CN104293864B - 一种淀粉糖原的合成方法 - Google Patents
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Abstract
一种淀粉糖原的合成方法，属于变性淀粉资源开发技术领域。本发明原理基于利用淀粉分支酶的转糖基作用，将聚合度均一化糊精嫁接于支链淀粉分子上，制备高度支化，结构类似动物糖原的植物性淀粉糖原。主要步骤为：以一定比例的DP10‑20的糊精和A链DP10‑20糯米淀粉为底物，分散于100mL的50mM、pH7.4的Tris‑HCl缓冲液中，沸水浴糊化20min，冷却至37℃后加入600U来源于灌浆期糯米籽粒的淀粉分支酶，恒温水浴反应6h，沸水浴10min灭酶，3000g离心5min去除沉淀，用5倍体积的无水乙醇分离淀粉产物，40℃烘干、粉碎即得淀粉糖原产品。该类淀粉糖原为短多分支淀粉（A链DP10‑20），适用于光敏性组分包埋保护、药物缓释等领域。
Description
技术领域
一种淀粉糖原的合成方法，涉及糯米来源的淀粉分支酶催化糯米淀粉和直链糊精底物形成类似动物糖原结构的高分支淀粉的合成过程，属于变性淀粉资源开发技术领域。
背景技术
在植物的su1突变体内存在一种高度支化的可溶性的α-D-葡聚糖，称为植物糖原。该葡聚糖具有与动物糖原几乎完全相同的链长和分支结构，分子量在105数量级，分支密度远高于支链淀粉，而平均链长则明显小于后者。目前国内外学者对其的研究集中在合成机理、性质及结构等方面。
淀粉分支酶是支链淀粉合成的关键酶，可以切断α-1,4糖苷键，同时以α-1,6糖苷键的形式将直链转移到支链上形成新的分支。目前国内外研究集中在利用淀粉分支酶作用单纯淀粉底物，考察该酶对淀粉回生、慢消化性等影响方面的研究。
本发明团队前期发现，灌浆期糯米来源的淀粉分支酶在体外可以将高直链的淀粉转化为分子量为105数量级的类似糖原结构的高度支化淀粉。当底物中直链淀粉（或直链糊精）的聚合度较低且分布集中时，所得的植物糖原分支程度提高且侧链分布更为集中。本发明即以DP10-20直链糊精和A链聚合度DP10-20的糯米淀粉为底物，利用灌浆期糯米籽粒淀粉分支酶合成短侧链高分支的淀粉糖原产品。
发明内容
本发明的目的是提供一种淀粉糖原的合成方法。
本发明的技术方案：一种淀粉糖原的合成方法，包括聚合度均一化底物糊精的制备、灌浆期糯米淀粉分支酶的筛选、淀粉糖原的酶法合成步骤，以聚合度DP10-20的直链糊精和A链DP10-20糯米淀粉为底物，利用从灌浆期糯米籽粒胚乳中提取的淀粉分支酶的转糖基作用来催化转化底物，将糊精接到糯米淀粉分支上，合成短链DP10-20、高分支化类似动物糖原的植物性淀粉糖原产品。合成步骤为：
1. 底物的制备与选择。底物一：糯米淀粉，平均链长DP为17.4，A链DP10-20；底物：DP10-20直链糊精，采用醇酸降解-聚乙二醇沉淀法获取DP10-20的直链糊精；
2. 灌浆期糯米籽粒淀粉分支酶的提取。采用的淀粉分支酶由灌浆12-15天的传统糯米籽粒胚乳中提取获得。称取50g灌浆12-15天的传统糯米籽粒，加入150mL的50mM、pH7.4的Tris-HC缓冲液，经匀浆、过滤、离心后获得粗酶液，并进一步过DEAE柱、ToyopearlHW-55F柱，收集活性成分并用SDS-PAGE电泳鉴定酶的组成与纯度，于4℃下储存，备用；
