CN102719416A

CN102719416A - 一种提高β-1,3-1,4-葡聚糖酶热稳定性的方法

Info

Publication number: CN102719416A
Application number: CN201210197691XA
Authority: CN
Inventors: 王金晶; 钮成拓; 李崎; 李永仙; 刘春凤; 郑飞云
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2012-06-15
Filing date: 2012-06-15
Publication date: 2012-10-10
Anticipated expiration: 2032-06-15
Also published as: CN102719416B

Abstract

本发明提供了一种提高β-1,3-1,4-葡聚糖酶热稳定性的方法，属于酶工程领域。通过HNO₂对β-1,3-1,4-葡聚糖酶进行修饰，β-1,3-1,4-葡聚糖酶的热稳定性得到大幅度提高，在啤酒行业麦汁糖化过程中应用前景广阔。该酶生产方法简便，成本较低，具有广阔的工业应用前景。

Description

一种提高β-1,3-1,4-葡聚糖酶热稳定性的方法

技术领域

本发明涉及一种提高β-1,3-1,4-葡聚糖酶热稳定性的方法，尤其是一种利用HNO₂修饰β-1,3-1,4-葡聚糖酶的化学修饰方法。

技术背景

β–葡聚糖是构成禾本科植物细胞壁的一种非淀粉性多糖，在大麦、黑麦、高梁、大米和小麦的胚乳细胞壁中含量尤其高。谷物β–葡聚糖都是由高达上千个β-D-葡萄糖残基通过β-1,3或β-1,4糖苷键排列成线状的葡聚糖，其种类随两种键的比例和混合链接片段的长度不同而变化。

β–葡聚糖的分子特点决定了其可以很大的分子量溶解于水中，其浓度越大，溶液的粘度也就越大，这给啤酒酿造工业和饲料工业都带来了很大问题。在啤酒酿造工业中，因所用的主要原料麦芽中含有大量β–葡聚糖，往往会造成麦汁粘度过大致使过滤困难，延长糖化醪过滤时间，降低浸出物含量，而且容易使成品啤酒产生早期雾浊从而影响保质期。

β-1,3-1,4-葡聚糖酶是一类具有严格底物专一性的葡聚糖水解酶，其只切断β-葡聚糖中3-O-吡喃葡萄糖取代基的β-1,4-糖苷键（β-1,3-1,4-键型），产物主要是三糖3-O-β-纤维二糖-D-吡喃葡萄糖（G4G3G）和四糖3-O-β-纤维三糖-D-吡喃葡萄糖(G4G4G3G)。在糖化过程中加入高活性耐热β-1,3-1,4-葡聚糖酶能够有效解决上述的酿造过程中过滤速度慢、清酒过滤酒损高、纯生啤酒过滤膜堵塞以及成品啤酒冷雾浊的一系列问题，在工业上具有重要应用价值。在啤酒酿造糖化过程中，添加β-1,3-1,4-葡聚糖酶可以将β-葡聚糖降解为低聚糖和葡萄糖，有效降低麦汁粘度，大大提高过滤速度，增加生产效率，提高啤酒非生物稳定性。

β-1,3-1,4-葡聚糖酶具有重要的工业应用价值，因此国内外研究者对其进行了大量研究。目前β-1,3-1,4-葡聚糖酶在啤酒糖化过程中使用已有一定应用，但是目前市场上国外的几家酶制剂公司如诺维信、DMS研发生产的β-葡聚糖酶制剂价格昂贵，而目前国内也有部分酶制剂公司生产β-葡聚糖酶制剂，但其水平远不及国外酶制剂公司，且β-葡聚糖酶制剂的生产菌种及工艺都是商业机密，国内研发速率缓慢，因此国内市场在很大程度上依然依赖进口。而且，野生菌来源的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的活性及热稳定性均不能达到工业应用要求，不适宜大量应用于工业生产。酶的化学修饰可以在无需蛋白三维结构信息的情况下引入所需基团，扩大酶的应用范围，并且化学修饰具有简单、快速、经济的优点，但是在修饰过程中可能会破坏酶分子的结构，降低酶的活性。所以就非常有必要研究酶化学修饰的条件，包括化学修饰剂、反应温度和反应时间等，从而保持或尽量减少酶的活性的损失。

附图说明:

