CN101633650A

CN101633650A - 新化合物、包含该化合物的药物组合物及该化合物的应用方法

Info

Publication number: CN101633650A
Application number: CN200910126506A
Authority: CN
Inventors: F·P·库哈蒂亚; S·M·麦德豪驰; J·N·苏帕里; C·A·唐森德; J·M·麦克法顿
Original assignee: Johns Hopkins University; Fasgen LLC
Current assignee: Johns Hopkins University; Fasgen LLC
Priority date: 2002-07-01
Filing date: 2003-07-01
Publication date: 2010-01-27
Also published as: JP2005533107A; EA200500122A1; US20060241177A1; AU2003248810A1; ZA200500203B; CA2491183A1; BRPI0312413A2; CN1705478A; EP1534263A4; WO2004006835A2; AU2003248810B2; SG170620A1; EP1534263A2; IL166054A0; KR20050072670A; EA010484B1; CN100482219C; HK1086485A1; MXPA05000152A; WO2004006835A3

Abstract

本发明涉及新化合物、包含该化合物的药物组合物及该化合物的应用方法，该化合物的结构详细公开在说明书中。本发明的化合物具有重量减少、抗微生物、抗癌应用、脂肪酸合酶和神经多肽－Y的抑制作用和肉碱棕榈酰转移酶－1活性刺激作用。

Description

新化合物、包含该化合物的药物组合物及该化合物的应用方法

本申请是申请号为03818369.2、申请日为2003年7月1日、具有相同发明名称的中国专利申请的分案申请。

背景技术

脂肪酸合酶

脂肪酸在细胞生理中具有三个主要作用。首先，它们是生物膜的构建单元，第二，脂肪酸衍生物起激素和细胞内信使的作用。第三，这一点对本发明特别重要，脂肪酸是燃料分子，能以三酰甘油的形式贮存在脂肪组织中，三酰甘油也被称为中性脂肪。

有四种重要的酶参与脂肪酸的合成途径：脂肪酸合酶(FAS)、乙酰辅酶A羧酶(ACC)、苹果酸酶、柠檬酸裂合酶。主要的酶：FAS，催化前体丙二酰-辅酶A与乙酰-辅酶A的NADPH依赖性缩合，产生脂肪酸。NADPH是还原剂，通常在FAS反应循环中的两个点起主要电子供体的作用。其它三个酶(即就是ACC、苹果酸酶和柠檬酸裂合酶)产生必需的前体。其它酶，例如，生成NADPH的酶，也参与脂肪酸合成。

FAS具有酶学委员会(E.C.)编号No.2.3.1.85，也被称为脂肪酸合成酶，脂肪酸连接酶，其系统名称为乙酰-辅酶A：丙二酰辅酶AC-酰基转移酶(去羧基，氧酰基和烯酰基-还原和硫代酸酯水解)。7种不同的酶-或催化域-参与脂肪酸的FAS催化合成：乙酰转移酶、丙二酰转移酶、β-酮脂酰合成酶(缩合酶)、β-酮脂酰还原酶、β-羟酰基脱水酶、烯酰还原酶和硫酯合酶(Wakil，S.J.，Biochemistry，28：4523-4530，1989)。这七种酶一起构成FAS。

尽管在低等生物如细菌和在高等生物如分支杆菌、酵母菌和人中FAS催化的脂肪酸合成是类似的，但存在一些重要区别。在细菌中，七种酶促反应是通过七种没有结合的独立多肽进行的。这种被分类为II型FAS。相反，在分支杆菌、酵母菌和人中的酶反应是通过多功能的多肽完成的。例如，酵母菌具有由两种独立的多肽构成的复合体，然而在分支杆菌和人中，所有的七种反应都是通过单一多肽完成的。这些被分类为I型FAS。

FAS抑制剂

已经表明，多种化合物能抑制脂肪酸合酶(FAS)。FAS抑制剂可由化合物抑制纯化的FAS酶活性的能力而鉴定的。FAS的活性可根据测量放射性标记前体向脂肪酸中的加入(即，乙酰辅酶A或丙二酰辅酶A)或根据分光光度法测量NADPH的氧化来检测(Dils，et al.，MethodsEnzymol.，35：74-83)。

表1，如下所示，列出了几种FAS抑制剂。

在脂肪酸合成途径中的四种酶中，FAS是抑制的优选靶点，因为FAS只在脂肪酸合成途经内起作用，而其它的三种酶参与其它的细胞功能。因此，其它三种酶中的一种的抑制剂更可能影响正常细胞。由FAS执行的七种酶促步骤中，缩合酶(即，β-酮酰基合成酶)和烯酰还原酶催化的步骤已经成为减少或阻止脂肪酸合成的抑制剂的最普通的候选者。FAS复合体的缩合酶的结构和功能被充分表征。缩合酶的活性位点包括关键的半胱氨酸硫醇，其是抗血脂剂，如，例如抑制剂浅蓝菌素的靶点。

优选的缩合酶抑制剂包括大量的化学化合物，包括烷基化剂、氧化剂、和能进行二硫化物交换的试剂。酶的结合口袋优选长链E，E，二烯。

首要的是，含有侧链双烯和表现出与硫醇盐阴离子反应性基团的试剂可能是良好的缩合酶抑制剂。浅蓝菌素[(2S，3R)-2，3-环氧-4-氧代-7，10十二碳二烯酰基酰胺]是一个例子：

浅蓝菌素与脂肪酸合酶的缩合酶的活性位点中关键的半胱氨酸硫醇基共价结合，灭活这一关键酶促步骤(Funa bashi，et al.，J.Biochem.，105：751-755，1989)。尽管注意到浅蓝菌素具有其它的活性，但这些活性发生在可能不是人细胞相关模型的微生物中(如，真菌内的胆固醇合成的抑制，Omura(1976)，Bacteriol.Rev.，40：681-697；或病毒内RNA合成的减少，Perez，et al.(1991)，FEBS，280：129-133)，发生在基本上更高的药物浓度(在5mg/ml的病毒HIV蛋白酶的抑制，Moelling，et al.(1990)，FEBS，261：373-377)或可为内源性脂肪酸合成抑制的直接结果(B淋巴和巨噬细胞内抗原加工的抑制，Falo，et al.(1987)，J.Immunol.，139：3918-3923)。一些数据显示，浅蓝菌素不特异性抑制蛋白的肉豆蔻酰化(Simon，etal.，J.Biol.Chem.，267：3922-3931，1992)。

更多一些的FAS抑制剂被公开于美国专利申请No.08/096,908和它的1994年1月24日申请的CIP中，其中公开的内容被引入本文作为参考。所包括的是脂肪酸合酶、柠檬酸裂合酶、辅酶A羧化酶及苹果酸酶的抑制剂。

Tomoda及其同事(Tomoda et.al.，Biochim.Biophys.Act 921：595-5981987；Omura el.al.，J.Antibiotics 39：1211-12181986)描述了三氮菌素C(有时称WS-1228A)，一种天然存在的酰基-辅酶A合成酶抑制剂，其是Streptomycessp.，SK-189的产物。TriacsinC的化学结构是1-羟基-3-(E，E，E-2′，4′，7′-undecatrienylidine)三氮烯。8.7μM的三氮菌素C导致大鼠肝酰基辅酶A合成酶50％的抑制；相关化合物，三氮菌素A通过与长链脂肪酸竞争的机制抑制酰基辅酶A合成酶。酰基辅酶A合成酶的抑制对动物细胞是有毒的。Tomoda et al.(Tomoda el.al.，J.Biol.Chem.266：4214-4219，1991)教导1.0μM的三氮菌素C引起Raji细胞生长抑制，并显示出抑制Vero和Hela细胞的生长。Tomoda el.al.进一步教导酰基辅酶A合成酶是动物细胞中所必需的，以及酶的抑制具有致命效应。

美国专利No.5,981,575(被引入本文作为参考)显示了抑制脂肪酸合成、抑制肿瘤细胞生长和引起体重减少的一族化合物(γ-取代-α-亚甲基-β-羧基-γ-丁内酯)。在′575专利中公开的化合物用于治疗应用具有优于天然产物浅蓝菌素的几个优点：[1]它们不包含浅蓝菌素的高反应性环氧基，[2]它们在水性溶液中是稳定的和可溶解的，[3]它们可由两步合成反应生成，因此容易大量制备，和[4]它们易被氚化，达到生化和药理分析的高比活性。在′575专利中描述了为脂肪酸合成酶抑制剂的该族化合物的合成，以及它们作为处理表达FAS的肿瘤细胞的方法的应用，和它们作为减少体重的方法的应用。′575专利还公开了任一脂肪酸合酶抑制剂全身性减少脂肪细胞物质(脂肪细胞数量和大小)的应用，作为减少体重的方法。

