CN101198703A - 生产糖原的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生产糖原的方法，所述方法包括用能合成糖原的分支酶在溶液中处理底物由此生产糖原的步骤，其中所述底物是主要通过α－1，4－葡萄糖苷键连接并且聚合度为4或更大的α－葡聚糖，而且开始反应前溶液中糖的数均分子量大于180，但是不超过150,000。这种分支酶的分支酶活性/降解活性可以是500或更低。这种分支酶可以是热稳定的分支酶。

Description

生产糖原的方法
技术领域
本发明涉及生产高分子量的高度分支α-葡聚糖尤其是糖原的方法。
背景技术
α-葡聚糖是α-D-葡萄糖的聚合物。自然界中存在多种形式的α-葡聚糖。α-葡聚糖中，典型的实例是糖原和淀粉。然而，糖原和淀粉在结构和物理性质上彼此明显不同。
糖原是动物、真菌、酵母和细菌的主要储存多糖。糖原是水溶性的并且形成乳白色溶液。已经很好地研究了动物体内糖原的分子结构。天然糖原是均聚葡聚糖(homoglucan)，其中通过α-1，4-葡萄糖苷键线性键合的葡萄糖(葡萄糖)的糖链通过α-1，6-葡萄糖苷键分支化，并且所得分支进一步分支而形成网络结构。天然糖原由α-1，4-葡糖苷连接的链组成，所述链的平均聚合度为约10-约14，并且通过α-1，6-葡萄糖苷键结合。天然糖原的分子量描述的各不相同，估计为约105-108。天然糖原以分子量为约107(β-颗粒)的颗粒或由β-颗粒聚集形成的更大颗粒(α-颗粒)出现。据认为细菌中糖原的结构类似于动物中糖原的结构。某些植物(例如甜玉米)中存在与糖原结构类似的葡聚糖，它们被称为植物糖原(phytoglycogen)。
淀粉是植物中的主要储存多糖，并且以水不溶性颗粒形式出现。这种颗粒含有两种不同的多糖。所述两种多糖是直链淀粉和支链淀粉。直链淀粉由α-1，4键连接的基本线性的D-葡萄糖单元组成。支链淀粉是被认为具有簇结构的分支聚合物。每个簇单元由α-1，4-连接的葡萄糖链组成，所述链的平均聚合度为约12-约24并且彼此通过α-1，6-葡萄糖苷键结合。所述簇单元进一步由平均聚合度为约30-约100的较长α-1，4-连接的葡萄糖链组成。按照聚合度，整个支链淀粉的平均链长度为约18-约25。与糖原类似，支链淀粉是由α-1，4-葡萄糖苷键和α-1，6-葡萄糖苷键结合的葡聚糖，但是糖原的分支程度比支链淀粉更高。
近来，已经证实糖原具有免疫刺激作用。因此，可以预期糖原用作免疫刺激剂、健康食品材料等。另外，可以预期糖原作为化妆品材料、食品材料(调味品材料)和其它工业材料的应用。糖原在多种工业领域中使用。糖原的应用包括例如微生物感染的治疗剂、湿润剂(例如有效改善皮肤保水的化妆品、防止嘴唇粗糙的化妆品)、复合调味料(例如具有扇贝(眼)味道的复合调味料)、抗肿瘤剂、形成发酵乳的加速剂、胶体颗粒聚集体、影响头发易梳性和光泽的改善头发表面摩擦阻力的物质、细胞活化剂(表皮细胞活化剂、成纤维细胞增殖剂等)、ATP生成促进剂、皮肤衰老症状如皱纹的改善剂、皮肤粗糙的改善剂、荧光颗粒表面处理剂和环状四糖(CTS；cyclo{→6)-α-D-glcp-(1→3)-α-D-glcp-(1→6)-α-D-glcp-(1→3)-α-D-glcp-(1→})合成的底物。糖原可以用于皮肤外用制剂中(例如化妆水、乳液、霜、精华素、生发剂、育发剂、面膜、唇膏、护唇霜、化妆粉底液、化妆粉底霜、粉底、眼影、腮红、香波、润丝、发用液剂、头发滋补剂、长效卷发剂、染发剂、处理(剂)、浴用剂、护手霜、护腿霜、护颈霜、爽身水等)、或眼用溶液等中。
来源于贝类(贻贝)的糖原和来源于甜玉米的植物性糖原已经上市，但是很昂贵并且主要用作化妆品中的湿润剂。作为试剂，来源于多种贝类或动物肝脏的糖原也已经上市，但是相当昂贵并且很难工业应用。
因此，期望大量提供廉价的糖原。
分支酶(系统名：1，4-α-D-葡聚糖：1，4-α-D-葡聚糖6-α-D-(1，4-α-D-葡聚糖)-转移酶，EC 2.4.1.18，在本说明书中也被称作BE)是一种酶，它切割α-1，4-葡萄糖苷键并且将所述键转移至另一个葡萄糖残基的6-位OH基而形成α-1，6-葡萄糖苷键。BE广泛分布在动物、植物、霉菌、酵母和细菌中，催化糖原或淀粉的分支键的合成。
在二十世纪七十年代已经详细研究了来源于马铃薯的BE的催化作用，并且已经证实BE催化分子间分支反应(图1A)。在二十世纪九十年代晚期已经证实BE催化环化反应(图1B)。通过证实这种环化反应，理论上估计，BE也催化分子内分支反应(图1C)。这是因为，从微观角度考虑，切割α-1，4-葡萄糖苷键、将该键转移至另一个葡萄糖残基中6-位上OH基、和形成α-1，6-葡萄糖苷键，这3种反应可以说是相同的。BE被认为是糖苷水解酶13家族(α-淀粉酶家族)的一个成员，并被认为其在单个活性中心通过与α-淀粉酶基本相同的机制催化切割α-1，4-葡萄糖苷键、将该键转移至另一个葡萄糖残基中6-位上OH基。
已经知道，通过使BE与另一种酶α-葡聚糖磷酸化酶一起作用于葡萄糖-1-磷酸和寡糖，或者通过使BE与糖原合成酶(或淀粉合成酶)一起作用于UDP-葡萄糖(或ADP-葡萄糖)，可以合成结构和性质与天然糖原类似的糖原。然而，α-葡聚糖磷酸化酶虽然是已经上市的试剂，但是相当昂贵。另外，很难获得糖原合成酶和淀粉合成酶。葡萄糖-1磷酸、UDP-葡萄糖和ADP-葡萄糖相当昂贵。因此，通过这种方法不能解决提供大量廉价糖原的问题。
大分子如葡聚糖通常不是均匀的分子，而是各种大小分子的混合物，因此根据数均分子量(Mn)或重均分子量(Mw)评估其分子量。Mn通过体系总质量除以体系中所含分子数来确定。也就是说，Mn是数目分数的平均值。另一方面，Mw是重量分数的平均值。如果是完全均匀的材料，Mw＝Mn，但是大分子通常具有分子量分布，因此Mw＞Mn。其遵循以下规律：随着Mw/Mn超过1以及更高，则分子量的不均匀性也更高(也就是说，分子量分布更宽)。
已知利用酶合成的直链淀粉(例如由Ajinoki Co.，Ltd制造的酶促合成直链淀粉)具有窄的分子量分布(在非专利文献4中，Mw/Mn＜1.2；在Fujii，K.et al.(2003)Biocatalysis and Biotransformation，Vol.21，pp.167-172中，Mw/Mn＝1.005-1.006)。另一方面，从自然界提取的直链淀粉具有相对较宽的分子量分布，Mw/Mn为约2-约5(描述于pp.347-429in Carbohydrates in food，edited by Eliasson，A.-C.，Marcel Dekker，Inc.，New York(1996)；Hizukuri，S.，Starch：analytical aspects中表15中的聚合度DP(数均DPn，重均DPw)。这些DP乘以162，得到各自的平均分子量)。
Mn可以通过评估分子数来确定。也就是说，直链淀粉等的Mn可以通过测量还原末端的数目来确定。还原末端的数目可以例如通过非专利文献7中描述的改良Park-Johnson方法来确定。Mn还可以例如通过非专利文献8中描述的凝胶过滤色谱法(MALLS方法)来确定，所述凝胶过滤色谱法利用示差折光计结合多角度激光光散射检测器。Mw可以通过非专利文献8中描述的MALLS方法来确定。
本说明书中，底物的分子量主要根据数均分子量(Mn)来评估，而产生的葡聚糖的分子量主要根据重均分子量(Mw)来评估。这是因为，当产物经过图1B中显示的环化反应时，Mn不能通过评估还原末端数的方法来正确地评估，还因为当评估非常大的分子的分子量时，还原末端数目相对较低，因此很难准确测量Mn，另外，因为通过MALLS法评估Mn的方法是基于这一前提：凝胶过滤的分级是完全的，因此当分级不完全时，准确评估Mn不可行。
已经有实例允许BE作用于支链淀粉或淀粉而产生高分子量的α-葡聚糖。并且有大量实例表明允许BE单独作用于α-葡聚糖(例如直链淀粉)。然而，没有实例表明允许BE作用于直链淀粉而产生分子量为约1,000,000或更高的高分子量α-葡聚糖。通过BE作用于支链淀粉得到的高分子量α-葡聚糖被认为在支链淀粉基本结构上具有更多分支，如非专利文献17中所示，并且可以说，没有合成糖原(具有球状结构)。例如，非专利文献1和2中描述了，来源于粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)的BE可作用于支链淀粉或直链淀粉，从而将它们转化为由6-葡萄糖单元的单元链组成的高度分支的糖原样分子。然而，术语“糖原样”只表示分子被碘染色的程度与糖原类似。其中用作底物的直链淀粉的数均聚合度为15、22或130，表明Mn分别为约2430、约3600和约21000。具体而言，非专利文献2描述了，来源于粗糙脉孢霉的BE可以作用于平均聚合度为15或22的短链直链淀粉，来源于植物的BE可以作用的直链淀粉的最小聚合度为30-40或更高。非专利文献2还描述了，已经提示来源于粗糙脉孢霉的BE作用于12个或更多残基的葡萄糖链，从而进行六糖作为最小单元的转移反应。从非专利文献1的图1和2以及非专利文献2的图3和4中可以看出，当来源于粗糙脉孢霉的BE作用于支链淀粉和直链淀粉时，这些底物的分子量不改变。另外，非专利文献1的图4和5以及非专利文献2的图5和6显示，得到了比底物分子稍大和稍小的分子，没有观察到明显高分子量的产物。
例如，非专利文献3描述了，当玉米BEI作用于平均链长度大于300的直链淀粉时，产物在凝胶过滤中的洗脱时间出现延迟，这种延迟是由于形状的改变，而不是由于分子量的改变。
例如，非专利文献4描述了，随着反应时间的延长，BE(具体而言，Q酶)作用于直链淀粉得到的支链淀粉样分子的分子量降低。
例如，非专利文献5描述了，当来源于马铃薯的BE(Q酶)作用于Mw为67600的直链淀粉时，可以得到Mw为33500的反应产物。
例如，非专利文献6描述了，当来源于马铃薯的BE(Q酶)作用于Mn为200,000的直链淀粉时，可以得到Mw为22,000的葡聚糖。
例如，非专利文献7描述了，当来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)的BE作用于Mw为302,000的酶促合成直链淀粉时，发生环化作用而降低它们的分子量。注意到，已知用作底物的酶促合成直链淀粉具有窄分子量分布。例如，根据非专利文献4的酶促合成直链淀粉的Mw/Mn＜1.2；根据Fujii，K.et al.(2003)Biocatalysis andBiotransformation，Vol.21，pp.167-172的酶促合成直链淀粉的Mw/Mn＝1.005-1.006。根据生产商Ajinoki Co.，Ltd的手册，酶促合成直链淀粉的Mw/Mn＜1.1。由此，用于这个文献的酶促合成直链淀粉的近似Mn为约252,000-302,000。因此，可以通过Mw除以1.1大概估计酶促合成直链淀粉的Mn。
例如，非专利文献8描述了，当来源于风产热菌(Aquifex aeolicus)的BE作用于α-葡聚糖时，可以得到环化的葡聚糖。这意味着，葡聚糖被降解为较低分子量的产物，如图1B所示。
例如，非专利文献9描述了，当来源于蜡质芽孢杆菌(Bacillus cereus)的BE作用于各种大小的酶促合成直链淀粉时，从所有酶促合成直链淀粉得到几乎相同大小的葡聚糖(图5.8)。另外，由这个文献的图5.9显而易见，没有检测到分子量大于约1,000,000的组分。另外，从这个文献的图5.13中的反应模型可知，不能预期高度分支和高分子量α-葡聚糖的形成。由图1显而易见，在BE的分子间分支反应中既产生了比原始分子大的又产生比原始分子小的分子(图1A)；在环化反应中产生比原始分子小的分子(图1B)；在分子内分支反应中(图1C)，反应前后分子量没有变化。因为这些反应的机制是相同的，不能预期这3种反应以明显不同的频率发生。事实上，非专利文献9的图5.8的结果表明，所有3种反应都是被催化的，只是根据底物分子量有些差异，导致了由任意大小的直链淀粉形成相同大小的葡聚糖。为了由直链淀粉得到分子量为1,000,000或更大的高分子量葡聚糖，(A)的分子间分支反应需要以压倒性优势更高的频率来催化，并且在所得的分子中，较大分子需要经过进一步继续聚合方向的反应。这不能从BE的常规催化机制中预期，并且没有获得有此提示的结果。
专利文献2描述了生产聚合度为50-5000、具有内部分支环状结构部分和外部分支结构部分的葡聚糖的方法，所述方法包括使BE(具体而言，分支酶)作用于直链淀粉、部分降解的淀粉、脱支淀粉、用磷酸化酶催化合成的直链淀粉、麦芽寡糖等。在此方法中，底物被环化并且由BE形成较低分子量的分子，从而产生聚合度为50-5000并且最大聚合度为10,000的环状葡聚糖。在此方法中，通过将底物形成低分子量分子得到产物，因此使用高分子量分子作为底物。这从段落0066的描述中是显而易见的，其中描述可以优选使用聚合度约400或更高的直链淀粉。聚合度为400的直链淀粉的分子量为约65,000，从该专利公开中不能显而易见地看出是否可以用低分子量直链淀粉作为底物获得高分子量α-葡聚糖。
如上所述，目前为止认为，当BE作用于直链淀粉时，直链淀粉被转化为较低分子量的分子，或者即使某个分子的分子量可以增加，也很少有分子经历聚合而增加其分子量，并且产物的分子量几乎不改变。
另外，据报道，通过BE作用于直链淀粉得到的α-葡聚糖与糖原不同，其差异在于α-葡聚糖易于被支链淀粉酶(pullulanase)降解(非专利文献10和16)。还有文献描述，通过BE作用于直链淀粉得到“糖原”(例如，非专利文献18(Walker et al.，Eur.J. Biochem.(1971)Vol.20，pp.14-21))，但是在这个文献中，没有测量所得葡聚糖的分子量，也没有分析其可消化性。
另外，还有很多实例，其中为了检验酶的性质使BE作用于直链淀粉(例如，专利文献3和非专利文献11-12)。然而，这些实例中没有一个测量了反应产物的分子量。
已知BE(尤其是来源于植物的BE)几乎不作用于短链直链淀粉。例如，非专利文献13描述了，BE几乎不作用于聚合度为40或更低的直链淀粉(分子量为约6480)。这可能是因为BE需要底物直链淀粉具有某种较高级结构，但是不具有某种长度的直链淀粉不能有这种较高级结构(非专利文献14)。另外，认为这种较高级结构与温度有关，当温度高时，直链淀粉没有这种较高级结构。
来源于细菌的BE似乎作用于短的底物(非专利文献15)，但是已知它的作用很弱(非专利文献9，图4.5)。
由前述，不能预期由直链淀粉作为底物通过BE合成分子量为1,000,000或更大的高度分支和高分子量的葡聚糖，更进一步，也不能预期支链淀粉酶和α-淀粉酶对高分子量葡聚糖的消化性较低。另外，由于对Mn为4800和9300的酶促合成直链淀粉的较低活性(与使用酶促合成的具有Mn为270,000的直链淀粉作为底物时的最大活性相比，约7％-12％活性。非专利文献9中图4.5)，使用Mn为8,000或更小(尤其Mn为4,000或更小)的直链淀粉作为底物的优势还没有想到。
另外，在生产糖原的常规方法中，也存在问题，为获得高纯度糖原必须有非常高的消耗，因为除非产物被高度纯化，否则电解质和单糖的含量较高。例如，在通过将BE加至蔗糖磷酸化酶和α-葡聚糖磷酸化酶而生产糖原的方法中，需要向反应溶液中加入约10mM磷酸，并且得到的反应产物含有大量果糖和少量磷酸(蔗糖+磷酸+寡糖→α-葡聚糖+果糖+磷酸)。在GP与BE组合的方法中，产物含有较大量的电解质(葡萄糖-1-磷酸+寡糖→α-葡聚糖+磷酸)。这还应用于糖原合成酶(GS)与BE组合的方法(ADP-葡萄糖+寡糖→α-葡聚糖+ADP)。
即使从天然产物中提取糖原，所述糖原也被多种物质如蛋白质、脂类和其它碳水化合物以及电解质污染，因此在获得高纯度的糖原中存在支出非常高的问题。
专利文献1：日本特许公开No.2000-316581
专利文献2：日本专利No.3107358，权利要求1，段0066
专利文献3：日本专利国家阶段PCT专利公开No.2002-539822
非专利文献1：Matsumoto et al.，J.Biochem，Vol.107，118-122(1990)(图2)
非专利文献2：Matsumoto and Matsuda，“Denpun Kagaku”(淀粉科学)，Vol.30，pp.212-222(1983)(图3和4)
非专利文献3：Boyer et al.，Starch/staerke 34 Nr.3，S.81-85(1982)(表1，图2和图3)
非专利文献4：Kitamura，Polymeric Materials Encyclopedia，Vol.10，pp.7915-7922(表2)
非专利文献5：Praznik et al.，Carbohydrate Research，227(1992)pp.171-182
非专利文献6：Griffin and Victor，Biochemistry Vol.7，No.9，September1968
非专利文献7：Takata，H.et al.，Cyclization reaction catalyzed bybranching enzyme.J.Bacteriol.，1996.178：pp.1600-1606
非专利文献8：Takata，H.et al.，J.Appl.Glycosci.，2003.50：pp.15-20
非专利文献9：Hiroki Takata博士论文(京都大学)1997(Studies onEnzymes Involved in Glycogen Metabolism of Bacillus Species)
非专利文献10：Charles Boyer and Jack Preiss，Biochemistry 1977，Vol.16，No.16，pp.3693-3699
非专利文献11：Shinohara，M.L.et al.，Appl Microbiol Biotechnol，2001.57(5-6)：pp.653-9
非专利文献12：Takata，H.et al.，Appl.Environ.Microbiol.，1994.60：pp.3096-3104
非专利文献13：Borovsky，D.，Smith，E.E.and Whelan，W. J.(1976)Eur.J.Biochem.62，307-312
非专利文献14：Borovsky，D.，Smith，E.E.and Whelan，W.J.(1975)FEBS Lett.54，201-205
非专利文献15：Okada et al.，“Denpun Kagaku”(淀粉科学)，Vol.30，pp.223-230(1983)
非专利文献16：Kitahata，S.and Okada，S.(1988)in Handbook ofamylase and related enzymes.Their sources，isolation methods，properties and applications.(The Amylase Research Society of Japan ed)，pp.143-154，Pergamon Press，Oxford
非专利文献17：Kawabata et al.(2002)J.Appl.Glycosci.Vol.49，No.3，273-279
非专利文献18：Walker et al.，Eur.J.Biochem.(1971)Vol.20，pp.14-21
发明内容
本发明要解决的问题
本发明的目的是，为了解决前面提到的问题，提供高度分支和高分子量的α-葡聚糖尤其是糖原的生产方法。
解决问题的手段
为了解决前面提到的问题，本发明人继续集中地研究，结果最终发现了具有比率(分支酶活性)/(分子量降低活性)为500或更小的BE具有合成糖原的能力，由此完成了本发明。
本发明的生产方法是生产糖原的方法，其包括使具有合成糖原能力的BE作用于底物来生产糖原的步骤，其中所述底物是α-葡聚糖，主要由α-1，4-葡萄糖苷键连接并且聚合度为4或更高，并且溶液中糖的数均分子量(Mn)在反应开始前大于180但是不超过150,000。
在一个实施方案中，(分支酶的分支酶活性)/(分支酶的分子量降低活性)可以为500或更小。
在一个实施方案中，BE可是是热稳定的分支酶。
在一个实施方案中，BE可以来源于嗜热菌或中温性菌。
在一个实施方案中，BE可以来源于选自产液菌属(Aquifex)、红嗜热盐菌属(Rhodothermus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、嗜热聚球蓝细菌属(Thermosynechococcus)和埃希氏菌属(Escherichia)的属的细菌。
在一个实施方案中，BE可以来源于选自风产液菌(Aquifexaeolicus)、嗜火产液菌(Aquifex pyrophilus)、Rhodothermus obamensis、海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、热速芽孢杆菌(Bacillus caldovelox)、热链形芽孢杆菌(Bacillus thermocatenulatus)、热溶芽孢杆菌(Bacilluscaldolyticus)、黄热芽孢杆菌(Bacillus flavothermus)、酸热芽孢杆菌(Bacillus acidocaldarius)、热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)、史氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)、Thermosynechococcus elongatus和大肠埃希氏菌(Escherichia coli)的细菌。
在一个实施方案中，BE可以来源于选自风产液菌、Rhodothermusobamensis、嗜热脂肪芽孢杆菌、热速芽孢杆菌、热链形芽孢杆菌、热溶芽孢杆菌和大肠埃希氏菌的细菌。
在一个实施方案中，BE的最佳反应温度可以不低于45℃并且不超过90℃。
在一个实施方案中，所述底物可以是脱支淀粉、脱支糊精或酶促合成的直链淀粉。
在一个实施方案中，开始反应前溶液中糖的Mn可以大于180并且小于4,000。
在一个实施方案中，开始反应前溶液中糖的Mn可以为4,000或更大以及8,000或更小，可以调节BE用量和反应时间，使得BE用量和反应时间的乘积为25,000 U·小时/g底物或更高。
在一个实施方案中，开始反应前溶液中糖的Mn可以为8,000或更大以及100,000或更小，可以调节BE用量和反应时间，使得BE用量和反应时间的乘积为40,000 U·小时/g底物或更高。
在一个实施方案中，开始反应前溶液中的糖的Mn可以为100,000或更大以及150,000或更小，调节BE用量和反应时间，使得BE用量和反应时间的乘积为150,000 U·小时/g底物或更高。
在一个实施方案中，本发明的方法可以进一步包括使4-α-葡聚糖基转移酶作用于Mn大于180并小于1,500的α-葡聚糖从而产生底物的步骤。
在一个实施方案中，所述Mn大于180并小于1,500的α-葡聚糖可以包含聚合度为4-7的麦芽寡糖。
在一个实施方案中，本发明的方法可以进一步包括使脱支酶作用于Mn为500或更大的低分支α-葡聚糖来生产底物的步骤。
在一个实施方案中，本发明的方法既不使用α-葡聚糖磷酸化酶，也不使用糖原合成酶。
在一个实施方案中，4-α-葡聚糖基转移酶可以与BE共存。
本发明的作用
根据本发明可以廉价地大量生产糖原。
本发明方法的优点在于，不需要高度纯化即可以活动含有非常少量电解质和单糖的糖原。因此，具有可以低成本获得高纯度糖原的优点。
附图说明
图1：图1是示意性显示BE的各种作用的图。图1A是显示BE催化分子间分支反应的图。图1B是显示BE催化环化反应的图。图1C是显示BE催化分子内分支反应的图。
图2：图2是显示由α-葡聚糖生产糖原的示意图。
图3：图3是显示利用各种量的BE所得产物的Mw的图表。
图4：图4是显示利用各种分子量的底物所得产物的Mw的图表。
图5：图5是反应的示意图，其中用脱支酶降解淀粉来得到直链淀粉，并且使BE与所述直链淀粉反应来生产糖原。
图6：图6是显示当使用异淀粉酶和各种量的BE来由淀粉生产α-葡聚糖时所得产物的Mw的图表。BE的量用U/g底物来表达。
图7：图7的示意图显示由麦芽五糖通过4-α-葡聚糖基转移酶生产直链淀粉，和由直链淀粉通过BE生产糖原。
图8：图8是显示利用各种DP(聚合度)的底物(G5、G6或G7)所得产物的Mw的图表。
图9：图9是显示在各种量的支链淀粉酶作用于通过本发明生产的糖原(空心三角、“目前生产的GLY)、试剂糖原(实心三角，“试剂GLY”)、蜡质玉米淀粉(实心圆，“蜡质”)或玉米淀粉(空心圆，“玉米淀粉”)之后所得产物的Mw的图表。
图10：图10是显示各种量的α-淀粉酶作用于通过本发明生产的糖原(空心三角、“目前生产的GLY)、试剂糖原(实心三角，”试剂GLY)、蜡质玉米淀粉(实心圆，“蜡质”)或玉米淀粉(空心圆，“玉米淀粉”)之后所得产物的Mw的图表。
图11A：图11A是具有合成糖原能力的BE的反应模型。
图11B：图11B是不具有合成糖原能力的BE的反应模型。
图12：图12的示意图显示，在来源于风产液菌VF5的BE作用于蜡质玉米淀粉情况下，酶量与产物Mw的关系。纵轴显示产物的Mw，水平轴显示BE添加量。
序列表自由文本
SEQ ID NO：1：编码来自风产液菌VF5的野生型BE的碱基序列；
SEQ ID NO：2：来自风产液菌VF5的野生型BE的氨基酸序列；
SEQ ID NO：3：编码来自Rhodothermus obamensis JCM9785的野生型BE的碱基序列；
SEQ ID NO：4：来自Rhodothermus obamensis JCM9785的野生型BE的氨基酸序列；
SEQ ID NO：5：编码来自嗜热脂肪芽孢杆菌TRBE14的野生型BE的碱基序列；
SEQ ID NO：6：来自嗜热脂肪芽孢杆菌TRBE14的野生型BE的氨基酸序列；
SEQ ID NO：7：编码来自嗜热脂肪芽孢杆菌1503-4R变种4的野生型BE的碱基序列；
SEQ ID NO：8：来自嗜热脂肪芽孢杆菌1503-4R变种4的野生型BE的氨基酸序列；
SEQ ID NO：9：编码来自热速芽孢杆菌IFO15315的野生型BE的碱基序列；
SEQ ID NO：10：来自热速芽孢杆菌IFO15315的野生型BE的氨基酸序列；
SEQ ID NO：11：编码来自热链形芽孢杆菌的野生型BE的碱基序列；
SEQ ID NO：12：来自热链形芽孢杆菌的野生型BE的氨基酸序列；
SEQ ID NO：13：编码来自热溶芽孢杆菌IFO15313的野生型BE的碱基序列；
SEQ ID NO：14：来自热溶芽孢杆菌IFO15313的野生型BE的氨基酸序列；
SEQ ID NO：15：编码来自Thermosynechococcus elongatus BP-1的野生型BE的碱基序列；
SEQ ID NO：16：来自Thermosynechococcus elongatus BP-1的野生型BE的氨基酸序列；
SEQ ID NO：17：编码来自大肠埃希氏菌W3110的野生型BE的碱基序列；
SEQ ID NO：18：来自大肠埃希氏菌W3110的野生型BE的氨基酸序列；
SEQ ID NO：19：编码来自水生栖热菌(Thermus aquaticus)的TaqMalQ的碱基序列；
SEQ ID NO：20：来自水生栖热菌的Taq MalQ的氨基酸序列；
SEQ ID NO：21：引物ECBEN-NCO的序列；
SEQ ID NO：22：引物ECBEC-HIN的序列；
SEQ ID NO：23：引物ROBEN-ECO的序列；和
SEQ ID NO：24：引物ROBEC-PST的序列。
最佳实施方式
在下文中将详细描述本发明。
本发明的方法是生产高度分支和高分子量α-葡聚糖(即糖原)的方法，其包括使具有合成糖原能力的BE在溶液中作用于底物来生产糖原的步骤，其中所述底物是主要由α-1，4-葡萄糖苷键连接并且聚合度为4或更高的α-葡聚糖，并且溶液中糖的数均分子量(Mn)在反应开始前大于约180但是不超过约150,000。
在本说明书中，“糖原”指一种糖类，其包含只通过α-1，4-葡萄糖苷键和α-1，6-葡萄糖苷键连接的D-葡萄糖作为组成单元，分子量为1,000,000Da或更高，并且当与50U/g底物量的支链淀粉酶在评估实施例1的条件下反应时，通过MALLS方法确定得到Mw为500,000 Da或更高的产物；当与300U/g底物量的α-淀粉酶在评估实施例2的条件下反应时，通过MALLS方法确定得到Mw为500,000 Da或更高的产物。当某种糖与50U/g底物量的支链淀粉酶在评估实施例1的条件下反应得到Mw为500,000 Da或更高的产物时，所述糖被称为“对支链淀粉酶降解有抗性”。当某种糖与300U/g底物量的α-淀粉酶在评估实施例2的条件下反应得到Mw为500,000 Da或更高的产物时，所述糖被称为“对α-淀粉酶降解有抗性”。其中，关于α-淀粉酶的活性，1U α-淀粉酶活性是指，当酶与淀粉在pH 6.9在20℃下反应时在3分钟内从淀粉释放1mg麦芽糖所用的酶量。关于支链淀粉酶的活性，1U支链淀粉酶活性是指，当酶与最终浓度为1％的支链淀粉在pH 5.0、40℃下反应时，在反应早期阶段1分钟内产生相应于1μmol葡萄糖的还原力所需的酶量。
(1.分支酶)
“具有合成糖原能力的分支酶”是指在BE中具有合成糖原能力的BE。通过本领域已知的方法可以确定某种BE是否具有合成糖原的能力。也就是说，某种BE是否具有合成糖原的能力可以例如如下确定：通过使BE作用于直链淀粉，然后检查是否在溶液中产生了分子量为1,000,000Da或更高的高分子量α-葡聚糖，以及通过确定产生的高分子量α-葡聚糖是否对支链淀粉酶降解和α-淀粉酶降解有抗性。溶液中是否存在高分子量α-葡聚糖可以通过使用示差折光计结合多角度激光光散射检测器作为检测器的HPLC凝胶过滤分析方法来确定，如非专利文献8中描述。根据评估实施例1中的方法可以确定对支链淀粉酶降解的抗性。根据评估实施例2中的方法可以确定对α-淀粉酶降解的抗性。
根据本发明人的研究，在BE中，(分支酶活性)/(分子量降低活性)为500或更小的BE具有合成糖原的能力，而在BE中，(分支酶活性)/(分子量降低活性)大于500的BE不具有合成糖原的能力。
分支酶活性是降低直链淀粉-碘复合物在660nm处吸光率的活性，并且是基于BE切割α-1，4-葡萄糖苷键并将所述键转移至另一个葡萄糖残基上6-位OH基从而形成α-1，6-葡萄糖苷键来减少直链淀粉的直链部分的能力。
测量BE的分支酶活性的方法在本领域是已知的，并且例如在非专利文献8中描述。例如按照下面的方法测量BE的分支酶活性：首先，将50μL酶溶液加入50μL底物溶液(0.12％(w/v)直链淀粉(III型，由SigmaChemical制造))中开始反应。反应在BE的最佳反应温度下进行。BE作用10分钟之后，加入1mL 0.4mM盐酸溶液来终止反应。此后，加入1mL碘溶液，并且充分混合，随后测量反应混合物在660nm的吸光率。作为对照溶液，同时制备在加入酶溶液之前加入0.4mM盐酸溶液的溶液。通过将200μL 50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)加入100μL 1.2％(w/v)III型直链淀粉溶液(溶解在二甲基亚砜中)中，随后加入700μL蒸馏水并且充分混合所得混合物来制备底物溶液。将缓冲液的pH调至所用BE的最佳反应pH。通过混合0.5mL 1 N盐酸溶液与0.125mL储备液(2.6wt％ I2，26wt％KI水溶液)混合并且用蒸馏水调节混合物的体积至65mL来制备碘溶液。根据下列等式确定酶溶液的BE活性：
BE活性(单位(U)/mL)＝{[(对照溶液在660nm的吸光率)-(样品溶液在660nm的吸光率)]/((对照溶液在660nm的吸光率)}×100/10×20
本说明书中，BE活性主要用作对BE活性的量度。因此，简单的“活性”是指“BE活性”，简单的“单位”或“U”是指BE活性测量的“单位”或“U”。
分子量降低活性是本发明人定义的活性。分子量降低活性也被称为支链淀粉分子量降低活性。在本说明书中，1U分子量降低活性被定义为，当酶在与BE活性的测量温度和pH相同的温度和pH下(优选酶的最佳反应温度和最佳pH)反应16小时时将1g底物(蜡质玉米淀粉)的Mw降至400kDa所需酶的量。
例如按照下列方式测量分子量降低活性。首先，将100μl蒸馏水加入50mg蜡质玉米淀粉(WCS，由Sanwa Cornstarch Co.，Ltd.制造)并且充分搅拌。随后，加入900μl二甲基亚砜，在沸水浴中搅拌20分钟。向其中加入8.9ml蒸馏水，在沸水浴中另外搅拌10分钟。向这种溶液中加入100μl 1M Tris-HCl(pH 7.5)或1M磷酸缓冲液(pH 7.5)，搅拌并且用作底物溶液。将缓冲液的pH调至测量BE活性的pH。
将底物溶液分成体积为800μL/管。也就是说，每管含4mg WCS。随后，以合适量XμL/管加入适当稀释的BE溶液以及按(200-X)μL/管的量加入稀释剂来开始反应。将反应温度调至测量BE活性的温度。稀释剂是含0.05％Triton X-100的10mM磷酸钾缓冲液(将pH调至测量BE活性的pH)。当反应时间达到16小时时，通过加入1N HCl将反应溶液的pH降至3-4，并且在100℃加热反应溶液10分钟来终止反应。对于BE的热稳定性非常低的情况，可以仅仅通过在100℃加热反应溶液10分钟来终止反应。
反应终止之后，通过0.45-μm过滤器过滤反应溶液，测量反应溶液中所含产物的Mw。调节BE的量，使得Mw落在2500kDa-200kDa范围内。Mw的测量通过下面“所产生葡聚糖的重均分子量(Mw)的测量方法”中描述的进行。
将计算的Mw(kDa)的对数标注在纵轴(y-轴)上，而将使用的酶量(μL)标注在水平轴(x-轴)上，使用Microsoft Corporation生产的软件MS-Excel绘制幂近似曲线(power approximation curve)。也就是说，用方程y＝cxb(c和b分别是常数)绘制近似曲线。通过将y＝400(kDa)代入所得方程，计算将底物WCS(4mg)的Mw降至400kDa所需的酶量V1(μL)。通过将酶的量V1(μL)转换为每1g底物的酶量，计算1U分子量降低活性所需的酶量V2(mL)(＝(V1μL/1000)×(1000mg/4mg)(mL))。酶溶液的分子量降低活性E1是单位分子量降低活性的倒数(E1＝1/V2)(U/mL)。
(BE活性)/(分子量降低活性)的上限为约500，更优选地为约400，又更优选为约300，进一步更优选为约200，最优选为约100。(BE活性)/(分子量降低活性)没有具体的下限。下限可以为约1或更大，约5或更大，或者约10或更大。
(BE活性)/(分子量降低活性)为约500或更低的BE具有合成糖原能力的机制不是显而易见的。这种机制可能基于下面描述的原理，但是并不受这种原理的限制：
为了通过BE合成高分子量的α-葡聚糖，图1中显示的分子间分支反应必须以比环化反应和分子内分支反应更高的频率发生。利用低分子量直链淀粉作为底物实现高频率的分子间分支反应。不仅高频率的分子间分支反应，而且连续和优先使用分支分子作为底物也是必需的。所述分支分子，在维持它们的大的结构单元的同时，必须接受BE的作用。这参考反应模型(图11A)进行描述。首先，将2分子的直链淀粉转化为具有一个α-1，6-键的分子。随后，用所得分子作为底物产生具有两个α-1，6-键的分子。另外，通过优先使用所述分支分子作为底物，产生了少量大分子α-葡聚糖分子和大量低分子的分子。
另一方面，对于不优先使用分支分子作为底物的BE，或者即使使用分支分子，当以破坏大结构单元的方式使用分支分子时，产生大量分支分子并且很少产生进一步的大分子(图11B)。
当整个反应体系中α-1，6-键的百分比为约10-12％时，BE的反应在任一情况下都不再进行。
在此描述BE的支链淀粉分子量降低作用。如日本专利No.3107358所示，通过使BE作用于支链淀粉的簇结构并且使之环化来引起这种反应。在这种情况下，BE作用于分支分子，从而环化所述簇结构连接中的单元链，同时维持大结构单元。因此，认为具有相对高的支链淀粉分子量降低活性的BE拥有优先使用分支分子并且用其作为反应底物、同时维持大结构单元的特性。
另外，根据本发明人的研究，所有目前已知的热稳定BE具有合成糖原的能力。另一方面，在最佳反应温度较低的中温BE中，存在不具有合成糖原能力的BE。
具有合成糖原能力的BE优选地是热稳定BE。热稳定BE是指当在各种反应温度下进行BE活性测量时，最佳反应温度为45℃或更高的BE。
具有合成糖原能力的BE的最佳反应温度为约45℃或更高，和约90℃或更低。在本说明书中，“最佳反应温度”是指当只改变温度进行前面提到的BE活性测量时，BE活性最高的温度。最佳反应温度优选为约45℃或更高，更优选为约50℃或更高，又更优选为约55℃或更高，尤其优选为约60℃或更高，最优选为约65℃或更高。尽管最佳反应温度没有上限，所述最佳反应温度优选为约90℃或更低，更优选为约85℃或更低，又更优选为约80℃或更低，尤其优选为约75℃或更低。
具有合成糖原能力的BE更优选为来源于嗜热菌或中温性菌的BE。在本说明书中，“嗜热菌”是最佳生长温度为约50℃或更高并且在约40℃或更低的温度下几乎不生长的微生物。嗜热菌分为中度嗜热菌和极度嗜热菌。“中度嗜热菌”是指最佳生长温度为约50℃-约70℃的微生物。“极度嗜热菌”是指最佳生长温度为约70℃或更高的微生物。极度嗜热菌中，最佳生长温度为约80℃或更高的微生物称为“嗜高温菌”。相反，“中温性菌”是指最佳生长温度为常温环境的微生物，尤其是最佳生长温度为约20℃-约40℃的微生物。
产生具有合成糖原能力的BE的嗜热菌优选属于产液菌属、红嗜热盐菌属、芽孢杆菌属或嗜热聚球蓝细菌属。产生具有合成糖原能力的BE的中温性菌优选属于埃希氏菌属。
具有合成糖原能力的BE更优选来源于选自下组的细菌：风产液菌、嗜火产液菌、Rhodothermus obamensis、海洋红嗜热盐菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、热速芽孢杆菌、热链形芽孢杆菌、热溶芽孢杆菌、黄热芽孢杆菌、酸热芽孢杆菌、热坚芽孢杆菌、史氏芽孢杆菌、Thermosynechococcus elongatus和大肠埃希氏菌，进一步更优选来源于选自下组的细菌：风产液菌、Rhodothermus obamensis、嗜热脂肪芽孢杆菌、热速芽孢杆菌、热链形芽孢杆菌、热溶芽孢杆菌和大肠埃希氏菌。请注意，近来经常将芽孢杆菌属的嗜热菌描述为Geobacillus菌属的细菌。例如，嗜热脂肪芽孢杆菌细菌是与Geobacillusstearothermophilus相同的细菌。
在本说明书中，酶“来源于”某种生物的事实不仅意味着直接由该生物分离所述酶，而且表示以任意形式利用所述生物来产生所述酶。例如，对于从已经导入编码所述酶的基因的大肠埃希氏菌中分离该酶，其中所述酶来源于一种生物，在此情况下所述酶“来源于”所述生物。
SEQ ID NO：1显示了编码来自风产液菌VF5的野生型BE的碱基序列，SEQ ID NO：2显示了其氨基酸序列。在本说明书中，“野生型”BE不仅包括从原始生产BE的细菌所分离的BE，而且包括通过基因重组得到的、与野生型BE具有相同氨基酸序列的BE。非专利文献8和van derMaarel，M.J.E.C.et al.，Biocatalysis and Biotransformation，2003，Vol.21，pp.199-207中描述了克隆编码来自风产液菌VF5的野生型BE的碱基序列的方法。来源于风产液菌的BE具有极好的产生糖原的性质，特别是从多种Mn的底物。
SEQ ID NO：3显示了编码来自Rhodothermus obamensis JCM9785的野生型BE的碱基序列，SEQ ID NO：4显示了其氨基酸序列。非专利文献11和专利文献3中描述了克隆编码来自Rhodothermus obamensisJCM9785的野生型BE的碱基序列的方法。
SEQ ID NO：5显示了编码来自嗜热脂肪芽孢杆菌TRBE14的野生型BE的碱基序列，SEQ ID NO：6显示了其氨基酸序列。非专利文献9和12中描述了克隆编码来自嗜热脂肪芽孢杆菌TRBE14的野生型BE的碱基序列的方法。来源于嗜热脂肪芽孢杆菌TRBE14的BE具有极好的生产糖原的性质，特别是从低分子量底物。请注意，在芽孢杆菌属和埃希氏菌属的细菌中，除了ATG之外，也使用TTG和GTG作为起始密码子并且被翻译成甲硫氨酸，因此，SEQ ID NO：5中1-3位的TTG起到起始密码子的作用并且被翻译成甲硫氨酸。当利用含SEQ ID NO：5碱基序列的核酸分子在其它生物中表达BE时，1位的T通常被A代替。
SEQ ID NO：7显示了编码来自嗜热脂肪芽孢杆菌1503-4R变种4的野生型BE的碱基序列，SEQ ID NO：8显示了其氨基酸序列。Kiel，J.A.K.W.et al.，Mol.Gen.Genet.，1991，230：PP.136-144和EP0418945B1中描述了克隆编码来自嗜热脂肪芽孢杆菌1503-4R变种4的野生型BE的碱基序列的方法。SEQ ID NO：7中1-3位的TTG起到起始密码子的作用并且被翻译成甲硫氨酸。当利用含SEQ ID NO：7碱基序列的核酸分子在其它生物中表达BE时，1位的T通常被A代替。
SEQ ID NO：9显示了编码来自热速芽孢杆菌IFO15315的野生型BE的碱基序列，SEQ ID NO：10显示了其氨基酸序列。SEQ ID NO：9中1-3位的TTG起到起始密码子的作用并且被翻译成甲硫氨酸。当利用含SEQ ID NO：9碱基序列的核酸分子在其它生物中表达BE时，1位的T通常被A代替。
SEQ ID NO：11显示了编码来自热链形芽孢杆菌的野生型BE的碱基序列，SEQ ID NO：12显示了其氨基酸序列。SEQ ID NO：11中1-3位的TTG起到起始密码子的作用并且被翻译成甲硫氨酸。当利用含SEQID NO：11碱基序列的核酸分子在其它生物中表达BE时，1位的T通常被A代替。
SEQ ID NO：13显示了编码来自热溶芽孢杆菌IFO15313的野生型BE的碱基序列，SEQ ID NO：14显示了其氨基酸序列。SEQ ID NO：13中1-3位的TTG起到起始密码子的作用并且被翻译成甲硫氨酸。当利用含SEQ ID NO：13的碱基序列的核酸分子在其它生物中表达BE时，1位的T通常被A代替。
SEQ ID NO：15显示了编码来自Thermosynechococcus elongatusBP-1的野生型BE的碱基序列，SEQ ID NO：16显示了其氨基酸序列。
SEQ ID NO：17显示了编码来自大肠埃希氏菌W3110的野生型BE的碱基序列，SEQ ID NO：18显示了其氨基酸序列。
这些野生型BE的碱基序列和氨基酸序列是举例说明性的，并且知道可以天然发生与这些序列有微小变化的序列的变体(所谓等位基因变体)。除了含有这些示例性序列的BE之外，这些天然发生的变体和通过人工突变野生型BE产生的变体可以用于本发明的方法中，只要它们具有合成糖原的能力。例如，小册子WO2000/058445和专利文献3描述了来源于Rhodothermus obamensis的BE变体。BE变体优选具有与修饰前BE相同或高于它的活性。例如在某种实施方案中，用于本发明的BE的氨基酸序列可以与选自下组的氨基酸序列(即参考氨基酸序列)相一致(即100％一致性)：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：18；或者在另一个实施方案中，与参考氨基酸序列相比，这种氨基酸序列可以改变某些数目的氨基酸。这种改变可以选自缺失、替换(包括保守和非保守替换)或插入至少1个(优选1个或几个)氨基酸。这种改变可以发生在参考氨基酸序列的氨基端或羧基端，或者可以发生在不同于这些末端的任意位置。氨基酸残基的改变可以是单个残基散布，或者几个残基可以连续。本领域的技术人员可以轻松地选择具有期望特性的BE。作为替代，编码目标BE的基因可以直接化学合成。这种化学合成的方法在本领域是熟知的。
可以使用本领域熟知的方法进行对BE的修饰，例如通过进行定点突变，用诱变剂的突变(用诱变剂如亚硝酸盐处理对象基因，或用紫外线处理)或易错PCR。从容易获得目标突变体的角度来看优选使用定点突变，因为当使用定点突变时可以将目标修饰在目标位点导入。作为替代，可以直接合成含有目标序列的核酸分子。这种化学合成方法在本领域是熟知的。定点突变技术例如在Nucleic Acids Research，Vol.10，pp.6487-6500(1982)中描述。
对于前述修饰的设计，可以考虑氨基酸的疏水性指数。疏水氨基酸指数对赋予蛋白质相互作用生物功能的意义在本领域是普遍被认知的(Kyte，J and Doolittle，R.F.J.Mol.Biol.157(1)：105-132，1982)。氨基酸的疏水性质有助于所产生蛋白质的二级结构，并且随后定义蛋白质与其他分子(例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等)之间的相互作用。基于氨基酸的疏水性和其电荷性质分配氨基酸的疏水性指数。它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。
本领域熟知的是，用含有相似疏水性指数的另一种氨基酸替换某种氨基酸，从而可以产生仍然具有基本相似生物功能的蛋白质(例如酶活性基本相同的蛋白质)。这些氨基酸替换中，疏水性指数优选在±2以内，更优选在±1以内，又更优选在±0.5以内。本领域内应该理解，这种基于疏水性的氨基酸替换是高效的。如USP No.4,554,101中描述的，下面的亲水性指数分配给氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。应该理解，氨基酸可以用具有相似亲水性指数的另一种氨基酸替换，并且仍可以提供生物等价物。在这些氨基酸替换中，亲水性指数优选在±2以内，更优选在±1以内，又更优选在±0.5以内。
本发明中，“保守替换”是指在氨基酸替换中、在原始氨基酸和待替换氨基酸之间亲水性指数或/和疏水性指数相似的替换，如上所述。保守替换的实例对本领域的技术人员是熟知的，并且包括但不限于以下各组中的替换，例如：精氨酸和赖氨酸；谷氨和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
用于本发明方法中的BE可以从产生BE的天然存在微生物中分离。野生型BE可以例如从风产液菌VF5、嗜热脂肪芽孢杆菌或类似细菌中分离。为了举例说明从嗜热脂肪芽孢杆菌TRBE14分离BE的过程，首先，将嗜热脂肪芽孢杆菌TRBE14接种到适当的培养基中(例如L肉汤(1％胰蛋白胨(Difco Laboratories，Detroit，Mich.，USA)，0.5％Bacto-酵母提取物(Difco)，0.5％NaCl，pH 7.3)，在约50℃-约60℃过夜振荡培养。随后，将这种培养物离心来收集微生物细胞。将得到的细胞沉淀物悬浮在20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)中，随后通过超声破碎得到无细胞提取物。在约60℃的水浴中加热所述无细胞提取物约30分钟。加热之后，用离心机(Beckmann制造的AVANTI J-25I)离心所述无细胞提取物来除去不溶解的蛋白质，并由此得到上清液。所得上清液通过预先平衡的阴离子交换树脂Q-Sepharose，使BE被吸附到树脂上。用含100mM氯化钠的缓冲液洗涤树脂来除去杂质。随后，用含400mM氯化钠的缓冲液洗脱BE，得到来源于嗜热脂肪芽孢杆菌TRBE14的BE酶溶液。当需要进一步纯化时，如果需要可以通过组合以下分级分离来获得含来源于嗜热脂肪芽孢杆菌TRBE14的BE的溶液：Sephacryl S-200HR(Pharmacia制造)等的凝胶过滤色谱、或者Phenyl-TOYOPEARL650M(Tosoh Corporation制造)等的疏水色谱。来源于其它微生物物种的BE的纯化也可以通过同样的方式进行。
作为替代，用于本发明方法的BE可以如下获得：将含有编码BE碱基序列的核酸分子导入适当的宿主细胞中来表达BE，并且从所述宿主细胞或其培养液中纯化所表达的BE。
用胰蛋白酶处理这样得到的纯化BE，通过HPLC分离所得胰蛋白酶处理的片段，使用肽序列分析仪确定任意分离肽片段的N端氨基酸序列。随后，使用基于所鉴定氨基酸序列而制备的合成寡核苷酸探针，筛选适当的基因组文库或cDNA文库，从而可以得到包含编码野生型BE的碱基序列的核酸分子(也称为基因)。制备寡核苷酸探针和DNA文库、以及通过核酸杂交筛选它们的基本策略对本领域的技术人员是熟知的。例如，见Sambrook et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(edited by D.N.Glover，1985)；Oligonucleotide Synthesis(edited by M.J.Gait，1984)；and Nucleic Acid Hybridization(edited by B.D.Hames & S.J.Higgins，1984)。
作为替代，基于与某种BE基因碱基序列的同源性，对该BE基因所编码BE的碱基序列是已知的，可以利用包含至少一部分这种碱基序列的核酸探针通过杂交来进行筛选，从而获得含有另一种BE基因的核酸分子。这种方法在本领域是已知的。
作为替代，制备对应于多种BE氨基酸序列中保守区域的简并引物，进行PCR，可以获得所述BE的碱基序列。这种方法在本领域是已知的。
筛选基因组文库时，可以使用本领域技术人员熟知的方法亚克隆所得的核酸分子。例如，通过混合含有目标基因的λ噬菌体、适当的大肠埃希氏菌和适当的辅助噬菌体，可以容易地得到含有目标基因的质粒。此后，通过使用含有所述质粒的溶液转化适当的大肠埃希氏菌，可以亚克隆目标基因。通过培养所得转化体，可以得到质粒DNA，例如通过碱性SDS方法，并且可以确定目标基因的碱基序列。确定碱基序列的方法是本领域的技术人员熟知的。另外，使用基于DNA片段的碱基序列合成的引物，利用聚合酶链式反应(PCR)，利用例如风产液菌、Rhodothermusobamensis、嗜热脂肪芽孢杆菌、热速芽孢杆菌、热链形芽孢杆菌、热溶芽孢杆菌等的基因组DNA作为模板，可以直接扩增BE基因。
作为替代，还可以基于已知碱基序列化学合成BE基因(编码氨基酸序列例如SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，14，16或18的碱基序列(例如，SEQ ID NO：1，3，5，7，9，11，13，15或17的碱基序列))。
编码用于本发明方法中BE的氨基酸序列的碱基序列，与编码上述参考氨基酸序列的核苷酸序列(即参考核苷酸序列)相比，可以改变某些数目的核苷酸。这种改变可以选自缺失至少一个核苷酸、用至少一个核苷酸替换，包括转换和颠换、或者插入至少一个核苷酸。这种改变可以在参考核苷酸序列的5′端或3′端发生，或者可以在其它位置发生。碱基的改变可以是单个碱基散布或者可以几个碱基连续。
核苷酸改变可以在编码序列中产生无义、错义或移码突变，因此，可以进行由这种改变碱基序列所编码BE的改变。
当两种氨基酸序列彼此直接比较时，这些氨基酸序列优选在这些氨基酸序列之间是一致的，典型地至少约20％的氨基酸，优选至少约30％，更优选至少约40％，又更优选至少约50％，尤其优选至少约60％，约70％，约80％，约90％，约95％，约96％，约97％，约98％或约99％。
在本说明书中，使用GENETYX-WIN Ver.4.0(Genetics Co.，Ltd.)的最大匹配来计算序列的一致性百分比。这个程序比对待分析的序列数据、和待比较的序列数据，使得序列间匹配的氨基酸对最多，同时考虑替换和缺失，从而得到匹配、错配和间隙各自的评分，计算总和，输出最小总和的比对，并计算一致性(参考：Takashi，K.，and Gotoh，O.1984.Sequence Relationships among Various 4.5 S RNA Species J.Biochem.92：1173-1177)。在本说明书中，使用GENETYX-WIN Ver.4.0的最大匹配在匹配＝-1；错配＝1；间隙＝1；*N+＝2的条件下来计算序列的一致性百分比。
作为野生型酶或核酸分子，如本说明书中具体描述的(例如，SEQ ID NOS：1，2等)，可以使用具有与所述BE的氨基酸序列或编码所述BE氨基酸序列的碱基序列不一致、但是同源的序列的酶或核酸分子。这种与野生型酶或核酸分子同源的酶或核酸分子，当在GENETYX-WIN Ver.4.0的最大匹配中在上述条件下比较时，对于核酸，包括但不限于包含与比较对象序列有至少30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％一致性的碱基序列的核酸分子；对于酶，包括但不限于具有与比较对象序列有至少约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％一致性的氨基酸序列的酶。
与由选自序列表中所列出SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：17的碱基序列组成的核酸分子在严谨条件下杂交的核酸分子所编码的BE可以用于本发明的方法中，只要所述BE具有合成糖原的能力。本发明的方法还可以使用由包含修饰碱基序列的核酸分子编码的BE，只要所述BE具有合成糖原的能力，其中所述修饰碱基序列通过修饰与由选自序列表中所列出SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：17的碱基序列组成的核酸分子在严谨条件下杂交的核酸分子而得到。本领域的技术人员可以很容易地选择期望的BE基因。
如本文所用的，术语“严谨条件”是指在此条件下序列与特异性序列杂交、但不与非特异性序列杂交的条件。本领域技术人员熟知合适严谨条件的选择，并且在例如Molecular Cloning(Sambrook，et al.，supra)中描述。具体来说，所述条件例如意味着，可以使用这种条件来鉴定多核苷酸，在所述条件下，利用已经固定了来源于菌落或噬斑的滤膜在溶液中在65℃进行杂交，其中所述溶液包含50％甲酰胺、5×SSC(750mMNaCl，75mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5×Denhardt’s溶液(0.2％BSA，0.2％Ficoll 400和0.2％聚乙烯吡咯烷酮)、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml变性剪切的鲑精DNA，并在65℃用0.1-2倍浓度(1倍浓度的SSC溶液的组成为150mM氯化钠和15mM柠檬酸钠)的SSC(氯化钠-柠檬酸钠)溶液的条件下清洗滤膜。
