CN118139983A - 用于一碳利用的正交代谢框架 - Google Patents
用于一碳利用的正交代谢框架 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118139983A CN118139983A CN202280068341.5A CN202280068341A CN118139983A CN 118139983 A CN118139983 A CN 118139983A CN 202280068341 A CN202280068341 A CN 202280068341A CN 118139983 A CN118139983 A CN 118139983A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- coa
- enzyme
- formyl
- formaldehyde
- conversion
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 58
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 title description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 126
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 126
- SXMOKYXNAPLNCW-GORZOVPNSA-N formyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 SXMOKYXNAPLNCW-GORZOVPNSA-N 0.000 claims abstract description 124
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 116
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 111
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 47
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 claims abstract description 16
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical group O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 434
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 160
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical group OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 140
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 92
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 80
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 claims description 80
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 55
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 50
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 claims description 47
- 108090001018 hexadecanal dehydrogenase (acylating) Proteins 0.000 claims description 43
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical group CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical group [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 41
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 25
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 20
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 102000005488 Thioesterase Human genes 0.000 claims description 18
- 108020002982 thioesterase Proteins 0.000 claims description 18
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 claims description 17
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical group O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical group C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 108010048916 alcohol dehydrogenase (acceptor) Proteins 0.000 claims description 11
- TVISEJUYYBUVNV-UHFFFAOYSA-N formyl dihydrogen phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC=O TVISEJUYYBUVNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 108020002663 Aldehyde Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 10
- 102000005369 Aldehyde Dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 10
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 10
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 claims description 8
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 claims description 8
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 6
- 108030007102 Formate kinases Proteins 0.000 claims description 6
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 4
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000011707 mineral Substances 0.000 claims description 4
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 4
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 4
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 4
- 102000005870 Coenzyme A Ligases Human genes 0.000 claims description 3
- 108010011449 Long-chain-fatty-acid-CoA ligase Proteins 0.000 claims description 3
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims description 3
- 108010009977 methane monooxygenase Proteins 0.000 claims description 3
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 2
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 2
- 108010053754 Aldehyde reductase Proteins 0.000 claims description 2
- 102100027265 Aldo-keto reductase family 1 member B1 Human genes 0.000 claims description 2
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 2
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 claims 1
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 claims 1
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 claims 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims 1
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 44
- 238000009833 condensation Methods 0.000 abstract description 30
- 230000005494 condensation Effects 0.000 abstract description 30
- 101710186882 2-hydroxyacyl-CoA lyase Proteins 0.000 abstract description 26
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 abstract description 13
- 230000008238 biochemical pathway Effects 0.000 abstract description 2
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 215
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 138
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 74
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 74
- 239000000047 product Substances 0.000 description 69
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 64
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 63
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 62
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 53
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N Glycolaldehyde Chemical compound OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 45
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 42
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 34
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 29
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 28
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 26
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 24
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 23
- 108010069175 acyl-CoA transferase Proteins 0.000 description 22
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 20
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 17
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 17
- 239000011678 thiamine pyrophosphate Substances 0.000 description 17
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 16
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 235000008170 thiamine pyrophosphate Nutrition 0.000 description 16
- YXVCLPJQTZXJLH-UHFFFAOYSA-N thiamine(1+) diphosphate chloride Chemical compound [Cl-].CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N YXVCLPJQTZXJLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000006870 function Effects 0.000 description 15
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 15
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 15
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O NAD(+) Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O 0.000 description 14
- NBBJYMSMWIIQGU-UHFFFAOYSA-N Propionic aldehyde Chemical compound CCC=O NBBJYMSMWIIQGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 14
- 108010032737 oxalyl CoA decarboxylase Proteins 0.000 description 14
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 14
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 13
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 13
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 13
- HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N glyoxylic acid Chemical compound OC(=O)C=O HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 13
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 13
- ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 2-Butanone Chemical compound CCC(C)=O ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- RBNPOMFGQQGHHO-UWTATZPHSA-N D-glyceric acid Chemical compound OC[C@@H](O)C(O)=O RBNPOMFGQQGHHO-UWTATZPHSA-N 0.000 description 12
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 12
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 12
- 150000001323 aldoses Chemical class 0.000 description 12
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 12
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 12
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-M Glycolate Chemical compound OCC([O-])=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 11
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 10
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 10
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 10
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 10
- KLHKNYVUTZICKN-GRFIIANRSA-N s-[2-[3-[[(2r)-4-[[[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-4-hydroxy-3-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-hydroxyphosphoryl]oxy-2-hydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoylamino]ethyl] 2-hydroxyethanethioate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KLHKNYVUTZICKN-GRFIIANRSA-N 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- 238000013461 design Methods 0.000 description 9
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 9
- 230000019525 primary metabolic process Effects 0.000 description 9
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 8
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 8
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 8
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 8
