CN103857793A - 从简单碳源合成ω-官能化的羧酸和羧酸酯的生物技术方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的主题是用于从简单碳源生产官能化的羧酸和官能化的羧酸酯的生物技术方法。

Description

从简单碳源合成ω-官能化的羧酸和羧酸酯的生物技术方法
发明领域
本发明的主题是从简单碳源生产ω-官能化的羧酸和ω-官能化的羧酸酯的生物技术方法。
现有技术
ω-官能化的羧酸和对应的酯的生物技术生产目前仅仅以生物转化的形式进行描述，其中将对应的羧酸作为底物与适当的生物细胞接触，其酶促催化必要的反应。
适合于生产ω-氨基羧酸及其酯的此类方法和细胞例如描述于WO2009077461中。
EP2322598还描述了在特定装备的热带假丝酵母（Candida tropicalis）细胞中从用作底物的脂肪酸生产ω-羟基羧酸及其酯。非常相似的程序描述于WO2011008232中，其中阻断了β-氧化的假丝酵母细胞通过酶促氧化从脂肪酸开始形成了对应的ω-官能化的羧酸和二酸。
需要作为底物的脂肪酸及其衍生物如今专门获自植物和动物的油或脂肪。这具有非常多的缺点：
具体而言，作为BSE危机的后果，动物脂肪作为原材料仍面临极低的客户接受度。含有短链和中长链脂肪酸的植物油难于获得，或者产自热带地区。由于在一些情况下清除了雨林以提供耕地面积，因此生产的可持续性在许多情况下产生问题。
此外，植物和动物油或脂肪对于各种原材料具有特定但确定的脂肪酸范围。因此，本文进行配对生产，其能够对某一脂肪酸种类是价格确定的。最后，但同样重要的是，许多植物油同时也是食品，从而在某些情形下，在用作材料和用作食品之间可能产生了竞争。
本发明的目的是提供用于不依赖于脂肪酸作为反应物生产ω-官能化羧酸和ω-官能化羧酸酯的生物技术方法。
发明内容
令人惊奇的是，已经发现下文描述的含有遗传修饰的细胞能够解决针对本发明的问题。
因此，本发明的主题是这样的微生物，其合成提高量的羧酸或羧酸酯，并且根据进一步的遗传特征提供具有ω-官能度的这些物质。
本发明的进一步的主题是上述微生物用于生产ω-官能化的羧酸和ω-官能化的羧酸酯的用途以及使用所述微生物生产ω-官能化的羧酸和ω-官能化的羧酸酯的方法。
本发明的优点是生产方法中的产物抑制能够显著降低。
本发明的进一步优点是所述方法能够从不相关碳源在培养上清液中生产具有高时空产量、高碳产量和高浓度的ω-官能化的羧酸和ω-官能化的羧酸酯。尤其是作为后者的结果，促进了有效的后处理。
本发明包括用于生成重组微生物细胞的方法，所述微生物细胞能够从不相关碳源生产ω-官能化的羧酸和ω-官能化的羧酸酯。
因此，本发明包括微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它的野生型，它能够从至少一种简单碳源形成更多的羧酸或羧酸酯，其特征在于所述微生物具有第二种遗传修饰，该遗传修饰包括所述微生物具有至少一种酶E1的相比于它的野生型提高的活性，其催化羧酸或羧酸酯转化为对应的ω-羟基羧酸或ω-羟基羧酸酯。
在本发明的范围，将术语“第一种遗传修饰”理解为表示微生物的至少一种遗传修饰，其中相比于野生型菌株，一种或多种基因的表达被修饰，即提高或降低。
在本发明的范围，将术语“简单碳源”理解为表示这样的碳源，其中在碳骨架上，至少一个C-C键已经被破坏和/或所述简单碳源的至少一个碳原子必须与另一分子的至少一个碳原子形成至少一个新的键，以获得“更多种形成的羧酸或羧酸酯”的碳骨架。
除非另有说明，所有说明的百分比（％）均为质量百分比。
可以将碳水化合物例如葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、纤维素和半纤维素，但还有甘油或最简单的有机分子诸如CO2、CO或合成气体用作碳源。
本发明优选的羧酸或羧酸酯是在羧酸链中具有多于一个，尤其是3-36个、优选6-24个、尤其是10-14个碳原子的那些。这可以是直链的、支链的、饱和的或不饱和的，并且任选被其他基团所取代。
羧酸酯优选是其中醇组分来源于甲醇、乙醇或其他具有3-18个碳原子的伯醇，尤其是甲醇和乙醇。
尤其优选的是，羧酸是选自以下的组的脂肪酸：甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、十九烷酸、花生酸、山萮酸、二十四烷酸、蜡酸、褐煤酸、蜂花酸、十一碳烯酸、肉豆蔻脑酸、岩芹酸、油酸、反油酸、异油酸、顺二十碳-9-烯酸、二十碳烯酸、鲸蜡烯酸、芥酸、神经酸、亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、金盖花素酸、石榴酸、α-桐酸、β-桐酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、斑鸠菊酸、蓖麻油酸
及其酯，其中所述脂肪酸酯优选是其中醇组分来源于甲醇、乙醇或其他具有3-18个碳原子的伯醇，尤其是甲醇和乙醇。
本发明优选的是，基于优良的遗传可达性，使用选自细菌的微生物，尤其选自包含以下，优选由其组成：乏养菌属（Abiotrophia）、Acaryochloris、Accumulibacter、醋弧菌属（Acetivibrio）、醋酸杆菌属（Acetobacter）、醋盐杆菌属（Acetohalobium）、醋丝菌属（Acetonema）、无色杆菌属（Achromobacter）、氨基酸球菌属（Acidaminococcus）、酸微菌属（Acidimicrobium）、嗜酸菌属（Acidiphilium）、酸硫杆状菌属（Acidithiobacillus）、酸杆菌属（Acidobacterium）、热酸菌属（Acidothermus）、食酸菌属（Acidovorax）、不动杆菌属（Acinetobacter）、放线杆菌属（Actinobacillus）、放线菌属（Actinomyces）、束丝放线菌属（Actinosynnema）、气球菌属（Aerococcus）、气微菌属（Aeromicrobium）、气单胞菌属（Aeromonas）、阿菲波菌属（Afipia）、凝聚杆菌属（Aggregatibacter ）、土壤杆菌属（Agrobacterium）、Ahrensia、Akkermansia、食碱菌属（Alcanivorax）、脂环酸芽胞杆菌属（Alicycliphilus ）、脂环酸杆菌属（Alicyclobacillus）、Aliivibrio、碱湖生菌属（Alkalilimnicola）、Alkaliphilus、异着色菌属（Allochromatium ）、交替单胞菌目（Alteromonadales）、交替单胞菌属（Alteromonas）、Aminobacterium、氨基酸单胞菌属（Aminomonas ）、制氨菌属（Ammonifex）、拟无枝酸菌属（Amycolatopsis）、Amycolicicoccus、鱼腥藻属（Anabaena ）、厌氧小杆菌属（Anaerobaculum）、厌氧球菌属（Anaerococcus ）、Anaerofustis、厌氧绳菌属（Anaerolinea ）、厌氧粘细菌属（Anaeromyxobacter ）、Anaerostipes、Anaerotruncus、无形体属（Anaplasma）、厌氧芽孢杆菌属（Anoxybacillus ）、产液菌属（Aquifex）、隐稳杆菌属（Arcanobacterium）、弓形杆菌属（Arcobacter）、Aromatoleum、节杆菌属（Arthrobacter）、Arthrospira、不粘柄菌属（Asticcacaulis）、陌生物菌属（Atopobium）、橙单胞菌属（Aurantimonas）、固氮弓菌属（Azoarcus）、固氮根瘤菌属（Azorhizobium）、固氮螺菌属（Azospirillum）、固氮菌属（Azotobacter）、杆菌属（Bacillus）、巴通体属（Bartonella）、Basfia、Baumannia、蛭弧菌属（Bdellovibrio）、贝扎托菌属（Beggiatoa）、拜叶林克氏菌属（Beijerinckia）、Bermanella、获山氏菌属（Beutenbergia ）、双岐杆菌属（Bifidobacterium）、嗜胆菌属（Bilophila）、Blastopirellula、Blautia、Blochmannia、博德氏菌属（Bordetella）、疏螺旋体属（Borrelia）、短状杆菌属（Brachybacterium）、短螺旋体属（Brachyspira）、短根瘤菌属（Bradyrhizobium）、短小芽孢杆菌属（Brevibacillus）、短杆菌属（Brevibacterium）、短波单胞菌属（Brevundimonas）、布鲁菌属（Brucella）、布赫纳氏菌属（Buchnera）、Bulleidia、伯克氏菌属（Burkholderia）、丁酸弧菌属（Butyrivibrio）、Caldalkalibacillus、Caldanaerobacter、热解纤维素菌属（Caldicellulosiruptor）、Calditerrivibrio、Caminibacter、弯曲菌属（Campylobacter）、Carboxydibrachium、一氧化碳嗜热菌属（Carboxydothermus）、心杆菌属（Cardiobacterium）、肉杆菌属（Carnobacterium）、Carsonella、Catenibacterium、Catenulispora、卡托氏菌属（Catonella）、柄杆菌属（Caulobacter）、纤维单胞菌属（Cellulomonas）、纤维弧菌属（Cellvibrio）、蜈蚣菌属（Centipeda）、根瘤菌属(Chelativorans)、绿屈挠菌属（Chloroflexus）、色杆菌属（Chromobacterium）、色盐杆菌属（Chromohalobacter）、Chthoniobacter、Citreicella、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）、柠檬酸微菌属（Citromicrobium）、棍状杆菌属（Clavibacter）、Cloacamonas、梭状芽孢杆菌属（Clostridium）、柯林斯氏菌属（Collinsella ）、科尔韦氏菌属（Colwellia）、丛毛单胞菌属（Comamonas）、Conexibacter、聚集杆菌属（Congregibacter）、Coprobacillus、粪球菌属（Coprococcus）、粪热杆菌属（Coprothermobacter）、Coraliomargarita、科里氏杆菌属（Coriobacterium）、corrodens、棒状杆菌属（Corynebacterium）、柯克斯体属（Coxiella）、鳄球藻属（Crocosphaera）、阪崎肠杆菌属（Cronobacter）、短小杆菌属（Cryptobacterium）、贪铜菌属（Cupriavidus）、蓝菌属（Cyanobium）、蓝丝菌属（Cyanothece）、拟筒孢蓝细菌属（Cylindrospermopsis）、Dechloromonas、铁还原杆菌属（Deferribacter）、Dehalococcoides、Dehalogenimonas、异常球菌属（Deinococcus）、代尔夫特菌属（Delftia）、氮还原弧菌属（Denitrovibrio）、皮生球菌属（Dermacoccus）、Desmospora、脱硫盒菌属（Desulfarculus）、Desulphateibacillum、脱亚硫酸菌属（Desulfitobacterium）、脱硫橄榄状菌属（Desulfobacca）、脱硫杆菌属（Desulfobacterium）、脱硫叶菌属（Desulfobulbus）、脱硫球菌属（Desulfococcus）、脱硫盐菌属（Desulfohalobium）、脱硫微菌属（Desulfomicrobium）、Desulfonatronospira、Desulforudis、脱硫小杆菌属（Desulfotalea）、脱硫肠状菌属（Desulfotomaculum）、脱硫弧菌属（Desulfovibrio）、（Desulfurispirillum）、脱硫杆菌属（Desulfurobacterium）、除硫单胞菌属（Desulfuromonas）、Dethiobacter、脱硫代硫酸盐弧菌属（Dethiosulfovibrio）、戴阿利斯特杆菌属（Dialister）、偶蹄形菌属（Dichelobacter）、Dickeya、网球菌属（Dictyoglomus）、迪茨氏菌属（Dietzia）、Dinoroseobacter、Dorea、爱德华氏菌属（Edwardsiella）、埃里希氏体属（Ehrlichia）、艾肯氏菌属（Eikenella）、Elusimicrobium、Endoriftia、水栖菌属（Enhydrobacter）、肠杆菌属（Enterobacter）、肠球菌属（Enterococcus）、Epulopiscium、欧文氏杆菌属（Erwinia）、丹毒丝菌属（Erysipelothrix）、赤细菌属（Erythrobacter）、埃希氏杆菌属（Escherichia）、产氢新菌属（Ethanoligenens）、真杆菌属（Eubacterium）、真杆菌属（Eubacterium）、微小杆菌属（Exiguobacterium）、Faecalibacterium、铁还原单胞菌属（Ferrimonas）、闪烁杆菌属（Fervidobacterium）、丝状杆菌属（Fibrobacter）、Finegoldia、弯枝菌属（Flexistipes）、弗朗西斯氏菌属（Francisella）、弗兰克氏菌属（Frankia）、Fructobacillus、Fulvimarina、梭杆菌属（Fusobacterium）、Gallibacterium、报毛菌属（Gallionella）、加德纳氏菌属（Gardnerella）、孪生球菌属（Gemella）、出芽菌属（Gemmata）、芽单胞菌属（Gemmatimonas）、土壤芽孢杆菌属（Geobacillus）、土杆菌属（Geobacter）、地嗜皮菌属（Geodermatophilus）、冰居菌属（Glaciecola）、粘杆菌属（Gloeobacter）、舌蝇属（Glossina）、葡糖酸醋酸杆菌属（Gluconacetobacter）、戈登氏菌属（Gordonia）、Granulibacter、颗粒链菌属（Granulicatella）、格里蒙菌属（Grimontia）、嗜血菌属（Haemophilus）、河氏菌属（Hahella）、Halanaerobiumns、Haliangium、盐单胞菌属（Halomonas）、盐红螺旋菌属（Halorhodospira）、盐热发菌属（Halothermothrix）、盐硫杆状菌属（Halothiobacillus）、Hamiltonella、螺杆菌属（Helicobacter）、阳光杆菌属（Heliobacterium）、草螺菌属（Herbaspirillum）、Herminiimonas、滑柱菌属（Herpetosiphon）、希普氏菌属（Hippea）、海氏菌属（Hirschia）、嗜组织菌属（Histophilus）、Hodgkinia、Hoeflea、霍尔德曼氏菌属（Holdemania）、Hydrogenivirga、Hydrogenobaculum、Hylemonella、生丝微菌属（Hyphomicrobium）、生丝单胞菌属（Hyphomonas）、Idiomarina、泥杆菌属（Ilyobacter）、间孢囊菌属（Intrasporangium）、白蚁菌属（Isoptericola）、等球菌属（Isosphaera）、两面神菌属（Janibacter）、紫色杆菌属（Janthinobacterium）、琼斯氏菌属（Jonesia）、Jonquetella、Kangiella、Ketogulonicigenium、动球菌属（Kineococcus）、金氏菌属（Kingella）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、考克氏菌属（Kocuria）、Koribacter、Kosmotoga、扑科研菌属（Kribbella）、纤线杆菌属（Ktedonobacter）、皮球菌属（Kytococcus）、Labrenzia、乳杆菌属（Lactobacillus）、乳球菌属（Lactococcus）、鸥杆菌属（Laribacter）、劳特罗普氏菌属（Lautropia）、劳森氏菌属（Lawsonia）、军团菌属（Legionella）、雷弗松氏菌属（Leifsonia）、Lentisphaera、纤发鞘丝蓝细菌属（Leptolyngbya）、钩端螺旋体属（Leptospira）、纤发菌属（Leptothrix）、纤毛菌属（Leptotrichia）、明串珠菌属（Leuconostoc）、韧皮杆菌属（Liberibacter）、Limnobacter、李斯特氏菌属（Listeria）、Loktanella、Lutiella、鞘丝蓝细菌属（Lyngbya）、Lysinibacillus、巨大球菌属（Macrococcus）、磁球菌属（Magnetococcus）、磁螺菌属（Magnetospirillum）、Mahella、默罕氏菌属（Mannheimia）、海洋杆状菌属（Maricaulis）、海栖热菌属（Marinithermus）、海杆菌属（Marinobacter）、海单胞菌属（Marinomonas）、深海菌属（Mariprofundus）、Maritimibacter、Marvinbryantia、巨球形菌属（Megasphaera）、稍热菌属（Meiothermus）、蜜蜂球菌属（Melissococcus）、中间根瘤菌属（Mesorhizobium）、Methylacidiphilum、Methylibium、甲基小杆菌属（Methylobacillus）、甲基杆菌属（Methylobacter）、甲基杆菌属（Methylobacterium）、甲基球菌属（Methylococcus）、甲基孢囊菌属（Methylocystis）、甲基微菌属（Methylomicrobium）、噬甲基菌属（Methylophaga）、嗜甲基菌目（Methylophilales）、甲基曲菌属（Methylosinus）、Methyloversatilis、食甲基菌属（Methylovorus）、微杆菌属（Microbacterium）、微球菌属（Micrococcus）、微鞘蓝细菌属（Microcoleus）、微囊蓝细菌属（Microcystis）、小月菌属（Microlunatus）、小单孢菌属（Micromonospora）、光岗菌属（Mitsuokella）、动弯杆菌属（Mobiluncus）、穆尔氏菌属（Moorella）、莫拉氏菌属（Moraxella）、南极嗜冷菌属（Moritella）、分枝杆菌属（Mycobacterium）、粘球菌属（Myxococcus）、Nakamurella、盐碱厌氧菌属（Natranaerobius）、奈瑟氏球菌属（Neisseria）、新立克次氏体属（Neorickettsia）、Neptuniibacter、Nitratifractor、Nitratiruptor、硝化杆菌属（Nitrobacter）、硝化球菌属（Nitrococcus）、亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas）、亚硝化螺菌属（Nitrosospira）、硝化螺菌属（Nitrospira）、诺卡氏菌属（Nocardia）、类诺卡氏菌属（Nocardioides）、拟诺卡氏菌属（Nocardiopsis）、节球蓝细菌属（Nodularia）、念珠蓝细菌属（Nostoc）、新鞘脂菌属（Novosphingobium）、Oceanibulbus、Oceanicaulis、海洋生菌属（Oceanicola）、海洋栖热菌属（Oceanithermus）、海洋芽胞杆菌属（Oceanobacillus）、苍白杆菌属（Ochrobactrum）、十八杆菌属（Octadecabacter）、Odyssella、寡养菌属（Oligotropha）、Olsenella、丰佑菌属（Opitutus）、Oribacterium、东方体属（Orientia）、Ornithinibacillus、颤蓝细菌属（Oscillatoria）、绿颤细菌属（Oscillochloris）、草酸杆菌属（Oxalobacter）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、泛菌属（Pantoea）、副球菌属（Paracoccus）、Parascardovia、Parasutterella、Parvibaculum、微单胞菌属（Parvimonas）、短小盒菌属（Parvularcula）、巴斯德氏菌属（Pasteurella）、巴斯德氏芽菌属（Pasteuria）、果胶杆菌属（Pectobacterium）、片球菌属（Pediococcus）、Pedosphaera、Pelagibaca、远洋杆菌属（Pelagibacter）、暗杆菌属（Pelobacter）、Pelotomaculum、Peptoniphilus、消化链球菌属（Peptostreptococcus）、Persephonella、石袍菌属（Petrotoga）、褐杆菌属（Phaeobacter）、考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）、苯基杆菌属（Phenylobacterium）、发光杆菌属（Photobacterium）、小小梨形菌属（Pirellula）、浮霉状菌属（Planctomyces）、动性球菌属（Planococcus）、Plesiocystis、极胞菌属（Polaromonas）、极胞菌属（Polaromonas）、Polymorphum、多核杆菌属（Polynucleobacter）、海绵杆菌门（Poribacteria）、原绿球菌属（Prochlorococcus）、丙酸杆菌属（Propionibacterium）、变形菌属（Proteus）、普罗威登斯菌属（Providencia）、假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas）、Pseudoflavonifractor、假单胞菌属（Pseudomonas）、假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）、假枝杆菌属（Pseudoramibacter）、Pseudovibrio、假黄色单胞菌属（Pseudoxanthomonas）、嗜冷杆菌属（Psychrobacter）、冷单胞菌属（Psychromonas）、Puniceispirillum、Pusillimonas、维形杆菌属（Pyramidobacter）、拉恩氏菌属（Rahnella）、罗尔斯通氏菌属（Ralstonia）、尖头藻属（Raphidiopsis）、Regiella、Reinekea、肾杆菌属（Renibacterium）、根瘤菌属（Rhizobium）、红细菌属（Rhodobacter）、红球菌属（Rhodococcus）、红育菌属（Rhodoferax）、红微菌属（Rhodomicrobium）、红小梨形菌属（Rhodopirellula）、红假单胞菌属（Rhodopseudomonas）、红螺菌属（Rhodospirillum）、立克次氏体属（Rickettsia）、立克次氏小体属（Rickettsiella）、Riesia、罗斯伯里氏菌属（Roseburia）、玫瑰菌属（Roseibium）、玫瑰弯菌属（Roseiflexus）、玫瑰杆菌属（Roseobacter）、玫瑰单胞菌属（Roseomonas）、玫瑰变色菌属（Roseovarius）、罗斯氏菌属（Rothia）、红长命菌属（Rubrivivax）、红色杆菌属（Rubrobacter）、鲁杰氏菌属（Ruegeria）、瘤胃球菌属（Ruminococcus）、Ruthia、糖单孢菌属（Saccharomonospora）、Saccharophagus、糖多孢菌属（Saccharopolyspora）、箭头菌属（Sagittula）、Salinispora、沙门氏菌属（Salmonella）、血杆菌属（Sanguibacte）、Scardovia、塞巴鲁德菌属（Sebaldella）、Segniliparus、月形单胞菌属（Selenomonas）、沙雷氏菌属（Serratia）、希瓦氏菌属（Shewanella）、志贺氏菌属（Shigella）、Shuttleworthia、Sideroxydans、Silicibacter、西蒙斯氏菌属（Simonsiella）、中华根瘤菌属（Sinorhizobium）、史雷克氏菌属（Slackia）、伴蝇菌属（Sodalis）、Solibacter、Solobacterium、堆囊菌属（Sorangium）、球杆菌属（Sphaerobacter）、鞘脂菌属（Sphingobium）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、Sphingopyxis、螺旋体属（Spirochaeta）、芽孢八叠球菌属（Sporosarcina）、Stackebrandtia、葡萄球菌属（Staphylococcus）、Starkeya、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）、标桩菌属（Stigmatella）、链杆菌属（Streptobacillus）、链球菌属（Streptococcus）、链霉菌属（Streptomyces）、链孢囊菌属（Streptosporangium）、Subdoligranulum、subvibrioides、Succinatimonas、亚硫酸盐杆菌属（Sulfitobacter）、硫化杆菌属（Sulfobacillus）、Sulfuricurvum、Sulfurihydrogenibium、Sulfurimonas、硫化螺旋菌属（Sulfurospirillum）、Sulfurovum、萨特氏菌属（Sutterella）、Symbiobacterium、集胞蓝细菌属（Synechocystis）、互营杆菌属（Syntrophobacter）、共养香肠样杆菌属（Syntrophobotulus）、共养单胞菌属（Syntrophomonas）、互营热菌属（Syntrophothermus）、互养菌属（Syntrophus）、taiwanensis、泰勒氏菌属（Taylorella）、Teredinibacter、Terriglobus、Thalassiobium、索氏菌属（Thauera）、嗜热好氧杆菌属（Thermaerobacter）、热厌氧弧菌属（Thermanaerovibrio）、Thermincola、热厌氧杆菌属（Thermoanaerobacter）、热厌氧杆菌属（Thermoanaerobacterium）、Thermobaculum、喜热裂孢菌属（Thermobifida）、嗜热双孢菌属（Thermobispora）、热发状菌属（Thermocrinis）、Thermodesulphateator、热脱硫杆菌属（Thermodesulfobacterium）、热脱硫菌属（Thermodesulfobium）、热脱硫弧菌属（Thermodesulfovibrio）、热微菌属（Thermomicrobium）、高温单孢菌属（Thermomonospora）、Thermosediminibacter、Thermosinus、栖热腔菌属（Thermosipho）、Thermosynechococcus、栖热孢菌属（Thermotoga）、热弧菌属（Thermovibrio）、栖热菌属（Thermus）、Thioalkalimicrobium、Thioalkalivibrio、硫杆菌属（Thiobacillus）、硫微螺菌属（Thiomicrospira）、硫单胞菌属（Thiomonas）、甲苯单胞菌属（Tolumonas）、密螺旋体属（Treponema）、tribocorum、束毛蓝细菌属（Trichodesmium）、Tropheryma、特吕珀菌属（Truepera）、冢村氏菌属（Tsukamurella）、Turicibacter、贪噬菌属（Variovorax）、韦荣氏菌属（Veillonella）、Verminephrobacter、疣微菌属（Verrucomicrobium）、疣孢菌属（Verrucosispora）、Vesicomyosocius、弧菌属（Vibrio）、弧菌目（Vibrionales）、食物谷菌属（Victivallis）、魏斯氏菌属（Weissella）、威格尔斯沃思氏菌属（Wigglesworthia）、沃尔巴克氏体属（Wolbachia）、沃林氏菌属（Wolinella）、黄色杆菌属（Xanthobacter）、黄单胞菌属（Xanthomonas）、致病杆菌属（Xenorhabdus）、Xylanimonas、木杆菌属（Xylella）、耶尔森氏菌属（Yersinia）、Zinderia和发酵单孢菌属（Zymomonas），
尤其是大肠杆菌（E. coli）、假单胞菌种（Pseudomonas sp.）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）、施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）、不动杆菌属种（Acinetobacter sp.）、伯克氏菌属种（Burkholderia sp.）、Burkholderia thailandensis、Cyanobakterien、克雷伯氏菌属种（Klebsiella sp.）、产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）、沙门氏菌属种（Salmonella sp.）、根瘤菌属种（Rhizobium sp.）和苜蓿根瘤菌（Rhizobium meliloti）、芽孢杆菌种（Bacillus sp.）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、梭状芽胞杆菌种（Clostridium sp.）、棒状杆菌种（Corynebacterium sp.）、谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）、短杆菌种（Brevibacterium sp.）、小球藻种（Chlorella sp.）和念珠藻种（Nostoc sp.），
其中尤其优选大肠杆菌。
本发明的微生物具有至少一种酶E1的与其野生型相比提高的活性。
如在上文中及在本发明下文的实施方式中所用的，将术语“酶的提高的活性”优选理解为提高的胞内活性。
