정되지 않으며, 이들은 단지 예시의 목적을 위하여 제시된 것이다.

실시예 1. 생체외 시험에서 세포 중의 FAS 저해

TOFA, 세룰레닌 및 C75는 모두 인간의 유방암 세포에서 지방산 합성을 저해하였다. 인간의 유방암 세포주, SKBR3 및 MCF7은 10 %의 소 태아 혈청을 가지는 RPMI에 유지되었다. 세포는 미코플라즈마 오염(Gen-probe)에 대하여 주기적으로 스크리닝되었다. 모든 저해제는 DMSO 중의 5 mg/ml 원액으로 첨가되었다. 지방산 합성 활성 측정을 위하여, 24개의 웰 플레이트에 5 ×10⁴세포수/웰은 약물에 대하여노출된 후 [U-¹⁴C] 아세테이트로 펄스 표지(pulse labeling)되고, 지질은 전술한 바와 같이 추출하여 정량하였다(Pizer,et al., 1988). MCF7 세포의 경우에, 경로 활성은 저해제에 노출 2 시간 후에 측정되었다. SKBR3 세포는 매우 고함량의 FAS 때문에 FAS 저해제에 대하여 더 늦은 반응을 나타내었고, 따라서 경로 활성은 저해제에 대한 노출 6 시간 후에 측정되었다.

유방암 세포주, SKBR3 및 MCF7이 FA 합성 저해제에 대하여 노출된 후 2 시간 동안 표지되는 표준 펄스 표지 실험에서, TOFA, C75 및 세룰레닌은 모두 유사한 정도로 지질로의 [U¹⁴C-아세테이트] 혼입을 저해하였다(도 1B 및 도 D). 다수의 대비 실험에서(제시되지 않음), TOFA는 1 내지 5 ㎍/ml의 투여량 범위에서 모든 시험된 세포주 중의 FA 합성을 최대로 저해하였고, 세룰레닌 및 C75는 10 ㎍/ml의 범위에서 FA 합성을 최대로 저해하였다.

실시예 2. 세포 성장에서 동일한 저해제의 효과

TOFA, 세룰레닌 및 C75는 모두 인간의 유방암 세포에서 지방산 합성을 저해하였으나, 상이한 세포 독성을 나타내었다. 세포와 저해제는 실시예 1에 기재된 바와 같다. 클론원성 분석을 위하여, 4 ×10⁵개 세포를 6 시간 동안 전술한 농도로 첨가하는 저해제와 함께 25 cm²의 플라스크에서 플레이트하였다. 처리 세포와 대조구의 동일한 수를 60 mm 접시에 플레이트하였다. 클론을 염색하고 7일 내지 10일 후에 계수하였다.

모든 저해제가 FA 합성을 유사한 정도로 감소시킨다고 할지라도, 클론원성 분석에 의해 측정된 바에 따르면, TOFA는 ACC 저해를 위한 투여량 범위에서 암세포 성장에 비독성이거나 자극적인 반면, 세룰레닌 및 C75는 FAS 저해를 위한 투여량 범위에서 상당한 세포 독성이 있다(도 1C 및 도 E). ACC 저해와 FAS 저해의 세포 독성 효과간의 상당한 차이는 지방산 생성의 급감 자체가 FAS 저해 후의 세포 손상의 주요 원인이 아니라는 것을 나타낸다.

실시예 3. 말로닐 CoA의 측정

이들 두 효소의 저해에 대하여 예상되는 결과에서 가장 명백한 차이는, 말로닐 CoA 농도는 ACC 저해 후에는 감소되어야 하고 FAS 저해 후에는 증가되어야 한다는 것이다. 진핵생물에서는 이전에 연구된 바 없지만, 이 콜리(E. coli)에서의 최근 데이터는 세룰레닌에 대한 노출에 의한 말로닐 CoA 농도의 상승을 나타내고 있다(Chohnan,et al., 1997, "Changes in the size and composition of intracellular pools of non-esterified coenzyme A and coenzyme A thioesters in aerobic and facultatively anaerobi bacteria",Applied and Environmental Microbiology, 63 :555-560). 말로닐 CoA 농도는 실시예 2에 기재된 조건 하에서 FAS가 저해되는 세포 및 TOFA에 의하여 저해되는 세포에서 측정되었다.