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 8
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 8
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 8
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 8
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 8
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 8
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 8
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 8
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 8
- -1 phosphoformyl Chemical group 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 7
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 7
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 7
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 7
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 7
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- AIJULSRZWUXGPQ-UHFFFAOYSA-N Methylglyoxal Chemical compound CC(=O)C=O AIJULSRZWUXGPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YRKCREAYFQTBPV-UHFFFAOYSA-N acetylacetone Chemical compound CC(=O)CC(C)=O YRKCREAYFQTBPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N butyric aldehyde Natural products CCCC=O ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 6
- XLSMFKSTNGKWQX-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetone Chemical compound CC(=O)CO XLSMFKSTNGKWQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 6
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 6
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 6
- AFENDNXGAFYKQO-VKHMYHEASA-N (S)-2-hydroxybutyric acid Chemical compound CC[C@H](O)C(O)=O AFENDNXGAFYKQO-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- 150000000180 1,2-diols Chemical class 0.000 description 5
- MNQZXJOMYWMBOU-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde Chemical compound OC[C@@H](O)C=O MNQZXJOMYWMBOU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- 108090001042 Hydro-Lyases Proteins 0.000 description 5
- 102000004867 Hydro-Lyases Human genes 0.000 description 5
- 241001642876 Rhodospirillales bacterium Species 0.000 description 5
- 239000004280 Sodium formate Substances 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 5
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 5
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 5
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 5
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- HLBBKKJFGFRGMU-UHFFFAOYSA-M sodium formate Chemical compound [Na+].[O-]C=O HLBBKKJFGFRGMU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 235000019254 sodium formate Nutrition 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 5
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 5
- AKXKFZDCRYJKTF-UHFFFAOYSA-N 3-Hydroxypropionaldehyde Chemical compound OCCC=O AKXKFZDCRYJKTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 4
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 4
- 241001468165 Clostridium aminobutyricum Species 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 241000605936 Oxalobacter formigenes Species 0.000 description 4
- 108700023175 Phosphate acetyltransferases Proteins 0.000 description 4
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 4
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 4
- 229940124277 aminobutyric acid Drugs 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 4
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 4
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 4
- 238000002856 computational phylogenetic analysis Methods 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- VNOYUJKHFWYWIR-ITIYDSSPSA-N succinyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 VNOYUJKHFWYWIR-ITIYDSSPSA-N 0.000 description 4
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 4
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 4
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 4
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 235000019190 thiamine hydrochloride Nutrition 0.000 description 4
- 239000011747 thiamine hydrochloride Substances 0.000 description 4
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- RBNPOMFGQQGHHO-UHFFFAOYSA-N -2,3-Dihydroxypropanoic acid Natural products OCC(O)C(O)=O RBNPOMFGQQGHHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QPRQEDXDYOZYLA-UHFFFAOYSA-N 2-methylbutan-1-ol Chemical compound CCC(C)CO QPRQEDXDYOZYLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000008146 Acetate-CoA ligase Human genes 0.000 description 3
- 108010049926 Acetate-CoA ligase Proteins 0.000 description 3
- 108010031025 Alanine Dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 description 3
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 3
- 101100119902 Escherichia coli (strain K12) fdoG gene Proteins 0.000 description 3
- 241000589989 Helicobacter Species 0.000 description 3
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 3
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 3
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 3
- ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N cephalexin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)C)C(O)=O)=CC=CC=C1 ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 3
- CATSNJVOTSVZJV-UHFFFAOYSA-N heptan-2-one Chemical compound CCCCCC(C)=O CATSNJVOTSVZJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 238000012750 in vivo screening Methods 0.000 description 3
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 3
- 239000003317 industrial substance Substances 0.000 description 3
- 238000003367 kinetic assay Methods 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- XNLICIUVMPYHGG-UHFFFAOYSA-N pentan-2-one Chemical compound CCCC(C)=O XNLICIUVMPYHGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 3
- OAJLVMGLJZXSGX-SLAFOUTOSA-L (2s,3s,4r,5r)-2-(6-aminopurin-9-yl)-5-methanidyloxolane-3,4-diol;cobalt(3+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7 Chemical compound [Co+3].O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]([CH2-])O[C@@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1.[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP([O-])(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O OAJLVMGLJZXSGX-SLAFOUTOSA-L 0.000 description 2
- ZKBSDMGDEJPNGS-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydroxypropanoic acid Chemical compound OCC(O)C(O)=O.OCC(O)C(O)=O ZKBSDMGDEJPNGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UFYGCFHQAXXBCF-UHFFFAOYSA-N 2,4-dihydroxybutanoic acid Chemical compound OCCC(O)C(O)=O UFYGCFHQAXXBCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTSNVMMGKAPSRT-UHFFFAOYSA-N 2-Hydroxy-4-oxopentanoic acid Chemical compound CC(=O)CC(O)C(O)=O QTSNVMMGKAPSRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NVIHALDXJWGLFD-UHFFFAOYSA-N 2-Methyl-3-hydroxyvaleric acid Chemical compound CCC(O)C(C)C(O)=O NVIHALDXJWGLFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MBIQENSCDNJOIY-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-2-methylbutyric acid Chemical compound CCC(C)(O)C(O)=O MBIQENSCDNJOIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NGEWQZIDQIYUNV-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-3-methylbutyric acid Chemical compound CC(C)C(O)C(O)=O NGEWQZIDQIYUNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGMMREBHCYXQMA-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyheptanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)C(O)=O RGMMREBHCYXQMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BWLBGMIXKSTLSX-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyisobutyric acid Chemical compound CC(C)(O)C(O)=O BWLBGMIXKSTLSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PFNHSEQQEPMLNI-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-1-pentanol Chemical compound CCCC(C)CO PFNHSEQQEPMLNI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QWGRWMMWNDWRQN-UHFFFAOYSA-N 2-methylpropane-1,3-diol Chemical compound OCC(C)CO QWGRWMMWNDWRQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXDRERIMPLZLU-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-2-methylbutanoic acid Chemical compound CC(O)C(C)C(O)=O VEXDRERIMPLZLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HSJKGGMUJITCBW-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxybutanal Chemical compound CC(O)CC=O HSJKGGMUJITCBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DBXBTMSZEOQQDU-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxyisobutyric acid Chemical compound OCC(C)C(O)=O DBXBTMSZEOQQDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ALRHLSYJTWAHJZ-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxypropionic acid Chemical compound OCCC(O)=O ALRHLSYJTWAHJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100235004 Acetobacterium woodii (strain ATCC 29683 / DSM 1030 / JCM 2381 / KCTC 1655 / WB1) lctD gene Proteins 0.000 description 2
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 2
- 241000603711 Actinomycetospora chiangmaiensis Species 0.000 description 2
- 102100039702 Alcohol dehydrogenase class-3 Human genes 0.000 description 2
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 2
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 2
- 101100246459 Escherichia coli (strain K12) puuC gene Proteins 0.000 description 2
- 101001065501 Escherichia phage MS2 Lysis protein Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588749 Klebsiella oxytoca Species 0.000 description 2