小鼠和人中脂肪酸合成的主要部位是肝脏(参见Roncari，Can.J.Biochem.，52：221-230，1974；Triscari et al.，1985，Metabolism，34：580-7；Barakat et al.，1991，Metabolism，40：280-5)、泌乳期乳腺(参见Thompson，et al.，Pediatr.Res.，19：139-143，1985)和脂肪组织(Goldrick et al.，1974，Clin.Sci.Mol.Med.，46：469-79)。

脂肪酸合成抑制剂用作抗微生物剂

浅蓝菌素最初是作为可能的抗真菌剂抗生素从Cephalosporiumcaerulens培养液中分离的。结构上浅蓝菌素被表征为[(2S，3R)-环氧-4-氧代-7，10-反式，反式十二酸酰胺]。显示它的作用机制是通过不可逆结合，抑制脂肪酸生物合成需要的缩合酶：β-酮脂酰基-ACP合酶。浅蓝菌素被分类为抗真菌剂，主要抗念球菌属(Candida)和Saccharomyces sp。而且，尽管发现它对结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)没有活性，但是表明抗某些细菌、放线菌类、分枝杆菌的一些体外活性。没有评价脂肪酸合成抑制剂，特别是浅蓝菌素对原生动物如鼠弓形体(Toxoplasma gondii)或其它感染性真核病原体如卡氏肺囊虫(Pneumocystis carini)、兰伯贾第虫(Giardialamblia)、Plasmodium sp.、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)、隐孢子虫属(Cryptosporidium)、锥虫属(Typanosoma)、利氏曼虫属(Leishmania)和血吸虫属(Schistosoma)的活性。

对治疗特别敏感的感染性疾病引起被感染的动物外部可接近的表面损害的疾病。外部可接近的表面包括通过非侵入性方法(不切开或刺破皮肤)可到达的所有表面，包括皮肤表面自身，粘膜，如覆盖鼻腔、口腔、胃肠道或泌尿生殖器表面的那些，和肺部表面如肺泡囊。易感疾病包括：(1)皮肤真菌病或皮肤癣，特别是由小孢子菌属(Microsporum)，发癣菌属(Trichophyton)，表皮癣菌属(Epidermophyton)或粘膜皮肤念珠菌(Mucocutaneous candidiasis)引起的；(2)mucotic角膜炎，特别是由曲霉属(Aspergillus)，镰刀菌属(Fusarium)或念球菌属引起的；(3)阿米巴性角膜炎，特别是由棘阿米巴属(Acanthamoeba)引起的；(4)胃肠道疾病，特别是由兰伯贾第虫、内变形虫属(Entamoeba)、隐孢子虫属、Microsporidium或念珠菌属(在无免疫应答的动物内最普遍)引起的；(5)泌尿生殖器感染，特别是由白色念珠菌(candida albicans)或阴道毛滴虫引起的；和(6)肺病，特别是由结核分枝杆菌、曲霉属或卡氏肺囊虫引起的。对用脂肪酸合成抑制剂治疗敏感的生物包括结核分支杆菌，特别是多药耐受性菌株和原生动物如弓形体属(Toxoplasma)。

抑制脂肪酸合成的任意化合物可以用于抑制微生物细胞生长。然而，给予患者的化合物必须不对患者和靶微生物细胞同等毒。因此，选择仅仅或主要作用于靶微生物细胞的抑制剂是有益的。

依靠它们自身内源性合成的脂肪酸的真核微生物细胞表达I型FAS。这是通过以下两个事实显示的：FAS抑制剂是生长抑制的和外源性加入的脂肪酸可保护正常患者细胞而不保护这些微生物细胞免受FAS抑制剂作用。因此，阻止细胞脂肪酸合成的药剂可用于治疗感染。在真核生物中，脂肪酸是由利用底物乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A和NADPH的I型FAS合成的。因而，其它可将底物供入这种途径的酶也可能影响脂肪酸合成的速度，从而在依赖内源性合成的脂肪酸的微生物中是重要的。这些酶中任意一个的活性或表达的抑制，都将影响那些依靠内源性合成的脂肪酸的微生物细胞的生长。

不同生物中的I型FAS产物是不同的。例如，在真菌S.Cerevisiae中，产物主要是与辅酶A酯化的棕榈酸酯和硬脂酸酯(sterate)。在耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)中，产物是长度为16到24个碳的饱和脂肪酸辅酶A酯。这些脂类经常被进一步处理以满足细胞对多种脂类成分的需要。

在脂肪酸下游处理或利用中关键步骤的抑制可被期望抑制细胞功能，无论该细胞是依靠内源性脂肪酸还是应用从细胞外供给的脂肪酸，因此这些下游步骤的这类抑制剂对依靠内源性脂肪酸的微生物细胞可能不是充分选择性的。然而，已发现给予这种微生物细胞I型脂肪酸合成抑制剂，使它们对下游脂肪酸处理和/或应用的抑制剂的抑制作用更加敏感。因为这种协同作用，在脂肪酸合成抑制剂与一种或多种脂质生物合成和/或应用中下游步骤的抑制剂联合给药，将选择性地影响依靠内源性合成的脂肪酸的微生物细胞。优选的组包括FAS抑制剂和乙酰辅酶A羧化酶或FAS和MAS抑制剂。

当确定哺乳动物被表达I型FAS的生物的细胞感染时，或如果在来自患者的生物流体中发现了FAS时，可通过给予脂肪酸合成抑制剂来治疗该哺乳动物或患者(专利No.5,614,551)。

国际专利申请No.PCT/US01/05316中描述了抑制神经肽-Y降低食欲并刺激体重减少，其中公开的内容被引入本文作为参考。然而，该申请并没有描述或公开本申请中公开的任一化合物。

序列号为No.60/354,480的美国专利申请中描述了刺激肉碱棕榈酰转移酶-1(CPT-1)以刺激体重减少，其中公开的内容被引入本文作为参考。该申请也没有描述或公开本申请中公开的任一化合物。

美国专利No.5,759,837中描述了FAS抑制剂抑制癌细胞生长的应用，其中公开的内容被引入本文作为参考。该申请没有描述或公开在此公开的任一化合物。

发明概述

发现了新类型化合物，其具有多种治疗学上有价值的性质，如FAS-抑制、NPY-抑制、CPT-1刺激、引起体重减少的能力，以及抗癌和抗微生物特性。

本发明的还一个目的是通过给予一种包含药物稀释剂和式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII或IX化合物的药物组合物，提供一种引起动物和人中体重减少的方法，下面对它们作详细描述。

本发明的还一个目的是通过给予人或动物一种包含药物稀释剂和式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII或IX化合物的药物组合物，提供一种刺激CPT-1活性的方法。

本发明的还一个目的是通过给予一种包含药物稀释剂和式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII或IX化合物的药物组合物，提供一种抑制人或动物中神经肽Y合成的方法。

本发明的还一个目的是通过给予一种包含药物稀释剂和式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII或IX化合物的药物组合物，提供一种抑制人或动物中脂肪酸合酶活性的方法。

本发明的还一个目的是通过给予一种包含药物稀释剂和式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII或IX化合物的药物组合物，提供一种治疗人和动物中癌症的方法。

本发明进一步的目的是通过给予一种包含药物稀释剂和式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII或IX化合物的药物组合物，提供一种预防人和动物中癌细胞生长的方法。

本发明进一步的目的是通过给予一种包含药物稀释剂和式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII或IX化合物的药物组合物，提供一种抑制侵入性微生物细胞生长的方法。

附图简述

图1显示制备根据本发明的某些化合物的合成图。

图2显示制备根据本发明的某些化合物的合成图。

图3显示根据本发明的某些化合物抗肿瘤性质的体内测试结果。

图4显示根据本发明的不同化合物抗肿瘤性质的体内测试结果。

图5显示根据本发明的某些化合物体重减少的体内测试结果。

发明详述

本发明的化合物可以采用常规的方法制备。实施例中公开了许多化合物的合成。所述化合物可用于治疗肥胖、癌症或微生物引起(microbially-based)的感染。

本发明的一个实施方案是式I化合物：

其中R¹＝H、或C₁-C₂₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基、或烷芳基、＝CHR³、-C(O)OR³、-C(O)R³、-CH₂C(O)OR³、-CH₂C(O)NHR³，其中R³是H或C₁-C₁₀烷基、环烷基、或链烯基；