用来生产本发明方法所用BE的核酸分子可以是相对于包含编码野生型BE碱基序列的核酸分子被保守性修饰的核酸分子。“相对于包含编码野生型BE碱基序列的核酸分子被保守修饰的核酸分子”是指包含编码与野生型BE氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列的碱基序列的核酸分子。“与野生型BE所编码氨基酸序列基本相同的氨基酸序列”是指具有与野生型BE酶活性基本相同的酶活性的氨基酸序列。由于遗传密码的简并性，很多功能等同的碱基序列编码指定的氨基酸序列。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在用GCA密码子表示丙氨酸的所有位置，所述密码子可以变为GCC、GCG或GCU，而不改变所编码的丙氨酸。类似地，对于可以由多个密码子编码的氨基酸，在由密码子表示氨基酸的所有位置，所述密码子可以变为任意另一种编码所述氨基酸的密码子，而不改变所编码的具体氨基酸。碱基序列的这种变异是“沉默突变”，是一种保守性修饰突变。本发明说明书中编码多肽的所有碱基序列还包括所述核酸的所有可能的沉默突变。沉默突变包括所编码氨基酸不改变的“沉默替换”和核酸最初不编码氨基酸的情况(例如，内含子部分的突变、其它未翻译区的突变等)。当某种核酸编码氨基酸时，沉默突变与沉默替换的意义相同。在本说明书中，“沉默替换”是指在碱基序列中，用另一种编码相同氨基酸的碱基序列替换编码特定氨基酸的碱基序列。基于遗传密码中的简并性现象，在存在多个碱基序列编码特定氨基酸(例如甘氨酸等)的情况下，这种沉默替换是可能的。因此，具有由沉默替换产生的碱基序列所编码氨基酸序列的多肽与原始多肽具有相同的氨基酸序列。本领域中，应该理解，为了生成功能等同的分子，可以修饰核酸中的各个密码子(除了通常编码甲硫氨酸的唯一密码子AUG和通常编码色氨酸的唯一密码子TGG之外)。因此，编码多肽的核酸的每种沉默突变隐含地包括在每个描述的序列中。优选地，可以进行这种修饰，使得避免替换半胱氨酸，其是严重影响多肽构象的氨基酸。
用于本发明中编码BE的碱基序列可以改变为符合生物中的密码子偏好，所述生物中导入所述序列用于表达。密码子偏好反映了在所述生物中高表达的基因中的偏好。例如，打算在大肠埃希氏菌中表达时，可以根据公开的密码子偏好表使序列对在大肠埃希氏菌中表达最优化(例如，Sharp，et al.，Nucleic Acids Research 16，No.17，p.8207(1988))。
使用包含上述修饰的碱基序列的核酸分子可以制备表达载体。本领域技术人员熟知那些利用特定核酸序列制备表达载体的方法。
当本发明说明书中提到核酸分子时，“载体”是指可以将目标碱基序列转移至目标细胞中的核酸分子。这种载体的实例包括可以在目标细胞中自主复制、或者可以整合入目标细胞染色体的载体，并且在适于转录修饰碱基序列的位置具有启动子。在本说明书中，所述载体可以是质粒。
如本文所用，“表达载体”是指可以在目标细胞中表达修饰碱基序列(即编码修饰BE的碱基序列)的载体。除了修饰碱基序列之外，表达载体还包含多种调控元件如调节其表达的启动子，如果需要，还包含在目标细胞中复制和选择重组体(例如复制起始(ori)，选择标记如药物抗性基因)必需的因子。在表达载体中，修饰碱基序列是可操作连接的，以便转录和翻译。调控元件包括启动子、终止子和增强子。另外，打算向细胞外分泌表达的酶时，编码分泌信号肽的碱基序列以正确的阅读框位于修饰碱基序列的上游。本领域技术人员熟知用于导入特定生物(例如细菌)的两种类型表达载体、和用于表达载体中的调控元件和其他因子的类型，可以根据目标细胞而改变。
如本文中所用，“终止子”是位于蛋白质编码区域下游的序列，并且参与终止通过将碱基序列转录为mRNA的转录，以及poly A序列。已知终止子通过参与mRNA的稳定性来影响基因的表达水平。
如本文中所用，“启动子”是指DNA上确定基因转录起始位点并且还直接调控转录频率的区域，它是RNA聚合酶结合的碱基序列，从而启动转录。由于启动子的区域在很多情况下通常是假想蛋白质编码区域的第一外显子上游约2kbp或更小的区域，当使用DNA分析软件预测基因组碱基序列中的蛋白质编码区域时，可以推断启动子区域。推断的启动子区域随着每个结构基因而变化，并且通常是在结构基因的上游，但不限于此，并且可以在结构基因的下游。优选地，推断启动子区域是第一个编码顺序翻译起始点上游约2kbp或更小的区域。
如本文中所用，“增强子”可以用来增强目标基因的表达效率。这种增强子在本领域是熟知的。可以使用多个增强子，或只使用一个增强子，或者根本不使用。
如本文中所用，“可操作连接”是指期望碱基序列置于转录和翻译调控序列(如启动子、增强子等)或影响表达(即操作)的翻译调控序列之下。为了使启动子与基因可操作连接，通常将启动子安排在基因的立即上游，但是不需要将启动子与所述基因邻接。
为了使修饰核酸序列可操作连接至前面提到的调控元件，在一些情况下应该加工目标BE基因。实例包括启动子和编码区之间距离过长、并且预期转录效率降低的情况，核糖体结合位点和翻译起始密码子之间距离不适当的情况等。加工手段的实例包括用限制酶消化、用核酸外切酶如Bal31和ExoIII消化、或者利用单链DNA如M13或PCR引入定点突变。
随后，将如上所述制备的表达载体导入细胞，从而表达BE。
如本文中使用的，酶的“表达”是指编码所述酶的碱基序列在体内或体外的转录或和翻译，以及所编码酶的生产。
导入表达载体的细胞(也称为宿主)包括原核生物和真核生物。考虑各种条件如易于表达BE、易于培养、生长速率和安全性，可以很容易地选择导入表达载体的细胞。例如，当BE用于合成糖原时，由于优选BE不合淀粉酶污染，优选使用不产生淀粉酶或只生产低水平淀粉酶的细胞。这种细胞的实例包括细菌和真菌。更优选细胞的实例包括中温性微生物(例如大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis))。细胞可以是微生物细胞，或者可以是植物或动物细胞。根据所使用的细胞，本发明的酶可以是经过翻译后加工的酶。
在本发明的方法中，将表达载体导入细胞的技术可以是任意本领域已知的技术。这种技术的实例包括例如转化、转导和转染。这种导入核酸分子的技术在本领域是熟知的，并且是常规技术，并且例如描述于Ausubel F.A.，et al.ed.(1988)，Current Protocols in MolecularBiology，Wiley，New York，NY；Sambrook J，et al.(1987)MolecularCloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY，和别册实验医学《遗传子导入和发现解析实验法》羊土社，1997(Bessatsu Jikken-igaku″Idenshidounyu &Hatsugen kaiseki jikkenhou″，Yodosha，1997)。
(2.底物)
在本发明中，使用聚合度为4或更高的、主要由α-1，4-葡萄糖苷键连接的α-葡聚糖作为底物。
在本说明书中，“α-葡聚糖”是指包含D-葡萄糖作为结构单元、并且具有至少2个或更多由α-1，4-葡萄糖苷键连接的葡萄糖残基的糖。α-葡聚糖可以是直链、支链或环状分子。直链α-葡聚糖与α-1，4-葡聚糖的意义相同。直链α-葡聚糖中，葡萄糖残基仅用α-1，4-葡萄糖苷键连接。包含一个或多个α-1，6-葡萄糖苷键的α-葡聚糖是支链α-葡聚糖。α-葡聚糖优选包含某种程度的直链节段。更优选没有分支的直链α-葡聚糖。
在本说明书中，“主要用α-1，4-葡萄糖苷键连接”意味着，葡萄糖残基主要用α-1，4-葡萄糖苷键连接。术语“主要”意味着，α-1，4-葡萄糖苷键占葡萄糖残基之间键的50％或更多。除了α-1，4-葡萄糖苷键之外，葡萄糖残基之间的键可以是任意键，通常是α-1，6-葡萄糖苷键。
在一些情况下优选使用含有少量分支(即α-1，6-葡萄糖苷键的数量)的α-葡聚糖作为底物。在这种情况下，每个分子中分支数目典型地为约0-约100，优选为约0-约50，更优选为约0-约25，约0-约10，约0-约5，进一步优选为约0。
α-1，6-葡萄糖苷键可以在α-葡聚糖内随机分布，或者可以均匀分布。优选在α-葡聚糖内形成5个或更多个葡萄糖残基的直链部分的分布。
用作本发明的底物的α-葡聚糖的聚合度为4(分子量666)或更大。作为底物的α-葡聚糖可以是均匀分子量的纯物质或含有各种分子量的分子的混合物。除了底物之外，可以将含不作为底物的葡萄糖的混合物加入溶液。工业上，通常使用含有各种分子量的分子的混合物用作原糖。
反应开始前溶液中糖的Mn大于约180，优选地约181或更大，更优选约182或更大，又更优选约183或更大，甚至更优选约184或更大，进一步更优选约185或更大。反应开始前溶液中糖的数均分子量可以例如是约190或更大，约195或更大，约200或更大，约250或更大，约300或更大，约350或更大，约400或更大，约450或更大，约500或更大，约550或更大，约600或更大，约650或更大，约700或更大，约750或更大，约800或更大，约850或更大，约900或更大，约950或更大，约1,000或更大，约1,500或更大，约2,000或更大或者约2,500或更大。葡萄糖(分子量180)或聚合度为3或更小的α-葡聚糖不能作为BE的底物，但是聚合度为4或更大的α-葡聚糖可以作为BE的底物。将大量葡萄糖加入少量底物中(例如，聚合度为4的那些)，混合物的Mn接近180。即使反应开始前溶液中糖类的Mn接近180，当存在聚合度为4或更大的α-葡聚糖时即能发生反应。因此，即使反应开始前溶液中糖的Mn接近180，只要溶液中包含聚合度为4或更大的α-葡聚糖，所述溶液可以在反应中使用。
本发明中用作底物的α-葡聚糖的分子量没有上限。反应开始前溶液中糖的Mn为约150,000或更小，优选约120,000或更小，更优选约100,000或更小，又更优选约80,000或更小，进一步更优选约50,000或更小，甚至更优选约20,000或更小，甚至更优选小于约8,000，最优选小于约4,000。具体而言，当含有低分子量α-葡聚糖的溶液用作底物时，其中反应开始前溶液中糖的Mn为约1,500或更大并且小于约4,000，其优势在于，可以非常容易地得到Mw为1,000,000或更大的高度分支的α-葡聚糖，其高度可溶于水，并且对支链淀粉酶和α-淀粉酶有高抗性。
在本发明中用作底物的α-葡聚糖可以仅由D-葡萄糖组成，或者可以是经过一定程度修饰的衍生物，其中BE的反应速率不降至20％或更低。α-葡聚糖优选不被修饰。
在本发明中用作底物的α-葡聚糖可以是天然直链淀粉，优选脱支淀粉，脱支糊精或酶促合成的直链淀粉。在一些情况下，天然直链淀粉含有一些分支结构。在脱支反应不充分的一些情况下，脱支淀粉和脱支糊精也含有一些分支结构。脱支淀粉可以是通过本领域已知的用异淀粉酶或支链淀粉酶降解淀粉得到的产物。用于得到脱支淀粉的淀粉的实例包括地下(underground)淀粉例如马铃薯淀粉、木薯淀粉、甘薯淀粉和野葛淀粉；地上(above-ground)淀粉例如玉米淀粉(蜡质玉米淀粉、高直链玉米淀粉等)、小麦淀粉、大米淀粉(例如，蜡质大米淀粉、非蜡质大米淀粉)，西米淀粉和豆子淀粉。脱支淀粉廉价、容易获得，因此尤其优选。还优选使用高直链玉米淀粉的α-1，6-葡萄糖苷键切割产物。
(3.其它酶)
(i.4-α-葡聚糖基转移酶)
本发明的生产方法可以进一步包括这种步骤：使4-α-葡聚糖基转移酶在溶液中作用于聚合物度为2或更高的α-葡聚糖，其中反应开始前溶液中糖的Mn大于180并且小于1,500，从而生产所述底物。
本发明的生产方法中，4-α-葡聚糖基转移酶可以与BE共存。
可用于本发明的4-α-葡聚糖基转移酶是将葡萄糖基或由两个或多个葡萄糖组成的单元从供体分子的非还原端转移至受体分子的非还原端。因此，这种酶反应导致最初提供的麦芽寡糖的聚合度不均匀。当供体分子和受体分子相同时，引起分子内转移，结果是得到具有环状结构的产物。基于它们的一级结构将4-α-葡聚糖基转移酶分为下面的6种类型：类型I、II、III、IV、V和其它(Takaha，T.and Smith，S.M.Biotechnol.Genet.Eng.Rev.Vol.16，pp.257-280(1999))。类型I称为环糊精葡聚糖基转移酶(在下文中称为CGTase，CGT酶)(EC 2.4.1.19)。类型II也称为歧化酶、D-酶、淀粉麦芽糖酶等(EC 2.4.1.25)(在下文中称为MalQ)。类型III是糖原脱支酶，也就是同时具有4-α-葡聚糖基转移酶活性和淀粉-1，6-葡萄糖苷酶活性的酶(EC 3.2.1.33+EC 2.4.1.25)。来源于嗜高温细菌的4-α-葡聚糖基转移酶被分类为类型IV和V。一些没有得到一级结构信息、但是报道了4-α-葡聚糖基转移酶活性的酶分类为“其它”。4-α-葡聚糖基转移酶活性可以基于Terada et al.(Applied and EnvironmentalMicrobiology，Vol.65，pp.910-915(1999))来确定。根据4-α-葡聚糖基转移酶的特性，可以调节测量的反应温度、反应pH等。
4-α-葡聚糖基转移酶存在于微生物和植物中。产生4-α-葡聚糖基转移酶的微生物的实例包括风产液菌、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、贝氏梭菌(Clostridium butylicum)、耐放射异常球菌(Deinococcus radiodurans)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、Thermococcus litralis、海栖热袍菌(Thermotoga maritime)、那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、火球菌属(Pyrococcus sp.)、嗜热网球菌(Dictyoglomus thermophilum)、布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、集胞蓝细菌物种(Synechosystis sp.)、大肠埃希氏菌(E.coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、水生栖热菌、嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)等。产生4-α-葡聚糖基转移酶的植物的实例包括块茎和块根植物例如马铃薯、甘薯、山药和木薯；谷类例如玉米、大米和小麦以及豆类例如豌豆和大豆。产生4-α-葡聚糖基转移酶的生物不限于这些。4-α-葡聚糖基转移酶可以商业获得或者可以通过本领域已知的方法从这些生物中制备，或者可以使用这些生物的脱支酶基因用基因重组方法制备。可以使用任意本领域已知的4-α-葡聚糖基转移酶。
CGT酶(EC 2.4.1.19)也是一种4-α-葡聚糖基转移酶，并且可以用在本发明的生产方法中。可以用在本发明中的CGT酶是能够催化麦芽寡糖的糖基转移反应(歧化反应)的酶。CGT酶是一种酶，其识别供体分子的非还原端6-8个葡萄糖的链并且影响转移反应使得这个部分环化，从而形成聚合度为6-8的环糊精和无环的极限糊精。
作为CGT酶，可以使用熟知的来源于微生物的CGT酶或者市售的CGT酶。优选地，可以使用来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的商品CGT酶((株)林原生物化学研究所，冈山)、来源于浸麻芽孢杆菌(Bacillusmacerans)的CGT酶(商品名：Contizyme，Amano Pharmaceutical Co.，Ltd.，Nagoya)或者来源于嗜碱芽孢杆菌种(Alkalophilic Bacillus sp.)A2-5a的CGT酶。更优选地，可以使用来源于嗜碱芽孢杆菌种A2-5a的CGT酶。嗜碱芽孢杆菌种A2-5a是日本特许公开No.7-107972公开的在碱性范围具有高活性的生产CGT酶的菌株，并且申请人已经在日本产业技术研究院、日本国家生物科学与人类科技研究所以保藏号No.FERMP-13864保藏。产生CGT酶的生物不限于这些。CGT酶可以是市售产品，或者可以通过本领域已知的方法从这些生物制备，或者可以使用这些生物的CGT酶基因用基因重组方法制备。可以使用任意本领域已知的CGT酶。在本发明的生产方法中，优选使用CGT酶以外的4-α-葡聚糖基转移酶。当CGT酶以外的4-α-葡聚糖基转移酶与BE共存时，与CGT酶与BE共存的情况相比，糖原的产率显著改善。
4-α-葡聚糖基转移酶优选与BE一起加入。然而，4-α-葡聚糖基转移酶可以在加入BE之前或之后加入，只要不对所产生糖原的分子量和产率有不利影响。当4-α-葡聚糖基转移酶与BE共存时，与单独使用BE的情况相比，糖原的产率显著改善。
(ii.Mn大于180并且小于1,500的α-葡聚糖)
当Mn大于180并且小于1,500的α-葡聚糖是单一物质时，所述α-葡聚糖的实例包括聚合度为2-9的麦芽寡糖。所述α-葡聚糖优选聚合度为3-8的麦芽寡糖，更优选聚合度为3-7的麦芽寡糖，又更优选聚合度为4-6的麦芽寡糖，尤其优选聚合度为4-5的麦芽寡糖，最优选聚合度为4的麦芽寡糖。
当Mn大于180并且小于1,500的α-葡聚糖是混合物时，所述混合物的实例包括包含聚合度为4-12的麦芽寡糖的混合物。除了聚合度为4-12的麦芽寡糖之外，Mn大于180并且小于1,500的α-葡聚糖可以包含低分子量糖例如葡萄糖。Mn大于180并且小于1,500的α-葡聚糖优选包含聚合度为4-7的麦芽寡糖，并且更优选是聚合度为4-7的麦芽寡糖。聚合度为4-7的麦芽寡糖还可以分别称为麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖和麦芽七糖。
(iii.脱支酶)
本发明的生产方法还可以包括使脱支酶作用于Mn为500或更高的低分支α-葡聚糖的步骤，从而生产底物。脱支酶是可以切割α-1，6-葡萄糖苷键的酶。脱支酶分为两种，异淀粉酶(EC 3.2.1.68)和α-糊精-内-1，6-α-葡糖苷酶(也称为支链淀粉酶)(EC3.2.1.41)，所述异淀粉酶良好地作用于支链淀粉和糖原，所述α-糊精内-1，6-α-葡糖苷酶良好地作用于支链淀粉(pullulan)。本发明的方法中既可以使用异淀粉酶也可以使用支链淀粉酶。脱支酶可以用于从廉价材料例如淀粉来生产主要由α-1，4-葡萄糖苷键连接的、聚合度为4或更高的α-葡聚糖。脱支酶活性可以基于Yokobayashiet al.(Biochim.Biophys.Acta，vol.212，pp.458-469(1970))来确定。根据脱支酶的特性，可以调节测量的反应温度、反应pH等。
脱支酶存在于微生物、原核生物和植物中。产生脱支酶的微生物的实例包括酿酒酵母和衣藻属(Chlamydomonas sp.)。产生脱支酶的原核生物的实例包括短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、酸性普鲁蓝芽饱杆菌(Bacillus acidopullulyticus)、浸麻芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、水生栖热菌、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、嗜温高温放线菌(Thermoactinomyces thalpophilus)、产乙醇热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)、介支淀粉假单胞菌(Pseudomonas amyloderamosa)、气味黄杆菌(Flavobacterium odoratum)、黄杆菌种(Falvobacterium sp.)、噬纤维菌种(Cytophaga sp.)、大肠埃希氏菌、嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)、Sulfolobus tokodaii、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)、Metallosphaera hakonensis。产生脱支酶的植物的实例包括马铃薯、甘薯、玉米、大米、小麦、大麦、燕麦和甜菜。产生脱支酶的生物不限于这些。脱支酶可以是市售的或者可以通过本领域已知的方法从这些生物制备，或者可以使用这些生物的脱支酶基因用基因重组方法制备。可以使用任意本领域已知的脱支酶。
脱支酶优选在加入BE之前加入反应溶液。
(iv.Mn为500或更大的低分支α-葡聚糖)
Mn为500或更大的低分支α-葡聚糖可以是天然α-葡聚糖。在本说明书中，“低分支”是指分支的频率低。低分支α-葡聚糖可以不含分支。在低分支α-葡聚糖中，假定α-1，6-葡萄糖苷键为1，α-1，4-葡萄糖苷键的数目相对于α-1，6-葡萄糖苷键的数目的比率优选为约10-约10000，更优选为10-约5000，进一步优选约15-约1000，进一步优选约20-约600。Mn为约500或更大的低分支α-葡聚糖的实例包括淀粉、直链淀粉、支链淀粉和它们的衍生物，或者它们的部分降解产物。淀粉的实例包括地下淀粉例如马铃薯淀粉、木薯淀粉、甘薯淀粉和野葛淀粉和地上淀粉例如玉米淀粉(蜡质玉米淀粉、高直链玉米淀粉等)、小麦淀粉、大米淀粉(例如，蜡质大米淀粉、非蜡质大米淀粉)，西米淀粉和豆子淀粉。直链淀粉的实例包括从这些淀粉分离的直链淀粉。支链淀粉包括从这些淀粉分离的支链淀粉。Mn为500或更大的低分支α-葡聚糖在本领域是已知的并且易于得到。
(4.生产糖原的方法)
在本发明的生产方法中，例如，使用具有合成糖原能力的BE、底物(即，主要由α-1，4-葡萄糖苷键连接的、聚合度为4或更高的α-葡聚糖)、缓冲剂和溶解它们的溶剂作为主要材料。所有这些材料通常在反应开始时加入，但是在这些材料中，可以在反应期间另外加入任意材料。如上所述，在本发明的生产方法中，必要时可以使用Mn大于180并且小于1,500的α-葡聚糖和4-α-葡聚糖基转移酶。在本发明的生产方法中，还可以使用Mn为500或更大的低分支α-葡聚糖和脱支酶。
本领域的技术人员很容易理解，可以通过适当选择本发明的生产方法中使用的底物量、酶量、反应时间等来得到具有期望分子量的α-葡聚糖。
相对于反应开始时溶液中的α-葡聚糖，反应开始时溶液中含有的BE量典型地为约100U/g底物或更高，优选约500U/g底物或更高，更优选约1,000U/g底物或更高。相对于反应开始时溶液中的α-葡聚糖，反应开始时溶液中含有的BE量典型地为约500,000U/g底物或更低，优选约100,000U/g底物或更低，更优选约80,000U/g底物或更低。如果使用的BE量过多，在反应期间变性的酶可能很容易聚集。如果使用的BE量过少，可能降低α-葡聚糖的产率。
使用的BE量与BE作用于底物(即α-葡聚糖)的时间有关。这是因为，如果使用的BE量少时，随反应时间增加而反应进行；如果使用的BE量大时，即使反应时间较短反应仍可以进行。因此，酶量与反应时间的乘积对反应产物的生产有显著影响。在本发明的方法中，优选调节BE用量和反应时间，使得BE用量和反应时间的乘积为约150,000U·小时/g底物或更高。在本说明书中，“U·小时/g底物”是指每g底物所用的酶量(U/g底物)和反应时间(小时)的乘积。BE用量和反应时间的乘积更优选为约160,000U·小时/g底物或更高，甚至更优选为约170,000U·小时/g底物或更高，甚至更优选为约180,000U·小时/g底物或更高，甚至更优选为约200,000U·小时/g底物或更高，甚至更优选为约250,000U·小时/g底物或更高，甚至更优选为约300,000U·小时/g底物或更高，和甚至更优选为约350,000U·小时/g底物或更高。即使BE以如下的量和时间作用于底物，仍然可以得到优选的结果：约400,000U·小时/g底物或更高，约500,000U·小时/g底物或更高，约600,000U·小时/g底物或更高，约700,000U·小时/g底物或更高，或者约800,000U·小时/g底物或更高。BE可以以很大量或者很长时间作用于底物，从而生产糖原。对于BE作用量和时间的乘积没有具体上限，但是太大量BE作用很长时间会使生产成本太高。BE作用量和时间的乘积例如可以为约10,000,000U·小时/g底物或更低，约8,000,000U·小时/g底物或更低，约50,000,000U·小时/g底物或更低，约10,000,000U·小时/g底物或更低，约8,000,000U·小时/g底物或更低，约5,000,000U·小时/g底物或更低，约1,000,000U·小时/g底物或更低等。
酶量和反应时间的乘积的优选范围根据反应开始前溶液中糖的Mn而变化。一般来说，反应开始前溶液中糖的Mn较低时，即使酶量和反应时间的乘积在任意范围内仍可以得到高分子量产物，并且所得产物的溶解度高。反应开始前溶液中糖的Mn越高，获得高溶解度和高分子量产物所需要的酶量和反应时间的乘积越高。
反应开始前溶液中糖的Mn低于约4,000时，本发明的方法中不特别限制BE用量和反应时间的乘积。例如，当该乘积为约25,000U·小时/g底物或更高时，可以得到高分子量产物。该乘积优选为约35,000U·小时/g底物或更高，更优选为约100,000U·小时/g底物或更高，最优选为约150,000U·小时/g底物或更高。
反应开始前溶液中糖的Mn为约4,000或更高并且小于约8,000时，BE用量和反应时间的乘积优选为约25,000U·小时/g底物或更高，更优选为约50,000U·小时/g底物或更高，最优选为约100,000U·小时/g底物或更高。
反应开始前溶液中糖的Mn为约8,000或更高并且小于约100,000时，BE用量和反应时间的乘积优选为约40,000U·小时/g物或更高，更优选为约100,000U·小时/g底物或更高，最优选为约150,000U·小时/g底物或更高。
反应开始前溶液中糖的Mn为约100,000或更高并且小于约150,000时，BE用量和反应时间的乘积优选为约150,000U·小时/g底物或更高，更优选为约200,000U·小时/g底物或更高，最优选为约300,000U·小时/g底物或更高。
用于本发明的方法中的溶剂可以是任意溶剂，只要所述溶剂不破坏BE的酶活性。
只要产生糖原的反应可以进行，所用溶剂不必要完全溶解根据本发明的方法中使用的材料。例如，用固体载体负载酶时，所述酶不必要溶解在溶剂中。另外，不必要所有的反应材料如α-葡聚糖被溶解，部分材料溶解就足够了，只要使反应可以进行即可。
代表性的溶剂是水。溶剂可以是细胞裂解物中的水，在制备上述BE时其伴随BE。
在包含具有合成糖原能力的BE和底物(即主要由α-1，4-葡萄糖苷键连接的、并且Mn大于180但不超过150,000的α-葡聚糖)的溶液中可以含有任意其它物质，只要其不妨碍BE和α-葡聚糖磷酸化酶之间的相互作用。这种物质的实例包括缓冲剂、产生BE的微生物(例如细菌、真菌)的成分、盐、和培养基成分。
这些待使用的材料的量是已知的，本领域的技术人员可以适当地选择。
在根据本发明的生产方法中，首先制备反应溶液。例如可以通过将具有合成糖原能力的BE和底物(即主要由α-1，4-葡萄糖苷键连接的、并且Mn大于180但不超过150,000的α-葡聚糖)加入适当的溶剂中来制备反应溶液。作为替代，反应溶液可以通过混合分别包含BE和底物(即主要由α-1，4-葡萄糖苷键连接的、并且Mn大于180但不超过150,000的α-葡聚糖)的溶液来制备。如果必要，可以向这种反应溶液中加入任意用于调节pH的缓冲剂，只要其不抑制酶反应。可以适当的选择反应溶液的pH，只要所用的BE可以在所述pH下表现出活性。反应溶液的pH优选地接近所用BE的最佳pH。反应溶液的pH典型地为约2或更高，优选为约3或更高，又更优选为约4或更高，尤其优选为约5或更高，进一步更优选为约6或更高，最优选为约7或更高。反应溶液的pH典型地为约13或更低，优选地为12或更低，更优选地为11或更低，又更优选地为10或更低，尤其优选地为9或更低，最优选地为8或更低。在一个实施方案中，反应溶液的pH典型地在3±所用BE最佳pH的范围内，优选在2±最佳pH范围内，更优选在1±最佳pH范围内，最优选在0.5±最佳pH范围内。
如果需要，可以向这种反应溶液中加入4-α-葡聚糖基转移酶和脱支酶。
基于反应开始时溶液中的α-葡聚糖，反应开始时溶液中所含4-α-葡聚糖基转移酶的量典型地为约0.1U/g底物或更高，优选为约0.5U/g底物或更高，更优选为约1U/g底物或更高。反应开始时溶液中所含4-α-葡聚糖基转移酶的量没有特定的上限，典型地为约50,000U/g底物或更低，优选为约10,000U/g底物或更低，更优选为约8,000U/g底物或更低，这是基于反应开始时溶液中的α-葡聚糖。如果所用4-α-葡聚糖基转移酶的量过高，反应期间变性的酶可以很容易聚集。如果所用4-α-葡聚糖基转移酶的量过小，可能降低α-葡聚糖的产率。
反应开始时溶液中所含脱支酶的量典型地为约10U/g底物或更高，优选为约50U/g底物或更高，更优选为约100U/g底物或更高，这是基于反应开始时溶液中的α-葡聚糖。反应开始时溶液中所含脱支酶的量没有特定的上限，典型地为约500,000U/g底物或更低，优选不高于约100,000U/g底物或更低，更优选为约80,000U/g底物或更低，这是基于反应开始时溶液中的α-葡聚糖。如果使用的脱支酶量过高，反应期间变性的酶可以很容易聚集。如果使用的脱支酶量过小，可能降低α-葡聚糖的产率。
如果需要，随后通过本领域已知的方法将反应溶液加热来开始反应。反应温度可以是任意温度，只要能得到本发明的效果。反应开始时反应溶液中BE活性为最佳反应条件下所确定活性的约5％-约100％时，反应温度可以典型地为约20℃或更高和约100℃或更低。优选这个反应步骤中的溶液温度使得在预定反应时间之后该活性保留反应开始前溶液中所含BE活性的约50％或更高，更优选约80％或更高。这个反应温度优选为约30℃或更高，更优选约40℃或更高，又更优选约50℃或更高，甚至更优选约55℃或更高，尤其优选约60℃或更高，最优选65℃或更高。这个反应温度为约90℃或更低，优选约85℃或更低，更优选约80℃或更低，甚至更优选约75℃或更低，尤其优选约70℃或更低，最优选约65℃或更低。
可以考虑反应温度、反应产生的α-葡聚糖的分子量和酶的剩余活性来选择反应时间。反应时间典型地是约1小时或更高，更优选约2小时或更高，又更优选约4小时或更高，最优选约6小时或更高。反应时间没有特定的上限，优选为约100小时或更低，更优选为约72小时或更低，又更优选约36小时或更低，最优选约24小时或更低。
在本发明的生产方法中，优选既不使用α-葡聚糖磷酸化酶也不使用糖原合成酶。
以此方式生产含糖原的溶液。通过本发明方法生产的糖原的Mw优选为约1,000,000(Da)或更高，更优选约2,000,000(Da)或更高，又更优选约5,000,000(Da)或更高，最优选约10,000,000(Da)或更高。通过本发明生产方法生产的糖原的Mw没有特定上限，例如可以合成Mw高达约50,000,000(Da)、高达约100,000,000(Da)或高达约1,000,000,000(Da)的糖原以实现极好的产率。可以通过本领域已知的方法确认得到的糖原的Mw。例如可以通过下列方法测量糖原的Mw。
首先，将合成的α-葡聚糖完全溶解在1N氢氧化钠中，并且用适量盐酸中和，随后含有约1μg-约300μgα-葡聚糖的溶液进行一起利用示示折光计和多角度激光光散射检测器的凝胶过滤色谱法来确定平均分子量。
具体而言，使用柱Shodex OH-Pack SB806MHQ(内径8mm，长度300mm，由Showa Denko K.K.制造)和保护柱Shodex OH-Pack SB-G(内径6mm，长度50mm，由Showa Denko K.K.制造)，将多角度激光光散射检测器(DAWN-DSP，由Wyatt Technology制造)和示差折光计(Shodex RI-71，由Showa Denko K.K.制造)按照这个顺序连接并且用作检测器。将柱保持在40℃，使用0.1M硝酸钠溶液作为洗脱剂，流速为1mL/分钟。分子量为约10,000或更高的α-葡聚糖在11分钟内从HPLC系统内洗脱，其中调节管道，使得Shodex制造的支链淀粉P-50(包含在GFC(水基GPC)的标准样品STANDARD P-82内)的峰在9.3分钟时洗脱出。具体而言，选择从洗脱开始至11分钟时的所有峰，使得包含示差折光计和多角度激光光散射检测器检出的峰作为数据，并且使用数据分析软件(商品名：STRA，由Wyatt Technology制造)收集数据，并用该软件分析确定Mw。这种方法在下文中称为MALLS方法。在这种分析方法中，不收集上述信号之后的信号，因此排除了分子量为约10,000或更低的葡聚糖。因此本发明中，根据MALLS方法确定的Mw不是反应溶液中所有葡聚糖的Mw，而是分子量为约10,000或更高的葡聚糖的Mw。另外，当HPLC柱和检测器之间管路的长度、内径等改变时，分子量为约10,000或更高的葡聚糖的洗脱时间可能改变。在这种情况下，本领域的技术人员可以适当地选择洗脱时间，使之适于通过根据本发明方法的MALLS方法利用上述支链淀粉P-50来确定Mw。
通过本发明方法生产的糖原与天然糖原类似，具有几乎不被支链淀粉和α-淀粉酶降解的特性。因此，通过本发明的方法生产的糖原可以与天然糖原相同的方式使用。
通过本发明的方法生产的糖原具有高溶解度的特性。根据本领域已知的方法可以确定所述溶解度。例如，将预定量的α-葡聚糖加入水中，搅拌预定的时间并且用过滤器过滤，得到滤出液，确定溶解在滤出液中的α-葡聚糖的量来计算加入的α-葡聚糖量与滤出液中溶解的α-葡聚糖量的比率，从而可以确定溶解度。也就是说，溶解度(％)＝{(滤出液中α-葡聚糖的量)/(过滤前溶液中α-葡聚糖的量)}×100。所产生的α-葡聚糖被干燥，在20℃时加入蒸馏水中至2mg/mL，在室温搅拌30秒，并且通过0.45-μm的过滤器过滤，在此条件下其溶解度优选为约20％或更高，更优选约30％或更高，又更优选约40％或更高，进一步更优选约50％或更高。
(糖原的用途)
通过本发明方法生产的糖原与常规的糖原类似，可以在例如免疫刺激剂、健康食品材料、化妆品材料、食品材料(调味料)和其它工业材料的应用中使用。
实施例
在下面的实施例中，使用生产实施例1、2、4、5、7和8中生产的各种BE作为BE。使用来源于介支淀粉假单胞菌的异淀粉酶(由林原生物化学研究所制造)作为脱支酶。基于Yokobayashi et al.(Biochim.Biophys.Acta，vol.212，pp.458-469(1970))确定脱支酶的活性。使用来源于水生栖热菌的MalQ(TaqMalQ)作为4-α-葡聚糖基转移酶。基于Terada et al.(Applied and Environmental Microbiology，vol.65，pp.910-915(1999))确定4-α-葡聚糖基转移酶的酶活性。
(生产实施例1：重组生产来源于风产液菌VF5的BE)
(A)制备风产液菌VF5 BE基因
化学合成编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的基因(SEQ ID NO：1)。将SD序列加在所述基因的翻译起始密码子的上游，并且在SD序列上游提供BamHI位点。在翻译终止密码子下游提供EcoRI位点。用BamHI和EcoRI切割这个合成基因来制备基因片段，随后利用T4-DNA连接酶将其连接入事先用BamHI和EcoRI切割的pUC19(由宝酒造株式会社制造)，得到质粒pAQBE1。
(B)风产液菌BE基因在大肠埃希氏菌中的表达
用这种质粒转化大肠埃希氏菌TG-1，将转化体稀释并且在含氨苄青霉素的LB琼脂培养基(100μg/ml氨苄青霉素，1％Difco制造的胰蛋白胨，0.5％Difco制造的酵母提取物，0.5％NaCl，1.5％琼脂，pH 7.3)上铺平板，以便得到独立的菌落，随后在37℃过夜培养。在这种含氨苄青霉素的LB琼脂培养基上增殖的大肠埃希氏菌具有所导入的质粒。可以用这种方式制造表达BE的大肠埃希氏菌。
在0.2升含终浓度为100μg/ml氨苄青霉素的L培养基(1％胰蛋白胨(Difco)，0.5％酵母提取物(Difco)，1％NaCl，pH 7.5)中在37℃培养用重组质粒pAQBE1转化的大肠埃希氏菌TG-1菌株，直到中对数生长期(约3小时)，随后加入最终浓度为0.1mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)。在37℃继续培养21小时，然后通过离心收集细胞。将这样得到的细胞用50ml缓冲液A(10mM磷酸钠缓冲液(pH 7.5))清洗，随后分散在20ml缓冲液A中，通过超声破碎细胞。将无细胞提取物在70℃加热30分钟使来源于大肠埃希氏菌的蛋白质变性，并用作BE酶溶液。这种BE酶溶液、与通过上述相同方式处理无pAQBE1大肠埃希氏菌得到的液体经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，比较它们的模式。结果是，证实了转化的大肠埃希氏菌TG-1菌株表达BE基因，并且产生由该基因编码的蛋白质。
(生产实施例2：重组生产来源于嗜热脂肪芽孢杆菌TRBE 14的BE)
通过非专利文献12中显示的方法由这个文献中所显示的携带质粒pUBE821的大肠埃希氏菌TG-1菌株来重组生产来源于嗜热脂肪芽孢杆菌TRBE 14的BE。
(生产实施例3：重组生产来源于水生栖热菌的MalQ(在下文中称为TaqMalQ))
通过Terada et al.(Applied and Environmental Microbillogy，vol.65，pp.910-915(1999))中显示的方法由这个文献中显示的携带质粒pFGQ8的大肠埃希氏菌MC1061菌株来重组生产TaqMalQ。
(生产实施例4：重组生产来源于大肠埃希氏菌的BE并测试其生产糖原的能力)
(操作)
用大肠埃希氏菌W3110菌株的染色体DNA作为模板，使用下列引物扩增大肠埃希氏菌BE基因。参考Hilden，I.et al.(2000)Eur JBiochem 267，2150-2155)设计引物，以便扩增全长大肠埃希氏菌BE结构基因。下面的表1A示出了设计的引物序列。
(表1A)
  引物1(N-端侧) ECBEN-NCO  GAACCATGGCCGATCGTATCGATAGAGACG(SEQ ID NO：21)NcoI位点
  引物2(C-端侧) ECBEC-HIN  CCCAAGCTTCATTCTGCCTCCCGAACC(SEQ ID NO：22)HindIII位点
使用宝生物公司制造的DNA聚合酶PyroBest根据推荐的方案进行PCR。将扩增片段插入pGEM-T Easy(由Promega制造)的TA克隆位点，所得质粒命名为pEBE1。用限制酶NcoI和HindIII处理pEBE1得到片段。将所得片段连接入事先用相同酶(NcoI和HindIII)处理的pTrc99A，在含有这种连接产物的溶液中转化大肠埃希氏菌TG-1。从转化的大肠埃希氏菌TG-1中分离质粒，所得质粒命名为pEBE2-1。
将携带pEBE2-1的大肠埃希氏菌TG-1在含有50μg/mL氨苄青霉素的培养基中37℃振荡培养，在晚对数期加入终浓度为0.1mM的IPTG，将转化体在37℃过夜培养。
通过离心收集细胞，将所得细胞沉淀物悬浮在10mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)中，通过超声破碎得到液体。离心这种液体，得到上清液，将上清液用作粗制酶液体。
制备用Q-Sepharose Fast Flow(Amersham-Pharmacia)填充的柱，用20mM Tris-HCl(pH 7)平衡树脂。将所述粗制酶液体施加到柱上，以便将粗制酶液体吸附到树脂上，随后用含0.1M NaCl的相同缓冲液，即含0.1M NaCl的20mM Tris-HCl(pH 7)洗涤树脂。用含0.2M NaCl的相同缓冲液(即含0.2M NaCl的20mM Tris-HCl(pH 7))洗脱BE活性。
将硫酸铵加入具有BE活性的洗脱液中至最终浓度0.3M，然后将其以下面的方式经过疏水色谱法来纯化BE酶。首先，制备用Phenyl-Toyopearl 650M(Tosoh Corporation)填充的柱，并且用含0.3M硫酸铵的20mM Tris-HCl(pH 7)平衡。将酶吸附到这种树脂上，随后用20mM Tris-HCl(pH 7)洗涤树脂。蒸馏水流过柱子来回收所述酶。以这种方式得到纯化的酶。
(测试合成糖原能力)
将直链淀粉A(Mn 2900，由Nacalai Tesque制造)或直链淀粉AS10(Mw 10,000(Mn 9100)，由Ajinoki Co.，Ltd.制造)溶解在1N NaOH中，随后用HCl中和。之后立即向直链淀粉溶液中加入水、酶溶液和缓冲液，使得反应溶液具有下面的组成，所得混合物在30℃反应24小时。反应溶液的组成：来源于大肠埃希氏菌的BE，40,000U/g底物；底物浓度，0.5wt％；磷酸钾浓度，20mM；pH 7.5。通过MALLS方法检验反应溶液中合成葡聚糖的平均分子量和它的产率。下面的表1B示出结果。
(表1B)
Figure A20058003801800481
结果是，发现来源于大肠埃希氏菌的BE具有合成Mw为1000kDa或更高的糖原的能力。
(生产实施例5：重组生产来源于Rhodothermus obamensis的BE)
从Bio Resource Center(RIKEN，独立行政法人，日本)得到Rhodothermus obamensis JCM9785.  这种菌株在Marine Broth 2216(由Difco制造)中70℃液体培养，并且从培养细胞中提取染色体DNA。
利用上述染色体DNA作为模板和下列引物扩增Rhodothermusobamensis BE基因。参考非专利文献11中公布的碱基序列信息设计这些引物，以便扩增全长Rhodothermus obamensis BE结构基因。下面的表1C示出设计的引物序列。
(表1C)
  引物1(N-端侧) ROBEN-ECO  AATCCAACCTTCGAATTCAGCTGGCTCACGGAAGAAGACA(SEQ ID NO：23)EcoRI位点
  引物2(C-端侧) ROBEC-PST  AATCAATCAATCAACTGCAGACGGTTACCCGTGCTCCGGC(SEQ ID NO：24)PstI位点
使用Toyobo Co.，Ltd.制造的DNA聚合酶KOD-Plus，在包含下列组成的反应溶液中在下列条件下进行PCR：
染色体DNA(约0.5μg/μL) 2μL
引物1(10pmol/μL) 3μL
引物2(10pmol/μL) 3μL
x10 KOD-Plus缓冲液 10μL
2mM dNTP 10μL
25mM MgSO4 4μL
KOD-Plus 2μL
蒸馏水(DW) 70μL
条件：在94℃加热2分钟，随后在94℃加热15秒、55℃加热13秒、68℃加热2.5分钟进行30个循环。
用限制酶EcoRI和PstI处理得到的DNA片段，随后连接入事先用相同酶(EcoRI和PstI)处理的pTrc99A，在含有连接产物的溶液中转化大肠埃希氏菌TG-1。从转化的大肠埃希氏菌TG-1中分离质粒，得到的质粒命名为pRBE1。
将携带pRBE1的大肠埃希氏菌TG-1在含有50μg/mL氨苄青霉素的培养基中37℃振荡培养，在晚对数期加入最终浓度为0.1mM的IPTG，将转化体在37℃过夜培养。
通过离心收集细胞，将得到的细胞沉淀物悬浮在20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7)中，通过超声破碎得到液体。离心这种液体，得到上清液，随后在70℃将上清液加热30分钟并且离心来回收上清液，得到的上清液用作粗制酶液体。
制备用Q-Sepharose Fast Flow(Amersham-Pharmacia)填充的柱，用20mM Tris-HCl(pH 7)平衡树脂。将所述粗制酶液体施加到柱上，以便将粗制酶液体吸附到树脂上，随后用含0.1M NaCl的相同缓冲液洗涤树脂。用含0.5M NaCl的相同缓冲液洗脱BE活性。对20mM Tris-HCl(pH 7)透析所述洗脱液，得到纯化的BE。如下面的实施例8所示，得到的纯化BE具有合成Mw为1000kDa或更高的糖原的能力。
(生产实施例6：重组生产来源于四季豆的BE并且测试其合成高分子量葡聚糖的能力)
作为来源于四季豆(Phaseolus vulugarisL.)的BE，使用Nozaki，K.et al.(2001)Biosci.Biotechnol.Biochem.65，1141-1148中描述的KBE2。
(测试合成糖原能力)
将直链淀粉A(Mn 2900，由Nacalai Tesque制造)或直链淀粉AS10(Mw 10,000(Mn 9100)，由Ajinoki Co.，Ltd.制造)溶解在1N NaOH中，随后用HCl中和。之后立即向直链淀粉溶液中加入水、酶溶液和缓冲液，使得反应溶液具有下面的组成，所得混合物在30℃反应24小时。反应溶液的组成：KBE2的量，40,000U/g底物；底物浓度，0.5wt％；磷酸钾浓度，20mM；pH 7.5。通过MALLS方法检验反应溶液中合成的葡聚糖的平均分子量和它的产率。下面的表1D示出结果。
(表1D)
Figure A20058003801800501
结果发现当使用KBE2时，不能合成1000kDa或更大的糖原。
(生产实施例7：重组生产来源于热速芽孢杆菌的BE)
除了使用编码来源于热速芽孢杆菌的BE的基因(SEQ ID NO：9)代替编码来源于风产液菌的BE的基因并且加热温度为60℃之外，用与生产实施例1相同的方式重组生产来源于热速芽孢杆菌的BE。
(生产实施例8：重组生产来源于热溶芽孢杆菌的BE)
除了使用编码来源于热溶芽孢杆菌的BE的基因(SEQ ID NO：9)代替编码来源于风产液菌的BE的基因并且加热温度为60℃之外，用与生产实施例1相同的方式重组生产来源于热溶芽孢杆菌的BE。
(测量实施例1：测量来源于风产液菌VF5的BE的降低支链淀粉分子量活性)
首先，将100μl蒸馏水加入50mg蜡质玉米淀粉(WCS，由SanwaCorn Starch Co.，Ltd.制造)中，并且充分搅拌。随后向其中加入900μl二甲基亚砜(DMSO)，搅拌并且在沸水浴中加热20分钟。向其中加入8.9ml蒸馏水，充分搅拌并且在沸水浴中再加热10分钟。向其中加入100μl 1M磷酸盐缓冲液(pH 7.5)，搅拌并用作底物溶液。
将所述底物溶液分配为800μL/管的体积。也就是说，每管含有4mg WCS。向各管中分别加入66.7、83.3、100、116.7、133.3或150μL含有通过与生产实施例1相同的方法生产的来源于风产液菌VF5的BE的溶液(BE活性：2.4 U/mL)，和133.3、116.7、100、83.3、66.7或50μL稀释剂，来调节反应溶液的体积至1000μL，随后在70℃反应16小时。所述稀释剂是含0.05％Triton X-100的10mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)。当反应时间达到16小时，加入1N HCl将反应溶液的pH从3降至4，在100℃另外加热反应溶液10分钟来终止反应。
反应终止之后，用0.45-μm的过滤器过滤反应溶液，通过MALLS方法测量反应溶液中所含产物的Mw。下面的“测量所产生葡聚糖的重均分子量(Mw)的方法”中详细描述了MALLS方法。
在纵轴(y-轴)上标出计算Mw(kDa)的对数，而在水平轴(x-轴)上标出酶的用量(μL)，使用Microsoft Corporation制造的软件MS-Excel绘制幂近似曲线。图12中示出这个图表。近似曲线的方程表达为y＝24,090x-1.340(R2＝0.9896)。从以上方程算出将4mg WCS底物的Mw降至400kDa所需的酶量V1(μL)为119μL。通过转换酶量/1g底物，计算1U分子量降低活性所需的酶量V2(mE)(＝(119μL/1000)×(1000mg/4mg)＝29.75(mL))。酶溶液的分子量降低活性E1是单位分子量降低活性的倒数(E1＝1/V2＝1/29.75＝0.0336)(U/mL)。因此，BE活性/分子量降低活性＝(2.4(U/mL)/0.0336(U/mL))＝71。
(测量实施例2：测量来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的BE的降低支链淀粉分子量活性)
除了使用生产实施例1中生产的来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的BE代替来源于风产液菌VF5的BE并且反应温度为50℃之外，用与测量实施例1相同的方式确定BE活性/分子量降低活性。结果是，BE活性/分子量降低活性为270。
(测量实施例3：测量来源于Rhodothermus obamensis的BE的降低支链淀粉分子量活性)
除了使用生产实施例5中生产的来源于Rhodothermus obamensis的BE代替来源于风产液菌VF5的BE并且反应温度为65℃之外，用与测量实施例1相同的方式确定BE活性/分子量降低活性。结果是，BE活性/分子量降低活性为35。
(测量实施例4：测量来源于大肠埃希氏菌的BE的降低支链淀粉分子量活性)
除了使用生产实施例4中生产的来源于大肠埃希氏菌的BE代替来源于风产液菌VF5的BE并且反应温度为30℃之外，用与测量实施例1相同的方式确定BE活性/分子量降低活性。结果是，BE活性/分子量降低活性为273。
(测量实施例5：测量来源于蜡质芽孢杆菌的BE的降低支链淀粉分子量活性)
除了使用根据非专利文献9所述方法中生产的来源于蜡质芽孢杆菌的BE代替来源于风产液菌VF5的BE并且反应温度为30℃之外，用与测量实施例1相同的方式确定BE活性/分子量降低活性。结果是，BE活性/分子量降低活性为1086。
(测量实施例6：测量来源于四季豆的BE的降低支链淀粉分子量活性)
除了使用生产实施例6中生产的来源于四季豆的BE代替来源于风产液菌VF5的BE并且反应温度为30℃之外，用与测量实施例1相同的方式确定BE活性/分子量降低活性。结果是，BE活性/分子量降低活性为130069。
(测量实施例7：测量来源于热速芽孢杆菌的BE的降低支链淀粉分子量活性)
除了使用生产实施例7中生产的来源于热速芽孢杆菌的BE代替来源于风产液菌VF5的BE并且反应温度为50℃之外，用与测量实施例1相同的方式确定BE活性/分子量降低活性。结果是，BE活性/分子量降低活性为466。
(测量实施例8：测量来源于热溶芽孢杆菌的BE的降低支链淀粉分子量活性)
除了使用生产实施例8中生产的来源于热溶芽孢杆菌的BE代替来源于风产液菌VF5的BE并且反应温度为50℃之外，用与测量实施例1相同的方式确定BE活性/分子量降低活性。结果是，BE活性/分子量降低活性为402。
下面的表1E总结了通过这些实施例测量的BE活性/分子量降低活性和糖原合成能力。
(表1E)
来源 BE活性/分子量降低活性 合成糖原能力     特性
四季豆     130069     无     中温性
蜡状芽孢杆菌     1086     无     中温性
热速芽孢杆菌     466     有     耐热性
热溶芽孢杆菌     402     有     耐热性
大肠埃希氏菌     273     有     中温性
嗜热脂肪芽孢杆菌     270     有     耐热性
风产液菌     71     有     耐热性
Rhodothermusobamensis     35     有     耐热性
(测量所产生葡聚糖的重均分子量(Mw)和产率的方法)
通过MALLS方法按照下面的方式测量所产生葡聚糖的Mw：使用柱Shodex OH-Pack SB806MHQ(内径8mm，长度300mm，由ShowaDenko K.K.制造)和保护柱Shodex OH-Pack SB-G(内径6mm，长度50mm，由Showa Denko K.K.制造)，将多角度激光光散射检测器(DAWN-DSP，由Wyatt Technology制造)和示差折光计(Shodex RI-71，由Showa Denko K.K.制造)按照这个顺序连接并用作检测器。将所述柱保持在40℃，使用0.1M硝酸钠溶液作为洗脱液，流速为1mL/分钟。分子量为约10,000或更高的α-葡聚糖在前11分钟内从HPLC系统内洗脱出，其中调节管路，使得Shodex制造的支链淀粉P-50(包含在GFC(水基GPC)的标准样品STANDARD P-82内)的峰在9.3分钟时洗出。具体而言，选择从洗脱开始至11分钟的所有峰，使得包含示差折光计和多角度激光光散射检测器检出的峰作为数据，并且使用数据分析软件(商品名：STRA，由Wyatt Technology制造)收集数据，并用该软件分析来确定Mw。在这些条件下排除了分子量为约10,000或更低的葡聚糖。作为葡聚糖的dn/dc(固有折光指数的增量)使用0.145mL/g。
测量示差折光计的峰面积，并且用这个峰面积除以dn/dc值，由此计算洗脱出的高分子量葡聚糖的量(g)。洗脱出的高分子量葡聚糖的量除以合成所用的底物量(其在计算公式中是底物浓度和HPLC上样体积的乘积)，并乘以100来确定产率(％)。也就是说，根据下面的等式计算产率：产率(％)＝{(洗脱出的高分子量葡聚糖的量(g))÷[(底物浓度(g/mL))×(HPLC上样体积(mL))]}×100
利用分子量为1,000,000或更高的高分子量葡聚糖的量，可以确定糖原的产率。
(实施例1：由低分子量直链淀粉生产糖原)
(1-1：由直链淀粉A生产)
将直链淀粉A(Mn 2900，由Nacalai Tesque制造)溶解在1N NaOH中，随后用HCl中和。之后立即向直链淀粉溶液中加入水、酶溶液和缓冲液，使得反应溶液具有下面的组成，并且所得混合物在70℃反应17小时。反应溶液的组成：来源于风产液菌的BE的量，10,000、20,000或40,000U/g底物；底物浓度，2wt％；磷酸钾浓度，20mM；pH 7.5。
图2中示出了由低分子量α-葡聚糖生产糖原的示意图。反应之后，测量产生的α-葡聚糖的分子量。结果显示在表1和图3中。在表1中，葡聚糖的产率表示分子量为10,000或更高的葡聚糖的总产率，糖原的产率(％)表示分子量为1,000,000或更高(即糖原)的葡聚糖的产率。结果是，证实了当使用10,000-40,000U/g底物的量的BE时，由Mn为2900的直链淀粉A产生Mw为1,000,000或更高的糖原，并且几乎所有由直链淀粉A生产的葡聚糖都是糖原。
(1-2：由各种分子量的底物生产糖原)
分别使用直链淀粉AS-5、AS-10、AS-30、AS-70或AS-110(Mw分别为5000、10000、30000、70000和110000，由Ajinoki Co.，Ltd.制造)作为底物。由于它们的Mw/Mn几乎为1.1，它们的Mn分别为4,500、9,100、27,000、64,000和100,000。
将各种直链淀粉溶解在1N NaOH中，随后用HCl中和。之后立即向直链淀粉溶液中加入水、酶溶液和缓冲液，使得反应溶液具有下面的组成，并且所得混合物在70℃反应16小时。反应溶液的组成：来源于风产液菌的BE的量，10,000U/g底物；底物浓度，2wt％；磷酸钾浓度，40mM；pH 7.5。
反应之后，测量产生的α-葡聚糖的分子量。结果显示在表1和图4中。在表1中，来源于风产液菌的BE用Aq表示。
结果发现，甚至从Mn为100,000的直链淀粉产生了糖原。反应开始前溶液中糖的Mn大于9100时，产物的分子量分成两个峰。存在分裂的峰时，只测量较高分子量的那个峰。有这种趋势，反应开始前溶液中糖的Mn越大，产物的Mw越小，且产率越高。
(1-3：由各种浓度的底物生产糖原)
作为底物，将直链淀粉A(Mn 2900，由Nacalai Tesque制造)溶解在1N NaOH中，随后用HCl中和。之后立即向直链淀粉溶液中加入水、酶溶液和缓冲液，使得反应溶液具有下面的组成，并且所得混合物在70℃反应17小时。反应溶液的组成：来源于风产液菌的BE的量，10,000或40,000U/g底物；底物浓度，2、4、8或12wt％；磷酸钾浓度，40mM；pH 7.5。