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 2
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- XCOBLONWWXQEBS-KPKJPENVSA-N N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide Chemical compound C[Si](C)(C)O\C(C(F)(F)F)=N\[Si](C)(C)C XCOBLONWWXQEBS-KPKJPENVSA-N 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 241001165050 Ocala Species 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 108010065027 Propanediol Dehydratase Proteins 0.000 description 2
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 2
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 2
- 244000300264 Spinacia oleracea Species 0.000 description 2
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 description 2
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 2
- 230000001195 anabolic effect Effects 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 238000007357 dehydrogenase reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- RXKJFZQQPQGTFL-UHFFFAOYSA-N dihydroxyacetone Chemical compound OCC(=O)CO RXKJFZQQPQGTFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- DCKSLNCVZHTEJK-UHFFFAOYSA-N formic acid;oxalic acid Chemical compound OC=O.OC(=O)C(O)=O DCKSLNCVZHTEJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010028610 formyl-coenzyme A transferase Proteins 0.000 description 2
- 101150030625 fucO gene Proteins 0.000 description 2
- 108700039708 galantide Proteins 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 101150106953 glcD gene Proteins 0.000 description 2
- 108010051015 glutathione-independent formaldehyde dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 2
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 2
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ROBFUDYVXSDBQM-UHFFFAOYSA-N hydroxymalonic acid Chemical compound OC(=O)C(O)C(O)=O ROBFUDYVXSDBQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- NNPPMTNAJDCUHE-UHFFFAOYSA-N isobutane Chemical compound CC(C)C NNPPMTNAJDCUHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N isobutanol Chemical compound CC(C)CO ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000011785 micronutrient Substances 0.000 description 2
- 235000013369 micronutrients Nutrition 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 101150106061 patD gene Proteins 0.000 description 2
- 238000003068 pathway analysis Methods 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000006861 primary carbon metabolism Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 2
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 2
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000013515 script Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 2
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 239000001373 (E)-2-methylpent-2-enoic acid Substances 0.000 description 1
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L (R)-2-Hydroxy-3-(phosphonooxy)-propanal Natural products O=C[C@H](O)COP([O-])([O-])=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L 0.000 description 1
- WXUAQHNMJWJLTG-VKHMYHEASA-N (S)-methylsuccinic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](C)CC(O)=O WXUAQHNMJWJLTG-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 102100038837 2-Hydroxyacid oxidase 1 Human genes 0.000 description 1
- UIERETOOQGIECD-ARJAWSKDSA-M 2-Methyl-2-butenoic acid Natural products C\C=C(\C)C([O-])=O UIERETOOQGIECD-ARJAWSKDSA-M 0.000 description 1
- JRQZJRDOZAJRTN-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-2,3-dimethylbutanoic acid Chemical compound CC(C)C(C)(O)C(O)=O JRQZJRDOZAJRTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DDNPKLYNPFAIEE-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-2-methyl-3-oxopropanoic acid Chemical compound O=CC(O)(C)C(O)=O DDNPKLYNPFAIEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WCUFLIBXUCELCS-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-2-methyl-4-oxopentanoic acid Chemical compound CC(=O)CC(C)(O)C(O)=O WCUFLIBXUCELCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YLYIMWJVICNSGF-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-2-methylheptanoic acid Chemical compound CCCCCC(C)(O)C(O)=O YLYIMWJVICNSGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BIEZUWIUHAKFHZ-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-2-methylpentanoic acid Chemical compound CCCC(C)(O)C(O)=O BIEZUWIUHAKFHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QWBAFPFNGRFSFB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-3-oxopropanoic acid Chemical compound O=CC(O)C(O)=O QWBAFPFNGRFSFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AIYBLGFBHQLGMH-MIZDRFBCSA-N 2-hydroxybutanoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C(O)CC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 AIYBLGFBHQLGMH-MIZDRFBCSA-N 0.000 description 1
- JRHWHSJDIILJAT-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypentanoic acid Chemical compound CCCC(O)C(O)=O JRHWHSJDIILJAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DOPZLYNWNJHAOS-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-1,2-butanediol Chemical compound CCC(C)(O)CO DOPZLYNWNJHAOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YUICRCSHEOZHST-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-4-oxopent-2-enoic acid Chemical compound CC(=O)C=C(C)C(O)=O YUICRCSHEOZHST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FYZUENZXIZCLAZ-UHFFFAOYSA-N 2-methylhept-2-enoic acid Chemical compound CCCCC=C(C)C(O)=O FYZUENZXIZCLAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QZESEQBMSFFHRY-UHFFFAOYSA-N 2-methylheptan-1-ol Chemical compound CCCCCC(C)CO QZESEQBMSFFHRY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UBNIJVDFUWZODL-UHFFFAOYSA-N 2-methylheptane-1,2-diol Chemical compound CCCCCC(C)(O)CO UBNIJVDFUWZODL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JJYWRQLLQAKNAD-UHFFFAOYSA-N 2-methylpent-2-enoic acid Chemical compound CCC=C(C)C(O)=O JJYWRQLLQAKNAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XERGTCWVYOKNAV-UHFFFAOYSA-N 2-methylpentane-1,2-diol Chemical compound CCCC(C)(O)CO XERGTCWVYOKNAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OOJRTGIXWIUBGG-UHFFFAOYSA-N 2-methylpropane-1,2,3-triol Chemical compound OCC(O)(C)CO OOJRTGIXWIUBGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SYBYTAAJFKOIEJ-UHFFFAOYSA-N 3-Methylbutan-2-one Chemical compound CC(C)C(C)=O SYBYTAAJFKOIEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FKMQLWUMYSBWQE-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-2,3-dimethylbutanoic acid Chemical compound OC(=O)C(C)C(C)(C)O FKMQLWUMYSBWQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXVVZFYATORPSX-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-2-methyl-4-oxopentanoic acid Chemical compound OC(=O)C(C)C(O)C(C)=O SXVVZFYATORPSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VBFGDSCDTYAEBA-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-2-methylheptanoic acid Chemical compound CCCCC(O)C(C)C(O)=O VBFGDSCDTYAEBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002407 ATP formation Effects 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- UIERETOOQGIECD-UHFFFAOYSA-N Angelic acid Natural products CC=C(C)C(O)=O UIERETOOQGIECD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100070115 Arabidopsis thaliana HACL gene Proteins 0.000 description 1
- 241000193398 Bacillus methanolicus Species 0.000 description 1
- 101100228546 Bacillus subtilis (strain 168) folE2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100098786 Bacillus subtilis (strain 168) tapA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100480629 Bacillus subtilis (strain 168) tatAy gene Proteins 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- 241000193165 Clostridium cylindrosporum Species 0.000 description 1
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde 3-phosphate Chemical compound O=C[C@H](O)COP(O)(O)=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZAQJHHRNXZUBTE-UHFFFAOYSA-N D-threo-2-Pentulose Natural products OCC(O)C(O)C(=O)CO ZAQJHHRNXZUBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100108235 Escherichia coli (strain K12) adhP gene Proteins 0.000 description 1
- 101100022866 Escherichia coli (strain K12) menI gene Proteins 0.000 description 1
- 101100321116 Escherichia coli (strain K12) yqhD gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000698 Formate Dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108700003564 IVA protocol Proteins 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N Methacrylic acid Chemical compound CC(=C)C(O)=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 150000007945 N-acyl ureas Chemical class 0.000 description 1
- PYVJMQVWWFEWQM-UHFFFAOYSA-N OC(C(=O)O)C(=O)O.C(C(O)C(O)C(=O)O)(=O)O Chemical compound OC(C(=O)O)C(=O)O.C(C(O)C(O)C(=O)O)(=O)O PYVJMQVWWFEWQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010718 Oxidation Activity Effects 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 241000223252 Rhodotorula Species 0.000 description 1
- KITNIIFVURZODI-FBMOWMAESA-N S-[2-[3-[[(2R)-4-[[[(2R,3S,4R,5R)-5-(6-aminopurin-9-yl)-4-hydroxy-3-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-hydroxyphosphoryl]oxy-2-hydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoylamino]ethyl] 2,3-dihydroxypropanethioate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C(O)CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KITNIIFVURZODI-FBMOWMAESA-N 0.000 description 1