以下关于细胞中酶活性的提高的实施方式适用于酶E1的活性的提高和下文提及的可任选提高其活性的所有酶，以及还适用于alkL基因产物的提高的形成。
基本上，酶活性的提高可以通过以下方法实现：提高编码酶的一条基因序列或多条基因序列的拷贝数，使用强启动子，改变基因的密码子利用，以多种方式提高mRNA或酶的半衰期，修饰基因表达的调节或利用编码具有提高的活性的对应酶的基因或等位基因，并且任选组合这些措施。根据本发明遗传修饰的微生物例如用载体通过转化、转导、接合或这些方法的组合来产生，所述载体含有所需基因、该基因的等位基因或其部分，并含有能够表达该基因的启动子。异源表达具体通过将基因或等位基因整合入细胞的染色体或染色体外复制的载体中来实现。
用丙酮酸羧化酶作为实例的提高细胞中酶活性的可能性的概述在DE-A-100 31 999中给出，其作为参考并入本文，并且其公开内容形成了关于提高细胞中酶活性的可能性的本发明公开内容的一部分。
上文提及的和下文提及的酶和基因的表达可以通过单向和双向蛋白凝胶分离和随后用适合的评价软件光学鉴定凝胶中的蛋白浓度来确定。
如果酶活性提高专有地基于对应基因表达的提高，则酶活性提高的定量可以简单地通过比较野生型和遗传修饰细胞之间的单向或双向蛋白分离来确定。用于制备用于细菌并用于鉴定蛋白的蛋白凝胶的常规方法是由Hermann等人所述的程序(Electrophoresis, 22:1712-23 (2001)。蛋白浓度还可以这样分析：通过用对待测定的蛋白特异性的抗体的蛋白质印记杂交(Sambrook等人, Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989)，随后用用于测定浓度的适当的软件的光学评价(Lohaus和Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32-39; Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 111: 2630-2647)。
当由待测定的酶活性催化的反应的可能产物可以在微生物中快速代谢时，或者另外当野生型自身中活性对其太低以致于不能根据产物形成来充分确定待测定的酶活性时，该方法也常常是种选择。
关于酶E1，将月桂酸和/或月桂酸甲酯向ω-羟基月桂酸和/或ω-羟基月桂酸甲酯的转化尤其理解为酶活性的计量。
具体的酶E1
如果在微生物中，则根据本发明优选酶E1选自组：
E1a P450烷羟化酶，其优选催化以下反应：还原的血红素 + 烷酸 (酯) = 氧化的血红素 + ω-羟基-烷酸 (酯) + H2O，
2 还原的血红素 + 烷酸 (酯) = 2 氧化的血红素 + ω-氧代烷酸 (酯) + 2 H2O 或
3 还原的血红素 + 烷酸 (酯) = 烷单加氧酶 + 3 氧化的血红素 +
ω-羧基烷酸 (酯) + 3 H2O，并且优选为
由两种酶组分“细胞色素P450烷羟化酶和EC 1.6.2.4的NADPH细胞色素P450氧化还原酶”组成的反应系统的成分或
由三种酶组分“CYP153型的细胞色素P450烷羟化酶、EC 1.18.1.2或EC 1.18.1.3的铁氧还蛋白NAD(P)+还原酶和铁氧还蛋白”组成的反应系统的成分，和
E1b EC 1.14.15.3的AlkB烷羟化酶，其优选催化以下反应：还原的红素氧还蛋白 + 烷酸 (酯) = 氧化的红素氧还蛋白 + ω-羟基烷酸 (酯) + H2O，
2 还原的红素氧还蛋白 + 烷酸 (酯) = 2 氧化的红素氧还蛋白 + ω-氧代烷酸 (酯) + 2 H2O 或
3 还原的红素氧还蛋白 + 烷酸 (酯) = 烷单加氧酶 + 3 氧化的红素氧还蛋白 + ω-羧基烷酸 (酯) + 3 H2O 和优选为
由三种酶组分“EC 1.14.15.3的AlkB烷羟化酶、EC 1.18.1.1或EC 1.18.1.4的AlkT红素氧还蛋白NAD(P)+还原酶和红素氧还蛋白AlkG”组成的反应系统的成分。
与本发明相关的检索号对应于日期为2011年07月26日的NCBI的ProteinBank数据库条目；通常，条目的版本号在本文中通过“.编号”识别，例如“.1”。
在该相关中优选的P450烷羟化酶选自列表：
Figure 661007DEST_PATH_IMAGE001
Figure 640464DEST_PATH_IMAGE002
Figure 420202DEST_PATH_IMAGE003
Figure 877728DEST_PATH_IMAGE004
Figure 692100DEST_PATH_IMAGE005
Figure 576879DEST_PATH_IMAGE006
Figure 105130DEST_PATH_IMAGE008
尤其是
Figure 774008DEST_PATH_IMAGE009
Figure 829689DEST_PATH_IMAGE010
Figure 584019DEST_PATH_IMAGE011
并且尤其优选
Figure 906732DEST_PATH_IMAGE013
Figure 398894DEST_PATH_IMAGE014
和
具有这样的多肽序列的蛋白，其中与上文提及的参考序列相比，多达60％、优选多达25％、尤其优选多达15％、尤其多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％的氨基酸残基通过缺失、插入、取代或其组合而修饰，并且其仍具有至少50％、优选65％、尤其优选80％、尤其多于90％的具有相应的上文提及的参考序列的蛋白的活性，其中将参考蛋白的100％活性理解为表示用作生物催化剂的细胞活性的提高，即基于所用的细胞量（单位/克细胞干重[U/g CDW]），相比于不存在参考蛋白的生物催化剂的活性，每单位时间所转化的物质的量，其中通常将在该相关中的活性和与酶E1a的活性测定的相关中的活性理解为具体表示转化月桂酸和/或月桂酸甲酯为ω-羟基月桂酸和/或ω-羟基月桂酸甲酯。
给定多肽序列的氨基酸残基的修饰（其并不引起给定多肽的特性和功能的任何明显改变）对于技术人员是已知的。因此，例如，某些氨基酸可以经常彼此交换而不引起问题；此类合适的氨基酸取代的实例为：Ser对Ala; Lys对Arg; Gln或His对Asn; Glu对Asp; Ser对Cys; Asn对Gln; Asp对Glu; Pro对Gly; Asn或Gln对His; Leu或Val对Ile; Met或Val对Leu; Arg或Gln或Glu对Lys; Leu或Ile对Met; Met或Leu或Tyr对Phe; Thr对Ser; Ser对Thr; Tyr对Trp; Trp或Phe对Tyr; Ile或Leu对Val。还已知修饰，尤其是在多肽的N-或C-末端处以例如氨基酸插入或缺失形式的修饰通常不会对多肽的功能产生显著影响。
根据本发明优选的AlkB烷羟化酶选自列表：
Figure 640519DEST_PATH_IMAGE015
Figure 977960DEST_PATH_IMAGE016
Figure 621431DEST_PATH_IMAGE017
Figure 18914DEST_PATH_IMAGE018
Figure 220908DEST_PATH_IMAGE022
和
具有这样的多肽序列的蛋白，其中与上文提及的参考序列相比，多达60％、优选多达25％、尤其优选多达15％、尤其多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％的氨基酸残基通过缺失、插入、取代或其组合而修饰，并且其仍具有至少50％、优选65％、尤其优选80％、尤其多于90％的具有相应的上文提及的参考序列的蛋白的活性，其中将参考蛋白的100％活性理解为表示用作生物催化剂的细胞活性的提高，即基于所用的细胞量（单位/克细胞干重[U/g CDW]），相比于不存在参考蛋白的生物催化剂的活性，每单位时间所转化的物质的量，其中通常将在该相关中的活性和与酶E1b的活性测定的相关中的活性理解为具体表示转化月桂酸和/或月桂酸甲酯为ω-羟基月桂酸和/或ω-羟基月桂酸甲酯。
E1的辅助酶
根据本发明优选的是，如果E1a是真核生物P450烷羟化酶，则本发明的微生物还具有相比于它的野生型提高的EC 1.6.2.4的NADPH细胞色素P450氧化还原酶的活性。这具有这样的技术效果，即真核生物P450烷羟化酶的活性提高，并且产物产量提高。
EC 1.6.2.4 的NADPH细胞色素P450氧化还原酶催化以下反应：
氧化的细胞色素 P450 + NADPH+ = 还原的细胞色素 P450 + NADP+ + H+。
根据本发明优选的是，如果酶E1a是CYP153型的原核生物P450烷羟化酶，则本发明的微生物还具有相比于它的野生型提高的EC 1.18.1.2或EC 1.18.1.3的铁氧还蛋白NAD(P)+还原酶的活性。这具有这样的技术效果，即CYP153型的原核生物P450烷羟化酶的活性提高，并且产物产量提高。
EC 1.18.1.2或EC 1.18.1.3的铁氧还蛋白NAD(P)+还原酶催化以下反应：
氧化的铁氧还蛋白 + NAD(P)H + H+ = 还原的铁氧还蛋白 + NAD(P)+ ，并且优选由位于上述CYP153型原核生物P450烷羟化酶的或在本发明相关中所述的铁氧还蛋白的基因的直接邻近处的基因所编码。
术语“在直接邻近处”表示最多三个其他结构基因位于所讨论的基因之间。
铁氧还蛋白催化以下反应：
烷羟化酶 + 还原的铁氧还蛋白 + 烷酸 (酯) = 烷单加氧酶 + 氧化的铁氧还蛋白 + ω-羟基烷酸 (酯) + H2O,
烷羟化酶 + 2 还原的铁氧还蛋白 + 烷酸 (酯) = 烷羟化酶 + 2 氧化的铁氧还蛋白 + ω-氧代烷酸 (酯) + 2H2O 或
烷羟化酶 + 3 还原的铁氧还蛋白 + 烷酸 (酯) = 烷羟化酶 + 3 氧化的铁氧还蛋白 + ω-羧基烷酸 (酯) + 3H3O 并且
优选由位于上述CYP153型原核生物P450烷羟化酶的或上述EC 1.18.1.2或EC 1.18.1.3的铁氧还蛋白NAD(P)+还原酶的基因的直接邻近处的基因所编码。术语“在直接邻近处”表示最多三个其他结构基因位于所讨论的基因之间。
优选的微生物具有相比于它的野生型提高的铁氧还蛋白NAD(P)+还原酶AlkT和铁氧还蛋白的活性。
根据本发明优选的是，如果酶E1是EC 1.14.15.3的AlkB烷羟化酶，则本发明的微生物也具有相比于它的野生型提高的EC 1.18.1.1或EC 1.18.1.4的AlkT红素氧还蛋白NAD(P)+还原酶和/或红素氧还蛋白AlkG的活性。这具有这样的技术效果，即AlkB烷羟化酶的活性提高，并且产物产量提高。
EC 1.18.1.1或EC 1.18.1.4的AlkT红素氧还蛋白NAD(P)+还原酶催化以下反应：
氧化的红素氧还蛋白 + NAD(P)H + H+ = 还原的红素氧还蛋白 + NAD(P)+ ，并且优选由位于上述EC 1.14.15.3的AlkB烷羟化酶的或在本发明相关中所述的红素氧还蛋白AlkG的基因的直接邻近处的基因所编码。
术语“在直接邻近处”表示最多三个其他结构基因位于所讨论的基因之间。
红素氧还蛋白AlkG催化以下反应：
烷单加氧酶 + 还原的红素氧还蛋白 + 烷酸 (酯) = 烷单加氧酶 + 氧化的红素氧还蛋白 + ω-羟基烷酸 (酯) + H2O, 烷单加氧酶 + 2 还原的红素氧还蛋白 + 烷酸 (酯) = 烷单加氧酶 + 2 氧化的红素氧还蛋白 + ω-氧代烷酸 (酯) + 2 H2O 或
烷单加氧酶 + 3 还原的红素氧还蛋白 + 烷酸 (酯) = 烷单加氧酶 + 3 氧化的红素氧还蛋白 + ω-羧基烷酸 (酯) + 3 H2O 并且
优选由位于上述EC 1.14.15.3的AlkB烷羟化酶的或在上述EC 1.18.1.1或EC 1.18.1.4的AlkT红素氧还蛋白NAD(P)+还原酶的基因的直接邻近处的基因所编码。术语“在直接邻近处”表示最多三个其他结构基因位于所讨论的基因之间。
优选的微生物具有相比于它的野生型提高的AlkT红素氧还蛋白NAD(P)+还原酶和红素氧还蛋白AlkG的活性。
酶E2 ω-氨基化
根据本发明优选提供尤其能够从至少一种简单碳源产生ω-官能化的羧酸和ω-官能化的羧酸酯的微生物，其中ω-官能化对应于在ω位置上的氨基，尤其是伯氨基。由此，所述微生物能够有利地用于生产ω-氨基羧酸或ω-氨基羧酸酯的方法。
因此，根据本发明优选的微生物的特征在于第二种遗传修饰另外包括所述微生物具有相比于它的野生型提高的酶E2的活性，所述酶E2催化ω-氧代羧酸或ω-氧代羧酸酯转化为对应的ω-氨基羧酸或ω-氨基羧酸酯。
根据本发明，酶E2优选为EC 2.6.1.-的ω-转氨酶。
作为酶活性E2的计量，具体可以进行ω-氧代月桂酸和/或ω-氧代月桂酸甲酯向ω-氨基月桂酸和/或ω-氨基月桂酸甲酯的转化。
优选的酶E2选自组：
Figure 233863DEST_PATH_IMAGE023
Figure 116369DEST_PATH_IMAGE024
Figure 554607DEST_PATH_IMAGE025
和
具有这样的多肽序列的蛋白，其中与上文提及的参考序列相比，多达60％、优选多达25％、尤其优选多达15％、尤其多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％的氨基酸残基通过缺失、插入、取代或其组合而修饰，并且其仍具有至少50％、优选65％、尤其优选80％、尤其多于90％的具有相应的上文提及的参考序列的蛋白的活性，其中将参考蛋白的100％活性理解为表示用作生物催化剂的细胞活性的提高，即基于所用的细胞量（单位/克细胞干重[U/g CDW]），相比于不存在参考蛋白的生物催化剂的活性，每单位时间所转化的物质的量，其中通常将在该相关中的活性和与酶E2的活性测定的相关中的活性理解为具体表示转化ω-氧代月桂酸和/或ω-氧代月桂酸甲酯为ω-氨基月桂酸和/或ω-氨基月桂酸甲酯。
具有相比于它的野生型提高的酶E2的活性的本发明的微生物有利地具有相比于它的野生型降低的EC 1.2.1.3、EC 1.2.1.4或EC 1.2.1.5的醛脱氢酶的活性，所述酶催化以下反应：
ω-氧代烷酸 (酯) + NAD(P)+ = ω-羧基烷酸 (酯) + NAD(P)H + H+
此类醛脱氢酶尤其为下文中列出为具体的E5的那些，和下文中列出作为优选的E4的EC 1.1.3.20的脂肪醇氧化酶、EC 1.1.99.-的AlkJ醇脱氢酶和EC 1.1.1.1或EC 1.1.1.2的醇脱氢酶并且催化下文提及的两种反应的至少第二种的那些；此类酶还在下文中被描述为酶E4*。
这具有这样的技术效果，防止了待氨基化的ω-氧代羧酸或ω-氧代羧酸酯的消耗，并因此更多底物可用于ω-氨基-羧酸或ω-氨基羧酸酯的产物形成。
优选将措辞“相比于它的野生型降低的活性”理解为表示基于野生型活性，降低至少50％、尤其优选至少90％、更优选至少99.9％、还更优选至少99.99％并且最优选至少99.999％的活性。措辞“降低的活性”也包含无法检测的活性（“零活性”）。例如可以通过定向突变或通过本领域技术人员已知的用于降低具体的酶的活性的其他措施来完成具体的酶活性的降低。在微生物中降低酶活性的进一步的方法是本领域技术人员已知的。分子生物学技术尤其适合于此。本领域技术人员将会在WO91/006660和WO03/100013中找到特别对念珠菌属的蛋白表达的修饰和降低以及由此伴随的酶活性降低的说明，尤其是对于特殊基因的间断的说明。
根据本发明优选的微生物的特征在于酶活性的降低通过修饰包含编码上述酶的核酸序列的基因来实现，其中所述修饰选自包含以下、优选由其构成的组：外源DNA插入至基因中，缺失至少部分基因，基因序列中点突变，RNA干扰（siRNA），反义RNA或修饰（插入、缺失或点突变）基因侧翼的调节序列。在本申请中，外源DNA理解应为表示对于基因（而非生物）是“外源的”任何DNA序列。在本申请中，尤其优选通过插入选择标记基因将基因间断，外源DNA因此是选择标记基因，其中所述插入优选通过向基因座内同源重组来完成。在本申请中，如果选择标记基因延长有进一步的官能度，其依次能够随后从基因中移除，则这可能是有利的。这可以例如通过对于生物是外源的重组系统，例如Cre/loxP系统或FRT (翻转酶识别目标)系统，或通过生物内在的同源重组系统来实现。
按照上文所述的用尽可能相同的细胞数/浓度测定活性的方法来测定本发明的微生物相比于它的野生型的活性降低，其中所述细胞已经在相同条件例如培养基、充气和搅动下生长。
酶E3 辅因子再循环ω-氨基化
对于生产ω-氨基-官能化的羧酸或ω-氨基-官能化的羧酸酯，如果所述第二种遗传修饰包含酶E3提高的活性，则这可能是有利的，所述酶E3催化转化α-酮基羧酸为氨基酸。优选的酶E3是氨基酸脱氢酶，例如丝氨酸脱氢酶、天冬氨酸脱氢酶、苯丙氨酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶，尤其优选EC 1.4.1.1的丙氨酸脱氢酶。
此类优选的丙氨酸脱氢酶选自：
Figure 497155DEST_PATH_IMAGE026
Figure 935090DEST_PATH_IMAGE027
Figure 418024DEST_PATH_IMAGE028
Figure 890593DEST_PATH_IMAGE029
Figure 4043DEST_PATH_IMAGE030
Figure 991591DEST_PATH_IMAGE031
Figure 215899DEST_PATH_IMAGE032
Figure 277395DEST_PATH_IMAGE033
Figure 624063DEST_PATH_IMAGE034
和
具有这样的多肽序列的蛋白，其中与上文提及的参考序列相比，多达60％、优选多达25％、尤其优选多达15％、尤其多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％的氨基酸残基通过缺失、插入、取代或其组合而修饰，并且其仍具有至少50％、优选65％、尤其优选80％、尤其多于90％的具有相应的上文提及的参考序列的蛋白的活性，其中将参考蛋白的100％活性理解为表示用作生物催化剂的细胞活性的提高，即基于所用的细胞量（单位/克细胞干重[U/g CDW]），相比于不存在参考蛋白的生物催化剂的活性，每单位时间所转化的物质的量，其中通常将在该相关中的活性和与酶E3的活性测定的相关中的活性理解为具体表示转化丙酮酸为丙氨酸。
酶E4 ω-氧化
对于生产ω-氨基-官能化的羧酸或ω-氨基-官能化的羧酸酯，如果所述第二种遗传修饰包含酶E4提高的活性，则这可能是有利的，所述酶E4催化转化ω-羟基羧酸或ω-羟基羧酸酯为对应的ω-氧代羧酸或ω-氧代羧酸酯。如果需要制备ω-氧代羧酸、ω-氧代羧酸酯、ω-羧基羧酸或ω-羧基-羧酸酯，则这种提高的酶E4的活性可能也是有利的。
当本发明的微生物用于生产ω-氧代羧酸或ω-氧代羧酸酯或来源于ω-氧代羧酸或ω-氧代羧酸酯的ω-官能化化合物例如ω-氨基化合物的方法时，则如果所述微生物如上文已对E2所述的具有相比于它的微生物降低的EC 1.2.1.3、EC 1.2.1.4或EC 1.2.1.5的醛脱氢酶的活性，则这是有利的。在本申请中，优选的酶E4是仅催化在以下部分中提及的两个反应中各个首先提及的反应的那些。
具体的酶E4
优选酶E4是
EC 1.1.3.20的脂肪醇氧化酶，其优选催化至少一种以下反应，尤其是首先提及的：
ω-羟基烷酸 (酯) + O2 = ω-氧代烷酸 (酯) + H2O2 和
ω-氧代烷酸 (酯) + O2 = ω-羧基烷酸 (酯) + H2O2 或
EC 1.1.99.-的AlkJ醇脱氢酶，其优选催化至少一种以下反应，尤其是首先提及的：
ω-羟基烷酸 (酯) + 氧化的受体 = ω-氧代烷酸 (酯) + 还原的受体和
ω-氧代烷酸 (酯) + 氧化的受体 = ω-羧基烷酸 (酯) + 还原的受体或
EC 1.1.1.1或EC 1.1.1.2的醇脱氢酶，其优选催化至少一种以下反应，尤其是首先提及的：
ω-羟基烷酸 (酯) + NAD(P)+ = ω-氧代烷酸 (酯) + NAD(P)H + H+ 和
ω-氧代烷酸 (酯) + NAD(P)+ = ω-羧基烷酸 (酯) + NAD(P)H + H+。
此类优选的脂肪醇氧化酶选自
Figure 36590DEST_PATH_IMAGE035
Figure 126906DEST_PATH_IMAGE036
Figure 308488DEST_PATH_IMAGE037
Figure 560478DEST_PATH_IMAGE038
和
具有这样的多肽序列的蛋白，其中与上文提及的参考序列相比，多达60％、优选多达25％、尤其优选多达15％、尤其多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％的氨基酸残基通过缺失、插入、取代或其组合而修饰，并且其仍具有至少50％、优选65％、尤其优选80％、尤其多于90％的具有相应的上文提及的参考序列的蛋白的活性，其中将参考蛋白的100％活性理解为表示用作生物催化剂的细胞活性的提高，即基于所用的细胞量（单位/克细胞干重[U/g CDW]），相比于不存在参考蛋白的生物催化剂的活性，每单位时间所转化的物质的量，其中通常将在该相关中的活性和与酶E4的活性测定的相关中的活性理解为具体表示转化ω-氧代月桂酸和/或ω-氧代月桂酸甲酯为ω-羧基月桂酸和/或ω-羧基月桂酸甲酯，或转化ω-羟基月桂酸和/或ω-羟基月桂酸甲酯为ω-氧代月桂酸和/或ω-氧代月桂酸甲酯。
此类优选的AlkJ醇脱氢酶选自
Figure 460301DEST_PATH_IMAGE039
Figure 88728DEST_PATH_IMAGE040
Figure 750971DEST_PATH_IMAGE042
Figure 200407DEST_PATH_IMAGE043
Figure 570208DEST_PATH_IMAGE044
和
具有这样的多肽序列的蛋白，其中与上文提及的参考序列相比，多达60％、优选多达25％、尤其优选多达15％、尤其多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％的氨基酸残基通过缺失、插入、取代或其组合而修饰，并且其仍具有至少50％、优选65％、尤其优选80％、尤其多于90％的具有相应的上文提及的参考序列的蛋白的活性，其中将参考蛋白的100％活性理解为表示用作生物催化剂的细胞活性的提高，即基于所用的细胞量（单位/克细胞干重[U/g CDW]），相比于不存在参考蛋白的生物催化剂的活性，每单位时间所转化的物质的量，其中通常将在该相关中的活性理解为具体表示转化ω-氧代月桂酸和/或ω-氧代月桂酸甲酯为ω-羧基月桂酸和/或ω-羧基月桂酸甲酯，或转化ω-羟基月桂酸和/或
ω-羟基月桂酸甲酯为ω-氧代月桂酸和/或ω-氧代月桂酸甲酯。
EC 1.1.1.1或EC 1.1.1.2的此类优选的醇脱氢酶选自来自细菌，尤其是大肠杆菌的
Figure 460804DEST_PATH_IMAGE045
和
具有这样的多肽序列的蛋白，其中与上文提及的参考序列相比，多达60％、优选多达25％、尤其优选多达15％、尤其多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％的氨基酸残基通过缺失、插入、取代或其组合而修饰，并且其仍具有至少50％、优选65％、尤其优选80％、尤其多于90％的具有相应的上文提及的参考序列的蛋白的活性，其中将参考蛋白的100％活性理解为表示用作生物催化剂的细胞活性的提高，即基于所用的细胞量（单位/克细胞干重[U/g CDW]），相比于不存在参考蛋白的生物催化剂的活性，每单位时间所转化的物质的量，其中通常将在该相关中的活性理解为具体表示转化ω-氧代月桂酸和/或ω-氧代月桂酸甲酯为ω-羧基月桂酸和/或ω-羧基月桂酸甲酯，或转化ω-羟基月桂酸和/或ω-羟基月桂酸甲酯为ω-氧代月桂酸和/或ω-氧代月桂酸甲酯。
WO2010062480 A2具体在示例性实施例3、4、6和7中描述了相比于它们的野生型能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是脂肪醇的微生物。该文件还具体在图10中和示例性实施例2-7中描述了根据本发明优选的酶E4及其序列。
酶E5 ω-氧化2
对于生产ω-羧基-官能化的羧酸或ω-羧基-官能化的羧酸酯，如果所述第二种遗传修饰包含酶E5提高的活性，则这可能是有利的，所述酶E5催化转化ω-氧代羧酸或ω-氧代羧酸酯为对应的ω-羧基羧酸或ω-羧基-羧酸酯。
具体的酶E5
优选地，酶E5为EC 1.2.1.3、EC 1.2.1.4或EC 1.2.1.5的醛脱氢酶，其优选催化以下反应：
ω-氧代烷酸 (酯) + NAD(P)+ = ω-羧基烷酸 (酯) + NAD(P)H + H+
此类优选的醛脱氢酶选自来自细菌，尤其是大肠杆菌的Prr, Usg, MhpF, AstD, GdhA, FrmA, Feab, Asd, Sad, PuuE, GabT, YgaW, BetB, PutA, PuuC, FeaB, AldA, Prr, EutA, GabD, AldB, TynA和YneI，
和
具有这样的多肽序列的蛋白，其中与上文提及的参考序列相比，多达60％、优选多达25％、尤其优选多达15％、尤其多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％的氨基酸残基通过缺失、插入、取代或其组合而修饰，并且其仍具有至少50％、优选65％、尤其优选80％、尤其多于90％的具有相应的上文提及的参考序列的蛋白的活性，其中将参考蛋白的100％活性理解为表示用作生物催化剂的细胞活性的提高，即基于所用的细胞量（单位/克细胞干重[U/g CDW]），相比于不存在参考蛋白的生物催化剂的活性，每单位时间所转化的物质的量，其中通常将在该相关中的活性和与酶E5的活性测定的相关中的活性理解为具体表示转化ω-氧代月桂酸和/或ω-氧代月桂酸甲酯为ω-羧基月桂酸和/或ω-羧基月桂酸甲酯。
alkL
通常，如果本发明的微生物能够快速地向培养基中分泌从简单碳源形成的ω-官能化的羧酸和ω-官能化的羧酸酯，则这对于它可能是有利的。
所述生物有利地实现这一点，这是由于第二种遗传修饰另外包含相比于它的野生型，微生物形成更多的alkL基因产物。
在本发明的范围，将术语“alkL基因产物”理解为表示满足以下两种条件中至少一种的蛋白：
1.)将蛋白鉴定为OmpW蛋白超家族的成员（在National Centre for Biotechnology Information (NCBI)的Conserved Domain Database (CDD)中为蛋白家族3922），其中该指定由蛋白的氨基酸序列与已经于2010年03月22日保存的的NCBI CDD中存在的数据库条目比对，并使用标准检索参数、低于0.01的e值并使用算法“blastp 2.2.23+”来完成，
2.)在通过RPS-BLAST的在NCBI CDD (版本2.20)中的包含于目标氨基酸序列中的保守蛋白结构域的检索中，用低于1 x 10-5的e值（“结构域命中”）鉴定保守结构域“OmpW, 外膜蛋白W” (COG3047)的存在。
包含于本发明的微生物中的优选的alkL基因产物的特征在于在天然宿主中所述alkL基因产物的产生由二环丙基酮所诱导；在本申请中，另外优选所述alkL基因的表达例如在调节子中、例如在操纵子中作为一组基因的部分来进行。
包含于本发明的微生物中的alkL基因产物优选由选自革兰氏阴性细菌的组的生物的alkL基因所编码，尤其是含有以下、优选由其组成的组：假单胞菌属种、固氮菌属种（Azotobacter sp.）、脱亚硫酸菌属种（Desulfitobacterium sp.）、伯克氏菌属种（Burkholderia sp.），优选洋葱伯克氏菌（Burkholderia cepacia）、黄色单胞菌属种（Xanthomonas sp.）、红杆菌属种（Rhodobacter sp.）、青枯菌属种（Ralstonia sp.）、代尔夫特菌属种（Delftia sp.）和立克次体属种（Rickettsia sp.）、Oceanicaulis sp.、柄杆菌属种（Caulobacter sp.）、海杆菌属种（Marinobacter sp.）和红假单胞菌属种（Rhodopseudomonas sp.），优选恶臭假单胞菌、Oceanicaulis alexandrii、水油海杆菌，尤其是恶臭假单胞菌GPo1和P1、Oceanicaulis alexandrii HTCC2633、柄杆菌种K31和水油海杆菌VT8（Marinobacter aquaeolei VT8）。
在本申请中，非常尤其优选的是由恶臭假单胞菌GPo1和P1的alkL基因（其由Seq ID No.1和Seq ID No.3所示）编码的alkL基因产物，和具有多肽序列Seq ID No.2、Seq ID No.4、Seq ID No.5、Seq ID No.6或Seq ID No.7的蛋白或具有这样的多肽序列的蛋白，其中与Seq ID No.2、Seq ID No.4、Seq ID No.5、Seq ID No.6或Seq ID No.7相比，多达60％、优选多达25％、尤其优选多达15％、尤其多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％的氨基酸残基通过缺失、插入、取代或其组合而修饰，并且其产物仍具有至少50％、优选65％、尤其优选80％、尤其多于90％的具有相应的参考序列Seq ID No.2、Seq ID No.4、Seq ID No.5、Seq ID No.6或Seq ID No.7的蛋白的活性，其中将参考蛋白的100％活性理解为表示用作生物催化剂的细胞活性的提高，即基于所用的细胞重量（单位/克细胞干重[U/g CDW]），相比于不存在参考蛋白的生物催化剂的活性（这在如示例性实施例中所述的系统中，其中在大肠杆菌细胞中将葡萄糖转化为ω-氨基月桂酸），每单位时间所转化的物质的量。确定合成速率的选择方法可以在示例性实施例中发现。
对于单位的定义，将酶动力学中常用的定义用于此：1单位生物催化剂在1分钟内转化1 µmol的底物为产物。
1 U = 1 µmol/分钟。
用于羧酸和羧酸酯合成的第一种遗传修饰
根据本发明，微生物具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的羧酸和羧酸酯。
在本申请中，根据本发明优选的是，所述第一种遗传修饰为至少一种选自以下组的酶的相比于野生型微生物的酶活性提高的活性：
Ei 酰基-ACP (酰基载体蛋白)硫酯酶，优选EC 3.1.2.14或EC 3.1.2.22的，其催化酰基-酰基载体蛋白硫酯的水解，
Eii 酰基-CoA (辅酶A)硫酯酶，优选EC 3.1.2.2、EC 3.1.2.18、EC 3.1.2.19、EC 3.1.2.20或EC 3.1.2.22的，其催化酰基-辅酶A硫酯的水解，
Eiib 酰基-CoA (辅酶A):ACP (酰基载体蛋白)转酰酶，其优选催化其中转化CoA硫酯为ACP硫酯的反应，
Eiii 聚酮合酶，其催化也参与羧酸和羧酸酯的合成的反应，和