反应之后，测量产生的α-葡聚糖的分子量。结果显示在表1-2中。在表1-2中，糖原的产率(％)表示分子量为1,000,000或更高(即糖原)的葡聚糖的产率。
结果发现，至少在底物浓度高达约12％时产生了糖原。有这种趋势，底物浓度越高，产物的Mw越小。
Figure A20058003801800561
(表1-2)
Figure A20058003801800571
Aq：来源于风产液菌的分支酶
Mw：重均分子量
Mn：数均分子量
(实施例2：由淀粉生产糖原)
(2-1：由玉米淀粉生产糖原)
将玉米淀粉(由和光纯药工业(株)制造)(2wt％)悬浮在水中，并在100℃加热30分钟，由此使玉米淀粉糊化。将混合物冷却至40℃，向其中加入异淀粉酶(缩写为IAM，5000或50000U/g底物，由(株)林原生物化学研究所制造)并且在40℃反应4小时、6小时、8小时或20小时，由此产生直链淀粉。之后，用5mM磷酸钾缓冲液调节溶液至pH7.5，向其中加入来源于风产液菌的BE得到混合物，其中底物浓度为2wt％，BE的量为10000、20000、40000或60000U/g底物，随后在55℃、65℃、70℃或75℃反应20小时。
图5示出用脱支酶降解淀粉来得到直链淀粉、随后所述直链淀粉与BE反应来产生糖原的示意图。反应之后，测量产生的α-葡聚糖的分子量。结果显示在表2和图6中，图6是标出结果的图表，其中IAM的量为5000U/g底物，BE的量为10000、20000、40000或60000U/g底物。在表2中，糖原的产率(％)表示分子量为1,000,000或更高的葡聚糖(即糖原)的产率。
(表2)
  IAM量(U/g底物)   IAM的反应温度(℃)   IAM的反应时间(小时)   BE量(U/g底物)   BE的反应温度(℃)   BE的反应时间(小时)   产物的Mw(kDa)   产物的Mn(kDa) Mw/Mn   糖原的产率(％)
  5000   40   20   10000   70   20   4866   3637   1.34   35.4
  50000   40   20   10000   70   20   5076   3047   1.67   33.4
  5000   40   20   20000   70   20   4078   3298   1.24   40.6
  50000   40   20   20000   70   20   5431   3015   1.80   33.6
  5000   40   20   40000   70   20   5215   3779   1.38   38.4
  50000   40   20   40000   70   20   5481   3407   1.61   33.6
  5000   40   20   60000   70   20   4367   2970   1.47   31.9
  50000   40   20   60000   70   20   4782   2930   1.63   30.4
  5000   40   4   20000   55   20   6579   5787   1.14   42.7
  5000   40   4   20000   65   20   4998   4255   1.17   42.5
  5000   40   4   20000   75   20   4632   3534   1.31   40.7
  5000   40   6   20000   55   20   5710   4947   1.15   46.4
  5000   40   6   20000   65   20   7302   5437   1.34   39.5
  5000   40   6   20000   75   20   4873   3781   1.29   40.1
  5000   40   8   20000   55   20   6583   5587   1.18   42.1
  5000   40   8   20000   65   20   6676   5057   1.32   40.7
  5000   40   8   20000   75   20   5950   3550   1.68   38.8
  5000   40   20   20000   55   20   7044   5979   1.18   36.8
  5000   40   20   20000   65   20   6028   4905   1.23   37.2
  5000   40   20   20000   75   20   5284   4053   1.30   36.8
BE：来源于风产液菌的分支酶
IAM：来源于介支淀粉假单胞菌的异淀粉酶
Mw：重均分子量
Mn：数均分子量
结果发现，由玉米淀粉的异淀粉酶降解产物产生了糖原。几乎与异淀粉酶的量和BE的量无关，所得Mw为约5,000,000的糖原的产率为约30％或更高。异淀粉酶的反应时间为4小时或更高时，产生了糖原。在55℃、65℃、70℃或75℃的任意BE反应温度下产生了糖原。
(2-2：由各种淀粉生产糖原)
将玉米淀粉(由和光纯药工业(株)制造)、蜡质玉米淀粉(由Roquette制造)、小麦淀粉(由和光纯药工业(株)制造)、马铃薯淀粉(由和光纯药工业(株)制造)或木薯淀粉(由VEDAN ENTERPRISE Co.，Ltd.制造)(2wt％)悬浮在水中并且在100℃加热30分钟，由此使玉米淀粉糊化。将混合物冷却至40℃，向其中加入异淀粉酶(5000U/g底物，由(株)林原生物化学研究所制造)并且在40℃反应20小时，由此产生直链淀粉。之后，用5mM磷酸钾缓冲液调节溶液至pH 7.5，向其中加入来源于风产液菌的BE得到混合物，其中底物浓度为2wt％，BE的量为20000U/g底物，随后在55℃、65℃或75℃反应20小时。
反应之后，测量产生的α-葡聚糖的分子量。结果显示在下面的表3中。
结果发现，可以使用各种淀粉作为异淀粉酶底物来生产糖原。
(2-3：使用来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的BE由淀粉生产糖原)
将玉米淀粉(由和光纯药工业(株)制造)(2wt％)悬浮在水中并且在100℃加热30分钟，由此使玉米淀粉糊化。将混合物冷却至40℃，向其中加入异淀粉酶(5000U/g底物，由(株)林原生物化学研究所制造)并且在40℃反应20小时，由此产生直链淀粉。之后，用40mM磷酸钾缓冲液调节溶液至pH 7.5，向其中加入来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的BE得到混合物，其中底物浓度为2wt％，BE的量为20000U/g底物，随后在55℃反应20小时。
反应之后，测量产生的α-葡聚糖的分子量。结果显示在下面的表3中。在表3中，葡聚糖的产率表示分子量为10,000或更高的葡聚糖的总产率，糖原的产率(％)表示分子量为1,000,000或更高的葡聚糖(即糖原)的产率。
结果发现，甚至使用来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的BE可以产生糖原。
(2-3：使用异淀粉酶和BE一起生产糖原)
将玉米淀粉(由和光纯药工业(株)制造)(1wt％)悬浮在水中并且在100℃加热30分钟，由此使玉米淀粉糊化。将混合物冷却至65℃，向其中加入异淀粉酶(500000U/g底物，由(株)林原生物化学研究所制造)和来源于风产液菌的BE(60000U/g底物)，用40mM磷酸钾缓冲液调节溶液至pH 7.5并且在65℃反应16小时。
反应之后，测量产生的α-葡聚糖的分子量。结果发现，甚至通过异淀粉酶和BE一起作用于淀粉可以产生糖原。
(实施例3A：通过使4-α-葡聚糖基转移酶和BE一起作用于短糖链直链淀粉来生产糖原)
(3-1：利用来源于风产液菌的BE和TaqMalQ生产糖原)
将底物(麦芽五糖(G5)、麦芽六糖(G6)或麦芽七糖(G7))溶解在水中，并且向底物溶液中加入水、酶溶液和缓冲液，使得反应溶液具有下面的组成，并且所得混合物在65℃反应17小时。反应溶液的组成：来源于风产液菌的BE的量，40000、80000或160000U/g底物；TaqMalQ，10U/g底物；底物浓度，1％；磷酸钾浓度，10mM；pH 7.5。
图7示出通过4-α-葡聚糖基转移酶由麦芽五糖生产直链淀粉、以及通过BE由直链淀粉生产糖原的示意图。反应之后，测量产生的α-葡聚糖的分子量。结果显示在表4和图8中。图8示出Mw，其中BE用量为80000U/g底物。存在分离的峰时，只测量分子量较高的峰。
结果发现，从G5、G6和G7利用4-α-葡聚糖基转移酶一起以高度有效的方式产生糖原。
(3-2：利用来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的BE和TaqMalQ生产糖原)
将底物(麦芽七糖(G7))溶解在水中，并且向底物溶液中加入水、酶溶液和缓冲液，使得反应溶液具有下面的组成，并且所得混合物在50℃反应17小时。反应溶液的组成：来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的BE的量，160000U/g底物；TaqMalQ的量，2.3U/g底物；底物浓度，0.5％；磷酸钾浓度，5mM；pH 7.5。
反应之后，测量产生的α-葡聚糖的分子量。结果显示在下面的表4中。在表4中，葡聚糖的产率表示分子量为10,000或更高的葡聚糖的总产率，糖原的产率表示分子量为1,000,000或更高的葡聚糖(即糖原)的产率。
结果发现，甚至使用来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的BE时，可以由G7利用4-α-葡聚糖基转移酶一起以高度有效的方式产生糖原。
Figure A20058003801800621
(实施例4：在相对低温的条件下生产糖原)
将直链淀粉A(Mn2900，由Nacalai Tesque制造)溶解在1N NaOH中，随后用HCl中和。之后立即向直链淀粉溶液中加入水、酶溶液和缓冲液，使得反应溶液具有下面的组成，所得混合物在30℃反应16小时。反应溶液的组成：来源于风产液菌或嗜热脂肪芽孢杆菌的BE的量，80,000U/g底物；底物浓度，2wt％；磷酸钾浓度，20mM；pH 7.5。
反应之后，测量产生的α-葡聚糖的分子量。结果显示在表5中。在表5中，葡聚糖的产率表示分子量为10,000或更高的葡聚糖的总产率，糖原的产率表示分子量为1,000,000或更高的葡聚糖(即糖原)的产率。
结果证实，甚至使用其中任一种热稳定BE而且反应温度为30℃时，可以由直链淀粉A产生Mw为1,000,000或更高的糖原。从这个结果看出，糖原的产生不是由于高温反应条件，而是由于热稳定BE的特性。
(比较实施例1：利用来源于蜡质芽孢杆菌的BE生产α-葡聚糖)
将直链淀粉A、或酶促合成的直链淀粉(AS-10(Mw10000；Mn9100)或AS-320(Mw320000；Mn290000))溶解在1N NaOH中，随后用HCl中和。之后立即向直链淀粉溶液中加入水、酶溶液和缓冲液，使得反应溶液具有下面的组成，所得混合物在30℃反应24小时。反应溶液的组成：来源于蜡质芽孢杆菌的BE的量，40,000U/g底物；底物浓度，0.5wt％；磷酸钾浓度，20mM；pH 7.5。根据非专利文献9中描述的方法制备来源于蜡质芽孢杆菌的BE。
反应之后，通过在沸水浴中加热10分钟来终止所述反应，通过MALLS方法分析得到的α-葡聚糖。结果显示在表6中。在表6中，葡聚糖的产率表示分子量为10,000或更高的葡聚糖的总产率，糖原的产率表示分子量为1,000,000或更高的葡聚糖(即糖原)的产率。
当使用直链淀粉A作为底物时，不能检测到高分子量α-葡聚糖。无论使用哪种酶促合成的直链淀粉，分子量为10,000-500,000的葡聚糖几乎占产物的100％，不能检测到分子量为1,000,000或更高的葡聚糖。当使用Mn为9100的底物时，产物的Mw为86900，当使用Mn为290000的底物时，产物的Mw为61900。当使用高分子量底物时，发生底物转换为小分子化合物。
另外，蜡质芽孢杆菌BE相似地作用于Mn为4500-290000的各种大小的直链淀粉，通过凝胶过滤分析所述产物，显示主要组分的分子量与上述试验中的几乎相同。也就是说，在任何情况下不能得到分子量大于1,000,000的高分子量α-葡聚糖。
(实施例3B：通过BE单独作用于短糖链直链淀粉来生产α-葡聚糖)
将底物(麦芽四糖(G4)、麦芽五糖(G5)、麦芽六糖(G6)或麦芽七糖(G7))溶解在水中，加入来源于风产液菌的BE，调节反应溶液使之具有下面表7中显示的底物浓度和BE量，用10mM磷酸钾缓冲液调节pH至7.5并且在下面表7中显示的温度下反应17小时。
反应之后，测量产生的α-葡聚糖的分子量。结果显示在下面的表7中。在表7中，糖原的产率(％)表示分子量为1,000,000或更高的葡聚糖(即糖原)的产率。
结果发现，使用低分子量底物G4-G7时，可以合成糖原。
(实施例5：BE和支链淀粉酶作用于淀粉来生产糖原)
将玉米淀粉(由和光纯药工业(株)制造)(2wt％)悬浮在水中并且在100℃加热30分钟，由此使玉米淀粉糊化。将混合物冷却至60℃，向其中加入支链淀粉酶(5U/g底物；Kleistase，由大和化成(株)制造)并且在60℃反应20小时，由此产生直链淀粉，随后在100℃加热10分钟来终止反应。之后，用10mM磷酸钾缓冲液调节溶液至pH 7.5，加入20000U/g底物的量的来源于风产液菌的BE，并且在65℃反应20小时。
反应之后，测量产生的α-葡聚糖的分子量。结果显示在下面的表8中。在表8中，糖原的产率(％)表示分子量为1,000,000或更高的葡聚糖(即糖原)的产率。结果是，与用异淀粉酶脱支的玉米淀粉类似，用支链淀粉酶脱支的玉米淀粉可以产生糖原。
(表5)
Aq：来源于风产液菌的分支酶
Bst：来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的分支酶
Mw：重均分子量
Mn：数均分子量
(表6)
Figure A20058003801800652
(表7)
Figure A20058003801800653
Aq：来源于风产液菌的分支酶
Mw：重均分子量
Mn：数均分子量
(表8)
Figure A20058003801800654
(评价实施例1：对用支链淀粉酶降解的抗性)
据报导，使用现有技术，通过BE作用于直链淀粉得到的α-葡聚糖与天然糖原不同，这种差异在于它容易被支链淀粉酶降解(非专利文献10)。
检验通过本发明的方法生产的糖原是否与天然糖原类似，对用支链淀粉酶降解有抗性。
将玉米淀粉(由和光纯药工业(株)制造)(1wt％)悬浮在水中并且蒸汽加压锅中糊化。将产物冷却至40℃，加入异淀粉酶(40000U/g底物，由(株)林原生物化学研究所制造)并且在40℃反应6小时来形成直链淀粉。之后，用3mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)和5N NaOH调节溶液至pH7.5，加入来源于风产液菌的BE至浓度为20000U/g底物并且在65℃反应19小时来产生重均分子量为9719 kDa的糖原。将这种糖原、来源于牡蛎的试剂糖原(由和光纯药工业(株)制造)、蜡质玉米淀粉(由Roquette制造)或玉米淀粉(由和光纯药工业(株)制造)溶解在1N NaOH中并且用HCl中和。之后立即加入来源于短芽孢杆菌的支链淀粉酶(由大和化成(株)制造)，调节反应溶液至底物浓度为0.5wt％和支链淀粉酶(0、2、4、16、64、256U/g底物)，并用10mM醋酸钠缓冲液(pH 5.0)调节溶液至pH 5.0，随后在60℃反应30分钟。
反应之后，测量产物的分子量。结果显示在图9中。
结果发现，淀粉迅速降解，但是来源于牡蛎的试剂糖原(由和光纯药工业(株)制造)和根据本发明的生产方法生产的糖原几乎不被支链淀粉酶降解。因此，证实了根据本发明的生产方法生产的糖原与天然糖原具有相同的性质并且可以称为真正的糖原。
(评价实施例2：对用α-淀粉酶降解的抗性)
已知糖原几乎不被支链淀粉酶降解，并且根据本发明人的试验发现对α-淀粉酶降解有极端的抗性。例如，通过用300U/g人唾液α-淀粉酶处理30分钟，蜡质玉米淀粉和常规玉米淀粉被降解至分子量为10,000或更低，但是在相同条件下来源于牡蛎的试剂糖原几乎不被降解。
检验通过本发明的方法生产的糖原是否与天然糖原类似，对用α-淀粉酶降解有抗性。
将在评价实施例1中制备的糖原、来源于牡蛎的试剂糖原(由和光纯药工业(株)制造)、蜡质玉米淀粉(由Roquette制造)或玉米淀粉(由和光纯药工业(株)制造)溶解在1N NaOH中并且用HCl中和。之后立即加入来源于人唾液的α-淀粉酶(XIII-A型，由Sigma制造)，调节反应溶液至底物浓度为0.5wt％和α-淀粉酶(0、5、37.5、75、150、300U/g底物)，用20mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)调节溶液至pH 7.0，随后在37℃反应30分钟。
反应之后，测量产物的分子量。结果显示在图10中。当α-淀粉酶的量为0、5或37.5U/g底物时，因为产物不能过滤，所以不能测量淀粉的分子量。
结果发现，淀粉迅速降解，但是来源于牡蛎的试剂糖原(由和光纯药工业(株)制造)和根据本发明的生产方法生产的糖原几乎不被α-淀粉酶降解。因此，证实了根据本发明的生产方法生产的糖原与天然糖原具有相同的性质并且可以称为真正的糖原。
(实施例6：证实糖原的溶解度)
将直链淀粉A(Mn2900，由Nacalai Tesque制造)或直链淀粉AS10(Mw10,000(Mn9100)，由Ajinoki Co.，Ltd.制造)溶解在1N NaOH中，随后用HCl中和。之后立即向直链淀粉溶液中加入水、酶溶液和缓冲液，使得反应溶液具有下面的组成，所得混合物在70℃反应24小时。反应溶液的组成：来源于风产液菌的BE的量，34,000U/g底物；底物浓度，0.5wt％；磷酸钾浓度，20mM；pH 7.5。通过这个反应得到的糖原的产率(％)为10.1％(使用直链淀粉A作为底物时)或者59.0％(使用直链淀粉AS10作为底物时)。
通过下面的方法确定溶解度。将得到的糖原通过乙醇沉淀回收，干燥，在室温(约20℃)加入蒸馏水得到2mg/mL混合物。在室温下用漩涡混合器将混合物搅拌30秒，用0.45μm过滤器过滤。通过MALLS方法测量滤出液中溶解糖原的量。
另外，通过下面的方法确定支链淀粉酶抗性和α-淀粉酶抗性。首先，将通过乙醇沉淀回收的糖原悬浮在水中，通过100℃加热使之完全溶解。支链淀粉酶处理中以量为256 U/g底物的Kleistase(由大和化成(株)制造)在60℃处理30分钟。α-淀粉酶处理中以量为300U/g底物的XIII-A型(由Sigma制造)在37℃处理30分钟。反应终止之后，通过MALLS方法计算葡聚糖的Mw。通过根据下面方程确定的比率来评估对支链淀粉酶和α-淀粉酶的抗性。即
支链淀粉酶抗性(％)
＝{(Mw支链淀粉酶处理后)/(Mw处理前)}×100，和
α-淀粉酶抗性(％)
＝{(Mwα-淀粉酶处理后)/(Mw处理前)}×100
结果显示在下面的表9中。
(表9)
Figure A20058003801800681
结果发现，通过本发明的方法可以得到具有高溶解度、对支链淀粉酶和α-淀粉酶有高抗性的糖原。
(实施例7：通过结合使用来源于风产液菌VF5的BE和来源于水生栖热菌的4-α-葡聚糖基转移酶(TaqMalQ)来改善糖原的产率)
(实施例7-1：通过TaqMalQ和来源于风产液菌的BE作用于直链淀粉A来生产糖原)
将直链淀粉A(Mn 2900，由Nacalai Tesque制造)溶解在1N NaOH中，随后用HCl中和。之后立即向直链淀粉溶液中加入水、酶溶液和缓冲液，使得反应溶液具有下面的组成，所得混合物在65℃反应20小时。反应溶液的组成：来源于风产液菌的BE的量，5000或20000U/g底物；TaqMalQ的量，5、10或20U/g底物；底物浓度，2wt％；磷酸钾浓度，20mM；pH 7.5。下面的表10显示反应条件和产物的分析结果。
(表10)
Figure A20058003801800682
底物：直链淀粉A
BE：来源于风产液菌的BE
Ma1Q：来源于水生栖热菌的4-α-葡聚糖基转移酶
因此发现，可以使用来源于风产液菌的BE和TaqMalQ来生产Mw为1000kDa或更高的糖原。这表明，通过加入TaqMalQ可以显著提高糖原的产率。
实施例7-2：通过TaqMalQ和来源于风产液菌的BE作用于玉米淀粉来生产糖原
将玉米淀粉(由和光纯药工业(株)制造)(2wt％)悬浮在水中并且在100℃加热30分钟，由此使玉米淀粉糊化。将混合物冷却至40℃，向其中加入量为5000U/g底物的异淀粉酶(由(株)林原生物化学研究所制造)并且在40℃反应20小时来生产直链淀粉。之后用5mM磷酸钾缓冲液调节溶液至pH 7.5，并加入来源于风产液菌的BE(20000U/g底物)和TaqMalQ(0.1、0.5、1、2、3、4、5、10或20U/g底物)并且在65℃反应20小时。下面的表11显示反应条件和产物的分析结果。
Figure A20058003801800701
因此发现，在异淀粉酶作用于玉米淀粉之后，可以利用来源于风产液菌的BE和TaqMalQ以高度有效的方式生产Mw为1000kDa或更高的糖原。
(实施例7-3：通过TaqMalQ和来源于风产液菌的BE作用于作为底物的液化脱支玉米淀粉来生产糖原)
将玉米淀粉(由和光纯药工业(株)制造)(2wt％)以6wt％的浓度悬浮在水中并且在100℃用α-淀粉酶(由大和化成(株)制造)液化至DE12。反应终止之后，向其中加入异淀粉酶(5000U/g底物，由(株)林原生物化学研究所制造)并且在40℃反应20小时来实现脱支。脱支产物的Mn为约600。用5mM磷酸钾缓冲液调节溶液至pH 7.5，加入来源于风产液菌的BE(5000U/g底物)和TaqMalQ(1U/g底物)并且在65℃反应20小时，由此得到Mw为11360kDa的糖原。
(实施例8：使用来源于Rhodothermus obamensis的BE生产糖原)
使来源于Rhodothermus obamensis的BE作用于直链淀粉A和AS-10来生产糖原。具体而言，将直链淀粉A(Mn2900，由Nacalai Tesque制造)或AS-10(Mn9100，由Ajinoki Co.，Ltd.制造)溶解在1N NaOH中，随后用HCl中和。之后立即向直链淀粉溶液中加入水、酶溶液和缓冲液，使得反应溶液具有下面的组成，所得混合物在65℃反应17小时。反应溶液的组成：来源于Rhodothermus obamensis的BE，40,000U/g底物；底物浓度，2wt％；醋酸钠浓度，40mM；pH 6.0。下面的表12显示反应条件和产物的分析结果。
(表12)
Figure A20058003801800711
BE：来源于Rhodothermus obamensis的BE
因此发现，使用来源于Rhodothermus obamensis的BE可以以高度有效的方式生产Mw为1000kDa或更高的糖原。
(实施例9：使用来源于热速芽孢杆菌的BE生产糖原)
使来源于热速芽孢杆菌的BE作用于直链淀粉A和AS-10来生产糖原。具体而言，将直链淀粉A(Mn2900，由Nacalai Tesque制造)或AS-10(Mn9100，由Ajinoki Co.，Ltd.制造)溶解在1N NaOH中，随后用HCl中和。之后立即向直链淀粉溶液中加入水、酶溶液和缓冲液，使得反应溶液具有下面的组成，所得混合物在55℃反应16小时。反应溶液的组成：来源于热速芽孢杆菌的BE的量，20,000U/g底物；底物浓度，2wt％；Tris浓度，20mM；pH 7.0。下面的表13显示反应条件和产物的分析结果。
(表13)
Figure A20058003801800721
BE：来源于热速芽孢杆菌的BE
因此发现，使用来源于热速芽孢杆菌的BE可以以高度有效的方式生产Mw为1000kDa或更高的糖原。
(实施例10：使用来源于热溶芽孢杆菌的BE生产糖原)
使来源于热溶芽孢杆菌的BE作用于直链淀粉A和AS-10来生产糖原。具体而言，将直链淀粉A(Mn2900，由Nacalai Tesque制造)或AS-10(Mn9100，由Ajinoki Co.，Ltd.制造)溶解在1N NaOH中，随后用HCl中和。之后立即向直链淀粉溶液中加入水、酶溶液和缓冲液，使得反应溶液具有下面的组成，所得混合物在45℃反应16小时。反应溶液的组成：来源于热溶芽孢杆菌的BE的量，20,000U/g底物；底物浓度，2wt％；Tris浓度，20mM；pH 7.0。下面的表14显示反应条件和产物的分析结果。
(表14)
Figure A20058003801800722
BE：来源于热溶芽孢杆菌的BE
因此发现，使用来源于热溶芽孢杆菌的BE可以生产Mw为1000kDa或更高的糖原。
已经参考上述本发明的优选实施方案描述了本发明，但是不应认为本发明限于这些实施方案。应该理解，本发明的范围应该只通过权利要求来解释。应该理解，通过对本发明的具体优选实施方案的描述，本领域的技术人员可以基于本发明的描述和公知技术实现等同的范围。应该理解，本说明书中引用的专利、专利申请和文献的公开内容通过引用以其整体并入本文，就像在本说明书中具体描述一样。
工业实用性
根据本发明，提供了廉价地生产具有与天然糖原相同性质的高度分支和高分子量的α-葡聚糖的方法。通过本发明的方法生产的糖原与常见的天然糖原类似，可以在广泛范围内应用。天然糖原在多种工业领域中应用。例如，可以预期根据本发明方法生产的糖原可以用作免疫刺激剂、健康食品材料等。还可以预期通过本发明方法生产的糖原可以用于化妆品材料、食品材料(调味料)和其它工业材料中。通过本发明方法生产的糖原的用途还包括，例如微生物感染的治疗剂、湿润剂(例如有效改善皮肤保湿性的化妆品、防止嘴唇粗糙的化妆品)、复合调味料(例如具有扇贝(眼)味道的复合调味料)、抗肿瘤剂、形成发酵乳的促进剂、胶体颗粒聚集体、影响头发易梳性和光泽的改善头发表面摩擦阻力的物质、细胞活化剂(表皮细胞活化剂、成纤维细胞增殖剂等)、ATP生成促进剂、皮肤老化症状例如皱纹的改善剂、皮肤粗糙的改善剂、荧光颗粒表面处理剂和环状四糖(CTS；cyclo{→6}-α-D-glcp-(1→3)-α-D-glcp-(1→6)-α-D-glcp-(1→3)-α-D-glcp-(1→})合成的底物。本发明的方法中生产的糖原可以用作皮肤的外用制剂(例如化妆水、乳液、霜、精华素、生发剂、育发剂、面膜、唇膏、护唇霜、化妆粉底液、化妆粉底霜、粉底、眼影、腮红、香波、润丝、发用液剂、头发滋补剂、长效卷发剂、染发剂、处理(剂)、浴用剂、护手霜、护腿霜、护颈霜、爽身水等)、或眼用溶液等中。
根据本发明的方法，可以得到(类似于天然糖原)具有高溶解度以及直链淀粉酶和α-淀粉酶低降解性的糖原。这被认为是由于具有合成糖原能力的BE(尤其是热稳定BE)的特异性质。
所得糖原对上述酶的低消化性是很重要的，例如，对于显示所述糖原的免疫刺激活性，因此本发明尤其有用。
序列表
<110>江崎格力高株式会社
<120>生产糖原的方法
<130>EG017PCT
<140>PCT/JP2005/017900
<141>2005-09-28
<150>JP 2004-289337
<151>2004-09-30
<160>24
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1893
<212>DNA
<213>风产热菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1893)
<400>1
atg aag aag ttc agt ctc atc agt gat tac gac gtt tac ctc ttt aag       48
Met Lys Lys Phe Ser Leu Ile Ser Asp Tyr Asp Val Tyr Leu Phe Lys
1               5                   10                  15
gag gga acg cac acg aga ctt tac gat aaa ctt ggc tcc cac gtt ata       96
Glu Gly Thr His Thr Arg Leu Tyr Asp Lys Leu Gly Ser His Val Ile
            20                  25                  30
gaa cta aac ggg aaa agg tat acc ttc ttt gcg gtt tgg gca ccc cac      144
Glu Leu Asn Gly Lys Arg Tyr Thr Phe Phe Ala Val Trp Ala Pro His
        35                  40                  45
gcg gat tac gta tca ctt ata ggc gat ttt aac gaa tgg gat aaa ggt      192
Ala Asp Tyr Val Ser Leu Ile Gly Asp Phe Asn Glu Trp Asp Lys Gly
    50                  55                  60
tct act ccc atg gta aag agg gag gac ggc tcc gga ata tgg gag gtt      240
Ser Thr Pro Met Val Lys Arg Glu Asp Gly Ser Gly Ile Trp Glu Val
65                  70                  75                  80
tta ctt gaa gga gac ctg act ggt tca aag tac aag tac ttt ata aag      288
Leu Leu Glu Gly Asp Leu Thr Gly Ser Lys Tyr Lys Tyr Phe Ile Lys
                85                  90                  95
aac ggg aat tac gaa gtt gat aag tcc gat ccc ttc gca ttt ttc tgt      336
Asn Gly Asn Tyr Glu Val Asp Lys Ser Asp Pro Phe Ala Phe Phe Cys
            100                 105                 110
gag caa ccc ccc gga aac gct tcc gta gtg tgg aag ctc aat tac agg      384
Glu Gln Pro Pro Gly Asn Ala Ser Val ValTrp Lys Leu Asn Tyr Arg
        115                 120                 125
tgg aac gac tcc gaa tac atg aaa aag agg aaa aga gta aac tca cac      432
Trp Asn Asp Ser Glu Tyr Met Lys Lys Arg Lys Arg Val Asn Ser His
    130                 135                 140
gac tcg cct ata tcc ata tac gaa gtt cac gtg ggt tct tgg agg aga      480
Asp Ser Pro Ile Ser Ile Tyr Glu Val His Val Gly Ser Trp Arg Arg
145                 150                 155                 160
gtt cca gaa gag gga aac aga ttt ttg agc tat agg gaa ctt gcc gaa      528
Val Pro Glu Glu Gly Asn Arg Phe Leu Ser Tyr Arg Glu Leu Ala Glu
                165                 170                 175
tac ctc cca tac tac gta aaa gag atg gga ttt act cac gtt gag ttc      576
Tyr Leu Pro Tyr Tyr Val Lys Glu Met Gly Phe Thr His Val Glu Phe
            180                 185                 190
tta ccc gtt atg gaa cat ccc ttt tac ggc tct tgg ggc tac cag ata      624
Leu Pro Val Met Glu His Pro Phe Tyr Gly Ser Trp Gly Tyr Gln Ile
        195                 200                 205
acg ggc tac ttc gct ccg act tcc aga tac gga act cct cag gac ttt      672
Thr Gly Tyr Phe Ala Pro Thr Ser Arg Tyr Gly Thr Pro Gln Asp Phe
    210                 215                 220
atg tac tta ata gac aaa ctt cat caa gaa ggg ata ggt gtg ata cta      720
Met Tyr Leu Ile Asp Lys Leu His Gln Glu Gly Ile Gly Val Ile Leu
225                 230                 235                 240
gac tgg gtt ccc tct cac ttt ccc acc gat gcc cac ggg ctc gca tac      768
Asp Trp Val Pro Ser His Phe Pro Thr Asp Ala His Gly Leu Ala Tyr
                245                 250                 255
ttt gac ggg act cac ctt tac gag tac gag gac tgg aga aag agg tgg      816
Phe Asp Gly Thr His Leu Tyr Glu Tyr Glu Asp Trp Arg Lys Arg Trp
            260                 265                 270
cat ccc gac tgg aac agc ttt gtt ttt gat tac gga aaa ccg gaa gtt      864
His Pro Asp Trp Asn Ser Phe Val Phe Asp Tyr Gly Lys Pro Glu Val
        275                 280                 285
cgc tcc ttt ctc ctg agt tct gcc cac ttc tgg ctc gac aag tac cac      912
Arg Ser Phe Leu Leu Ser Ser Ala His Phe Trp Leu Asp Lys Tyr His
    290                 295                 300
gca gac ggt ctc aga gtg gat gca gtt gct tca atg ctt tac cta gat      960
Ala Asp Gly Leu Arg Val Asp Ala Val Ala Ser Met Leu Tyr Leu Asp
305                 310                 315                 320
tac tct agg aaa gaa tgg gtt cca aac ata tac gga ggg aaa gaa aac     1008
Tyr Ser Arg Lys Glu Trp Val Pro Asn Ile Tyr Gly Gly Lys Glu Asn
                325                 330                 335
ctc gag gct ata gaa ttc ctc agg aag ttt aac gaa agc gtt tac aga     1056
Leu Glu Ala Ile Glu Phe Leu Arg Lys Phe Asn Glu Ser Val Tyr Arg
            340                 345                 350
aat ttt cca gac gtc cag aca ata gcg gag gaa tca aca gcc tgg cct     1104
Asn Phe Pro Asp Val Gln Thr Ile Ala Glu Glu Ser Thr Ala Trp Pro
        355                 360                 365
atg gtg tcc aga cct aca tac gtg ggg gga ctg gga ttt gga atg aag     1152
Met Val Ser Arg Pro Thr Tyr Val Gly Gly Leu Gly Phe Gly Met Lys
    370                 375                 380
tgg aat atg ggt tgg atg aac gac aca ctc ttt tac ttt tca aag gat     1200
Trp Asn Met Gly Trp Met Asn Asp Thr Leu Phe Tyr Phe Ser Lys Asp
385                 390                 395                 400
ccc atc tac agg aag tac cac cat gaa gtc ctc act ttc agt ata tgg     1248
Pro Ile Tyr Arg Lys Tyr His His Glu Val Leu Thr Phe Ser Ile Trp
                405                 410                 415
tac gct ttt tcc gag aac ttc gtc ctt cca cta tcc cac gat gaa gtt     1296
Tyr Ala Phe Ser Glu Asn Phe Val Leu Pro Leu Ser His Asp Glu Val
            420                 425                 430
gtt cac gga aag ggt tct ctg ata ggg aag atg cca gga gat tac tgg     1344
Val His Gly Lys Gly Ser Leu Ile Gly Lys Met Pro Gly Asp Tyr Trp
        435                 440                 445
cag aag ttt gca aac ctt aga gcc ctt ttc gga tac atg tgg gca cac     1392
Gln Lys Phe Ala Asn Leu Arg Ala Leu Phe Gly Tyr Met Trp Ala His
    450                 455                 460
cca ggg aaa aaa ctc ctc ttt atg ggg gga gag ttc gga cag ttt aag     1440
Pro Gly Lys Lys Leu Leu Phe Met Gly Gly Glu Phe Gly Gln Phe Lys
465                 470                 475                 480
gaa tgg gat cac gaa acg agt ctc gac tgg cac ctc ttg gaa tac cct     1488
Glu Trp Asp His Glu Thr Ser Leu Asp Trp His Leu Leu Glu Tyr Pro
                485                 490                 495
tct cac aga ggt att cag aga tta gtt aag gac tta aac gaa gtt tac     1536
Ser His Arg Gly Ile Gln Arg Leu Val Lys Asp Leu Asn Glu Val Tyr
            500                 505                 510
agg agg gaa aag gct ttg cac gaa acg gat ttt tca cct gag ggc ttt     1584
Arg Arg Glu Lys Ala Leu His Glu Thr Asp Phe Ser Pro Glu Gly Phe
        515                 520                 525
gag tgg gta gac ttc cac gac tgg gaa aag agc gtt ata tcc ttc ttg     1632
Glu Trp Val Asp Phe His Asp Trp Glu Lys Ser Val Ile Ser Phe Leu
    530                 535                 540
aga aag gac aaa agc ggt aag gaa att ata ctc gta gtt tgc aac ttc     1680
Arg Lys Asp Lys Ser Gly Lys Glu Ile Ile Leu Val Val Cys Asn Phe
545                 550                 555                 560
aca ccc gtt ccg aga tac gat tac agg gta ggt gta ccg aaa ggc gga     1728
Thr Pro Val Pro Arg Tyr Asp Tyr Arg Val Gly Val Pro Lys Gly Gly
                565                 570                 575
tac tgg agg gag ata atg aat acc gat gca aag gag tac tgg ggc tcc     1776
Tyr Trp Arg Glu Ile Met Asn Thr Asp Ala Lys Glu Tyr Trp Gly Ser
            580                 585                 590
gga atg gga aat ctg ggt gga aaa gag gct gat aaa atc ccg tgg cac     1824
Gly Met Gly Asn Leu Gly Gly Lys Glu Ala Asp Lys Ile Pro Trp His
        595                 600                 605
gga aga aaa ttc tca ctt tca ctt acc ctg cct ccc ctt tcc gtg atc     1872
Gly Arg Lys Phe Ser Leu Ser Leu Thr Leu Pro Pro Leu Ser Val Ile
    610                 615                 620
tat tta aag cac gaa gga tga                                         1893
Tyr Leu Lys His Glu Gly
625                 630
<210>2
<211>630
<212>PRT
<213>风产热菌
<400>2
Met Lys Lys Phe Ser Leu Ile Ser Asp Tyr Asp Val Tyr Leu Phe Lys
1               5                   10                  15
Glu Gly Thr His Thr Arg Leu Tyr Asp Lys Leu Gly Ser His Val Ile
            20                  25                  30
Glu Leu Asn Gly Lys Arg Tyr Thr Phe Phe Ala ValTrp Ala Pro His
        35                  40                  45
Ala Asp Tyr Val Ser Leu Ile Gly Asp Phe Asn Glu Trp Asp Lys Gly
    50                  55                  60
Ser Thr Pro Met Val Lys Arg Glu Asp Gly Ser Gly Ile Trp Glu Val
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Gly Asp Leu Thr Gly Ser Lys Tyr Lys Tyr Phe Ile Lys
                85                  90                  95
Asn Gly Asn Tyr Glu Val Asp Lys Ser Asp Pro Phe Ala Phe Phe Cys
            100                 105                 110
Glu Gln Pro Pro Gly Asn Ala Ser Val Val Trp Lys Leu Asn Tyr Arg
        115                 120                 125
Trp Asn Asp Ser Glu Tyr Met Lys Lys Arg Lys Arg Val Asn Ser His
    130                 135                 140
Asp Ser Pro Ile Ser Ile Tyr Glu Val His Val Gly Ser Trp Arg Arg
145                 150                 155                 160
Val Pro Glu Glu Gly Asn Arg Phe Leu Ser Tyr Arg Glu Leu Ala Glu
                165                 170                 175
Tyr Leu Pro Tyr Tyr Val Lys Glu Met Gly Phe Thr His Val Glu Phe
            180                 185                 190
Leu Pro Val Met Glu His Pro Phe Tyr Gly Ser Trp Gly Tyr Gln Ile
        195                 200                 205
Thr Gly Tyr Phe Ala Pro Thr Ser Arg Tyr Gly Thr Pro Gln Asp Phe
    210                 215                 220
Met Tyr Leu Ile Asp Lys Leu His Gln Glu Gly Ile Gly Val Ile Leu
225                 230                 235                 240
Asp Trp Val Pro Ser His Phe Pro Thr Asp Ala His Gly Leu Ala Tyr
                245                 250                 255
Phe Asp Gly Thr His Leu Tyr Glu Tyr Glu Asp Trp Arg Lys Arg Trp
            260                 265                 270
His Pro Asp Trp Asn Ser Phe Val Phe Asp Tyr Gly Lys Pro Glu Val
        275                 280                 285
Arg Ser Phe Leu Leu Ser Ser Ala His Phe Trp Leu Asp Lys Tyr His
    290                 295                 300
Ala Asp Gly Leu Arg Val Asp Ala Val Ala Ser Met Leu Tyr Leu Asp
305                 310                 315                 320
Tyr Ser Arg Lys Glu Trp Val Pro Asn Ile Tyr Gly Gly Lys Glu Asn
                325                 330                 335
Leu Glu Ala Ile Glu Phe Leu Arg Lys Phe Asn Glu Ser Val Tyr Arg
            340                 345                 350
Asn Phe Pro Asp Val Gln Thr Ile Ala Glu Glu Ser Thr Ala Trp Pro
        355                 360                 365
Met Val Ser Arg Pro Thr Tyr Val Gly Gly Leu Gly Phe Gly Met Lys
    370                 375                 380
Trp Asn Met Gly Trp Met Asn Asp Thr Leu Phe Tyr Phe Ser Lys Asp
385                 390                 395                 400
Pro Ile Tyr Arg Lys Tyr His His Glu Val Leu Thr Phe Ser Ile Trp
                405                 410                 415
Tyr Ala Phe Ser Glu Asn Phe Val Leu Pro Leu Ser His Asp Glu Val
            420                 425                 430
Val His Gly Lys Gly Ser Leu Ile Gly Lys Met Pro Gly Asp Tyr Trp
        435                 440                 445
Gln Lys Phe Ala Asn Leu Arg Ala Leu Phe Gly Tyr Met Trp Ala His
    450                 455                 460
Pro Gly Lys Lys Leu Leu Phe Met Gly Gly Glu Phe Gly Gln Phe Lys
465                 470                 475                 480
Glu Trp Asp His Glu Thr Ser Leu Asp Trp His Leu Leu Glu Tyr Pro
                485                 490                 495
Ser His Arg Gly Ile Gln Arg Leu Val Lys Asp Leu Asn Glu Val Tyr
            500                 505                 510
Arg Arg Glu Lys Ala Leu His Glu Thr Asp Phe Ser Pro Glu Gly Phe
        515                 520                 525
Glu Trp Val Asp Phe His Asp Trp Glu Lys Ser Val Ile Ser Phe Leu
    530                 535                 540
Arg Lys Asp Lys Ser Gly Lys Glu Ile Ile Leu Val Val Cys Asn Phe
545                 550                 555                 560
Thr Pro Val Pro Arg Tyr Asp Tyr Arg Val Gly Val Pro Lys Gly Gly