- FGOMUCHJEQZFTR-MIZDRFBCSA-N S-[2-[3-[[(2R)-4-[[[(2R,3S,4R,5R)-5-(6-aminopurin-9-yl)-4-hydroxy-3-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-hydroxyphosphoryl]oxy-2-hydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoylamino]ethyl] 2,4-dihydroxybutanethioate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C(O)CCO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 FGOMUCHJEQZFTR-MIZDRFBCSA-N 0.000 description 1
- 239000011542 SDS running buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 1
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 1
- 235000019892 Stellar Nutrition 0.000 description 1
- 101100297542 Streptomyces viridochromogenes (strain DSM 40736 / JCM 4977 / BCRC 1201 / Tue 494) phpC gene Proteins 0.000 description 1
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 102100023038 WD and tetratricopeptide repeats protein 1 Human genes 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 101150019439 aldB gene Proteins 0.000 description 1
- 150000004716 alpha keto acids Chemical class 0.000 description 1
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000889 atomisation Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000011203 carbon fibre reinforced carbon Substances 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N carbonic acid Chemical class OC(O)=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001925 catabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 1
- 239000007859 condensation product Substances 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000006114 decarboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 229940120503 dihydroxyacetone Drugs 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 150000002009 diols Chemical class 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 101150035934 eutG gene Proteins 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 101150039130 fadM gene Proteins 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 230000004136 fatty acid synthesis Effects 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- XVVLAOSRANDVDB-UHFFFAOYSA-N formic acid Chemical compound OC=O.OC=O XVVLAOSRANDVDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 101150043213 frmA gene Proteins 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MNQZXJOMYWMBOU-UHFFFAOYSA-N glyceraldehyde Chemical compound OCC(O)C=O MNQZXJOMYWMBOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010062584 glycollate oxidase Proteins 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000007412 host metabolism Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000007852 inverse PCR Methods 0.000 description 1
- 239000001282 iso-butane Substances 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- VIWKEBOLLIEAIL-FBMOWMAESA-N lactoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C(O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 VIWKEBOLLIEAIL-FBMOWMAESA-N 0.000 description 1
- 101150090611 ltaE gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005065 mining Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N n-[(2s,3r,4r,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-acetamido-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](OC=2C=C3OC(=O)C=C(C)C3=CC=2)O[C@@H]1CO UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- 206010053219 non-alcoholic steatohepatitis Diseases 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- OZVGVRNUXRBFMZ-UHFFFAOYSA-N oxaldehydic acid Chemical compound OC(=O)C=O.OC(=O)C=O OZVGVRNUXRBFMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LFGREXWGYUGZLY-UHFFFAOYSA-N phosphoryl Chemical group [P]=O LFGREXWGYUGZLY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012809 post-inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N pyridoxal 5'-phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP(O)(O)=O)C(C=O)=C1O NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000007682 pyridoxal 5'-phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011589 pyridoxal 5'-phosphate Substances 0.000 description 1
- 229960001327 pyridoxal phosphate Drugs 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000006798 ring closing metathesis reaction Methods 0.000 description 1
- 102220076589 rs796052863 Human genes 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000012932 thermodynamic analysis Methods 0.000 description 1
- UIERETOOQGIECD-ONEGZZNKSA-N tiglic acid Chemical compound C\C=C(/C)C(O)=O UIERETOOQGIECD-ONEGZZNKSA-N 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000013579 wash concentrate Substances 0.000 description 1
- 101150102457 ybgC gene Proteins 0.000 description 1
- 101150103853 yciA gene Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
- C12Y401/02—Aldehyde-lyases (4.1.2)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
提供了用于将C1底物转化为含有一个以上碳的产物而不产生作为中间产物的中心代谢构件的系统和方法。在一个实施方案中，所述系统/方法可以包括一种生物化学途径，以实现基于甲酰基‑CoA延伸(FORCE)反应的C1利用的正交平台。在一个实施方案中，所述系统/方法可以包括甲酰基‑CoA和含羰基分子之间的酮醇缩合。在一个实施方案中，所述系统/方法可以包括一种通过酶2‑羟基酰基‑CoA裂解酶(HACL)催化的反应。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年7月12日提交的美国临时专利申请No.63/233,589的权益，所述临时申请通过引用的方式将其内容整体并入本文。
关于联邦政府资助的研究或研发的声明
本发明是在政府支持下完成，并获得能源部和联合基因组研究所授予的DE-AR0001508和DE-EE0008499的奖励。政府享有在本文所公开的发明中的某些权利。
背景技术
1.公开的领域
本发明涉及将含碳底物生物转化为产物的领域。
2.背景说明
新陈代谢是所有活细胞的保守特征之一，其通过进化来优化生物体的生存和繁殖能力。所有的生物体，那些从单细胞细菌到像人类一样复杂的生物体，都显示出一种典型的新陈代谢结构，这种代谢结构是随着中央代谢的发展而演变的，中央代谢是分解代谢(降解)和合成代谢(合成)途径之间的纽带，通过这些途径，碳源和能源被用于细胞组分和代谢产物的生物合成。通常其被称为“领结”或“沙漏”结构，这种结构可以通过一碳(“C1”)底物的新陈代谢来进行例证。
然而，大多数人所具有的鲁棒性和可塑性带来了巨大的工程挑战。例如，出于产生和平衡前体代谢产物的使用的需要，许多细胞已经进化出复杂的调节机制来控制途径通量。此外，由于新陈代谢途径是由进化和给定的适应性优势决定的，而不是最大限度地利用或合成所需化合物，因此天然途径往往会由于其内在的新陈代谢效率低下以及产物形成与生长维持反应之间的负面串扰而限制了其可获得的产物滴度、速率和产量。C1底物再次体现了这一点，因为目前同时包含天然途径和合成途径的从这些分子合成生物产物的方法必须同时设计C1同化、中心代谢和产物合成途径，以有效生产目标化学品。因此，尽管C1分子可以被微生物利用用来生长，但通过C1原料生物生产的工业化学品以及在C1底物上高效生长工业生物体仍然是悬而未决的挑战，尽管此类过程存在激励和前景。迄今为止，对于设计C1生物转化的尝试，即使是那些利用合成途径或新颖酶设计的尝试，也依赖于中心碳代谢来利用各种C1底物作为碳源和/或用于产物合成。这些设计需要重新连接宿主的代谢网络，以适应C1生物转化，这已被证明是具有挑战性的。
发明内容
所述产物的生成可以通过使用正交生物系统来促进从C1底物来产生，所述产物例如工业化学品。所述正交系统不太可能影响其生物环境或受其生物环境的影响，与修改或重新利用自然部分相比，正交系统可以实现更可预测和一致的行为。正交代谢范式可能是蝴蝶结架构内工程的有力替代方案，因为绕过中央代谢的目标产物途径既可以更直接(即更少的步骤)，又可以规避许多内在的调节机制以及碳和能源的低效。
对于C1底物而言，由于它们不具有任何预先存在的碳-碳键，因此原则上没有理由在获得所需产物的过程中首先产生中心代谢构建模块。因此，在提供了正确的生物化学条件下，有机会建立一个基于C1分子直接合成产物的正交代谢框架。
本发明涉及基于甲酰基-CoA延伸(FORCE)反应实现C1利用正交平台的生物化学途径的概念化和设计。该方法依赖于甲酰基-CoA和含羰基分子之间的酮醇缩合反应。这些反应可以由2-羟基酰基-CoA裂解酶(HACL)来催化。HACL(以及相关的草酰基-CoA脱羧酶，OXC17)可以利用具有宽链长度和功能化的含羰基受体以产生适用于广泛生物化学转化的酰基-CoA，所述含羰基受体包括C1化合物甲醛。除了产物合成之外，FORCE途径还可以作为基础，从而能够通过产生多碳化合物来实现在非天然C1底物上生长，所述多碳化合物是宿主微生物的天然底物。
在本发明的一个方面，与红螺旋杆菌(Rhodospirillales bacterium)URHD0017的2-羟基酰基-CoA合成酶相比，重组2-羟基酰基-CoA合成酶能够以至少2倍、或者3倍以上的速率来通过含羰基化合物和甲酰基-CoA酶促形成2-羟基酰基-CoA。
在一些实施方案中，所述含羰基化合物选自由醛和酮组成的组。在一些实施方案中，2-羟基酰基-CoA合成酶选自表1或表2。在一些实施方案中，2-羟基酰基-CoA合成酶与表1或表2中的酶具有90％或更高的同一性。
本发明公开的另一方面，所述酶进一步涉及通过使一碳底物与酶催化剂接触来生产甲酰基-CoA。另一方面，所述酶进一步涉及通过使底物与酶催化剂接触以将底物转化为含羰基化合物。在另一个方面，所述酶进一步涉及将2-羟基酰基-CoA转化为有机化学产物。在另一个方面，所述含羰基化合物是具有至少一个取代基的醛。
在一些实施方案中，所述醛取代基可以是羟基、羰基、烷基或胺。在一些实施方案中，所述含羰基化合物是酮，并且该酮是甲基酮。
在一些实施方案中，所述一碳底物是甲醛，并且所述产生甲酰基-CoA的酶催化剂是酰基-CoA还原酶(酰化醛脱氢酶)，其可催化甲醛转化为甲酰基-CoA。
在一些实施方案中，所述一碳底物是甲醇，并且所述产生甲酰基-CoA的酶催化剂是一种甲醇脱氢酶，其可催化甲醇转化为甲醛；和一种酰基-CoA还原酶(酰化醛脱氢酶)，其可催化甲醛转化为甲酰基-CoA。
在一些实施方案中，所述一碳底物是甲烷，并且所述产生甲酰基-CoA的酶催化剂是一种甲烷单加氧酶，其催化甲烷转化为甲醇；一种甲醇脱氢酶，其催化甲醇转化为甲醛；以及一种酰基-CoA还原酶(酰化醛脱氢酶)，其催化甲醛转化为甲酰基-CoA。
在一些实施方案中，所述一碳底物是甲酸，并且所述产生甲酰基-CoA的酶催化剂是一种催化甲酸转化为甲酰基-CoA的酰基-CoA合成酶或者一种催化甲酸转化为甲酰基-磷酸的甲酸激酶以及一种催化甲酰基-磷酸转化为甲酰基-CoA的磷酸甲酰基转移酶。
在一些实施方案中，所述一碳底物是二氧化碳，并且所述产生甲酰基-CoA的酶催化剂是一种催化二氧化碳转化为甲酸的二氧化碳还原酶；以及一种催化甲酸转化为甲酰基-CoA的酰基-CoA合成酶；或者一种催化甲酸转化为甲酰基-磷酸的甲酸激酶以及一种催化甲酰基-磷酸转化为甲酰基-CoA的磷酸甲酰基-转移酶。
在一些实施方案中，从2-羟基酰基-CoA衍生的产物是一种醛，并且其中将2-羟基酰基-CoA转化为所述产物的酶催化剂是一种酰基-CoA还原酶，其可催化2-羟基酰基-CoA转化为醛。
在一些实施方案中，从2-羟基酰基-CoA衍生的产物是一种醇，并且其中将2-羟基酰基-CoA转化为所述产物的酶催化剂是一种催化2-羟基酰基-CoA转化为醛的酰基-CoA还原酶；以及一种催化醛转化为醇的醇脱氢酶(醛还原酶)。
在一些实施方案中，从2-羟基酰基-CoA衍生的产物是一种羧酸，并且其中将2-羟基酰基-CoA转化为所述产物的酶催化剂是一种硫酯酶，其催化2-羟基酰基-CoA转化为羧酸。
在一些实施方案中，所述酶催化剂包含在一种重组微生物中，所述重组微生物携带有用于表达每种酶的基因。
在一些实施方案中，将底物与含有酶催化剂的重组微生物在一种任选地含有缓冲剂、盐、维生素、矿物质的水性介质中进行接触。
在一些实施方案中，将底物与酶催化剂进行接触，通过将每一个添加至任选含有缓冲剂、盐、维生素、矿物质和辅因子的水性反应混合物中。
在一些实施方案中，所述酶催化剂以粗细胞提取物的方式提供。在一些实施方案中，所述酶催化剂以纯化的蛋白质方式提供。
本申请的一个方面是一种修饰的有机体，其包含至少一种本发明在此所述的异源酶，其中所述有机体能够在一种一碳底物上生长，并且其中不含异源酶的有机体无法在一碳底物上生长。
在一些实施方案中，所述修饰的有机体是一种细菌。在一些实施方案中，所述有机体包含两种或更多种修饰的酶。
附图的简要说明
图1是生物体的C1利用的典型的(a)和合成的(b、c)代谢结构的示意图，以及流程图；
图2是通过C1底物合成产物的FORCE途径的示意图，以及流程图；
图3显示了FORCE途径的分析图；
图4显示了使用纯化酶的FORCE途径核心模块的体外评价图；
图5显示了FORCE产物合成途径的α-还原变体的某些无细胞原型图；
图6显示了使用FORCE途径的醛糖延伸和α-还原变体的C1底物甲醛的静息细胞生物转化的示意图和曲线图；
图7显示了在使用甲醇作为C1底物的生长细胞培养物中的FORCE途径实施的示意图和曲线图；
图8显示了使用FORCE途径变体的基因组规模大肠杆菌(E.coli)生长模型的模拟通量图的示意图：a)(形式)醛延伸，b)α-还原，c)醛糖延伸；
图9显示了用于评价FORCE途径在C1底物上生长能力的双菌株系统的示意图和曲线图；
图10是正交C1路径概念的综合说明图；
图11是基于2-羟基酰基-CoA和α-还原的脱水的一种替代FORCE途径的示意图；
图12是NADH/NAD+比率对甲醛(顶部)和甲醇(底部)通过FORCE途径转化为乙醇酸或醋酸的影响的图示；
图13是末端对迭代醛糖延伸途径的影响的图示；
图14是通过用甲酸-活化途径改造的大肠杆菌(E.coli)来通过甲酸生产乙醇酸的图示；
图15是多聚甲醛溶解速率和用多聚甲醛进行静息细胞生物转化的图示；
图16显示了乙醇酸、甲酸和甲醛浓度的分布图以及传感器菌株在具有5mM多聚甲醛的双菌株系统中的细胞生长的图示；
图17显示了乙醇酸、甲酸和甲醛浓度的分布图以及传感器菌株在具有500mM甲醇的双菌株系统中的细胞生长的图示；
图18显示了在具有1mM甲醛和10mM甲酸的双菌株系统中的乙醇酸和甲醛的浓度的分布图；
图19描述了用于确认以红螺旋杆菌(Rhodospirillales bacterium)URHD0017(RuHACL)作为起始参考基因的34个2-羟基酰基-CoA合成酶(HACS)变体的生物检测规划；
图20描述的是(a)通过2-羟基酰基-CoA合成酶(HACS)和酰基-CoA还原酶(LmACR)活化来从甲醛生产乙醇酸，(b)用于筛选HACS变体的高通量静息细胞生物转化平台，(c)对于每细胞密度(uM/OD)和表达水平的乙醇酸生产率的初始29个HACS变体和RuHACL的筛选结果；
图21描绘的是(a)通过2-羟基酰基-CoA合成酶(HACS)和酰基-CoA还原酶(LmACR)活化来由甲醛生产乙醇酸。5mM的甲醛被使用作为唯一的碳源。(b)两个诱导型启动子，使用在IPTG-诱导型T7启动子控制下的HACS和在cumate诱导型T5启动子控制下的LmACR和EcAldA用于分析。(c)使用RuHACLG390N作为HACS的随着IPTG和cumate浓度变化的乙醇酸生产率(μM/OD)。(d)使用JGI15作为HACS的随着IPTG和cumate浓度变化的乙醇酸生产率(μM/OD)；
图22描述的是(a)通过共同进料甲醛(0.5mM或5mM)和甲酸(20mM)的乙醇酸生产。HACS和FAE(AbfT)的表达是由诱导型启动子(IPTG和cumate)独立控制。(b)针对起始参考、RuHACL和第一轮中的两个最佳变体的HACS筛选结果。C1-C1缩合反应活性是通过在0.5mM或5mM甲醛(FALD)下的乙醇酸生产率来表示；