3．淀粉糖原的合成。按质量比1:1～1:2的比例称取A链DP10-20的糯米淀粉和DP10-20直链糊精，共10g，分散于100mL的Tris-HCl（50mM、pH 7.4）缓冲液中，沸水浴中加热20min至完全糊化，冷却至37℃，加入600U淀粉分支酶，于37℃振荡水浴中反应6h。沸水浴10min灭酶，3000g离心5min，去掉沉淀，清液用5倍体积的无水乙醇沉淀，5000g下离心15min。沉淀用乙醇反复洗涤三次，于40℃烘箱中过夜，干燥、粉碎得到淀粉糖原产品。
4. 淀粉糖原分子结构鉴定。采用高效排阻色谱联合多角度激光检测器检测淀粉糖原的分子量和分散系数；利用异淀粉酶对淀粉糖原进行脱支处理，用高效阴离子色谱分析其侧链分布。结果证明淀粉糖原产品的平均分子量为105 Da数量级，分散系数小于1.4，侧链链长DP10-20，呈非晶簇状，具有与动物糖原相似的结构与空间多维包埋能力。
本发明的有益效果：与现有技术相比，本发明提供了一种短链多分支淀粉糖原的体外制备方法，具有底物利用率高，副产物少，多维空间包埋性能优越等优点。
具体实施方式
实施例1
淀粉分支酶的提取：称取50g灌浆12-15天的传统糯米籽粒，加入150mL的Tris-HCl（50mM、pH 7.4）缓冲液，经匀浆、过滤、离心后获得粗酶液，并进一步过DEAE柱、ToyopearlHW-55F柱，收集活性成分并用SDS-PAGE电泳鉴定酶的组成与纯度，于4℃下储存，备用。
采用醇酸降解-聚乙二醇沉淀法获取DP10-20的糊精：称取50g木薯淀粉分散于500mL正丁醇中，加入5mL浓盐酸，于40℃下水解3d，加入1M NaNO3终止反应，4000g离心15min，用50%乙醇洗涤沉淀数次至无氯离子，40℃烘箱干燥24h，粉碎，过筛。将水解的淀粉用蒸馏水配置成100mL 的3.2%的糊精溶液，逐步加入数均分子量8000Da的聚乙二醇（化学纯），加热搅拌至聚乙二醇溶解，在空气中自然冷却到25℃，置于25℃水浴锅24h，于4000g下离心20min。取聚乙二醇加入量在50-60g之间离心得到的浓相，用三氯甲烷洗涤除去残留的聚乙二醇，40℃干燥24h，粉碎，所得糊精的重均分子量为2.440×103Da，分散系数为1.27。
分别以1:1的比例称取该糊精和糯米淀粉共10g，分散于100mL Tris-HCl（50mM、pH7.4）缓冲液中并于沸水浴中加热20min至完全糊化，冷却至37℃，加入600U淀粉分支酶，于37℃振荡水浴中反应6h。沸水浴10min灭酶，3000g下离心5min，去掉沉淀，清液用5倍体积无水乙醇沉淀，5000g下离心15min。沉淀用乙醇反复洗涤三次，于40℃烘箱中干燥过夜，粉碎，得到重均分子量为4.578×105 Da，分散系数为1.24的淀粉糖原，其分支侧链的DP为10-17，平均链长DP为11.3。
实施例2
称取50g灌浆12-15天的传统糯米籽粒，加入150mL的Tris-HCl（50mM、pH 7.4）缓冲液，经匀浆、过滤、离心后获得粗酶液，并进一步过DEAE柱、Toyopearl HW-55F柱，收集活性成分并用SDS-PAGE电泳鉴定酶的组成与纯度，于4℃下储存，备用。
采用醇酸降解-聚乙二醇沉淀法获取DP10-20的糊精：称取50g木薯淀粉分散于500mL正丁醇中，加入5mL浓盐酸，于40℃下水解3d，加入1M NaNO3终止反应，4000g离心15min，用50%乙醇洗涤沉淀数次至无氯离子，40℃烘箱干燥24h，粉碎，过筛。将水解的淀粉用蒸馏水配置成100mL 的3.2%的糊精溶液，逐步加入数均分子量8000Da的聚乙二醇（化学纯），加热搅拌至聚乙二醇溶解，在空气中自然冷却到25℃，置于25℃水浴锅24h，于4000g下离心20min。取聚乙二醇加入量在50-60g之间离心得到的浓相，用三氯甲烷洗涤除去残留的聚乙二醇，40℃干燥24h，粉碎，所得糊精的重均分子量为2.440×103Da，分散系数为1.27。