말로닐 CoA 농도는 코키 등의 문헌["Analysis of acyl-coenzyme A esters in biological samples",Methods in Enzymology, 166 :55-70]의 HPLC 방법을 이용하여 MCF-7 중에서 측정되었다. 간단히 말하면, 24개 웰 플레이트내의 2.5 ×10⁵세포수/웰을 다양한 약물 치료 후에 4 ℃에서 10% TCA 1.2 ml에 제공하였다. 이 펠렛의 중량을 기록하고 상청액을 에테르 1.2 ml로 6회 세척한 후 25 ℃에서 진공 원심분리기를 사용하여 건조상태가 되도록 하였다. 조효소 A 에스테르를 분리하여 조효소 A에 대한 최대 흡광도로서 254 nm을 모니터하는 밀레니엄³²소프트웨어를 운영하는 워터스 HPLC 시스템을 가지는 5 μ수펠코(Supelco) C18 컬럼상에서 역상 HPLC를 이용하여 정량하였다. 다음의 농도 구배 및 완충액, 즉 완충액 A: 0.1 M 인산칼륨, pH 5.0, 완충액 B: 0.1 M 인산칼륨, pH 5.0 (40 % 아세토니트릴 함유)를 사용하였다. 92 % A, 8 % B를 사용하여 20분간 0.4 ml/분으로 등용매를 전개시킨 후, 1분 동안 흐름을 0.8 ml/분으로 증가시켰는데, 이 때 10 % B까지의 선형 구배는 24분까지 전개되었고 50분까지 10 % B로 유지되었는데 이 때 선형 구배는 55분에 100 % B까지 진행되었으며 60분에 완료되었다. 다음의 조효소 A 에스테르(Sigma)가 표준 물질로 전개되었다: 말로닐 CoA, 아세틸 CoA, 글루타티온 CoA, 숙시닐 CoA, HMG-CoA 및 유리 CoA. 시료 및 표준은 완충액 A의 50㎕에 용해되었다. 조효소 A 에스테르는 다음과 같이 순차적으로 용출되었다: 말로닐 CoA, 글루타치온 CoA, 유리 CoA, 숙시닐 CoA, HMG-CoA 및 아세틸 CoA. 조효소 A 에스테르의 정량은 밀레니엄³²소프트웨어에 의하여 수행되었다.

약물 처리 세포로부터 나온 산성 가용성 추출물의 역상 HPLC에 의하여 MCF-7 세포 중의 조효소 A 유도체의 직접적인 측정 결과, TOFA는 말로닐 CoA 농도를 감소시키는 반면 세룰레닌 및 C75는 모두 말로닐 CoA 농도를 신속하게 증가시켰다는 것이 확인되었다. 도 2A는 세포 대사에 중요한 조효소 A 유도체의 분리 및 동정을 나타내는 대표적인 크로마토그래프이다. 말로닐 CoA는 이들 중에 제일 먼저 용출되며, 19~22분의 컬럼 체류 시간(retention time)을 가진다. 도 2B의 크로마토그래프의 오버레이(overlay)는 세룰레닌 처리구는 대조구에 비하여 말로닐 CoA의 현저한 증가를 일으키는 반면, TOFA는 상당한 감소를 일으킨다는 것을 나타낸다. 말로닐 CoA의 화학적 동일성은 시료를 표준 물질로 스파이킹(spiking)함으로써 독립적으로 확인되었다(제시되지 않음).