                565                 570                 575
Tyr Trp Arg Glu Ile Met Asn Thr Asp Ala Lys Glu Tyr Trp Gly Ser
            580                 585                 590
Gly Met Gly Asn Leu Gly Gly Lys Glu Ala Asp Lys Ile Pro Trp His
        595                 600                 605
Gly Arg Lys Phe Ser Leu Ser Leu Thr Leu Pro Pro Leu Ser Val Ile
    610                 615                 620
Tyr Leu Lys His Glu Gly
625                 630
<210>3
<211>1866
<212>DNA
<213>Rhodothermus obamensis
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1866)
<400>3
atg agc tgg ctc acg gaa gaa gac atc cgg cgc tgg gaa agc ggt acg        48
Met Ser Trp Leu Thr Glu Glu Asp Ile Arg Arg Trp Glu Ser Gly Thr
1               5                   10                  15
ttc tac gac agt tac cga aag ctg ggc gcc cat ccc gac gac gaa ggc        96
Phe Tyr Asp Ser Tyr Arg Lys Leu Gly Ala His Pro Asp Asp Glu Gly
            20                  25                  30
acc tgg ttc tgc gtc tgg gcg ccg cat gcc gat ggc gtc tcg gtg ctc      144
Thr Trp Phe Cys Val Trp Ala Pro His Ala Asp Gly Val Ser Val Leu
        35                  40                  45
gga gcg ttc aac gac tgg aat ccg gag gcc aac ccg ctg gag cgc tac      192
Gly Ala Phe Asn Asp Trp Asn Pro Glu Ala Asn Pro Leu Glu Arg Tyr
    50                  55                  60
ggc ggc ggc ctg tgg gcc ggt tac gta ccg gga gcg cgc ccg ggc cac      240
Gly Gly Gly Leu Trp Ala Gly Tyr Val Pro Gly Ala Arg Pro Gly His
65                  70                  75                  80
acc tac aag tat cgc atc cgg cac ggc ttc tat cag gcc gac aag acg      288
Thr Tyr Lys Tyr Arg Ile Arg His Gly Phe Tyr Gln Ala Asp Lys Thr
                85                  90                  95
gat ccc tac gcc ttc gcc atg gag ccg cct acc ggc agt ccc atc gaa      336
Asp Pro Tyr Ala Phe Ala Met Glu Pro Pro Thr Gly Ser Pro Ile Glu
            100                 105                 110
ggg ctg gcc tcc atc atc acg cgg ctc gac tac acc tgg cac gac gac      384
Gly Leu Ala Ser Ile Ile Thr Arg Leu Asp Tyr Thr Trp His Asp Asp
        115                 120                 125
gaa tgg atg cgg cgc cgg aag ggt ccg gcc agc ctt tac gag ccg gtt      432
Glu Trp Met Arg Arg Arg Lys Gly Pro Ala Ser Leu Tyr Glu Pro Val
    130                 135                 140
tcc atc tac gag gta cat ctg ggc tcc tgg cgt cac aaa cgg ccc ggc      480
Ser Ile Tyr Glu Val His Leu Gly Ser Trp Arg His Lys Arg Pro Gly
145                 150                 155                 160
gag tcc ttc tct tac cgg gag att gcc gag ccg ctg gcc gac tac gtg      528
Glu Ser Phe Ser Tyr Arg Glu Ile Ala Glu Pro Leu Ala Asp Tyr Val
                165                 170                 175
cag gag atg ggc ttc acg cac gtg gag ctg ctg ccc gtc atg gaa cat      576
Gln Glu Met Gly Phe Thr His Val Glu Leu Leu Pro Val Met Glu His
            180                 185                 190
ccc tac tac ggc tcc tgg ggc tat cag gtg gtg ggc tac tac gcc cca      624
Pro Tyr Tyr Gly Ser Trp Gly Tyr Gln Val Val Gly Tyr Tyr Ala Pro
        195                 200                 205
acg ttt cgc tac gga tca ccc cag gac ctg atg tac ctg atc gac tac      672
Thr Phe Arg Tyr Gly Ser Pro Gln Asp Leu Met Tyr Leu Ile Asp Tyr
    210                 215                 220
ctg cac cag cgc ggc atc ggc gtc atc ctc gac tgg gtc ccg agc cac      720
Leu His Gln Arg Gly Ile Gly Val Ile Leu Asp Trp Val Pro Ser His
225                 230                 235                 240
ttt gcg gcc gat ccc cag gga ctg gtt ttc ttc gac ggg acc aca ctc      768
Phe Ala Ala Asp Pro Gln Gly Leu Val Phe Phe Asp Gly Thr Thr Leu
                245                 250                 255
ttc gaa tac gac gat ccc aag atg cgc tat cac cct gac tgg ggt acg      816
Phe Glu Tyr Asp Asp Pro Lys Met Arg Tyr His Pro Asp Trp Gly Thr
            260                 265                 270
tat gtg ttc gat tac aac aag ccg ggc gta cgc aac ttt ctg att tcc      864
Tyr Val Phe Asp Tyr Asn Lys Pro Gly Val Arg Asn Phe Leu Ile Ser
        275                 280                 285
aac gca ctt ttc tgg ctc gaa aag tac cac gtc gac ggg ctg cgc gtc      912
Asn Ala Leu Phe Trp Leu Glu Lys Tyr His Val Asp Gly Leu Arg Val
    290                 295                 300
gat gcg gtg gct tct atg ctc tac cgg gac tac tca cgc aag gag tgg      960
Asp Ala Val Ala Ser Met Leu Tyr Arg Asp Tyr Ser Arg Lys Glu Trp
305                 310                 315                 320
aca ccc aac atc ttc ggc ggc cgt gaa aac ctg gag gcc att gat ttc      1008
Thr Pro Asn Ile Phe Gly Gly Arg Glu Asn Leu Glu Ala Ile Asp Phe
                325                 330                 335
atc aag aaa ttc aac gaa acg gtc tac ctg cac ttc ccc gag gcc atg     1056
Ile Lys Lys Phe Asn Glu Thr Val Tyr Leu His Phe Pro Glu Ala Met
            340                 345                 350
acg atc gcc gag gag tcg acg gcc tgg ccc ggc gtg tcg gcc ccc acc     1104
Thr Ile Ala Glu Glu Ser Thr Ala Trp Pro Gly Val Ser Ala Pro Thr
        355                 360                 365
tac aac aac ggt ctg ggc ttc ctc tac aag tgg aac atg ggc tgg atg     1152
Tyr Asn Asn Gly Leu Gly Phe Leu Tyr Lys Trp Asn Met Gly Trp Met
    370                 375                 380
cac gac acg ctg gac tac atc cag cgc gat ccc atc tac cgc aag tat     1200
His Asp Thr Leu Asp Tyr Ile Gln Arg Asp Pro Ile Tyr Arg Lys Tyr
385                 390                 395                 400
cac cac gac gag ctg acc ttc tcg ctc tgg tac gcc ttt tcg gag cac     1248
His His Asp Glu Leu Thr Phe Ser Leu Trp Tyr Ala Phe Ser Glu His
                405                 410                 415
tac gtc ctg ccg ctc tcg cac gac gag gtg gtg cac ggc aag ggc tcg     1296
Tyr Val Leu Pro Leu Ser His Asp Glu Val Val His Gly Lys Gly Ser
            420                 425                 430
ctc tgg ggt aaa atg ccc ggc gac gac tgg cag aag gca gcc aac ttg     1344
Leu Trp Gly Lys Met Pro Gly Asp Asp Trp Gln Lys Ala Ala Asn Leu
        435                 440                 445
cgc ctg ctc ttt ggc cac atg tgg ggc cat ccg ggc aaa aaa ctg ctc     1392
Arg Leu Leu Phe Gly His Met Trp Gly His Pro Gly Lys Lys Leu Leu
    450                 455                 460
ttc atg ggc ggc gag ttc ggc cag cac cac gag tgg aac cac gac acg     1440
Phe Met Gly Gly Glu Phe Gly Gln His His Glu Trp Asn His Asp Thr
465                 470                 475                 480
cag ctc gaa tgg cac ctg ctg gac cag ccc tac cat cga ggt att cag     1488
Gln Leu Glu Trp His Leu Leu Asp Gln Pro Tyr His Arg Gly Ile Gln
                485                 490                 495
ctg tgg gtg tgc gat ctg aac cac ctc tac cgt acg aat ccg gcc ctc     1536
Leu Trp Val Cys Asp Leu Asn His Leu Tyr Arg Thr Asn Pro Ala Leu
            500                 505                 510
tgg cac gac gga ccg gaa ggg ttc gag tgg atc gac ttc agc gac cgc     1584
Trp His Asp Gly Pro Glu Gly Phe Glu Trp Ile Asp Phe Ser Asp Arg
        515                 520                 525
gac cag agc gtg atc tgt tac ctg cgc aag aat gcc ggc cgc atg ctg     1632
Asp Gln Ser Val Ile Cys Tyr Leu Arg Lys Asn Ala Gly Arg Met Leu
    530                 535                 540
ctg ttc gtg ctg aac ttt acg ccc gtg cca cgc gag cac tac cgc gtg     1680
Leu Phe Val Leu Asn Phe Thr Pro Val Pro Arg Glu His Tyr Arg Val
545                 550                 555                 560
ggc gtg ccg atc ggt ggc ccc tgg cac gag gtg ctc aac agc gac gcg     1728
Gly Val Pro Ile Gly Gly Pro Trp His Glu Val Leu Asn Ser Asp Ala
                565                 570                 575
gtg gcc tac ggc ggg agc ggg atg ggc aac ttc ggc cgc gtc gag gcg     1776
Val Ala Tyr Gly Gly Ser Gly Met Gly Asn Phe Gly Arg Val Glu Ala
            580                 585                 590
gtg ccc gag tcc tgg cac ggc cgc ccc ttc cac tta gag ctg acg ctt     1824
Val Pro Glu Ser Trp His Gly Arg Pro Phe His Leu Glu Leu Thr Leu
        595                 600                 605
ccc ccg ctg gcc gcc ctc atc ctg gag ccg gag cac ggg tag             1866
Pro Pro Leu Ala Ala Leu Ile Leu Glu Pro Glu His Gly
    610                 615                 620
<210>4
<211>621
<212>PRT
<213>Rhodothermus obamensis
<400>4
Met Ser Trp Leu Thr Glu Glu Asp Ile Arg Arg Trp Glu Ser Gly Thr
1               5                   10                  15
Phe Tyr Asp Ser Tyr Arg Lys Leu Gly Ala His Pro Asp Asp Glu Gly
            20                  25                  30
Thr Trp Phe Cys Val Trp Ala Pro His Ala Asp Gly Val Ser Val Leu
        35                  40                  45
Gly Ala Phe Asn Asp Trp Asn Pro Glu Ala Asn Pro Leu Glu Arg Tyr
    50                  55                  60
Gly Gly Gly Leu Trp Ala Gly Tyr Val Pro Gly Ala Arg Pro Gly His
65                  70                  75                  80
Thr Tyr Lys Tyr Arg Ile Arg His Gly Phe Tyr Gln Ala Asp Lys Thr
                85                  90                  95
Asp Pro Tyr Ala Phe Ala Met Glu Pro Pro Thr Gly Ser Pro Ile Glu
            100                105                  110
Gly Leu Ala Ser Ile Ile Thr Arg Leu Asp Tyr Thr Trp His Asp Asp
        115                 120                  125
Glu Trp Met Arg Arg Arg Lys Gly Pro Ala Ser Leu Tyr Glu Pro Val
    130                 135                 140
Ser Ile Tyr Glu Val His Leu Gly Ser Trp Arg His Lys Arg Pro Gly
145                 150                 155                 160
Glu Ser Phe Ser Tyr Arg Glu Ile Ala Glu Pro Leu Ala Asp Tyr Val
                165                 170                 175
Gln Glu Met Gly Phe Thr His Val Glu Leu Leu Pro Val Met Glu His
            180                 185                 190
Pro Tyr Tyr Gly Ser Trp Gly Tyr Gln Val Val Gly Tyr Tyr Ala Pro
        195                 200                 205
Thr Phe Arg Tyr Gly Ser Pro Gln Asp Leu Met Tyr Leu Ile Asp Tyr
    210                 215                 220
Leu His Gln Arg Gly Ile Gly Val Ile Leu Asp Trp Val Pro Ser His
225                 230                 235                 240
Phe Ala Ala Asp Pro Gln Gly Leu Val Phe Phe Asp Gly Thr Thr Leu
                245                 250                 255
Phe Glu Tyr Asp Asp Pro Lys Met Arg Tyr His Pro Asp Trp Gly Thr
            260                 265                 270
Tyr Val Phe Asp Tyr Asn Lys Pro Gly Val Arg Asn Phe Leu Ile Ser
        275                 280                 285
Asn Ala Leu Phe Trp Leu Glu Lys Tyr His Val Asp Gly Leu Arg Val
    290                 295                 300
Asp Ala Val Ala Ser Met Leu Tyr Arg Asp Tyr Ser Arg Lys Glu Trp
305                 310                 315                 320
Thr Pro Asn Ile Phe Gly Gly Arg Glu Asn Leu Glu Ala Ile Asp Phe
                325                 330                 335
Ile Lys Lys Phe Asn Glu Thr Val Tyr Leu His Phe Pro Glu Ala Met
            340                 345                 350
Thr Ile Ala Glu Glu Ser Thr Ala Trp Pro Gly Val Ser Ala Pro Thr
        355                 360                 365
Tyr Asn Asn Gly Leu Gly Phe Leu Tyr Lys Trp Asn Met Gly Trp Met
    370                 375                 380
His Asp Thr Leu Asp Tyr Ile Gln Arg Asp Pro Ile Tyr Arg Lys Tyr
385                 390                 395                 400
His His Asp Glu Leu Thr Phe Ser Leu Trp Tyr Ala Phe Ser Glu His
                405                 410                 415
Tyr Val Leu Pro Leu Ser His Asp Glu Val Val His Gly Lys Gly Ser
            420                 425                 430
Leu Trp Gly Lys Met Pro Gly Asp Asp Trp Gln Lys Ala Ala Asn Leu
        435                 440                 445
Arg Leu Leu Phe Gly His Met Trp Gly His Pro Gly Lys Lys Leu Leu
    450                 455                 460
Phe Met Gly Gly Glu Phe Gly Gln His His Glu Trp Asn His Asp Thr
465                 470                 475                 480
Gln Leu Glu Trp His Leu Leu Asp Gln Pro Tyr His Arg Gly Ile Gln
                485                 490                 495
Leu Trp Val Cys Asp Leu Asn His Leu Tyr Arg Thr Asn Pro Ala Leu
            500                 505                 510
Trp His Asp Gly Pro Glu Gly Phe Glu Trp Ile Asp Phe Ser Asp Arg
        515                 520                 525
Asp Gln Ser Val Ile Cys Tyr Leu Arg Lys Asn Ala Gly Arg Met Leu
    530                 535                 540
Leu Phe Val Leu Asn Phe Thr Pro Val Pro Arg Glu His Tyr Arg Val
545                 550                 555                 560
Gly Val Pro Ile Gly Gly Pro Trp His Glu Val Leu Asn Ser Asp Ala
                565                 570                 575
Val Ala Tyr Gly Gly Ser Gly Met Gly Asn Phe Gly Arg Val Glu Ala
            580                 585                 590
Val Pro Glu Ser Trp His Gly Arg Pro Phe His Leu Glu Leu Thr Leu
        595                 600                 605
Pro Pro Leu Ala Ala Leu Ile Leu Glu Pro Glu His Gly
     610                 615                 620
<210>5
<211>1959
<212>DNA
<213>嗜热脂肪芽孢杆菌TRBE14
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1959)
<400>5
ttg att gcg gcg aat ccg acg gat ttg gaa gtg tat ttg ttt cat gaa        48
Met Ile Ala Ala Asn Pro Thr Asp Leu Glu Val Tyr Leu Phe His Glu
1               5                   10                  15
ggc agc ttg tat aaa agt tac gag ctg ttt ggc gcc cat gtg att aat        96
Gly Ser Leu Tyr Lys Ser Tyr Glu Leu Phe Gly Ala His Val Ile Asn
            20                  25                  30
gag ggc ggg aag gtc ggc acc cgt ttt tgt gtt tgg gcg ccg cac gcg       144
Glu Gly Gly Lys Val Gly Thr Arg Phe Cys Val Trp Ala Pro His Ala
        35                  40                  45
cgc gag gtg cgt ctt gtc ggc agt ttc aac gat tgg gac ggg acg gat       192
Arg Glu Val Arg Leu Val Gly Ser Phe Asn Asp Trp Asp Gly Thr Asp
    50                  55                  60
ttt cgc ctt gag aaa gtg aat gat gaa ggg gta tgg acg att gtt gtc       240
Phe Arg Leu Glu Lys Val Asn Asp Glu Gly Val Trp Thr Ile Val Val
65                  70                  75                  80
ccc gaa aac ttg gaa ggg cat tta tat aag tat gag att gtt acg ccg       288
Pro Glu Asn Leu Glu Gly His Leu Tyr Lys Tyr Glu Ile Val Thr Pro
                85                  90                  95
gac gga cag gtg ctg ttc aaa gcc gac ccg tac gct ttt tac tcc gaa       336
Asp Gly Gln Val Leu Phe Lys Ala Asp Pro Tyr Ala Phe Tyr Ser Glu
            100                 105                 110
ttg cgt cct cat acc gcc tcg att gcc tac gat ctg aaa gga tac cag       384
Leu Arg Pro His Thr Ala Ser Ile Ala Tyr Asp Leu Lys Gly Tyr Gln
        115                 120                 125
tgg aac gat caa tct tgg aag cgg aag aag cga cga aaa cgg att tat       432
Trp Asn Asp Gln Ser Trp Lys Arg Lys Lys Arg Arg Lys Arg Ile Tyr
    130                 135                 140
gat cag ccc atg gtg att tat gaa ctc cat ttc ggt tcg tgg aag aaa       480
Asp Gln Pro Met Val Ile Tyr Glu Leu His Phe Gly Ser Trp Lys Lys
145                 150                 155                 160
aaa gat ggg cgt ttt tat acg tac cgt gag atg gcc gat gaa ctg atc       528
Lys Asp Gly Arg Phe Tyr Thr Tyr Arg Glu Met Ala Asp Glu Leu Ile
                165                 170                 175
tcg tat gtg ctc gat cat ggg ttt acg cac att gag ttg ctt cct ctc       576
Ser Tyr Val Leu Asp His Gly Phe Thr His Ile Glu Leu Leu Pro Leu
            180                 185                 190
gtc gag cat ccg ctc gac cgc tcg tgg ggc tat caa gga aca ggg tat       624
Val Glu His Pro Leu Asp Arg Ser Trp Gly Tyr Gln Gly Thr Gly Tyr
        195                 200                 205
tat gcg gta acg agt cgc tat ggt acg cca cac gac ttc atg tacttc       672
Tyr Ala Val Thr Ser Arg Tyr Gly Thr Pro His Asp Phe Met Tyr Phe
    210                 215                 220
gtc gac cgt tgc cat cag gcg gga atc ggg gtc att atg gac tgg gtg      720
Val Asp Arg Cys His Gln Ala Gly Ile Gly Val Ile Met Asp Trp Val
225                 230                 235                 240
ccg ggg cat ttt tgc aag gac gcc cat ggg tta tat atg ttt gat ggc      768
Pro Gly His Phe Cys Lys Asp Ala His Gly Leu Tyr Met Phe Asp Gly
                245                 250                 255
gcc ccg acg tat gaa tac gcg aat gaa aaa gac cga gaa aat tac gtt      816
Ala Pro Thr Tyr Glu Tyr Ala Asn Glu Lys Asp Arg Glu Asn Tyr Val
            260                 265                 270
tgg ggg acg gcc aat ttt gat tta ggc aag ccg gaa gtg cgc agt ttt      864
Trp Gly Thr Ala Asn Phe Asp Leu Gly Lys Pro Glu Val Arg Ser Phe
        275                 280                 285
ctc atc tcg aac gca ttg ttt tgg ctc gag tat tac cat atc gac ggg      912
Leu Ile Ser Asn Ala Leu Phe Trp Leu Glu Tyr Tyr His Ile Asp Gly
    290                 295                 300
ttc cgg gtc gat gcg gtt gcc aat atg ctt tat tgg ccg aac aat gac      960
Phe Arg Val Asp Ala Val Ala Asn Met Leu Tyr Trp Pro Asn Asn Asp
305                 310                 315                 320
agg ctg tac gag aac ccg tat gcg gtc gag ttt ttg cgc aag tta aac     1008
Arg Leu Tyr Glu Asn Pro Tyr Ala Val Glu Phe Leu Arg Lys Leu Asn
                325                 330                 335
gaa gcg gtg ttt gcc tat gat ccg aat gcg ctg atg att gcg gaa gat     1056
Glu Ala Val Phe Ala Tyr Asp Pro Asn Ala Leu Met Ile Ala Glu Asp
            340                 345                 350
tcg act gac tgg ccg aag gtg acc gcg ccg acg tat gaa ggc gga ctc     1104
Ser Thr Asp Trp Pro Lys Val Thr Ala Pro Thr Tyr Glu Gly Gly Leu
        355                 360                 365
ggc ttt aat tat aaa tgg aac atg ggc tgg atg aac gac atg ctg aag     1152
Gly Phe Asn Tyr Lys Trp Asn Met Gly Trp Met Asn Asp Met Leu Lys
    370                 375                 380
tac atg gaa aca ccg ccg tat gag cgg agg cat gtg cat aac caa gta     1200
Tyr Met Glu Thr Pro Pro Tyr Glu Arg Arg His Val His Asn Gln Val
385                 390                 395                 400
acg ttc tcc ctc ctt tat gcg tat tcg gaa aat ttc att ttg ccg ttt     1248
Thr Phe Ser Leu Leu Tyr Ala Tyr Ser Glu Asn Phe Ile Leu Pro Phe
                405                 410                 415
tcc cac gat gaa gtc gtg cat ggc aaa aaa tcg ctg ctc aat aaa atg     1296
Ser His Asp Glu Val Val His Gly Lys Lys Ser Leu Leu Asn Lys Met
            420                 425                 430
cca ggg tcg tat gaa gag aag ttc gcc cag ctg cgc ctc ttg tac ggc     1344
Pro Gly Ser Tyr Glu Glu Lys Phe Ala Gln Leu Arg Leu Leu Tyr Gly
        435                 440                 445
tac atg atg gct cat ccg ggg aaa aag ctg ttg ttt atg ggc aat gaa     1392
Tyr Met Met Ala His Pro Gly Lys Lys Leu Leu Phe Met Gly Asn Glu
    450                 455                 460
ttt gct cag ttt gat gaa tgg aag ttt gag gat gaa ctc gat tgg gtg     1440
Phe Ala Gln Phe Asp Glu Trp Lys Phe Glu Asp Glu Leu Asp Trp Val
465                 470                 475                 480
ctg ttt gat ttt gag ctg cac cgg aag atg aac gat tac atg aaa gag     1488
Leu Phe Asp Phe Glu Leu His Arg Lys Met Asn Asp Tyr Met Lys Glu
                485                 490                 495
tta atc gcc tgc tat aaa cgg tat aag ccg ttt tac gaa ttg gat cat     1536
Leu Ile Ala Cys Tyr Lys Arg Tyr Lys Pro Phe Tyr Glu Leu Asp His
            500                 505                 510
gac ccg caa gga ttt gaa tgg att gac gtt cac aac gct gaa caa agc     1584
Asp Pro Gln Gly Phe Glu Trp Ile Asp Val His Asn Ala Glu Gln Ser
        515                 520                 525
att ttc tca ttc atc cgc cgc ggg aaa aaa gaa gat gat gtg ctt gtt     1632
Ile Phe Ser Phe Ile Arg Arg Gly Lys Lys Glu Asp Asp Val Leu Val
    530                 535                 540
att gtt tgc aat ttc aca aat cag gcg tat gac gac tac aaa gtt gga     1680
Ile Val Cys Asn Phe Thr Asn Gln Ala Tyr Asp Asp Tyr Lys Val Gly
545                 550                 555                 560
gtg ccg ttg ctc gta ccg tat cgg gaa gtg ctg aat agc gat gcg gtc     1728
Val Pro Leu Leu Val Pro Tyr Arg Glu Val Leu Asn Ser Asp Ala Val
                565                 570                 575
acg ttt ggt gga tcg ggg cat gtc aat ggg aaa cgg ctt tcc gcc ttc     1776
Thr Phe Gly Gly Ser Gly His Val Asn Gly Lys Arg Leu Ser Ala Phe
            580                 585                 590
aat gag ccg ttt cat ggt aaa cca tac cac gtg cgc atg acg att ccg     1824
Asn Glu Pro Phe His Gly Lys Pro Tyr His Val Arg Met Thr Ile Pro
        595                 600                 605
cca ttt ggc att tcc att tta cgg cca gtg caa aaa cga ggg gag aga     1872
Pro Phe Gly Ile Ser Ile Leu Arg Pro Val Gln Lys Arg Gly Glu Arg
    610                 615                 620
aag cga aat gaa aaa gaa atg cat cgc cat gtt att ggc cgg cgg gca     1920
Lys Arg Asn Glu Lys Glu Met His Arg His Val Ile Gly Arg Arg Ala
625                 630                 635                 640
agg aag tcg gct tcg ctc gct gac gac aaa cat cgc taa                 1959
Arg Lys Ser Ala Ser Leu Ala Asp Asp Lys His Arg
                645                 650
<210>6
<211>652
<212>PRT
<213>嗜热脂肪芽孢杆菌TRBE14
<400>6
Met Ile Ala Ala Asn Pro Thr Asp Leu Glu Val Tyr Leu Phe His Glu
1               5                   10                  15
Gly Ser Leu Tyr Lys Ser Tyr Glu Leu Phe Gly Ala His Val Ile Asn
            20                  25                  30
Glu Gly Gly Lys Val Gly Thr Arg Phe Cys Val Trp Ala Pro His Ala
        35                  40                  45
Arg Glu Val Arg Leu Val Gly Ser Phe Asn Asp Trp Asp Gly Thr Asp
    50                  55                  60
Phe Arg Leu Glu Lys Val Asn Asp Glu Gly Val Trp Thr Ile Val Val
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asn Leu Glu Gly His Leu Tyr Lys Tyr Glu Ile ValThr Pro
                85                  90                  95
Asp Gly Gln Val Leu Phe Lys Ala Asp Pro Tyr Ala Phe Tyr Ser Glu
            100                 105                 110
Leu Arg Pro His Thr Ala Ser Ile Ala Tyr Asp Leu Lys Gly Tyr Gln
        115                 120                 125
Trp Asn Asp Gln Ser Trp Lys Arg Lys Lys Arg Arg Lys Arg Ile Tyr
    130                 135                 140
Asp Gln Pro Met Val Ile Tyr Glu Leu His Phe Gly Ser Trp Lys Lys
145                 150                 155                 160
Lys Asp Gly Arg Phe Tyr Thr Tyr Arg Glu Met Ala Asp Glu Leu Ile
                165                 170                 175
Ser Tyr Val Leu Asp His Gly Phe Thr His Ile Glu Leu Leu Pro Leu
            180                 185                 190
Val Glu His Pro Leu Asp Arg Ser Trp Gly Tyr Gln Gly Thr Gly Tyr
        195                 200                 205
Tyr Ala Val Thr Ser Arg Tyr Gly Thr Pro His Asp Phe Met Tyr Phe
    210                 215                 220
Val Asp Arg Cys His Gln Ala Gly Ile Gly Val Ile Met Asp Trp Val
225                 230                 235                 240
Pro Gly His Phe Cys Lys Asp Ala His Gly Leu Tyr Met Phe Asp Gly
                245                 250                 255
Ala Pro Thr Tyr Glu Tyr Ala Asn Glu Lys Asp Arg Glu Asn Tyr Val
            260                 265                 270
Trp Gly Thr Ala Asn Phe Asp Leu Gly Lys Pro GIu Val Arg Ser Phe
        275                 280                 285
Leu Ile Ser Asn Ala Leu Phe Trp Leu Glu Tyr Tyr His Ile Asp Gly
    290                 295                 300
Phe Arg Val Asp Ala Val Ala Asn Met Leu Tyr Trp Pro Asn Asn Asp
305                 310                 315                 320
Arg Leu Tyr Glu Asn Pro Tyr Ala Val Glu Phe Leu Arg Lys Leu Asn
                325                 330                 335
Glu Ala Val Phe Ala Tyr Asp Pro Asn Ala Leu Met Ile Ala Glu Asp
            340                 345                 350
Ser Thr Asp Trp Pro Lys Val Thr Ala Pro Thr Tyr Glu Gly Gly Leu
        355                 360                 365
Gly Phe Asn Tyr Lys Trp Asn Met Gly Trp Met Asn Asp Met Leu Lys
    370                 375                 380
Tyr Met Glu Thr Pro Pro Tyr Glu Arg Arg His Val His Asn Gln Val
385                 390                 395                 400
Thr Phe Ser Leu Leu Tyr Ala Tyr Ser Glu Asn Phe Ile Leu Pro Phe