Eiv 己酸合酶，FAS-I类的专用脂肪酸合酶，其催化从两分子的丙二酸单酰辅酶A和一分子的乙酰辅酶A合成己酸。
具体的酶Ei
由Ei催化的反应与由Eii催化的反应的不同之处仅在于，酰基辅酶A硫酯而非酰基-酰基载体蛋白硫酯被水解。显而易见的是，由于显著的次要活性，许多所述的酶Ei也可以用作Eii，并且反之亦然。
在根据本发明优选的细胞中，所述酶Ei是包含选自以下的序列的酶：
Figure 320176DEST_PATH_IMAGE046
Figure 929011DEST_PATH_IMAGE047
和
具有这样的多肽序列的蛋白，其中与上文提及的参考序列相比，多达60％、优选多达25％、尤其优选多达15％、尤其多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％的氨基酸残基通过缺失、插入、取代或其组合而修饰，并且其仍具有至少50％、优选65％、尤其优选80％、尤其多于90％的具有相应的上文提及的参考序列的蛋白的活性，其中将参考蛋白的100％活性理解为表示用作生物催化剂的细胞活性的提高，即基于所用的细胞量（单位/克细胞干重[U/g CDW]），相比于不存在参考蛋白的生物催化剂的活性，每单位时间所转化的物质的量，其中通常将在该相关中的活性和与酶Ei的活性测定的相关中的活性理解为具体表示水解十二烷酰-ACP硫酯。
根据本发明优选的微生物是当将在下文中列出的具有本发明的意义内的第一种遗传修饰的微生物用作起始点，从而为它们提供第二种遗传修饰，并且任选至少一种本发明的意义内的进一步的遗传修饰时，获得的那些微生物。
WO2010063031 A2具体在段落[0007]-[0008]、[0092]-[0100]、[0135]-[0136]、[0181]-[0186]和[0204]-[0213]和示例性实施例4-8中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的微生物油。该文件还具体在段落[0012]-[0013]、[0155]、[0160]-[0163]、[0185]-[0190]和[0197]-[0199]、图12、示例性实施例4-8和表3中描述了根据本发明优选的酶Ei和它们的序列。
WO2010063032 A2具体在段落[0007]-[0008]、[0092]-[0100]、[0135]-[0136]、[0181]-[0186]和[0204]-[0213]和示例性实施例4-8中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的微生物油。该文件还具体在段落[0012]-[0013]、[0155]、[0160]-[0163]、[0185]-[0190]和[0197]-[0199]、图12、示例性实施例4-8和表3中描述了根据本发明优选的酶Ei和它们的序列。
WO2011003034 A2具体在第3页第2段至第7页第1段、第20页第2段至第22页第2段、和第156页至第166也第5段、以及在权利要求1-100中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是己二酸。该文件还具体在第35页第3段和第36页第1段中描述了根据本发明优选的酶Ei和它们的序列。
WO2011008565 A1具体在段落[0018]-[0024]和[0086]-[0102]以及示例性实施例2、4、7、9和10中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是脂肪酸、脂肪醛、脂肪醇、烷和脂肪酸酯。该文件还具体在段落[0009]-[0018]和[0073]-[0082]、图1-3和7、表4、示例性实施例1-10和权利要求1-5和11-13中描述了根据本发明优选的酶Ei和它们的序列。
WO2009076559 A1具体在段落[0013]-[0051]和[0064]-[00111]以及权利要求1-10中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是脂肪酸、脂肪醇、烷或烯。该文件还具体在表1、段落[0021]、[0024]-[0030]和[0064]-[00111]和图6中描述了根据本发明优选的酶Ei和它们的序列。
WO2010017245 A1具体在段落[0011]-[0015]和[00114]-[00134]、示例性实施例3和权利要求1-2和9-11中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物。该文件还具体在表1、2和3、段落[0080]-[00112]和权利要求3-8中描述了根据本发明优选的酶Ei和它们的序列。
WO2010127318 A2具体在第1-9页和第11-16页、示例性实施例1、2和4、图1A-1E和权利要求23-43、62-79和101-120中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是生物柴油等同物和其它脂肪酸衍生物，主要是脂肪酸乙酯、脂肪酸酯、蜡酯、脂肪醇和脂肪醛。该文件还具体在第17页和第19-23页中描述了根据本发明优选的酶Ei和它们的序列。
WO2008100251 A1具体在第4-7页和第45-46页、图1A-1E以及权利要求9-13中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是脂肪酸酯、蜡酯和脂肪醇。该文件还具体在第4-5页和第45-46页中描述了根据本发明优选的酶Ei和它们的序列。
WO2007136762 A2具体在第2-4页和第17-18页、表7、图2-4、示例性实施例2-8以及权利要求13和35中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是脂肪酸酯、蜡酯、烃和脂肪醇。该文件还具体在第17-18页、表1、7、8和10以及图10中描述了根据本发明优选的酶Ei和它们的序列。
WO2008113041 A2具体在第35-41页和第64-67页、图2、示例性实施例6和10以及权利要求7和36中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是脂肪酸酯、蜡酯、烃、脂族酮和脂肪醇。该文件还具体在图7中和示例性实施例6和10中描述了根据本发明优选的酶Ei及其序列。
WO2010126891 A1具体在段落[0034]-[0091]、[0195]-[0222]和[0245]-[0250]、图3-5以及示例性实施例1-5中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是脂肪酸酯、蜡酯和脂肪醇。该文件还具体在段落[0245]-[0250]、表1和示例性实施例1-5中描述了根据本发明优选的酶Ei及其序列。
WO2010118410 A1具体在段落[0022]-[0043]、[0158]-[0197]、图1-4、示例性实施例3和5-8以及权利要求1-53和82-100中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是脂肪酸酯和蜡酯。该文件还具体在段落[0158]-[0197]、表1、图3和4以及示例性实施例3和5-8中描述了根据本发明优选的酶Ei及其序列。
WO2010118409 A1具体在段落[0134]-[0154]、图1-3和6以及示例性实施例3中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是脂肪酸酯和蜡酯。该文件还具体在段落[0134]-[0154]、图3和6以及示例性实施例3中描述了根据本发明优选的酶Ei及其序列。
WO2010075483 A2具体在段落[0061]-[0090]和[0287]-[0367]、图1、4和5、示例性实施例1-38以及权利要求18-26中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是脂肪酸、脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯、脂肪醇、脂肪烷基乙酸酯、脂肪醛、脂肪胺、脂肪酰胺、脂肪硫酸酯、脂肪醚、酮、烷、内部和末端烯烃、二羧酸、α,ω-二羧酸和α,ω-二醇。该文件还具体在段落[0012]-[0060]、表7、17、26和27、图1、44-47和55-59、示例性实施例1-38以及权利要求1-17中描述了根据本发明优选的酶Ei和它们的序列。
WO2010062480 A2具体在段落[0022]-[0174]和[0296]-[0330]、示例性实施例3和5-8以及权利要求17和24中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是脂肪醇。该文件还具体在段落[0022]-[0174]、表1和示例性实施例3和5-8中描述了根据本发明优选的酶Ei及其序列。
WO2010042664 A2具体在段落[0022]-[0143]和[0241]-[0275]、示例性实施例2以及权利要求3和9中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是脂肪醛。该文件还具体在表1、图5以及示例性实施例2中描述了根据本发明优选的酶Ei及其序列。
WO2011008535 A1具体在段落[0024]-[0032]和[0138]-[0158]以及图13中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是羧酸、羟基羧酸及其内酯。
WO2010022090 A1具体在段落[0022]-[0143]、[0238]-[0275]、图3-5、示例性实施例2以及权利要求5、15、16和36中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是脂肪酸酯和蜡酯。该文件还具体在表1、图6以及示例性实施例2中描述了根据本发明优选的酶Ei及其序列。
WO2009140695 A1具体在段落[0214]-[0248]以及示例性实施例22-24中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是烃。该文件还具体在表1、图40和示例性实施例22-24中描述了根据本发明优选的酶Ei及其序列。
WO2010021711 A1具体在段落[0009]-[0020]和[0257]-[0317]、图3-5和19、示例性实施例2-24以及权利要求4、5和30中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是脂肪酸酯和蜡酯。该文件还具体在表3、图6和示例性实施例2-24中描述了根据本发明优选的酶Ei及其序列。
WO2009085278 A1具体在段落[0188]-[0192]以及图10中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是烯烃。该文件还具体在表1和图10中描述了根据本发明优选的酶Ei及其序列。
WO2011019858 A1具体在段落[0023]、[0064]-[0074]和[0091]-[0099]、示例性实施例1-13、图1以及权利要求8中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是脂肪醇。该文件还具体在段落[0085]-[0090]、示例性实施例1-13以及表1中描述了根据本发明优选的酶Ei及其序列。
WO2009009391 A2具体在段落[0010]-[0019]、[0191]-[0299]、图3-5、示例性实施例2、4-6、9-14、17和19以及权利要求16、39、44和55-59中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是脂肪酸酯、蜡酯和脂肪醇。该文件还具体在段落[0010]-[0019]和[0191]-[0299]、图9以及示例性实施例2、4-6、9-14、17和19中描述了根据本发明优选的酶Ei及其序列。
WO2008151149 A2具体在段落[0009]、[0015]-[0033]、[0053]、[0071]、[0174]-[0191]、[0274]-[0396]和权利要求53-144、188－206和344-355以及表1-3中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的微生物油。该文件还具体在表5中描述了根据本发明优选的酶Ei及其序列。
WO2008147781 A2具体在段落[0147]-[0156]、示例性实施例1-3、8、9和14以及权利要求65-71中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是烃、烯烃和脂族酮。该文件还具体在示例性实施例1-3、8、9和14中描述了根据本发明优选的酶Ei及其序列。
WO2008119082 A2具体在第3-5页、第8-10页和第40-77页、图4和5、示例性实施例2-5和8-18以及权利要求3-39和152-153中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是脂肪酸酯、蜡酯、甘油三酯、生物柴油、汽油、飞机燃料和脂肪醇。该文件还具体在表1、图1、示例性实施例2-5和8-18以及权利要求124-134和138-141中描述了根据本发明优选的酶Ei及其序列。
WO2010135624 A2具体在段落[0067]-[0083]和[0095]-[0098]中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是脂肪醇。该文件还具体在段落[0067]-[0083]和[0095]-[0098]中描述了根据本发明优选的酶Ei和它们的序列。
Zheng Z, Gong Q, Liu T, Deng Y, Chen JC和Chen GQ. (Thioesterase II of Escherichia coli plays an important role in 3-hydroxydecanoic acid production. Appl Environ Microbiol. 2004. 70(7):3807-13)具体在第3808-3810页和第3012页和表1、3和4中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是脂肪酸酯、蜡酯和脂肪醇。该文件还具体在第3807页和表2中描述了根据本发明优选的酶Ei和它们的序列。
Steen EJ, Kang Y, Bokinsky G, Hu Z, Schirmer A, McClure A, Del Cardayre SB和Keasling JD (Microbial production of fatty acid-derived fuels and chemicals from plant biomass. Nature. 2010. 463(7280):559-62)具体在第559页第3段至第559页第1段中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是脂肪酸和脂肪酸酯。该文件还具体在补充附表1中描述了根据本发明优选的酶Ei及其序列。
Lennen RM, Braden DJ, West RA, Dumesic JA和Pfleger BF (A process for microbial hydrocarbon synthesis: Overproduction of fatty acids in Escherichia coli and catalytic conversion to alkanes. Biotechnol Bioeng. 2010. 106(2):193-202)具体在第193页第1段、第194页第1和第2段、第195页第2段至第197页第2段、第198页第2段至第199页第3段中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是脂肪酸和脂肪酸酯。该文件还具体在第193页第1段、第194页第1和2段、第196页第2段中和在补充材料中描述了根据本发明优选的酶Ei和它们的序列。
Liu T, Vora H和Khosla C. (Quantitative analysis and engineering of fatty acid biosynthesis in E. coli. Metab Eng. 2010 Jul;12(4):378-86.)具体在部分2.2和3.1以及表1和2中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是脂肪酸和脂肪酸酯。该文件还具体在表1中描述了根据本发明优选的酶Ei及其序列。
Yuan L, Voelker TA和Hawkins DJ. (Modification of the substrate specificity of an acyl-acyl carrier protein thioesterase by protein engineering. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 Nov 7;92(23):10639-43)具体在第10641页第4段和图2和表1中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是脂肪酸和脂肪酸酯。该文件还具体在第10639页第1段、第10640页第2、3和最后一段、第10641页第2和3段中以及在图1和表1和2中描述了根据本发明优选的酶Ei和它们的序列。
Lu X, Vora H和Khosla C. (Overproduction of free fatty acids in E. coli: implications for biodiesel production. Metab Eng. 2008. 10(6):333-9.)具体在第334页第2段、第2.2、2.3和3段（第1-4段）和表1中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是脂肪酸和脂肪酸酯。该文件还具体在段落2.2中描述了根据本发明优选的酶Ei及其序列。
Liu X, Sheng J和Curtiss IIII R. (Fatty acid production in genetically modified cyanobacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011. 108(17):6899-904)具体在第6899页第4段和最后一段、第6900页第1至倒数第2段和“支持信息”的表S1中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是脂肪酸和脂肪酸酯。该文件还具体在第6899页第6段和最后一段中描述了根据本发明优选的酶Ei及其序列。
具体的酶Eii
根据本发明优选的微生物是当将在下文中列出的具有本发明的意义内的第一种遗传修饰的微生物用作起始点，从而为它们提供第二种遗传修饰，并且任选至少一种本发明的意义内的进一步的遗传修饰时，获得的那些微生物。
Steen EJ, Kang Y, Bokinsky G, Hu Z, Schirmer A, McClure A, Del Cardayre SB和Keasling JD (Microbial production of fatty-acid-derived fuels and chemicals from plant biomass. Nature. 2010. 463(7280):559-62)具体在第559页第3段至第559页第1段中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的羧酸和羧酸酯，尤其是脂肪酸和脂肪酸酯。该文件还具体在补充附表1中描述了根据本发明优选的酶Eii及其序列。
Lennen RM, Braden DJ, West RA, Dumesic JA和Pfleger BF (A process for microbial hydrocarbon synthesis: Overproduction of fatty acids in Escherichia coli and catalytic conversion to alkanes. Biotechnol Bioeng. 2010. 106(2):193-202)具体在第193页第1段、第194页第1和第2段、第195页第2段至第197页第2段、第198页第2段至第199页第3段中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的羧酸和羧酸酯，尤其是脂肪酸和脂肪酸酯。该文件还具体在第193页第1段、第194页第1和2段、第196页第2段中和在补充材料中描述了根据本发明优选的酶Eii和它们的序列。
Liu T, Vora H和Khosla C. (Quantitative analysis and engineering of fatty acid biosynthesis in E. coli. Metab Eng. 2010 Jul;12(4):378-86.)具体在部分2.2和3.1以及表1和2中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的羧酸和羧酸酯，尤其是脂肪酸和脂肪酸酯。该文件还具体在表1中描述了根据本发明优选的酶Eii及其序列。
Yuan L, Voelker TA和Hawkins DJ. (Modification of the substrate specificity of an acyl-acyl carrier protein thioesterase by protein engineering. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 Nov 7;92(23):10639-43)具体在第10641页第4段和图2和表1中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的羧酸和羧酸酯，尤其是脂肪酸和脂肪酸酯。该文件还具体在第10639页第1段、第10640页第2、3和最后一段、第10641页第2和3段中以及在图1和表1和2中描述了根据本发明优选的酶Eii和它们的序列。
Lu X, Vora H和Khosla C. (Overproduction of free fatty acids in E. coli: implications for biodiesel production. Metab Eng. 2008. 10(6):333-9.)具体在第334页第2段、第2.2、2.3和3段（第1-4段）和表1中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的羧酸和羧酸酯，尤其是脂肪酸和脂肪酸酯。该文件还具体在段落2.2中描述了根据本发明优选的酶Eii及其序列。
Liu X, Sheng J和Curtiss IIII R. (Fatty acid production in genetically modified cyanobacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011. 108(17):6899-904)具体在第6899页第4段和最后一段、第6900页第1至倒数第2段和“支持信息”的表S1中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的羧酸和羧酸酯，尤其是脂肪酸和脂肪酸酯。该文件还具体在第6899页第6段和最后一段中描述了根据本发明优选的酶Eii及其序列。
具体的酶Eiii
根据本发明优选的微生物是当将在下文中列出的具有本发明的意义内的第一种遗传修饰的微生物用作起始点，从而为它们提供第二种遗传修饰，并且任选至少一种本发明的意义内的进一步的遗传修饰时，获得的那些微生物。
WO2009121066 A1具体在权利要求8-14中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是二羧酸。该文件还具体在段落[00026]-[0054]、示例性实施例1-6、图4-10以及权利要求1-7中描述了根据本发明优选的酶Eiii及其序列。
WO2009134899 A1具体在段落[0079]-[0082]、示例性实施例1以及权利要求20中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是羧酸、羟基羧酸及其内酯。该文件还具体在段落[0009]-[0010]和[0044]-[0078]、示例性实施例1、图1和5-8以及权利要求15-17和19中描述了根据本发明优选的酶Eiii和它们的序列。
具体的酶Eiv
在根据本发明优选的细胞中，所述酶Eiv是包含选自以下的序列的酶：
Figure 164821DEST_PATH_IMAGE048
Figure 175502DEST_PATH_IMAGE049
Figure 143458DEST_PATH_IMAGE050
和
具有这样的多肽序列的蛋白，其中与上文提及的参考序列相比，多达60％、优选多达25％、尤其优选多达15％、尤其多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％的氨基酸残基通过缺失、插入、取代或其组合而修饰，并且其仍具有至少50％、优选65％、尤其优选80％、尤其多于90％的具有相应的上文提及的参考序列的蛋白的活性，其中将参考蛋白的100％活性理解为表示用作生物催化剂的细胞活性的提高，即基于所用的细胞量（单位/克细胞干重[U/g CDW]），相比于不存在参考蛋白的生物催化剂的活性，每单位时间所转化的物质的量，其中通常将在该相关中的活性和与酶Eiv的活性测定的相关中的活性理解为具体表示从2分子的丙二酸单酰辅酶A和一分子的乙酰辅酶A转化己酸。
根据本发明优选的微生物是当将在下文中列出的具有本发明的意义内的第一种遗传修饰的微生物用作起始点，从而为它们提供第二种遗传修饰，并且任选至少一种本发明的意义内的进一步的遗传修饰时，获得的那些微生物。
WO2011003034 A2具体在第2-3页、第5页第3段、示例性实施例1-4、7-9和12-14以及权利要求1-100中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是己酸。该文件还具体在第5页和示例性实施例3中描述了根据本发明优选的酶Eiv和它们的序列。
Hitchman TS, Schmidt EW, Trail F, Rarick MD, Linz JE和Townsend CA. (Hexanoate synthase, a specialized type I fatty acid synthase in aflatoxin B1 biosynthesis. Bioorg Chem. 2001. 29(5):293-307)具体在第296页倒数第二段至第298页第2段中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是己酸。该文件还具体在第299页第4段至第302页第1段中描述了根据本发明优选的酶Eiv及其序列。
与第一种遗传修饰相关，使用相比于野生型活性提高的酶Eii与活性提高的酶Eiib配对的组合来代替酶Ei，可能是有利的，所述酶Eiib催化其中将CoA硫酯转化为ACP硫酯的反应。
合适的酶Eiib已知为酰基-CoA（辅酶A）:ACP（酰基载体蛋白）转酰酶。优选的酶Eiib选自
Figure 13511DEST_PATH_IMAGE052
Figure 878699DEST_PATH_IMAGE053
和
具有这样的多肽序列的蛋白，其中与上文提及的参考序列相比，多达60％、优选多达25％、尤其优选多达15％、尤其多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％的氨基酸残基通过缺失、插入、取代或其组合而修饰，并且其仍具有至少50％、优选65％、尤其优选80％、尤其多于90％的具有相应的上文提及的参考序列的蛋白的活性，其中将参考蛋白的100％活性理解为表示用作生物催化剂的细胞活性的提高，即基于所用的细胞量（单位/克细胞干重[U/g CDW]），相比于不存在参考蛋白的生物催化剂的活性，每单位时间所转化的物质的量，其中通常将在该相关中的活性和与酶Eiib的活性测定的相关中的活性理解为具体表示转化十二烷酰-CoA硫酯为十二烷酰-ACP硫酯。
生产羧酸酯的第三种遗传修饰
具体对于生产ω-官能化的羧酸酯，例如
ω-羟基-、ω-氧代-、ω-羧基-或ω-氨基羧酸酯，如果微生物具有第三种遗传修饰，该遗传修饰包含至少一种酶Eiib、Ev、Evi或Evii的相比于野生型微生物的酶活性提高的活性，所述酶参与转化羧酸或ω-官能化羧酸为羧酸酯或ω-官能化羧酸酯，则这是有利的。
在本申请中，根据本发明优选的是，该遗传修饰为至少一种选自以下组的酶的相比于野生型微生物的酶活性提高的活性：
Eiib 酰基-CoA (辅酶A):ACP (酰基载体蛋白)转酰酶，其转化ACP硫酯为CoA硫酯或者转化CoA硫酯为ACP硫酯，
Ev 蜡酯合酶或醇O酰基转移酶，优选EC 2.3.1.75或EC 2.3.1.84的，其催化从酰基-辅酶A硫酯或ACP硫酯和醇合成酯，
Evi 酰基-CoA (辅酶A)合酶，优选EC 6.2.1.3的，其催化酰基-辅酶A硫酯的合成，和
Evii 酰基硫酯酶，优选EC 3.1.2.2、EC 3.1.2.4、EC 3.1.2.18、EC 3.1.2.19、EC 3.1.2.20或EC 3.1.2.22的，其催化酰基硫酯与醇转化为羧酸酯。
在本申请中，尤其优选第三种遗传修饰包含选自以下的酶的提高的活性的组合：
Ev、Evii、EvEvi、EviEvii和EviEviiEiib。
优选的与第三种遗传修饰有关的酶Eiib对应于上文列出的作为优选与第一种遗传修饰有关的酶Eiib。
具体的酶Ev
在根据本发明优选的细胞中，所述酶Ev是包含选自以下的序列的酶：
Figure 79873DEST_PATH_IMAGE054
Figure 663301DEST_PATH_IMAGE055
Figure 975334DEST_PATH_IMAGE056
Figure 960607DEST_PATH_IMAGE057
Figure 270366DEST_PATH_IMAGE058
Figure 403407DEST_PATH_IMAGE059
和