图23描述的是(a)使用AlphaFold2建模的JGI15蛋白质结构。(b)使用AlphaFold2建模的JGI20蛋白质结构。(c)通过与OfOXC(PDB代码：2JI8)的晶体结构对齐将两个配体(二磷酸硫胺素和甲酰基-CoA)结合到活性位点；
图24描述的是(a)通过二磷酸硫胺素(TPP)来选择在范围内的氨基酸残基来确定活性位点残基。(b)通过从甲酰基-CoA来选择在范围内的氨基酸残基来确定活性位点残基。(c)关于使用与AbfT共表达的甲醛(0.5mM或5mM)和甲酸(20mM)系统的野生型JGI20，以乙醇酸生产率(μM/OD/h)表示的丙氨酸扫描的活性位点残基的筛选结果；
图25描述的是(a)在c-末端的第一轮JGI变体的序列分析。活性变体(带星号)显示了相当保守的RKPQQF-W(SEQ ID NO：62)残基的SEQ ID按降序排列是从SEQ ID NO：25到SEQID NO：59。(b)关于使用与AbfT共表达的甲醛(0.5mM或5mM)和甲酸(20mM)系统的野生型JGI20，以乙醇酸生产率(μM/OD/h)表示丙氨酸扫描保守的C-末端残基的筛选结果；
图26描述的是(a)由对准的氨基酸残基表示的JGI15和JGI20AlphaFold结构排列的比对。JGI20的N461和JGI15的R493是在两个变体之间未对准的两个残基，其中JG115序列的顶部是SEQ ID NO：60，JGI20序列是SEQ ID NO：61。(b)通过单残基插入/缺失的两种蛋白质的结构杂交体的筛选结果，其以相对于使用甲醛(0.5mM或者5mM)和甲酸(20mM)系统与AbfT共表达的野生型JGI120的乙醇酸生产率(μM/OD/h)来表示；
图27描述的是(a)在JGI15(SEQ ID NO:25)和JGI20(SEQ ID NO:26)之间的C-末端尾部“覆盖环”的序列和结构，(b)通过用JGI15替代JGI20的c-末端的结构杂交体的筛选结果，其以相对于使用甲醛(0.5mM或者5mM)和甲酸(20mM)系统与AbfT共表达的野生型JGI120的乙醇酸生产率(μM/OD/h)来表示；
图28描述的是(a)通过2-羟基酰基-CoA合成酶(HACS)和酰基-CoA还原酶(LmACR)活性从甲醛生产乙醇酸。5mM的甲醛被用作唯一的碳源。(b)两个诱导型启动子，将在IPTG诱导型的T7启动子控制下的HACS和在cumate诱导型的T5启动子控制下的LmACR和EcAldA用于分析。(c)在5mM甲醛下的RuHACL、三个最佳第一轮突变体和AcHACL的乙醇酸生产率；
图29基于作为起始参考的AcHACL、JGI19、JGI15和JGI20的第二轮JGI HACS同源物的确定。系统发育树包括所有第一轮和第二轮的HACS变体以及文献中可用的HACL和OXC；
图30描述的是(a)通过共同进料的甲醛(0.5mM)和甲酸(20mM)来生产乙醇酸。HACS和FAE(AbfT)的表达是由诱导型启动子(IPTG和cumate)来独立地控制。(b)有前景的第二轮变体的HACS筛选结果，以相对于JGII5作为参考的乙醇酸生产率的变化百分比(％)来表示；
图31描述的是(a)通过共同进料的醛和甲酸生产2-羟基酸。(b)HACS和FAE(CaAbfT)的表达是由诱导型启动子(IPTG和cumate)来独立控制；
图32描述的是(a)通过共同进料的乙醛(5mM)和甲酸(20mM)来生产的乳酸(Lacticacid)(乳酸lactate)(b)有前景的第一轮变体的HACS筛选结果，以乳酸生产率(μM/OD)来表示；(c)有前景的第二轮变体的HACS筛选结果，以相对于JGII5作为参考的乙醇酸生产率的变化百分比(％)来表示；
图33描述的是(a)通过共同进料的丙醛(5mM)和甲酸(20mM)生产2-羟基丁酸(2HB)。(b)有前景的第一轮变体的HACS筛选结果，以2HB生产率(μM/OD)来表示。(c)有前景的第二轮变体的HACS筛选结果，以相对于JGII5作为参考的2HB生产率的变化百分比(％)来表示；
图34描述的是(a)通过共同进料的乙醇醛(5mM)和甲酸(20mM)生产甘油酸(glycerate)；(b)有前景的第一轮变体的HACS筛选结果，以甘油酸生产率(μM/OD)来表示；
图35描述的是(a)通过共同进料的乙醛酸(5mM)和甲酸(20mM)生产丙醇二酸(酒石酸)。(b)有前景的第一轮变体的HACS筛选结果，以酒石酸生产率(μM/OD)来表示；
图36描述的是(a)通过共同进料的3-羟基丙醛(5mM)和甲酸(20mM)生产2,4-二羟基丁酸(DHB)。(b)有前景的第一轮变体的HACS筛选结果，以DHB生产率(μM/OD)来表示；
图37描述的是使用丙酮和甲酸的第一轮HACS的筛选。(a)通过共同进料的100mM的丙酮和20mM的甲酸生产2HIB。HACS和FAE(CaAbfT)的表达由诱导型启动子(IPTG和cumate)来独立控制。(b)有前景的HACS变体的HACS筛选结果；
图38描述的是甲基酮作为底物用于使用纯化的酶的与甲酰基-CoA缩合反应。(a)甲基酮和甲酰基-CoA从甲酸缩合成2-羟基-2-甲基酸的途径；(b)不同的甲基酮和甲酸的体外测定GC-MS结果。所需的产物是由蓝色箭头指出；
图39描述的是通过羧酸衍生的酮和甲酰基-CoA的缩合来生产2-羟基酸、3-羟基酸、乙醇、1,2-二醇和α,β-不饱和酸；
图40描述的是通过乳酸衍生的丙酮和甲酰基-CoA的缩合来生产2-羟基异丁酸、3-羟基异丁酸、异丁醇、异丁二醇和甲基丙烯酸；
图41描述的是通过2-羟基丁酸衍生的丁酮和甲酰基-CoA缩合来生产2-羟基-2-甲基丁酸、3-羟基-2-甲基丁酸、2-甲基丁基-1-醇、2-甲基丁烷-1,2-二醇和2-甲基-2-丁烯酸；
图42描述的是通过2-羟基戊酸衍生的戊酮和甲酰基-CoA缩合来生产2-羟基-2-甲基戊酸、3-羟基-2-甲基戊酸、2-甲基戊-1-醇、2-甲基戊烷-1,2-二醇和2-甲基戊-2-烯酸；
图43描述的是通过2-羟基庚酸衍生的庚酮和甲酰基-CoA缩合来生产2-羟基-2-甲基庚酸、3-羟基-2-甲基庚酸、2-甲基庚-1-醇、2-甲基庚烷-1,2-二醇和2-甲基庚-2-烯酸；
图44描述的是通过2,3-羟基丙酸衍生的羟基丙酮和甲酰基-CoA的缩合来生产2,3-羟基-2-甲基丙酸、2-甲基丙烷-1,3-二醇、2-甲基丙烷-1,2,3-三醇和3-羟基-2-甲基丙烯酸；
图45描述的是通过2-羟基-3-甲基丁酸衍生的3-甲基-2-丁酮和甲酰基-CoA的缩合来生产2-羟基-2,3-二甲基丁酸、3-羟基-2,3-二甲基丁酸、2,3-二甲基丁-1-醇、2,3-二甲基丁-1,2-二醇和2,3-二甲基丁-1,2-二醇；
图46描述的是通过2-羟基-3氧代丙酸衍生的甲基乙二醛和甲酰基-CoA的缩合来生产2-羟基-2-甲基-3-氧代丙酸、2-甲基丙烷-1,3-二醇和2-甲基庚烷-1,2,3-三醇；
图47描述的是通过2-羟基-4-氧代戊酸衍生的戊烷-2,4-二酮和甲酰基-CoA的缩合来生产2-羟基-2-甲基-4-氧代戊酸、3-羟基-2-甲基-4-氧代戊酸、5-羟基-4-甲基戊-2-酮、4,5-二羟基-4-甲基戊-2-酮和2-甲基-4-氧代戊-2-烯酸；
图48描述的是(a)通过2-羟基酰基-CoA合成酶(RuHACL)和酰基-CoA还原酶(ACR)变体从甲醛生产乙醇酸。(b)从文献中确定的初始ACR变体的筛选结果；
图49描述的是(a)使用LmACR作为起始参考确定的ACR变体的系统发育树图。(b)通过测量ACR变体过度表达下的甲醛消耗量来进行ACR变体的筛选。(c)在0.5mM和3mM甲醛浓度下的ACR变体筛选结果，以LmACR作为参考的甲醛消耗活性的百分比(％)变化来表示；
图50描述的是(a)通过2-羟基酰基-CoA合成酶(JGI15)和甲酸活化酶变体经由甲醛和甲酸生产乙醇酸。PTA-ACK通过甲酰磷酸中间体生成甲酰基-CoA，而ACT将CoA直接从CoA供体分子转移至甲酸。(b)从文献中确定的初始ACR和PTA-ACK变体的筛选结果；
图51描述的是(a)使用AbfT作为起始参考确定的ACT变体的系统发育树图。(b)使用CcAck-Pta作为起始参考确定的ACT变体的系统发育树图；
图52描述的是(a)通过2-羟基酰基-CoA合成酶和甲酸活化酶变体经由甲醛和甲酸来生产乙醇酸。PTA-ACK通过甲酰磷酸中间体生成甲酰基-CoA，而ACT将CoA直接从CoA供体分子转移至甲酸。(b)针对乙醇酸生产率(μM/OD/h)的有前景的ACT和ACK-PTA变体的筛选结果；
图53描述的是(a)通过强制将乙醇酸作为甘氨酸合成的唯一来源，来对乙醇酸营养缺陷型菌株进行工程设计。该菌株只有在补充甘氨酸或提供具有适当酶的乙醇酸以合成甘氨酸时才能生长。(b)工程化的乙醇酸营养缺陷型菌株仅在补充乙醇酸的情况下才能生长，随着乙醇酸浓度的增加，其显示出更高的生长速率。
具体实施方式
本文使用的术语“大约”指的是可能出现的数值差异，该差异可以例如通过用于鞋类物品或可包括本发明在这里公开的实施方案的其他制造物品的通常测量和制造程序；由于在这些程序中的无意错误；通过用于制备组合物或混合物或实施方法的原料的制造、来源或纯度的差异等发生。在整个本发明所公开内容中，术语“大约”和“近似”是指该术语前面的数值的±5％的数值范围。
在典型“领结”结构中的代谢底物通过生物合成构件和从所得的中心代谢产物中衍生的感兴趣产物进入到中心代谢中。迄今为止，设计C1生物转化工程的尝试需要中央碳代谢来利用C1底物并将其转化为感兴趣的产物。这些表现出最小的正交性的代谢，需要优化宿主的代谢网络以适应C1生物转化，这已被证明具有挑战性。
然而，甲酰基-CoA延伸(FORCE)途径的实施，使得C1能够抑制宿主代谢正交的方式利用和生物转化，这可以解决这些挑战。FORCE途径是基于使用甲酰基-CoA作为合成代谢产物，这是通过在甲酰基-CoA和含羰基底物之间的醇酮缩合反应来实现的，该反应是由2-羟基酰基-CoA裂解酶(HACL)催化。与其他方法相比，产物合成以相对较高的与中心代谢的正交性来实现。我们对途径热力学的分析表明，其对于甲酸、甲醛和甲醇通过FORCE途径转化为乙醇酸或乙酸作为示例性产物的有利驱动力。自包含的正交途径在体外(纯化的酶和细胞提取物)和体内(静止和生长的细胞)的实施中均被证明具有潜在可行性，其中使用甲醛、甲酸或甲醇作为唯一的C1底物，可以以不依赖于生长和宿主代谢的方式生产具有不同功能的产物(例如乙醇酸、乙醇醛、乙二醇、乙醇)。这里展示的产物合成完全绕过了中央代谢，这与迄今为止报道的所有其他方法均不同。人们可以设想潜在的生物过程，其中生物催化剂的生长和维持是用多碳底物进行的，并且所述生物催化剂用于C1生物转化。基于多酶级联和两相发酵的这种性质的生物过程已成为最近评论的主题。
一种用于C1利用和产物合成的正交代谢架构设计
本发明在下文讨论了一些FORCE途径实施方案，其可以将C1底物生物转化为所需要的产物，并在附图中示出了所述途径。具体参考图1a和1b中所示的实施例，一些实施方案的系统可具有正交代谢架构的三个主要特征：1)将C1底物活化成用于碳链延伸的合适构建块；2)通过每循环一个碳来进行碳链的迭代延伸；3)所述途径的终止导致目标产物的积累。例如，在一个实施方案中，具有这些特征的正交代谢架构可以使用甲酰基-CoA作为用于迭代碳链延伸的活化C1单元来实现。
在现有文献中，关于通过C1分子生成甲酰基-CoA的报道很少。然而，酰基-CoA是介于羧酸和醛形式之间的一种方便的中间体。因此，如图2的一碳活化面板所示，可以从氧化和还原的C1底物中生产甲酰基-CoA。通过甲醛，甲酰基-CoA可以通过酰基-CoA还原酶(ACR)的活性来产生，并且甲醇可以通过甲醇脱氢酶(MDH)转化为甲醛。
甲酰基-CoA可以通过使用CoA转移酶经由甲酸来产生。甲酰基-CoA转移酶是一种已知在CoA硫酯转移中涉及甲酸和甲酰基-CoA的酶。通过来自大肠杆菌(Escherichiacoli)(EcACS)的乙酰基-CoA合成酶(ACS)的混杂活性将甲酸激活为甲酰-CoA是完全可能的。虽然通过EcACS催化的反应是AMP形成(消耗2个ATP当量)的原因，但存在通过中间体甲酰基-磷酸形成ADP途径的证据。在此途径中，甲酸通过甲酸激酶(FOK)转化为甲酰基-磷酸，并且磷酸转酰基酶(PTA)将甲酰基-磷酸转化为甲酰基-CoA。还可以以不依赖于ATP的方式将甲酸转化为甲酰基-CoA，通过甲醛脱氢酶(FaldDH)将甲酸直接还原为甲醛。尽管这种转化在热力学上具有挑战性，如图2所示，但该反应已在无细胞系统中得到证实，并且可能对体外和体内的实施均有用。此外，二氧化碳(CO2)可以通过甲酸脱氢酶(或二氧化碳还原酶)的逆向活性转化为甲酸，并且甲烷通过甲烷单加氧酶转化为甲醇，当与上述反应耦合时可以导致甲酰基-CoA的形成。
通过使用C1单元延伸的不同碳骨架的正交的、全新结构，需要类似于自然界中发现的由C2-C5代谢产物构建的碳骨架的迭代途径，但是该途径存在于中央代谢之外。因为2-羟基酰基-CoA裂解酶(HACL)具有广泛的碳链长度特异性，因此它是建立所述迭代途径的良好候选者。这里存在许多潜在的反应途径，这些途径能够通过将HACL催化反应的产物，如2-羟基酰基-CoA，转化为醛来实现迭代，所述醛可通过甲酰基-CoA进一步来延伸。如图11所示，在α-碳处，可以发生脱水反应，将2-羟基酰基-CoA转化为图11中的2-烯酰基-CoA，其类似于公认的丙烯酸途径的机制。所述2-烯酰基-CoA的生产也很方便，因为2-烯酰基-CoA参与了β-氧化，潜在地允许使用为平台途径β-氧化逆转而建立的酶促工具包和知识。然而，在β-氧化逆转中，2-羟基酰基-CoA的脱水比3-羟基酰基-CoA的脱水更具挑战性，因此需要氧敏感的自由基机制。2-羟基酰基-CoA的脱水也需要一种β-碳的存在，并且因此限制了通往3个碳或更多碳的中间体途径的实施。
这些问题使得硫酯的转化成为一种更有前途的途径。如图2和甲酰基-CoA延伸板所示，CoA-硫酯的还原会产生2-羟基醛，这可能是由于某些酰基-CoA还原酶(ACR)的非特异性活性的原因。通过HACL将2-羟基醛与甲酰基-CoA进一步连接以得到多羟基酰基-CoA和更多的多羟基醛，通常称为醛糖。所述多羟基醛原则上可以作为HACL催化反应的底物，该反应可以称为醛糖延伸反应，其中一个例子如图2中的甲酰基-CoA延伸面板所示。
通过二醇氧化还原酶(DOR)的活性，可以进一步还原2-羟基醛以得到1,2-二醇。大肠杆菌(E.coli)FucO是DOR的一个实施例，它催化1,2-二醇与2-羟基醛34的相互转化。然而，大肠杆菌(E.coli)只是DOR的一个例子，并且在一些实施例中可以使用其他合适的DOR来代替。例如，在一些实施方案中，DOR可以是另一种原核细菌。或者，在一些实施方案中，DOR可以是真核细菌或真菌。1,2-二醇的脱水可以通过二醇脱水酶(DDR)的活性进行催化以生成醛，以有效地完成α-还原。虽然二醇脱水也需要自由基机制，但是所述B12-依赖性的二醇脱水酶是具有耐氧性的。甲酰基-CoA对醛的进一步延伸(可称为醛延伸)导致了烷基链的延伸，其类似于脂肪酸生物合成或反向β-氧化途径中的双碳延伸。这些途径包括醛糖延伸，其可统称为α-还原和醛延伸，称为甲酰基-CoA延伸(FORCE)途径，因为它们促进了甲酰基-CoA作为碳链延伸单元的使用，如图2所示，在甲酰基-CoA延伸板上。
如图2所示，多种产物类别可以作为中间体产生或者通过FORCE途径的中间体的衍生物产生，其中一些还可以支持微生物的生长(如图1c所示)。例如，醛糖是2-羟基醛节点的直接结果。二醇，包括乙二醇等主要工业化学品的二醇类都是1,2-二醇节点的产物。2-羟基酰基-CoA节点的衍生物包括2-羟基酸，例如工业产物乙醇酸和乳酸，其通过硫酯酶催化的反应产生。许多化学类别可以从醛节点衍生出来，包括羧酸、醇和酰基-CoA，它们可以作为其他产物的前体。
用于C1利用的FORCE途径的热力学分析
图2所示的途径反应的标准吉布斯自由能使得潜在的反应显而易见，但吉布斯能不足以预测整个途径是否可行并按预期的方向运行。为此，有必要对途径热力学进行整体研究，其考虑了途径反应相互影响的能力。为了实现这一目标，将“最大-最小驱动力(MDF)”方法应用于这些反应。
对用于通过单独地C1底物生产的C2代谢产物乙醇酸和乙酸的FORCE途径的MDF方法进行评价，但是，仅仅是对可溶性C1底物的MDF方法进行评价，因为质量传输限制可能会显著地限制CO2和甲烷利用。选择乙醇酸和乙酸作为代表性的C2产物，它们既是途径产物又是生长底物，其中乙醇酸需要最短的途径，而乙酸需要醛延伸反应的整个序列。如图3a所示，对于每种底物，乙醇酸的生产驱动力均大于乙酸的生产驱动力。这是由于通过硫酯酶的乙醇酰基-CoA热力学有利水解，而乙酸的生产则需要乙醇酰基-CoA的热力学挑战性的还原反应。使用代谢产物浓度的标准限值，甲醛可实现最大的MDF，因为它不需要具有挑战性的NAD+依赖性的甲醇脱氢酶反应或甲酰基-CoA还原成甲醛的反应。同样显而易见的是，尽管甲醇脱氢酶反应具有热力学挑战，但是在优选方向上有足够的驱动力用于乙醇酸和乙酸净生产。
甲酸利用的驱动力是最低的。在这里，ATP水解有助于甲酸的活化。通过ACS的2个ATP当量的水解仅为乙酸的净生产提供了足够的驱动力，而1个ATP当量的利用仅可为乙醇酸的生产提供足够的驱动力。在这些条件下，不依赖ATP的途径是不可行的。
虽然上述分析假设代谢产物浓度的标准限制为1μM至10mM，但在实践中，C1底物浓度可能高于或低于所述上限，这具体取决于外源供应的能力。接下来，如图3所示，更严格/现实的值被用于底物浓度，其是基于物理限制(例如C1底物的毒性)。尽管一些生物体可以存活并消耗浓度为10mM42的甲醛，但是包括大肠杆菌(E.coli)在内的大多数生物体却不能够存活。当甲醛的上限调整到更合理的0.1mM时，所述途径的MDF就会如预期那样地降低。另一方面，甲醇的毒性比甲醛低得多，并且已经以100mM43的浓度提供给大肠杆菌(E.coli)生长培养基。增加甲醇浓度的上限会增加甲醇转化率的MDF。有趣的是，在这些浓度下，甲醇利用的驱动力略大于甲醛利用的驱动力。
类似地，大肠杆菌(E.coli)能够在具有浓度约为100mM9的甲酸存在下生长的能力。在其他实施方案中，也可以使用在甲酸浓度存在下生长的其他DOR。在1或2个ATP的消耗场景中，增加与甲酸的结合浓度对MDF没有影响，但对0个ATP路线的MDF有重大影响。使用100mM的甲酸，可以在不需要ATP水解的情况下净生产乙醇酸，但不生产乙酸。这种分析可以为无细胞生物转化系统提供信息，并为体内实现提供有关底物吸收的有价值的见解。
除了底物浓度外，NADH/NAD+比率是途径热力学的另一个主要制约因素。虽然之前使用的对NADH/NAD+的限制是0.141，这反映了大肠杆菌(E.coli)的生长是在有氧条件下进行的，但是生理学的NADH/NAD+可能会发生变化，在厌氧条件下达到接近或大于1的值。甚至可以在体外实施中实现更高的比率。为了评价NADH/NAD+比率对途径驱动力的影响，对NADH/NAD+比率进行改变。如图12所示，在生理学范围内(此处取0.1-1之间)，对于甲醛和甲醇作为图12中所述底物的途径驱动力保持正值。正如预期的那样，当所述途径产生氧化还原(甲醇转化为乙酸/乙醇酸和甲醛转化为乙醇酸)时，低比例是有利的；而当途径消耗氧化还原(甲酸转化为乙酸/乙醇酸)或氧化还原平衡(甲醛转化为醋酸——可能是因为还原反应在热力学上更具挑战性)时，高比率是有利的。如图3b所示，NADH/NAD+比率可能对甲酸利用途径的驱动力至关重要。
对于甲酸到乙醇酸的转化，所述需要1-2个ATP当量的途径保持一种贯穿几乎整个生理学范围内的正驱动力。然而，对于甲酸到乙酸的转化，所述NADH/NAD+比率必须处于生理学范围的高端，才能在消耗1个ATP当量的情况下具有正驱动力。在10mM的甲酸浓度下，乙醇酸和乙酸产生的驱动力在生理学范围内都不是正值。当甲酸浓度增加至100mM时，乙醇酸或乙酸产生的驱动力在NADH/NAD+比率的生理学范围内也可为正值，即使没有ATP水解。总体而言，将甲酸转化为更为还原的产物(例如乙酸)，其在热力学和净氧化还原平衡的基础上都面临挑战。
作为将C1底物转化为产物的实施方案方法的一个实施例，由于甲醛的中间氧化还原状态，所述FORCE途径支持使用甲醛作为示例性底物的迭代的能力被进一步评价。如图3c所示，醛糖和醛延伸途径的热力学均支持多达4个碳的迭代。此外，所述途径的驱动力随着迭代次数的增加而减小。在4个碳之后，醛糖延伸模式变得不理想，这可能是由于连续的酰基-CoA还原反应的累积效应。另一方面，醛延伸模式仍然有利的，尽管也需要相同的酰基-CoA还原反应，这可能是由于DOR和DDR催化的热力学有利的反应。当迭代次数较低时，不同的C1活化和终止途径会对整个延伸循环的MDF产生影响。如图13所示，随着迭代次数的增加，图13中显示的延伸循环反应的热力学占主导地位。根据前面的分析可知，当甲醇或甲酸为C1底物时，可以预期醛糖和醛延伸途径的MDF将相似或较低，因为这些底物的利用在热力学上受到更多限制。
体外途径验证
FORCE途径的先决条件是甲酰基-CoA和甲醛的产生。为了验证这些反应的功能，如图4所示，开发了纯化酶系统，并对来自不同C1底物的甲酰基-CoA的生成和HACL缩合产物乙醇酰基-CoA的生成进行跟踪。如图2所示，甲酰基-CoA可以通过酰基-CoA还原酶(ACR)从甲醛进行生产。在含有来自单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)ACR(LmACR)和来自红螺旋杆菌(Rhodospirillales bacterium)URHD0017(RuHACL)的HACL的反应中，同时观察到甲酰基-CoA和乙醇酰基-CoA的生成。甲酰基-CoA也可以通过甲酸的活化衍生自氧化的C1底物。使用来自产甲酸草酸杆菌(Oxalobacter formigenes)(OfFrc)的甲酰基-CoA转移酶和琥珀酰基-CoA作为CoA供体，观察到甲酸活化为甲酰基-CoA，并且在添加甲醛的情况下，导致乙醇酰基-CoA的生成。进一步对是否可以通过使用LmACR还原甲酰基-CoA来原位产生甲醛进行测试。事实上，观察到了乙醇酰基-CoA，尽管此时其丰度低于直接添加甲醛时的丰度。综上所述，这些结果表明，在该酶系统中，所述限制是由ACR反应施加，这是由于酶的活性或者是由于需要适当形式的NAD(H)而施加的限制。在后者的支持下，在氧化方向(即甲醛转化为甲酰基-CoA)上，CoA硫酯水解后观察到的乙醇酸的量几乎等于添加到反应(1mM)中的NADH的量。如图2和图3b所示，在相反的方向上，观察到少于当量的乙醇酸，这与随着NADH/NAD+比率的降低而变得不理想的反应热力学一致。