R²＝C₁-C₂₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基、或烷芳基；

X¹＝NHR⁴，其中R⁴是H、C₁-C₂₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基、或烷芳基，所述R⁴基团选择性地含有羰基、羧基、羧基酰胺基、醇基、或醚基，所述R⁴基团进一步选择性地含有一个或多个卤素原子。

在优选的实施方案中，R¹是C₁-C₁₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基、或烷芳基、或＝CH₂。在更优选的实施方案中，R¹是-CH₃或＝CH₂。

在另一优选的实施方案中，R⁴是-CH₂C(O)OR⁵或-CH₂C(O)NHR⁵，其中R⁵是C₁-C₁₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基、或烷芳基。

本发明的另一实施方案是式II化合物：

其中R⁶＝H、或C₁-C₂₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基、或烷芳基、-C(O)OR⁸、-C(O)R⁸、-CH₂C(O)OR⁸、-CH₂C(O)NHR⁸，其中R⁸是H或C₁-C₁₀烷基、环烷基或链烯基；

R⁷＝C₁-C₂₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基、或烷芳基；

X²＝NHR⁹，其中R⁹是H、C₁-C₂₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基，所述R⁹基团选择性地含有羰基、羧基、羧基酰胺基、醇基或醚基，所述R⁹基团进一步选择性地含有一个或多个卤素原子；

条件是：当R⁶是-CH₃，且R⁷是n-C₁₃H₂₇时，X²不是-NHC₂H₅。

在优选的实施方案中，R⁶是C₁-C₁₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基。在更优选的实施方案中，R⁶是-CH₃。

在另一优选的实施方案中，R⁹是-CH₂C(O)OR¹⁰或-CH₂C(O)NHR¹⁰，其中R¹⁰是C₁-C₁₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基。

本发明的另一实施方案是式III化合物：

其中

R¹¹＝H、或C₁-C₂₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基、或烷芳基、＝CHR¹³、-C(O)OR¹³、-C(O)R¹³、-CH₂C(O)OR¹³、-CH₂C(O)NHR¹³，其中R¹³是H或C₁-C₁₀烷基、环烷基或链烯基；

R¹²＝C₁-C₂₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基、或烷芳基；

X³＝OR¹⁴，其中R¹⁴是C₁-C₂₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基、或烷芳基，所述R¹⁴基团选择性地含有羰基、羧基、羧基酰胺基、醇基或醚基，所述R¹⁴基团进一步选择性地含有一个或多个卤素原子。

在优选的实施方案中，R¹¹是C₁-C₁₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基、或＝CH₂。在更优选的实施方案中，R¹¹是-CH₃或＝CH₂。

在另一优选的实施方案中，R¹⁴是-CH₂C(O)OR¹⁵或-CH₂C(O)NHR¹⁵，其中R¹⁵是C₁-C₁₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基。

本发明的另一实施方案是式IV化合物：

其中

R¹⁶＝H或C₁-C₂₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基、或烷芳基、-C(O)OR¹⁸、-C(O)R¹⁸、-CH₂C(O)OR¹⁸、-CH₂C(O)NHR¹⁸、其中R¹⁸是H或C₁-C₁₀烷基、环烷基、或链烯基；

R¹⁷＝C₁-C₂₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基；

X⁴＝OR¹⁹，其中R¹⁹是C₁-C₂₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基，所述R¹⁹基团选择性地含有羰基、羧基、羧基酰胺基、醇基或醚基，所述R¹⁹基团进一步选择性地含有一个或多个卤素原子；

条件是：当R¹⁶是-CH₃，且R¹⁹是-CH₃时，R¹⁷不是取代或未取代的苯基、-nC₃H₇、-nC₅H₁₁或-nC₁₃H₂₇，

并且，进一步的条件是：当R¹⁶是H且R¹⁹是-CH₃时，R¹⁷不是取代或未取代的苯基、或-CH₃，并且当R¹⁶是H且R¹⁹是-CH₂CH₃时，R¹⁷不是-iC₃H₇或取代或未取代的苯基。

在优选的实施方案中，R¹⁶是C₁-C₁₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基、或烷芳基。在更加优选的实施方案中，R¹⁶是-CH₃。

在另一优选的实施方案中，R¹⁹是-CH₂C(O)OR²⁰或-CH₂C(O)NHR²⁰，其中R²⁰是C₁-C₁₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基。

本发明的另一实施方案是式V化合物：

其中

R²¹＝C₂-C₂₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基、或烷芳基、＝CHR²³、-C(O)OR²³、-C(O)R²³、-CH₂C(O)OR²³、-CH₂C(O)NHR²³，其中R²³是H或C₁-C₁₀烷基、环烷基、或链烯基，但当R²¹是＝CHR²³时，R²³不是H；

R²²＝C₁-C₂₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基、或烷芳基；

条件是：当R²¹是-COOH时，R²²不是-CH₃、-nC₅H₁₁或C₁₃H₂₇，并且进一步的条件是：当R²¹是-CH₂COOH时，R²²不是-CH₃、-CH₂CH₃或-iC₅H₁₁，以及进一步的条件是：当R²¹是＝CHCH₃时，R²²不是n-C₅H₁₁。

在优选的实施方案中，R²¹是C₂-C₁₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基。

本发明的另一实施方案是式VI化合物：

其中：

R²⁴＝C₂-C₂₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基、或烷芳基、C(O)OR²⁶、-C(O)R²⁶、-CH₂C(O)OR²⁶、-CH₂C(O)NHR²⁶、，其中R²⁶是H或C₁-C₁₀烷基、环烷基、或链烯基；

R²⁵＝C₁-C₂₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基、或烷芳基；

条件是：当R²⁴是-COOH时，R²⁵不是-CH₃、-nC₅H₁₁、或C₁₃H₂₇，并且进一步地条件是：当R²⁴是-CH₂COOH时，R²⁵不是-CH₃、-CH₂CH₃、或-iC₅H₁₁。

在优选的实施方案中，R²⁴是C₂-C₁₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基。

本发明的另一实施方案是式VII化合物：

其中R²⁷＝C₃-C₄烷基、C₆-C₁₀烷基、C₁₂烷基、C₁₄烷基、C₁₆-C₂₀烷基。

本发明的另一实施方案是式VIII的化合物：

其中R²⁸是C₁-C₂₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基、或烷芳基，条件是：R²⁸不是-CH₃、-nC₃H₇、-nC₁₁H₂₃或-nC₁₃H₂₇。

本发明的另一实施方案是包括药学稀释剂和式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII或IX的化合物的药物组合物：

R²⁹＝H或C₁-C₂₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基、＝CHR³¹、-C(O)OR³¹、-C(O)R³¹、-CH₂C(O)OR³¹、-CH₂C(O)NHR³¹，其中R³¹是H或C₁-C₁₀烷基、环烷基、或链烯基；

R³⁰＝C₁-C₂₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基；

X⁵＝-OR³²或-NHR³²，其中R³²是H、C₁-C₂₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基、或烷芳基，所述R³²基团选择性地含有羰基、羧基、羧基酰胺基、醇基或醚基，所述R³²基团进一步选择性地含有一个或多个卤素原子；

条件是：当R²⁹是＝CH₂时，X⁵不是-OH。

在优选的实施方案中，R²⁹是C₁-C₁₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基、或烷芳基、或＝CH₂。在更优选的实施方案中，R²⁹是-CH₃或＝CH₂。

在另一优选的实施方案中，R³²是-CH₂C(O)OR³³或-CH₂C(O)NHR³³，其中R³³是C₁-C₁₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基。

本发明的组合物可以以单元剂量形式给予人和其它动物，比如片剂、胶囊、散剂、颗粒剂、无菌肠胃外溶液或混悬液、口服溶液或混悬液、包含有适量化合物的水包油或油包水乳液、栓剂或流体悬浮液或溶液。在本说明书中，使用的术语“药物稀释剂”和“药物载体”具有相同的意思。口服给药，可制备成固体或流体单元剂量形式。制备固体组合物，如片剂，该化合物可以与常规组分如滑石粉、硬脂酸镁、磷酸二钙、硅酸铝镁、硫酸钙、淀粉、乳糖、阿拉伯胶、甲基纤维素及作为药学稀释剂或载体的功能上类似的材料混合。胶囊是通过将化合物与惰性药学稀释剂混合并将混合物填充入合适大小的硬明胶胶囊中而制备的。软明胶胶囊是通过将化合物与可接受的植物油、轻液体石蜡或其它的惰性油的浆液由机器包囊而制备的。