具有这样的多肽序列的蛋白，其中与上文提及的参考序列相比，多达60％、优选多达25％、尤其优选多达15％、尤其多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％的氨基酸残基通过缺失、插入、取代或其组合而修饰，并且其仍具有至少50％、优选65％、尤其优选80％、尤其多于90％的具有相应的上文提及的参考序列的蛋白的活性，其中将参考蛋白的100％活性理解为表示用作生物催化剂的细胞活性的提高，即基于所用的细胞量（单位/克细胞干重[U/g CDW]），相比于不存在参考蛋白的生物催化剂的活性，每单位时间所转化的物质的量，其中通常将在该相关中的活性和与酶Ev的活性测定的相关中的活性理解为具体表示转化十二烷酰-CoA硫酯和/或十二烷酰-ACP硫酯与甲醇为十二烷酰甲酯。
如果酶Ev是EC 2.3.1.84的醇O-酰基转移酶，那么其优选选自：
Figure 456814DEST_PATH_IMAGE060
和
具有这样的多肽序列的蛋白，其中与上文提及的参考序列相比，多达60％、优选多达25％、尤其优选多达15％、尤其多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％的氨基酸残基通过缺失、插入、取代或其组合而修饰，并且其仍具有至少50％、优选65％、尤其优选80％、尤其多于90％的具有相应的上文提及的参考序列的蛋白的活性，其中将参考蛋白的100％活性理解为表示用作生物催化剂的细胞活性的提高，即基于所用的细胞量（单位/克细胞干重[U/g CDW]），相比于不存在参考蛋白的生物催化剂的活性，每单位时间所转化的物质的量，其中通常将在该相关中的活性和与酶Ev的活性测定的相关中的活性理解为具体表示转化十二烷酰-CoA硫酯与甲醇为十二烷酰甲酯。
根据本发明优选的微生物是当将在下文中列出的具有本发明的意义内的第三种遗传修饰的微生物用作起始点，从而为它们提供第一种和第二种遗传修饰，并且任选至少一种本发明的意义内的进一步的遗传修饰时，获得的那些微生物。
WO2007136762 A2具体在第2-4页和第21-24页、图2-4、示例性实施例1、2和5-7以及权利要求1、2、5、6、9-27和33中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第三种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是脂肪酸酯、蜡酯、烃和脂肪醇。该文件还具体在第21-24页、表10以及图10中描述了根据本发明优选的酶Ev和它们的序列。
具体的酶Evi
在根据本发明优选的细胞中，所述酶Evi是包含选自YP_001724804.1 (由SEQ ID No.21编码)的序列的酶
和
具有这样的多肽序列的蛋白，其中与上文提及的参考序列相比，多达60％、优选多达25％、尤其优选多达15％、尤其多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％的氨基酸残基通过缺失、插入、取代或其组合而修饰，并且其仍具有至少50％、优选65％、尤其优选80％、尤其多于90％的具有相应的上文提及的参考序列的蛋白的活性，其中将参考蛋白的100％活性理解为表示用作生物催化剂的细胞活性的提高，即基于所用的细胞量（单位/克细胞干重[U/g CDW]），相比于不存在参考蛋白的生物催化剂的活性，每单位时间所转化的物质的量，其中通常将在该相关中的活性和与酶Evi的活性测定的相关中的活性理解为具体表示合成十二烷酰-CoA硫酯。
具体的酶Evii
根据本发明优选的微生物是当将在下文中列出的具有本发明的意义内的第三种遗传修饰的微生物用作起始点，从而为它们提供第一种和第二种遗传修饰，并且任选至少一种本发明的意义内的进一步的遗传修饰时，获得的那些微生物。
WO2010075483 A2具体在段落[0061]-[0090]和[0287]-[0367]、图1、4和5、示例性实施例1-38以及权利要求18-26中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第三种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是脂肪酸、脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯、脂肪醇、脂肪烷基乙酸酯、脂肪醛、脂肪胺、脂肪酰胺、脂肪硫酸酯、脂肪醚、酮、烷、内部和末端烯烃、二羧酸、α,ω-二羧酸和α,ω-二醇。该文件还具体在段落[0012]-[0060]、表7、17、26和27、图1、44-47和55-59、示例性实施例1-38以及权利要求1-17中描述了根据本发明优选的酶Evii和它们的序列。
用于生产ω-羟基- 或ω-氧代-官能化羧酸和羧酸酯的第四种遗传修饰
对于其中需要生产ω-羟基-或ω-氧代-官能化羧酸和羧酸酯（也作为进一步ω-官能化例如ω-氨基化的前体阶段）的情况，在微生物中相应地酶促减少已经在ω位置处氧化为羧基官能的对应的羧酸或羧酸酯可能是有利的。
对此，根据本发明优选的微生物具有第四种遗传修饰，所述第四种遗传修饰包含至少一种选自以下组的酶的相比于野生型微生物的酶活性提高的活性：
Eiib 酰基-CoA (辅酶A):ACP (酰基载体蛋白)转酰酶，其转化ACP硫酯为CoA硫酯或者转化CoA硫酯为ACP硫酯，
Evi 酰基-CoA (辅酶A)合酶，优选EC 6.2.1.3的，其优选催化酰基辅酶A硫酯的合成，
Eviii 酰基-CoA (辅酶A)还原酶，优选EC 1.2.1.42或EC 1.2.1.50的，其优选催化酰基-辅酶A硫酯的还原为对应的烷-1-醛或烷-1-醇，
Eix 脂肪酸还原酶（也为脂肪醛脱氢酶或芳醛氧化还原酶），优选EC 1.2.1.3、EC 1.2.1.20或EC 1.2.1.48的，其优选催化烷酸还原为对应的烷-1-醛，和
Ex 酰基-ACP (酰基载体蛋白)还原酶，优选EC 1.2.1.80的，其优选催化酰基-ACP硫酯还原为对应的烷-1-醛或烷-1-醇。
在本申请中，尤其优选第四种遗传修饰，该遗传修饰包含选自以下的酶的提高的活性的组合：
Eviii、Eix、Ex、EviEviii和EviExEiib。
优选的与第四种遗传修饰有关的酶Eiib对应于上文列出的作为优选与第一种和第三种遗传修饰有关的酶Eiib。
因此，根据本发明优选的如此设计的生物也显著适合于生产选自以下的化合物
α,ω-烷二醇、α,ω-烷二醛、α-氧代-ω-羟基烷和α,ω-烷二胺，
α,ω-烯二醇、α,ω-烯二醛、α-氧代-ω-羟基烯和α,ω-烯二胺,
这是由于除了ω-官能化的羧酸和ω-官能化的羧酸酯之外以显著的量产生这些类别的化合物。
在本申请中，可以提及的是烯衍生物具体经由微生物形成的不饱和的脂肪酸（例如棕榈油酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸和γ-亚麻酸）转化产生。
具体的酶Eviii
根据本发明优选的微生物是当将在下文中列出的具有本发明的意义内的第四种遗传修饰的微生物用作起始点，从而为它们提供第一种和第二种遗传修饰，并且任选至少一种本发明的意义内的进一步的遗传修饰时，获得的那些微生物。
WO2011008565 A1具体在段落[0021]、[0103]-[0106]、[0108]和[0129]中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第四种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是脂肪酸、脂肪醛、脂肪醇、烷和脂肪酸酯。该文件还具体在段落[0104]-[0106]和[0108]和[0129]以及示例性实施例11中描述了根据本发明优选的酶Eviii及其序列。
WO2008151149 A2具体在段落[0009]、[0015]-[0037]、[0053]、[0071]、[0171]、[0174]-[0191]、[0274]-[0396]和权利要求53-144、188-206和344-355以及表1-3中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第四种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的微生物油。该文件还具体在段落[0255]-[0261]和[0269]以及表6和7中描述了根据本发明优选的酶Eviii及其序列。
WO2007136762 A2具体在第2-4页和第19-20页、图2-4、示例性实施例2-7以及权利要求4、8-27和33中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第四种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是脂肪酸酯、蜡酯、烃和脂肪醇。该文件还具体在第19-20页、表10以及图10中描述了根据本发明优选的酶Eviii和它们的序列。
WO2011019858 A1具体在段落[0015]-[0020]、[0064]-[0074]、[0085]-[0086]和[0092]-[0099]、示例性实施例1-13、图1以及权利要求1-14中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是脂肪醇。该文件还具体在段落[0004]-[0007]和[0075]-[0080]以及示例性实施例1-13中描述了根据本发明优选的酶Eviii及其序列。
WO2009140695 A1具体在段落[0031]-[0040]、[0051]和[0214]-[0233]、示例性实施例22-24、表1、图40、示例性实施例5-24和28-30以及权利要求29-30中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第四种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是烃。该文件还具体在段落[0023]-[0030]、[0056]、[0066]-[0069]和[0193]-[0208]、表1、图39、示例性实施例5-24和28-30以及权利要求69-74中描述了根据本发明优选的酶Eviii和它们的序列。
WO2011008535 A1具体在段落[0023]-[0024]和[0133]-[0158]、图13、权利要求39和45-47以及示例性实施例1-5中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第四种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是羧酸、羟基羧酸及其内酯。该文件还具体在段落[0017]-[0022]、[0084]-[0132]、图2-12、权利要求31-37和40-44以及示例性实施例1-5中描述了根据本发明优选的酶Eviii和它们的序列。
WO2010063031 A2具体在段落[0007]、[0092]-[0100]、[0181]-[0183]和[0199]-[0213]中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第四种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的微生物油。该文件还具体在段落[0191]-[0194]以及表4和5中描述了根据本发明优选的酶Eviii及其序列。
WO2010063032 A2具体在段落[0007]、[0092]-[0100]、[0181]-[0183]和[0199]-[0213]中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第四种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的微生物油。该文件还具体在段落[0191]-[0194]以及表4和5中描述了根据本发明优选的酶Eviii及其序列。
具体的酶Eix
根据本发明优选的微生物是当将在下文中列出的具有本发明的意义内的第四种遗传修饰的微生物用作起始点，从而为它们提供第一种和第二种遗传修饰，并且任选至少一种本发明的意义内的进一步的遗传修饰时，获得的那些微生物。
WO2011019858 A1具体在段落[0004]-[0008]、[0064]-[0074]、[0085]-[0086]和[0095]-[0099]、示例性实施例1-13、图1以及权利要求7中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第四种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是脂肪醇。该文件还具体在段落[0008]-[0009]、[0074]和[0081]-[0082]以及示例性实施例1-13中描述了根据本发明优选的酶Eix及其序列。
WO2010135624 A2具体在段落[0005]、[0067]-[0085]和[0092]-[0102]、权利要求13-17以及示例性实施例1-4中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第四种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是羧酸、羟基羧酸及其内酯。该文件还具体在段落[0005]-[0006]和[0086]-[0090]、图3-7、权利要求28以及示例性实施例1-4中描述了根据本发明优选的酶Eix及其序列。
WO2010062480 A2具体在段落[0022]-[0174]和[0292]-[0316]、示例性实施例1和3-8、图9以及权利要求17和24中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第四种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是脂肪醇。该文件还具体在段落[0019]-[0032]和[0263]-[0286]、表1、图6-8以及示例性实施例1和3-8中描述了根据本发明优选的酶Eix及其序列。
WO201042664 A2具体在段落[0236]-[0261]、示例性实施例2、图1和5以及权利要求25中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第四种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是脂肪醇。该文件还具体在段落[0211]-[0233]、图2-4以及示例性实施例1-2中描述了根据本发明优选的酶Eix及其序列。
具体的酶Ex
根据本发明优选的微生物是当将在下文中列出的具有本发明的意义内的第四种遗传修饰的微生物用作起始点，从而为它们提供第一种和第二种遗传修饰，并且任选至少一种本发明的意义内的进一步的遗传修饰时，获得的那些微生物。
WO2007136762 A2具体在第2-4页和第19-20页、图2-4、示例性实施例2-7以及权利要求4、8-27和33中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第四种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是脂肪酸酯、蜡酯、烃和脂肪醇。该文件还具体在第19-20页、表10以及图10中描述了根据本发明优选的酶Ex和它们的序列。
WO2011019858 A1具体在段落[0015]-[0020]、[0064]-[0074]、[0085]-[0086]和[0092]-[0099]、示例性实施例1-13、图1以及权利要求1-14中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第四种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是脂肪醇。该文件还具体在段落[0004]-[0007]和[0075]-[0080]以及示例性实施例1-13中描述了根据本发明优选的酶Ex及其序列。
WO2009140695 A1具体在段落[0031]-[0040]、[0051]和[0214]-[0233]、示例性实施例22-24、表1、图40、示例性实施例5-24和28-30以及权利要求29中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第四种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是烃。该文件还具体在段落[0023]-[0030]、[0056]、[0066]-[0069]和[0193]-[0208]、表1、图39、示例性实施例5-24和28-30以及权利要求69-74中描述了根据本发明优选的酶Ex和它们的序列。
WO2011008535 A1具体在段落[0023]-[0024]和[0133]-[0158]、图13、权利要求39和45-47以及示例性实施例1-5中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第四种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是羧酸、羟基羧酸及其内酯。该文件还具体在段落[0017]-[0022]、[0084]-[0132]、图2-12、权利要求31-37和40-44以及示例性实施例1-5中描述了根据本发明优选的酶Ex和它们的序列。
用于抑制羧酸和羧酸衍生物的降解的第五种遗传修饰
根据本发明还优选的是具有第五物种遗传修饰的微生物，所述第五种遗传修饰包含至少一种选自以下组的酶的相比于野生型微生物的酶活性降低的活性：
Ea 酰基-CoA合酶，优选EC 6.2.1.3的，其催化酰基-辅酶A硫酯的合成，
Eb 酰基-CoA脱氢酶，优选EC 1.3.99.-、EC 1.3.99.3或EC 1.3.99.13的，其催化酰基-辅酶A硫酯的氧化以产生对应的烯酰-辅酶A硫酯，
Ec 酰基-CoA氧化酶，优选EC 1.3.3.6的，其催化酰基-辅酶A硫酯氧化为对应的烯酰-辅酶A硫酯，
Ed 烯酰-CoA水合酶，优选EC 4.2.1.17或EC 4.2.1.74的，其催化烯酰-辅酶A硫酯水合为对应的3-羟酰基-辅酶A硫酯，
Ee 3-羟酰基-CoA脱氢酶，优选EC 1.1.1.35或EC 1.1.1.211的，其催化3-羟酰基-辅酶A硫酯氧化为对应的3-氧代酰基-辅酶A硫酯，和
Ef 乙酰基-CoA酰基转移酶，优选EC 2.3.1.16的，其催化乙酰基从3-氧代酰基-辅酶A硫酯转移至辅酶A，并因此产生缩短两个碳原子的酰基-辅酶A硫酯。
这具有这样的技术效果，即防止经第一种遗传修饰以提高的量形成的羧酸和羧酸酯的消耗，以及经第二种、第三种和第四种遗传修饰以提高的量形成的ω-官能化羧酸和羧酸酯的消耗。
具体的酶Ea
根据本发明还优选本发明的细胞中的酶Ea是这样的酶，其包含序列NP_416319.1，
和
具有这样的多肽序列的蛋白，其中与上文提及的参考序列相比，多达60％、优选多达25％、尤其优选多达15％、尤其多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％的氨基酸残基通过缺失、插入、取代或其组合而修饰，并且其仍具有至少50％、优选65％、尤其优选80％、尤其多于90％的具有相应的上文提及的参考序列的蛋白的活性，其中将参考蛋白的100％活性理解为表示用作生物催化剂的细胞活性的提高，即基于所用的细胞量（单位/克细胞干重[U/g CDW]），相比于不存在参考蛋白的生物催化剂的活性，每单位时间所转化的物质的量，其中通常将在该相关中的活性和与酶Ea的活性测定的相关中的活性理解为具体表示合成十二烷酰-CoA硫酯。
具体的酶Eb
根据本发明还优选本发明的细胞中的酶Eb是这样的酶，其包含选自以下的序列：
Figure 839570DEST_PATH_IMAGE062
Figure 132011DEST_PATH_IMAGE063
和
具有这样的多肽序列的蛋白，其中与上文提及的参考序列相比，多达60％、优选多达25％、尤其优选多达15％、尤其多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％的氨基酸残基通过缺失、插入、取代或其组合而修饰，并且其仍具有至少50％、优选65％、尤其优选80％、尤其多于90％的具有相应的上文提及的参考序列的蛋白的活性，其中将参考蛋白的100％活性理解为表示用作生物催化剂的细胞活性的提高，即基于所用的细胞量（单位/克细胞干重[U/g CDW]），相比于不存在参考蛋白的生物催化剂的活性，每单位时间所转化的物质的量，其中通常将在该相关中的活性和与酶Eb的活性测定的相关中的活性理解为具体表示氧化十二烷酰-CoA硫酯为2-十二碳烯酰-CoA硫酯。
具体的酶Ec
根据本发明还优选本发明的细胞中的酶Ec是这样的酶，其包含选自以下的序列：
Figure 745712DEST_PATH_IMAGE065
Figure 397274DEST_PATH_IMAGE066
和
具有这样的多肽序列的蛋白，其中与上文提及的参考序列相比，多达60％、优选多达25％、尤其优选多达15％、尤其多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％的氨基酸残基通过缺失、插入、取代或其组合而修饰，并且其仍具有至少50％、优选65％、尤其优选80％、尤其多于90％的具有相应的上文提及的参考序列的蛋白的活性，其中将参考蛋白的100％活性理解为表示用作生物催化剂的细胞活性的提高，即基于所用的细胞量（单位/克细胞干重[U/g CDW]），相比于不存在参考蛋白的生物催化剂的活性，每单位时间所转化的物质的量，其中通常将在该相关中的活性和与酶Ec的活性测定的相关中的活性理解为具体表示氧化十二烷酰-CoA硫酯为2-十二碳烯酰-CoA硫酯。
具体的酶Ed和Ee
根据本发明还优选本发明的细胞中的酶Ed或Ee是这样的酶，其包含选自以下的序列：
Figure 511226DEST_PATH_IMAGE069
Figure 599268DEST_PATH_IMAGE070
Figure 866301DEST_PATH_IMAGE071
Figure 127518DEST_PATH_IMAGE072
Figure 530818DEST_PATH_IMAGE073
Figure 789761DEST_PATH_IMAGE074
Figure 606407DEST_PATH_IMAGE075
和
具有这样的多肽序列的蛋白，其中与上文提及的参考序列相比，多达60％、优选多达25％、尤其优选多达15％、尤其多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％的氨基酸残基通过缺失、插入、取代或其组合而修饰，并且其仍具有至少50％、优选65％、尤其优选80％、尤其多于90％的具有相应的上文提及的参考序列的蛋白的活性，其中将参考蛋白的100％活性理解为表示用作生物催化剂的细胞活性的提高，即基于所用的细胞量（单位/克细胞干重[U/g CDW]），相比于不存在参考蛋白的生物催化剂的活性，每单位时间所转化的物质的量，其中通常将在该相关中的活性和与酶Ed和Ee的活性测定的相关中的活性理解为具体表示转化2-十二碳烯酰-CoA硫酯为3-氧代-十二烷酰-CoA硫酯。
具体的酶Ef
根据本发明还优选本发明的细胞中的酶Ef是这样的酶，其包含选自以下的序列：
Figure 866804DEST_PATH_IMAGE077
Figure 358965DEST_PATH_IMAGE078
Figure 335012DEST_PATH_IMAGE079
Figure 938031DEST_PATH_IMAGE080
Figure 581502DEST_PATH_IMAGE081
Figure 916669DEST_PATH_IMAGE082
和
具有这样的多肽序列的蛋白，其中与上文提及的参考序列相比，多达60％、优选多达25％、尤其优选多达15％、尤其多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％的氨基酸残基通过缺失、插入、取代或其组合而修饰，并且其仍具有至少50％、优选65％、尤其优选80％、尤其多于90％的具有相应的上文提及的参考序列的蛋白的活性，其中将参考蛋白的100％活性理解为表示用作生物催化剂的细胞活性的提高，即基于所用的细胞量（单位/克细胞干重[U/g CDW]），相比于不存在参考蛋白的生物催化剂的活性，每单位时间所转化的物质的量，其中通常将在该相关中的活性和与酶Ef的活性测定的相关中的活性理解为具体表示转化3-氧代-十二烷酰-CoA硫酯和CoA为癸酰-CoA硫酯和乙酰-CoA。
用于增强酰基-ACP硫酯合成的第六种遗传修饰
根据本发明，微生物具有第六种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的酰基-ACP硫酯。关于相应地希望的遗传修饰的概述可以见于WO2008119082的图1、第1段（脂肪酸产生提高/产物产生提高）中。
这具有这样的技术效果，即还进一步增强经第一种遗传修饰增强的羧酸和羧酸酯的形成，以及经第二种、第三种、第四种、第五种或第七种遗传修饰以更高的量形成的ω-官能化羧酸和羧酸酯的形成。
因此，根据本发明优选的如此设计的生物也显著适合于生产选自以下的化合物
α,ω-烷二醇、α,ω-烷二醛、α-氧代-ω-羟基烷和α,ω-烷二胺，
这是由于这些类别的化合物以显著的量与ω-官能化的烷酸和ω-官能化的烷酸酯一同产生。
用于生产具有末端双键的ω-官能化的羧酸和ω-官能化的羧酸酯的第七种遗传修饰
本发明的微生物可以另外设计使它们有利地适合于生产具有末端双键的ω-官能化的羧酸和ω-官能化的羧酸酯。为此，优选的微生物包含第七种遗传修饰，该遗传修饰包含酶Exi的相比于野生型微生物的酶活性提高的活性，所述酶Exi催化ω-羧基羧酸或ω-羧基羧酸酯转化为具有末端双键的羧酸或羧酸酯，并选自组
Exi) 细胞色素P450脂肪酸脱羧酶，其催化具有n个碳原子的烷酸转化为对应的具有n-1个碳原子的末端烯烃，尤其是十二烷酸转化为十一碳-10-烯酸。
根据本发明优选的微生物是当将在下文中列出的具有本发明的意义内的第七种遗传修饰的微生物用作起始点，从而为它们提供第一种和第二种遗传修饰，并且任选至少一种本发明的意义内的进一步的遗传修饰时，获得的那些微生物。
WO2009085278 A1具体在段落[0033]-[0048]、[0056]-[0063]和[0188]-[0202]、图10、表8、示例性实施例5-18以及权利要求28-51和188-195中描述了优选用于本发明的微生物，其具有第七种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物，尤其是烯烃。该文件还具体在段落[0021]-[0032]、[0051]-[0055]、[0081]-[0084]和[0160]-[0183]、表8、示例性实施例5-18、权利要求1-25以及图3、7和9中描述了根据本发明优选的酶Exi和它们的序列。
优选微生物和酶的具体实施方案
根据本发明，微生物尤其优选选自那些微生物，其具有：
在本发明的意义内的第一种和第二种遗传修饰，
在本发明的意义内的第一种、第二种和第五种遗传修饰，
在本发明的意义内的第一种、第二种和第三种遗传修饰，
在本发明的意义内的第一种、第二种、第三种和第五种遗传修饰，
在本发明的意义内的第一种、第二种和第四种遗传修饰，
在本发明的意义内的第一种、第二种、第四种和第五种遗传修饰，
在本发明的意义内的第一种、第二种、第三种和第四种遗传修饰，
在本发明的意义内的第一种、第二种、第三种、第四种和第五种遗传修饰，
在本发明的意义内的第一种、第二种和第七种遗传修饰，
在本发明的意义内的第一种、第二种、第五种和第七种遗传修饰，
在本发明的意义内的第一种、第二种、第三种和第七种遗传修饰，
在本发明的意义内的第一种、第二种、第三种、第五种和第七种遗传修饰，
在本发明的意义内的第一种、第二种和第六种遗传修饰，
在本发明的意义内的第一种、第二种、第五种和第六种遗传修饰，
在本发明的意义内的第一种、第二种、第三种和第六种遗传修饰，
在本发明的意义内的第一种、第二种、第三种、第五种和第六种遗传修饰，
在本发明的意义内的第一种、第二种、第四种和第六种遗传修饰，
在本发明的意义内的第一种、第二种、第四种、第五种和第六种遗传修饰，
在本发明的意义内的第一种、第二种、第三种、第四种和第六种遗传修饰，
在本发明的意义内的第一种、第二种、第三种、第四种、第五种和第六种遗传修饰，
在本发明的意义内的第一种、第二种、第六种和第七种遗传修饰，
在本发明的意义内的第一种、第二种、第五种、第六种和第七种遗传修饰，
在本发明的意义内的第一种、第二种、第三种、第六种和第七种遗传修饰，
在本发明的意义内的第一种、第二种、第三种、第五种、第六种和第七种遗传修饰。
根据本发明，微生物尤其优选具有第一种遗传修饰，从而相比于它们的野生型，它们能够从至少一种简单碳源形成更多的羧酸和羧酸酯，其中所述第一种遗传修饰具有至少一种酶Ei的相比于野生型微生物的酶活性提高的活性或一种具有这样的多肽序列的酶的相比于野生型微生物的酶活性提高的活性，其中与下表中通过引用提及的序列相比，多达60％、优选多达25％、尤其优选多达15％、尤其多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％的氨基酸残基通过缺失、插入、取代或其组合而修饰，并且其仍具有至少50％、优选65％、尤其优选80％、尤其多于90％的具有相应的参考序列的蛋白的活性，其中将参考蛋白的100％活性理解为表示用作生物催化剂的细胞活性的提高，即基于所用的细胞量（单位/克细胞干重[U/g CDW]），相比于不存在参考蛋白的生物催化剂的活性，每单位时间所转化的物质的量，其中通常将在该相关中的活性和与酶Ef的活性测定的相关中的活性理解为具体表示水解具有下表中对各个酶Ei指定的碳链长度的ACP硫酯，
并且所述羧酸和羧酸酯具有如下文表中表示的羧酸部分的碳链长度：
Figure 786721DEST_PATH_IMAGE084
相比于在上文的表中通过参考说明的序列的氨基酸残基的上述缺失具体指在N末端和/或C末端的缺失，尤其是N末端。尤其优选的是，上述N末端是植物质体靶向序列的N末端。此类植物质体靶向序列例如用由预测工具TargetP 1.1 (www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)利用的并且描述于以下出版物中的算法来预测，优选不使用截止值：
Predicting subcellular localization of proteins based on their N-terminal amino acid sequence.Olof Emanuelsson, Henrik Nielsen, Søren Brunak和Gunnar von Heijne.