말로닐 CoA 농도는 FAS 저해와 함께 현저하게 증가하였고 TOFA에 의하여 감소하였다. 도 2C의 다수의 실험을 분석한 결과, 세룰레닌 또는 C75에 대한 1 시간 노출 후에 말로닐 CoA 농도는 대조구에 비하여 각각 930% 및 371%까지 증가한 반면, TOFA 처리구(20μg/ml)는 말로닐 CoA 농도의 60% 감소를 일으켰다는 것이 나타났다. 말로닐 CoA 농도의 최대 감소를 위하여 필요한 TOFA의 농도는 도 1B 및 도 D의 경로 저해를 위한 투여량보다 4배 더 높았다. 그러나, CoA 유도체의 추출을 위한 최적 배양물은 종래의 기타 생화학적 분석 및 생존능 분석에서 사용된 배양물 보다 세포 밀도가 5배 더 높았다.

FAS 저해 후의 말로닐 CoA의 현저한 증가는 ACC의 장쇄 지방 아실 CoA 저해를 완화시키는데 부분적으로 기여하여 ACC 활성의 증가를 초래할 수 있다(도 1A). 더구나, 세룰레닌에 의하여 유도된 말로닐 CoA 농도의 증가는 처리 후 30분 이내에 일어났고(대조구에 비하여 930+/-15% 증가, 제시되지 않음), 이는 FA 합성 저해의 시간 프레임 내이고 DNA 합성 저해의 개시 또는 초기 세포 소멸보다 훨씬이전이다(Pizer,et al., 1998). 따라서, 고농도의 말로닐 CoA는 FAS 저해제의 특징적인 효과이고 세포 소멸을 비롯한 다른 세포 반응을 일시적으로 선행하였다.

고농도의 말로닐 CoA를 유발하는 세룰레닌 또는 C75의 농도는 클론원성 분석 및 메로시아닌 450 염색을 이용하는 세포 소멸에 대한 유세포 분석에 의하여 측정된 바와 같이 인간의 유방암 세포에 대하여 세포 독성이 있다(Pizer,et al., 1998). FAS 저해는 장쇄 아실 CoA의 ACC 활성에 대한 저해 효과를 완화시키므로써 말로닐 CoA의 합성을 자극하는 동시에 FAS 저해를 통하여 말로닐 CoA의 소비를 저해함으로써 고농도의 말로닐 CoA를 초래한다(도 2).

실시예 4. FAS 저해의 TOFA 구제

FAS 저해의 TOFA 구제는 고농도의 말로닐 CoA가 암세포에 대한 세포 독성을 초래한다는 것을 나타낸다. FAS 저해로부터 기인된 말로닐 CoA 농도의 증가가 세포 독성을 초래하였다면, 그 이후에 TOFA로 말로닐 CoA의 축적을 감소시키므로서 세포를 FAS 저해로부터 구제하는 것이 가능해야만 한다. SKBR3에 대한 TOFA 및 세룰레닌의 병행 투여(도 3A)는 실시예 2에서 기재된 바와 같이 수행된 클론원성 분석에서 세룰레닌 단독의 세포 독성 효과를 차단하였다. MCF7 세포(도 3C)에서, TOFA는 유사한 실험 조건하에서 세룰레닌 및 C75 양자의 구제를 나타내었다.