可制备成流体单元剂量形式或口服给药如糖浆、酏剂和悬浮剂。该形式与糖、芳香调味剂和防腐剂一起溶于水性载体中制成糖浆。混悬液可借助于阿拉伯胶、黄芪胶、甲基纤维素等助悬剂用水性载体制备。

采用化合物和灭菌载体可制备肠胃外给药流体单元剂量形式。在制备溶液中，可将化合物溶于注射用水中，过滤灭菌，然后装入适合的小瓶或安瓿中封口。可将辅助剂如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂溶于载体中。将组合物装入小瓶后，冷冻组合物，真空除水，然后可以称重小瓶中的冷冻粉末，在使用前重构。

预期的本发明化合物的临床治疗适应症包括：(1)由侵入性微生物如葡萄球菌属(Staphylococci)和肠球菌属(Enterococci)引起的感染；(2)细胞过度表达脂肪酸合酶的许多组织中出现的癌症；(3)摄取过量热量引起的肥胖。治疗剂量和时间将取决于多种因素，包括(1)患者的年龄、体重和器官功能(如肝和肾功能)；(2)待治疗的疾病过程的属性和程度，及任何存在的共同发病和服用的伴随药物，和(3)药物相关参数如产生治愈所需的给药途径、给药频率和持续时间及药物的治疗指数。总之，选择剂量以获得血清水平1ng/ml到100ng/ml，实现在靶位获得大约1μg/ml到10μg/ml有效浓度的目标。

实施例

通过下述实施例来阐述，但不限制本发明。

如下所述合成了根据本发明的一系列化合物。某些化合物的生物活性描述如下：测试化合物：(1)纯化的人FAS的抑制，(2)整细胞中脂肪酸合成活性的抑制，(3)对培养的MCF-7人乳腺癌细胞的细胞毒性，已知这种细胞具有高水平的FAS和脂肪酸合成活性，采用结晶紫和XTT测定法，和(4)抗微生物活性。选择具有低水平细胞毒性的化合物，然后测试Bal b/C小鼠体重减少。此外，在Balb/C小鼠中测试来自表现出明显体重减少和低水平细胞毒性组的代表性化合物对脂肪酸氧化、和肉碱棕榈酰基转移酶-1(CPT-1)活性、以及通过Northern分析的下丘脑NPY表达的影响。还测试了某些化合物抗革兰氏阳性和/或阴性菌的活性。还测试了某些化合物体内抗肿瘤活性。

化合物的制备

(±)-α-亚甲基-γ-丁内酯-5-辛基-4-烯丙基酰胺(1)。将三(2-氧代-3-噁唑啉基)氧化膦¹(91.7mg，0.2mmol)、烯丙胺(12μl，0.2mmol))和NEt₃(0.04mL，0.3mmol)加到(±)-α-亚甲基-γ-丁内酯-5-辛基-4-羧酸(C75)，(40mg，0.16mmol)的CH₃CN(0.9mL)溶液中，允许溶液在室温下搅拌30分钟。将混合物倒入NH₄Cl_(sat)/l N HCl(10mL，3∶1)溶液中，用Et₂O(3×15mL)提取。干燥(MgSO₄)合并的有机物，过滤，蒸发并色谱分析(35％EtOAc/己烷)，得到纯的1(26.2mg，54％)：mp.66-68℃。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.84(t，J＝6Hz，3H)，1.23(m，11H)，1.34-1.47(m，1H)，1.60-1.71(m，2H)，3.43-3.46(m，1H)，3.87(dt，J＝1.4，5.7Hz，2H)，4.74(dt，J＝5，7Hz，1H)，5.12(d，J＝10.6Hz，1H)，5.16(d，J＝17.3Hz，1H)，5.72-5.85(m，1H)，5.76(d，J＝2.6Hz，1H)，6.34(d，J＝2.6Hz，1H)，6.50(bs，1H)。¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ14.0，22.6，24.9，29.1，29.2，29.4，31.8，35.9，42.3，52.2，80.5，117.0，124.3，133.5，135.4，168.6，168.6。IR(NaCl)2922，1771，1756，1642，1557cm^-1。C₁₇H₂₇NO₃的分析计算值：C，69.5；H，9.28；实测值：C，69.5；H，9.09。

(±)-α-亚甲基-γ-丁内酯-5-己基-4-烯丙基酰胺(2)。按照上述步骤，由(±)-α-亚甲基-γ-丁内酯-5-己基-4-羧酸(60mg，0.27mmol)与烯丙胺(33μl，0.29mmol)开始，经急骤色谱(30-40％EtOAc/己烷)后，得到2(51.8mg，74％)。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.86(t，J＝6Hz，3H)，1.26-1.52(m，8H)，1.63-1.77(m，2H)，3.40-3.43(m，1H)，3.91(app tt，J＝5.76，1.44Hz，2H)，4.72-4.78(m，1H)，5.14-5.20(m，2H)，5.75-5.87(m，1H)，5.78(d，J＝2.4Hz，1H)，5.93(bt，11H)，6.41(d，J＝2.9Hz，1H)；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ13.7，22.3，24.7，28.8，31.5，35.9，42.3，52.4，80.3，116.9，123.9，133.5，135.6，168.4，168.5.IR(NaCl)2923，1755，1641，1557cm^-1。C₁₅H₂₃NO₃的分析计算值：C，67.9；H，8.74；实测值：C，67.8；H，8.67。

(±)-α-亚甲基-γ-丁内酯-5-丁基-4-烯丙基酰胺(3)。按照上述步骤，由(±)-α-亚甲基-γ-丁内酯-5-丁基-4-羧酸(100mg，0.50mmol)与烯丙胺(41μl，0.55mmol)开始，经急骤色谱(30-40％EtOAc/己烷)后，得到3(68mg，57％)。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.87(t，J＝6Hz，3H)，1.28-1.50(m，4H)，1.66-1.74(m，2H)，3.41-3.45(m，1H)，3.90(app tt，J＝5.7，1.4Hz，2H)，4.72-4.78(m，1H)，5.14-5.20(m，2H)，5.74-5.87(m，1H)，5.78(d，J＝2.5Hz，1H)，6.12(bt，1H)，6.39(d，J＝2.8Hz 1H)；¹³C NMR(75MHz，CDC₁₃)δ13.6，22.2，26.8，35.5，42.3，52.5，80.3，117.0，123.9，133.5，135.5，168.3，168.5。IR(NaCl)2958，1768，1652，1548。C₁₃H₁₉NO₃的分析计算：C，65.8；H，8.07；实测值：C，65.8；H，8.07.

(±)-α-亚甲基-γ-丁内酯-5-辛基-4-羧基-甲基氨基乙酸酯(4)。按照上述步骤，由C75(39mg，0.15mmol)与甲基氨基乙酸酯盐酸盐(20mg，0.16mmol)开始，经急骤色谱(35％EtOAc/己烷)后，得到4(28mg，56％)。mp.94.5-95.5℃。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.85(t，J＝6.9Hz，3H)，1.23(s，11H)，1.41-1.49(m，1H)，1.63-1.74(m，2H)，3.46-3.49(m，1H)，3.75(s，3H)，3.97-4.14(dd，J＝5.4，8Hz，2H)，4.75(dt，J＝5.7，7Hz 1H)，5.88(d，J＝2Hz，1H)，6.41(d，J＝2Hz，1H)，6.55(bs，1H)；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ14.1，22.6，24.8，29.2，29.2，29.4，31.8，35.8，41.4，52.0，52.6，80.2，124.8，134.9，168.6，169.0，169.9。IR(NaCl)2915，1768，1737，1644cm-1；C₁₇H₂₇NO₅的分析计算值：C，62.7；H，8.36；实测值：C，62.7；H，8.27。

(±)-α-亚甲基-γ-丁内酯-5-辛基-4-羧基-叔-丁基-氨基乙酸酯(5)。按照上述步骤，由C75(100mg，0.39mmol)与叔-丁基氨基乙酸酯盐酸盐(66mg，0.4mmol)开始，经急骤色谱(35％Et₂O-30％EtOAc/己烷)后，得到5(108mg，75％)。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.84(t，J＝6.8Hz，3H)，1.25(s，12H)，1.44(s，9H)，1.65-1.73(m，2H)，3.44-3.48(m，1H)，3.92-3.95(dd，J＝3.6，5Hz，2H)，4.76(dt，J＝5.7，7Hz，1H)，5.88(d，J＝2Hz，1H)，6.41(d，J＝2Hz，1H)，4.47(bt，1H)。¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ13.9，22.5，24.8，28.0，29.1，29.2，29.3，31.7，35.8，42.2，51.9，80.2，82.6，124.6，135.1，168.5，168.6，168.8。C₂₀H₃₃NO₆的分析计算值：C，65.4，H，9.05；实测值：C，65.3；H，9.02。