无细胞代谢工程方法被用来进一步原型化产物合成的FORCE途径。表达包含α-还原性FORCE途径的每种途径酶的大肠杆菌(E.coli)提取物被一次被依次地组合，以逐步的方式证明该途径的功能。如图2(在甲酰基-CoA延伸图中)所示，除了通过由HACL生成的2-羟基酰基-CoA的硫酯裂解直接生成2-羟基羧酸(例如乙醇酸)之外，其他的C2产物(包括醛糖或乙醛延伸途径)需要这种2-羟基酰基-CoA的还原(在甲醛和甲酰基-CoA连接的情况下的乙醇酰基-CoA)。单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)ACR(LmACR)也能够作用于乙醇醛。如图5a所示，为了最大限度地降低工程系统的复杂性，LmACR发挥双功能作用，其既催化甲醛氧化为甲酰基-CoA，又催化乙醇酰基-CoA还原为乙醇醛。如图5b所示，单独的LmACR仅可导致甲醛转化为甲酸。在包含先前从红螺旋杆菌(Rhodospirillalesbacterium)URHD0017(RuHACL)中确定出的HACL的情况下，观察到乙醇酸。然而，乙醇醛作为产物并未被显著检测到，这可能是由于细胞提取物系统中存在的内源性氧化还原酶，所述酶催化乙醇醛氧化为乙醇酸(例如AldA、AldB、PuuC、PatD)，或者在较小程度上催化乙醇醛还原为乙二醇(例如FucO、YqhD、AdhP、EutG等)。
如图5a和5b所示，下一个还原产物的合成，乙二醇，是通过添加过表达大肠杆菌(E.coli)FucO的大肠杆菌细胞提取物而显著增加(增加了2倍，从1.37±0.1mM增加至2.73±0.03mM)，所述细胞提取物是一种1,2-二醇氧化还原酶。乙二醇可以通过二醇脱水酶进一步脱水为乙醛(如图5a所示)。在进一步添加表达来自产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)的二醇脱水酶(DDR))的大肠杆菌细胞提取物以及辅酶B12之后，检测到乙醇(1小时为1.90±0.03mM：图5b)，这可能是由于内源性氧化还原酶对乙醛的还原以及乙二醇的相应减少所致。在随后的时间点(2小时)，观察到乙酸的增加，这可能是由于内源性氧化还原酶活性的存在而再次导致乙醇和乙醛的氧化所致。各种产物(例如乙醇酸、乙二醇、乙醇、甘油酸、乙酸)的合成表明，途径酶的明智地选择可用于控制来自酰基-CoA节点的不同还原水平、链长和功能的产物的合成，所有这些都独立于中心代谢。
FORCE途径的体内实现
FORCE途径的正交性质不仅允许在无细胞系统中快速构建原型，而且还可以轻松地在体内实现。图6和图7展示了所设计平台的关键特征，以及使用静息大肠杆菌(E.coli)和生长大肠杆菌(E.coli)培养物两者的另外产物的合成和各种C1底物的利用。FORCE途径设计的一个关键特征是迭代，这可以通过醛糖或醛延伸来实现(如图2的甲酰基-CoA延伸图所示，图3c)。为了证明体内醛糖迭代延伸的可行性，其目标是从甲醛合成三碳产物甘油酸，如图6a所示。从先前开发的具有C1异化和乙醇酸消耗敲除(AC440：MG1655(DE3)ΔfrmAΔfdhFΔfdnGΔfdoGΔglcD)并且过表达的RuHACLG390N、LmACR和EcAldA的菌株16开始。为了促进乙醇醛的积累及其与甲酰基-CoA的缩合，从表达载体中去除了EcAldA。虽然甲醛的消耗显著降低，但图6b显示了观察到乙醇醛和甘油酸的积累，这证明了迭代的醛糖延伸途径。为了增加这些化合物的产量，使编码醛脱氢酶的基因(ΔaldAΔaldBΔpatDΔpuuC，统称为Δaldh)被进一步敲除。使用该宿主，当EcAldA不过表达时，氧化产物乙醇酸的浓度降低，而乙醇醛的浓度升高。尽管如此，这些敲除似乎并没有影响甘油酸的积累，这可能表明乙醇醛和甲酰基-CoA之间的缩合反应受到限制，该反应是由RuHACL催化的。敲除也没有对副产物甲酸的积累产生影响，这表明副产物形成的可能途径是通过甲酰基-CoA的硫酯水解。
所述途径还通过在表达载体中包含大肠杆菌(E.coli)fucO将该途径从乙醇醛的生产扩展到下一个还原产物乙二醇，已知其可以催化乙醇醛和乙二醇的相互转化。如图6b所示，这导致乙二醇在细胞外培养基中积累。醛脱氢酶的额外敲除导致乙二醇产量增加约68％。有趣的是，EcFucO的加入极大地增加了甲醛的消耗，其中大部分转化为甲酸。这可以通过甲醛生产乙二醇的净氧化还原平衡来解释，这需要NADH形式的额外还原当量。这将降低NADH/NAD+比率并为甲醛氧化提供额外的电子受体。
为了验证观察到的产物源自甲醛而不是残留的多碳底物或生物质成分，使用13C标记的甲醛被用作工程菌株的底物。如图6c所示，基于产物的TMS衍生物的特征[M-15]+离子，发现产物乙醇酸、乙二醇和甘油酸完全被13C标记。因此，2碳和3碳产物均可以使用FORCE途径由甲醛来生产。
除了不同的产物之外，还对是否可以使用不同的基质进行了评价。如图2、图7a所示，只有甲醇脱氢酶(MDH)的额外表达能够将甲醇转化为甲醛，这是先前建立的甲醛利用途径的方便扩展。来自经过充分研究的甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanolicus)MGA3的MDH变体(BmMDH2MGA3)与菌株AC440中的RuHACLG390N、LmACR和EcAldA进行表达。与甲醛不同，甲醛的毒性需要使用静息细胞，甲醇还可以直接添加到生长的大肠杆菌(E.coli)培养物中。如图7b所示，当工程化的甲醇利用菌株在复杂营养物和500mM甲醇的情况下生长时，观察到乙醇酸的形成，而在不表达RuHACL的菌株中则观察不到这种情况。
为了提高该系统的性能，将RuHACLG390N替换为新确定的源自沙滩沙宏基因组的HACL，此处称为BsmHACL(UniProt登录号：A0A3C0TX30)。如图7c所示，BsmHACL的使用使乙醇酸的积累显著增加了约3倍，反映了该途径中的主要瓶颈。尽管乙醇酸产量有所提高，但甲酸积累量仍然是高的。为了解决这个问题，将终止酶EcAldA替换为先前被确定的来自氨基丁酸梭菌(Clostridium aminobutyricum)(CaAbfT)的CoA转移酶，该酶被发现比OfFrc具有更好的特性51。CaAbfT既可以从乙醇酰基-CoA中释放乙醇酸，又可以将观察到的副产物甲酸重新活化为甲酰基-CoA以进一步缩合。当CaAbfT表达时，乙醇酸积累进一步增加约33％，而甲酸积累减少约36％。最后，由于CaAbfT作为经由释放乙醇酸来终止途径的一种方式，预期不需要内源硫酯酶，并且推测内源硫酯酶被认为是观察到的甲酸的部分原因。因此，构建了硫酯酶缺陷的菌株(ΔyciAΔtesAΔtesBΔybgCΔydiIΔfadM)，并用该途径进行测试。使用硫酯酶缺陷的背景进一步减少了观察到的甲酸，但并未消除它。可能还有其他的途径产生了甲酸，例如甲醛的直接氧化或尚未确定的硫酯酶。为了验证观察到的乙醇酸源自甲醇，进一步使用了13C标记的甲醇。如图7d所示，从乙醇酸的TMS衍生物的[M-15]+离子观察到，在这些培养物中产生的乙醇酸完全来源于13C-甲醇。
在确定CaAbfT是用于甲酸活化的一种有前景的途径后，对CaAbfT是否可用于实现整合外源供应的甲酸还需要进一步评价。在大肠杆菌(E.coli)的工程菌株中，CaAbfT被表达以便在没有LmACR过表达的情况下活化甲酸，因此甲醛和甲酰基-CoA之间没有相互转化。因此，观察到的乙醇酸应该是由甲酸活化为甲酰基-CoA以及所得甲酰基-CoA与甲醛的进一步缩合产生的。如图14所示，在表达BsmHACL的工程菌株中，与单独供应甲醛时相比，当培养基中除了甲醛之外还包含甲酸时，观察到乙醇酸增加了12倍。如图14所示，以乙醇酸形式累积的总碳量大于最初以甲醛形式添加的量。因此，该菌株产生的乙醇酸是甲酸-依赖性的，这证明了外源供应的甲酸可以用作具有FORCE途径的C1底物。
用于合成甲基营养的FORCE途径的通量平衡分析
已经证明了FORCE途径在支持产物合成方面的潜力，并且由于某些产物(例如乙醇酸、甘油酸、乙酸)可以作为生长底物，因此通过计算机评价了它们在大肠杆菌(E.coli)中实现合成甲基营养的能力。使用基因组规模的大肠杆菌(E.coli)模型iML151552，通过向模型中添加反应来评价大肠杆菌(E.coli)在有机C1底物上的生长，其包含已报道或提出的能够实现甲基营养的选择途径。用能够在存在不同还原水平的情况下使C1分子相互转化的反应来对所有途径进行评价。表3给出了实现每个途径的完整反应。
表3续
模拟结果表明，先前提出的实现某种形式的大肠杆菌(E.coli)甲基营养的所有途径，包括天然的(核酮糖单磷酸或RuMP、丝氨酸)和合成的(甲醛裂合酶(formolase)、合成乙酰基-CoA或SACA、还原性甘氨酸)的两者都能够做到这一点，如下表1所示。
表1
评价非天然C1底物转化为天然生长底物乙醇酸、乙酸和甘油醛的FORCE途径也不例外，并证明了该平台正交性的另一个优势。通过开发到代表大肠杆菌(E.coli)或任何其他生物体的生理底物的化合物的直接途径，可以将FORCE途径整合到不同或多个代谢节点，以利用天然代谢和底物利用的调节，而不需要对它们进行工程化设计。有趣的是，计算机分析表明，预计产生3-碳代谢产物(FORCE-甘油醛、甲醛裂合酶(formolase)、RuMP)的途径将导致基于碳和电子的最高的生物质产量，如上表1所示。
对三种模型化的FORCE途径的通量分布的分析如图8所示，并提供了一些关于为什么3-碳代谢产物的生产可能是有利的见解。如图8所示，导致乙醇酸形成的FORCE途径利用了大肠杆菌(E.coli)中存在的碳效率低下的乙醇酸利用途径，该途径需要两个乙醛酸分子进行脱羧缩合。产生更多还原的C2代谢产物，例如乙醇醛或乙酸，优选以乙醇酸形式的氧化C2。预测的乙醇醛代谢特别令人感兴趣，因为该模型提出了用于乙醇醛同化的途径，包括与甘氨酸缩合和逆向吡哆醛-5-磷酸生物合成途径，最终导致戊糖磷酸重排以得到甘油醛-3-磷酸(如图8b所示)。根据预测的通量分布，该途径似乎优于经由乙醛酸旁路的乙酰基-CoA同化。如图8c所示，从基于HACL的途径直接生产甘油醛导致甘油醛转化为甘油，随后进行天然甘油代谢。因此，所述途径导致C3分子例如甘油醛或二羟基丙酮的产生，该途径可以利用糖酵解反应，以导致ATP的净生产，最终实现更高的生物质产量。总体而言，在上面讨论的3种情况中(如图8和表1所示)，FORCE途径能够将非天然C1底物转化为天然多碳底物，如图1c所示。表4显示，基于其他指标，例如氧化还原平衡、ATP需求和所需反应次数，FORCE途径也具有前景的特征。
表4
评价合成甲基营养的双菌株共培养系统
FORCE途径与大肠杆菌(E.coli)代谢的正交性还允许C1转化途径与生长完全解耦，因此使得评价该途径的甲基营养潜力的独特设计成为可能。一种潜在有利的实施方式可以采用通过将多碳化合物产生和细胞生长分离得到的两种宿主中来进行分工，如果该途径直接与中央代谢连接，例如经由醛糖磷酸或乙酰基-CoA(C1同化途径中的两种常见产物)，这将是不可能的。以这种方式模块化系统可以更容易地分析潜在的局限性。利用这一概念，对FORCE途径支持大肠杆菌(E.coli)在C1底物(例如甲醛、甲酸和甲醇)上生长的能力进行评价。
如图9a所示，设计和构建了由两种工程化大肠杆菌(E.coli)菌株组成的双菌株系统，并设想其在共培养物中发挥作用。第一菌株，称为作为生产者菌株，包含表达FORCE途径的构建体，其用于将非天然C1底物转化为天然C2生长底物乙醇酸，但缺乏消耗乙醇酸和在乙醇酸上生长的能力。第二菌株，称为传感器菌株，保留了基于乙醇酸上生长的能力，并且另外组成型表达作为信号的eGFP，但是不表达乙醇酸生产的FORCE途径。因此，可以通过乙醇酸最小培养基平板上选择和通过检测荧光菌落两者来区分生产菌株和传感器菌株。为了评价不同底物的可行性，设计了三种不同的生产者菌株。甲醛利用的生产者菌株表达LmACR、BsmHACL和EcAldA。用于评价甲醛对甲酸的利用，CaAbfT与BsmHACL一起表达。最后，对于甲醇利用的生产者菌株，其是表达BmMdhMGA3、LmACR、BsmHACL和CaAbfT的硫酯酶缺陷背景(如图9a所示)。
如图15a所示，甲醛是第一个测试的底物，尽管为了实现生长条件，使用了多聚甲醛。多聚甲醛在水性介质中逐渐解聚生成甲醛，并能够通过选择粒径和浓度来控制溶解速率(参见图15)。现在参考图15b，这反过来又实现了一个系统，其中甲醛可以保持在亚毫摩尔浓度，避免累积到有毒水平，并且在图15中仍然观察到显著的乙醇酸产生。在含有(多聚)甲醛(相当于5mM)作为唯一的碳底物的最小培养基中，观察到传感器菌株的生长，如相对于生产者菌株不表达HACL的对照系统，菌落形成单位(CFU)的增加所指示，如图9b和图16所示。乙醇酸在前8小时内迅速积累，并在初始滞后期之后出现传感器菌株的持续性指数增长。发现传感器菌株在30小时内经历了约6.6倍的倍增。
对甲醇作为双菌株系统的底物进行评价。图9c和图17显示了仅当生产者菌株表达BsmHACL时才观察到传感器菌株的生长。然而，图17显示了与使用多聚甲醛的情况相比，传感器菌株的生长动力学有所不同，这反映出CFU随时间的近似线性增加。所观察到的动力学的差异可能反映了生产者菌株从甲醇生产乙醇酸的速率所施加的限制，类似于在恒定进料速率分批进料培养中观察到的现象56。甲醇的利用明显比(多聚)甲醛的利用慢得多，导致72小时内大约4.6倍的倍增。
使用1mM甲醛和10mM甲酸共底物系统进行类似的实验，并使用静息细胞进行了测试。如图18所示，以及在上面所观察到的，在乙醇酸中观察到比作为甲醛形式添加的更多的碳，表明了甲酸的掺入，参见图18。图9c显示了传感器菌株的生长比在甲醇上的生长快，但没有导致像在5mM(多聚)甲醛上那样多的倍增。在27小时内，观察到大约4.9倍的倍增。
讨论
虽然经由C1底物合成产物是FORCE途径的一个决定性特征，但它们也有可能通过产生异养生物天然消耗的多碳化合物，例如乙醇酸、乙酸或甘油醛，使得能够基于非天然C1底物(例如合成甲基营养体)上生长的潜力。为此，通过基因组规模建模和通量平衡分析对FORCE途径实现合成甲基营养的功效进行评价。该分析表明，FORCE途径与其他方法相当或更好。虽然当前途径的性能无法支持单一大肠杆菌(E.coli)菌株在C1底物上的生长，但该途径的正交性质允许生长、分离和评价单独的不同大肠杆菌(E.coli)菌株基于甲酸、甲醛和甲醇生长的途径限制。生产菌株必须过量添加，这表明在途径效率中的细胞特异性提高应该能够使FORCE途径与生长整合到单一底盘中。FORCE途径实现甲基营养的潜力允许基于C1作为唯一碳源来实现更类似于传统发酵的生物过程实现。在这些方法中，底物用于产物合成，也用于生物催化剂的生产和维护。
因为FORCE途径是流向产物合成和生长的通量分支点，所以对通量分配的简便控制具有巨大的潜力，如图10所示。对这些通量的精细控制可能对于实现C1的高产率生物转化是至关重要的，特别是当碳和能量有限时，例如在甲酸作为唯一底物的情况下。
FORCE途径的进一步开发应该能够实现更有效地设计合成甲基营养和更多样化的产物合成，特别是通过途径迭代。例如，使用HACL催化的醛与甲酰基-CoA的酰脲缩合反应的主要瓶颈。在使用还原底物甲醛和甲醇的各种实施方案中观察到的作为副产物的甲酸，可能是由于甲酰基-CoA的生产速率和HACL对其利用速率之间的不平衡引起的。还观察到甲酰基-CoA水解，这可能通过在体内的内源性硫酯酶的存在而加剧。解决这一限制的一个示例方法是使用CoA-转移酶将甲酸重新活化为甲酰基-CoA，正如在这里使用CoA-转移酶CaAbfT所实现的。具有更好特性的HACL酶的确定或工程化应该有助于解决这一限制。这种方法的一个具体例子是本文所述的BsmHACL的确定。其他例子包括宿主菌株修饰，例如内源醛脱氢酶和硫酯酶的缺失。
由于HACL催化的缩合反应和酶活性只是最近才被描述，因此预计进一步的基因组挖掘、生物勘探、酶工程化和生物生化表征将导致发现有更好性能的变体，最终克服了途径瓶颈。具有明确的链长度和官能团特异性的HACL变体，与兼容的特异性终止酶相结合，还应该允许产生特定性产物，类似于已用其他平台途径所展示的那样。
方法：
下面概述的方法描述了用于生成本发明公开的特定测试实例的程序和材料。
热力学计算
反应的标准吉布斯自由能是可以从数据库来源(MetaCyc)或使用eQuilibrator生化热力学计算器得到的。使用先前报道的方法使用MATLAB(Mathworks)实现来计算途径的最小-最大驱动力。补充文件中提供了用于执行分析的脚本。
通量平衡分析
使用带有Gurobi solver(Gurobi Optimization,LLC)的MATLAB(Mathworks)的COBRA Toolbox66进行通量平衡分析。将能够实现各种甲基营养途径(如表3所示)的反应添加或修饰到大肠杆菌(E.coli)基因组规模模型iML151552中。对于所有C1底物，将底物交换反应的限制设置为10mmol C/g DCW/hr。补充文件中提供了用于执行分析的脚本。
试剂
除非另有说明，否则所有化学品均由Fisher Scientific Co.和Sigma-AldrichCo.获得。引物由Integrated DNA Technologies或者Eurofins Genomics合成。除非另有说明，否则限制性内切酶均由New England Biolabs获得。
遗传方法
根据本发明上文所描述的方法构建质粒和菌株16。对于大肠杆菌(E.coli)非天然的基因被密码子优化并由GeneArt(Thermo Fisher)合成。大肠杆菌(E.coli)基因根据标准方案从染色体DNA扩增。本研究中使用的质粒和菌株在表2中列出。
表2
使用纯化的酶评价核心途径模块
如前所述的RuHACLG390N、LmACR和OfFrc的表达和纯化。为了测试甲醛作为唯一C1底物的利用，所述反应是由50mM的KPi且pH 7.4、5mM的MgCl2、0.1mM的TPP、1mM的NAD+、2mM的CoASH、1μM的RuHACLG390N、1μM的LmACR和100mM的FALD组成。为了测试甲酸和甲醛作为共底物的利用，所述反应是由50mM的KPi且pH 7.4、5mM的MgCl2、0.1mM的TPP、1mM的琥珀酰基-CoA、1μM的RuHACLG390N、2μM的OfFrc、100mM的甲酸钠和100mM的甲醛组成。为了测试甲酸作为唯一C1底物的利用，所述反应是由50mM的KPi且pH 7.4、5mM的MgCl2、0.1mM的TPP、1mM的NADH、2mM的琥珀酰基-CoA、1μM的RuHACLG390N、2μM的OfFrc、1μM的LmACR和100mM的甲酸钠组成。作为对照，所述反应包含50mM的KPi且pH 7.4、5mM的MgCl2、0.1mM的TPP、1mM的NADH、1mM的NAD+、2mM的琥珀酰基-CoA、2mM的CoASH、2μM的BSA、100mM的甲酸钠和100mM的甲醛。反应体积为200μL，并且反应在室温下的rotisserie振荡器上进行30分钟。在用5μL的10M的NaOH处理200μL反应样品后，如前所述对游离酸进行GC-MS分析。
为了使用LC-MS分析酰基-CoA，通过向200μL反应样品中添加8μL的甲酸来终止反应，并使用1mL的HyperSep C18柱(Thermo Scientific)脱盐，该柱用200μL甲醇预处理(prime)两次，并用100μL的1mM乙酸铵pH 3.0平衡。用200μL的1mM的醋酸铵pH 3.0洗涤柱一次，并用200μL甲醇洗脱酰基-CoA。基于先前描述的内容进行LC-MS分析。Agilent 6540Q-TOF LC-MS系统配备了设置为正电离模式的喷射流电喷雾电离源和100mm x 4.6mmKinetex 2.6μm Polar C18色谱柱(Phenomenex)。LC条件为：柱烘箱设定为40℃，注入体积为5μL，并且流动相为50mM甲酸铵和甲醇。以400μL/min的流量，使用以下梯度法实现了化合物分离：0min 0％甲醇；1min 0％甲醇；3min 2.5％甲醇；9min 23％甲醇；14min80％甲醇；16min 80％甲醇；17min 0％甲醇。MS条件为：毛细管电压3.5kV，喷嘴电压500V，碎片电压(fragmentor voltage)150V，并且使用氮气进行雾化(25psig)、干燥(5L/min，225°)和用作鞘气(10L/min，400℃)。使用100-1000m/z的扫描范围。使用MassHunterQualitative Analysis B.05.00(Agilent)进行数据分析。
用于途径验证的无细胞代谢工程化
如前所述进行酶表达和细胞提取物制备。无细胞反应包含有50mM的KPi且pH 7.4、4mM的MgCl2、0.1mM的TPP、2.5mM的CoASH、5mM的NAD+、50mM的甲醛和0.1mM的辅酶B12。单个细胞提取物载量约为4.4g/L蛋白质(反应体积的1/8)，并且使用BL21(DE3)提取物将添加到每个反应中的蛋白的量标准化为～26g/L蛋白质(反应体积的3/4)。将反应物在室温下孵育指定的时间，此时添加反应体积的1/4的用1％硫酸酸化的饱和硫酸铵溶液以终止反应。将样品以20817×g离心15分钟，并如前所述通过HPLC对上清液进行分析。