                405                 410                 415
Ser His Asp Glu Val Val His Gly Lys Lys Ser Leu Leu Asn Lys Met
            420                 425                 430
Pro Gly Ser Tyr Glu Glu Lys Phe Ala Gln Leu Arg Leu Leu Tyr Gly
        435                 440                 445
Tyr Met Met Ala His Pro Gly Lys Lys Leu Leu Phe Met Gly Asn Glu
    450                 455                 460
Phe Ala Gln Phe Asp Glu Trp Lys Phe Glu Asp Glu Leu Asp Trp Val
465                 470                 475                 480
Leu Phe Asp Phe Glu Leu His Arg Lys Met Asn Asp Tyr Met Lys Glu
                485                 490                 495
Leu Ile Ala Cys Tyr Lys Arg Tyr Lys Pro Phe Tyr Glu Leu Asp His
            500                 505                 510
Asp Pro Gln Gly Phe Glu Trp Ile Asp Val His Asn Ala Glu Gln Ser
        515                 520                 525
Ile Phe Ser Phe Ile Arg Arg Gly Lys Lys Glu Asp Asp Val Leu Val
    530                 535                 540
Ile Val Cys Asn Phe Thr Asn Gln Ala Tyr Asp Asp Tyr Lys Val Gly
545                 550                 555                 560
Val Pro Leu Leu Val Pro Tyr Arg Glu Val Leu Asn Ser Asp Ala Val
                565                 570                 575
Thr Phe Gly Gly Ser Gly His Val Asn Gly Lys Arg Leu Ser Ala Phe
            580                 585                 590
Asn Glu Pro Phe His Gly Lys Pro Tyr His Val Arg Met Thr Ile Pro
        595                 600                 605
Pro Phe Gly Ile Ser Ile Leu Arg Pro Val Gln Lys Arg Gly Glu Arg
    610                 615                 620
Lys Arg Asn Glu Lys Glu Met His Arg His Val Ile Gly Arg Arg Ala
625                 630                 635                 640
Arg Lys Ser Ala Ser Leu Ala Asp Asp Lys His Arg
                645                 650
<210>7
<211>1920
<212>DNA
<213>嗜热脂肪芽孢杆菌1503-4R变种4
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1920)
<400>7
ttg atc gcc gtc ggt ccc act gat tta gaa atc tat tta ttt cat gaa        48
Met Ile Ala Val Gly Pro Thr Asp Leu Glu Ile Tyr Leu Phe His Glu
1               5                   10                  15
ggc agc tta tat aaa agt tat gaa ttg ttt ggt gca cat gtg ata aag       96
Gly Ser Leu Tyr Lys Ser Tyr Glu Leu Phe Gly Ala His Val Ile Lys
            20                  25                  30
aaa aat ggc atg gtc gga acc cgg ttt tgt gta tgg gca ccc cat gcg      144
Lys Asn Gly Met Val Gly Thr Arg Phe Cys Val Trp Ala Pro His Ala
        35                  40                  45
cgg gaa gtg cga tta gtc ggc agt ttt aat gaa tgg aac gga act aat      192
Arg Glu Val Arg Leu Val Gly Ser Phe Asn Glu Trp Asn Gly Thr Asn
    50                  55                  60
ttt aac ctt atg aaa gta agt aat caa ggc gta tgg atg att ttt att      240
Phe Asn Leu Met Lys Val Ser Asn Gln Gly Val Trp Met Ile Phe Ile
65                  70                  75                  80
cct gaa aac tta gaa ggg cat tta tat aaa tac gaa att acg acg aac      288
Pro Glu Asn Leu Glu Gly His Leu Tyr Lys Tyr Glu Ile Thr Thr Asn
                85                  90                  95
gat ggg aat gtt ctg tta aaa tcg gat cca tac gcg ttt tac tcc gag      336
Asp Gly Asn Val Leu Leu Lys Ser Asp Pro Tyr Ala Phe Tyr Ser Glu
            100                 105                 110
ttg cgt ccc cat act gct tcc att gtc tac aac ata aaa gga tat caa      384
Leu Arg Pro His Thr Ala Ser Ile Val Tyr Asn Ile Lys Gly Tyr Gln
        115                 120                 125
tgg aat gac cag aca tgg cga cgg aag aaa cag cga aag cga att tat      432
Trp Asn Asp Gln Thr Trp Arg Arg Lys Lys Gln Arg Lys Arg Ile Tyr
    130                 135                 140
gac cag cct ttg ttc att tat gaa ctt cac ttt ggt tcg tgg aaa aag      480
Asp Gln Pro Leu Phe Ile Tyr Glu Leu His Phe Gly Ser Trp Lys Lys
145                 150                 155                 160
aaa gag gac ggc agt ttt tat aca tat caa gag atg gca gag gag cta      528
Lys Glu Asp Gly Ser Phe Tyr Thr Tyr Gln Glu Met Ala Glu Glu Leu
                165                 170                 175
atc cct tat gtt ctc gaa cat ggg ttt act cat att gag ctg ctc cca      576
Ile Pro Tyr Val Leu Glu His Gly Phe Thr His Ile Glu Leu Leu Pro
            180                 185                 190
ctc gtc gag cat ccg ttc gat cgt tct tgg gga tat cag gga ata ggt      624
Leu Val Glu His Pro Phe Asp Arg Ser Trp Gly Tyr Gln Gly Ile Gly
        195                 200                 205
tat tat tca gca aca agc cgc tac gga aca ccg cat gat ttg atg tat      672
Tyr Tyr Ser Ala Thr Ser Arg Tyr Gly Thr Pro His Asp Leu Met Tyr
    210                 215                 220
ttt att gac cgc tgt cac caa gct gga ata ggc gtc att ctc gat tgg      720
Phe Ile Asp Arg Cys His Gln Ala Gly Ile Gly Val Ile Leu Asp Trp
225                 230                 235                 240
gtt cct ggc cac ttt tgt aaa gat tcc cat ggg tta tat atg ttt gat      768
Val Pro Gly His Phe Cys Lys Asp Ser His Gly Leu Tyr Met Phe Asp
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ggc gca ccg gca tat gaa tat gcc aac atg caa gac cgg gaa aat tac      816
Gly Ala Pro Ala Tyr Glu Tyr Ala Asn Met Gln Asp Arg Glu Asn Tyr
            260                 265                 270
gta tgg gga acg gca aac ttt gac ctt ggc aag ccg gaa gtc cgc agc      864
Val Trp Gly Thr Ala Asn Phe Asp Leu Gly Lys Pro Glu Val Arg Ser
        275                 280                 285
ttt ttg att tcc aat gcg tta ttt tgg atg gaa tat ttc cat gtg gac      912
Phe Leu Ile Ser Asn Ala Leu Phe Trp Met Glu Tyr Phe His Val Asp
    290                 295                 300
ggg ttt cgt gta gat gct gtt gcc aat atg tta tat tgg cca aac agc      960
Gly Phe Arg Val Asp Ala Val Ala Asn Met Leu Tyr Trp Pro Asn Ser
305                 310                 315                 320
gac gta cta tac aaa aat acg tat gcc gtg gag ttc ttg caa aaa tta     1008
Asp Val Leu Tyr Lys Asn Thr Tyr Ala Val Glu Phe Leu Gln Lys Leu
                325                 330                 335
aat gaa acg gta ttc gcc tat gat ccg aac ata tta atg att gcc gaa     1056
Asn Glu Thr Val Phe Ala Tyr Asp Pro Asn Ile Leu Met Ile Ala Glu
            340                 345                 350
gat tcg aca gac tgg ccg cgc gtc act gct cca aca tac gac gga gga     1104
Asp Ser Thr Asp Trp Pro Arg Val Thr Ala Pro Thr Tyr Asp Gly Gly
        355                 360                 365
tta gga ttt aac tat aaa tgg aac atg gga tgg atg aac gat att tta     1152
Leu Gly Phe Asn Tyr Lys Trp Asn Met Gly Trp Met Asn Asp Ile Leu
    370                 375                 380
act tat atg gaa acg ccg cct gaa cat cga aaa tac gtg cac aat aaa     1200
Thr Tyr Met Glu Thr Pro Pro Glu His Arg Lys Tyr Val His Asn Lys
385                 390                 395                 400
gta aca ttt tcc ctc ttg tat gcg tat tcg gaa aat ttc att tta cct     1248
Val Thr Phe Ser Leu Leu Tyr Ala Tyr Ser Glu Asn Phe Ile Leu Pro
                405                 410                 415
ttt tcc cat gac gag gtc gta cat gga aaa aaa tcg ctg tta agt aaa     1296
Phe Ser His Asp Glu Val Val His Gly Lys Lys Ser Leu Leu Ser Lys
            420                 425                 430
atg ccg ggg aca tat gag gaa aag ttt gcg caa tta agg ttg ctg tat     1344
Met Pro Gly Thr Tyr Glu Glu Lys Phe Ala Gln Leu Arg Leu Leu Tyr
        435                 440                 445
gga tat ttg ttg acg cat cct ggt aag aaa tta ttg ttt atg ggc ggc     1392
Gly Tyr Leu Leu Thr His Pro Gly Lys Lys Leu Leu Phe Met Gly Gly
     450                 455                 460
gaa ttt ggc cag ttt gat gaa tgg aaa gat tta gag cag ctg gat tgg     1440
Glu Phe Gly Gln Phe Asp Glu Trp Lys Asp Leu Glu Gln Leu Asp Trp
465                 470                 475                 480
atg ctt ttt gat ttt gat atg cat cgg aat atg aat atg tat gtg aaa     1488
Met Leu Phe Asp Phe Asp Met His Arg Asn Met Asn Met Tyr Val Lys
                485                 490                 495
gaa ttg ttg aaa tgt tat aag cgc tat aaa ccg ctt tat gag tta gac     1536
Glu Leu Leu Lys Cys Tyr Lys Arg Tyr Lys Pro Leu Tyr Glu Leu Asp
            500                 505                 510
cac tct cca gat gga ttc gag tgg att gat gtt cat aac gcc gaa caa     1584
His Ser Pro Asp Gly Phe Glu Trp Ile Asp Val His Asn Ala Glu Gln
        515                 520                 525
agt att ttc tca ttc att cgc aga gga aaa aaa gag gat gat ttg ctt     1632
Ser Ile Phe Ser Phe Ile Arg Arg Gly Lys Lys Glu Asp Asp Leu Leu
    530                 535                 540
att gtt gtg tgt aat ttc aca aat aaa gta tac cac ggt tat aaa gtt     1680
Ile Val Val Cys Asn Phe Thr Asn Lys ValTyr His Gly Tyr Lys Val
545                 550                 555                 560
ggt gtt ccg tta ttt aca aga tat cgg gaa gta atc aat agc gat gca     1728
Gly Val Pro Leu Phe Thr Arg Tyr Arg Glu Val Ile Asn Ser Asp Ala
                565                 570                 575
atc caa ttc ggc ggc ttt ggg aat atc aat cca aaa ccg att gcg gcg     1776
Ile Gln Phe Gly Gly Phe Gly Asn Ile Asn Pro Lys Pro Ile Ala Ala
            580                 585                 590
atg gaa ggg ccg ttt cac gga aag cca tat cat att cag atg acg atc     1824
Met Glu Gly Pro Phe His Gly Lys Pro Tyr His Ile Gln Met Thr Ile
        595                 600                 605
ccg ccg ttt ggc att tct att tta aga cca gta aaa aaa ggt agc gtc     1872
Pro Pro Phe Gly Ile Ser Ile Leu Arg Pro Val Lys Lys Gly Ser Val
    610                 615                 620
aaa agt ttt atg aaa act cca cat ccg cca tcc cat gga gca tcg taa     1920
Lys Ser Phe Met Lys Thr Pro His Pro Pro Ser His Gly Ala Ser
625                 630                 635
<210>8
<211>639
<212>PRT
<213>嗜热脂肪芽孢杆菌1503-4R变种4
<400>8
Met Ile Ala Val Gly Pro Thr Asp Leu Glu Ile Tyr Leu Phe His Glu
1               5                   10                  15
Gly Ser Leu Tyr Lys Ser Tyr Glu Leu Phe Gly Ala His Val Ile Lys
            20                  25                  30
Lys Asn Gly Met Val Gly Thr Arg Phe Cys Val Trp Ala Pro His Ala
        35                  40                  45
Arg Glu Val Arg Leu Val Gly Ser Phe Asn Glu Trp Asn Gly Thr Asn
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Met Lys Val Ser Asn Gln Gly Val Trp Met Ile Phe Ile
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asn Leu Glu Gly His Leu Tyr Lys Tyr Glu Ile Thr Thr Asn
                85                  90                  95
Asp Gly Asn Val Leu Leu Lys Ser Asp Pro Tyr Ala Phe Tyr Ser Glu
            100                 105                 110
Leu Arg Pro His Thr Ala Ser Ile Val Tyr Asn Ile Lys Gly Tyr Gln
        115                 120                 125
Trp Asn Asp Gln Thr Trp Arg Arg Lys Lys Gln Arg Lys Arg Ile Tyr
    130                 135                 140
Asp Gln Pro Leu Phe Ile Tyr Glu Leu His Phe Gly Ser Trp Lys Lys
145                 150                 155                 160
Lys Glu Asp Gly Ser Phe Tyr Thr Tyr Gln Glu Met Ala Glu Glu Leu
                165                 170                 175
Ile Pro Tyr Val Leu Glu His Gly Phe Thr His Ile Glu Leu Leu Pro
            180                 185                 190
Leu Val Glu His Pro Phe Asp Arg Ser Trp Gly Tyr Gln Gly Ile Gly
        195                 200                 205
Tyr Tyr Ser Ala Thr Ser Arg Tyr Gly Thr Pro His Asp Leu Met Tyr
    210                 215                 220
Phe Ile Asp Arg Cys His Gln Ala Gly Ile Gly Val Ile Leu Asp Trp
225                 230                 235                 240
Val Pro Gly His Phe Cys Lys Asp Ser His Gly Leu Tyr Met Phe Asp
                245                 250                 255
Gly Ala Pro Ala Tyr Glu Tyr Ala Asn Met Gln Asp Arg Glu Asn Tyr
            260                 265                 270
Val Trp Gly Thr Ala Asn Phe Asp Leu Gly Lys Pro Glu Val Arg Ser
        275                 280                 285
Phe Leu Ile Ser Asn Ala Leu Phe Trp Met Glu Tyr Phe His Val Asp
    290                 295                 300
Gly Phe Arg Val Asp Ala Val Ala Asn Met Leu Tyr Trp Pro Asn Ser
305                 310                 315                 320
Asp Val Leu Tyr Lys Asn Thr Tyr Ala Val Glu Phe Leu Gln Lys Leu
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Asn Glu Thr Val Phe Ala Tyr Asp Pro Asn Ile Leu Met Ile Ala Glu
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385                 390                 395                 400
Val Thr Phe Ser Leu Leu Tyr Ala Tyr Ser Glu Asn Phe Ile Leu Pro
               405                 410                 415
Phe Ser His Asp Glu Val Val His Gly Lys Lys Ser Leu Leu Ser Lys
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Met Pro Gly Thr Tyr Glu Glu Lys Phe Ala Gln Leu Arg Leu Leu Tyr
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465                 470                 475                 480
Met Leu Phe Asp Phe Asp Met His Arg Asn Met Asn Met Tyr Val Lys
                485                 490                 495
Glu Leu Leu Lys Cys Tyr Lys Arg Tyr Lys Pro Leu Tyr Glu Leu Asp
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His Ser Pro Asp Gly Phe Glu Trp Ile Asp Val His Asn Ala Glu Gln
        515                 520                 525
Ser Ile Phe Ser Phe Ile Arg Arg Gly Lys Lys Glu Asp Asp Leu Leu
    530                 535                 540
Ile Val Val Cys Asn Phe Thr Asn Lys Val Tyr His Gly Tyr Lys Val
545                 550                 555                 560
Gly Val Pro Leu Phe Thr Arg Tyr Arg Glu Val Ile Asn Ser Asp Ala
                565                 570                 575
Ile Gln Phe Gly Gly Phe Gly Asn Ile Asn Pro Lys Pro Ile Ala Ala
            580                 585                 590
Met Glu Gly Pro Phe His Gly Lys Pro Tyr His Ile Gln Met Thr Ile
        595                 600                 605
Pro Pro Phe Gly Ile Ser Ile Leu Arg Pro Val Lys Lys Gly Ser Val
    610                 615                 620
Lys Ser Phe Met Lys Thr Pro His Pro Pro Ser His Gly Ala Ser
625                 630                 635
<210>9
<211>2001
<212>DNA
<213>热速芽孢杆菌IF015315
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2001)
<400>9
ttg att gcg gcg aat ccg aca gat tta gaa gtg tat ttg ttt cat gaa       48
Met Ile Ala Ala Asn Pro Thr Asp Leu Glu Val Tyr Leu Phe His Glu
1               5                   10                  15
ggc cgt ttg tat caa agt tat gag ttg ttc ggc gct cat gtc atc cgc       96
Gly Arg Leu Tyr Gln Ser Tyr Glu Leu Phe Gly Ala His Val Ile Arg
            20                  25                  30
gac ggc gga gcg gtc ggc act cgc ttt tgc gtg tgg gcg ccc cat gcg      144
Asp Gly Gly Ala Val Gly Thr Arg Phe Cys Val Trp Ala Pro His Ala
        35                  40                  45
cgg gaa gtc cgt ctt gtc ggc agt ttc aac gat tgg aat ggg gcg aat      192
Arg Glu Val Arg Leu Val Gly Ser Phe Asn Asp Trp Asn Gly Ala Asn
    50                  55                  60
tcc ccc ctg acg aag gtg aac gac gaa ggg gta tgg acg atc gtt gtt      240
Ser Pro Leu Thr Lys Val Asn Asp Glu Gly Val Trp Thr Ile Val Val
65                  70                  75                  80
cca gaa aac ttg gaa ggg cat ctc tat aaa tat gag atc atc aca ccg      288
Pro Glu Asn Leu Glu Gly His Leu Tyr Lys Tyr Glu Ile Ile Thr Pro
                85                  90                  95
gat ggc cgt gtt ctg ttg aaa gcc gac ccg tac gcc ttt tac tcc gaa      336
Asp Gly Arg Val Leu Leu Lys Ala Asp Pro Tyr Ala Phe Tyr Ser Glu
            100                 105                 110
ttg cgc cct cat acc gcc tcg att gtc tac gat ttg aaa gga tac gag      384
Leu Arg Pro His Thr Ala Ser Ile Val Tyr Asp Leu Lys Gly Tyr Glu
        115                 120                 125
tgg aat gat tca tct tgg cag cgg aag aaa cgg cga aag cgg att tat      432
Trp Asn Asp Ser Ser Trp Gln Arg Lys Lys Arg Arg Lys Arg Ile Tyr
    130                 135                 140
gac caa ccg atg gtc att tat gaa ctt cat ttc ggt tcg tgg aaa aag      480
Asp Gln Pro Met Val Ile Tyr Glu Leu His Phe Gly Ser Trp Lys Lys
145                 150                 155                 160
aaa ccg gac ggc cgc ttt tat acg tac cgt gag atg gcc gac gaa ctt      528
Lys Pro Asp Gly Arg Phe Tyr Thr Tyr Arg Glu Met Ala Asp Glu Leu
                165                 170                 175
atc ccg tac gtg cta gag cgt gga ttt acg cac att gag ctg ctt ccg      576
Ile Pro Tyr Val Leu Glu Arg Gly Phe Thr His Ile Glu Leu Leu Pro
            180                 185                 190
ctt gtc gag cat ccg ctc gac cgt tcg tgg ggg tat caa ggg acc ggc      624
Leu Val Glu His Pro Leu Asp Arg Ser Trp Gly Tyr Gln Gly Thr Gly
        195                 200                 205
tat tat gcg gtg aca agc cgc tac ggt gcg ccg cat gat ttc atg tat      672
Tyr Tyr Ala Val Thr Ser Arg Tyr Gly Ala Pro His Asp Phe Met Tyr
    210                 215                 220
ttc gtc gac cgc tgc cat cag gca gga atc ggg gtc att ctc gat tgg      720
Phe Val Asp Arg Cys His Gln Ala Gly Ile Gly Val Ile Leu Asp Trp
225                 230                 235                 240
gtg ccg ggg cat ttt tgc aag gac gcc cac ggg tta tat atg ttt gac      768
Val Pro Gly His Phe Cys Lys Asp Ala His Gly Leu Tyr Met Phe Asp
                245                 250                 255
ggc gcc ccg acg tac gaa tat gcg aac gaa aaa gac cgg gaa aat tac      816
Gly Ala Pro Thr Tyr Glu Tyr Ala Asn Glu Lys Asp Arg Glu Asn Tyr
            260                 265                 270
gtc tgg ggg acg gcg aat ttt gac ttg ggc aaa ccg gaa gtg cgc agt      864
Val Trp Gly Thr Ala Asn Phe Asp Leu Gly Lys Pro Glu Val Arg Ser
        275                 280                 285
ttt ctc atc tcc aac gcc ttg ttt tgg ctc gag tat tac cac gtc gac      912
Phe Leu Ile Ser Asn Ala Leu Phe Trp Leu Glu Tyr Tyr His Val Asp
    290                 295                 300
gga ttc cgc gtc gat gcg gtc gcg aac atg ctg tat tgg ccg aac aac      960
Gly Phe Arg Val Asp Ala Val Ala Asn Met Leu Tyr Trp Pro Asn Asn
305                 310                 315                 320
gac cag ctc tat gaa aac ccg tat gcg gtc gag ttt ttg cgc aag tta     1008
Asp Gln Leu Tyr Glu Asn Pro Tyr Ala Val Glu Phe Leu Arg Lys Leu
                325                 330                 335
aac gaa gcg gtg ttt gcc tat gac ccc aac gtc ttg atg atc gcc gaa     1056
Asn Glu Ala Val Phe Ala Tyr Asp Pro Asn Val Leu Met Ile Ala Glu
            340                 345                 350
gat tcg acc gat tgg ccg cgg gtg acg gcg ccg acg tat gac ggc ggg     1104
Asp Ser Thr Asp Trp Pro Arg Val Thr Ala Pro Thr Tyr Asp Gly Gly
        355                 360                 365
ctt ggc ttt aac tac aag tgg aac atg ggc tgg atg aac gac atg ctg     1152
Leu Gly Phe Asn Tyr Lys Trp Asn Met Gly Trp Met Asn Asp Met Leu
    370                 375                 380
aag tat atg gaa acg ccg ccg cat gag cgg aaa tac gcc cat aac caa     1200
Lys Tyr Met Glu Thr Pro Pro His Glu Arg Lys Tyr Ala His Asn Gln
385                 390                 395                 400
gtc agt ttt tcc ctc ctt tat gcg tat tca gaa aat ttc att ttg ccg     1248
Val Ser Phe Ser Leu Leu Tyr Ala Tyr Ser Glu Asn Phe Ile Leu Pro
                405                 410                 415
ttt tct cat gat gaa gtt gtg cat ggc aaa aag tcg ctg ctc aac aaa     1296
Phe Ser His Asp Glu Val Val His Gly Lys Lys Ser Leu Leu Asn Lys
            420                 425                 430
atg ccg ggg tcg tac gag gag aag ttc gcc cag ctg agg ctg ttg tac     1344
Met Pro Gly Ser Tyr Glu Glu Lys Phe Ala Gln Leu Arg Leu Leu Tyr
        435                 440                 445
ggc tac atg atg gcc cac ccc ggg aaa aag ttg ttg ttt atg ggc aac     1392
Gly Tyr Met Met Ala His Pro Gly Lys Lys Leu Leu Phe Met Gly Asn
    450                 455                 460
gaa ttc gcc cag ttt gac gaa tgg aag ttt gag gga gag ctc gac tgg     1440
Glu Phe Ala Gln Phe Asp Glu Trp Lys Phe Glu Gly Glu Leu Asp Trp
465                 470                 475                 480
gtg ctg ttt gat ttt gac ttg cac cgg aag atg gat gag tat gtc aag     1488
Val Leu Phe Asp Phe Asp Leu His Arg Lys Met Asp Glu Tyr Val Lys
                485                 490                 495
caa ttg atc gcc tgc tac aag cgg tat aag ccg ttt tac gag ctt gat     1536
Gln Leu Ile Ala Cys Tyr Lys Arg Tyr Lys Pro Phe Tyr Glu Leu Asp
            500                 505                 510
cat gat ccg agg ggg ttt gaa tgg att gac gtt cat aat gcc gag caa     1584
His Asp Pro Arg Gly Phe Glu Trp Ile Asp Val His Asn Ala Glu Gln
        515                 520                 525
agt att ttc tca ttc atc cgc cgc ggg aaa aaa gac ggc gat cta ttg     1632
Ser Ile Phe Ser Phe Ile Arg Arg Gly Lys Lys Asp Gly Asp Leu Leu
    530                 535                 540
gta att gtt tgc aat ttc aca aat cag gcg tat gac gat tac aaa gtc     1680
Val Ile Val Cys Asn Phe Thr Asn Gln Ala Tyr Asp Asp Tyr Lys Val
545                 550                 555                 560
ggc gtg ccg ctt ttg gcg ccg tac cgc gaa gtg ctg agc agc gat gca     1728
Gly Val Pro Leu Leu Ala Pro Tyr Arg Glu Val Leu Ser Ser Asp Ala
                565                 570                 575
gcg gag ttt ggc gga tca ggg cat gtc aat tcg aag cgg ctt tcc gct     1776
Ala Glu Phe Gly Gly Ser Gly His Val Asn Ser Lys Arg Leu Ser Ala
            580                 585                 590
ttc cat gag ccg ttt cat gga aaa ccg tac cat gtg cgc atg acg att     1824
Phe His Glu Pro Phe His Gly Lys Pro Tyr His Val Arg Met Thr Ile
        595                 600                 605
ccg ccg ttt ggc att tcc att ttg cgg cca gtg caa aaa cga ggg gag     1872
Pro Pro Phe Gly Ile Ser Ile Leu Arg Pro Val Gln Lys Arg Gly Glu
    610                 615                 620
aga aag cag aat gaa gaa gaa gtg cat cgc cat gtt att ggc cgg cgg     1920
Arg Lys Gln Asn Glu Glu Glu Val His Arg His Val Ile Gly Arg Arg
625                 630                 635                 640
gca agg aag ccg gct tcg ctc gct gac gaa aaa cat cgc gaa acc agc     1968
Ala Arg Lys Pro Ala Ser Leu Ala Asp Glu Lys His Arg Glu Thr Ser
                645                 650                 655
cgt gcc gtt tgg ggg gaa gta ccg gat cat tga                          2001
Arg Ala Val Trp Gly Glu Val Pro Asp His
            660                 665
<210>10
<211>666
<212>PRT
<213>热速芽孢杆菌IF015315
<400>10
Met Ile Ala Ala Asn Pro Thr Asp Leu Glu Val Tyr Leu Phe His Glu
1               5                   10                  15
Gly Arg Leu Tyr Gln Ser Tyr Glu Leu Phe Gly Ala His Val Ile Arg
            20                  25                  30
Asp Gly Gly Ala Val Gly Thr Arg Phe Cys Val Trp Ala Pro His Ala
        35                  40                  45
Arg Glu Val Arg Leu Val Gly Ser Phe Asn Asp Trp Asn Gly Ala Asn
    50                  55                  60
Ser Pro Leu Thr Lys Val Asn Asp Glu Gly Val Trp Thr Ile Val Val
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asn Leu Glu Gly His Leu Tyr Lys Tyr Glu Ile Ile Thr Pro
                85                  90                  95
Asp Gly Arg Val Leu Leu Lys Ala Asp Pro Tyr Ala Phe Tyr Ser Glu
            100                 105                 110
Leu Arg Pro His Thr Ala Ser Ile Val Tyr Asp Leu Lys Gly Tyr Glu
        115                 120                 125
Trp Asn Asp Ser Ser Trp Gln Arg Lys Lys Arg Arg Lys Arg Ile Tyr
    130                 135                 140
Asp Gln Pro Met Val Ile Tyr Glu Leu His Phe Gly Ser Trp Lys Lys
145                 150                 155                 160
Lys Pro Asp Gly Arg Phe Tyr Thr Tyr Arg Glu Met Ala Asp Glu Leu
                165                 170                 175
Ile Pro Tyr Val Leu Glu Arg Gly Phe Thr His Ile Glu Leu Leu Pro
            180                 185                 190
Leu Val Glu His Pro Leu Asp Arg Ser Trp Gly Tyr Gln Gly Thr Gly
        195                 200                 205
Tyr Tyr Ala Val Thr Ser Arg Tyr Gly Ala Pro His Asp Phe Met Tyr
    210                 215                 220
Phe Val Asp Arg Cys His Gln Ala Gly Ile Gly Val Ile Leu Asp Trp