J. Mol.Biol., 300:1005-1016, 2000和Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites.Henrik Nielsen, Jacob Engelbrecht, Søren Brunak和 Gunnar von Heijne.Protein Engineering, 10:1-6, 1997。
根据本发明非常尤其优选的微生物（缩写为MO）显著适合于生产ω-氨基羧酸并具有提高或降低的下表中描述的酶活性（缩写为E），其中这些能够另外有利地组合有相比于野生型微生物提高的酶活性，其对3-酮脂酰基-ACP (酰基载体蛋白)合酶III (EC 2.3.1.41)进行描述，尤其是来自于植物的，优选来自于其种子含有少于14个C原子的烷基的脂肪酸的植物的，并且尤其优选来自萼距花属（Cuphea）、油棕属（Elaeis）、椰子属（Cocos）、月桂属（Umbellularia ）和樟属（Cinnamomum）的植物的和选自
Figure 853083DEST_PATH_IMAGE086
Figure 69301DEST_PATH_IMAGE087
的基因产物。
这些酶活性的至少两种的任何组合可以有利地被提高。
此外，如果使微生物拥有相比于野生型微生物更低的酶活性，则可能是有利的，所述酶活性描述于单独的或以任何组合的选自下列的基因产物：
Figure 366607DEST_PATH_IMAGE089
。
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Figure 939967DEST_PATH_IMAGE117
根据本发明非常尤其优选的微生物（缩写为MO）显著适合于生产ω-氨基羧酸酯并具有提高或降低的下表中描述的酶活性（缩写为E），其中这些能够另外有利地组合有相比于野生型微生物提高的酶活性，其对3-酮脂酰基-ACP (酰基载体蛋白)合酶III (EC 2.3.1.41)进行描述，尤其是来自于植物的，优选来自于其种子含有少于14个C原子的烷基的脂肪酸的植物的，并且尤其优选来自萼距花属、油棕属、椰子属、加州月桂属和樟属的植物的和选自
Figure 724569DEST_PATH_IMAGE119
的基因产物。
这些酶活性的至少两种的任何组合可以有利地被提高。
此外，如果使微生物拥有相比于野生型微生物更低的酶活性，则可能是有利的，所述酶活性描述于单独的或以任何组合的选自下列的基因产物：
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Figure 21875DEST_PATH_IMAGE121
。
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根据本发明非常尤其优选的微生物（缩写为MO）显著适合于生产ω-羟基羧酸或ω-氧代羧酸并具有提高或降低的下表中描述的酶活性（缩写为E），其中这些能够另外有利地组合有相比于野生型微生物提高的酶活性，其对3-酮脂酰基-ACP (酰基载体蛋白)合酶III (EC 2.3.1.41)进行描述，尤其是来自于植物的，优选来自于其种子含有少于14个C原子的烷基的脂肪酸的植物的，并且尤其优选来自萼距花属、油棕属、椰子属、加州月桂属和樟属的植物的和选自
Figure 118213DEST_PATH_IMAGE177
的基因产物。
这些酶活性的至少两种的任何组合可以有利地被提高。
此外，如果使微生物拥有相比于野生型微生物更低的酶活性，则可能是有利的，所述酶活性描述于单独的或以任何组合的选自下列的基因产物：
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根据本发明非常尤其优选的微生物（缩写为MO）显著适合于生产ω-羟基羧酸酯或ω-氧代羧酸酯并具有提高或降低的下表中描述的酶活性（缩写为E），其中这些能够另外有利地组合有相比于野生型微生物提高的酶活性，其对3-酮脂酰基-ACP (酰基载体蛋白)合酶III (EC 2.3.1.41)进行描述，尤其是来自于植物的，优选来自于其种子含有少于14个C原子的烷基的脂肪酸的植物的，并且尤其优选来自萼距花属、油棕属、椰子属、加州月桂属和樟属的植物的和选自
Figure 967461DEST_PATH_IMAGE196
的基因产物。
这些酶活性的至少两种的任何组合可以有利地被提高。
此外，如果使微生物拥有相比于野生型微生物更低的酶活性，则可能是有利的，所述酶活性描述于单独的或以任何组合的选自下列的基因产物：
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根据本发明非常尤其优选的微生物（缩写为MO）显著适合于生产ω-羧基羧酸并具有提高或降低的下表中描述的酶活性（缩写为E），其中这些能够另外有利地组合有相比于野生型微生物提高的酶活性，其对3-酮脂酰基-ACP (酰基载体蛋白)合酶III (EC 2.3.1.41)进行描述，尤其是来自于植物的，优选来自于其种子含有少于14个C原子的烷基的脂肪酸的植物的，并且尤其优选来自萼距花属、油棕属、椰子属、加州月桂属和樟属的植物的和选自
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这些酶活性的至少两种的任何组合可以有利地被提高。
此外，如果使微生物拥有相比于野生型微生物更低的酶活性，则可能是有利的，所述酶活性描述于单独的或以任何组合的选自下列的基因产物：
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根据本发明非常尤其优选的微生物（缩写为MO）显著适合于生产ω-羧基羧酸酯并具有提高或降低的下表中描述的酶活性（缩写为E），其中这些能够另外有利地组合有相比于野生型微生物提高的酶活性，其对3-酮脂酰基-ACP (酰基载体蛋白)合酶III (EC 2.3.1.41)进行描述，尤其是来自于植物的，优选来自于其种子含有少于14个C原子的烷基的脂肪酸的植物的，并且尤其优选来自萼距花属、油棕属、椰子属、加州月桂属和樟属的植物的和选自
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的基因产物。
这些酶活性的至少两种的任何组合可以有利地被提高。
此外，如果使微生物拥有相比于野生型微生物更低的酶活性，则可能是有利的，所述酶活性描述于单独的或以任何组合的选自下列的基因产物：
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本发明微生物的用途
本发明进一步的主题涉及上述微生物用于生产ω-官能化羧酸和ω-官能化羧酸酯的用途，尤其是那些羧酸和羧酸酯，其在上文中强调为在与本发明的微生物的相关中是优选的，其中作为ω-官能化，ω-氨基化是尤其被强调的。上述微生物用于生产ω-氨基羧酸和ω-氨基羧酸酯，尤其是ω-氨基月桂酸和ω-氨基月桂酸甲酯和ω-氨基月桂酸乙酯以及ω-氨基己酸和ω-氨基己酸甲酯和ω-氨基己酸乙酯的用途是尤其优选的。
与本发明的微生物相关作为优选强调的微生物还优选与本发明的用途相关。哪种本发明的生物对于特定的ω-官能化羧酸或ω-官能化羧酸酯是优选的已经在本发明的微生物的相关中被强调。
生产ω-官能化羧酸和ω-官能化羧酸酯的方法
本发明进一步的主题涉及用于从简单碳源生产ω-官能化的羧酸和ω-官能化的羧酸酯的方法，其包括以下方法步骤：
I)将本发明的微生物与包含所述简单碳源的培养基接触，
II)将所述微生物在能够使所述微生物从简单碳源形成ω-官能化的羧酸或ω-官能化的羧酸酯的条件下培养，和
III)任选分离形成的ω-官能化的羧酸或ω-官能化的羧酸酯。
在本发明的方法中，为了生产ω-官能化羧酸或ω-官能化羧酸酯的目的，可以将本发明的微生物在分批方法（分批培养）或供料分批方法或重复供料分批方法中连续或不连续地与培养基接触并由此培养。还可行的是GB-A-1009370中所述的半连续方法。已知培养方法的概述描述于Chmiel的教科书(“Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik”, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)中或Storhas的教科书(“Bioreaktoren und periphere Einrichtungen”, Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)中。
待使用的培养基必须适当地满足各种菌株的需要。用于多种微生物的培养基的描述包含在American Society for Bacteriology手册“Manual of Methods for General Bacteriology” (Washington D.C., USA, 1981)中。
在本发明的方法中，优选使用根据本发明优选的微生物。
至于本发明的方法中的简单碳源，使用上文优选提及的那些。
作为氮源，可以使用有机含氮化合物，诸如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素或无机化合物诸如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵、氨、氢氧化铵或氨水。氮源可以单独使用或作为混合物使用。
作为磷源，可以使用磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或对应的含钠的盐。培养基此外必须包含金属盐，例如硫酸镁或硫酸铁，其对于生长是必需的。最后，除了上述物质外，可以使用必需营养物诸如氨基酸和维生素。此外，可以向培养基中加入合适的前体。可以将所述原料以单独制剂形式加入到培养物中，或在培养过程中以合适方式补入。
对于培养物的pH控制，可以以合适的方式使用碱性化合物诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水、或酸性化合物诸如磷酸或硫酸。为了控制泡沫发生，可以使用消泡剂例如脂肪酸聚乙二醇酯。为了维持质粒的稳定性，可以将合适的选择作用物质例如抗生素加入到培养基中。为了维持好氧条件，可以将氧气或含氧气体混合物例如空气注入到培养基中。
根据本发明的方法的一个实施方案，这以两相系统进行，其包括：
A)水相，和
B)有机相，
其中由微生物在方法步骤II)中形成ω-官能化的羧酸或ω-官能化的羧酸酯在水相中发生，并且形成的ω-官能化的羧酸或ω-官能化的羧酸酯积累在有机相中。以这种方式，可以原位萃取形成的ω-官能化的羧酸或ω-官能化的羧酸酯。
用本发明的方法产生的优选的ω-官能化的羧酸或ω-官能化的羧酸酯是在本发明的微生物和本发明的用途的相关中作为优选提及的那些。
尤其优选的ω-官能化的羧酸或ω-官能化的羧酸酯是
ω-氨基羧酸和ω-氨基羧酸酯，尤其是ω-氨基月桂酸和ω-氨基月桂酸甲酯和ω-氨基月桂酸乙酯以及ω-氨基己酸和ω-氨基己酸甲酯和ω-氨基己酸乙酯，和
ω-羟基羧酸和ω-羟基羧酸酯，尤其是ω-羟基月桂酸和ω-羟基月桂酸甲酯和ω-羟基月桂酸乙酯以及ω-羟基己酸和ω-羟基己酸甲酯和ω-羟基己酸乙酯，和
ω-羧基羧酸和ω-羧基羧酸酯，尤其是ω-羧基月桂酸和ω-羧基月桂酸甲酯和ω-羧基月桂酸乙酯以及ω-羧基己酸和ω-羧基己酸甲酯和ω-羧基己酸乙酯。
哪种本发明的生物优选用于本发明对特定的ω-官能化羧酸或ω-官能化羧酸酯的优选方法中已经在本发明的微生物的相关中被强调。
本发明进一步的主题是生产基于ω-氨基羧酸的聚酰胺的方法，其包括以下方法步骤：
(a1) 生产ω-氨基羧酸或ω-氨基羧酸酯，其通过上文描述的用于生产ω-氨基羧酸的方法之一，尤其是通过上文描述的生产ω-氨基月桂酸、ω-氨基月桂酸甲酯、ω-氨基己酸或ω-氨基己酸甲酯和任选转化ω-氨基-羧酸酯为ω-氨基羧酸的方法；
(a2) 将ω-氨基羧酸聚合获得聚酰胺。
在本发明用于生产基于ω-氨基羧酸的聚酰胺的方法的方法步骤（a2）中，可以通过任何方法例如酸或碱催化的水解将ω-氨基羧酸酯转化为ω-氨基羧酸。
在本发明用于生产基于ω-氨基羧酸的聚酰胺的方法的方法步骤（a2）中，方法步骤（a1）中获得的ω-氨基羧酸，尤其是方法步骤（a1）中获得的ω-氨基月桂酸，转化为聚合的聚酰胺，其中任选还可以使用多种ω-氨基羧酸的混合物，其至少部分的ω-氨基羧酸、优选基于方法中使用的所有ω-氨基羧酸的至少50重量%，但还任选所有的ω-氨基羧酸均由本发明用于生产ω-氨基羧酸的方法来产生。
从ω-氨基羧酸生产聚酰胺可以在本身已知的方法中实现，例如描述于L. Notarbartolo, Ind. Plast. Mod. 10 (1958) 2, p.44, JP 01-074224, JP 01-051433, JP63286428, JP58080324或JP60179425中。
在以下呈现的实施例中，通过实施例来描述本发明，而不意在本发明（其申请范围从整个说明书和权利要求中得出）受实施例中提及的实施方案的限定。
实施例：
实施例1：产生来自湿地萼距花（Cuphea palustris）的基因fatB2、来自枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的基因ald和来自紫色色杆菌（Chromobacterium violaceum）的Cv_2025的表达载体
为了产生来自湿地萼距花的基因fatB2 (SEQ ID No.10)(酶Ei)、来自枯草芽孢杆菌的基因ald (SEQ ID No.11)(酶E3)和来自紫色色杆菌的基因Cv_2025 (SEQ ID No.12)(酶E2)的大肠杆菌表达载体，将这些基因连续克隆入载体pJ294 (DNA2.0 Inc., Menlo Park, CA, USA)中。将基因Cv_2025与lacUV5启动子和来自球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericus）的基因ald一同合成，并同时引入在启动子上游的切割位点和在终止子下游的切割位点。将合成的DNA片段Plac UV5-ald_Bsp_TA_C.v.(Ct) (SEQ ID No.13)用限制性内切核酸酶PstI和XbaI消化并连接入相应切割的载体pJ294中。将完成的大肠杆菌表达载体命名为pJ294_alaD_Bsp_TA_C.v.(Ct) (SEQ ID No.14)。在该载体中，将球形芽孢杆菌ald基因由来自枯草芽孢杆菌的ald基因替换。通过PCR从菌株枯草芽孢杆菌菌株168的染色体DNA上扩增基因ald。其中使用以下寡核苷酸：
Figure 509498DEST_PATH_IMAGE279
以下参数用于PCR：1 x: 起始变性, 98°C, 0:30 min; 35 x: 变性, 98°C, 0:10 min, 退火, 65°C, 0:30 min; 延伸, 72°C, 0:20 min; 1 x: 末端延伸, 72°C, 10 min。对于扩增，按照制造商推荐，使用来自New England Biolabs (Frankfurt)的Phusion™ High-Fidelity Master Mix。随后将50 µl的每种PCR反应产物在1% TAE琼脂糖凝胶上分离。PCR、琼脂糖凝胶电泳、DNA的溴化乙啶染色和PCR片段大小的确定均以本领域技术人员已知的方式进行。PCR片段显示出1137个碱基对的预期大小，并用来自Qiagen (Hilden)的Quick PCR Purification Kit按照制造商说明书从PCR制剂中纯化。为了连接PCR产物与载体，通过多核苷酸激酶(New England Biolabs, Frankfurt)将5'-磷酸连到PCR产物上。为此，按照制造商推荐进行。
将载体用限制性内切核酸酶HindIII和NdeI消化，由此去除包含的基因球形芽孢杆菌ald。将限制性消化的制剂在1％ TAE琼脂糖凝胶上分离。能够鉴定到大小为5696 bp和1124 bp两条带。为了从琼脂糖凝胶上分离载体DNA，将5696 bp的DNA条带用手术刀从凝胶中分离并使用Qiagen (Hilden)的Quick Gel Extraction Kit按照制造商说明书纯化。为了产生平端，将纯化的载体DNA的5'突出端用DNA聚合酶I的Klenow片段 (New England Biolabs, Frankfurt)填平。为此，按照制造商推荐进行。将具有5'磷酸残基的DNA片段枯草芽孢杆菌ald连接入具有平端的载体中。将完成的大肠杆菌表达载体命名为pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) (SEQ ID No.17)。
为了产生完整的表达载体，将来自湿地萼距花的基因 fatB2 对在大肠杆菌中表达进行密码子优化。将基因与tac启动子(DNA 2.0; Menlo Park, CA, USA)一同合成，并同时引入在启动子上游的切割位点和在终止子下游的切割位点。将合成的DNA片段Ptac -CpFatB2 (SEQ ID No.18)用限制性内切核酸酶BamHI和NotI消化并连接入相应切割的载体pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)和载体pJ294中。将完成的载体命名为pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CpFATB2] (SEQ ID No.19)和pJ294[Ptac-CpFATB2_optEc] (SEQ ID No.20)。
实施例2：产物基于LC-ESI/MS2的定量
发酵样品中月桂酸甲酯LSME、ω-羟基月桂酸甲酯 HLSME、ω-氧代月桂酸甲酯 OLSME、ω-氨基月桂酸甲酯ALSME和ω-羧基月桂酸甲酯DDSME、ω-氨基月桂酸 ALS、ω-羧基月桂酸 DDS、月桂酸LS、ω-羟基月桂酸 HLS和ω-氧代月桂酸 OLS的定量通过LC-ESI/MS2根据对所有分析物的外部校准并使用内标氨基十一烷酸(AUD)来实现。
为此，使用以下仪器：
• 具有自动取样器(G1367E)、二元泵(G1312B)和柱加热器(G1316A)的HPLC单元1260 (Agilent; Böblingen)
• 具有ESI源的质谱仪TripelQuad 6410 (Agilent; Böblingen)
• HPLC柱:Kinetex C18, 100 x 2.1 mm, 颗粒大小:2.6 µm, 孔径100 Å (Phenomenex; Aschaffenburg)
• 预柱：KrudKatcher Ultra HPLC串联滤器; 0.5 µm滤器深度和0.004 mm内径(Phenomenex; Aschaffenburg)。
将样品通过吸取1900 µL溶剂(丙酮/ 0.1 N HCl混合物= 1:1)和100 µL样品至2 mL反应器内来制备。将混合物涡旋大概10秒，并随后在大概13000 rpm下离心5分钟。用移液器吸取澄清的上清液，并在用稀释剂(80% (v/v) ACN, 20% 双蒸水(v/v), + 0.1% 甲酸)适当稀释后分析。用移液器将100 µL的ISTD加入到每一900 µL样品中(10 µL在90 µL的样品体积中)。
用上述柱或预柱实现HPLC分离。注射体积为0.7 µl，柱温为50°C，并且流速为0.6 ml/min。流动相由洗脱液A(0.1% (v/v)甲酸水溶液)和洗脱液B (含0.1% (v/v)甲酸的乙腈)组成。使用以下梯度概况
在正极模式中用以下ESI源参数实现ESI-MS2分析：
• 气体温度280°C
• 气体流速11 l/min
• 雾化器压力50 psi
• 毛细管电压4000 V。
各种化合物的检测和定量用以下参数实现，其中在每种情况下将一种产物离子用作定性物并将一种产物离子用作定量物：
实施例 3 ：通过大肠杆菌菌株生产氨基月桂酸，所述大肠杆菌菌株缺失基因fadE并具有来自湿地萼距花的基因fatB2、来自枯草芽孢杆菌的ald和来自紫色色杆菌的Cv_2025的表达载体，并组合有来自恶臭假单胞菌的alk操纵子的基因alkB、alkG、alkT和alkL的表达载体。
所用的宿主菌大肠杆菌JW5020-1 (CGSC, The coli genetic stock center, Yale University, New Haven, USA)是携带有基因fadE (编码酶Eb)缺失的大肠杆菌BW25113的衍生物。将fadE基因由卡那霉素盒置换。在提供具有表达载体的菌株前，以本领域技术人员已知的方式(见Datsenko K.A. and Wanner B.L. (2000) PNAS 97(12):6640-6645)，使用编码Flp重组酶的辅助质粒将其去除，产生大肠杆菌菌株JJW5020-1 KanS。为了产生具有湿地萼距花的基因fatB2 (酶Ei)、枯草芽孢杆菌的基因ald(酶E3)和紫色色杆菌的基因Cv_2025(酶E2)的表达载体并组合有来自恶臭假单胞菌GPo1的alk操纵子的基因alkB (酶E1a)、alkG 、 alkT (酶E1b的辅助酶)和alkL (编码alkL基因产物)的表达载体pBT10_alkL (序列和产生：比较PCT/EP2011/053834的实施例1和那里列出的Seq ID No.8)的大肠杆菌，产生大肠杆菌JW5020-1 KanS的电感受态细胞。这以本领域技术人员已知的方式进行。将其用质粒pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CpFATB2]和pBT10_alkL转化并铺板至含有氨苄青霉素(100 µg/ml)和卡那霉素(50 µg/ml)的LB琼脂板上。通过质粒制备和分析性限制性分析来检查转化子中正确质粒的存在。以这种方式，构建以下菌株：大肠杆菌JW5020-1 KanS pBT10_alkL / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CpFATB2]。
将该菌株进行供料分批发酵，以分析它从葡萄糖生产氨基月桂酸的能力。待检测的菌株首先从甘油培养物中在含有100 µg/ml氨苄青霉素和50 µg/ml卡那霉素的M9培养基中作为预培养物在37℃过夜生长。用25％的氢氧化铵溶液调节培养基至pH 7.4，所述培养基由38 mM二水磷酸氢二钠、22 mM磷酸二氢钾、8.6 mM氯化钠、37 mM氯化铵、1.5%（w/v）葡萄糖、2 mM七水硫酸镁（所有物质均来自于Merck, Darmstadt）和0.5% (v/v)微量元素溶液组成。所加入的微量元素溶液由溶于37%的盐酸中的9.7 mM四水氯化锰(II)、6.5 mM七水硫酸锌、2.5 mM EDTA钠(Titriplex III)、4.9 mM硼酸、1 mM二水钼酸钠、32 mM二水氯化钙、64 mM七水硫酸铁(II)和0.9 mM二水氯化铜(II)组成（所有物质均来自于Merck, Darmstadt），其在加入M9培养基前过滤灭菌。用预培养物接种发酵罐，从而达到0.06的光密度。培养在用25％氨水和0.5 M硫酸调节的pH 6.8下，经在发酵起始时800 rpm/min的搅拌速度和0.4 vvm/min的送气调节的20％氧分压下，和37°C的温度下实现。葡萄糖供料在培养基中存在的葡萄糖消耗后基于初始体积以5 g/l/h的供料速率进行。9小时发酵后葡萄糖供料开始时，将温度调整至30°C。葡萄糖供料开始后2小时通过加入1 mM的异丙基-β-D-半乳糖苷和0.025%双环丙基酮诱导基因表达。在保持相同的条件下将菌株再培养49小时。培养过程中，取出1 ml样品并通过实施例2中描述的方法对脂肪酸和ω-官能化的脂肪酸的浓度定量。结果显示于下文的表中。
c 月桂酸 [mg/l] c 羧基月桂酸[mg/l] c 羟基月桂酸[mg/l] c 氨基月桂酸[mg/l]
56.5 16.0 54.4 22.8
用大肠杆菌JW5020-1 KanS pBT10_alkL / pJ294[alaDH_Bs_TAcv(ct_Ptac-CpFATB2]生产ω-官能化的脂肪酸。给出60小时发酵后的月桂酸、ω-羧基-月桂酸、ω-羟基月桂酸和ω-氨基月桂酸的浓度。
实施例4：产生来自大肠杆菌的基因fadD和来自不动杆菌属种ADP1（Acinetobacter sp. ADP1）的基因atfA的大肠杆菌表达载体
为了产生在tac启动子控制下的来自大肠杆菌的基因fadD (SEQ ID No.21)(编码酶Evi) 和来自不动杆菌属种ADP1的具有终止子的atfA(SEQ ID No.22) (编码酶Ev) 的大肠杆菌表达载体， 将这些基因分别通过PCR从大肠杆菌W3110和醋酸钙不动杆菌ADP1的染色体DNA扩增，并引入同源区用于重组克隆。从pJ294衍生物(DNA 2.0; Menlo Park, CA, USA)通过核糖体结合位点扩增合成tac启动子(SEQ ID No.: 23)，并引入同源区。通过DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden)，按照制造商说明书完成从大肠杆菌W3110和醋酸钙不动杆菌ADP1制备染色体DNA。在用大肠杆菌W3110和醋酸钙不动杆菌ADP1的染色体DNA分别作为基质扩增来自大肠杆菌的基因fadD和来自不动杆菌属种ADP1的基因atfA中，以及在扩增来自pJ294衍生物的合成Ptac启动子中，使用以下寡核苷酸：
Figure 249604DEST_PATH_IMAGE283
以下参数用于PCR：1 x: 初始变性, 103°C, 3:00 mins; 35 x: 变性, 98°C, 0:10 mins, 退火, 65°C, 0:15 min; 延伸, 72°C, 0:45 mins; 1 x: 终点变性, 72°C, 10 mins。对于扩增，按照制造商推荐，使用来自New England Biolabs (Frankfurt)的Phusion™ High-Fidelity Master Mix。随后将50 µl的每种PCR反应产物在1% TAE琼脂糖凝胶上分离。PCR、琼脂糖凝胶电泳、DNA的溴化乙啶染色和PCR片段大小的确定均以本领域技术人员已知的方式进行。
在所有情况下，能够扩增到预期大小的PCR片段。这些是：对于启动子区 Ptac 为607 bp, 对于fadD 为1778 bp 并且对于atfA 为1540 bp。
为了从琼脂糖凝胶上分离DNA，将目标DNA用手术刀从凝胶中分离并使用Qiagen (Hilden)的Quick Gel Extraction Kit按照制造商说明书纯化。使用Invitrogen (Darmstadt)的Geneart Seamless Cloning and Assembly Kit通过体外克隆将纯化的PCR产物与EcoNI/NdeI切割的载体pCDFDuetTM-1 (71340-3, Merck, Darmstadt)进行重组。该使用按照制造商推荐。pCDFDuet-1是导入生物中壮观霉素/链霉素抗性并且携带ColDF13复制起点的大肠杆菌载体。以本领域技术人员已知的方式实现化学感受态大肠杆菌DH5α细胞(New England Biolabs, Frankfurt)的转化。
通过用XbaI限制性分析检查质粒的正确性。通过DNA测序检查插入片段的可靠性。将完成的大肠杆菌表达载体命名为pCDF[fadD-atfA] (SEQ ID No.30)。
实施例5：通过大肠杆菌菌株生产氨基月桂酸甲酯和氨基月桂酸乙酯，所述大肠杆菌菌株缺失基因fadE并具有来自湿地萼距花的基因fatB2、来自枯草芽孢杆菌的ald和来自紫色色杆菌的Cv_2025的表达载体，并组合有来自恶臭假单胞菌的alk操纵子的基因alkB、alkG、alkT和alkL的表达载体和来自大肠杆菌的基因fadD和来自不动杆菌属种ADP1的基因atfA的表达载体。