静息细胞生物转化
使用静息细胞的生物转化如前描述的稍作修改来进行。使用的基础盐培养基为另外补充有Neidhardt的微量营养液的M9(6.78g/L Na2HPO4、3g/L KH2PO4、1g/L NH4Cl、0.5g/LNaCl、2mM MgSO4、100μM CaCl2和15μM硫胺素-HCl)。使用每种菌株的过夜LB培养物接种(1％)250mL烧瓶，该烧瓶中含有50mL进一步补充有20g/L甘油、10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物和适当的抗生素(50μg/mL羧苄青霉素、50μg/mL壮观霉素)的上述培养基。将烧瓶培养物在NBS I24台式培养振荡器(New Brunswick Scientific Co.)中在30℃和250rpm下孵育。2.5小时后，通过添加0.1mM异丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)和0.04mM的cumate(0.2mM IPTG和0.1mM用于累积甲醛和甲酸的实验)诱导基因表达。
通过离心(5000×g，22℃、5分钟)收获来自上述培养物的细胞，并用上述不含任何碳源的M9培养基洗涤两次。将最终的细胞沉淀物重悬于具有适当碳源的M9中(～10OD600，含有10mM甲醛；或～50D600，含有1mM的甲醛和10mM的甲酸)。将5mL细胞悬浮液添加至25mL的Erlenmeyer烧瓶(Corning Inc.)中，并在顶部用泡沫塞塞住。将烧瓶在NBS I24台式培养振荡器(New Brunswick Scientific Co.)中以30℃和200rpm下进行孵育。1.5小时后，当甲醛是唯一碳源时，再添加另外10mM的甲醛。24小时后采集样品用于如上描述的HPLC分析。当使用13C标记的甲醛作为底物时，在如上描述的提取和衍生化之后，通过GC-MS对样品进行分析。
发酵实验
所使用的生长培养基是另外补充有500mM甲醇、10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物和Neidhardt微量营养素溶液的M9(6.78g/L Na2HPO4、3g/L KH2PO4、1g/L NH4Cl、0.5g/LNaCl、2mM MgSO4、100μM CaCl2和15μM硫胺素-HCl)。使用每种菌株的过夜LB培养物用于接种至(1％)50mL封闭式锥形管(Genesee Scientific Co.)，该管包含5mL进一步补充有适当抗生素(50μg/mL羧苄青霉素、50μg/mL壮观霉素)的上述培养基。大约3小时后，通过添加0.04mM异丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)和0.04mM的cumate诱导基因表达。将管在NBS I24台式培养箱振荡器(New Brunswick Scientific Co.)中以30℃和200rpm下进行孵育。接种后每24、48、72和96小时采集样品(100μL)，用于进行OD600测量和如上描述的HPLC分析。当使用13C-甲醇作为底物时，在如上描述的提取和衍生化之后通过GC-MS对样品进行分析。
以甲醛为唯一碳源生长的双菌株大肠杆菌(E.coli)系统
使用如先前描述使用M9培养基培养和诱导的菌株进行双菌株实验。将诱导的细胞重悬至M9培养基中，达到3*109CFU(菌落形成单位)/mL(相当于～5的OD600)的初始浓度。将20mL悬浮液加入到含有3mg多聚甲醛(相当于5mM)的25mL烧瓶中，或将10mL悬浮液添加至含有添加的500mM甲醇或1mM甲醛和10mM甲酸钠的25mL烧瓶中。将能够消耗乙醇酸的第二个大肠杆菌(E.coli)菌株AC763添加到5*106CFU/mL(相当于～0.005的OD600)的初始浓度。AC763另外还含有组成型表达的eGFP的染色体拷贝，以帮助区分这两种菌株。在将AC763添加到培养物中之前，使AC763在25mL的Erlenmeyer烧瓶中(来自单菌落接种)以200rpm和30℃在5mL补充有5g/L乙醇酸和2g/L胰蛋白胨的上述M9最小培养基中预生长24个小时。然后将细胞离心(5000×g、22℃、5分钟)，用补充有5g/L乙醇酸的培养基洗涤两次，并将其重悬至～0.05的光密度。在200rpm和30℃(5mL，在25mL的Erlenmeyer烧瓶中)下孵育24个小时，离心细胞(5000×g、22℃)，用不含任何碳源的培养基洗涤两次，并将适当体积添加到双菌株系统中。将含有这两种菌株的烧瓶在200rpm和30℃下进一步孵育。在不同时间采集样品用于HPLC和细胞生长分析。每毫升培养物的菌落形成单位被用来衡量细胞生长的量度。在不含任何碳源的上述最小培养基中稀释适当体积的培养物，并将50μL的各种稀释液在含有2.5g/L乙醇酸的最小培养基平板上铺板。在37℃平板孵育后，对菌落进行手动计数，并使用蓝光透照仪(Vernier,Beaverton,OR)进行可视化以照射表达eGFP的菌株AC763。
如前所述，本领域技术人员将理解，虽然上文已经结合具体实施方式和实施例描述了本发明，但本发明不一定如此受限，并且许多其他实施方式，实施例，用途，对实施方式、实施例和用途的修改和偏离旨在被所附权利要求所涵盖。
实施例
实施例1：用于基于序列相似性以确定具有相似结构和/或功能的酶的策略
本实施例的目的是提供用于从参考酶作为查询开始确认具有所需活性的酶变体的工作流程的概述。在此实施例中，使用来自红螺旋杆菌(Rhodospirillales bacterium)URHD0017(RuHACL)的2-羟基酰基-CoA裂解酶HACL作为起始查询，用于确定第一轮2-羟基酰基-CoA合成酶(HACS)变体。使用蛋白质BLAST(pBLAST)时，基于RuHACL和草酰基-CoA脱羧酶之间、来自大肠杆菌(Escherichia coli)的OXC(EcOXC)和产甲酸草酸杆菌(Oxalobacterformigenes)(OfOXC)之间的E值的E值截止(cutoff)一起使用(参见图19)。为了通过将查询结果聚类到具有相似序列的家族中来向下选择代表性的变体，我们使用了CD-HIT Web服务器(参见Huang等人，Bioinformatics,(2010).26:680)。对原核起源的基因施加更宽松的70％同一性阈值限制，而对没有分类限制的基因使用50％同一性阈值限制(参见图19)。使用CD-HIT对代表性基因进行聚类和挑选，得到93个与RuHACL类似的HACS变体。对列表进行进一步的整理，包括消除动物界中过长或过短的序列和变体，这些序列不太可能在大肠杆菌(E.coli)中很好地表达。因此，我们确定了筛选后剩余的34个变体作为第一轮HACS变体，用于在大肠杆菌(E.coli)作为宿主中进行合成和测试(参见图19)。然后对选定的基因进行密码子优化，以便在大肠杆菌(E.coli)中表达，并与联合基因组研究所(JGI)合作合成。5个变体在合成过程中失败，这产生了29个第一轮JGI HACS变体(JGI1至JGI29)(参见表5)。
表5.通过使用RuHACL作为参考酶从具有序列相似性的基因簇中选择代表性基因来确定的2-羟基酰基-CoA(HACS)变体(JGI)列表
实施例2：建立用于筛选C1-C1缩合的第一轮HACS变体的高通量平台
本实施例的目的是证明用于在体内筛选2-羟基酰基-CoA合成酶(HACS)变体的高通量平台。我们使用每细胞密度的乙醇酸(glycolate)生产率(μM乙醇酸/OD600)作为HACS活性的指标。在活性HACS变体和来自单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)(LmACR)的酰基-CoA还原酶存在下，可以由甲醛作为唯一碳源生产乙醇酸(参见图20A)。LmACR被证明能够催化从甲醛到甲酰基-CoA的氧化反应(参见Chou,A.等人，Nat.Chem.Biol.15:900-906(2019))。HACS将甲醛和甲酰基-CoA缩合形成乙醇酰基-CoA，然后通过天然硫酯酶活性将其水解成乙醇酸(参见图20A)。
为了使体内甲醛产生乙醇酸的途径原型化，我们构建了分别在pCDFDuet-1和pETDuet-1中的IPTG诱导型T7启动子的控制下的过表达各种HACS候选物和LmACR的载体(参见图20C)。作为这些载体的宿主，我们使用了一种基于MG1655(DE3)的工程化大肠杆菌(E.coli)菌株，该菌株可敲除用于甲醛(ΔfrmA)和甲酸(ΔfdhFΔfdnGΔfdoG)氧化反应以及乙醇酸利用(ΔglcD)，我们预计这可能会与我们的途径分析相竞争或干扰。
除非另有说明，否则使用M9最小培养基(6.78g/L Na2HPO4、3g/L KH2PO4、1g/LNH4Cl、0.5g/L NaCl、2mM MgSO4、100μM CaCl2和15μM硫胺素-HCl)进行体内产物合成。细胞最初在96个深孔板(USA Scientific，Ocala,FL)中生长，该板含有0.2mL上述培养基，该培养基中进一步补充了20g/L甘油、10g/L胰蛋白胨和5g/L酵母提取物。将所需菌株的单个菌落在含有适当抗生素的LB培养基中培养过夜(14-16小时)并用作接种物(1％)。在适当的情况下，加入抗生素(100μg/mL羧苄青霉素、100μg/mL壮观霉素)。然后，将培养物在数字微孔板摇床(Fisher Scientific)中以30℃和1000rpm下孵育，直至OD600达到约0.4，此时添加适量的诱导剂(异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG))。接种后将平板孵育总共24小时(参见图20B)。
然后将来自上述预培养物的细胞离心(4000rpm，22℃)，用上述不含任何碳源的最小培养基洗涤，并用1mL含有指定量碳源的上述最小培养基重悬。在0小时的时候加入5mM甲醛。并在数字微孔板摇床(Fisher Scientific)中在30℃和1000rpm下孵育。在30℃的温度下孵育3小时后，通过离心得到细胞颗粒并使用如下所述的方式通过HPLC或GC-MS分析上清液。将生物转化后得到的细胞颗粒重悬至在的细菌蛋白提取试剂(ThermoFisher)中直至20OD，该细菌蛋白提取试剂中补充有的0.1mg/mL鸡蛋白溶菌酶(Fisher)和5U/mL 核酸酶(Sigma)，以用于细胞裂解。在室温下孵育15分钟后，将100μL的每种细胞裂解液转移至1.5mL的微量离心管中，以15,000x g离心5分钟。使用SDS-PAGE分析从上清液中获得的可溶性细胞裂解物。通过蛋白质凝胶图像中的条带面积来估计HACS的相对表达。
通过HPLC测定产物和底物浓度(甲酸、甲醛和乙醇酸)，使用配备有折射率检测器和HPX-87H有机酸柱(Bio-Rad,Hercules,CA)的Shimadzu Prominence SIL 20system(Shimadzu Scientific Instruments,Inc.,Columbia,MD)，该系统具有优化峰分离的操作条件(0.3ml/min的流速，30mM的H2SO4流动相，柱温度42℃)。使用配备了5977B Inert PlusMass Selective Detector Turbo EI Bundle(用于确定)和Agilent HP-5-ms毛细管柱(内径0.25mm，薄膜厚度0.25μm，长度30m)的Agilent 7890B Series Custom GasChromatography system对化合物经由GC-MS进行确定和分析。
第一轮HACS变体的筛选表明，29个变体中的3个变体(JGI15、19、20)表现出比起始参考RuHACL更好的乙醇酸生产率和相对HACS的表达(参见图20C)。JGI15和JGI20是两个最佳候选者，其乙醇酸生产率提高了3倍以上，并被选择进行进一步分析。
实施例3：在各种C1-C1冷凝平台下测试高性能变体
本实施例的目的是证明对两种高性能HACS变体(JGI15和JGI20)与参考酶RuHACL进行比较的分析。我们使用每种细胞密度的乙醇酸(glycolate)生产率(μM乙醇酸/OD600)作为HACS活性的指标。探索了两种不同的酶促合成乙醇酸合成酶的途径。第一条途径(途径1)类似实施例2中用于初始筛选的途径，添加了额外的基因，即来自大肠杆菌(Escherichiacoli)的醛脱氢酶aldA(EcAldA)，其过表达以驱动从乙醇醛到乙醇酸的通量(参见图21A)。此外，HACS和LmACR-AldA受到独立的诱导型启动子控制，以研究不同的相对基因表达的影响(参见图21B)。第二条途径(途径2)涉及甲醛和甲酰基-CoA的独立通量，允许仅响应于甲醛浓度的变化来评价酶活性，同时保持恒定的甲酰基-CoA通量。甲酰基-CoA是通过来自氨基丁酸梭菌(Clostridium aminobutyricum)(CaAbfT)的酰基-CoA转移酶催化的甲酸(formate)产生(参见图22A)。
对于体内原型设计，我们设计载体以独立控制HACS变体和LmACR-EcAldA(途径1，图21A)或CaAbfT(途径2，图22A)的表达，使用在pETDuet-1中的IPTG-inducible T7启动子控制下的HACS和在pETDuet-1中的cumate诱导型T5启动子的控制下LmACR-EcAldA或CaAbfT(参见图21B)。作为这些载体的宿主，我们使用了一种基于MG1655(DE3)的工程化大肠杆菌(E.coli)菌株，该菌株可敲除(ΔfrmA)和甲酸盐(ΔfdhFΔfdnGΔfdoG)氧化以及乙醇酸利用(ΔglcD)，我们预计这可能会与我们的途径分析相竞争或干扰。
除非另有说明，否则使用M9最小培养基(6.78g/L Na2HPO4、3g/L KH2PO4、1g/LNH4Cl、0.5g/L NaCl、2mMMgSO4、100μM CaCl2和15μM硫胺素-HCl)进行体内产物合成。细胞最初在96个深孔板(USA Scientific，Ocala,FL)中生长，该板含有0.2mL的上述培养基，该培养基进一步补充了20g/L甘油、10g/L胰蛋白胨和5g/L酵母提取物。将所需菌株的单个菌落在含有适当抗生素的LB培养基中培养过夜(14-16小时)，并用作接种物(1％)。在适当的情况下，加入抗生素(100μg/mL羧苄青霉素、100μg/mL壮观霉素)。然后，将培养物在数字微孔板摇床(Fisher Scientific)中在30℃和1000rpm下孵育，直至OD600达到约0.4，此时添加适量的诱导剂(异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG))。接种后将平板孵育总共24小时(参见图20B)。
然后将来自上述预培养物的细胞离心(4000rpm，22℃)，用上述不含任何碳源的最小培养基洗涤，并用1mL含有指定量碳源的上述最小培养基重悬。在0小时时加入仅用于LmACR-EcAldA共表达(参见图21A)的5mM甲醛、用于CaAbfT共表达(参见图22A)的0.5/5mM甲醛和20mM甲酸，并在数字微孔板摇床(Fisher Scientific)中在30℃和1000rpm下孵育。在3小时后通过离心收获用于LmACR-EcAldA共表达的细胞，并在1小时后通过离心收获细胞用于CaAbfT共表达的细胞，并通过如实施例2中所述的HPLC或GC-MS对上清液进行分析。
当使用5mM甲醛用作唯一碳源时，基于3小时内的乙醇酸生产率(μM/OD600)，JGI15(参见图21C)在最佳诱导剂浓度(相对基因表达)下的表现是RuHACL(参见图21D)的2.5倍。当甲醛和甲酸共同进料时，JGI15在低甲醛可用性(0.5mM)下的表现明显优于RuHACL和JGI20(分别为7倍和1.5倍)，表明JGI15与甲醛具有更好的亲和力(低Km)(参见图4B)。另一方面，JGI20在高甲醛浓度(5mM)下显示出更好的乙醇酸生产率，这表明该变体具有更好的周转率(高kcat)。
实施例4：高性能HACS变体的动力学特征
本实施例的目的是使用纯化酶进行体外动力学测定，以证明来自第一轮同源物的高性能HACS变体(JGI15、JGI20、JGI23和JGI24)的动力学特征。使用乙酰基-CoA作为CoA供体，通过CoA转移酶CaAbfT催化从甲酸提供甲酰基-CoA的偶联反应进行动力学测定。
使用由联合基因组研究所(JGI)构建的用于HACS变体(JGI15、20、23和24)的基于质粒的基因表达或通过将所需基因克隆到用适当的限制性内切酶消化的pCDFDuet-1(Novagen,Darmstadt,Germany)中，并利用In-Fusion克隆技术(Clontech Laboratories,Inc.,Mountain View,CA)来实现所选的酶变体的表达。通过密码子优化基因的基因合成产生用于插入的线性DNA片段。基因由GeneArt(Life Technologies,Carlsbad,CA)或Twist(Twist Biosciences)合成。所得的In-Fusion反应产物用于转化大肠杆菌(E.coli)Stellar细胞(Clontech Laboratories,Inc.,Mountain View,CA)，并通过PCR筛选确定出的克隆通过DNA测序进一步确认。
表达菌株的过夜培养物在LB中生长，用于在250mL带挡板烧瓶中以1v/v％(250μL)接种于25mL的TB培养基。所述培养物在振荡器中的30℃和250rpm下生长，直至OD550达到0.4-0.6，此时用0.1mM的IPTG诱导表达。接种24小时后，通过离心收获细胞。将细胞沉淀用9g/L的冷NaCl溶液洗涤一次，并在-80℃下进行储存直至需要为止。在适当的情况下，包括以下浓度的抗生素：羧苄青霉素(50μg/mL)和壮观霉素(50μg/mL)。
为了蛋白质纯化，如上文所述制备的表达所需his-标记酶的大肠杆菌(E.coli)细胞沉淀。将冷冻的细胞颗粒重悬于冷裂解缓冲液(50mM NaPi pH 7.4、300mM NaCl、10mM咪唑、0.1％Triton-X 100)中，直至OD550约为40，向其中加入1mg/mL的溶菌酶和250UBenzonase的核酸酶。使用Branson Sonifier 250在冰上超声处理混合物(5分钟，占空比25％，输出控制设置为3)，并在4℃下以7500×g离心15分钟。将上清液加至含有1mLTALON金属亲和树脂(Clontech Laboratories,Inc.,Mountain View,CA)的色谱柱中，该色谱柱已用裂解缓冲液预平衡。然后首先用10mL裂解缓冲液洗涤柱，然后用20mL的洗涤缓冲液(50mMNaPi pH 7.4、300mM NaCl、20mM咪唑)洗涤柱两次。使用1-2次4mL的洗涤缓冲液(50mM NaPipH 7.4、300mM NaCl、250mM咪唑)洗脱his-标记的目标蛋白。收集洗脱液并将其应用于10,000MWCO Amicon超滤离心装置(Millipore,Billerica,MA)中，并用4mL 50mM KPi pH 7.4洗涤浓缩物(约100μL)洗涤两次以脱盐。蛋白质浓度通过Bradford方法进行评估。纯化的蛋白质保存在-80℃下以20μL等份的试样中，直至需要为止。
根据制造商协议(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)，使用NuPAGE 12％Bis-Tris蛋白凝胶与SDS运行缓冲液进行SDS-PAGE，并通过SimplyBlue SafeStain进行染色。
体外动力学测定是由100mM KPi pH 6.9、10mM MgCl2、0.15mM TPP、2mM乙酰基-CoA、1μM CaAbfT、0.25μM HACS变体和20mM甲酸钠构成。将反应物在室温下孵育3分钟，以将甲酸转化为甲酰基-CoA，然后将特定浓度的醛(此处具体为乙醛或丙醛)添加到反应中。在再孵育3分钟后，加入1/20反应体积的10M NaOH溶液以终止反应。在水解30分钟之后，加入1/20反应体积的10N H2SO4以中和pH。将样品以20817×g下离心15分钟，并通过如下所述的GC-MS对上清液进行分析。
对于该分析，向样品中添加0.15的反应体积的内标琥珀酸甲酯。通过剧烈涡旋20分钟，以将所得样品萃取到4mL乙酸乙酯中。对有机相进行分离，并在氮气流下蒸发至干燥。将残余物溶解于30μL吡啶和30μL N,O-双(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)中，并在60℃下孵育15分钟。使用配备了5977B Inert Plus Mass Selective Detector Turbo EIBundle(用于确定)和Agilent HP-5-ms毛细管柱(内径0.25mm，薄膜厚度0.25μm，长度30m)的Agilent 7890B Series Custom Gas Chromatography system，通过GC-MS对化合物进行确定和分析。样品通过GC(1μL进样，分流比为20:1)进行分析，其使用氦气作为载气，1.5mL/min的流速和以下的温度分布：初始90℃，持续3分钟；以15℃/min升温至170℃；以20℃/min升温至300℃，并保持8分钟。进样器和检测器的温度分别为250℃和350℃。
正如实施例3所假设的(参见图22B)的那样，JGI15相对于甲醛具有更低的Km和更低的kcat(参见表8)。对于较长链的醛，与JGI23和JGI24相比，JGI15和JGI20对乙醛和丙醛的Km(亚毫摩尔)较低，同时Kcat也较低。这表明它们对醛具有更强的亲和力和更低的酶活性。JGI23和JGI24是有前景的，因为它们具有更好的活性(更高的Kcat)，通过提高它们与底物的亲和力(更低的Km)，他们具有更好地在体内发挥作用的良好潜力。类似地，AcHACL与丙酮的Km较低，而JGI15与丙酮的Kcat更好(参见表8)。