225                 230                 235                 240
Val Pro Gly His Phe Cys Lys Asp Ala His Gly Leu Tyr Met Phe Asp
                245                 250                 255
Gly Ala Pro Thr Tyr Glu Tyr Ala Asn Glu Lys Asp Arg Glu Asn Tyr
            260                 265                 270
Val Trp Gly Thr Ala Asn Phe Asp Leu Gly Lys Pro Glu Val Arg Ser
        275                 280                 285
Phe Leu Ile Ser Asn Ala Leu Phe Trp Leu Glu Tyr Tyr His Val Asp
    290                 295                 300
Gly Phe Arg Val Asp Ala Val Ala Asn Met Leu Tyr Trp Pro Asn Asn
305                 310                 315                 320
Asp Gln Leu Tyr Glu Asn Pro Tyr Ala Val Glu Phe Leu Arg Lys Leu
                325                 330                 335
Asn Glu Ala Val Phe Ala Tyr Asp Pro Asn Val Leu Met Ile Ala Glu
            340                 345                 350
Asp Ser Thr Asp Trp Pro Arg Val Thr Ala Pro Thr Tyr Asp Gly Gly
        355                 360                 365
Leu Gly Phe Asn Tyr Lys Trp Asn Met Gly Trp Met Asn Asp Met Leu
    370                 375                 380
Lys Tyr Met Glu Thr Pro Pro His Glu Arg Lys Tyr Ala His Asn Gln
385                 390                 395                 400
ValSer Phe Ser Leu Leu Tyr Ala Tyr Ser Glu Asn Phe Ile Leu Pro
               405                 410                 415
Phe Ser His Asp Glu Val Val His Gly Lys Lys Ser Leu Leu Asn Lys
            420                 425                 430
Met Pro Gly Ser Tyr Glu Glu Lys Phe Ala Gln Leu Arg Leu Leu Tyr
        435                 440                 445
Gly Tyr Met Met Ala His Pro Gly Lys Lys Leu Leu Phe Met Gly Asn
    450                 455                 460
Glu Phe Ala Gln Phe Asp Glu Trp Lys Phe Glu Gly Glu Leu Asp Trp
465                 470                 475                 480
Val Leu Phe Asp Phe Asp Leu His Arg Lys Met Asp Glu Tyr Val Lys
                485                 490                 495
Gln Leu Ile Ala Cys Tyr Lys Arg Tyr Lys Pro Phe Tyr Glu Leu Asp
            500                 505                 510
His Asp Pro Arg Gly Phe Glu Trp Ile Asp Val His Asn Ala Glu Gln
        515                 520                 525
Ser Ile Phe Ser Phe Ile Arg Arg Gly Lys Lys Asp Gly Asp Leu Leu
    530                 535                 540
Val Ile Val Cys Asn Phe Thr Asn Gln Ala Tyr Asp Asp Tyr Lys Val
545                 550                 555                 560
Gly Val Pro Leu Leu Ala Pro Tyr Arg Glu Val Leu Ser Ser Asp Ala
                565                 570                 575
Ala Glu Phe Gly Gly Ser Gly His Val Asn Ser Lys Arg Leu Ser Ala
            580                 585                 590
Phe His Glu Pro Phe His Gly Lys Pro Tyr His Val Arg Met Thr Ile
        595                 600                 605
Pro Pro Phe Gly Ile Ser Ile Leu Arg Pro Val Gln Lys Arg Gly Glu
    610                 615                 620
Arg Lys Gln Asn Glu Glu Glu Val His Arg His Val Ile Gly Arg Arg
625                 630                 635                 640
Ala Arg Lys Pro Ala Ser Leu Ala Asp Glu Lys His Arg Glu Thr Ser
                645                 650                 655
Arg Ala Val Trp Gly Glu Val Pro Asp His
            660                 665
<210>11
<211>2001
<212>DNA
<213>热链形芽孢杆菌IF015316
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2001)
<400>11
ttg att gcg gcg aat ccg aca gat tta gaa gtg tat ttg ttt cat gaa       48
Met Ile Ala Ala Asn Pro Thr Asp Leu Glu Val Tyr Leu Phe His Glu
1               5                   10                  15
ggc cgt ttg tat caa agt tat gag ctg ttc ggc gct cat gtc atc cgc       96
Gly Arg Leu Tyr Gln Ser Tyr Glu Leu Phe Gly Ala His Val Ile Arg
            20                  25                  30
gac ggc gga gcg atc ggt act cgc ttt tgc gtg tgg gcg ccc cat gcg      144
Asp Gly Gly Ala Ile Gly Thr Arg Phe Cys Val Trp Ala Pro His Ala
        35                  40                  45
cgg gaa gtc cgt ctt gtc ggt agt ttc aac gat tgg aat ggg gcg aat      192
Arg Glu Val Arg Leu Val Gly Ser Phe Asn Asp Trp Asn Gly Ala Asn
    50                  55                  60
tcc ccc ctg acg aag gtg aac gac gaa ggg gta tgg acg atc gtt gtt      240
Ser Pro Leu Thr Lys Val Asn Asp Glu Gly Val Trp Thr Ile Val Val
65                  70                  75                  80
cca gaa aac ttg gaa ggg cat ctc tat aaa tat gag atc atc aca ccg      288
Pro Glu Asn Leu Glu Gly His Leu Tyr Lys Tyr Glu Ile Ile Thr Pro
                85                  90                  95
gat ggc cgt gtt ctg ttg aaa gcg gac ccg tac gcc ttt tgc tcc gaa      336
Asp Gly Arg Val Leu Leu Lys Ala Asp Pro Tyr Ala Phe Cys Ser Glu
            100                 105                 110
ttg cgc cct cat acc gcc tcg att gtc tac gat ttg aaa gga tac gag      384
Leu Arg Pro His Thr Ala Ser Ile Val Tyr Asp Leu Lys Gly Tyr Glu
        115                 120                 125
tgg aat gat tca tct tgg cag cgg aag aaa cgg cga aag cgg att tat      432
Trp Asn Asp Ser Ser Trp Gln Arg Lys Lys Arg Arg Lys Arg Ile Tyr
    130                 135                 140
gac caa ccg atg gtc att tat gaa ctt cat ttc ggt tcg tgg aaa aag      480
Asp Gln Pro Met Val Ile Tyr Glu Leu His Phe Gly Ser Trp Lys Lys
145                 150                 155                 160
aaa ccg gac ggc cgc ttt tat aca tac cgt gag atg gcg gac gaa ctc      528
Lys Pro Asp Gly Arg Phe Tyr Thr Tyr Arg Glu Met Ala Asp Glu Leu
                165                 170                 175
att ccg tac gtg ctg gag cgc gga ttt acg cac att gag ctg ctt ccg      576
Ile Pro Tyr Val Leu Glu Arg Gly Phe Thr His Ile Glu Leu Leu Pro
            180                 185                 190
ctt gtc gag cat ccg ctc gat cgt tcg tgg gga tat caa ggg act ggc      624
Leu Val Glu His Pro Leu Asp Arg Ser Trp Gly Tyr Gln Gly Thr Gly
        195                 200                 205
tat tat tcg gtg aca agc cgc tat ggc aca ccg cac gat ttc atg tat      672
Tyr Tyr Ser Val Thr Ser Arg Tyr Gly Thr Pro His Asp Phe Met Tyr
     210                 215                 220
ttc gtc gac cgc tgc cat caa gcg agg ctt ggc gtc atc atc gac tgg      720
Phe Val Asp Arg Cys His Gln Ala Arg Leu Gly Val Ile Ile Asp Trp
225                 230                 235                 240
gtg ccg ggg cat ttt tgc aag gac gcc cac ggg ctg tac atg ttt gac      768
Val Pro Gly His Phe Cys Lys Asp Ala His Gly Leu Tyr Met Phe Asp
                245                 250                 255
ggc gcg ccg acg tat gaa tac gcg aat gaa aaa gac cga gaa aat tac      816
Gly Ala Pro Thr Tyr Glu Tyr Ala Asn Glu Lys Asp Arg Glu Asn Tyr
            260                 265                 270
gtc tgg ggg acg gcg aat ttt gac ttg ggc aag ccg gaagtg cgc agt       864
Val Trp Gly Thr Ala Asn Phe Asp Leu Gly Lys Pro Glu Val Arg Ser
        275                 280                 285
ttt ctg atc tcc aat gcg ttg ttt tgg ctg gag tat tac cat gtg gac      912
Phe Leu Ile Ser Asn Ala Leu Phe Trp Leu Glu Tyr Tyr His Val Asp
    290                 295                 300
ggg ttt cgc gtc gat gcg gtc gcc aat atg ctt tat tgg ccg aac aat      960
Gly Phe Arg Val Asp Ala Val Ala Asn Met Leu Tyr Trp Pro Asn Asn
305                 310                 315                 320
gat agg ctg tac gaa aat ccg tat gcg gtc gag ttt ttg cgc cag ttg     1008
Asp Arg Leu Tyr Glu Asn Pro Tyr Ala Val Glu Phe Leu Arg Gln Leu
                325                 330                 335
aat gag gcg gtg ttt gcc tat gac ccg aat gtc ttg atg att gcg gaa     1056
Asn Glu Ala Val Phe Ala Tyr Asp Pro Asn Val Leu Met Ile Ala Glu
            340                 345                 350
gat tcg acc gac tgg cct cgg gtg acc gcg ccg acg tac gat ggc ggc     1104
Asp Ser Thr Asp Trp Pro Arg Val Thr Ala Pro Thr Tyr Asp Gly Gly
        355                 360                 365
ctt ggg ttt aac tac aag tgg aac atg ggc tgg atg aac gac atg ctg     1152
Leu Gly Phe Asn Tyr Lys Trp Asn Met Gly Trp Met Asn Asp Met Leu
    370                 375                 380
aag tat atg gaa acg ccg ccg cat gag cgg aaa tac gcc cat aac caa     1200
Lys Tyr Met Glu Thr Pro Pro His Glu Arg Lys Tyr Ala His Asn Gln
385                 390                 395                 400
gtc agt ttt tcc ctc ctt tat gcg tat tcg gaa aat ttc att ttg cca     1248
Val Ser Phe Ser Leu Leu Tyr Ala Tyr Ser Glu Asn Phe Ile Leu Pro
                405                 410                 415
ttt tcc cat gat gaa gtt gtg cat ggc aaa aaa tcg ctg ctc aat aaa     1296
Phe Ser His Asp Glu Val Val His Gly Lys Lys Ser Leu Leu Asn Lys
            420                 425                 430
atg cct ggg tcg tac gaa gag aag ttc gcc cag ctg cgc cta ttg tat     1344
Met Pro Gly Ser Tyr Glu Glu Lys Phe Ala Gln Leu Arg Leu Leu Tyr
        435                 440                 445
ggc tac atg atg gcc cac cct ggg aaa aag ctg ctg ttt atg ggc agt     1392
Gly Tyr Met Met Ala His Pro Gly Lys Lys Leu Leu Phe Met Gly Ser
    450                 455                 460
gag ttt gcc cag ttt gat gaa tgg aag ttt gag gga gag ctc gac tgg     1440
Glu Phe Ala Gln Phe Asp Glu Trp Lys Phe Glu Gly Glu Leu Asp Trp
465                 470                 475                 480
gtg ctg ttc gat ttt gac ttg cac cgg aaa atg gac gaa tat gtg aag     1488
Val Leu Phe Asp Phe Asp Leu His Arg Lys Met Asp Glu Tyr Val Lys
                485                 490                 495
caa ctg atc gcc tgc tat aaa cgg tat aag ccg ttt tac gag ctt gat     1536
Gln Leu Ile Ala Cys Tyr Lys Arg Tyr Lys Pro Phe Tyr Glu Leu Asp
            500                 505                 510
cat gat ccg agg ggg ttt gaa tgg att gac gtt cat aat gcc gaa caa     1584
His Asp Pro Arg Gly Phe Glu Trp Ile Asp Val His Asn Ala Glu Gln
        515                 520                 525
agc att ttc tcg ttc gtc cgc cgc ggg aaa aaa gac ggc gat cta ttg     1632
Ser Ile Phe Ser Phe Val Arg Arg Gly Lys Lys Asp Gly Asp Leu Leu
    530                 535                 540
gta att gtt tgc aat ttc aca aat cag gcg tat gac gat tac aaa gtc     1680
Val Ile Val Cys Asn Phe Thr Asn Gln Ala Tyr Asp Asp Tyr Lys Val
545                 550                 555                 560
ggc gtg ccg ctt ttg gcg ccg tac cgc gaa gtg ctg aac agc gat gca     1728
Gly Val Pro Leu Leu Ala Pro Tyr Arg Glu Val Leu Asn Ser Asp Ala
                565                 570                 575
gcg gag ttt ggc gga tca ggg cat gtc aat tcg aag cgg ctt tcc gct     1776
Ala Glu Phe Gly Gly Ser Gly His Val Asn Ser Lys Arg Leu Ser Ala
            580                 585                 590
ttc cat gag ccg ttt cat gga aaa ccg tgc cat gtg cgc atg acg att     1824
Phe His Glu Pro Phe His Gly Lys Pro Cys His Val Arg Met Thr Ile
        595                 600                 605
ccg ccg ttt ggc att tcc att ttg cgg cca gtg caa aaa cga ggg gag     1872
Pro Pro Phe Gly Ile Ser Ile Leu Arg Pro Val Gln Lys Arg Gly Glu
    610                 615                 620
aga aag cag aat gaa gaa gac gtg cat cgc cat gtt att ggc cgg cgg     1920
Arg Lys Gln Asn Glu Glu Asp Val His Arg His Val Ile Gly Arg Arg
625                 630                 635                 640
cca agg aag ccg gct tcg ctc gct gac gaa aaa cat cgc gaa acc ggc     1968
Pro Arg Lys Pro Ala Ser Leu Ala Asp Glu Lys His Arg Glu Thr Gly
                645                 650                 655
cgt gcc gtt tgg ggg gaa gta ccg gat cat tga                         2001
Arg Ala Val Trp Gly Glu Val Pro Asp His
            660                 665
<210>12
<211>666
<212>PRT
<213>热链形芽孢杆菌IF015316
<400>12
Met Ile Ala Ala Asn Pro Thr Asp Leu Glu Val Tyr Leu Phe His Glu
1               5                   10                  15
Gly Arg Leu Tyr Gln Ser Tyr Glu Leu Phe Gly Ala His Val Ile Arg
            20                  25                  30
Asp Gly Gly Ala Ile Gly Thr Arg Phe Cys Val Trp Ala Pro His Ala
        35                  40                  45
Arg Glu Val Arg Leu Val Gly Ser Phe Asn Asp Trp Asn Gly Ala Asn
    50                  55                  60
Ser Pro Leu Thr Lys Val Asn Asp Glu Gly Val Trp Thr Ile Val Val
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asn Leu Glu Gly His Leu Tyr Lys Tyr Glu Ile Ile Thr Pro
                85                  90                  95
Asp Gly Arg Val Leu Leu Lys Ala Asp Pro Tyr Ala Phe Cys Ser Glu
            100                 105                 110
Leu Arg Pro His Thr Ala Ser Ile Val Tyr Asp Leu Lys Gly Tyr Glu
        115                 120                 125
Trp Asn Asp Ser Ser Trp Gln Arg Lys Lys Arg Arg Lys Arg Ile Tyr
    130                 135                 140
Asp Gln Pro Met Val Ile Tyr Glu Leu His Phe Gly Ser Trp Lys Lys
145                 150                 155                 160
Lys Pro Asp Gly Arg Phe Tyr Thr Tyr Arg Glu Met Ala Asp Glu Leu
                165                 170                 175
Ile Pro Tyr Val Leu Glu Arg Gly Phe Thr His Ile Glu Leu Leu Pro
            180                 185                 190
Leu Val Glu His Pro Leu Asp Arg Ser Trp Gly Tyr Gln Gly Thr Gly
        195                 200                 205
Tyr Tyr Ser Val Thr Ser Arg Tyr Gly Thr Pro His Asp Phe Met Tyr
    210                 215                 220
Phe Val Asp Arg Cys His Gln Ala Arg Leu Gly Val Ile Ile Asp Trp
225                 230                 235                 240
Val Pro Gly His Phe Cys Lys Asp Ala His Gly Leu Tyr Met Phe Asp
                245                 250                 255
Gly Ala Pro Thr Tyr Glu Tyr Ala Asn Glu Lys Asp Arg Glu Asn Tyr
            260                 265                 270
Val Trp Gly Thr Ala Asn Phe Asp Leu Gly Lys Pro Glu Val Arg Ser
        275                 280                 285
Phe Leu Ile Ser Asn Ala Leu Phe Trp Leu Glu Tyr Tyr His Val Asp
    290                 295                 300
Gly Phe Arg Val Asp Ala Val Ala Asn Met Leu Tyr Trp Pro Asn Asn
305                 310                 315                 320
Asp Arg Leu Tyr Glu Asn Pro Tyr Ala Val Glu Phe Leu Arg Gln Leu
                325                 330                 335
Asn Glu Ala Val Phe Ala Tyr Asp Pro Asn Val Leu Met Ile Ala Glu
            340                 345                 350
Asp Ser Thr Asp Trp Pro Arg Val Thr Ala Pro Thr Tyr Asp Gly Gly
        355                 360                 365
Leu Gly Phe Asn Tyr Lys Trp Asn Met Gly Trp Met Asn Asp Met Leu
    370                 375                 380
Lys Tyr Met Glu Thr Pro Pro His Glu Arg Lys Tyr Ala His Asn Gln
385                 390                 395                 400
Val Ser Phe Ser Leu Leu Tyr Ala Tyr Ser Glu Asn Phe Ile Leu Pro
                405                 410                 415
Phe Ser His Asp Glu Val Val His Gly Lys Lys Ser Leu Leu Asn Lys
            420                 425                 430
Met Pro Gly Ser Tyr Glu Glu Lys Phe Ala Gln Leu Arg Leu Leu Tyr
        435                 440                 445
Gly Tyr Met Met Ala His Pro Gly Lys Lys Leu Leu Phe Met Gly Ser
    450                 455                 460
Glu Phe Ala Gln Phe Asp Glu Trp Lys Phe Glu Gly Glu Leu Asp Trp
465                 470                 475                 480
Val Leu Phe Asp Phe Asp Leu His Arg Lys Met Asp Glu Tyr Val Lys
                485                 490                 495
Gln Leu Ile Ala Cys Tyr Lys Arg Tyr Lys Pro Phe Tyr Glu Leu Asp
            500                 505                 510
His Asp Pro Arg Gly Phe Glu Trp Ile Asp Val His Asn Ala Glu Gln
        515                 520                 525
Ser Ile Phe Ser Phe Val Arg Arg Gly Lys Lys Asp Gly Asp Leu Leu
    530                 535                 540
Val Ile Val Cys Asn Phe Thr Asn Gln Ala Tyr Asp Asp Tyr Lys Val
545                 550                 555                 560
Gly Val Pro Leu Leu Ala Pro Tyr Arg Glu Val Leu Asn Ser Asp Ala
                565                 570                 575
Ala Glu Phe Gly Gly Ser Gly His Val Asn Ser Lys Arg Leu Ser Ala
            580                 585                 590
Phe His Glu Pro Phe His Gly Lys Pro Cys His Val Arg Met Thr Ile
        595                 600                 605
Pro Pro Phe Gly Ile Ser Ile Leu Arg Pro Val Gln Lys Arg Gly Glu
    610                 615                 620
Arg Lys Gln Asn Glu Glu Asp Val His Arg His Val Ile Gly Arg Arg
625                 630                 635                 640
Pro Arg Lys Pro Ala Ser Leu Ala Asp Glu Lys His Arg Glu Thr Gly
                645                 650                 655
Arg Ala Val Trp Gly Glu Val Pro Asp His
            660                 665
<210>13
<211>2001
<212>DNA
<213>热溶芽孢杆菌IF015313
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2001)
<400>13
ttg att gcg gcg aat ccg aca gat tta gaa gtg tat ttg ttt cat gaa        48
Met Ile Ala Ala Asn Pro Thr Asp Leu Glu ValTyr Leu Phe His Glu
1               5                   10                 15
ggc cgt ttg tat caa agt tat gag ttg ttc ggc gct cat gtc atc cgc        96
Gly Arg Leu Tyr Gln Ser Tyr Glu Leu Phe Gly Ala His Val Ile Arg
             20                 25                  30
gac ggc gga gcg gtc ggc act cgc ttt tgc gtg tgg gcg ccc cat gcg      144
Asp Gly Gly Ala Val Gly Thr Arg Phe Cys Val Trp Ala Pro His Ala
        35                  40                  45
cgg gaa gtc cgt ctt gtc ggc agt ttc aac gat tgg aat ggg gcg aat      192
Arg Glu Val Arg Leu Val Gly Ser Phe Asn Asp Trp Asn Gly Ala Asn
    50                  55                  60
tcc ccc ctg acg aag gtg aac gac gaa ggg gta tgg acg atc gtt gtt       240
Ser Pro Leu Thr Lys Val Asn Asp Glu Gly Val Trp Thr Ile Val Val
65                  70                  75                  80
cca gaa aac ttg gaa ggg cat ctc tat aaa tat gag atc atc aca ccg       288
Pro Glu Asn Leu Glu Gly His Leu Tyr Lys Tyr Glu Ile Ile Thr Pro
                85                  90                  95
gat ggc cgt gtt ctg ttg aaa gcc gac ccg tac gcc ttt tac tcc gaa       336
Asp Gly Arg Val Leu Leu Lys Ala Asp Pro Tyr Ala Phe Tyr Ser Glu
            100                 105                 110
ttg cgc cct cat acc gcc tcg att gtc tac gat ttg aaa gga tac cag       384
Leu Arg Pro His Thr Ala Ser Ile Val Tyr Asp Leu Lys Gly Tyr Gln
        115                 120                 125
tgg aat gat tca tct tgg cag cgg aag aaa cgg cga aag cgg att tat       432
Trp Asn Asp Ser Ser Trp Gln Arg Lys Lys Arg Arg Lys Arg Ile Tyr
    130                 135                 140
gac caa ccg atg gtc att tat gaa ctt cat ttc ggt tcg tgg aaa aag       480
Asp Gln Pro Met Val Ile Tyr Glu Leu His Phe Gly Ser Trp Lys Lys
145                 150                 155                 160
aaa ccg gac ggc cgc ttt tat acg tac cgt gag atg gcc gac gaa ctc       528
Lys Pro Asp Gly Arg Phe Tyr Thr Tyr Arg Glu Met Ala Asp Glu Leu
                165                 170                 175
att ccg tac gtg ctg gag cgc gga ttt acg cac att gag ctg ctt ccg       576
Ile Pro Tyr Val Leu Glu Arg Gly Phe Thr His Ile Glu Leu Leu Pro
            180                 185                 190
ctt gtc gag cat ccg ctc gat cgt tcg tgg gga tat caa ggg acc ggc       624
Leu Val Glu His Pro Leu Asp Arg Ser Trp Gly Tyr Gln Gly Thr Gly
        195                 200                 205
tat tat tcg gtg aca agc cgc tat ggc acg ccg cac gat ttc atg tat       672
Tyr Tyr Ser Val Thr Ser Arg Tyr Gly Thr Pro His Asp Phe Met Tyr
    210                 215                 220
ttc gtc gac cgc tgc cat caa gcg ggg ctt ggc gtc atc atc gac tgg       720
Phe Val Asp Arg Cys His Gln Ala Gly Leu Gly Val Ile Ile Asp Trp
225                 230                 235                 240
gtg ccg ggg cat ttt tgc aag gac gcc cac ggg ctg tac atg ttt gac       768
Val Pro Gly His Phe Cys Lys Asp Ala His Gly Leu Tyr Met Phe Asp
                245                 250                 255
ggc gca ccg acg tat gaa tac gcg aat gaa aaa gac cga gaa aat tac       816
Gly Ala Pro Thr Tyr Glu Tyr Ala Asn Glu Lys Asp Arg Glu Asn Tyr
            260                 265                 270
gtc tgg ggg acg gcg aat ttt gac ttg ggc aag ccg gaa gtg cgc agt       864
Val Trp Gly Thr Ala Asn Phe Asp Leu Gly Lys Pro Glu Val Arg Ser
        275                 280                 285
ttt ctg atc tcc aat gcg ttg ttt tgg ctg gag tat tac cat gtg gac       912
Phe Leu Ile Ser Asn Ala Leu Phe Trp Leu Glu Tyr Tyr His Val Asp
    290                 295                 300
ggg ttt cgc gtc gat gcg gtc gcc aat atg ctt tat tgg ccg aac aat       960
Gly Phe Arg Val Asp Ala Val Ala Asn Met Leu Tyr Trp Pro Asn Asn
305                 310                 315                 320
gac cgg ctc tat gaa aat ccg tat gcg gtc gag ttt ttg cgc cag ttg      1008
Asp Arg Leu Tyr Glu Asn Pro Tyr Ala Val Glu Phe Leu Arg Gln Leu
                325                 330                 335
aat gag gcg gtg ttt gcc tat gac ccg aac gtc ttg atg atc gct gaa      1056
Asn Glu Ala Val Phe Ala Tyr Asp Pro Asn Val Leu Met Ile Ala Glu
            340                 345                 350
gat tcg acc gac tgg cct cgg gtg acc gcg ccg acg tac gat ggc ggc      1104
Asp Ser Thr Asp Trp Pro Arg Val Thr Ala Pro Thr Tyr Asp Gly Gly
        355                 360                 365
ctt ggg ttt aac tac aag tgg aac atg ggc tgg atg aac gac atg ctg      1152
Leu Gly Phe Asn Tyr Lys Trp Asn Met Gly Trp Met Asn Asp Met Leu
    370                 375                 380
aag tat atg gaa acg ccg ccg cat gag cgg aaa tac gcc cat aac caa      1200
Lys Tyr Met Glu Thr Pro Pro His Glu Arg Lys Tyr Ala His Asn Gln
385                 390                 395                 400
gtc agt ttt tcc ctc ctt tat gcg tat tcg gaa aat ttc att ttg cca      1248
Val Ser Phe Ser Leu Leu Tyr Ala Tyr Ser Glu Asn Phe Ile Leu Pro
                405                 410                 415
ttt tcc cat gat gaa gtt gtg cat ggc aaa aaa tcg ctg ctc aat aaa      1296
Phe Ser His Asp Glu Val Val His Gly Lys Lys Ser Leu Leu Asn Lys
            420                 425                 430
atg cct ggg tcg tac gaa gag aag ttc gcc cag ctg cgc cta ttg tat      1344
Met Pro Gly Ser Tyr Glu Glu Lys Phe Ala Gln Leu Arg Leu Leu Tyr
        435                 440                 445
ggc tac atg atg gcc cac cct ggg aaa aag ctg ctg ttt atg ggc agt      1392
Gly Tyr Met Met Ala His Pro Gly Lys Lys Leu Leu Phe Met Gly Ser
    450                 455                 460
gag ttt gcc cag ttt gat gaa tgg aag ttt gag gga gag ctc gac tgg      1440
Glu Phe Ala Gln Phe Asp Glu Trp Lys Phe Glu Gly Glu Leu Asp Trp
465                 470                 475                 480
gtg ctg ttc gat ttt gaa ttg cac tgg aaa atg gac gaa tat gtg aag      1488
Val Leu Phe Asp Phe Glu Leu His Trp Lys Met Asp Glu Tyr Val Lys
                485                 490                 495
cag ctg atc gcc tgc tat aaa cgg tat aag ccg ttt tac gag ctt gat      1536
Gln Leu Ile Ala Cys Tyr Lys Arg Tyr Lys Pro Phe Tyr Glu Leu Asp
            500                 505                 510
cat gat ccg agg ggg ttt gaa tgg att gac gtt cat aat gcc gag caa      1584
His Asp Pro Arg Gly Phe Glu Trp Ile Asp Val His Asn Ala Glu Gln
        515                 520                 525
agt att ttc tca ttc atc cgc cgg ggg aaa aaa gaa ggt gat gtg ctg      1632
Ser Ile Phe Ser Phe Ile Arg Arg Gly Lys Lys Glu Gly Asp Val Leu
    530                 535                 540
gtc att gtt tgt aat ttc aca aat cag gcg tat gac gat tac aaa gtc      1680
Val Ile Val Cys Asn Phe Thr Asn Gln Ala Tyr Asp Asp Tyr Lys Val
545                 550                 555                 560
ggc gtg ccg ctt ttg gcg ccg tac cgc gaa gtg ctg aac agc gat gca      1728
Gly Val Pro Leu Leu Ala Pro Tyr Arg Glu Val Leu Asn Ser Asp Ala
                565                 570                 575
gcg gag ttt ggc gga tca ggg cat gtc aat tcg aag cgg ctt tcc gct      1776
Ala Glu Phe Gly Gly Ser Gly His ValAsn Ser Lys Arg Leu Ser Ala
            580                 585                 590
ttc cat gag ccg ttt cat gga aaa ccg tac cat gtg cgc atg acg att      1824
Phe His Glu Pro Phe His Gly Lys Pro Tyr His ValArg Met Thr Ile
        595                 600                 605