(±)-α-亚甲基-γ-丁内酯-5-辛基-4-羧基-氨基乙酸酯(6)。向化合物5(100mg，0.27mmol)的CH₂CI₂(2.0mL)溶液中加入TFA(1.3mL)，允许溶液在室温下搅拌3小时。蒸发溶剂后，柱色谱分析(50％EtOAc/2％CH₃CO₂H/己烷)，获得纯的6(61mg，73％)。¹H NMR(300MHz，MeOD)δ0.82(t，J＝7Hz，3H)，1.22(s，10H)，1.28-1.38(m，2H)，1.57-1.69(m，2H)，3.55-3.59(m，2H)，3.78-3.95(ab-q，J＝17Hz，2H)，4.63(q_app，J＝6.4Hz，1H)，4.88(bs，1H)，5.87(d，J＝2.6Hz，1H)，6.19(d，J＝2.6Hz，1H)。¹³C NMR(75MHz，MeOD)δ14.6，23.8，26.1，30.5，30.5，30.6，33.2，36.6，42.2，52.8，81.7，124.8，137.4，170.8，172.6，172.5.IR(NaCl)2915，1769，1731，1644cm^-1.C₁₆H₂₅NO₅分析计算值：C，61.7；H，8.09；实测值：C，61.7；H，8.05。

(±)-α-亚甲基-γ-丁内酯-5-辛基-4-羧酸乙醇酰胺(7)。按照上述步骤，由C75(30mg，0.12mmol)与乙醇胺(7.8μl，0.13mmol)开始，经急骤色谱(50％EtOAc/己烷-100％EtOAc/2％CH₃CO₂H)后，得到7(32mg，91％)。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.86(t，J＝6.9Hz，3H)，1.24(s，10H)，1.35-1.48(m，2H)，1.64-1.75(m，2H)，3.40-3.57(m，3H)，3.74(t，J＝5Hz，2H)，4.73-4.79(dt，J＝5.7，7Hz，1H)，5.82(d，J＝2Hz，1H)，6.42(d，J＝2Hz，1H)。

(8，9)向C75(100mg，0.39mmol)的EtOAc(3.0mL)溶液中加入Pd(30mg，10％在碳上)，并通H₂(50psi)2小时。通过C盐过滤混合物，蒸发得到非对映异构体的混合物(1.8∶1，反式9∶顺式8)。柱色谱(20％EtOAc/2％CH₃CO₂H/己烷)得到分开的具有不可分的异构化副产物的反式对映异构体(9∶10，3.8∶1，59.5mg)和纯的顺式异构体(8，32.7mg，)(总产率92％)。

(±)-α-甲基-γ-丁内酯-5-辛基-4-羧酸(反式非对映体)(9)。

¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.85(t，J＝7Hz，3H)，1.23(s，10H)，1.31(d，J＝7Hz，3H)，1.41-1.50(m，2H)，1.64-1.69(m，2H)，2.62-2.69(dd，J＝9.6，11.3Hz，1H)，2.91-3.0(dq，J＝11.3，7Hz，1H)，4.42-4.49(td，J＝4，9Hz，1H)。¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ13.9，14.5，22.6，25.2，29.1，29.2，29.3，31.8，32.7，39.9，53.9，79.5，176.0，176.9。C₁₄H₂₄O₄Na⁺(M+Na⁺)的HRMS(ES)m/z计算值279.1566，观察值279.1562。

(±)-α-甲基-γ-丁内酯-5-辛基-4-羧酸(顺式非对映体)(8)

¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.86(t，J＝6.9Hz，3H)，1.25(bs，10H)，1.29(d，J＝7.4Hz，3H)，1.36-1.49(m，2H)，1.63-1.71(m，2H)，3.14(dd，J＝6，9Hz，1H)，3.02(dq，J＝7，9Hz，1H)，4.69(qapp，J＝6.3Hz，1H)。¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ11.8，14.0，22.6，25.3，29.1，29.2，29.3，31.8，34.7，37.0，49.9，79.5，175.4，177.3。C₁₄H₂₄O₄Na⁺(M+Na⁺)的HRMS(ES)m/z计算值为279.1566，观察值279.1568。

(±)-α-甲基-γ-丁内酯-5-辛基-4-羧酸烯丙基酰胺(11)。按照上述步骤，由9(52mg，0.20mmol)与烯丙基胺(16μl，0.22mmol)开始，经急骤色谱(40％Et₂O/己烷-30％EtOAc/己烷)后，得到11(30mg，51％)。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.86(t，J＝7Hz，3H)，1.23-1.30(m，13H)，1.38-1.49(m，2H)，1.61-1.69(m，2H)，2.29-2.36(dd，J＝9.3，11.3Hz，1H)，3.00-3.09(dq，J＝7，11Hz，1H)，3.92(tt，J＝1.5，5.7Hz，2H)，4.45-4.52(m，1H)，5.15-5.22(dd，J＝10，17Hz，2H)，5.76-5.88(m，2H)。¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ13.9，14.0，22.6，25.4，29.1，29.3，29.3，31.8，34.7，40.5，42.2，57.4，80.4，116.9，133.5，169.3，177.4。C₁₇H₂₉NO₃Na⁺(M+Na⁺)的HRMS(ES)m/z计算值318.2039，观察值318.2040。

(±)-α-甲基-γ-丁内酯-5-辛基-4-羧酸烯丙基酰胺(12)。按照上述步骤，由8(32mg，0.12mmol)与烯丙基胺(10μl，0.13mmol)开始，经急骤色谱(40％Et₂O/己烷-30％EtOAc/己烷)后，得到12(20mg，53％)。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.86(t，J＝7Hz，3H)，1.21-1.25(m，13H)，1.41-1.47(m，2H)，1.58-1.67(m，2H)，2.81-2.91(m，2H)，3.83-3.96(tt，J＝1.5，5Hz，2H)，4.71-4.77(m，1H)，5.13-5.21(dd，J＝10，17Hz，2H)，5.75-5.87(m，2H)。¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ11.5，14.0，22.6，25.4，29.1，29.2，29.4，31.8，34.8，37.4，42.0，51.2，80.3，116.9，133.8，169.1，177.9。C₁₇H₂₉NO₃Na⁺(M+Na⁺)的HRMS(ES)m/z计算318.2039；观察值318.2041。

3-甲基-5-辛基-5-氧代-2，5-二氢-呋喃-3-羧酸烯丙基酰胺(13)。按照上述步骤，由3-甲基-5-辛基-5-氧代-2，5-二氢-呋喃-4-羧酸(46mg，0.18mmol)与烯丙基胺(14μl，0.19mmol)开始，经急骤色谱(40％EtOAC/己烷)后，得到13(30mg，55％)。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.85(t，J＝6.9Hz，3H)，1.22(s，10H)，1.46-1.55(m，2H)，1.90-1.95(m，2H)，2.04(s，3H)，4.02(td，J＝1.4，5.7Hz，2H)，5.13-5.15(m，1H)，5.18-5.25(dd，J＝10.6，17.3Hz，2H)，5.80-5.92(ddt，J＝10.3，17，5.7Hz，1H)，6.07(t，J＝1.4Hz，1H)。¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ10.3，14.0，22.6，24.8，29.1，29.2，29.3，31.8，32.7，42.0，81.7，117.5，128.8，133.1，153.7，162.1，173.3。C₁₇H₂₇NO₃Na⁺(M+Na⁺)的HRMS(ES)m/z计算值316.1883，观察值316.1895。

参考文献：1.Kunieda，T.；Nagamatsu，T.；Higuchi，T.Hirobe，M.Tetrahedron Lett.1988，29，2203-2206。

生物学和生物化学方法

从ZR-75-1人乳腺癌细胞中纯化FAS

从培养的获自美国典型培养物中心的ZR-75-1人乳腺癌细胞中纯化人FAS。修改自1981年Linn等和1994年Kuhajda等的所述方法，利用低渗裂解、连续聚乙二醇(PEG)沉淀和阴离子交换色谱。在37℃，5％CO₂下，在含10％胎牛血清、青霉素和链霉素的RPMI培养基中培养ZR-75-1细胞。