为了产生这样的大肠杆菌菌株，其具有来自湿地萼距花的基因fatB2 (编码酶Ei)、来自枯草芽孢杆菌的ald (编码酶E3)和来自紫色色杆菌的Cv_2025 (编码酶E2)的表达载体，并组合有来自恶臭假单胞菌GPo1的alk操纵子的基因alkB (编码酶E1b)、alkG、alkT (编码E1b的辅助酶)和alkL (编码alkL基因产物)的表达载体和来自大肠杆菌的基因fadD (编码酶Evi)和来自不动杆菌属种ADP1 (编码酶Ev)的基因atfA的表达载体，产生大肠杆菌JW5020-1 KanS的电感受态细胞。这以本领域技术人员已知的方式进行。大肠杆菌JW5020-1 KanS是大肠杆菌JW5020-1 (CGSC, The coli genetic stock center, Yale University, New Haven, USA)的衍生物，并且这依次是携带有基因fadE (编码酶Eb)缺失的大肠杆菌BW25113的衍生物。将fadE基因由卡那霉素盒置换。在提供具有表达载体的菌株前，以本领域技术人员已知的方式(见Datsenko K.A. and Wanner B.L. (2000) PNAS 97(12):6640-6645)，使用编码Flp重组酶的辅助质粒将其去除，产生大肠杆菌菌株JJW5020-1 KanS。连续用质粒pBT10_alkL、pCDF[fadD-atfA]和pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CpFATB2]转化大肠杆菌JW5020-1 KanS和大肠杆菌W3110 △fadE (构建描述于实施例8中)，并铺板至含有卡那霉素(50 µg/ml)、壮观霉素(100 µg/ml)和氨苄青霉素(100 µg/ml)的LB琼脂板上。通过质粒制备和分析性限制性分析来检查转化子中正确质粒的存在。以这种方式，构建以下菌株：大肠杆菌JW5020-1 KanS pBT10_alkL / pCDF[fadD-atfA] / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CpFATB2]和大肠杆菌W3110 △fadE pBT10_alkL / pCDF[fadD-atfA] / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CpFATB2]。
将该菌株进行供料分批发酵，以分析它从葡萄糖生产氨基月桂酸甲酯和氨基月桂酸乙酯的能力。待检测的菌株首先从甘油培养物中在37°C下在含有卡那霉素(50 µg/ml)、壮观霉素(100 µg/ml)和氨苄青霉素(100 µg/ml)的M9培养基中作为预培养物生长。用25％的氢氧化铵溶液调节培养基至pH 7.4，所述培养基由38 mM二水磷酸氢二钠、22 mM磷酸二氢钾、8.6 mM氯化钠、37 mM氯化铵、1.5%（w/v）葡萄糖、2 mM七水硫酸镁（所有物质均来自于Merck, Darmstadt）和0.5% (v/v)微量元素溶液组成。所加入的微量元素溶液由溶于37%的盐酸中的9.7 mM四水氯化锰(II)、6.5 mM七水硫酸锌、2.5 mM EDTA钠(Titriplex III)、4.9 mM硼酸、1 mM二水钼酸钠、32 mM二水氯化钙、64 mM七水硫酸铁(II)和0.9 mM二水氯化铜(II)组成（所有物质均来自于Merck, Darmstadt），其在加入M9培养基前过滤灭菌。用预培养物接种发酵罐，从而达到0.2的光密度。培养在用25％氨水和0.5 M硫酸调节的pH 6.8下，经搅拌速度和送气调节的氧分压下，和37°C的温度下实现。葡萄糖供料在培养基中存在的葡萄糖消耗后基于初始体积以5 g/l/h的供料速率实现。葡萄糖供料开始时，将温度调整至30°C。葡萄糖供料开始后2小时通过加入1 mM的异丙基-β-D-半乳糖苷和0.025%双环丙基酮诱导基因表达。诱导同时，加入2% (v/v)甲醇或2% (v/v)乙醇作为脂肪酸酯化的甲基供体或乙基供体。在保持相同的条件下将菌株至少再培养48小时。培养过程中，取出1 ml样品并通过实施例2中描述的方法定量脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯、ω-官能化的脂肪酸甲酯和ω-官能化的脂肪酸乙酯的浓度。显示出菌株大肠杆菌JW5020-1 KanS pBT10_alkL / pCDF[fadD-atfA] / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CpFATB2]和大肠杆菌W3110 △fadE pBT10_alkL / pCDF[fadD-atfA] / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CpFATB2]分别能够形成月桂酸甲酯、ω-羟基月桂酸甲酯、ω-氧代月桂酸甲酯、ω-氨基月桂酸甲酯和ω-羧基月桂酸甲酯（加入2% (v/v)甲醇时）以及月桂酸乙酯、ω-羟基月桂酸乙酯、ω-氧代月桂酸乙酯、ω-氨基月桂酸乙酯和ω-羧基月桂酸乙酯 （加入2% (v/v)乙醇时）。
实施例6：产生来自加州月桂（Umbellularia californica）的基因synUcTE、来自枯草芽孢杆菌的基因ald和来自紫色色杆菌的Cv_2025的表达载体
为了产生来自加州月桂的基因synUcTE (SEQ ID No.31)(编码酶Ei)、来自枯草芽孢杆菌的ald (SEQ ID No.33)(编码酶E3)和来自紫色色杆菌的Cv_2025 (SEQ ID No.35)(编码酶E2)的大肠杆菌表达载体，将基因synUcTE对在大肠杆菌中表达进行密码子优化，并与tac启动子(SEQ ID No.37)一同合成。合成过程中，引入启动子上游的切割位点和终止子下游的切割位点。将合成的DNA片段Ptac -synUcTE用限制性内切核酸酶BamHI和NotI消化并连接入相应切割的载体pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) (SEQ ID No.17)和载体pJ294 (DNA2.0 Inc., Menlo Park, CA, USA)中。将完成的载体命名为pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID No.38)和pJ294[Ptac-synUcTE] (SEQ ID No.39)。
实施例7：产生来自大肠杆菌的基因fadD和来自不动杆菌属种ADP1的基因wax-dgaT和来自泊库岛食烷菌(Alcanivorax borkumensis)的基因atfA1的表达载体
为了分别产生来自大肠杆菌的基因fadD (SEQ ID No.21)和来自不动杆菌属种ADP1的wax-dgaT (SEQ ID No.42) (编码酶Ev)和来自泊库岛食烷菌SK2的atfA1 (SEQ ID No.44) (编码酶Ev)的表达载体，将基因wax-dgaT和atfA1对在大肠杆菌中表达进行密码子优化，并与来自大肠杆菌的基因fadD (编码酶Evi)组合合成。扩增合成的DNA片段wax-dgaT_AsADP1-fadD_Ec (SEQ ID No.46)和atfA1_Ab-fadD_Ec (SEQ ID No.47)，并并入用于重组克隆的同源区。
为了扩增片段wax-dgaT_AsADP1-fadD_Ec，使用以下寡核苷酸：
Figure 267425DEST_PATH_IMAGE285
为了扩增片段atfA1_Ab-fadD_Ec，使用以下寡核苷酸：
Figure 443191DEST_PATH_IMAGE286
以下参数用于PCR：1 x: 初始变性, 98°C, 0:30 mins; 35 x: 变性, 98°C, 0:10 min, 退火, 70°C, 0:20 min; 延伸, 72°C, 1 min; 1 x: 末端延伸, 72°C, 10 min。对于扩增，按照制造商推荐，使用来自New England Biolabs (Frankfurt)的Phusion™ High-Fidelity Master Mix。随后将50 µl的每种PCR反应产物在1% TAE琼脂糖凝胶上分离。PCR、琼脂糖凝胶电泳、DNA的溴化乙啶染色和PCR片段大小的确定均以本领域技术人员已知的方式进行。在两种情况下，能够扩增到预期大小的PCR片段。对于wax-dgaT_AsADP1-fadD_Ec为3192个碱基对，并且对于 atfA1_Ab-fadD_Ec为3189个碱基对。对于从琼脂糖凝胶上分离DNA，将目标DNA用手术刀从凝胶中切出并使用QiaQuick凝胶提取试剂盒按照制造商说明书(Qiagen, Hilden)纯化。使用Geneart® Seamless Cloning and Assembly Kit按照制造商说明书(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)，将纯化的PCR产物通过重组克隆入NdeI和XhoI切割的pCDF衍生物中，该衍生物已含有合成的tac启动子(SEQ ID No. 50)。以本领域技术人员已知的方式实现化学感受态大肠杆菌DH5α (New England Biolabs, Frankfurt)的转化。通过限制性分析检验目标基因的正确插入，并通过DNA测序确定并入基因的可靠性。将获得的表达载体命名为pCDF[wax-dgaT_AsADP1(co_Ec)-fadD_Ec] (SEQ ID No.48)和pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec] (SEQ ID No.49)。
实施例8：通过大肠杆菌菌株生产氨基月桂酸甲酯，所述大肠杆菌菌株缺失基因fadE并具有来自加州月桂的基因synUcTE、来自枯草芽孢杆菌的ald和来自紫色色杆菌的Cv_2025的表达载体，并组合有来自恶臭假单胞菌的alk操纵子的基因alkB、alkG、alkT和alkL的表达载体和来自大肠杆菌的基因fadD和来自不动杆菌属种ADP1的基因wax-dgaT或来自泊库岛食烷菌的基因atfA1的表达载体
首先，构建缺失基因fadE (SEQ ID No.40)的大肠杆菌菌株。为了产生基因缺失，构建携带有DNA序列△fadE (SEQ ID No. 55)的质粒。合成该序列，其由fadE基因的上游和下游的同源区500个碱基对和在5'和3'端限制性内切核酸酶NotI的识别序列组成。将序列△fadE用限制性内切核酸酶NotI消化并连接至相应切割的载体pKO3中。使用pKO3-△fadE 构建体(SEQ ID No. 56)用本领域技术人员已知的方法(见Link AJ, Phillips D, Church GM. J.Bacteriol. 1997. 179(20))构建菌株大肠杆菌W3110 △fadE 。缺失后fadE的DNA序列在SEQ ID No.57中复制。
为了产生具有来自加州月桂的基因synUcTE、来自枯草芽孢杆菌的ald和来自紫色色杆菌的Cv_2025的表达载体，并组合有来自恶臭假单胞菌GPo1的alk操纵子的基因alkB (酶E1a)、alkG 、 alkT (酶E1b的辅助酶)和alkL (编码alkL的基因产物)的表达载体和来自大肠杆菌的基因fadD和来自不动杆菌属种ADP1的基因wax-dgaT或来自泊库岛食烷菌SK2的基因atfA1的表达载体的大肠杆菌菌株，产生大肠杆菌W3110 △fadE的电感受态细胞。这以本领域技术人员已知的方式进行。连续用质粒pBT10_alkL (序列和产生: 比较PCT/EP2011/053834的实施例1和其中列出的Seq ID No.8)、pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID No.38)和pCDF[wax-dgaT_AsADP1(co_Ec)-fadD_Ec] (SEQ ID No.48)和pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec] (SEQ ID No.49)分别转化大肠杆菌W3110 △fadE，并铺板至含有卡那霉素(50 µg/ml)、氨苄青霉素(100 µg/ml)和壮观霉素(100 µg/ml)的LB琼脂板上。
通过质粒制备和分析性限制性分析来检查转化子中正确质粒的存在。以这种方式，构建以下菌株：
将该菌株进行供料分批发酵，以分析它从葡萄糖生产羟基月桂酸甲酯、氧代月桂酸甲酯、羧基月桂酸甲酯和氨基月桂酸甲酯的能力。这用来自DASGIP的8倍平行发酵系统来进行。
对于发酵，使用1L反应器，其装备有顶置式搅拌器和叶轮涡轮。为了工艺监测，在线测量pH和pO2。尤其是使用OTR/CTR测量来估计细胞的代谢选择性和适合性。
pH探针按照DASGIP的技术手册用pH 4.0和pH 7.0的标准溶液两点校准来进行校准。反应器按照技术手册装备有必要的传感器和线路以及安装了搅拌器轴。它们装有300 mL水并在121°C下高压灭菌20分钟以确保无菌。随后，pO2探针在与测量强化器连接后极化过夜。随后，将水在净化台上取出，并通过高细胞密度培养基（其由(NH4)2SO4 1.76 g/L、K2HPO4 19.08 g/L、KH2PO4 12.5 g/L、酵母提取物6.66 g/L、二水合柠檬酸三钠11.2g、17mL /L的单独高压灭菌的1%柠檬酸铁铵溶液、和5 mL/L的单独高压灭菌的微量元素母液(由HCl (37%) 36.50 g/L、MnCl2*4H2O 1.91 g/L、ZnSO4*7H2O 1.87 g/L、二水合乙二胺四乙酸0.84 g/L、H3BO3 0.30 g/L、Na2MoO4*2H2O 0.25 g/L、CaCl2*2H2O 4.70 g/L、FeSO4*7H2O 17.80 g/L、CuCl2*2H2O 0.15 g/L组成)组成，还含有15 g/L葡萄糖作为碳源（通过计量加入30 mL/L的单独高压灭菌的供料溶液混入，所述供料溶液由500 g/L葡萄糖、1% (w/v) MgSO4*7H2O和2.2% (w/v) NH4Cl组成），并含有100 mg/L氨苄青霉素、50 mg/L卡那霉素和100 mg/L壮观霉素）替换。
下文中，将pO2探针用单点校准（搅拌器：600 rpm / 通气: 10 sL/h空气）进行校准，并且按照技术手册利用原地清理（Cleaning-in-Place）清理供料段、校正剂段和诱导剂段。为此，将管用70％乙醇，随后用1 M NaOH，随后用无菌的去矿物质水冲洗，并最终用各种培养基装满。
来自低温培养物的菌株W3110 △fadE pJ294[alaDH_Bs/TAcv(ct)]{Ptac}[synUcTE] pBT10_alkL pCDF[atfA_AsADP1(co_Ec)/fadD]和W3110 △fadE pJ294[alaDH_Bs/TAcv(ct)]{Ptac}[synUcTE] pBT10_alkL pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)/fadD]首先在含有100 mg/L氨苄青霉素、50 mg/L卡那霉素和100 mg/L壮观霉素的LB培养基（25 mL在100 mL的挡板烧瓶中）中在37°C和200 rpm下过夜生长大约18小时。随后，将2 mL该培养物转移至第二预培养阶段的25 mL高细胞密度培养基中，该培养基由(NH4)2SO4 1.76 g/L、K2HPO4 19.08 g/L、KH2PO4 12.5 g/L、酵母提取物6.66 g/L、二水合柠檬酸三钠11.2g、17mL /L的单独高压灭菌的1%柠檬酸铁铵溶液、和5 mL/L的单独高压灭菌的微量元素母液(由HCl (37%) 36.50 g/L、MnCl2*4H2O 1.91 g/L、ZnSO4*7H2O 1.87 g/L、二水合乙二胺四乙酸0.84 g/L、H3BO3 0.30 g/L、Na2MoO4*2H2O 0.25 g/L、CaCl2*2H2O 4.70 g/L、FeSO4*7H2O 17.80 g/L、CuCl2*2H2O 0.15 g/L组成)组成，并含有15 g/L葡萄糖作为碳源（通过计量加入30 mL/L的单独高压灭菌的供料溶液混入，所述供料溶液由500 g/L葡萄糖、1% (w/v) MgSO4*7H2O和2.2% (w/v) NH4Cl组成）并含有已经描述的在100 mL摇瓶中的抗生素，并再次在37°C / 200 rpm再培养6小时。
为了用0.1的光密度接种反应器，测量第二预培养阶段的OD，并计算接种所需的培养物的量。利用5 mL注射器通过隔膜将培养物所需的量加入到调温且充气的反应器内。
使用以下标准程序：
Figure 655046DEST_PATH_IMAGE289
Figure 716543DEST_PATH_IMAGE291
描述
灵敏的引发 31% DO (1/60h)
诱导IPTG 供料开始后2小时
供料引发 50% DO
供料速率 3 [mL/h]
用12.5%氨溶液将pH调节为pH 6.8。生长和生物转化过程中，经搅拌器转数和通气速率将培养物中的溶解氧(pO2或DO)调解为至少30％。接种后，DO从100％掉至该30％，其中它在发酵的剩余过程中保持稳定。
发酵作为供料分批进行，其中作为供料阶段的开始，用由500 g/L葡萄糖、1% (w/v) MgSO4*7H2O和2.2% (w/v) NH4Cl组成的5 g/Lh葡萄糖物料，经表明分批阶段结束的DO峰引发供料开始。供料开始时，温度还从37°C降至30°C。
在该时刻，向反应器中加入24 mL油酸、油酸/十六烷(1:1 (w/w))或2-己基癸酸/十六烷混合物(1:1 (w/w))。供料开始后2小时，通过在反应器中自动加入已制备的IPTG溶液至1 mM最终浓度，诱导来自大肠杆菌的基因fadD和来自不动杆菌属种ADP1的基因atfA或来自泊库岛食烷菌SK2的基因atfA1的表达。该IPTG溶液还含有3 mL甲醇，其对于产生的脂肪酸的酯化是必需的。通过在供料开始后10小时手动加入0.025% (v/v) DCPK实现alkBGT基因的诱导。
在培养过程中，取出样品并用下文描述的方法定量脂肪酸和ω-官能化的脂肪酸的浓度。对于取样，从容器中取出2 mL发酵液，并将其一部分在乙腈-甲酸混合物(80% (v/v)水中的乙腈; 0.1% (v/v)甲酸)中稀释1/10。
发酵样品中的月桂酸甲酯LSME、ω-羟基月桂酸甲酯 HLSME、ω-氧代月桂酸甲酯 OLSME、ω-氨基月桂酸甲酯ALSME和ω-羧基月桂酸甲酯DDSME、ω-氨基月桂酸 ALS、ω-羧基月桂酸 DDS、月桂酸LS, ω-羟基月桂酸 HLS和ω-氧代月桂酸 OLS的定量通过LC-ESI/MS2基于对所有分析物的外部校准(0.1–50 mg/L)并利用内标氨基十一酸(AUD)、d4-ALSME、13C-DDSME和d3-LSME来进行。
为此，使用以下仪器：
• 具有自动取样器(G1367E)、二元泵(G1312B)和柱加热器(G1316A)的HPLC单元1260 (Agilent; Böblingen)
• 具有ESI源的质谱仪TripelQuad 6410 (Agilent; Böblingen)
• HPLC柱:Kinetex C18, 100 x 2.1 mm, 颗粒大小:2.6 µm, 孔径100 Å (Phenomenex; Aschaffenburg)
• 预柱：KrudKatcher Ultra HPLC串联滤器; 0.5 µm滤器深度和0.004 mm内径(Phenomenex; Aschaffenburg)。
通过移液器吸取1900 µL溶剂(80% (v/v) ACN, 20% 双蒸水(v/v), + 0.1%甲酸)和100 µL样品至2 mL反应容器中来制备样品。将混合物涡旋大概10秒，并随后在大概13000 rpm下离心5分钟。用移液器吸取澄清的上清液，并在用稀释剂(80% (v/v) ACN, 20% 双蒸水(v/v), + 0.1% 甲酸)适当稀释后分析。用移液器将100 µL的ISTD加入到每一900 µL样品中(10 µL在90 µL的样品体积中)。
用上述柱或预柱实现HPLC分离。注射体积为0.7 µL，柱温为50°C，并且流速为0.6 ml/min。流动相由洗脱液A(0.1% (v/v)甲酸水溶液)和洗脱液B (含0.1% (v/v)甲酸的乙腈)组成。使用以下梯度概况
在正极模式中用以下ESI源参数实现ESI-MS2分析：
• 气体温度280°C
• 气体流速11 L/min
• 雾化器压力50 psi
• 毛细管电压4000 V。
各种化合物的检测和定量用以下参数实现，其中在每种情况下将一种产物离子用作定性物并将一种产物离子用作定量物：
Figure 475738DEST_PATH_IMAGE294
显示在加入1% (v/v)甲醇时，菌株大肠杆菌W3110 △fadE pBT10_alkL / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] / pCDF[wax-dgaT_AsADP1(co_Ec)-fadD_Ec]和大肠杆菌W3110 △fadE pBT10_alkL / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] / pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec]能够形成月桂酸甲酯、ω-羟基月桂酸甲酯、ω-氧代月桂酸甲酯、ω-氨基月桂酸甲酯和ω-羧基月桂酸甲酯。此外，能够显示在这些条件下，两种菌株还形成月桂酸、ω-羟基月桂酸、ω-氧代月桂酸、ω-氨基月桂酸和ω-羧基月桂酸。
ω-官能化的脂肪酸甲酯的产生。给出了38.33小时发酵时间后月桂酸甲酯、ω-羧基月桂酸甲酯、ω-羟基月桂酸甲酯、ω-氧代月桂酸甲酯和ω-氨基-月桂酸甲酯的浓度。
Figure 566054DEST_PATH_IMAGE295
实施例9：通过大肠杆菌菌株生产氨基月桂酸甲酯，所述大肠杆菌菌株缺失基因fadE并具有来自加州月桂的基因synUcTE、来自枯草芽孢杆菌的ald和来自紫色色杆菌的Cv_2025的表达载体，并组合有来自恶臭假单胞菌的alk操纵子的基因alkB、alkG和alkT的表达载体和来自大肠杆菌的基因fadD和来自不动杆菌属种ADP1的基因wax-dgaT或来自泊库岛食烷菌的基因atfA1的表达载体
为了产生具有来自加州月桂的基因synUcTE、来自枯草芽孢杆菌的ald和来自紫色色杆菌的Cv_2025的表达载体，并组合有来自恶臭假单胞菌GPo1的alk操纵子的基因alkB 、alkG和alkT的表达载体和来自大肠杆菌的基因fadD和来自不动杆菌属种ADP1的基因wax-dgaT或来自泊库岛食烷菌SK2的基因atfA1 的表达载体的大肠杆菌菌株，产生大肠杆菌W3110 △fadE（构建描述于实施例8中）的电感受态细胞。这以本领域技术人员已知的方式进行。连续用质粒pBT10 (构建描述于PCT/EP2008/067447的实施例B.2中)、pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID No.5)和pCDF[wax-dgaT_AsADP1(co_Ec)-fadD_Ec] (SEQ ID No.16)或pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec] (SEQ ID No.17)分别转化大肠杆菌W3110 △fadE，并铺板至含有卡那霉素(50 µg/ml)、氨苄青霉素(100 µg/ml)和壮观霉素(100 µg/ml)的LB琼脂板。通过质粒制备和分析性限制性分析来检查转化子中正确质粒的存在。以这种方式，构建以下菌株：
将该菌株进行供料分批发酵，以分析它从葡萄糖生产羟基月桂酸甲酯、氧代月桂酸甲酯、羧基月桂酸甲酯和氨基月桂酸甲酯的能力。如实施例8中描述，这用来自DASGIP的8倍平行发酵系统进行。
显示在加入1% (v/v)甲醇时，菌株大肠杆菌W3110 △fadE pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] / pCDF[wax-dgaT_AsADP1(co_Ec)-fadD_Ec]和大肠杆菌W3110 △fadE pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] / pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec]能够形成月桂酸、月桂酸甲酯、ω-羟基月桂酸甲酯、ω-氧代月桂酸甲酯、ω-氨基月桂酸甲酯和ω-羧基月桂酸甲酯。
实施例10：通过大肠杆菌菌株产生氨基己酸甲酯、氨基辛酸甲酯、氨基癸酸甲酯、氨基十四酸甲酯和氨基-9-十六碳烯酸甲酯，所述大肠杆菌菌株不缺失fad基因但缺失基因fadA、fadB、fadD、fadE或fadL之一，并具有来自加州月桂的基因synUcTE、来自萼距花的基因ChFATB2、来自椰子的基因CnFATB3或来自产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）的基因CPF_2954和来自枯草芽孢杆菌的基因ald和来自紫色色杆菌的基因Cv_2025的表达载体，并组合有来自恶臭假单胞菌的alk操纵子的基因alkB、alkG和alkT的表达载体和来自大肠杆菌的基因fadD和来自不动杆菌属种ADP1的基因wax-dgaT或来自泊库岛食烷菌的基因atfA1的表达载体
为了产生具有来自加州月桂的基因synUcTE、来自萼距花的基因ChFATB2 (SEQ ID No.58)、来自椰子的基因CnFATB3 (SEQ ID No.60)或来自产气荚膜梭菌的基因CPF_2954 (SEQ ID No.62)和来自枯草芽孢杆菌的基因ald和来自紫色色杆菌的基因Cv_2025的表达载体，并组合有来自恶臭假单胞菌GPo1的alk操纵子的基因alkB 、 alkG和alkT的表达载体和来自大肠杆菌的基因fadD和来自不动杆菌属种ADP1的基因wax-dgaT或来自泊库岛食烷菌SK2的基因atfA1的表达载体的大肠杆菌菌株，产生大肠杆菌BW25113、JW5578-1 KanS、JW3822-1 KanS、JW1794-1 KanS、JW5020-1 KanS和JW2341-1 KanS的电感受态细胞。这以本领域技术人员已知的方式进行。
大肠杆菌JW5578-1 KanS、JW3822-1 KanS、JW1794-1 KanS、JW5020-1 KanS和JW2341-1 KanS是大肠杆菌大肠杆菌JW5578-1、JW3822-1、JW1794-1、JW5020-1和JW2341-1 (CGSC, The coli genetic stock center, Yale University, New Haven, USA)的衍生物, 并且这些依次为携带有基因fadA (SEQ ID No.64; 编码酶Ef)、fadB (SEQ ID No.66; 编码酶Ed 和酶Ee)、fadD (SEQ ID No.21; 编码酶Ea)、fadE (SEQ ID No.40; 编码酶Eb)和fadL (SEQ ID No.68; 编码催化脂肪酸甲酯穿过外膜转运的酶)的缺失的大肠杆菌BW25113的衍生物。将基因fadA、fadB、fadD、fadE 和fadL用卡那霉素盒替代。在提供具有表达载体的菌株前，以本领域技术人员已知的方式(见Datsenko K.A. and Wanner B.L. (2000) PNAS 97(12):6640-6645)，使用编码Flp重组酶的辅助质粒将其去除，产生大肠杆菌菌株JW5578-1 KanS、JW3822-1 KanS、JW1794-1 KanS、JW5020-1 KanS和JW2341-1 KanS。
BW25113、JW5578-1 KanS、JW3822-1 KanS 、JW1794-1 KanS、JW5020-1 KanS和JW2341-1 KanS 连续用以下质粒转化：
Figure 999626DEST_PATH_IMAGE297
并铺板至含有卡那霉素(50 µg/ml)、氨苄青霉素 (100 µg/ml)和壮观霉素(100 µg/ml)的LB琼脂板上。通过质粒制备和分析性限制性分析来检查转化子中正确质粒的存在。