ccg ccg ttt ggc att tcc att ttg cgg cca gtg caa aaa cga ggg gag      1872
Pro Pro Phe Gly Ile Ser Ile Leu Arg Pro Val Gln Lys Arg Gly Glu
    610                 615                 620
aga aag cag aat gaa gaa gaa gtg cat cgc cat gtt att ggc cgg cgg     1920
Arg Lys Gln Asn Glu Glu Glu Val His Arg His Val Ile Gly Arg Arg
625                 630                 635                 640
gca agg aag ccg gct tcg ctc gct gac gaa aaa cat cgc gaa acc agc     1968
Ala Arg Lys Pro Ala Ser Leu Ala Asp Glu Lys His Arg Glu Thr Ser
                645                 650                 655
cgt gcc gtt tgg ggg gaa gta ccg gat cat tga                         2001
Arg Ala Val Trp Gly Glu Val Pro Asp His
            660                 665
<210>14
<211>666
<212>PRT
<213>热溶芽孢杆菌IF015313
<400>14
Met Ile Ala Ala Asn Pro Thr Asp Leu Glu Val Tyr Leu Phe His Glu
1               5                   10                  15
Gly Arg Leu Tyr Gln Ser Tyr Glu Leu Phe Gly Ala His Val Ile Arg
            20                  25                  30
Asp Gly Gly Ala Val Gly Thr Arg Phe Cys Val Trp Ala Pro His Ala
        35                  40                  45
Arg Glu Val Arg Leu Val Gly Ser Phe Asn Asp Trp Asn Gly Ala Asn
    50                  55                  60
Ser Pro Leu Thr Lys Val Asn Asp Glu Gly Val Trp Thr Ile Val Val
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asn Leu Glu Gly His Leu Tyr Lys Tyr Glu Ile Ile Thr Pro
                85                  90                  95
Asp Gly Arg Val Leu Leu Lys Ala Asp Pro Tyr Ala Phe Tyr Ser Glu
            100                 105                 110
Leu Arg Pro His Thr Ala Ser Ile Val Tyr Asp Leu Lys Gly Tyr Gln
        115                 120                 125
Trp Asn Asp Ser Ser Trp Gln Arg Lys Lys Arg Arg Lys Arg Ile Tyr
    130                 135                 140
Asp Gln Pro Met Val Ile Tyr Glu Leu His Phe Gly Ser Trp Lys Lys
145                 150                 155                 160
Lys Pro Asp Gly Arg Phe Tyr Thr Tyr Arg Glu Met Ala Asp Glu Leu
                165                 170                 175
Ile Pro Tyr Val Leu Glu Arg Gly Phe Thr His Ile Glu Leu Leu Pro
            180                 185                 190
Leu Val Glu His Pro Leu Asp Arg Ser Trp Gly Tyr Gln Gly Thr Gly
        195                 200                 205
Tyr Tyr Ser Val Thr Ser Arg Tyr Gly Thr Pro His Asp Phe Met Tyr
    210                 215                 220
Phe Val Asp Arg Cys His Gln Ala Gly Leu Gly Val Ile Ile Asp Trp
225                 230                 235                 240
Val Pro Gly His Phe Cys Lys Asp Ala His Gly Leu Tyr Met Phe Asp
                245                 250                 255
Gly Ala Pro Thr Tyr Glu Tyr Ala Asn Glu Lys Asp Arg Glu Asn Tyr
            260                 265                 270
Val Trp Gly Thr Ala Asn Phe Asp Leu Gly Lys Pro Glu Val Arg Ser
        275                 280                 285
Phe Leu Ile Ser Asn Ala Leu Phe Trp Leu Glu Tyr Tyr His Val Asp
    290                 295                 300
Gly Phe Arg Val Asp Ala Val Ala Asn Met Leu Tyr Trp Pro Asn Asn
305                 310                 315                 320
Asp Arg Leu Tyr Glu Asn Pro Tyr Ala Val Glu Phe Leu Arg Gln Leu
                325                 330                 335
Asn Glu Ala Val Phe Ala Tyr Asp Pro Asn Val Leu Met Ile Ala Glu
            340                 345                 350
Asp Ser Thr Asp Trp Pro Arg Val Thr Ala Pro Thr Tyr Asp Gly Gly
        355                 360                 365
Leu Gly Phe Asn Tyr Lys Trp Asn Met Gly Trp Met Asn Asp Met Leu
    370                 375                 380
Lys Tyr Met Glu Thr Pro Pro His Glu Arg Lys Tyr Ala His Asn Gln
385                 390                 395                 400
Val Ser Phe Ser Leu Leu Tyr Ala Tyr Ser Glu Asn Phe Ile Leu Pro
                405                 410                 415
Phe Ser His Asp Glu Val Val His Gly Lys Lys Ser Leu Leu Asn Lys
            420                 425                 430
Met Pro Gly Ser Tyr Glu Glu Lys Phe Ala Gln Leu Arg Leu Leu Tyr
        435                 440                 445
Gly Tyr Met Met Ala His Pro Gly Lys Lys Leu Leu Phe Met Gly Ser
    450                 455                 460
Glu Phe Ala Gln Phe Asp Glu Trp Lys Phe Glu Gly Glu Leu Asp Trp
465                 470                 475                 480
Val Leu Phe Asp Phe Glu Leu His Trp Lys Met Asp Glu Tyr Val Lys
                485                 490                 495
Gln Leu Ile Ala Cys Tyr Lys Arg Tyr Lys Pro Phe Tyr Glu Leu Asp
            500                 505                 510
His Asp Pro Arg Gly Phe Glu Trp Ile Asp Val His Asn Ala Glu Gln
        515                 520                 525
Ser Ile Phe Ser Phe Ile Arg Arg Gly Lys Lys Glu Gly Asp Val Leu
    530                 535                 540
Val Ile Val Cys Asn Phe Thr Asn Gln Ala Tyr Asp Asp Tyr Lys Val
545                 550                 555                 560
Gly Val Pro Leu Leu Ala Pro Tyr Arg Glu Val Leu Asn Ser Asp Ala
                565                 570                 575
Ala Glu Phe Gly Gly Ser Gly His Val Asn Ser Lys Arg Leu Ser Ala
            580                 585                 590
Phe His Glu Pro Phe His Gly Lys Pro Tyr His Val Arg Met Thr Ile
        595                 600                 605
Pro Pro Phe Gly Ile Ser Ile Leu Arg Pro Val Gln Lys Arg Gly Glu
    610                 615                 620
Arg Lys Gln Asn Glu Glu Glu Val His Arg His Val Ile Gly Arg Arg
625                 630                 635                 640
Ala Arg Lys Pro Ala Ser Leu Ala Asp Glu Lys His Arg Glu Thr Ser
                645                 650                 655
Arg Ala Val Trp Gly Glu Val Pro Asp His
            660                 665
<210>15
<211>2301
<212>DNA
<213>Thermosynechococcus elongatus BP-1
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2301)
<400>15
atg acc gtt tcg cct gag cag att gac cgc att gtt tcc aac cag cac        48
Met Thr Val Ser Pro Glu Gln Ile Asp Arg Ile Val Ser Asn Gln His
1               5                   10                  15
cac gat ccc ttt gaa att tta ggg tgt cat cag att cag caa aat ggc        96
His Asp Pro Phe Glu Ile Leu Gly Cys His Gln Ile Gln Gln Asn Gly
            20                  25                  30
caa tcc gtt tgg gcg gta cgt gcc tac tta ccc aat gcc gag cgg gtg       144
Gln Ser Val Trp Ala Val Arg Ala Tyr Leu Pro Asn Ala Glu Arg Val
        35                  40                  45
agt gtc ctc tgt ccg gag cag cgg caa gaa tat cca atg aca ccg gtg       192
Ser Val Leu Cys Pro Glu Gln Arg Gln Glu Tyr Pro Met Thr Pro Val
    50                  55                  60
cac cac cct cac ttt ttt gag tgc cac att ccc gta gcg gaa ctc aat       240
His His Pro His Phe Phe Glu Cys His Ile Pro Val Ala Glu Leu Asn
65                  70                  75                  80
aac tat caa ctg aaa atc tac gaa aat ggc cac gag cgg gtt atc tat       288
Asn Tyr Gln Leu Lys Ile Tyr Glu Asn Gly His Glu Arg Val Ile Tyr
                85                  90                  95
gac cct tat gcc ttt cgc tcc ccc aag ttg acc gac ttt gat att cac       336
Asp Pro Tyr Ala Phe Arg Ser Pro Lys Leu Thr Asp Phe Asp Ile His
            100                 105                 110
ctt ttt gcc gag ggc aat cat cac cgc atc tac gaa aaa ctg ggg gct      384
Leu Phe Ala Glu Gly Asn His His Arg Ile Tyr Glu Lys Leu Gly Ala
        115                 120                 125
cat ctg ctg aca gtg gat ggg gta gag ggg gtc tat ttt gcc gtc tgg      432
His Leu Leu Thr Val Asp Gly Val Glu Gly Val Tyr Phe Ala Val Trp
    130                 135                 140
gca ccc aat gcc cgc aat gtt tct gtc att ggt gac ttt aac cac tgg      480
Ala Pro Asn Ala Arg Asn Val Ser Val Ile Gly Asp Phe Asn His Trp
145                 150                 155                 160
gac ggc cgc aaa cat caa atg gca cga cgg ggc aat ggc atc tgg gaa      528
Asp Gly Arg Lys His Gln Met Ala Arg Arg Gly Asn Gly Ile Trp Glu
                165                 170                 175
ctg ttt att ccc ggc ttg agc gtc ggc gag cgc tat aag tac gaa atc      576
Leu Phe Ile Pro Gly Leu Ser Val Gly Glu Arg Tyr Lys Tyr Glu Ile
            180                 185                 190
aag aac caa gag ggc cac atc tac gaa aaa tca gat ccc tac ggc ttc      624
Lys Asn Gln Glu Gly His Ile Tyr Glu Lys Ser Asp Pro Tyr Gly Phe
        195                 200                 205
tac caa gaa ccg cgt ccc aag act gct tcc att gtc acc gac ctc aat      672
Tyr Gln Glu Pro Arg Pro Lys Thr Ala Ser Ile Val Thr Asp Leu Asn
    210                 215                 220
agc tac gaa tgg ggg gac agc gac tgg cta gaa aaa cgg cgc cac acc      720
Ser Tyr Glu Trp Gly Asp Ser Asp Trp Leu Glu Lys Arg Arg His Thr
225                 230                 235                 240
gac ccc ctc aac caa ccg att tct gtc tat gag gtg cac cta gga tct      768
Asp Pro Leu Asn Gln Pro Ile Ser Val Tyr Glu Val His Leu Gly Ser
                245                 250                 255
tgg ctc cat gcc tcg atg gag gat ccc ccc att ggt gcc gat ggc caa      816
Trp Leu His Ala Ser Met Glu Asp Pro Pro Ile Gly Ala Asp Gly Gln
            260                 265                 270
ccc caa gaa ccc gta cag gcg gca gaa ctc aag ccc tgg gca cgc ttc      864
Pro Gln Glu Pro Val Gln Ala Ala Glu Leu Lys Pro Trp Ala Arg Phe
        275                 280                 285
ctg acc tat cgt gaa ttg gca gcc aaa ctc att ccc tac gtc aag gaa      912
Leu Thr Tyr Arg Glu Leu Ala Ala Lys Leu Ile Pro Tyr Val Lys Glu
    290                 295                 300
ttg ggc tac acc cac att gaa ctt ttg cct gtt gct gag cat ccc ttc      960
Leu Gly Tyr Thr His Ile Glu Leu Leu Pro Val Ala Glu His Pro Phe
305                 310                 315                 320
gat ggc tct tgg ggc tat caa gtg act ggc tac tat gcc ccc aca tcc      1008
Asp Gly Ser Trp Gly Tyr Gln Val Thr Gly Tyr Tyr Ala Pro Thr Ser
                325                 330                 335
cgc tat ggc agt ccc cac gac ttt atg tat ttt gtg gat cag tgc cac      1056
Arg Tyr Gly Ser Pro His Asp Phe Met Tyr Phe Val Asp Gln Cys His
            340                 345                 350
caa aac ggc att ggc gtc att gtc gat tgg gta ccg ggg cac ttt ccc      1104
Gln Asn Gly Ile Gly Val Ile Val Asp Trp Val Pro Gly His Phe Pro
        355                 360                 365
aag gac ggc cat ggg ctg gcg ttc ttt gat ggc acc cac ctc tac gaa      1152
Lys Asp Gly His Gly Leu Ala Phe Phe Asp Gly Thr His Leu Tyr Glu
    370                 375                 380
cac gcg gat ccc cgc aag ggt gaa cat aag gaa tgg ggc acc ctt gtc      1200
His Ala Asp Pro Arg Lys Gly Glu His Lys Glu Trp Gly Thr Leu Val
385                 390                 395                 400
ttt aac tat ggt cgc cac gaa gtg cgc aat ttt ctc gtc gcc aat gcc     1248
Phe Asn Tyr Gly Arg His Glu Val Arg Asn Phe Leu Val Ala Asn Ala
                405                 410                 415
ctg ttt tgg ttt gac aag tac cac att gac ggt att cgc gtg gat gcc     1296
Leu Phe Trp Phe Asp Lys Tyr His Ile Asp Gly Ile Arg Val Asp Ala
            420                 425                 430
gtc gcc tca atg ctc tat ctc gac tat ggc cgc aaa gag gga gag tgg     1344
Val Ala Ser Met Leu Tyr Leu Asp Tyr Gly Arg Lys Glu Gly Glu Trp
        435                 440                 445
ata ccc aat gaa tac ggt gga cgg gag aat tta gag gcg gcc aac ttc     1392
Ile Pro Asn Glu Tyr Gly Gly Arg Glu Asn Leu Glu Ala Ala Asn Phe
    450                 455                 460
ctg cgc caa gtc aac cat gtt atc ttt agc tac ttt ccg ggg att ctc     1440
Leu Arg Gln Val Asn His Val Ile Phe Ser Tyr Phe Pro Gly Ile Leu
465                 470                 475                 480
tcg atc gcc gag gag tca acc gcc tgg ccg atg gtc tcc tgg ccg acc     1488
Ser Ile Ala Glu Glu Ser Thr Ala Trp Pro Met Val Ser Trp Pro Thr
                485                 490                 495
tac atg ggg gga ttg ggc ttt aac ctg aag tgg aac atg ggt tgg atg     1536
Tyr Met Gly Gly Leu Gly Phe Asn Leu Lys Trp Asn Met Gly Trp Met
            500                 505                 510
cac gat atg ctt gac tac ttc agc atg gat ccg tgg ttc cgc cag ttc     1584
His Asp Met Leu Asp Tyr Phe Ser Met Asp Pro Trp Phe Arg Gln Phe
        515                 520                 525
cat cac aac aat gtc acc ttc agt atg tgg tac cac cac agc gag aac     1632
His His Asn Asn Val Thr Phe Ser Met Trp Tyr His His Ser Glu Asn
    530                 535                 540
ttc atg ctg gca ctt tcc cac gat gag gtg gtt cac ggc aag agt cac     1680
Phe Met Leu Ala Leu Ser His Asp Glu Val Val His Gly Lys Ser His
545                 550                 555                 560
atc att ggc aaa atg ccg ggc gat cgc tgg caa aaa ttt gcg aac ctg      1728
Ile Ile Gly Lys Met Pro Gly Asp Arg Trp Gln Lys Phe Ala Asn Leu
                565                 570                 575
cgc tgt tta ttt gcc tat atg ttc acc cac ccc ggt aag aaa aca atg      1776
Arg Cys Leu Phe Ala Tyr Met Phe Thr His Pro Gly Lys Lys Thr Met
            580                 585                 590
ttc atg ggc atg gag ttt gcc caa tgg agc gag tgg aat gtc tgg agc      1824
Phe Met Gly Met Glu Phe Ala Gln Trp Ser Glu Trp Asn Val Trp Ser
        595                 600                 605
gat cta gag tgg cac ctg ctg caa tac gaa ccc cac cag caa atc aaa      1872
Asp Leu Glu Trp His Leu Leu Gln Tyr Glu Pro His Gln Gln Ile Lys
    610                 615                 620
cgc ttc ttt ggg gat ctg aat cac ctc tac cgt tcc caa ccc gca ctc      1920
Arg Phe Phe Gly Asp Leu Asn His Leu Tyr Arg Ser Gln Pro Ala Leu
625                 630                 635                 640
tat agc caa gat ttc aaa cag gag ggc ttt gag tgg att gac tgt agc      1968
Tyr Ser Gln Asp Phe Lys Gln Glu Gly Phe Glu Trp Ile Asp Cys Ser
                645                 650                 655
gat aac cgc cac agc gtt gtg tcc ttt atc cgc tgg gac aag gac tac      2016
Asp Asn Arg His Ser Val Val Ser Phe Ile Arg Trp Asp Lys Asp Tyr
            660                 665                 670
caa gat ttt gta gtt gtc gtc tgt aac ttt aca cca cag ccc cat agc      2064
Gln Asp Phe Val Val Val Val Cys Asn Phe Thr Pro Gln Pro His Ser
        675                 680                 685
cac tac cgt atc ggg gtg cct gag cat ggc ttc tat agg gaa ctg ttt      2112
His Tyr Arg Ile Gly Val Pro Glu His Gly Phe Tyr Arg Glu Leu Phe
    690                 695                 700
aac agt gat gcc cgc gag tac ggc ggc agc aat atg ggc aac tta ggc     2160
Asn Ser Asp Ala Arg Glu Tyr Gly Gly Ser Asn Met Gly Asn Leu Gly
705                 710                 715                 720
ggc aag tgg gca gat gag tgg ccc tat cac cag cgt cgc tat tcc ctt     2208
Gly Lys Trp Ala Asp Glu Trp Pro Tyr His Gln Arg Arg Tyr Ser Leu
                725                 730                 735
gat ctg tgc tta ccc ccc ttg gca gtg ctc att ttg aaa ctg gat cgg     2256
Asp Leu Cys Leu Pro Pro Leu Ala Val Leu Ile Leu Lys Leu Asp Arg
            740                 745                 750
gag aaa aca gtg gca gag cgg gca cgc tat aac ctt cag tcc taa         2301
Glu Lys Thr Val Ala Glu Arg Ala Arg Tyr Asn Leu Gln Ser
        755                 760                 765
<210>16
<211>766
<212>PRT
<213>Thermosynechococcus elongatus BP-1
<400>16
Met Thr Val Ser Pro Glu Gln Ile Asp Arg Ile Val Ser Asn Gln His
1               5                   10                  15
His Asp Pro Phe Glu Ile Leu Gly Cys His Gln Ile Gln Gln Asn Gly
            20                  25                  30
Gln Ser Val Trp Ala Val Arg Ala Tyr Leu Pro Asn Ala Glu Arg Val
        35                  40                  45
Ser Val Leu Cys Pro Glu Gln Arg Gln Glu Tyr Pro Met Thr Pro Val
    50                  55                  60
His His Pro His Phe Phe Glu Cys His Ile Pro Val Ala Glu Leu Asn
65                  70                  75                  80
Asn Tyr Gln Leu Lys Ile Tyr Glu Asn Gly His Glu Arg Val Ile Tyr
                85                  90                  95
Asp Pro Tyr Ala Phe Arg Ser Pro Lys Leu Thr Asp Phe Asp Ile His
            100                 105                 110
Leu Phe Ala Glu Gly Asn His His Arg Ile Tyr Glu Lys Leu Gly Ala
        115                 120                 125
His Leu Leu Thr Val Asp Gly Val Glu Gly Val Tyr Phe Ala Val Trp
    130                 135                 140
Ala Pro Asn Ala Arg Asn Val Ser Val Ile Gly Asp Phe Asn His Trp
145                 150                 155                 160
Asp Gly Arg Lys His Gln Met Ala Arg Arg Gly Asn Gly Ile Trp Glu
                165                 170                 175
Leu Phe Ile Pro Gly Leu Ser Val Gly Glu Arg Tyr Lys Tyr Glu Ile
            180                 185                 190
Lys Asn Gln Glu Gly His Ile Tyr Glu Lys Ser Asp Pro Tyr Gly Phe
        195                 200                 205
Tyr Gln Glu Pro Arg Pro Lys Thr Ala Ser Ile Val Thr Asp Leu Asn
    210                 215                 220
Ser Tyr Glu Trp Gly Asp Ser Asp Trp Leu Glu Lys Arg Arg His Thr
225                 230                 235                 240
Asp Pro Leu Asn Gln Pro Ile Ser Val Tyr Glu Val His Leu Gly Ser
                245                 250                 255
Trp Leu His Ala Ser Met Glu Asp Pro Pro Ile Gly Ala Asp Gly Gln
            260                 265                 270
Pro Gln Glu Pro Val Gln Ala Ala Glu Leu Lys Pro Trp Ala Arg Phe
        275                 280                 285
Leu Thr Tyr Arg Glu Leu Ala Ala Lys Leu Ile Pro Tyr Val Lys Glu
    290                 295                 300
Leu Gly Tyr Thr His Ile Glu Leu Leu Pro Val Ala Glu His Pro Phe
305                 310                 315                 320
Asp Gly Ser Trp Gly Tyr Gln Val Thr Gly Tyr Tyr Ala Pro Thr Ser
                325                 330                 335
Arg Tyr Gly Ser Pro His Asp Phe Met Tyr Phe Val Asp Gln Cys His
            340                 345                 350
Gln Asn Gly Ile Gly Val Ile Val Asp Trp Val Pro Gly His Phe Pro
        355                 360                 365
Lys Asp Gly His Gly Leu Ala Phe Phe Asp Gly Thr His Leu Tyr Glu
    370                 375                 380
His Ala Asp Pro Arg Lys Gly Glu His Lys Glu Trp Gly Thr Leu Val
385                 390                 395                 400
Phe Asn Tyr Gly Arg His Glu Val Arg Asn Phe Leu Val Ala Asn Ala
                405                 410                 415
Leu Phe Trp Phe Asp Lys Tyr His Ile Asp Gly Ile Arg Val Asp Ala
            420                 425                 430
Val Ala Ser Met Leu Tyr Leu Asp Tyr Gly Arg Lys Glu Gly Glu Trp
        435                 440                 445
Ile Pro Asn Glu Tyr Gly Gly Arg Glu Asn Leu Glu Ala Ala Asn Phe
    450                 455                 460
Leu Arg Gln Val Asn His Val Ile Phe Ser Tyr Phe Pro Gly Ile Leu
465                 470                 475                 480
Ser Ile Ala Glu Glu Ser Thr Ala Trp Pro Met Val Ser Trp Pro Thr
                485                 490                 495
Tyr Met Gly Gly Leu Gly Phe Asn Leu Lys Trp Asn Met Gly Trp Met
            500                 505                 510
His Asp Met Leu Asp Tyr Phe Ser Met Asp Pro Trp Phe Arg Gln Phe
        515                 520                 525
His His Asn Asn Val Thr Phe Ser Met Trp Tyr His His Ser Glu Asn
    530                 535                 540
Phe Met Leu Ala Leu Ser His Asp Glu Val Val His Gly Lys Ser His
545                 550                 555                 560
Ile Ile Gly Lys Met Pro Gly Asp Arg Trp Gln Lys Phe Ala Asn Leu
                565                 570                 575
Arg Cys Leu Phe Ala Tyr Met Phe Thr His Pro Gly Lys Lys Thr Met
            580                 585                 590
Phe Met Gly Met Glu Phe Ala Gln Trp Ser Glu Trp Asn Val Trp Ser
        595                 600                 605
Asp Leu Glu Trp His Leu Leu Gln Tyr Glu Pro His Gln Gln Ile Lys
    610                 615                 620
Arg Phe Phe Gly Asp Leu Asn His Leu Tyr Arg Ser Gln Pro Ala Leu
625                 630                 635                 640
Tyr Ser Gln Asp Phe Lys Gln Glu Gly Phe Glu Trp Ile Asp Cys Ser
                645                 650                 655
Asp Asn Arg His Ser Val Val Ser Phe Ile Arg Trp Asp Lys Asp Tyr
            660                 665                 670
Gln Asp Phe Val Val Val Val Cys Asn Phe Thr Pro Gln Pro His Ser
        675                 680                 685
His Tyr Arg Ile Gly Val Pro Glu His Gly Phe Tyr Arg Glu Leu Phe
    690                 695                 700
Asn Ser Asp Ala Arg Glu Tyr Gly Gly Ser Asn Met Gly Asn Leu Gly
705                 710                 715                 720
Gly Lys Trp Ala Asp Glu Trp Pro Tyr His Gln Arg Arg Tyr Ser Leu
                725                 730                 735
Asp Leu Cys Leu Pro Pro Leu Ala Val Leu Ile Leu Lys Leu Asp Arg
            740                 745                 750
Glu Lys Thr Val Ala Glu Arg Ala Arg Tyr Asn Leu Gln Ser
        755                 760                 765
<210>17
<211>2187
<212>DNA
<213>大肠埃希氏菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2187)
<400>17
atg tcc gat cgt atc gat aga gac gtg att aac gcg cta att gca ggc       48
Met Ser Asp Arg Ile Asp Arg Asp Val Ile Asn Ala Leu Ile Ala Gly
1               5                   10                  15
cat ttt gcg gat cct ttt tcc gta ctg gga atg cat aaa acc acc gcg       96
His Phe Ala Asp Pro Phe Ser Val Leu Gly Met His Lys Thr Thr Ala
            20                  25                  30
gga ctg gaa gtc cgt gcc ctt tta ccc gac gct acc gat gtg tgg gtg      144
Gly Leu Glu Val Arg Ala Leu Leu Pro Asp Ala Thr Asp Val Trp Val
        35                  40                  45
att gaa ccg aaa acc ggg cgc aaa ctc gca aaa ctg gag tgt ctc gac      192
Ile Glu Pro Lys Thr Gly Arg Lys Leu Ala Lys Leu Glu Cys Leu Asp
    50                  55                  60
tca cgg gga ttc ttt agc ggc gtc att ccg cga cgt aag aat ttt ttc      240
Ser Arg Gly Phe Phe Ser Gly Val Ile Pro Arg Arg Lys Asn Phe Phe
65                  70                  75                  80
cgc tat cag ttg gct gtt gtc tgg cat ggt cag caa aac ctg att gat      288
Arg Tyr Gln Leu Ala Val Val Trp His Gly Gln Gln Asn Leu Ile Asp
                85                  90                  95
gat cct tac cgt ttt ggt ccg cta atc cag gaa atg gat gcc tgg cta      336
Asp Pro Tyr Arg Phe Gly Pro Leu Ile Gln Glu Met Asp Ala Trp Leu
            100                 105                 110
tta tct gaa ggt act cac ctg cgc ccg tat gaa acc tta ggc gcg cat      384
Leu Ser Glu Gly Thr His Leu Arg Pro Tyr Glu Thr Leu Gly Ala His
        115                 120                 125
gca gat act atg gat ggc gtc aca ggt acg cgt ttc tct gtc tgg gct      432
Ala Asp Thr Met Asp Gly Val Thr Gly Thr Arg Phe Ser Val Trp Ala
    130                 135                 140
cca aac gcc cgt cgg gtc tcg gtg gtt ggg caa ttc aac tac tgg gac      480
Pro Asn Ala Arg Arg Val Ser Val Val Gly Gln Phe Asn Tyr Trp Asp
145                 150                 155                 160
ggt cgc cgt cac ccg atg cgc ctg cgt aaa gag agc ggc atc tgg gaa      528
Gly Arg Arg His Pro Met Arg Leu Arg Lys Glu Ser Gly Ile Trp Glu
                165                 170                 175
ctg ttt atc cct ggg gcg cat aac ggt cag ctc tat aaa tac gag atg      576
Leu Phe Ile Pro Gly Ala His Asn Gly Gln Leu Tyr Lys Tyr Glu Met
            180                 185                 190
att gat gcc aat ggc aac ttg cgt ctg aag tcc gac cct tat gcc ttt      624
Ile Asp Ala Asn Gly Asn Leu Arg Leu Lys Ser Asp Pro Tyr Ala Phe
        195                 200                 205
gaa gcg caa atg cgc ccg gaa acc gcg tct ctt att tgc ggg ctg ccg      672
Glu Ala Gln Met Arg Pro Glu Thr Ala Ser Leu Ile Cys Gly Leu Pro
    210                 215                 220
gaa aag gtt gta cag act gaa gag cgc aaa aaa gcg aat cag ttt gat      720
Glu Lys Val Val Gln Thr Glu Glu Arg Lys Lys Ala Asn Gln Phe Asp