将十个T150烧瓶的汇合细胞用1.5ml裂解缓冲液(20mM Tris-HCI，pH 7.5，1mM EDTA，0.1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)，0.1％Igepal CA-630)溶解和在冰上匀浆20次的dounce裂解。在JA-20转动件(Beckman)中，在4℃以20,000rpm离心裂解产物30分钟，用裂解缓冲液使上清液至42ml。将50％PEG 8000的裂解缓冲溶液缓慢地加到上清液中，使得终浓度为7.5％。在4℃摇动60分钟后，在JA-20转动件(Beckman)中，在4℃以15,000rpm离心溶液30分钟。然后往上清液中加入固体PEG 8000，使终浓度为15％。摇动和如上重复离心，将吐弃块重新悬浮在10ml缓冲液A(20mM K₂HPO₄，pH 7.4)中，在4℃下过夜。在0.45μM过滤之后，将蛋白质溶液应用到Mono Q 5/5阴离子交换柱(Pharmacia)上。用缓冲液A以1ml/分钟洗柱15分钟，用60分钟内线性60-ml梯度至1M KCl洗脱结合的物质。FAS(MW-270kD)通常在0.25M KCl三个0.5ml的组分洗脱出，使用以考马斯G250染色(Bio-Rad)的4-15％SDS-PAGE鉴定这些组分。根据制造商的说明，用考马斯加蛋白质分析试剂(Pierce)，以BSA作为标准，测定FAS蛋白质浓度。该方法得到基本上纯的FAS制备物(＞95％)，如通过考马斯-染色的凝胶判定。

FAS酶活性的测量和化合物IC₅₀的测定

在96孔板中，通过分光光度法以OD₃₄₀监测丙二酰-辅酶A依赖性NADPH氧化来测量FAS的活性(Dils等和Arslanian等，1975)。每孔含有2μg纯化的FAS、100mM K₂HP0₄、pH 6.5，1mM二硫苏糖醇(Sigma)和187.5μM β-NADPH(Sigma)。以2、1和0.5mg/ml在DMSO溶液中制备抑制剂的储备液，使得当每孔加入1μl储备液时，终浓度为20、10和5μg/ml。对于每次试验，使用浅蓝菌素(Sigma)作为阳性对照，它与DMSO对照、抑制剂和空白(不含FAS酶)都是一式两份。

在Molecular Devices SpectraMax Plus分光光度计上进行该试验。将含有FAS、缓冲液、抑制剂和对照的板放入加热至37℃的分光光度计中。运用动力学程序，将双份含有100μl 100mM K₂HP0₄，pH 6.5的孔作为空白对照，在OD₃₄₀处每隔10秒读数，读数5分钟，测量任何丙二酰-辅酶A非依赖性NADPH氧化。从分光光度计中取出板，除了空白外，向每孔中加入丙二酰-辅酶A(每孔终浓度为67.4uM)和乙酰-辅酶A(每孔终浓度为61.8μM)。如上所述，再次用动力学程序读板以测量丙二酰-辅酶A依赖性NADPH氧化。丙二酰-辅酶A依赖性和非丙二酰-辅酶A依赖性NADPH氧化的ΔOD₃₄₀之间的差就是特异FAS活性。因为FAS制备物的纯度，非丙二酰-辅酶A依赖性NADPH氧化可以忽略不计。

通过对每个被测抑制剂浓度的ΔOD₃₄₀值绘图，进行线性回归和求解最佳拟合线、r²值和95％置信区间来测定化合物的抗FAS IC₅₀。产生50％FAS抑制的化合物浓度为IC₅₀。用SOFTmax PRO软件(MolecularDevices)绘制每个化合物浓度的ΔOD₃₄₀值对时间的曲线图。线性回归、最佳拟合线、r²和95％置信区间的求解是用Prism Version 3.0(GraphPad Software)计算的。

结晶紫细胞生长试验

结晶紫试验测量细胞生长但不测量细胞毒性。该试验使用结晶紫对在96孔板上的固定细胞染色，随后溶解并在分光光度计上测量OD₄₉₀值。OD₄₉₀值对应每被测量单位时间的细胞生长。用目的化合物或载体对照处理细胞，计算每个化合物的IC₅₀值。

为测量具体化合物对癌细胞的细胞毒性，将每孔5×10⁴个MCF-7人乳腺癌细胞(从美国典型培养物中心获得)置于24孔板中的含10％牛胎血清、青霉素和链霉素的DMEM培养基中。在37℃和5％CO₂下过夜培养之后，将溶于DMSO中的待测试化合物，以下面的浓度往孔中加1μl体积：50、40、30、20和10μg/ml一式三份。如果需要，测试另外的浓度。往一式三份孔中加入1μlDMSO作为载体对照。一式三份以5和10μg/ml使用C75作为阳性对照。

孵育72小时后，每孔中的细胞用0.5ml的结晶紫染色剂(0.5％的25％甲醇)染色。10分钟后，清洗孔，风干，然后用0.5ml 10％的十二烷基硫酸钠振荡2小时溶解。从每孔中转移100μl至96孔板中，在Molecular Devices SpectraMax Plus Spectrophotometer上在OD₄₉₀处读板。平均OD₄₉₀值用SOFTmax Pro Software(Molecular Devices)计算，用Prism version 3.02(Graph Pad Software，San Diego)通过线性回归分析测定IC₅₀值。

XTT细胞毒性试验

XTT试验是[⁵¹Cr]释放细胞毒性试验的一种非放射性替代。XTT是一种四唑盐，它只被代谢活泼、活细胞还原成甲臢染料。以分光光度法测量XTT的还原为OD₄₉₀-OD₆₅₀。

为测量具体化合物对癌细胞的细胞毒性，将每孔9×10³个MCF-7人乳腺癌细胞(从美国典型培养物中心获得)置于96孔板中的含10％牛胎血清、胰岛素、青霉素和链霉素的DMEM培养基中。在37℃和5％CO₂下过夜培养之后，将溶于DMSO中的待测化合物，以下面的浓度往孔中加1μl体积：80、40、20、10、5、2.5、1.25和0.625μg/ml一式三份。如果需要，测试另外的浓度。往一式三份孔中加入1μlDMSO作为载体对照。一式三份以40、20、10、15、12.5、10和5μg/ml使用C75作为阳性对照。

孵育72小时后，按照制造商的说明，将细胞与XTT试剂(细胞增殖试剂盒II(XTT)Roche)一起孵育4小时。在Molecular DevicesSpectraMax Plus分光光度计上在OD₄₉₀和OD₆₅₀处读板。含有XTT试剂但不含细胞的三个孔作为板空白。以OD₄₉₀-OD₆₅₀报告XTT数据。平均值与平均值的标准误差是用SOFTmaxPro软件(Molecular Dynamics)计算的。

化合物的IC₅₀被定义为与对照相比导致OD₄₉₀-OD₆₅₀值50％减小的药物浓度。通过SOFTmax PRO软件(Molecular Devices)计算每个化合物浓度的OD₄₉₀-OD₆₅₀。IC₅₀是通过线性回归，将以对照百分比表示的FAS活性对药物浓度作图来计算的。线性回归、最佳拟合线、r²和95％置信区间使用Prism Version 3.0(Graph Pad Software)测定。

掺入总脂的[¹⁴C]醋酸酯的测量和化合物IC₅₀的测定

该试验测量向总脂中[¹⁴C]醋酸酯的掺入，是脂肪酸合成途径活性的体外测量。用它体外测量脂肪酸合成的抑制。

将按照上面方法培养的MCF-7人乳腺癌细胞，以每孔5×10⁴个细胞置入24孔板中。过夜孵育之后，以5、10和20μg/ml的浓度一式三份加入溶于DMSO中的待测化合物，如果需要，用更低的测试浓度。向一式三份孔中加入DMSO作为载体对照。一式三份以5和10μg/ml使用C75作为阳性对照。孵育4小时后，往每个孔中加入0.25μCi的[¹⁴C]醋酸酯(10μl体积)。

另外孵育2小时后，从孔中吸出培养基，然后往每孔中加入800μl氯仿∶甲醇(2∶1)和700μl 4mM MgCl₂。将每孔中的内容物转移至1.5mlEppendorf管中，在高速Eppendorf微型离心机5415D中全速离心2分钟。在移去水层(上层)后，向每管中加入另外700μl氯仿∶甲醇(2∶1)和500μl 4mM MgCl₂，然后按照上面的方法离心1分钟。用Pasteur移液管移出水层，弃去。向每管中加入另外400μl氯仿∶甲醇(2∶1)和200μl 4mM MgCl₂，然后离心并弃去水层。将下层(有机)相转移至闪烁瓶中，在40℃ N₂气下干燥。一经干燥，加入3ml闪烁剂(APB#NBC5104)，对小瓶进行¹⁴C计数。用Beckman闪烁计数仪计算一式三份的平均cpm值。