质粒pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-ChFATB2] (SEQ ID No.38)、pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CnFATB3] (SEQ ID No.70)和pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CPF_2954] (SEQ ID No.71)从质粒pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID No.72)开始产生, 其中编码硫酯酶synUcTE的基因与Ptac 和 3'-侧翼区经BamHI/NotI一同从载体上切出，并用编码硫酯酶ChFATB2 (SEQ ID No.59) CnFATB3 (SEQ ID No.61)或CPF_2954 (SEQ ID No.63) (包括 Ptac 和相同的3'-侧翼区)的基因替换。这些片段由基因合成产生，其中编码ChFATB2和CnFATB3的区域对在大肠杆菌中表达进行密码子优化，但编码CPF_2954的区域未进行密码子优化，而是使用野生型序列。
以这种方式，尤其构建以下菌株：
Figure 899449DEST_PATH_IMAGE298
将这些菌株进行供料分批发酵，以分析它们从葡萄糖生产羟基月桂酸甲酯、氧代月桂酸甲酯、羧基月桂酸甲酯和氨基月桂酸甲酯以及羟基十四酸甲酯、氧代十四酸甲酯、羧基十四酸甲酯和氨基十四酸甲酯的能力。如实施例8中描述，这用来自DASGIP的8倍平行发酵系统进行。
显示在加入1％ （v/v）甲醇时，这些菌株能够从葡萄糖形成月桂酸甲酯、羟基月桂酸甲酯、氧代月桂酸甲酯、羧基月桂酸甲酯和氨基月桂酸甲酯以及十四酸甲酯、羟基十四酸甲酯、氧代十四酸甲酯、羧基十四酸甲酯和氨基十四酸甲酯。
进一步，构建以下菌株：
Figure 527876DEST_PATH_IMAGE299
Figure 829545DEST_PATH_IMAGE300
将这些菌株进行供料分批发酵，以分析它们从葡萄糖生产羟基辛酸甲酯、氧代辛酸甲酯、羧基辛酸甲酯和氨基辛酸甲酯以及羟基癸酸甲酯、氧代癸酸甲酯、羧基癸酸甲酯和氨基癸酸甲酯的能力。如实施例8中描述，这用来自DASGIP的8倍平行发酵系统进行。
显示在加入1％ （v/v）甲醇时，这些菌株能够从葡萄糖形成辛酸甲酯、羟基辛酸甲酯、氧代辛酸甲酯、羧基辛酸甲酯和氨基辛酸甲酯以及癸酸甲酯、羟基癸酸甲酯、氧代癸酸甲酯、羧基癸酸甲酯和氨基癸酸甲酯。
进一步，构建以下菌株：
Figure 252436DEST_PATH_IMAGE301
Figure 639555DEST_PATH_IMAGE302
将这些菌株进行供料分批发酵，以分析它们从葡萄糖生产羟基月桂酸甲酯、氧代月桂酸甲酯、羧基月桂酸甲酯和氨基月桂酸甲酯以及羟基十四酸甲酯、氧代十四酸甲酯、羧基十四酸甲酯和氨基十四酸甲酯以及羟基-9-十六碳烯酸甲酯、氧代-9-十六碳烯酸甲酯、羧基-9-十六碳烯酸甲酯和氨基-9-十六碳烯酸甲酯的能力。如实施例8中描述，这用来自DASGIP的8倍平行发酵系统进行。
显示在加入1％ （v/v）甲醇时，这些菌株能够从葡萄糖形成月桂酸甲酯、羟基月桂酸甲酯、氧代月桂酸甲酯、羧基月桂酸甲酯和氨基月桂酸甲酯以及十四酸甲酯、羟基十四酸甲酯、氧代十四酸甲酯、羧基十四酸甲酯和氨基十四酸甲酯以及9-十六碳烯酸甲酯、羟基-9-十六碳烯酸甲酯、氧代-9-十六碳烯酸甲酯、羧基-9-十六碳烯酸甲酯和氨基-9-十六碳烯酸甲酯。
最后，构建以下菌株：
Figure 962269DEST_PATH_IMAGE304
将这些菌株进行供料分批发酵，以分析它们从葡萄糖生产羟基辛酸甲酯、氧代辛酸甲酯、羧基辛酸甲酯和氨基辛酸甲酯以及羟基己酸甲酯、氧代己酸甲酯、羧基己酸甲酯和氨基己酸甲酯的能力。如实施例8中描述，这用来自DASGIP的8倍平行发酵系统进行。
显示在加入1％ （v/v）甲醇时，这些菌株能够从葡萄糖形成辛酸甲酯、羟基辛酸甲酯、氧代辛酸甲酯、羧基辛酸甲酯和氨基辛酸甲酯以及己酸甲酯、羟基己酸甲酯、氧代己酸甲酯、羧基己酸甲酯和氨基己酸甲酯。
实施例11：通过大肠杆菌菌株生产氨基己酸、氨基辛酸、氨基癸酸、氨基十四酸和氨基-9-十六碳烯酸，所述大肠杆菌菌株缺失基因fadA、fadB、fadD、fadE或fadL之一，并具有来自加州月桂的基因synUcTE、来自萼距花的基因ChFATB2、来自椰子的基因CnFATB3或来自产气荚膜梭菌的基因CPF_2954(Genbank Acc. # ABG82470 SEQ-ID XY)和来自枯草芽孢杆菌的基因ald、来自紫色色杆菌的基因Cv_2025的表达载体，并组合有来自恶臭假单胞菌的alk操纵子的基因alkB、alkG和alkT的表达载体
为了产生具有来自加州月桂的基因synUcTE、来自萼距花的基因ChFATB2 (SEQ ID No.58)、来自椰子的基因CnFATB3 (SEQ ID No.60)或来自产气荚膜梭菌的基因CPF_2954 (SEQ ID No.62)和来自枯草芽孢杆菌的基因ald和来自紫色色杆菌的基因Cv_2025的表达载体，并组合有来自恶臭假单胞菌GPo1的alk操纵子的基因alkB 、 alkG和alkT的表达载体的大肠杆菌菌株，产生大肠杆菌JW5578-1 KanS、JW3822-1 KanS、JW1794-1 KanS、JW5020-1 KanS和JW2341-1 KanS的电感受态细胞。这以本领域技术人员已知的方式进行。
JW5578-1 KanS、JW3822-1 KanS 、JW1794-1 KanS、JW5020-1 KanS和JW2341-1 KanS 连续用以下质粒转化：
Figure 845078DEST_PATH_IMAGE305
并铺板至含有卡那霉素(50 µg/ml)和氨苄青霉素(100 µg/ml)的LB琼脂板上。通过质粒制备和分析性限制性分析来检查转化子中正确质粒的存在。
以这种方式，尤其构建以下菌株：
Figure 453914DEST_PATH_IMAGE306
将这些菌株进行供料分批发酵，以分析它们从葡萄糖生产羟基月桂酸、氧代月桂酸、羧基月桂酸和氨基月桂酸以及羟基十四酸、氧代十四酸、羧基十四酸和氨基十四酸的能力。如实施例8中描述，这用来自DASGIP的8倍平行发酵系统进行。
显示这些菌株能够从葡萄糖形成月桂酸、羟基月桂酸、氧代月桂酸、羧基月桂酸和氨基月桂酸以及十四酸、羟基十四酸、氧代十四酸、羧基十四酸和氨基十四酸。
进一步，构建以下菌株：
Figure 689723DEST_PATH_IMAGE307
将这些菌株进行供料分批发酵，以分析它们从葡萄糖生产羟基辛酸、氧代辛酸、羧基辛酸和氨基辛酸以及羟基癸酸、氧代癸酸、羧基癸酸和氨基癸酸的能力。如实施例8中描述，这用来自DASGIP的8倍平行发酵系统进行。
显示这些菌株能够从葡萄糖形成辛酸、羟基辛酸、氧代辛酸、羧基辛酸和氨基辛酸以及癸酸、羟基癸酸、氧代癸酸、羧基癸酸和氨基癸酸。
进一步，构建以下菌株：
Figure 700404DEST_PATH_IMAGE308
将这些菌株进行供料分批发酵，以分析它们从葡萄糖生产羟基月桂酸、氧代月桂酸、羧基月桂酸和氨基月桂酸以及羟基十四酸、氧代十四酸、羧基十四酸和氨基十四酸以及羟基-9-十六碳烯酸、氧代-9-十六碳烯酸、羧基-9-十六碳烯酸和氨基-9-十六碳烯酸的能力。如实施例8中描述，这用来自DASGIP的8倍平行发酵系统进行。
显示这些菌株能够从葡萄糖形成月桂酸、羟基月桂酸、氧代月桂酸、羧基月桂酸和氨基月桂酸以及十四酸、羟基十四酸、氧代十四酸、羧基十四酸和氨基十四酸以及
9-十六碳烯酸、羟基-9-十六碳烯酸、氧代-9-十六碳烯酸、羧基-9-十六碳烯酸和氨基-9-十六碳烯酸。
最后，构建以下菌株：
将这些菌株进行供料分批发酵，以分析它们从葡萄糖生产羟基辛酸、氧代辛酸、羧基辛酸和氨基辛酸以及羟基己酸、氧代己酸、羧基己酸和氨基己酸的能力。如实施例8中描述，这用来自DASGIP的8倍平行发酵系统进行。
显示这些菌株能够从葡萄糖形成辛酸、羟基辛酸、氧代辛酸、羧基辛酸和氨基辛酸以及己酸、羟基己酸、氧代己酸、羧基己酸和氨基己酸。
实施例12：通过大肠杆菌菌株生产氨基月桂酸甲酯，所述大肠杆菌菌株缺失基因fadE并具有来自加州月桂的基因synUcTE、来自枯草芽孢杆菌的基因ald、来自丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)丁香致病变种B728a的基因Psyr_4866、来自Pseudomonas protegens Pf-5的基因PFL_5927、来自丁香假单胞菌菜豆致病变种1448A的基因PSPPH_4896或来自丁香假单胞菌的番茄致病变种T1的基因PSPTOT1_2473的表达载体，并组合有来自恶臭假单胞菌alk操纵子的基因alkB、alkG、alkT和alkL的表达载体和来自大肠杆菌的基因fadD和来自不动杆菌属种ADP1的基因wax-dgaT或来自泊库岛食烷菌的基因atfA1的表达载体
为了产生具有来自加州月桂的基因synUcTE、来自枯草芽孢杆菌的基因ald、来自丁香假单胞菌丁香致病变种B728a的基因Psyr_4866(SEQ ID No.73)、来自Pseudomonas protegens Pf-5的基因PFL_5927(SEQ ID No.75)、来自丁香假单胞菌菜豆致病变种1448A的基因PSPPH_4896(SEQ ID No.77)或来自丁香假单胞菌的番茄致病变种T1的基因PSPTOT1_2473(SEQ ID No.79)的表达载体，并组合有来自恶臭假单胞菌GPo1的alk操纵子的基因alkB 、 alkG和alkT的表达载体和来自大肠杆菌的基因fadD和来自不动杆菌属种ADP1的基因wax-dgaT或来自泊库岛食烷菌的基因atfA1的表达载体的大肠杆菌菌株，产生大肠杆菌JW5020-1 KanS的电感受态细胞。这以本领域技术人员已知的方式进行。
JW5020-1 KanS连续用以下质粒转化：
Figure 826809DEST_PATH_IMAGE310
并铺板至含有卡那霉素(50 µg/ml)、氨苄青霉素 (100 µg/ml)和壮观霉素(100 µg/ml)的LB琼脂板上。通过质粒制备和分析性限制性分析来检查转化子中正确质粒的存在。
质粒pJ294[alaDH_B.s._Psyr_4866_Ptac-synUcTE] (SEQ ID No.81)、pJ294[alaDH_B.s._TA_PFL_5927_Ptac-synUcTE] (SEQ ID No.82)、pJ294[alaDH_B.s._TA_PSPPH_4896_Ptac-synUcTE] (SEQ ID No.83)和pJ294[alaDH_B.s._TA_PSPTOT1_2473_Ptac-synUcTE] (SEQ ID No.84)从质粒pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID No.38)开始产生, 其中编码转氨酶Cv_2025的基因与枯草芽孢杆菌的基因ald 的3'-端和3'-侧翼区经BglII/FseI从载体上切出，并由编码转氨酶Psyr_4866 (SEQ ID No.74)、PFL_5927 (SEQ ID No.76)、PSPPH_4896 (SEQ ID No.78)或PSPTOT1_2473 (SEQ ID No.80) (包括来自枯草芽孢杆菌的ald基因的3'-端和相同的3'-侧翼区)的基因替换。这些片段通过基因合成产生，其中将编码Psyr_4866、PFL_5927、PSPPH_4896 和PSPTOT1_2473的区域对在大肠杆菌中表达进行密码子优化。
以这种方式，构建以下菌株：
Figure 538413DEST_PATH_IMAGE311
Figure 465918DEST_PATH_IMAGE312
将这些菌株进行供料分批发酵，以分析它们从葡萄糖生产羟基月桂酸甲酯、氧代月桂酸甲酯、羧基月桂酸甲酯和氨基月桂酸甲酯以及羟基十四酸甲酯、氧代十四酸甲酯、羧基十四酸甲酯和氨基十四酸甲酯的能力。如实施例8中描述，这用来自DASGIP的8倍平行发酵系统进行。
显示在加入1％ （v/v）甲醇时，这些菌株能够从葡萄糖形成月桂酸甲酯、羟基月桂酸甲酯、氧代月桂酸甲酯、羧基月桂酸甲酯和氨基月桂酸甲酯以及十四酸甲酯、羟基十四酸甲酯、氧代十四酸甲酯、羧基十四酸甲酯和氨基十四酸甲酯。
实施例13：通过大肠杆菌菌株生产氨基月桂酸，所述大肠杆菌菌株缺失基因fadE并具有来自加州月桂的基因synUcTE、来自枯草芽孢杆菌的基因ald、来自丁香假单胞菌丁香致病变种B728a的基因Psyr_4866、来自Pseudomonas protegens Pf-5的基因PFL_5927、来自丁香假单胞菌菜豆致病变种1448A的基因PSPPH_4896或来自丁香假单胞菌的番茄致病变种T1的基因PSPTOT1_2473的表达载体，并组合有来自恶臭假单胞菌alk操纵子的基因alkB、alkG、alkT和alkL的表达载体
为了产生具有来自加州月桂的基因synUcTE、来自枯草芽孢杆菌的基因ald、来自丁香假单胞菌丁香致病变种B728a的基因Psyr_4866(SEQ ID No.73)、来自Pseudomonas protegens Pf-5的基因PFL_5927(SEQ ID No.75)、来自丁香假单胞菌菜豆致病变种1448A的基因PSPPH_4896(SEQ ID No.77)或来自丁香假单胞菌的番茄致病变种T1的基因PSPTOT1_2473(SEQ ID No.79)的表达载体，并组合有来自恶臭假单胞菌GPo1的alk操纵子的基因alkB 、 alkG和alkT的表达载体的大肠杆菌菌株，产生大肠杆菌JW5020-1 KanS的电感受态细胞。这以本领域技术人员已知的方式进行。
JW5020-1 KanS连续用以下质粒转化：
并铺板至含有卡那霉素(50 µg/ml)和氨苄青霉素(100 µg/ml)的LB琼脂板上。通过质粒制备和分析性限制性分析来检查转化子中正确质粒的存在。
以这种方式，构建以下菌株：
Figure 250520DEST_PATH_IMAGE314
将这些菌株进行供料分批发酵，以分析它们从葡萄糖生产羟基月桂酸、氧代月桂酸、羧基月桂酸和氨基月桂酸以及羟基十四酸、氧代十四酸、羧基十四酸和氨基十四酸的能力。如实施例8中描述，这用来自DASGIP的8倍平行发酵系统进行。
显示这些菌株能够从葡萄糖形成月桂酸、羟基月桂酸、氧代月桂酸、羧基月桂酸和氨基月桂酸以及十四酸、羟基十四酸、氧代十四酸、羧基十四酸和氨基十四酸。
实施例14：通过大肠杆菌菌株生产氨基月桂酸甲酯，所述大肠杆菌菌株缺失基因fadE并具有来自加州月桂的基因synUcTE、来自念珠藻属（Nostoc）种PCC 7120的基因alr2355、来自豌豆根瘤菌三叶草生物变种（Rhizobium leguminasorum bv. trifolii）WSM1325的基因Rleg_1610、来自慢生大豆根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）USDA 110的基因blr1738 (aldA)、或来自巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）DSM 319的基因BMD_5199和来自紫色色杆菌的Cv_2025的表达载体，并组合有来自恶臭假单胞菌的alk操纵子的基因alkB、alkG、alkT和alkL的表达载体和来自大肠杆菌的基因fadD和来自不动杆菌属种ADP1的基因wax-dgaT或来自泊库岛食烷菌的基因atfA1的表达载体
为了产生具有来自加州月桂的基因synUcTE、来自念珠藻属种PCC 7120的基因alr2355 (SEQ ID No.85)、来自豌豆根瘤菌三叶草生物变种WSM1325的基因Rleg_1610 (SEQ ID No.87)、来自慢生大豆根瘤菌USDA 110的基因blr1738 (SEQ ID No.89)、或来自巨大芽孢杆菌DSM 319的基因BMD_5199 (SEQ ID No.91)和来自紫色色杆菌的Cv_2025的表达载体，并组合有来自恶臭假单胞菌GPo1的alk操纵子的基因alkB 、 alkG和alkT的表达载体和来自大肠杆菌的基因fadD和来自不动杆菌属种ADP1的基因wax-dgaT 或来自泊库岛食烷菌的基因atfA1的表达载体的大肠杆菌菌株，产生大肠杆菌JW5020-1 KanS的电感受态细胞。这以本领域技术人员已知的方式进行。
JW5020-1 KanS连续用以下质粒转化：
Figure 500236DEST_PATH_IMAGE315
并铺板至含有卡那霉素(50 µg/ml)、氨苄青霉素 (100 µg/ml)和壮观霉素(100 µg/ml)的LB琼脂板上。通过质粒制备和分析性限制性分析来检查转化子中正确质粒的存在。
质粒pJ294[alr2355_TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID No.93)、
pJ294[Rleg_1610_TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID No.94)、
pJ294[blr1738_TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID No.95)和
pJ294[BMD_5199_TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID No.96)从质粒pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID No.38)开始产生, 其中编码来自枯草芽孢杆菌的丙氨酸脱氢酶的基因与PlacUV5 和来自紫色色杆菌的Cv_2025基因的5'-端经PstI/EcoNI从载体中切出，并由编码丙氨酸脱氢酶alr2355 (SEQ ID No.86), Rleg_1610 (SEQ ID No.88)、blr1738 (SEQ ID No.90)或BMD_5199 (SEQ ID No.92) (包括PlacUV5 和来自紫色色杆菌的Cv_2025基因的5'-端)的基因替换。这些片段通过基因合成产生，其中编码alr2355、Rleg_1610、blr1738和BMD_5199的区域不对在大肠杆菌中表达进行密码子优化，而是使用野生型序列。
以这种方式，构建以下菌株：
Figure 547826DEST_PATH_IMAGE316
Figure 857585DEST_PATH_IMAGE317
将这些菌株进行供料分批发酵，以分析它们从葡萄糖生产羟基月桂酸甲酯、氧代月桂酸甲酯、羧基月桂酸甲酯和氨基月桂酸甲酯以及羟基十四酸甲酯、氧代十四酸甲酯、羧基十四酸甲酯和氨基十四酸甲酯的能力。如实施例8中描述，这用来自DASGIP的8倍平行发酵系统进行。
显示在加入1％ （v/v）甲醇时，这些菌株能够从葡萄糖形成月桂酸甲酯、羟基月桂酸甲酯、氧代月桂酸甲酯、羧基月桂酸甲酯和氨基月桂酸甲酯以及十四酸甲酯、羟基十四酸甲酯、氧代十四酸甲酯、羧基十四酸甲酯和氨基十四酸甲酯。
实施例15：通过大肠杆菌菌株生产氨基月桂酸，所述大肠杆菌菌株缺失基因fadE并具有来自加州月桂的基因synUcTE、来自念珠藻属种PCC 7120的基因alr2355、来自豌豆根瘤菌三叶草生物变种WSM1325的基因Rleg_1610、来自慢生大豆根瘤菌USDA 110的基因blr1738 (aldA)、或来自巨大芽孢杆菌DSM 319的基因BMD_5199和来自紫色色杆菌的Cv_2025的表达载体，并组合有来自恶臭假单胞菌的alk操纵子的基因alkB、alkG、alkT和alkL的表达载体
为了产生具有来自加州月桂的基因synUcTE、来自念珠藻属种PCC 7120的基因alr2355 (SEQ ID No.85)、来自豌豆根瘤菌三叶草生物变种WSM1325的基因Rleg_1610 (SEQ ID No.87)、来自慢生大豆根瘤菌USDA 110的基因blr1738 （aldA）(SEQ ID No.89)、或来自巨大芽孢杆菌DSM 319的基因BMD_5199 (SEQ ID No.91)和来自紫色色杆菌的Cv_2025的表达载体，并组合有来自恶臭假单胞菌GPo1的alk操纵子的基因alkB 、 alkG和alkT的表达载体的大肠杆菌菌株，产生大肠杆菌JW5020-1 KanS的电感受态细胞。这以本领域技术人员已知的方式进行。
JW5020-1 KanS连续用以下质粒转化：
Figure 990626DEST_PATH_IMAGE318
并铺板至含有卡那霉素(50 µg/ml)和氨苄青霉素(100 µg/ml)的LB琼脂板上。通过质粒制备和分析性限制性分析来检查转化子中正确质粒的存在。
以这种方式，构建以下菌株：
Figure 44033DEST_PATH_IMAGE319
将这些菌株进行供料分批发酵，以分析它们从葡萄糖生产羟基月桂酸、氧代月桂酸、羧基月桂酸和氨基月桂酸以及羟基十四酸、氧代十四酸、羧基十四酸和氨基十四酸的能力。如实施例8中描述，这用来自DASGIP的8倍平行发酵系统进行。
显示这些菌株能够从葡萄糖形成月桂酸、羟基月桂酸、氧代月桂酸、羧基月桂酸和氨基月桂酸以及十四酸、羟基十四酸、氧代十四酸、羧基十四酸和氨基十四酸。
实施例16：通过大肠杆菌菌株生产氨基月桂酸甲酯，所述大肠杆菌菌株缺失基因fadE并具有来自加州月桂的基因synUcTE和来自紫色色杆菌的Cv_2025的表达载体，并组合有来自恶臭假单胞菌的alk操纵子的基因alkB、alkG、alkT和alkL的表达载体和来自大肠杆菌的基因fadD和来自不动杆菌属种ADP1的基因wax-dgaT或来自泊库岛食烷菌的基因atfA1的表达载体
为了产生具有来自加州月桂的基因synUcTE和来自紫色色杆菌的Cv_2025的表达载体，并组合有来自恶臭假单胞菌GPo1的alk操纵子的基因alkB 、alkG和alkT的表达载体和来自大肠杆菌的基因fadD和来自不动杆菌属种ADP1的基因wax-dgaT或来自泊库岛食烷菌的基因atfA1 的表达载体的大肠杆菌菌株，产生大肠杆菌JW5020-1 KanS的电感受态细胞。这以本领域技术人员已知的方式进行。
JW5020-1 KanS连续用以下质粒转化：
并铺板至含有卡那霉素(50 µg/ml)、氨苄青霉素 (100 µg/ml)和壮观霉素(100 µg/ml)的LB琼脂板上。通过质粒制备和分析性限制性分析来检查转化子中正确质粒的存在。
质粒pJ294[TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID No.97)从质粒pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID No.38)开始产生, 其中编码来自枯草芽孢杆菌的丙氨酸脱氢酶的基因对功能表达必需的部分用PmeI/SnaBI从载体中切出，并且这随后再连接。
以这种方式，构建以下菌株：
Figure 426790DEST_PATH_IMAGE321
将这些菌株进行供料分批发酵，以分析它们从葡萄糖生产羟基月桂酸甲酯、氧代月桂酸甲酯、羧基月桂酸甲酯和氨基月桂酸甲酯以及羟基十四酸甲酯、氧代十四酸甲酯、羧基十四酸甲酯和氨基十四酸甲酯的能力。如实施例8中描述，这用来自DASGIP的8倍平行发酵系统进行。
显示在加入1％ （v/v）甲醇时，这些菌株能够从葡萄糖形成月桂酸甲酯、羟基月桂酸甲酯、氧代月桂酸甲酯、羧基月桂酸甲酯和氨基月桂酸甲酯以及十四酸甲酯、羟基十四酸甲酯、氧代十四酸甲酯、羧基十四酸甲酯和氨基十四酸甲酯。
实施例17：通过大肠杆菌菌株生产氨基月桂酸，所述大肠杆菌菌株缺失基因fadE并具有来自加州月桂的基因synUcTE和来自紫色色杆菌的Cv_2025的表达载体，并组合有来自恶臭假单胞菌的alk操纵子的基因alkB、alkG、alkT和alkL的表达载体
为了产生具有来自加州月桂的基因synUcTE和来自紫色色杆菌的Cv_2025的表达载体，并组合有来自恶臭假单胞菌GPo1的alk操纵子的基因alkB 、 alkG和alkT的表达载体的大肠杆菌菌株，产生大肠杆菌JW5020-1 KanS的电感受态细胞。这以本领域技术人员已知的方式进行。
JW5020-1 KanS连续用以下质粒转化：
Figure 719231DEST_PATH_IMAGE322
并铺板至含有卡那霉素(50 µg/ml)和氨苄青霉素(100 µg/ml)的LB琼脂板上。通过质粒制备和分析性限制性分析来检查转化子中正确质粒的存在。
以这种方式，构建以下菌株：
Figure 638645DEST_PATH_IMAGE323
。
将该菌株进行供料分批发酵，以分析它从葡萄糖生产羟基月桂酸、氧代月桂酸、羧基月桂酸和氨基月桂酸以及羟基十四酸、氧代十四酸、羧基十四酸和氨基十四酸的能力。如实施例8中描述，这用来自DASGIP的8倍平行发酵系统进行。
显示该菌株能够从葡萄糖产生月桂酸、羟基月桂酸、氧代月桂酸、羧基月桂酸和氨基月桂酸以及十四酸、羟基十四酸、氧代十四酸、羧基十四酸和氨基十四酸。
实施例18：通过大肠杆菌菌株生产氨基月桂酸甲酯，所述大肠杆菌菌株缺失基因fadE并具有来自加州月桂的基因synUcTE的表达载体，并组合有来自恶臭假单胞菌的alk操纵子的基因alkB、alkG、alkT和alkL的表达载体和来自大肠杆菌的基因fadD和来自不动杆菌属种ADP1的基因wax-dgaT或来自泊库岛食烷菌的基因atfA1的表达载体
为了产生具有来自加州月桂的基因synUcTE的表达载体，并组合有来自恶臭假单胞菌GPo1的alk操纵子的基因alkB、alkG和alkT的表达载体和来自大肠杆菌的基因fadD和来自不动杆菌属种ADP1的基因wax-dgaT或来自泊库岛食烷菌的基因atfA1 的表达载体的大肠杆菌菌株，产生大肠杆菌JW5020-1 KanS的电感受态细胞。这以本领域技术人员已知的方式进行。
JW5020-1 KanS连续用以下质粒转化：
Figure 332932DEST_PATH_IMAGE324
并铺板至含有卡那霉素(50 µg/ml)、氨苄青霉素 (100 µg/ml)和壮观霉素(100 µg/ml)的LB琼脂板上。通过质粒制备和分析性限制性分析来检查转化子中正确质粒的存在。
质粒pJ294[Ptac-synUcTE] (SEQ ID No.98)从质粒pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID No.38)开始产生, 其中编码来自枯草芽孢杆菌的丙氨酸脱氢酶和来自紫色色杆菌的转氨酶Cv_2025的基因对功能表达必需的部分用SrfI/SnaBI从载体中切出，并且这随后再连接。
以这种方式，构建以下菌株：
Figure 46810DEST_PATH_IMAGE325
将这些菌株进行供料分批发酵，以分析它们从葡萄糖生产羟基月桂酸甲酯、氧代月桂酸甲酯和羧基月桂酸甲酯以及羟基十四酸甲酯、氧代十四酸甲酯和羧基十四酸甲酯的能力。如实施例8中描述，这用来自DASGIP的8倍平行发酵系统进行。
显示在加入1％ （v/v）甲醇时，这些菌株能够从葡萄糖形成月桂酸甲酯、羟基月桂酸甲酯、氧代月桂酸甲酯和羧基月桂酸甲酯以及十四酸甲酯、羟基十四酸甲酯、氧代十四酸甲酯和羧基十四酸甲酯。
实施例19：通过大肠杆菌菌株生产氨基月桂酸，所述大肠杆菌菌株缺失基因fadE并具有来自加州月桂的基因synUcTE的表达载体，并组合有来自恶臭假单胞菌的alk操纵子的基因alkB、alkG、alkT和alkL的表达载体
为了产生具有来自加州月桂的基因synUcTE的表达载体，并组合有来自恶臭假单胞菌GPo1的alk操纵子的基因alkB、alkG和alkT的表达载体的大肠杆菌菌株，产生大肠杆菌JW5020-1 KanS的电感受态细胞。这以本领域技术人员已知的方式进行。
JW5020-1 KanS连续用以下质粒转化：
Figure 92126DEST_PATH_IMAGE326
并铺板至含有卡那霉素(50 µg/ml)和氨苄青霉素(100 µg/ml)的LB琼脂板上。通过质粒制备和分析性限制性分析来检查转化子中正确质粒的存在。
以这种方式，构建以下菌株：
Figure 549652DEST_PATH_IMAGE327
。
将该菌株进行供料分批发酵，以分析它从葡萄糖生产羟基月桂酸、氧代月桂酸和羧基月桂酸以及羟基十四酸、氧代十四酸和羧基十四酸的能力。如实施例8中描述，这用来自DASGIP的8倍平行发酵系统进行。
显示该菌株能够从葡萄糖产生月桂酸、羟基月桂酸、氧代月桂酸和羧基月桂酸以及十四酸、羟基十四酸、氧代十四酸和羧基十四酸。