图1被修饰的酶与未被修饰酶的最适温度曲线。

□:修饰酶的最适温度曲线；▲:天然酶的最适温度曲线

图2被修饰的酶与未被修饰酶的最适pH曲线。

□:修饰酶的最适pH曲线；▲:天然酶的最适pH曲线

图3被修饰的酶与未被修饰酶的T50值测定曲线

□:修饰酶的最适pH曲线；▲:天然酶的最适pH曲线

图4被修饰的酶与未被修饰酶的t_(1/2,60℃)值测定曲线

□:修饰酶的最适pH曲线；▲:天然酶的最适pH曲线

具体实施方式

1、β-1,3-1,4-葡聚糖酶的制备

根据NCBI数据库中淀粉液化芽孢杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因序列（M15674）。通过全基因合成，将目的基因bgl连接到质粒pET28a⁽⁺⁾中并将质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中，挑选验证后进行发酵培养。培养基各组分和培养条件如下(g/L):蛋白胨10，氯化钠10，酵母提取物5，终浓度50μg/mL的卡那霉素。在37°C恒温培养至OD₆₀₀等于1.0后加入终浓度为10mmol的IPTG和0.0336mmol的α-乳糖共同诱导，在24℃下培养24h，对发酵液进行离心，然后将上清液通过10kDa蛋白超滤管浓缩，最后得到100μg/mL-200μg/mL的β-1,3-1,4-葡聚糖酶液。

2、化学修饰剂亚硝酸（HNO₂）溶液的制备。

具体过程和步骤如下:称取13.8gNaNO₂，溶于少量的水中，最后用容量瓶定容至1L，即可得到0.2MNaNO₂溶液；用量筒量取18mL浓盐酸，溶于少量的水中，最后用容量瓶定容至1L，即可的到0.2MHCl溶液；将NaNO₂溶液和HCl溶液在有盖子的棕色玻璃容器中等体积混合，用振荡器或搅拌器使之混合均匀，反应后生成浓度为0.1M HNO₂溶液。将反应后生成的0.1MHNO₂溶液放在4℃冰箱中，待用。

3、β-1,3-1,4-葡聚糖酶的化学修饰

将170ul0.1M pH6的磷酸缓冲液加入到150μLβ-1,3-1,4-葡聚糖酶酶液中，然后加入新鲜制备的0.1MHNO₂至终浓度为10-100mM，将混合好的溶液放在40℃的恒温水浴锅中，反应15-120min。

其中，所述β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶液浓度最佳为100μg/mL-200μg/mL，HNO₂的最佳浓度为10-30mM，最佳反应时间为30min。

4、β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活的测定

酶活定义：取单位体积酶液于40℃和pH 6.5条件下，每分钟水解β-葡聚糖生成相当于1μmol的葡萄糖还原物质的量为1个酶活力单位，以U/mL表示。

改良AZO方法：将发酵液离心后取上清并适当稀释，取0.1mL加入0.4mL经40℃预热的蓝色葡聚糖底物(使用前和0.02mol/L的pH6.5的磷酸缓冲液等体积混合)，在40℃精确反应10min，然后每个反应样品中加入3.0mL沉淀液，混匀后10,000r/min离心5min，取上清液，使用1cm的玻璃比色杯准确测定其在590nm处的吸光值，以0.1mL的去离子水代替离心发酵液上清做空白对照。每个样品做3个平行样。酶活计算公式如下：

β-葡聚糖酶酶活(U/mL)=稀释倍数×(OD₅₉₀+0.0558)/(0.0012×180)

5、修饰酶的酶学性质研究

A.最适温度的测定:测定范围从30℃到65℃，分别测定不同温度下的酶活。将酶活最高的作为100％，然后计算其它温度下的相对酶活，结果如图1。

B.最适pH的测定:测定范围从pH4.5到pH8，,分别测定不同pH条件下的酶活，将酶活最高的作为100％，然后计算其它pH下的相对酶活,结果如图2。

C.温度稳定性的测定:得到的β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶液分别在25℃~80℃的水浴中保温10min，立即冰浴20min，测定酶活力。记酶溶液不经过钝化处理时的酶活力为100％，以不同温度对相应的残余酶活力百分比作图，求出酶活力丧失50％时的温度，即该酶的半失活温度T₅₀。定义β-1,3-1,4-葡聚糖酶特定温度下酶活丢失一半的时间为其半衰期，记为t_{（1/2，X℃)}，结果见图3-4。

通过本方法制备的β-1,3-1,4-葡聚糖酶，其T₅₀值与t_(1/2,60℃)分别提高了4.76%和62.1%，热稳定性明显提高，最适温度和最适pH变化不大，更适合工业应用，本发明所述的化学修饰剂价格便宜，用量少，成本低。

Claims

1.一种提高β-1,3-1,4-葡聚糖酶热稳定性的方法，其特征在于通过亚硝酸HNO₂对β-1,3-1,4-葡聚糖酶进行化学修饰。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述β-1,3-1,4-葡聚糖酶的浓度为100μg/mL-200μg/mL，所述亚硝酸的浓度为10-30mM。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于修饰工艺为40℃恒温处理15-120min。