225                 230                 235                 240
gcg cca atc tct att tat gaa gtt cac ctg ggt tcc tgg cgt cgc cac      768
Ala Pro Ile Ser Ile Tyr Glu Val His Leu Gly Ser Trp Arg Arg His
                245                 250                 255
acc gac aac aat ttc tgg ttg agc tac cgc gag ctg gcc gat caa ctg      816
Thr Asp Asn Asn Phe Trp Leu Ser Tyr Arg Glu Leu Ala Asp Gln Leu
            260                 265                 270
gtg cct tat gct aaa tgg atg ggc ttt acc cac ctc gaa cta ctg ccc      864
Val Pro Tyr Ala Lys Trp Met Gly Phe Thr His Leu Glu Leu Leu Pro
        275                 280                 285
att aac gag cat ccc ttc gat ggc agt tgg ggt tat cag cca acc ggc      912
Ile Asn Glu His Pro Phe Asp Gly Ser Trp Gly Tyr Gln Pro Thr Gly
    290                 295                 300
ctg tat gcg cca acc cgc cgt ttt ggt act cgc gac gac ttc cgt tat      960
Leu Tyr Ala Pro Thr Arg Arg Phe Gly Thr Arg Asp Asp Phe Arg Tyr
305                 310                 315                 320
ttc att gat gcc gca cac gca gct ggt ctg aac gtg att ctc gac tgg     1008
Phe Ile Asp Ala Ala His Ala Ala Gly Leu Asn Val Ile Leu Asp Trp
                325                 330                 335
gtg cca ggc cac ttc ccg act gat gac ttt gcg ctt gcc gaa ttt gat     1056
Val Pro Gly His Phe Pro Thr Asp Asp Phe Ala Leu Ala Glu Phe Asp
            340                 345                 350
ggc acg aac ttg tat gaa cac agc gat ccg cgt gaa ggc tat cat cag     1104
Gly Thr Asn Leu Tyr Glu His Ser Asp Pro Arg Glu Gly Tyr His Gln
        355                 360                 365
gac tgg aac acg ctg atc tac aac tat ggt cgc cgt gaa gtc agt aac     1152
Asp Trp Asn Thr Leu Ile Tyr Asn Tyr Gly Arg Arg Glu Val Ser Asn
    370                 375                 380
ttc ctc gtc ggt aac gcg ctt tac tgg att gaa cgt ttt ggt att gat     1200
Phe Leu Val Gly Asn Ala Leu Tyr Trp Ile Glu Arg Phe Gly Ile Asp
385                 390                 395                 400
gcg ctg cgc gtc gat gcg gtg gcg tca atg att tat cgc gac tac agc     1248
Ala Leu Arg Val Asp Ala Val Ala Ser Met Ile Tyr Arg Asp Tyr Ser
                405                 410                 415
cgt aaa gag ggg gag tgg atc ccg aac gaa ttt ggc ggg cgc gag aat     1296
Arg Lys Glu Gly Glu Trp Ile Pro Asn Glu Phe Gly Gly Arg Glu Asn
            420                 425                 430
ctt gaa gcg att gaa ttc ttg cgt aat acc aac cgt att ctt ggt gag     1344
Leu Glu Ala Ile Glu Phe Leu Arg Asn Thr Asn Arg Ile Leu Gly Glu
        435                 440                 445
cag gtt tcc ggt gcg gtg aca atg gct gag gag tct acc gat ttc cct     1392
Gln Val Ser Gly Ala Val Thr Met Ala Glu Glu Ser Thr Asp Phe Pro
    450                 455                 460
ggc gtt tct cgt ccg cag gat atg ggc ggt ctg ggc ttc tgg tac aag     1440
Gly Val Ser Arg Pro Gln Asp Met Gly Gly Leu Gly Phe Trp Tyr Lys
465                 470                 475                 480
tgg aac ctc ggc tgg atg cat gac acc ctg gac tac atg aag ctc gac     1488
Trp Asn Leu Gly Trp Met His Asp Thr Leu Asp Tyr Met Lys Leu Asp
                485                 490                 495
ccg gtt tat cgt cag tat cat cac gat aaa ctg acc ttc ggg att ctc     1536
Pro Val Tyr Arg Gln Tyr His His Asp Lys Leu Thr Phe Gly Ile Leu
            500                 505                 510
tac aac tac act gaa aac ttc gtc ctg ccg ttg tcg cat gat gaa gtg     1584
Tyr Asn Tyr Thr Glu Asn Phe Val Leu Pro Leu Ser His Asp Glu Val
        515                 520                 525
gtc cac ggt aaa aaa tcg att ctc gac cgc atg ccg ggc gac gca tgg     1632
Val His Gly Lys Lys Ser Ile Leu Asp Arg Met Pro Gly Asp Ala Trp
    530                 535                 540
cag aaa ttc gcg aac ctg cgc gcc tac tat ggc tgg atg tgg gca ttc     1680
Gln Lys Phe Ala Asn Leu Arg Ala Tyr Tyr Gly Trp Met Trp Ala Phe
545                 550                 555                 560
ccg ggc aag aaa cta ctg ttc atg ggt aac gaa ttt gcc cag ggc cgc     1728
Pro Gly Lys Lys Leu Leu Phe Met Gly Asn Glu Phe Ala Gln Gly Arg
                565                 570                 575
gag tgg aac cat gac gcc agc ctc gac tgg cat ctg ttg gaa ggc ggc     1776
Glu Trp Asn His Asp Ala Ser Leu Asp Trp His Leu Leu Glu Gly Gly
            580                 585                 590
gat aac tgg cac cac ggt gtc cag cgt ctg gtg cgc gat ctg aac ctc     1824
Asp Asn Trp His His Gly Val Gln Arg Leu Val Arg Asp Leu Asn Leu
        595                 600                 605
acc tac cgc cac cat aaa gca atg cat gaa ctg gat ttt gac ccg tac     1872
Thr Tyr Arg His His Lys Ala Met His Glu Leu Asp Phe Asp Pro Tyr
    610                 615                 620
ggc ttt gaa tgg ctg gtg gtg gat gac aaa gaa cgc tcg gtg ctg atc     1920
Gly Phe Glu Trp Leu ValVal Asp Asp Lys Glu Arg Ser Val Leu Ile
625                 630                 635                 640
ttt gtg cgt cgc gat aaa gag ggt aac gaa atc atc gtt gcc agt aac     1968
Phe Val Arg Arg Asp Lys Glu Gly Asn Glu Ile Ile ValAla Ser Asn
                645                 650                 655
ttt acg ccg gta ccg cgt cat gat tat cgc ttc ggc ata aac cag ccg     2016
Phe Thr Pro Val Pro Arg His Asp Tyr Arg Phe Gly Ile Asn Gln Pro
             660                 665                 670
ggc aaa tgg cgt gaa atc ctc aat acc gat tcc atg cac tat cac ggc     2064
Gly Lys Trp Arg Glu Ile Leu Asn Thr Asp Ser Met His Tyr His Gly
        675                 680                 685
agt aat gca ggc aat ggc ggc acg gta cac agc gat gag att gcc agc     2112
Ser Asn Ala Gly Asn Gly Gly Thr Val His Ser Asp Glu Ile Ala Ser
    690                 695                 700
cac ggt cgt cag cat tca cta agc ctg acg cta cca ccg ctg gcc act     2160
His Gly Arg Gln His Ser Leu Ser Leu Thr Leu Pro Pro Leu Ala Thr
705                 710                 715                 720
atc tgg ctg gtt cgg gag gca gaa tga                                 2187
Ile Trp Leu Val Arg Glu Ala Glu
                725
<210>18
<211>728
<212>PRT
<213>大肠埃希氏菌
<400>18
Met Ser Asp Arg Ile Asp Arg Asp Val Ile Asn Ala Leu Ile Ala Gly
1               5                   10                  15
His Phe Ala Asp Pro Phe Ser Val Leu Gly Met His Lys Thr Thr Ala
            20                  25                  30
Gly Leu Glu Val Arg Ala Leu Leu Pro Asp Ala Thr Asp Val Trp Val
        35                  40                  45
Ile Glu Pro Lys Thr Gly Arg Lys Leu Ala Lys Leu Glu Cys Leu Asp
    50                  55                  60
Ser Arg Gly Phe Phe Ser Gly Val Ile Pro Arg Arg Lys Asn Phe Phe
65                  70                  75                  80
Arg Tyr Gln Leu Ala Val Val Trp His Gly Gln Gln Asn Leu Ile Asp
                85                  90                  95
Asp Pro Tyr Arg Phe Gly Pro Leu Ile Gln Glu Met Asp Ala Trp Leu
            100                 105                 110
Leu Ser Glu Gly Thr His Leu Arg Pro Tyr Glu Thr Leu Gly Ala His
        115                 120                 125
Ala Asp Thr Met Asp Gly Val Thr Gly Thr Arg Phe Ser Val Trp Ala
    130                 135                 140
Pro Asn Ala Arg Arg Val Ser Val Val Gly Gln Phe Asn Tyr Trp Asp
145                 150                 155                 160
Gly Arg Arg His Pro Met Arg Leu Arg Lys Glu Ser Gly Ile Trp Glu
                165                 170                 175
Leu Phe Ile Pro Gly Ala His Asn Gly Gln Leu Tyr Lys Tyr Glu Met
            180                 185                 190
Ile Asp Ala Asn Gly Asn Leu Arg Leu Lys Ser Asp Pro Tyr Ala Phe
        195                 200                 205
Glu Ala Gln Met Arg Pro Glu Thr Ala Ser Leu Ile Cys Gly Leu Pro
    210                 215                 220
Glu Lys Val Val Gln Thr Glu Glu Arg Lys Lys Ala Asn Gln Phe Asp
225                 230                 235                 240
Ala Pro Ile Ser Ile Tyr Glu Val His Leu Gly Ser Trp Arg Arg His
                245                 250                 255
Thr Asp Asn Asn Phe Trp Leu Ser Tyr Arg Glu Leu Ala Asp Gln Leu
            260                 265                 270
Val Pro Tyr Ala Lys Trp Met Gly Phe Thr His Leu Glu Leu Leu Pro
        275                 280                 285
Ile Asn Glu His Pro Phe Asp Gly Ser Trp Gly Tyr Gln Pro Thr Gly
    290                 295                 300
Leu Tyr Ala Pro Thr Arg Arg Phe Gly Thr Arg Asp Asp Phe Arg Tyr
305                 310                 315                 320
Phe Ile Asp Ala Ala His Ala Ala Gly Leu Asn Val Ile Leu Asp Trp
                325                 330                 335
Val Pro Gly His Phe Pro Thr Asp Asp Phe Ala Leu Ala Glu Phe Asp
            340                 345                 350
Gly Thr Asn Leu Tyr Glu His Ser Asp Pro Arg Glu Gly Tyr His Gln
        355                 360                 365
Asp Trp Asn Thr Leu Ile Tyr Asn Tyr Gly Arg Arg Glu Val Ser Asn
    370                 375                 380
Phe Leu Val Gly Asn Ala Leu Tyr Trp Ile Glu Arg Phe Gly Ile Asp
385                 390                 395                 400
Ala Leu Arg Val Asp Ala Val Ala Ser Met Ile Tyr Arg Asp Tyr Ser
                405                 410                 415
Arg Lys Glu Gly Glu Trp Ile Pro Asn Glu Phe Gly Gly Arg Glu Asn
            420                 425                 430
Leu Glu Ala Ile Glu Phe Leu Arg Asn Thr Asn Arg Ile Leu Gly Glu
        435                 440                 445
Gln Val Ser Gly Ala Val Thr Met Ala Glu Glu Ser Thr Asp Phe Pro
    450                 455                 460
Gly Val Ser Arg Pro Gln Asp Met Gly Gly Leu Gly Phe Trp Tyr Lys
465                 470                 475                 480
Trp Asn Leu Gly Trp Met His Asp Thr Leu Asp Tyr Met Lys Leu Asp
                485                 490                 495
Pro Val Tyr Arg Gln Tyr His His Asp Lys Leu Thr Phe Gly Ile Leu
            500                 505                 510
Tyr Asn Tyr Thr Glu Asn Phe Val Leu Pro Leu Ser His Asp Glu Val
        515                 520                 525
Val His Gly Lys Lys Ser Ile Leu Asp Arg Met Pro Gly Asp Ala Trp
    530                 535                 540
Gln Lys Phe Ala Asn Leu Arg Ala Tyr Tyr Gly Trp Met Trp Ala Phe
545                 550                 555                 560
Pro Gly Lys Lys Leu Leu Phe Met Gly Asn Glu Phe Ala Gln Gly Arg
                565                 570                 575
Glu Trp Asn His Asp Ala Ser Leu Asp Trp His Leu Leu Glu Gly Gly
            580                 585                 590
Asp Asn Trp His His Gly Val Gln Arg Leu Val Arg Asp Leu Asn Leu
        595                 600                 605
Thr Tyr Arg His His Lys Ala Met His Glu Leu Asp Phe Asp Pro Tyr
    610                 615                 620
Gly Phe Glu Trp Leu Val Val Asp Asp Lys Glu Arg Ser Val Leu Ile
625                 630                 635                 640
Phe Val Arg Arg Asp Lys Glu Gly Asn Glu Ile Ile Val Ala Ser Asn
                645                 650                 655
Phe Thr Pro Val Pro Arg His Asp Tyr Arg Phe Gly Ile Asn Gln Pro
            660                 665                 670
Gly Lys Trp Arg Glu Ile Leu Asn Thr Asp Ser Met His Tyr His Gly
        675                 680                 685
Ser Asn Ala Gly Asn Gly Gly Thr Val His Ser Asp Glu Ile Ala Ser
    690                 695                 700
His Gly Arg Gln His Ser Leu Ser Leu Thr Leu Pro Pro Leu Ala Thr
705                 710                 715                 720
Ile Trp Leu Val Arg Glu Ala Glu
                725
<210>19
<211>1503
<212>DNA
<213>水生栖热菌Taq MalQ
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1503)
<400>19
atg gag ctt ccc cgc gct ttc ggt ctg ctt ctc cac ccc acg agc ctc        48
Met Glu Leu Pro Arg Ala Phe Gly Leu Leu Leu His Pro Thr Ser Leu
1               5                   10                  15
ccc ggc ccc tac ggc gtc ggc gtc ctg ggc cgg gag gcc cgg gac ttc        96
Pro Gly Pro Tyr Gly Val Gly Val Leu Gly Arg Glu Ala Arg Asp Phe
            20                  25                  30
ctc cgc ttc ctc aag gag gcg ggg ggg cgg tac tgg cag gtc ctc ccc       144
Leu Arg Phe Leu Lys Glu Ala Gly Gly Arg Tyr Trp Gln Val Leu Pro
        35                  40                  45
ttg ggc ccc acg ggc tat ggc gac tcc ccc tac cag tcc ttc agc gcc       192
Leu Gly Pro Thr Gly Tyr Gly Asp Ser Pro Tyr Gln Ser Phe Ser Ala
    50                  55                  60
ttc gcc gga aac ccc tac ctc ata gac ctg agg ccc ctc gcg gaa agg       240
Phe Ala Gly Asn Pro Tyr Leu Ile Asp Leu Arg Pro Leu Ala Glu Arg
65                  70                  75                  80
ggc tac gtg cgc ctg gag gac ccc ggc ttc ccc caa ggc cgg gtg gac       288
Gly Tyr Val Arg Leu Glu Asp Pro Gly Phe Pro Gln Gly Arg Val Asp
                85                  90                  95
tac ggc ctc ctc tac gcc tgg aag tgg ccc gcc ctg aag gag gcc ttc       336
Tyr Gly Leu Leu Tyr Ala Trp Lys Trp Pro Ala Leu Lys Glu Ala Phe
            100                 105                 110
cgg ggc ttc aag gaa aag gcc tcc ccg gag gag cgg gag gcc ttc gcc       384
Arg Gly Phe Lys Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Arg Glu Ala Phe Ala
        115                 120                 125
gcc ttc cgg gag agg gag gcc tgg tgg ctc gag gac tac gcc ctc ttc       432
Ala Phe Arg Glu Arg Glu Ala Trp Trp Leu Glu Asp Tyr Ala Leu Phe
    130                 135                 140
atg gcc ctg aag ggg gcg cac ggg ggg ctt ccc tgg aac cgg tgg ccc       480
Met Ala Leu Lys Gly Ala His Gly Gly Leu Pro Trp Asn Arg Trp Pro
145                 150                 155                 160
ctt ccc ctg cgg aag cgg gaa gag aag gcc ctt agg gag gcg aaa agc       528
Leu Pro Leu Arg Lys Arg Glu Glu Lys Ala Leu Arg Glu Ala Lys Ser
                165                 170                 175
gcc ttg gcc gag gag gtg gcc ttc cac gcc ttc acc cag tgg ctc ttc       576
Ala Leu Ala Glu Glu Val Ala Phe His Ala Phe Thr Gln Trp Leu Phe
            180                 185                 190
ttc cgc cag tgg ggg gcc ttg aag gcg gag gcc gag gcg ttg ggc atc       624
Phe Arg Gln Trp Gly Ala Leu Lys Ala Glu Ala Glu Ala Leu Gly Ile
        195                 200                 205
cgg atc atc ggg gac atg ccc atc ttc gtg gcc gag gac tcc gcc gag       672
Arg Ile Ile Gly Asp Met Pro Ile Phe ValAla Glu Asp Ser Ala Glu
    210                 215                 220
gtc tgg gcc cac ccc gag tgg ttt cac ctg gac gag gag ggc cgc ccc       720
Val Trp Ala His Pro Glu Trp Phe His Leu Asp Glu Glu Gly Arg Pro
225                 230                 235                 240
acg gtg gtg gcg ggg gtg ccc ccc gac tacttc tcg gag acg ggc cag        768
Thr Val Val Ala Gly Val Pro Pro Asp Tyr Phe Ser Glu Thr Gly Gln
                245                 250                 255
cgc tgg ggt aac ccc ctt tac cgc tgg gac gtt ttg gag cgg gag ggg       816
Arg Trp Gly Asn Pro Leu Tyr Arg Trp Asp Val Leu Glu Arg Glu Gly
            260                 265                 270
ttc tcc ttc tgg atc cgc cgt ctg gag aag gcc ctg gag ctc ttc cac       864
Phe Ser Phe Trp Ile Arg Arg Leu Glu Lys Ala Leu Glu Leu Phe His
        275                 280                 285
ctg gtg cgc ata gac cac ttc cgc ggc ttt gag gcc tac tgg gag atc       912
Leu Val Arg Ile Asp His Phe Arg Gly Phe Glu Ala Tyr Trp Glu Ile
    290                 295                 300
ccc gca agc tgc ccc acg gcg gtg gag ggg cgc tgg gtc aag gcc ccg       960
Pro Ala Ser Cys Pro Thr Ala Val Glu Gly Arg Trp ValLys Ala Pro
305                 310                 315                 320
ggg gag aag ctc ttc cag aag atc cag gag gtc ttc ggc gag gtc ccc      1008
Gly Glu Lys Leu Phe Gln Lys Ile Gln Glu Val Phe Gly Glu Val Pro
                325                 330                 335
gtc ctc gcc gag gac ctg ggg gtc atc acc ccc gag gtg gag gcc ctg      1056
Val Leu Ala Glu Asp Leu Gly Val Ile Thr Pro Glu Val Glu Ala Leu
            340                 345                 350
cgc gac cgc ttc ggc ctt ccc ggg atg aag gtc ctg cag ttc gcc ttt      1104
Arg Asp Arg Phe Gly Leu Pro Gly Met Lys Val Leu Gln Phe Ala Phe
        355                 360                 365
gac gac ggg atg gaa aac ccc ttc ctc ccc cac aac tac cct gcc cac      1152
Asp Asp Gly Met Glu Asn Pro Phe Leu Pro His Asn Tyr Pro Ala His
    370                 375                 380
ggc cgg gtg gtg gtc tac acc ggc acc cac gac aac gac acc acc ctg      1200
Gly Arg Val Val ValTyr Thr Gly Thr His Asp Asn Asp Thr Thr Leu
385                 390                 395                 400
ggc tgg tac cgc acg gcc acc ccc cac gag aag gcc ttc atg gcg cgg      1248
Gly Trp Tyr Arg Thr Ala Thr Pro His Glu Lys Ala Phe Met Ala Arg
                405                 410                 415
tac ctg gcg gac tgg ggg atc acc ttc cgg gaa gag gag gag gtg ccc      1296
Tyr Leu Ala Asp Trp Gly Ile Thr Phe Arg Glu Glu Glu Glu Val Pro
            420                 425                 430
tgg gcc ctg atg cac ctg ggg atg aag tcc gtg gcc cgg ctc gcc gtc      1344
Trp Ala Leu Met His Leu Gly Met Lys Ser Val Ala Arg Leu Ala Val
        435                 440                 445
tac ccg gtg cag gac gtc ctg gcc ctg ggc agc gag gcc cgg atg aac      1392
Tyr Pro Val Gln Asp Val Leu Ala Leu Gly Ser Glu Ala Arg Met Asn
    450                 455                 460
tac ccg gga agg ccc tcg ggg aac tgg gcc tgg cgg ctc ctc ccg ggg      1440
Tyr Pro Gly Arg Pro Ser Gly Asn Trp Ala Trp Arg Leu Leu Pro Gly
465                 470                 475                 480
gag ctt tcc ccg gag cac ggg gcg agg ctt agg gcc atg gcc gag gcc      1488
Glu Leu Ser Pro Glu His Gly Ala Arg Leu Arg Ala Met Ala Glu Ala
                485                 490                 495
acg gaa cgg ctc tag                                                  1503
Thr Glu Arg Leu
            500
<210>20
<211>500
<212>PRT
<213>水生栖热菌Taq MalQ
<400>20
Met Glu Leu Pro Arg Ala Phe Gly Leu Leu Leu His Pro Thr Ser Leu
1               5                   10                  15
Pro Gly Pro Tyr Gly Val Gly Val Leu Gly Arg Glu Ala Arg Asp Phe
            20                  25                  30
Leu Arg Phe Leu Lys Glu Ala Gly Gly Arg Tyr Trp Gln Val Leu Pro
        35                  40                  45
Leu Gly Pro Thr Gly Tyr Gly Asp Ser Pro Tyr Gln Ser Phe Ser Ala
    50                  55                  60
Phe Ala Gly Asn Pro Tyr Leu Ile Asp Leu Arg Pro Leu Ala Glu Arg
65                  70                  75                  80
Gly Tyr Val Arg Leu Glu Asp Pro Gly Phe Pro Gln Gly Arg Val Asp
                85                  90                  95
Tyr Gly Leu Leu Tyr Ala Trp Lys Trp Pro Ala Leu Lys Glu Ala Phe
            100                 105                 110
Arg Gly Phe Lys Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Arg Glu Ala Phe Ala
        115                 120                 125
Ala Phe Arg Glu Arg Glu Ala Trp Trp Leu Glu Asp Tyr Ala Leu Phe
    130                 135                 140
Met Ala Leu Lys Gly Ala His Gly Gly Leu Pro Trp Asn Arg Trp Pro
145                 150                 155                 160
Leu Pro Leu Arg Lys Arg Glu Glu Lys Ala Leu Arg Glu Ala Lys Ser
                165                 170                 175
Ala Leu Ala Glu Glu Val Ala Phe His Ala Phe Thr Gln Trp Leu Phe
            180                 185                 190
Phe Arg Gln Trp Gly Ala Leu Lys Ala Glu Ala Glu Ala Leu Gly Ile
        195                 200                 205
Arg Ile Ile Gly Asp Met Pro Ile Phe Val Ala Glu Asp Ser Ala Glu
    210                 215                 220
Val Trp Ala His Pro Glu Trp Phe His Leu Asp Glu Glu Gly Arg Pro
225                 230                 235                 240
Thr Val Val Ala Gly Val Pro Pro Asp Tyr Phe Ser Glu Thr Gly Gln
                245                 250                 255
Arg Trp Gly Asn Pro Leu Tyr Arg Trp Asp Val Leu Glu Arg Glu Gly
            260                 265                 270
Phe Ser Phe Trp Ile Arg Arg Leu Glu Lys Ala Leu Glu Leu Phe His
        275                 280                 285
Leu Val Arg Ile Asp His Phe Arg Gly Phe Glu Ala Tyr Trp Glu Ile
    290                 295                 300
Pro Ala Ser Cys Pro Thr Ala Val Glu Gly Arg Trp Val Lys Ala Pro
305                 310                 315                 320
Gly Glu Lys Leu Phe Gln Lys Ile Gln Glu Val Phe Gly Glu Val Pro
                325                 330                 335
Val Leu Ala Glu Asp Leu Gly Val Ile Thr Pro Glu Val Glu Ala Leu
            340                 345                 350
Arg Asp Arg Phe Gly Leu Pro Gly Met Lys Val Leu Gln Phe Ala Phe
        355                 360                 365
Asp Asp Gly Met Glu Asn Pro Phe Leu Pro His Asn Tyr Pro Ala His
    370                 375                 380
Gly Arg Val Val Val Tyr Thr Gly Thr His Asp Asn Asp Thr Thr Leu
385                 390                 395                 400
Gly Trp Tyr Arg Thr Ala Thr Pro His Glu Lys Ala Phe Met Ala Arg
                405                 410                 415
Tyr Leu Ala Asp Trp Gly Ile Thr Phe Arg Glu Glu Glu Glu Val Pro
            420                 425                 430
Trp Ala Leu Met His Leu Gly Met Lys Ser Val Ala Arg Leu Ala Val
        435                 440                 445
Tyr Pro Val Gln Asp Val Leu Ala Leu Gly Ser Glu Ala Arg Met Asn
    450                 455                 460
Tyr Pro Gly Arg Pro Ser Gly Asn Trp Ala Trp Arg Leu Leu Pro Gly
465                 470                 475                 480
Glu Leu Ser Pro Glu His Gly Ala Arg Leu Arg Ala Met Ala Glu Ala
                485                 490                 495
Thr Glu Arg Leu
            500
<210>21
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ECBEN-NCO
<400>21
gaaccatggc cgatcgtatc gatagagacg    30
<210>22
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ECBEC-HIN
<400>22
cccaagcttc attctgcctc ccgaacc                 27
<210>23
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>引物ROBEN-ECO
<400>23
aatccaacct tcgaattcag ctggctcacg gaagaagaca    40
<210>24
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ROBEC-PST
<400>24
aatcaatcaa tcaactgcag acggttaccc gtgctccggc    40

Claims (19)

1.一种生产糖原的方法，其包括以下步骤：
使具有合成糖原能力的分支酶在溶液中作用于底物，由此生产糖原，其中所述底物是主要由α-1，4-葡萄糖苷键连接并且聚合度为4或更大的α-葡聚糖，而且开始反应前溶液中糖的数均分子量大于180但不超过150,000。
2.根据权利要求1的方法，其中(分支酶的分支酶活性)/(分支酶的分子量降低活性)是500或更低。
3.根据权利要求1的方法，其中所述分支酶是热稳定分支酶。
4.根据权利要求1的方法，其中所述分支酶来源于嗜热菌或中温性菌。
5.根据权利要求1的方法，其中所述分支酶来源于属于选自产液菌属(Aquifex)、红嗜热盐菌属(Rhodothermus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、嗜热聚球蓝细菌属(Thermosynechococcus)和埃希氏菌属(Escherichia)之中属的细菌。
6.根据权利要求1的方法，其中所述分支酶来源于选自风产液菌、嗜火产液菌(Aquifex pyrophilus)、Rhodothermus obamensis、海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、热速芽孢杆菌(Bacillus caldovelox)、热链形芽孢杆菌(Bacillus thermocatenulatus)、热溶芽孢杆菌(Bacilluscaldolyticus)、黄热芽孢杆菌(Bacillus flavothermus)、酸热芽孢杆菌(Bacillus acidocaldarius)、热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)、史氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)、Thermosynechococcus elongatus和大肠埃希氏菌(Escherichia coli)的细菌。
7.根据权利要求1的方法，其中所述分支酶来源于选自风产液菌、Rhodothermus obamensis、嗜热脂肪芽孢杆菌、热速芽孢杆菌、热链形芽孢杆菌、热溶芽孢杆菌和大肠埃希氏菌的细菌。
8.根据权利要求1的方法，其中所述分支酶的最佳反应温度不低于45℃并且不超过90℃。
9.根据权利要求1的方法，其中开始反应前溶液中的所述糖是脱支淀粉、脱支糊精或酶促合成的直链淀粉。
10.根据权利要求1的方法，其中开始反应前溶液中所述糖的数均分子量大于180并且小于4,000。
11.根据权利要求1的方法，其中开始反应前溶液中所述糖的数均分子量为4,000或更大，但小于8,000，并且调节所述分支酶用量和反应时间，使得分支酶用量和反应时间的乘积为25,000U·小时/g底物或更高。
12.根据权利要求1的方法，其中开始反应前溶液中所述糖的数均分子量为8,000或更大，但小于100,000，并且调节所述分支酶用量和反应时间，使得分支酶用量和反应时间的乘积为40,000U·小时/g底物或更高。
13.根据权利要求1的方法，其中开始反应前溶液中所述糖的数均分子量为100,000或更大，并且是150,000或更小，调节所述分支酶用量和反应时间，使得分支酶用量和反应时间的乘积为150,000U·小时/g底物或更高。
14.根据权利要求1的方法，其进一步包括使4-α-葡聚糖基转移酶作用于数均分子量大于180并小于1,500的α-葡聚糖以产生所述底物的步骤。
15.根据权利要求14的方法，其中所述4-α-葡聚糖基转移酶是来源于水生栖热菌(Thermus aquaticus)的淀粉麦芽糖酶。
16.根据权利要求1的方法，其中所述数均分子量大于180并小于1,500的α-葡聚糖包含聚合度为4-7的麦芽寡糖。
17.根据权利要求1的方法，其进一步包括使脱支酶作用于数均分子量为500或更大的低分支α-葡聚糖以产生所述底物的步骤。
18.根据权利要求1的方法，其中所述4-α-葡聚糖基转移酶与所述分支酶共存。
19.根据权利要求18的方法，其中所述4-α-葡聚糖基转移酶是来源于水生栖热菌的淀粉麦芽糖酶。
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