SKBR3 세포(도 3B) 및 MCF7(도 3D)의 대표적인 유세포 분석은 이들 발견을 실증하였으며, 이는 TOFA가 세룰레닌에 의하여 유발되는 세포 소멸로부터 세포를 구제하였기 때문이다. 세포 소멸은 아르곤과 크립톤 레이져가 장착된 FACStar^Plus유세포 분석기(Becton Dickinson)를 사용하는 다변수 유세포 분석기에 의하여 측정되었다. 세포 소멸 초기에 발생하는 변화된 원형질 막 인지질 팩킹(packing)을 검출하고 배양물로부터 세포로 직접 첨가되는 메로시아닌 540 염색(Sigma)를 이용하여 세포 소멸을 정량하였다(Pizer,et al., 1998; Mower,et al., 1994, "Decreased membrane pospholipid packing and decreased cell size precede DNA cleavage in mature mouse B cell apoptosis,J. Immunol., 152 :4832-4842). 어떤 실험에서, 세포 소멸의 크로마틴 구조 변화는 LDS-751로 염색이 감소될 때 동시에 측정되었다(Exciton)(Frey,et al., 1995, "Nucleic acid dyes for detection of apoptosis in live cells",Cytometry, 21 :265-274). 메로시아닌 540[10μg/ml]은 물중의 1g/ml 원액으로 첨가되었다. 세포는 DMSO 중의 1mM 원액으로부터 최종 농도 100nm에서 LDS-751로 염색되었다. 메로시아닌 540 양성 세포는 메로시아닌 540 음성 세포에 대하여 0.5 내지 2 로그, 575+/-20nm에서 수집되고 적색 형광의 증가에 의하여 표시되었다. 유사하게, LDS-751 딤(dim) 세포는 정상 세포에 대하여 0.5 내지 1.5 로그의 형광에서 감소를 나타내었고, DF20 밴드 통과 필터로 660nm에서 수집되었다. 데이터를 수집하여 셀퀘스트(CellQuest) 소프트웨어(Becton Dickinson)을 사용하여 분석하였다.

이들 실험에서, 모든 LDS-751 딤 세포는 메로시아닌 540 브라이트이었으나 다수의 메로시아닌 540 브라이트 세포는 LDS-751 딤으로 검출되지 않았다. 메로시아닌 540 브라이트 세포는 세포 소멸성으로 분류되었다. 또한, 이들 실험은 세룰레닌(>85%의 세포 소멸; 클론원성에서 70% 감소) 및 TOFA(세포 소멸에서 <5% 증가;클론원성에서 감소 없음) 사이의 상이한 세포 독성을 확인하였다. 이들 연구 모두는 고농도의 말로닐 CoA가 암세포 중에서 FAS 저해제의 세포 독성 효과의 역할을 함을 나타낸다.

실시예 5. 생체 내의 종양 세포 중에서 FAS 저해제의 효과

생체외에서 나타난 FAS 저해의 효과가 전신의 활성을 필요로 하는 생체 내 환경에도 적용되는지 여부를 측정하기 위하여, C75를 무흉선 누드 마우스의 피하의 MCF-7 이종이식편에 대하여 시험하여 FA의 합성 및 확립된 고형 종양의 성장에 대한 효과를 정량하였다. 이전의 연구는 인간의 암 이종이식편에 대한 세룰레닌의 국소적인 효능을 나타내었으나(Pizer,et al., 1996, "Inhibition of fatty acid synthesis delays disease progression in a zenograft model of ovarian cancer", Cancer Res., 56 :1189-1193), 세룰레닌이 전신에서 작용하지 못하는 데에 한계가 있었다. 생체 내에서 세룰레닌 및 C75에 대한 유방암 세포의 유사한 반응은 이식된 유방암 세포에 대하여 생체 내에서 효율적일 수 있다.

nu/nu 암컷 마우스(Harlan)에서 인간의 유방암 세포주인 MCF-7의 피하 측면 이종이식편이 생체 내에서의 C75의 항암 효과를 연구하기 위하여 사용되었다. 모든 동물 실험은 동물 보호 기관의 지침을 따랐다. 모든 마우스는 종양 접종 7일 전에 전측부(anterior flank)에 90일용 서방성 피하 에스트로겐 환약(Innovative Research)를 받았다. 10⁷MCF-7세포는 10% FBS와 인슐린 10μg/ml로 보충된 DMEM의 배양물로부터 이식되었다.