化合物的IC₅₀被定义为与对照相比导致向脂中掺入的[¹⁴C]醋酸酯50％减少的药物浓度。这是通过绘制每个待测抑制剂浓度的平均cpm图，进行线性回归和求解最佳拟合线、r²值和95％置信区间而测定的。用Beckman闪烁计数仪(Model LS6500)计算每个化合物浓度的平均cpm值。线性回归、最佳拟合线、r²和95％置信区间的求解通过PrismVersion 3.0(Graph Pad Software)来计算。

肉碱棕榈酰转移酶-1(CPT-1)试验

CPT-1催化长链脂肪酸由酰基-辅酶A向酰基-肉碱的ATP依赖性转移，丙二酰-辅酶A抑制该转移。由于CPT-1活性需要线粒体膜，所以在可渗透化的细胞或线粒体中测量酶活性。该测试使用可渗透化的细胞来测量[甲基-¹⁴C]L-肉碱向有机可溶的酰基-肉碱衍生物的转移。

以10⁶个细胞将MCF-7细胞放入24孔板中的含有10％胎牛血清的DMEM中，对照、药物和丙二酰-辅酶A一式三份。开始测试前两小时，以由10mg/ml DMSO中的储备溶液制备的所示浓度加入药物，载体对照由DMSO组成，不含药物。由于丙二酰-辅酶A不能进入完整的细胞，所以仅将它加入到尚未与药物预孵育的细胞测试缓冲液中。37℃孵育过夜后，取出培养基并替换为700μl的测试缓冲液，该缓冲液由50mM咪唑、70mM KCl、80mM蔗糖、1mM EGTA、2mM MgCl₂、1mM DTT、1mM KCN、1mM ATP、0.1％不含脂肪酸的牛血清白蛋白、70μM棕榈酰-辅酶A、0.25μCi[甲基-¹⁴C]L-肉碱、40ug洋地黄皂甙组成，具有药物、DMSO载体对照或20μM丙二酰-辅酶A。测试缓冲液中的药物和DMSO的浓度与2小时预孵育中采用的相同。37℃孵育6分钟后，加入500μl冰冷4M高氯酸终止反应。然后收获细胞，并在13000×g离心5分钟。用500μl的冰冷2mM高氯酸清洗吐弃块，并再次离心。将得到的吐弃块再悬浮在800μl dH₂O中，然后用150μl丁醇提取。丁醇相通过液体闪烁计数并代表酰基肉碱衍生物。

新FAS抑制剂的体重减少筛选

利用Balb/C小鼠(Jackson实验室)进行最初的体重减少筛选。在温度和12小时白天/黑夜循环的房间内饲养动物，并且自由供给小鼠食物和水。每种测试化合物和载体对照利用三只小鼠，每个试验一式三份。关于实验，将每种测试化合物的小鼠分开饲养，三只小鼠一笼。用DMSO稀释化合物，当给药剂量为30mg/kg时，化合物被稀释为10mg/ml，当给药剂量为60mg/kg时被稀释为30mg/ml，并且腹膜内注射小鼠大约100μl DMSO中的60mg/kg或者单独注射载体。每天观察小鼠并且称重；用Excel(Microsoft)计算平均体重和标准误差。实验继续直到动物达到它们的预处理体重为止。在利用饲养在代谢笼中的动物中测试选择化合物。

图5显示了体重减少的一些体内试验结果。动物的剂量与筛选试验的一致，一个代谢笼中三只动物。每天测量动物的体重、水和食物的消耗以及尿和粪便的产生。在0天以所示剂量的化合物或者等体积的载体(DMSO)对照处理以小鼠粮维持的三只瘦Balb/C小鼠(Harlan)。将化合物6溶解在40μl的DMSO中，而将化合物8溶解在60μlDMSO中。全部腹膜内注射。在所示的天测量体重。误差线表示平均值的标准误差。

抗微生物性质

利用培养液微稀释试验来评价所述化合物的抗微生物活性。以两倍连续稀释来测试化合物，并将抑制可视生长的浓度(10％对照的OD₆₀₀)定义为MIC。测试的微生物包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(ATCC # 29213)，粪肠道球菌(Enterococcus faecalis)(ATCC # 29212)，绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)(ATCC #27853)，和大肠杆菌(Escherichia coli)(ATCC # 25922)。该试验是在两种生长培养基，Mueller Hinton培养液和Trypticase Soy培养液中进行的。

由在含有10％甘油的T大豆培养液中维持的冰冻原液接种血液(T大豆/5％绵羊血)琼脂板并在37℃孵育过夜。将菌落悬浮在无菌培养液中，以便浑浊度符合0.5McFarland标准的混浊度。将接种物使用无菌培养液(Mueller Hinton或Trypticase soy)稀释1∶10，96孔板的每孔分散195μl。将溶于DMSO中的测试化合物，以下列浓度加入孔中5μl体积：25、12.5、6.25、3.125、1.56和0.78μg/ml，一式两份。如果需要，测试另外的浓度。加入复制孔的5μl DMSO为载体对照。在每次操作中包括阳性对照化合物、万古霉素(粪肠道球菌和金黄色葡萄球菌)与托普霉素(大肠杆菌和绿脓杆菌)的连续稀释。

37℃孵育24小时后，在Molecular Devices SpectraMax Plus分光光度计上在OD₆₀₀处读板。用SOFTmax Pro Software(MolecularDevices)计算平均OD₆₀₀值，使用Prism version 3.02(Graph PadSoftware，San Diego)通过线性回归分析测定MIC值。MIC被定义为产生与载体对照读数10％相等的OD₆₀₀读数所需的化合物浓度。

抗肿瘤活性的体内测试

使用人结肠癌细胞系，HCT-166在nu/nu雌性小鼠(Harlan)中的皮下侧面异种移植研究化合物1的体内抗肿瘤作用。所有动物试验遵守规定的动物保护指南。从补充有10％FBS的DMEM中的培养物中将10⁷个HCT-116细胞(～0.1ml细胞叠集)，异种移植到20只无胸腺小鼠体内。接种后大约3天，当可测量的肿瘤发育时，处理开始。将化合物1(10mg/kg)稀释到40μl DMSO中，腹膜内注射(i.p.)处理。在箭头所示的天，11只动物接受JMM-III-23110mg/kg，i.p.，以及11只动物接受DMSO对照。在所示的天测量肿瘤。1只化合物1处理的小鼠在第10天死于重复的腹膜内注射。结果显示在图4中。误差线代表平均值的标准误差。

使用人结肠癌细胞系的皮下侧面异种移植物，nu/nu雌性小鼠(Harlan)中的HCT-116研究化合物7和化合物3的体内抗肿瘤作用。所有动物试验遵守规定的动物保护指南。从补充有10％FBS的DMEM中的培物中将10⁷个HCT-116细胞(～0.1ml细胞叠集)，异种移植到15只无胸腺小鼠体内。接种后大约4天，在可测量的肿瘤发育时，处理开始。将化合物7和化合物3(10mg/kg)稀释到20μl DMSO中，供腹膜内(i.p.)注射。在箭头所示的天，5只动物接受药物i.p.，以及5只动物接受DMSO对照。在所示的天测量肿瘤。结果显示在图3中。误差线代表平均值的标准误。

生物测试的结果

Claims

1.式I的化合物

其中

R¹＝H或C₁-C₂₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基、＝CHR³、-C(O)OR³、-C(O)R³、-CH₂C(O)OR³、-CH₂C(O)NHR³，其中R³是H或C₁-C₁₀烷基、环烷基或链烯基；

R²＝C₁-C₂₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基；

X¹＝NHR⁴，其中R⁴是H、C₁-C₂₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基，所述R⁴基团选择性地含有羰基、羧基、羧基酰胺基、醇基或醚基，所述R⁴基团进一步选择性地含有一个或多个卤素原子。

2.权利要求1的化合物，其中R¹是C₁-C₁₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基或＝CH₂。

3.权利要求2的化合物，其中R¹是-CH₃或＝CH₂。

4.权利要求3的化合物，其中所述化合物选自由下列化合物组成的组：

5.权利要求1的化合物，其R⁴是-CH₂C(O)OR⁵或-CH₂C(O)NHR⁵，其中R⁵是H、C₁-C₁₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基。

6.权利要求5的化合物，其中所述化合物选自由下列化合物组成的组：

7.式II化合物：

其中

R⁶＝H或C₁-C₂₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基、-C(O)OR⁸、-C(O)R⁸、-CH₂C(O)OR⁸、-CH₂C(O)NHR⁸，其中R⁸是H或C₁-C₁₀烷基、环烷基或链烯基；