以2:1的比例称取该糊精和糯米淀粉共10g，分散于100mL Tris-HCl（50mM、pH7.4）缓冲液中并于沸水浴中加热20min至完全糊化，冷却至37℃，加入600U淀粉分支酶，于37℃振荡水浴中反应6h。沸水浴10min灭酶，3000g下离心5min，去掉沉淀，清液用5倍体积无水乙醇沉淀，5000g下离心15min。沉淀用乙醇反复洗涤三次，于40℃烘箱中干燥过夜，粉碎，得到重均分子量为5.339×105 Da，分散系数为1.31的淀粉“糖原”，其分支侧链的DP为10-20，平均链长DP为14.1。
Claims (2)
1.一种淀粉糖原的合成方法，其特征在于包括聚合度均一化底物糊精的制备、灌浆期糯米淀粉分支酶的筛选、淀粉糖原的酶法合成步骤；以聚合度DP10-20的糊精和A链DP10-20糯米淀粉为底物，利用从灌浆期糯米籽粒胚乳中提取的淀粉分支酶的转糖基作用来催化转化底物，将糊精接到糯米淀粉分支上，合成短链DP10-20、高分支化类似动物糖原的植物性淀粉糖原产品；
具体步骤为：
（1）底物的制备与选择：选取A链DP10-20的糯米淀粉和DP10-20直链糊精为底物；
聚合度均一化的DP10-20直链糊精，由木薯淀粉经过醇酸降解，8000Da的聚乙二醇逐步沉淀分级得到：称取50g木薯淀粉分散于500mL正丁醇中，加入5mL浓盐酸，于40℃下降解3d，加入1M NaNO3终止反应，4000g离心15min，用50%乙醇洗涤沉淀数次至无氯离子，40℃烘箱干燥24h，粉碎，过筛；将降解的淀粉用蒸馏水配置成100mL 的3.2%的糊精溶液，逐步加入数均分子量8000Da的聚乙二醇，加热搅拌至聚乙二醇溶解，在空气中自然冷却到25℃，置于25℃水浴锅24h，于4000g下离心20min，取聚乙二醇加入量在50-60g之间离心得到的浓相，用三氯甲烷洗涤除去残留的聚乙二醇，40℃干燥24h，粉碎，即为DP10-20直链糊精；
（2）灌浆期糯米籽粒淀粉分支酶的提取：采用的淀粉分支酶由灌浆12-15天的传统糯米籽粒胚乳中提取获得；称取50g灌浆12-15天的传统糯米籽粒，加入150mL的50mM、pH 7.4的Tris-HCl缓冲液，经匀浆、过滤、离心后获得粗酶液，并进一步过DEAE柱、Toyopearl HW-55F柱，收集活性成分并用SDS-PAGE电泳鉴定酶的组成与纯度，于4℃下储存，备用；
（3）淀粉糖原的合成：称取A链DP10-20的糯米淀粉和DP10-20直链糊精，质量比1:1～1:2，总共10g，分散于100mL的50mM pH 7.4的Tris-HCl缓冲液中，沸水浴中加热20min至完全糊化，冷却至37℃，加入600U淀粉分支酶，于37℃振荡水浴中反应6h；沸水浴10min灭酶，3000g离心5min，去掉沉淀，清液用5倍体积的无水乙醇沉淀，5000g下离心15min；沉淀用乙醇反复洗涤三次，于40℃烘箱中过夜，干燥、粉碎得到产品淀粉糖原。
2.根据权利要求1所述的淀粉糖原的合成方法，其特征在于所得到的淀粉糖原产品平均分子量为105 Da数量级，分散系数小于1.4，侧链链长DP10-20，呈非晶簇状，具有与动物糖原相似的结构与空间多维包埋能力。
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