접종 약 10일 후에 측정 가능한 종양이 발달하였을 때 처리를 시작하였다. 11마리의 마우스(각각 5마리와 6마리가 2개의 분리된 시험으로 나누어짐)는 0.1ml RPMI 중의 C75 투여량 30mg/kg으로 매주 복강내 처리되었다. 투여량은 BALB/c 마우스에서 40mg/kg의 단일 투여량 LD₁₀측정에 기초하였고, 30mg/kg이 이계 교배된 누드 마우스에서 잘 허용되었다. 11마리의 대조구 마우스(처리구와 같은 방식으로 나누어짐)는 RPMI만을 받았다. 종양 부피는 캘리퍼(caliper)를 가지고 삼차원으로 측정되었다. 대조구가 대리 종말점(surrogate endpoint)에 도달했을 때에 실험을 종료하였다.

처리된 종양과 대조구 종양에서 지방산 합성 활성을 측정하기 위한 대비 실험에서, MCF-7가 이식된 마우스 군은 C75 또는 비히클이 상기의 투여량으로 처리되었고, 3 시간 후에 치사시켰다. 종양 및 간 조직을 생체외에서 [U^14-C]로 표지하고, 지질을 추출한 후 기재된 바와 같이 계수하였다(Rashid,et al., 1997).

처리된 종양과 대조구 종양을 조직학적으로 관찰하는 추가의 대비 실험에서, 6마리의 C75 처리된 마우스와 6마리의 비히클 대조구 마우스를 처리 6 시간 후에 치사시켰다. 종양 조직과 정상 조직을 중성-완충 포르말린에 고정시키고, 통상의 조직학을 위하여 처리한 후 FAS에 대한 면역화학분석이 수행되었다. FAS에 대한 면역화학분석은 LSAB2 검출 키트를 사용하는 다코 이뮤노스테이너(Dako Immunostainer)의 1:2000에서 마우스의 모노클로날 항FAS 항체(Alo,et al., 1996)을 사용하여 MCF-7 이종이식편에서 수행되었다.

이식된 마우스의 조직에서 지방산 합성 경로 활성은 생체외에서 [U¹⁴C]-아세테이트로 펄스 표지하므로써 측정되었다. 종양 이종이식편은 간보다 FA 합성 활성이 10배 더 높으며, 양호한 조직과 악성 조직 사이의 경로 활성의 차이가 강조된다(도 4A). MCF-7 이종이식편에서 FAS 발현은 고농도의 FA 합성 활성과 유사하였다(도 4B). C75 30mg/kg의 복강내 주입은 3 시간 이내에 생체외에서 표지된 간에서 76%까지, MCF-7 이종이식편에서 70%까지 지방산 합성을 감소시켰다(도 4A). FA 합성에서의 이들 변화는 이종이식편에서 세포 독성의 조직학적 증거보다 먼저 일어났고, 처리 6 시간 후에 명백해졌다(도 4C 및 4D). C75가 처리된 이종이식편은 종양 조직 전반에 많은 세포 소멸체를 나타내었고, 비히클이 처리된 종양에서는 세포 소멸체가 나타나지 않았다. C75 처리 후 간 및 다른 숙주 조직의 조직학적 분석은 어떤 단기간 또는 장기간 독성의 증거를 나타내지 않았다(제시하지 않음).

이종이식편의 C75 처리는 세포 독성 및 정상 조직에 대한 손상 없이 종양의 성장 감소를 초래한다. C75 30mg/kg의 투여 6 시간 후 종양 조직학은 대조구 종양과 비교되는 상당한 세포 독성을 나타낸다(또 4C 및 도 4D, 견본을 첨부함). 간 및 다른 기관의 관찰은 어떠한 조직 손상의 흔적도 없는 반면 C75가 처리된 이종이식편에서의 세포 소멸체의 흔적을 주목해야 한다(데이터는 제시되지 않음). 매주 C75의 복강내 처리는 비히클 대조구와 비교하여 확립된 피하의 MCF-7 종양의 성장을 지연시켜서 전신적인 항암 효과를 나타낸다(도 4E). 매주 처리후 32일째에, 비히클 대조구에 비하여 처리구에서 종양 성장에서 8배 이상의 차이점이 있었다. 세룰레닌과 유사하게, 일시적인 가역적 체중 손실이 주목할 만한 유일한 독성이다(Pizer,et al., 1996).