实施例20：通过大肠杆菌菌株产生氨基己酸甲酯、氨基辛酸甲酯、氨基癸酸甲酯、氨基十四酸甲酯和氨基-9-十六碳烯酸甲酯，所述大肠杆菌菌株缺失fadE基因，并具有来自加州月桂的基因synUcTE、来自萼距花的基因ChFATB2、来自椰子的基因CnFATB3或来自产气荚膜梭菌的基因CPF_2954和来自枯草芽孢杆菌的基因ald、来自紫色色杆菌的基因Cv_2025的表达载体，并组合有来自恶臭假单胞菌的alk操纵子的基因alkB、alkG和alkT的表达载体和来自海分枝杆菌（Mycobacterium marinum）的基因Mmar_3356或来自大肠杆菌的基因’tesA*的表达载体
为了产生具有来自加州月桂的基因synUcTE、来自萼距花的基因ChFATB2 (SEQ ID No.58)、来自椰子的基因CnFATB3 (SEQ ID No.60)或来自产气荚膜梭菌的基因CPF_2954(SEQ ID No.62)和来自枯草芽孢杆菌的基因ald、来自紫色色杆菌的基因Cv_2025的表达载体，并组合有来自恶臭假单胞菌GPo1的alk操纵子的基因alkB、alkG和alkT的表达载体和来自海分枝杆菌的基因Mmar_3356(SEQ ID No.99)或来自大肠杆菌的基因'tesA* (SEQ ID No.101)的表达载体的大肠杆菌菌株，产生大肠杆菌JW5020-1 KanS的电感受态细胞。这以本领域技术人员已知的方式进行。
JW5020-1 KanS连续用以下质粒转化：
Figure 98445DEST_PATH_IMAGE328
并铺板至含有卡那霉素(50 µg/ml)、氨苄青霉素 (100 µg/ml)和壮观霉素(100 µg/ml)的LB琼脂板上。通过质粒制备和分析性限制性分析来检查转化子中正确质粒的存在。
质粒pCDF[Mmar_3356] (SEQ ID No.103)和pCDF[Ec’tesA*] (SEQ ID No.104)从质粒pCDF[wax-dgaT_AsADP1(co_Ec)-fadD_Ec] (SEQ ID No.16)开始产生, 其中将来自不动杆菌属种ADP1的wax-dgaT 基因和来自大肠杆菌的fadD 基因（包括Ptac 和fadD的3'-侧翼区）用BamHI/XhoI从载体中切出，并由编码脂肪酸O-甲基转移酶Mmar_3356 (SEQ ID No.100)或酰基-ACP: 甲醇O-甲基转移酶’TesA* (SEQ ID No.102) (包括Ptac 和与fadD的3'-侧翼区相同的区域)的基因替换。这些片段通过基因合成产生，其中编码脂肪酸O-甲基转移酶的区域对在大肠杆菌中表达进行密码子优化，而编码硫酯转酯酶’TesA*的区域不对在大肠杆菌中表达进行密码子优化，而使用野生型序列。
以这种方式，构建以下菌株：
将这些菌株进行供料分批发酵，以分析它们从葡萄糖生产羟基脂肪酸甲酯、氧代脂肪酸甲酯、羧基脂肪酸甲酯和氨基脂肪酸甲酯的能力。如实施例8中描述，这用来自DASGIP的8倍平行发酵系统进行。
显示在加入1% (v/v)甲醇时，菌株大肠杆菌JW5020-1 KanS pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] / pCDF[Mmar_3356] 和大肠杆菌JW5020-1 KanS pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] / pCDF[Ec’tesA*]能够从葡萄糖形成月桂酸甲酯、羟基月桂酸甲酯、氧代月桂酸甲酯、羧基月桂酸甲酯和氨基月桂酸甲酯以及十四酸甲酯、羟基十四酸甲酯、氧代十四酸甲酯、羧基十四酸甲酯和氨基十四酸甲酯。
显示在加入1% (v/v)甲醇时，菌株大肠杆菌JW5020-1 KanS pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-ChFATB2] / pCDF[Mmar_3356]和大肠杆菌JW5020-1 KanS pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-ChFATB2] / pCDF[Ec’tesA*]能够从葡萄糖形成辛酸甲酯、羟基辛酸甲酯、氧代辛酸甲酯、羧基辛酸甲酯和氨基辛酸甲酯以及癸酸甲酯、羟基癸酸甲酯、氧代癸酸甲酯、羧基癸酸甲酯和氨基癸酸甲酯。
显示在加入1% (v/v)甲醇时，菌株大肠杆菌JW5020-1 KanS pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CnFATB3] / pCDF[Mmar_3356]和大肠杆菌JW5020-1 KanS pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CnFATB3] / pCDF[Ec’tesA*]能够从葡萄糖形成月桂酸甲酯、羟基月桂酸甲酯、氧代月桂酸甲酯、羧基月桂酸甲酯和氨基月桂酸甲酯以及十四酸甲酯、羟基十四酸甲酯、氧代十四酸甲酯、羧基十四酸甲酯和氨基十四酸甲酯以及9-十六碳烯酸甲酯、羟基-9-十六碳烯酸甲酯、氧代-9-十六碳烯酸甲酯、羧基-9-十六碳烯酸甲酯和氨基-9-十六碳烯酸甲酯。
显示在加入1% (v/v)甲醇时，菌株大肠杆菌JW5020-1 KanS pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CnFATB3] / pCDF[Mmar_3356]和大肠杆菌JW5020-1 KanS pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CnFATB3] / pCDF[Ec’tesA*]能够从葡萄糖形成辛酸甲酯、羟基辛酸甲酯、氧代辛酸甲酯、羧基辛酸甲酯和氨基辛酸甲酯以及己酸甲酯、羟基己酸甲酯、氧代己酸甲酯、羧基己酸甲酯和氨基己酸甲酯。
实施例21：通过大肠杆菌菌株生产氨基月桂酸甲酯和氨基十四酸甲酯，所述大肠杆菌菌株缺失基因fadE并具有来自加州月桂的基因synUcTE、来自枯草芽孢杆菌的ald和来自紫色色杆菌的Cv_2025的表达载体，并组合有来自不动杆菌属种ADP1的alk操纵子的基因alkM、alkG和alkT或来自水油海杆菌（Marinobacter aquaeoli）VT8的alk操纵子的基因alkS、alkT、alkB1、alkG和alkT的表达载体和来自大肠杆菌的基因fadD和来自不动杆菌属种ADP1的基因wax-dgaT或来自泊库岛食烷菌的基因atfA1的表达载体
为了产生具有来自加州月桂的基因synUcTE、来自枯草芽孢杆菌的ald和来自紫色色杆菌的Cv_2025的表达载体，并组合有来自不动杆菌属种ADP1的alk操纵子(SEQ ID No.105)的基因alkM、alkG和alkT或来自水油海杆菌VT8的alk操纵子(SEQ ID No.106)的基因alkS、alkT、alkB1 、 alkG和alkT的表达载体和来自大肠杆菌的基因fadD和来自不动杆菌属种ADP1的基因wax-dgaT或来自泊库岛食烷菌SK2的基因atfA1的表达载体的大肠杆菌菌株，产生大肠杆菌JW5020-1 KanS的电感受态细胞。这以本领域技术人员已知的方式进行。
JW5020-1 KanS连续用以下质粒转化：
Figure 578154DEST_PATH_IMAGE330
并铺板至含有卡那霉素(50 µg/ml)、氨苄青霉素 (100 µg/ml)和壮观霉素(100 µg/ml)的LB琼脂板上。通过质粒制备和分析性限制性分析来检查转化子中正确质粒的存在。
质粒pCOM10-AcalkMGT (SEQ ID No.107)和pCOM10-MaalkST-B1G (SEQ ID No.108)从质粒pCOM10 (SEQ ID No.109; Smits TH, Seeger MA, Witholt B, van Beilen JB. New alkane-responsive expression vectors for Escherichia coli and Pseudomonas. Plasmid. 2001. 46(1):16-24.)开始产生。为此，将pCOM10用XhoI/BamHI (pCOM10-MaalkST-B1G)或EcoRI (pCOM10-AcalkMGT)切割，并将基因座不动杆菌属种ADP1 alkMGT或水油海杆菌VT8 alkST-alkB1G分别插入pCOM10中。这些基因座通过基因合成产生，其中编码不动杆菌属种ADP1 AlkM (SEQ ID No.110)、AlkG (SEQ ID No.111)和AlkT (SEQ ID No.112)的区域和编码水油海杆菌VT8 AlkS (SEQ ID No.113)、AlkT (SEQ ID No.114)、AlkB1 (SEQ ID No.115)和AlkG (SEQ ID No.116)的区域不对在大肠杆菌中表达进行密码子优化，而使用野生型序列。
以这种方式，构建以下菌株：
将这些菌株进行供料分批发酵，以分析它们从葡萄糖生产羟基脂肪酸甲酯、氧代脂肪酸甲酯、羧基脂肪酸甲酯和氨基脂肪酸甲酯的能力。如实施例8中描述，这用来自DASGIP的8倍平行发酵系统进行。
显示在加入1％ （v/v）甲醇时，这些菌株能够从葡萄糖形成月桂酸甲酯、羟基月桂酸甲酯、氧代月桂酸甲酯、羧基月桂酸甲酯和氨基月桂酸甲酯以及十四酸甲酯、羟基十四酸甲酯、氧代十四酸甲酯、羧基十四酸甲酯和氨基十四酸甲酯。
实施例22：通过大肠杆菌菌株生产氨基月桂酸和氨基十四酸，所述大肠杆菌菌株缺失基因fadE并具有来自加州月桂的基因synUcTE、来自枯草芽孢杆菌的ald和来自紫色色杆菌的Cv_2025的表达载体，并组合有来自不动杆菌属种ADP1的alk操纵子的基因alkM、alkG和alkT或来自水油海杆菌VT8的alk操纵子的基因alkS、alkT、alkB1、alkG和alkT的表达载体
为了产生具有来自加州月桂的基因synUcTE、来自枯草芽孢杆菌的ald和来自紫色色杆菌的Cv_2025的表达载体，并组合有来自不动杆菌属种ADP1的alk操纵子(SEQ ID No.105)的基因alkM、alkG和alkT或来自水油海杆菌VT8的alk操纵子(SEQ ID No.106)的基因alkS、alkT、alkB1 、 alkG和alkT的表达载体的大肠杆菌菌株，产生大肠杆菌JW5020-1 KanS的电感受态细胞。这以本领域技术人员已知的方式进行。
JW5020-1 KanS连续用以下质粒转化：
Figure 242671DEST_PATH_IMAGE332
并铺板至含有卡那霉素(50 µg/ml)和氨苄青霉素(100 µg/ml)的LB琼脂板上。通过质粒制备和分析性限制性分析来检查转化子中正确质粒的存在。
以这种方式，构建以下菌株：
Figure 563931DEST_PATH_IMAGE333
将这些菌株进行供料分批发酵，以分析它们从葡萄糖生产羟基脂肪酸、氧代脂肪酸、羧基脂肪酸和氨基脂肪酸的能力。如实施例8中描述，这用来自DASGIP的8倍平行发酵系统进行。
显示这些菌株能够从葡萄糖形成月桂酸、羟基月桂酸、氧代月桂酸、羧基月桂酸和氨基月桂酸以及十四酸、羟基十四酸、氧代十四酸、羧基十四酸和氨基十四酸。
实施例23：通过大肠杆菌菌株生产氨基月桂酸甲酯和氨基十四酸甲酯，所述大肠杆菌菌株缺失基因fadE并具有来自加州月桂的基因synUcTE、和来自枯草芽孢杆菌的ald、和来自紫色色杆菌的Cv_2025的表达载体，并组合有来自泊库岛食烷菌SK2的基因ABO_0200、 ABO_0201和ABO_0203的表达载体和来自大肠杆菌的基因fadD和来自不动杆菌属种ADP1的基因wax-dgaT或来自泊库岛食烷菌的基因atfA1的表达载体
为了产生具有来自加州月桂的基因synUcTE、来自枯草芽孢杆菌的ald和来自紫色色杆菌的Cv_2025的表达载体，并组合有来自库岛食烷菌SK2的基因ABO_0200、 ABO_0201和ABO_0203 (SEQ ID No.117)（编码铁氧还蛋白(ABO_0200; SEQ ID No.118)、CYP153单加氧酶(ABO_0201; SEQ ID No.119)和铁氧还蛋白氧化还原酶(ABO_0203; SEQ ID No.120)）的表达载体和来自大肠杆菌的基因fadD和来自不动杆菌属种ADP1的基因wax-dgaT或来自泊库岛食烷菌SK2的基因atfA1的表达载体的大肠杆菌菌株，产生大肠杆菌JW5020-1 KanS的电感受态细胞。这以本领域技术人员已知的方式进行。
JW5020-1 KanS连续用以下质粒转化：
Figure 318260DEST_PATH_IMAGE334
并铺板至含有卡那霉素(50 µg/ml)、氨苄青霉素 (100 µg/ml)和壮观霉素(100 µg/ml)的LB琼脂板上。通过质粒制备和分析性限制性分析来检查转化子中正确质粒的存在。
质粒pCOM10-AbCYP153 (SEQ ID No.121)从质粒pCOM10 (SEQ ID No.97; Smits TH, Seeger MA, Witholt B, van Beilen JB. New alkane-responsive expression vectors for Escherichia coli and Pseudomonas. Plasmid. 2001. 46(1):16-24.)开始产生。为此，将pCOM10用EcoRI/SalI切割并插入含有来自泊库岛食烷菌SK2的基因ABO_0200、 ABO_0201和ABO_0203 的片段。该片段通过基因合成产生，其中来自泊库岛食烷菌SK2的编码铁氧还蛋白(ABO_0200; SEQ ID No.106)、CYP153单加氧酶(ABO_0201; SEQ ID No.107)和铁氧还蛋白氧化还原酶(ABO_0203; SEQ ID No.108)的部分不对在大肠杆菌中表达进行密码子优化，而使用野生型序列。
以这种方式，构建以下菌株：
Figure 117589DEST_PATH_IMAGE335
将这些菌株进行供料分批发酵，以分析它们从葡萄糖生产羟基脂肪酸甲酯、氧代脂肪酸甲酯、羧基脂肪酸甲酯和氨基脂肪酸甲酯的能力。如实施例8中描述，这用来自DASGIP的8倍平行发酵系统进行。
显示在加入1％ （v/v）甲醇时，这些菌株能够从葡萄糖形成月桂酸甲酯、羟基月桂酸甲酯、氧代月桂酸甲酯、羧基月桂酸甲酯和氨基月桂酸甲酯以及十四酸甲酯、羟基十四酸甲酯、氧代十四酸甲酯、羧基十四酸甲酯和氨基十四酸甲酯。
实施例24：通过大肠杆菌菌株生产氨基月桂酸和氨基十四酸，所述大肠杆菌菌株缺失基因fadE并具有来自加州月桂的基因synUcTE、来自枯草芽孢杆菌的ald和来自紫色色杆菌的Cv_2025的表达载体，并组合有来自泊库岛食烷菌SK2的基因ABO_0200、 ABO_0201和ABO_0203的表达载体
为了产生具有来自加州月桂的基因synUcTE、来自枯草芽孢杆菌的ald和来自紫色色杆菌的Cv_2025的表达载体，并组合有来自库岛食烷菌SK2的基因ABO_0200、 ABO_0201和ABO_0203 (SEQ ID No.117)（编码铁氧还蛋白(ABO_0200; SEQ ID No.118)、CYP153单加氧酶(ABO_0201; SEQ ID No.119)和铁氧还蛋白氧化还原酶(ABO_0203; SEQ ID No.120)）的表达载体的大肠杆菌菌株，产生大肠杆菌JW5020-1 KanS的电感受态细胞。这以本领域技术人员已知的方式进行。
JW5020-1 KanS连续用以下质粒转化：
并铺板至含有卡那霉素(50 µg/ml)和氨苄青霉素(100 µg/ml)的LB琼脂板上。通过质粒制备和分析性限制性分析来检查转化子中正确质粒的存在。
以这种方式，构建以下菌株：
Figure 133135DEST_PATH_IMAGE337
将该菌株进行供料分批发酵，以分析它从葡萄糖生产羟基脂肪酸、氧代脂肪酸、羧基脂肪酸和氨基脂肪酸的能力。如实施例8中描述，这用来自DASGIP的8倍平行发酵系统进行。
显示该菌株能够从葡萄糖形成月桂酸、羟基月桂酸、氧代月桂酸、羧基月桂酸和氨基月桂酸以及十四酸、羟基十四酸、氧代十四酸、羧基十四酸和氨基十四酸。

Claims (23)

1.微生物，其具有第一种遗传修饰，从而相比于它的野生型，它能够从至少一种简单碳源形成更多的羧酸或羧酸酯，
其特征在于，所述微生物具有第二种遗传修饰，该遗传修饰包括所述微生物相比于它的野生型显示出至少一种酶E1的提高的活性，
所述酶E1催化羧酸或羧酸酯转化为对应的ω-羟基羧酸或ω-羟基-羧酸酯。
2.权利要求1的微生物，其特征在于所述酶E1选自组：
EC 1.14.15.3的E1a P450烷羟化酶和E1b AlkB烷羟化酶。
3.权利要求1或2的微生物，其特征在于第二种遗传修饰另外包含所述微生物具有选自以下酶的相比于它的野生型提高的活性：
酶E2，其催化ω-氧代羧酸或ω-氧代羧酸酯转化为对应的ω-氨基羧酸或ω-氨基羧酸酯，
酶E3，其催化α-酮基羧酸转化为氨基酸，
酶E4，其催化ω-羟基羧酸或ω-羟基羧酸酯转化为对应的ω-氧代羧酸或ω-氧代羧酸酯，和
酶E5，其催化ω-氧代羧酸或ω-氧代羧酸酯转化为对应的ω-羧基羧酸或ω-羧基羧酸酯。
4.前述权利要求中至少一项的微生物，其特征在于所述第二种遗传修饰包含选自E1E2E3、E1E2E3E4、E1E5和E1E4E5的酶的提高的活性的组合。
5.权利要求2-4中至少一项的微生物，其特征在于
所述酶E2为ω-转氨酶，
所述酶E3为EC 1.4.1.1的丙氨酸脱氢酶，
所述酶E4为EC 1.1.3.20的脂肪醇氧化酶、EC 1.1.99.-的AlkJ醇脱氢酶或EC 1.1.1.1或EC 1.1.1.2的醇脱氢酶，和
所述酶E5为EC 1.2.1.3、EC 1.2.1.4或EC 1.2.1.5的醛脱氢酶。
6.前述权利要求中至少一项的微生物，其特征在于所述酶E1为由alkBGT编码的来自恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）GPo1的烷单加氧酶和具有多肽序列的蛋白，其中多达60％的氨基酸残基相比于上述参考序列通过缺失、插入、取代或其组合而修饰，并且其仍具有至少50％的具有相应的、上文提及的参考序列的蛋白的活性。
7.前述权利要求中至少一项的微生物，其特征在于所述第二种遗传修饰另外包含所述微生物相比于它的野生型形成更多的alkL基因产物。
8.权利要求7的微生物，其特征在于所述alkL基因产物由选自革兰氏阴性细菌的生物的alkL基因所编码，所述革兰氏阴性细菌尤其来自于含有以下、优选由其组成的组：假单胞菌属种（Pseudomonas sp.）、固氮菌属种（Azotobacter sp.）、脱亚硫酸菌属种（Desulfitobacterium sp.）、伯克氏菌属种（Burkholderia sp.），优选洋葱伯克氏菌（Burkholderia cepacia）、黄色单胞菌属种（Xanthomonas sp.）、红杆菌属种（Rhodobacter sp.）、青枯菌属种（Ralstonia sp.）、代尔夫特菌属种（Delftia sp.）和立克次体属种（Rickettsia sp.）、Oceanicaulis sp.、柄杆菌属种（Caulobacter sp.）、海杆菌属种（Marinobacter sp.）和红假单胞菌属种（Rhodopseudomonas sp.），优选恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）、Oceanicaulis alexandrii、水油海杆菌(Marinobacter aquaeolei)，尤其是恶臭假单胞菌GPo1和P1、Oceanicaulis alexandrii HTCC2633、柄杆菌属种K31和水油海杆菌VT8。
9.权利要求7或8至少一项的微生物，其特征在于所述alkL基因产物选自：由Seq ID No.1和Seq ID No.3编码的蛋白和
具有多肽序列Seq ID No.2、Seq ID No.2、Seq ID No.4、Seq ID No.5、Seq ID No.6或Seq ID No.7的蛋白和
具有这样多肽序列的蛋白，其中相对于Seq ID No.2、Seq ID No.4、Seq ID No.5、Seq ID No.6或Seq ID No.7多达60％的氨基酸残基通过缺失、插入、取代或其组合而修饰，并且其仍具有至少50％的具有相应的参考序列Seq ID No.2、Seq ID No.4、Seq ID No.5、Seq ID No.6或Seq ID No.7的蛋白的活性。
10.前述权利要求中至少一项的微生物，其特征在于它选自
大肠杆菌、假单胞菌属种（Pseudomonas sp.）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）、施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）、不动杆菌属种（Acinetobacter sp.）、伯克氏菌属种（Burkholderia sp.）、泰国伯克氏菌（Burkholderia thailandensis）、蓝藻（Cyanobakterien）、克雷伯氏菌属种（Klebsiella sp.）、产酸克雷伯氏菌（Klebsiellaoxytoca）、沙门氏菌属种（Salmonella sp.）、根瘤菌属种（Rhizobium sp.）和苜蓿根瘤菌（Rhizobium meliloti）、芽孢杆菌属种（Bacillus sp.）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、梭菌属种（Clostridium sp.）、棒杆菌属种（Corynebacterium sp.）、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）、短杆菌属种（Brevibacterium sp.）、小球藻属种（Chlorella sp.）和念珠藻属种（Nostoc sp.）。
11.前述权利要求中至少一项的微生物，其特征在于所述第一种遗传修饰为至少一种选自以下组的酶的相比于所述微生物野生型的酶活性提高的活性：
Ei 酰基-ACP硫酯酶，优选EC 3.1.2.14或EC 3.1.2.22的,
Eii 酰基-CoA硫酯酶，优选EC 3.1.2.2、EC 3.1.2.18、EC 3.1.2.19、EC 3.1.2.20或EC 3.1.2.22的,
Eiib 酰基-CoA:ACP转酰酶,
Eiii 聚酮合酶，其催化参与羧酸和羧酸酯的合成的反应，和
Eiv 己酸合酶。
12.前述权利要求中至少一项的微生物，其特征在于它具有第三种遗传修饰，该遗传修饰包含至少一种酶Eiib、Ev、Evi或Evii的相比于所述微生物野生型的酶活性提高的活性，所述酶参与转化羧酸或ω-官能化的羧酸为羧酸酯或ω-官能化的羧酸酯，并选自组：
Eiib 酰基-CoA:ACP转酰酶，其转化ACP硫酯为CoA硫酯或者转化CoA硫酯为ACP硫酯，
Ev 蜡酯合酶或醇O-酰基转移酶，优选EC 2.3.1.75或EC 2.3.1.84的，其催化从酰基-辅酶A硫酯或酰基-ACP硫酯和醇合成酯，
Evi 酰基-CoA (辅酶A)合酶，优选EC 6.2.1.3的，其催化酰基-辅酶A硫酯的合成，和
Evii 酰基硫酯酶，优选EC 3.1.2.2、EC 3.1.2.4、EC 3.1.2.18、EC 3.1.2.19、EC 3.1.2.20或EC 3.1.2.22的，其催化酰基硫酯与醇转化为羧酸酯。
13.前述权利要求中至少一项的微生物，其特征在于所述第三种遗传修饰包含选自以下的酶的提高的活性的组合：
Ev、Evii、EvEvi、EviEvii和EviEviiEiib。
14.前述权利要求中至少一项的微生物，其特征在于它具有第四种遗传修饰，该遗传修饰包含至少一种选自以下组的酶的相比于所述微生物野生型的酶活性提高的活性：
Eiib 酰基-CoA (辅酶A):ACP (酰基载体蛋白)转酰酶，其转化ACP硫酯为CoA硫酯或者转化CoA硫酯为ACP硫酯，
Evi 酰基-CoA (辅酶A)合酶，优选EC 6.2.1.3的，其优选催化酰基辅酶A硫酯的合成，
Eviii 酰基-CoA (辅酶A)还原酶，优选EC 1.2.1.42或EC 1.2.1.50的，其优选催化酰基-辅酶A硫酯的还原为对应的烷-1-醛或烷-1-醇，
Eix 脂肪酸还原酶（也为脂肪醛脱氢酶或芳醛氧化还原酶），优选EC 1.2.1.3、EC 1.2.1.20或EC 1.2.1.48的，其优选催化烷酸还原为对应的烷-1-醛，和
Ex 酰基-ACP (酰基载体蛋白)还原酶，优选EC 1.2.1.80的，其优选催化酰基-ACP硫酯还原为对应的烷-1-醛或烷-1-醇。
15.前述权利要求中至少一项的微生物，其特征在于所述第二种遗传修饰包含选自以下的酶的提高的活性的组合：
Eviii、Eix、Ex、EviEviii和EviExEiib。
16.前述权利要求中至少一项的微生物，其特征在于它含有第五种遗传修饰，该遗传修饰，包含至少一种选自以下组的酶的相比于所述微生物野生型的酶活性降低的活性：
Ea 酰基-CoA合酶，优选EC 6.2.1.3的，其催化酰基-辅酶A硫酯的合成，
Eb 酰基-CoA脱氢酶，优选EC 1.3.99.-、EC 1.3.99.3或EC 1.3.99.13的，其催化酰基-辅酶A硫酯的氧化以产生对应的烯酰-辅酶A硫酯，
Ec 酰基-CoA氧化酶，优选EC 1.3.3.6的，其催化酰基-辅酶A硫酯氧化为对应的烯酰-辅酶A硫酯，
Ed 烯酰-CoA水合酶，优选EC 4.2.1.17或EC 4.2.1.74的，其催化烯酰-辅酶A硫酯水合为对应的3-羟酰基-辅酶A硫酯，
Ee 3-羟酰基-CoA脱氢酶，优选EC 1.1.1.35或EC 1.1.1.211的，其催化3-羟酰基-辅酶A硫酯氧化为对应的3-氧代酰基-辅酶A硫酯，和
Ef 乙酰基-CoA酰基转移酶，优选EC 2.3.1.16的，其催化乙酰基从3-氧代酰基-辅酶A硫酯转移至辅酶A，并由此产生缩短两个碳原子的酰基-辅酶A硫酯。
17.前述权利要求中至少一项的微生物用于生产ω-官能化的羧酸和ω-官能化的羧酸酯的用途，尤其是权利要求3或4的微生物，用于生产ω-氨基-羧酸和ω-氨基羧酸酯的用途，尤其是用于生产ω-氨基月桂酸和ω-氨基月桂酸甲酯和ω-氨基月桂酸乙酯以及ω-氨基己酸和ω-氨基己酸甲酯和ω-氨基己酸乙酯的用途。
18.用于从简单碳源生产ω-官能化的羧酸和ω-官能化的羧酸酯的方法，其包括以下方法步骤
I)将权利要求1-16中至少一项的微生物与包含所述简单碳源的培养基接触，
II)将所述微生物在能够使所述微生物从简单碳源形成ω-官能化的羧酸或ω-官能化的羧酸酯的条件下培养，和
III)任选分离形成的ω-官能化的羧酸或ω-官能化的羧酸酯。
19.权利要求18的方法，其尤其利用权利要求3-15和18中至少一项的微生物从简单碳源生产ω-氨基羧酸和ω-氨基羧酸酯，尤其是ω-氨基月桂酸和ω-氨基月桂酸甲酯和ω-氨基月桂酸乙酯以及ω-氨基己酸和ω-氨基己酸甲酯和ω-氨基己酸乙酯。
20.用于生产基于ω-氨基羧酸、尤其是基于ω-氨基月桂酸或ω-氨基己酸的聚酰胺的方法，其包括以下方法步骤：
(a1)通过权利要求21的方法生产ω-氨基羧酸，
(a2)不同ω-氨基羧酸的任选混合物的聚合而获得聚酰胺，其中基于所有所述方法中使用的ω-氨基羧酸的至少一部分ω-氨基羧酸，优选至少50重量%在步骤(a1)中产生，或用来自步骤(a1)的ω-氨基羧酸。
21.聚酰胺，其通过权利要求20的方法可获得，尤其是聚酰胺12和聚酰胺6。
22.权利要求18的方法，其尤其利用权利要求3-16中至少一项的微生物从简单碳源生产ω-羟基羧酸和ω-羟基羧酸酯，尤其是ω-羟基月桂酸和ω-羟基月桂酸甲酯和ω-羟基月桂酸乙酯以及ω-羟基己酸和ω-羟基己酸甲酯和ω-羟基己酸乙酯。
23.权利要求18的方法，其尤其利用权利要求3-18中至少一项的微生物从简单碳源生产ω-羧基羧酸和ω-羧基羧酸酯，尤其是ω-羧基月桂酸和ω-羧基月桂酸甲酯和ω-羧基月桂酸乙酯以及ω-羧基己酸和ω-羧基己酸甲酯和ω-羧基己酸乙酯。
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