R⁷＝C₁-C₂₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基；

8.权利要求7的化合物，其中R⁶是C₁-C₁₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基。

9.权利要求8的化合物，其中R⁶是-CH₃。

10.权利要求7的化合物，其中R⁹是-CH₂C(O)OR¹⁰或-CH₂C(O)NHR¹⁰，其中R¹⁰是H、C₁-C₁₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基A或烷芳基。

11.式IV化合物：

其中

R¹⁶＝H或C₁-C₂₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基、-C(O)OR¹⁸、-C(O)R¹⁸、-CH₂C(O)OR¹⁸、-CH₂C(O)NHR¹⁸、其中R¹⁸是H或C₁-C₁₀烷基、环烷基或链烯基；

条件是：当R¹⁶是-CH₃且R¹⁹是-CH₃时，R¹⁷不是取代或未取代的苯基、-nC₃H₇、-nC₅H₁₁、-nC₁₃H₂₇，

并且，进一步的条件是：当R¹⁶是H且R¹⁹是-CH₃时，R¹⁷不是取代或未取代的苯基或-CH₃，以及当R¹⁶是H且R¹⁹是-CH₂CH₃时，R¹⁷不是-iC₃H₇或取代或未取代的苯基。

12.权利要求11的化合物，其中R¹⁶是C₁-C₁₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基。

13.权利要求12的化合物，其中R¹⁶是-CH₃。

14.权利要求11的化合物，其中R¹⁹是-CH₂C(O)OR²⁰或-CH₂C(O)NHR²⁰，其中R²⁰是C₁-C₁₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基。

15.式V化合物：

其中

R²¹＝C₂-C₂₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基、＝CHR²³、-C(O)OR²³、-C(O)R²³、-CH₂C(O)OR²³、-CH₂C(O)NHR²³，其中R²³是H或C₁-C₁₀烷基、环烷基或链烯基，但当R²¹是＝CHR²³时，R²³不是H；

R²²＝C₁-C₂₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基；

条件是：当R²¹是-COOH时，R²²不是-CH₃、-nC₅H₁₁或C₁₃H₂₇，并且进一步的条件是：当R²¹是-CH₂COOH时，R²²不是-CH₃、-CH₂CH₃或-iC₅H₁₁。

16.权利要求15的化合物，其中R²¹是C₂-C₁₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基.

17.权利要求16的化合物，其中R²¹是＝CH₂。

18.式VI化合物：

其中：

R²⁴＝C₂-C₂₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基、-C(O)OR²⁶、-C(O)R²⁶、-CH₂C(O)OR²⁶、-CH₂C(O)NHR²⁶，其中R²⁶是H或C₁-C₁₀烷基、环烷基或链烯基；

R²⁵＝C₁-C₂₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基；

条件是：当R²⁴是-COOH时，R²⁵不是-CH₃、-nC₅H₁₁或C₁₃H₂₇，并且进一步的条件是：当R²⁴是-CH₂COOH时，R²⁵不是-CH₃、-CH₂CH₃或-iC₅H₁₁。

19.权利要求18的化合物，其中R²⁴是C₂-C₁₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基。

20.式VII化合物：

21.权利要求20的化合物，选自由下列化合物组成的组：

22.式VIII的化合物：

其中R²⁸是C₁-C₂₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基，条件是：R²⁸不是-CH₃、-nC₃H₇、-nC₁₁H₂₃或-nC₁₃H₂₇。

23.药物组合物，包含药物稀释剂和式IX化合物：

R²⁹＝H或C₁-C₂₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基、＝CHR³¹、-C(O)OR³¹、-C(O)R³¹、-CH₂C(O)OR³¹、-CH₂C(O)NHR³¹，其中R⁵¹是H或C₁-C₁₀烷基、环烷基或链烯基；

X⁵＝-OR³²或-NHR³²，其中R³²是H、C₁-C₂₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基，所述R³²基团选择性地含有羰基、羧基、羧基酰胺基、醇基或醚基，所述R³²基团进一步选择性地含有一个或多个卤素原子；

条件是：当R²⁹是＝CH₂时，X⁵不是OH。

24.权利要求23的药物组合物，其中R²⁹是C₁-C₁₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基或＝CH₂。

25.权利要求24的药物组合物，其中R²⁹是-CH₃或＝CH₂。

26.权利要求23的药物组合物，其中R³²是-CH₂C(O)OR³³或-CH₂C(O)NHR³³，其中R³³是C₁-C₁₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基。

27.权利要求23的药物组合物，其中R²⁹是-C₆H₁₃或-C₈H₁₇。

28.权利要求23的药物组合物，其中所述化合物选自由下列化合物组成的组：

29.药物组合物，包括药物稀释剂和根据权利要求1的化合物。

30.药物组合物，包括药物稀释剂和根据权利要求7的化合物。

31.药物组合物，包括药物稀释剂和根据权利要求11的化合物。

32.药物组合物，包括药物稀释剂和根据权利要求15的化合物。

33.药物组合物，包括药物稀释剂和根据权利要求18的化合物。

34.药物组合物，包括药物稀释剂和根据权利要求20的化合物。

35.药物组合物，包括药物稀释剂和根据权利要求22的化合物。

36.药物组合物，包括药物稀释剂和式III化合物：

其中

R¹¹＝H或C₁-C₂₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基、＝CHR¹³、-C(O)OR¹³、-C(O)R¹³，-CH₂C(O)OR¹³、-CH₂C(O)NHR¹³，其中R¹³是H或C₁-C₁₀烷基、环烷基或链烯基；

R¹²＝C₁-C₂₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基；

X³＝OR¹⁴，其中R¹⁴是C₁-C₂₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基，所述R¹⁴基团选择性地含有羰基、羧基、羧基酰胺基、醇基或醚基，所述R¹⁴基团进一步选择性地含有一个或多个卤素原子。

37.权利要求36的药物制剂，其中R¹¹是C₁-C₁₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基，或＝CH₂。

38.权利要求37的药物制剂，其中R¹¹是-CH₃或＝CH₂。

39.权利要求36的药物制剂，其中R¹⁴是-CH₂C(O)OR¹⁵或CH₂C(O)NHR¹⁵，其中R¹⁵是C₁-C₁₀烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基。

40.式IX的化合物在制备引起体重减轻的药物中的用途。

41.权利要求40所述的化合物的用途，其中所述药物用于给人施用。

42.权利要求40所述的化合物的用途，其中所述药物用于给动物施用。

43.权利要求41所述的化合物的用途，其中所述化合物选自由下列化合物组成的组：

44.权利要求42所述的化合物的用途，其中所述化合物选自由下列化合物组成的组：

45.式IX的化合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

46.权利要求45所述的化合物的用途，其中所述药物用于给人施用。

47.权利要求45所述的化合物的用途，其中所述药物用于给动物施用。

48.权利要求46所述的化合物的用途，其中化合物选自由下列化合物组成的组：

49.权利要求46所述的化合物的用途，其中所述化合物选自由下列化合物组成的组：

50.式IX的化合物在制备用于刺激CPT-1活性的药物中的用途。

51.权利要求50所述的化合物的用途，其中所述药物用于给人施用。

52.权利要求50所述的化合物的用途，其中所述药物用于给动物施用。

53.权利要求51所述的化合物的用途，其中所述化合物是：

54.权利要求52所述的化合物的用途，其中所述化合物是：

55.式IX的化合物在制备用于抑制神经肽-Y活性的药物中的用途。

56.权利要求55所述的化合物的用途，其中所述药物用于给人施用。

57.权利要求55所述的化合物的用途，其中所述药物用于给动物施用。

58.式IX的化合物在制备用于抑制脂肪酸合酶活性的药物中的用途。

59.权利要求58所述的化合物的用途，其中所述药物用于给人施用。

60.权利要求58所述的化合物的用途，其中所述药物用于给动物施用。

61.权利要求59所述的化合物的用途，其中所述化合物选自由下列化合物组成的组：

62.权利要求60所述的化合物的用途，其中所述化合物选自由下列化合物组成的组：

63.式IX的化合物在制备用于抑制侵入性微生物细胞生长的药物中的用途。

64.权利要求63所述的化合物的用途，其中所述药物用于给人施用。

65.权利要求63所述的化合物的用途，其中所述药物用于给动物施用。

66.权利要求64所述的化合物的用途，其中所述化合物选自由下列化合物组成的组：

67.权利要求65所述的化合物的用途，其中所述化合物选自由下列化合物组成的组：