C75의 전신적인 약리학적 활성은 전신의 FAS 저해제 처리 결과의 첫 번째 분석을 제공하였다. 주변 지방산이 생리학적 농도인 환경에서 인간의 유방암 이종이식편에 대한 C75의 상당한 항암 효과는 혈청이 보충된 배지에서의 생체외 결과와 유사하고, 지방산 고갈과 독립적인 세포 독성 메카니즘과 일관적이었다.

실시예 6. 생체내에서 인간의 암세포는 말로닐 CoA의 높은 정상 상태를 갖는다.

실시예 5의 결과는 말로닐 CoA 축적이 정상 조직에서는 별로 중요한 문제가 아닐 수 있다는 것을 제안했으며, 이는 FA 합성 경로 활성은 간과 같은 지방 생성 기관에서 조차도 낮은 것이 정상적이기 때문이다. 더 흥미로운 것은 이들 실험에서 말로닐 CoA는 유방암 세포에서 검출된 주로 낮은 분자량의 CoA 접합체이었던 반면, 다른 연구는 주로 배양된 간세포의 숙시닐 CoA 및 아세틸 CoA를 보고하고 있다(Corkey, 1988). 종양 조직에서 고농도의 말로닐 CoA는 간에 비해 종양 세포에서 고농도의 지방산을 합성한다는 것을 반영한다(Rashid,et al., 1997).

실시예 5의 MCF7 인간 유방암 이종이식편 모델을 사용하여 말로닐 CoA 농도를 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 동일한 동물의 종양 이종이식편과 간에서 측정하였다. 하기 도 3은 간과 비교되는 종양 조직에서 간과 비교되는 고농도의 말로닐 CoA를 나타낸다. 그 밖에, 다른 CoA 유도체의 분포는 현저하게 변화되었다. 예를 들면, 간은 이종이식편과 비교하여 약 10배 적은 말로닐 CoA를 갖는 반면, 10배 더 고농도의 아세틸 CoA와 더 고농도의 다른 CoA 유도체, 특히 숙시닐 CoA를 갖는다. 암세포와 간세포 사이에서 CoA 유도체 농도의 차이는 에너지 대사에서의 더 큰 차이점을 나타낼 수도 있다.

다른 관점, 이점 및 변형은 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자들에게 명백한 것일 지라도, 이해를 명확히 하기 위하여 앞의 발명을 특정한 실시 상태와 관련하여 예증 및 예를 드는 방법에 의하여 상세하게 설명하였다. 앞의 설명 및 예는 예시하기 위한 것이나, 발명의 범위를 제한하지 않는다. 의학, 면역학, 하이브리도마 기술, 약리학 및/또는 관계분야에서 숙련된 사람에게 명백한 본 발명을 수행하기 위한 상기 실시 상태의 변형은 본 발명의 범위 내에 속하며, 본 발명의 범위는 첨부되는 청구항에 의해서만 제한된다.

본 명세서에 언급한 모든 간행물 및 특허 출원은 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자의 수준을 가리킨다. 모든 간행물 및 특허 출원은 참고에 포함된다고 특별히 그리고 개인적으로 지시된 개개의 간행물 또는 특허 출원과 동일한 정도로 본 명세서에 참고로 포함된다.

Claims (21)

1. 유기체의 암세포 중의 세포내 유리 조효소 A의 급감을 일으키는 조성물을 유기체에게 투여하는 것을 특징으로 하는, 유기체의 종양 세포의 성장을 저해하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 유기체의 세포 중의 세포내 말로닐 CoA는 급증하는 것인 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 유기체의 세포 중의 세포내 말로닐 CoA는 상기 투여 후 3 시간 이내에 증가하는 것인 방법.
4. 제1항에 있어서, 세포내 말로닐 CoA는 세포의 성장 저해 전에 증가하는 것인 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 세포내 말로닐 CoA의 증가는 말로닐 CoA의 소비 감소와 관련되는 것인 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 세포내 말로닐 CoA의 증가는 말로닐 CoA 소비율의 증가 전에 일어나는 것인 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 세포내 말로닐 CoA의 증가는 말로닐 CoA 디카복실라아제(MCD)의 세포내 활성 감소 또는 지방산 합성 효소의 세포내 활성 감소와 관련되는 것인 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 MCD의 저해제를 포함하는 것인 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 세포내 말로닐 CoA의 증가는 말로닐 CoA의 합성 증가와 관련되는 것인 방법.
10. 제1항에 있어서, 상기 세포내 말로닐 CoA의 증가는 아세틸-CoA 카복실라아제(ACC)의 세포내 활성 증가와 관련되는 것인 방법.
11. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 ACC의 활성제, 시트르산염 합성 효소의 활성제, 5'-AMP-활성화된 단백질 키나아제(AMPK) 저해제 및/또는 아실 CoA 합성 효소의 저해제를 포함하는 것인 방법.
12. 제1항에 있어서, 제2의 화학 요법제가 상기 유기체에게 투여되는 것인 방법.
13. 제1항에 있어서, 상기 조성물 투여 전의 세포내 말로닐 CoA 농도가 비악성세포 중의 정상적인 말로닐 CoA 농도보다 2배 이상인 방법.
14. 제1항에 있어서, 처리 전 농도에 비하여 말로닐 CoA의 세포내 농도는 상승되고 아세틸 CoA 및 유리 CoA의 세포내 농도는 감소되는 것인 방법.
15. 제1항에 있어서, 상기 유기체의 일부 세포 중의 지방산 합성률이 상기 조성물 투여 전에 정상보다 2배 이상이고, 상기 조성물의 투여가 상기 세포에 대하여 세포 독성인 것인 방법.
16. 제1항에 있어서, 세포내 유리 조세포 A 농도의 감소는 조효소 A가 감소된 세포의 세포 소멸과 관련되는 것인 방법.
17. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 판토테네이트 키나아제의 저해제, 포스포판토테노일시스테인 합성 효소의 저해제, 포스포판토테노일시스테인 디카복실라아제의 저해제 및/또는 포스포판토테인 아데닐릴트랜스페라아제의 저해제를 포함하는 것인 방법.
18. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 CoA로 에스테르화될 수 있는 기질을 포함하는 것인 방법.
19. 제1항에 있어서, 상기 유기체는 지방산 합성률이 증가된 종양 세포를 포함하고 상기 종양 세포의 세포 수가 상기 조성물의 투여 후에 감소되는 것인 방법.
20. 목적 세포에 목적 조성물을 투여하는 단계 및 이 투여 후에 세포 중의 유리 및/또는 유도된 조효소 A의 세포내 농도를 모니터하는 단계를 포함하고, 상기 세포내 유리 조효소 A의 급감은 선택적인 세포 독성을 나타내는 것인, 종양 세포에 대하여 선택적으로 세포 독성이 있는 조성물의 검출을 위한 스크리닝법.
21. 말로닐 CoA의 생성을 제한하는 충분한 ACC 저해제의 존재하 및 부재하에 목적 세포에 목적 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 세포 독성의 차이는 유리 및/또는 유도된 조효소 A의 세포내 농도에 대한 효과로부터 유발된 세포 독성 활성을 나타내는 것인, 종양 세포에 대하여 선택적으로 세포 독성이 있는 조성물의 분류를 위한 스크리닝법.