表8.以各种醛和酮作为底物的2-羟基酰基-CoA合成酶(HACS)变体的表观动力学参数。
1参见Chou等人，Nat Chem Biol 15,906-919(2019)
实施例5：对高性能HACS变体的蛋白质结构进行建模并通过结构分析了解关键的
催化残基
该实施例证明了使用蛋白质结构分析和丙氨酸扫描方法对重组高性能HACS变体(JGI15和JGI20)的分析。JGI15(参见图23A)和JGI20(参见图23B)的完整二聚体结构在ColabFold平台上(参见Mirdita等人NatureMethods 19:679-682(2022))使用AlphaFold(参见Jumper等人Nature 596:583-589(2021))进行建模。该模型与来自产形氧化杆菌(Oxalobacter formigenes)的草酰基-CoA脱羧酶与甲酰基-CoA复合物的晶体结构(PDB代码：2JI8)(参见Berthold等人，结构15:853-861(2007))相一致，以了解在活性位点中的两个关键配体、二磷酸硫胺素(TPP)甲酰基-CoA的取向。JGI15和JGI20的结构高度相似，其均方根距离(RMSD)值分别为和所述活性位点(其中TPP和甲酰基-CoA界面的甲酰基残基用于催化)和CoA结合位点均暴露于溶剂，以表明对接在JGI15和JGI20结构上的配体的正确方向(参见图23C)。
为了了解负责催化活性和底物结合的特定氨基酸(AA)残基，我们使用JGI20作为参考蛋白从TPP(参见图24A)或甲酰基-CoA(参见图24B)中选择了内的所有AA残基(表7)。然后，我们选择了所有第一轮JGI变体(包括RuHACL在内的30个)中不保守的AA残基，并且是具有C1-C1缩合活性的变体所独有的AA残基。结果选择了来自TPP结合位点的3个AA残基(来自JGI20的H80、Q113和Y367)和来自CoA结合位点的6个AA残基(F112、V354、M392、T397、Q544和W548)(参见图24C)。Q544和W548位于JGI20的C-末端，其显示覆盖其他类似蛋白质中活性位点的闭合环，例如来自清迈放线菌(Actinomycetospora chiangmaiensis)的2-羟基酰基-CoA裂解酶(AcHACL)(参见Zahn等人，J.Biol.Chem.298(1)101522(2022))。发现活性HACS变体在该区域中具有保守的“RKPQQF-W”残基，而其他变体则没有(参见图25A)。因此，我们决定使用丙氨酸扫描方法(Morrison and Weiss,Curr Opin Chem Biol.5(3):302–7(2001))，仅在活性位点和C-末端闭合环附近的活性变体中探索保守残基的重要性，以确定其中的关键催化残基。
表7.活性位点残基(在TPP中以及基于JGI20的AlphaFold结构甲酰基-CoA)和在C1-C1缩合上的高性能变体的相应残基。粗体的残基表示活性变体中未保留的残基。带星号(*)的残基表示被假设可用于区分HACS和OXC的关键催化残基。
通过将野生型JGI15和JGI20克隆到载体pUC19(Clontech Laboratories,Inc.,Mountain View,CA)中来制备JGI15和JGI20的突变体。根据用于诱变“体内组装”(IVA)诱变方案设计的包含所需突变的引物(参见Garcia-Nafria等人，Sci.Rep.6,12.2016)。根据IVA方案生成含有突变的PCR产物，并用于转化大肠杆菌(E.coli)Stellar细胞(ClontechLaboratories)。通过DNA测序证实所需的突变序列。然后，使用限制性内切酶进行消化和连接，将突变基因克隆到最终表达载体(pCDFDuet-1)中。用0.5mM甲醛和20mM甲酸作为碳源，以与实施例3(参见图22A)中描述的途径2相同的方式检测突变体的HACS活性。
对活性位点残基的丙氨酸扫描结果显示，来自TPP结合的谷氨酰胺113(Q113)和酪氨酸367(Y367)以及来自CoA结合的苯丙氨酸112(F112)和甲硫氨酸392(M392)是针对HACS活性对甲醛-甲酰基-CoA缩合的重要残基(参见图24C)。Q113显示了在其他2-羟基酰基-CoA合成酶(例如AcHACL)中具有关键催化功能(参见Zahn等人，J.Biol.Chem.298(1)101522(2022))。此外，在之前的RuHACL研究中，F112和Q113的诱变显示出HACS活性的消除(参见Chou,A.,等人，Nat.Chem.Biol.15:900-906(2019))。还发现已知的草酰基-CoA脱羧酶(OXC)变体，包括来自大肠杆菌(E.coli)、O.formigenes和豁免甲基红酵母(Methylorubrumextorquens))基因，在F112 Q113的位置具有保守的酪氨酸-谷氨酸(YE)残基。来自第一轮HACS变体的所有具有OXC样“YE”残基的变体(JGI4、6、7、9、10、11)不具有任何由甲醛产生的乙醇酸，并且在系统发育分析中与OXC聚集在一起(参见图29)。因此，“FQ”和“YE”可能是区分HACS和OXC类型酶的关键催化残基。有趣的是，我们发现对催化功能重要的两个额外残基(Y367和M392)(参见图24C)也仅在HACS中保守，而在OXC中不保守(表7)。OXC类型酶在对应于Y367的位置具有非保守的残基，并且在该M392的位置具有保守的亮氨酸(L)残基。因此，这两个残基也可能在区分HACS和OXC活性的催化功能中发挥重要作用。
除了JGI20的Q545A之外，JGI15和JGI20中没有一个C-末端残基消除了从点突变到丙氨酸的活性(参见图25B)。根据文献(参见Zahn等人，J.Biol.Chem.298(1)101522(2022))，预期HACS的C-末端可充当闭合环稳定底物结合而没有催化功能。因此，假设C-末端在限制结合袋的底物尺寸方面发挥了重要作用。根据JGI15和JGI20对该区域的丙氨酸扫描结果，我们可以看到总体活性降低的趋势，特别是在高甲醛浓度(5mM)下，这可能是由于结合袋的稳定性降低。然而，有趣的是，一些突变例如P547A(JGI15)、P543A(JGI20)、Q549A(JGI15)和Q544A(JGI20)，在低甲醛(0.5mM)下显示出显著的活性改善(参见图25B)。这可能是由于改变了底物与最小的醛(甲醛)的结合亲和力的结果。
实施例6：通过产生两种高性能变体的杂交蛋白来提高HACS活性
本实施例展示了通过基于结构分析产生杂交蛋白来工程化重组高性能的HACS变体(JGI15和JGI20)。根据动力学特性(表8)，JGI20与JGI15相比具有更高的kcat，且其与甲醛的Km也更高。我们假设我们可以通过在JGI20和JGI15之间产生杂交蛋白来提高他们两者的亲和力或周转率。为了确定两种蛋白质之间的结构差异，我们使用蛋白质数据库(PDB)网站(www.rcsb.org)中的“成对结构比对”功能。使用由AlphaFold建模的JGI15和JGI20结构进行结构比较，结果显示两种蛋白质结构之间存在两个不对齐的残基(参见图26A)。JGI15-20杂交蛋白是通过插入或删除AA残基以完全对齐两种结构而构建的。因此，JGI15N465ins、R493del和N465 R493del被构建为使JGI15“JGI20-类似”，而JGI20 N461del、R480ins和N461del R480ins被构建为使JGI20“JGI15-类似”(参见图26B)。
另一种方法是通过改造JGI20的活性位点以模拟JGI15，从而提高JGI20与底物的结合亲和力(Km)。比较两种酶的活性位点残基(表11)，唯一不保守的残基是A253和P254，其中JGI15在相应位置具有两个连续的甘氨酸残基。因此，构建了一个“JGI15-类似”的JGI20A253G P254G。另一个目标区域是C-末端，丙氨酸扫描结果显示了此处的活性变化。JGI15和JGI20在c-末端尾部具有高度保守的序列，除了最后的四到五个残基之外(参见图27A)。基于由AlphaFold建模的JGI15和JGI20的蛋白质结构，c-末端的差异显示了闭环的方向略有不同(参见图27A)。我们假设这种差异可能导致JGI15和JGI20之间的Km差异，并构建了JGI20的“JGI15-类似”的C-末端：JGI20 L549H T550G R551del。
表11.通过使用CcAck和CcPta作为参考酶从具有序列相似性的基因簇中选择代表性基因来确定的酰基-CoA激酶(ACK)和磷酸酰基转移酶(PTA)变体(JGIK)的列表。
突变体的构建和测试以与实施例5中描述的相同的方式进行。
基于结构比对的JGI15-20杂合体显示JGI15在高甲醛下和JGI20在低甲醛下的显著改善，有趣的是，在这两种变体中都表现出了积极影响(参见图26B)。这两种变体的排列可能会影响催化残基的取向，从而特别地在高甲醛浓度或低甲醛浓度下改变活性。在低甲醛浓度下，在JGI20活性位点和c-末端上模拟JGI15的突变，以显示出乙醇酸生产率分别为39％和61％的更显著的提高(参见图27B)。我们还尝试将来自JGI15-20的结构杂合体和活性位点杂合体的有益突变与JGI20 R480 L549H T550G R551del组合，将AlphaFold结构杂合体和C-末端杂合体组合，显示出高达70％的活性最佳改善，在高甲醛浓度下仅具有最小的活性下降(参见图27B)。这比0.5mM FALD下的JGI15提高了近50％，这表明JGI20的Km值显著降低，这是采用混合方法的目的。
实施例7：用于甲醛活性的第二轮HACS变体的确定、合成和筛选
本实施例展示了以甲醛为底物的第二轮HACS变体的确定、合成和筛选。从第一轮变体中，我们发现JGI15、JGI19和JGI20对于乙醇酰基-CoA合成酶的活性超过其对于起始参考酶RuHACL的活性(参见图28C)。此外，文献中证明了来自清迈放线菌(Actinomycetosporachiangmaiensis)的2-羟基酰基-CoA裂解酶(AcHACL)的潜在的乙醇酰基-CoA合成酶(C1-C1缩合)(参见Rohwerder等人Front.Microbiol.11:691(2020))。基于使用甲醛作为唯一碳源的体内筛选(参见图28A)(实施例3的途径1)，在5mM的甲醛下AcHACL显示出比RuHACL更好的乙醇酸生产率。从系统发育树可以看出，AcHACL与RuHACL和其他第一轮JGI变体有远亲关系(参见图29)。因此，我们决定使用第一轮变体中的JGI15、JGI19、JGI20和AcHACL作为参考酶来确定第二轮HACS变体(JGIH)。
表6.通过使用AcHACL、JGI15、JGI19和JGI20作为参考酶从具有序列相似性的基因簇中选择代表性基因来确定的2-羟基酰基-CoA(HACS)变体(JGIH)的列表
将实施例1(参见图19)中描述的方法用于每种起始参考酶。共确定出99种酶，其与AcHACL密切相关(AcHACL簇)、与AcHACL(与AcHACL簇较远相关)、JGI19簇、JGI15簇和JGI20簇(参见图29)较远相关。我们还从I-TASSER(参见Yang等人，NatureMethods,12:7-8(2015))中确定了9种额外的酶，不考虑其序列相似性，它们在结构上与AcHACL、JGI15、JGI19或JGI20相似。与联合基因组研究所合作，对总共108个基因(JGIH1至JGIH108)进行了密码子优化和合成，并成功将其中99个变体构建到pCDFDuet-1表达载体中进行测试。
使用高通量筛选将甲醛(0.5mM)和甲酸与甲酸活化酶共进料来测试第二轮变体的乙醇酰基-CoA合成酶活性(参见图30A)。结果显示，六个变体(JGIH25、26、30、41、61和65)的性能比野生型JGI15表现得更好，其中JGIH25和JGIH65的乙醇酸生产率提高了超过50％。还有5个其他候选者的表现以与JGI15类似的水平执行(参见图30B)。
根据系统发育树分析可知，JGIH25、26和30属于JGI20簇，41和61属于JGI15簇，JGI65属于JGI19簇。来自AcHACL簇的几个变体(JGIH5和12)也显示出不错的乙醇酸生产率，约为JGI15的80％。当比较与实施例5中确定的JGI20的活性位点残基比对的六个最佳变体的残基时，我们可以看到它们中的大多数都是高度保守的，除了在JGI15和JGI15之间不保守的两个残基(JGI20中的A253 P254)之外(表7)。JGIH61和65在系统发育上与JGI15和20的距离最远，因此，除了之前确定的两个残基之外，在活性位点上还有多个非保守的残基。在对这两个变体进行进一步表征，例如它们与甲醛和甲酰基-CoA的亲和力以及周转率之后，可以考虑根据之前的JGI15和20杂交方法的经验构建新的杂交蛋白。除了JGIH61和65在c-末端有两个和三个额外的AA残基外，六个最佳变体的c-末端残基也非常保守。六个变体中没有一种具有与JGI15相同的C-末端残基，JGI15可能是闭环杂交蛋白方法的另一个目标。
实施例8：第一轮和第二轮醛活性变体的筛选
本实施例的目的是展示用于筛选在体内以各种醛作为底物的第一轮和第二轮的2-羟基酰基-CoA合成酶(HACS)变体的高通量平台。我们使用每细胞密度的2-羟基酸生产率(μM/OD600)作为HACS活性的指标。在活性HACS变体和来自氨基丁酸梭菌(Clostridiumaminobutyricum)(CaAbfT)的酰基-CoA转移酶存在下，可以以共同供给各种醛和甲酸(formate)作为碳源来生产2-羟基酸。CaAbfT被证明能够催化从甲酸到甲酰基-CoA的反应(参见Nattermann,M.等人，ACS Catal 11(9):5396-5404(2021))。HACS使醛和甲酰基-CoA缩合以形成2-羟基酰基-CoA，然后其可以通过天然硫酯酶活性水解成2-羟基酸(参见图31A)。
对于体内原型设计，我们设计了载体来独立控制HACS变体和CaAbfT的表达，通过使用在pCDFDuet-1中的IPTG诱导的T7启动子控制下的HACS和在pETDuet-1中的cumate诱导型T5启动子的控制下的CaAbfT(参见图31B)，并将它们转化到实施例3中描述的工程化大肠杆菌(E.coli)菌株中。
使用如实施例3中所述的高通量筛选平台，通过共同进料5mM醛和20mM甲酸来对HACS变体进行2-羟基酸生产的筛选。1小时后通过离心收获细胞，并通过HPLC(如实施例2中所述)或SoGO方法分析上清液。在SoGO方法中，来自菠菜(Spinacia oleracea)(SoGO)的乙醇酸氧化酶被用于催化2-羟基酸的氧化，以产生2-含氧酸和过氧化氢(H2O2)。然后，使用Amplex UltraRed(Invitrogen)试剂作为辣根过氧化物酶(HRP)(Sigma)的荧光底物，该酶以1:1的化学计量比与H2O2反应产生Amplex UltroxRed，这是一种荧光性强、吸收性强的反应产物(激发/发射最大值～568/581nm)。2-羟基酸浓度通过使用基于BioTek Synergy HT平板读取器(BioTek Instruments)由Amplex UltroxRed测量的荧光读数的校准来计算。
实施例9：第一轮和第二轮HACS变体的乙醛活性筛选
本实施例证明了以乙醛为底物的体内第一轮和第二轮HACS变体的筛选。我们使用每细胞密度的乳酸(lactate)生产率(μM乳酸/OD600)作为HACS活性的指标。使用如实施例3中所述的高通量筛选平台，通过共同进料5mM乙醛和20mM甲酸来筛选HACS变体的乳酸生产。HACS使乙醛和甲酰基-CoA缩合以形成乳酰基-CoA，然后可以通过天然硫酯酶活性将乳酰基-CoA水解成乳酸(参见图32A)。
第一轮HACS变体的筛选显示，29个变体中有6个变体提供了良好的乳酸生产率(参见图32B)。JGI15和JGI20是两个最佳候选者，与其他HACS变体相比，其乳酸生产率高出2倍以上。
如实施例8所述，通过SoGO方法确定第二轮HACS变体的产物浓度(乳酸)的定量。结果表明，一种变体JGIH48比野生型JGI15表现得更好，乳酸生产率增加超过20％(参见图32C)。此外，JGIH28的性能与JGI15相似。
实施例10：第一轮和第二轮HACS变体的丙醛活性筛选
本实施例展示了以丙醛作为底物的体内第一轮和第二轮HACS变体的筛选。我们使用每细胞密度的2-羟基丁酸(2HB)生产率(μM 2HB/OD600)作为HACS活性的指标。使用如实施例3中所述的高通量筛选平台，通过共同进料5mM丙醛和20mM甲酸来对HACS变体的2HB生产进行筛选。HACS使丙醛和甲酰基-CoA缩合以形成2-羟基丁酰基-CoA，然后其可以通过天然硫酯酶活性水解成2HB(参见图33A)。
第一轮HACS变体的筛选显示，29个变体中有10个提供了不错的2HB生产率(参见图33B)。JGI20、JGI23和JGI24是三个最佳候选者，与其他HACS变体相比，其2HB生产率高出3倍以上。
如实施例8所述，通过SoGO方法确定第二轮HACS变体的产物浓度(2HB)的定量。结果表明，三种变体(JGIH25、JGIH28和JGIH48)的表现比JGI23表现得更好，其中JGIH28的2HB生产率增加超过40％(参见图33C)。
实施例11：第一轮和第二轮HACS变体的乙醛活性筛选
本实施例展示了以乙醇醛作为底物的体内第一轮和第二轮HACS变体的筛选。我们使用每细胞密度的甘油酸(glycerate)生产率(μM甘油酸/OD600)作为HACS活性的指标。使用如实施例3中所述的高通量筛选平台，通过共同进料5mM乙醇醛和20mM甲酸来对HACS变体的2HB生产进行筛选。HACS将乙醇醛和甲酰基-CoA缩合以形成甘油基-CoA，然后甘油基-CoA其可以通过天然硫酯酶活性水解成甘油酸(参见图34A)。
第一轮HACS变体的筛选显示，29个变体中有9个突变体提供了良好的甘油酸生产率(参见图34B)。JGI15和JGI20是两种最佳候选者，与其他HACS变体相比，其甘油酸生产率高出2倍以上。
基于系统发育树分析(参见图29)，由于JGI15和JGI20是第一轮HACS筛选中表现最好的候选者，我们预计属于JGI15和/或JGI20簇的变体在第二轮HACS变体筛选中将表现出良好的性能(甘油酸生产率)。
实施例12：第一轮和第二轮HACS变体的乙醛酸活性筛选
本实施例展示了以乙醛酸(glyoxylate)作为底物的体内第一轮和第二轮HACS变体的筛选。我们使用每细胞密度的酒石酸(tartronate)生产率(μM酒石酸/OD600)作为HACS活性的指标。使用如实施例3中所述的高通量筛选平台，通过共同进料5mM乙醛酸和20mM甲酸来对HACS变体的酒石酸生产进行筛选。HACS使乙醛酸和甲酰基-CoA缩合以形成酒石酰-CoA，然后可以通过天然硫酯酶活性将其水解成酒石酸(参见图35A)。
第一轮HACS变体的筛选显示，29个变体中有6个变体具有良好的酒石酸生产率(参见图35B)。JGI20是最佳候选者，与其他HACS变体相比，酒石酸生产率提高了30％。
基于系统发育树分析(参见图29)，由于JGI20是第一轮HACS筛选中表现最好的候选者，我们预计属于JGI20簇的变体在第二轮HACS变体筛选中表现出良好的性能(酒石酸生产率)。
实施例13：第一轮和第二轮HACS变体的3-羟基丙醛活性筛选
本实施例展示了以3-羟基丙醛(3HP)作为体内底物的第一轮和第二轮HACS变体的筛选。我们使用每细胞密度的2,4-二羟基丁酸(DHB)生产率(μM DHB/OD600)作为HACS活性的指标。使用如实施例3中所述的高通量筛选平台，通过共同进料5mM 3HP和20mM甲酸来对HACS变体的DHB生产进行筛选。HACS使3HP和甲酰基-CoA缩合以形成2,4-二羟基丁酰基-CoA，然后可以通过天然硫酯酶活性将其水解成DHB(参见图36A)。
第一轮HACS变体的筛选显示，29个变体中的3个变体(JGI15、JGI20和RuHACL)提供了良好的DHB生产率(参见图36B)。
根据系统发育树分析(参见图29)，由于JGI15、JGI20和RuHACL是第一轮HACS筛选中表现最好的候选者，我们预计属于这些簇的变体在第二轮HACS变体筛选中表现出良好的性能(DHB生产率)。
实施例14：第一轮变体的酮活性筛选
本实施例展示了以各种酮作为底物生产支链化合物的第一、第二轮HACS变体的筛选。使用如实施例3的途径2中所述的高通量筛选平台，通过将100mM丙酮和20mM甲酸与甲酸活化酶CaAbfT共同进料来测试HACS变体(参见图37A)。
结果表明，JGI15、JGI19和JGI20一起的AcHACL具有比其他HACL更好的性能，其中JGI15的性能最好。使用实施例4中描述的方法进行JGI15和AcHACL与丙酮和甲酸的动力学表征。JGI15具有更好的活性(更高的kcat)，这在体内提供了更好的性能，同时它具有更高的Km，这限制了它的性能(表8)。尽管AcHACL的活性较差，但其Km却低得多(参见图37B)。在使用AcHACL或JGI15作为参考的第二轮HACS变体中，预期通过丙酮和甲酰基-CoA的缩合来生产2HIB的更好的HACL。
实施例15：通过体外检测甲基酮作为底物与甲酰基-COA的缩合反应
本实施例展示了使用纯化的酶实现甲基酮与甲酰基-CoA的缩合。由CoA转移酶CaAbfT催化的甲酰基-CoA生成和由HACS JGI15催化的缩合与上文所述的实施例相同(参见图38A)。甲基酮可以通过文献中证明的脂肪酸合成和β-氧化途径来产生(参见Goh E-B等人，Appl Environ Microbiol 78:70-80(2012)；Nies SC等人，Metab Eng 62:84-94(2020))。
如上所述，所述酶CoA转移酶CaAbfT和HACS JGI15被过表达和纯化。用于甲基酮和甲酰基-CoA缩合的体外纯化酶反应由100mM KPi pH 6.9、10mM MgCl2、0.15mM TPP、2mM乙酰基-CoA、1μM JGI15、2μM CaAbfT、20mM甲酸和100mM测试的甲基酮构成。除非另有说明，否则将反应在30℃下孵育24小时。
对于该分析，首先用1/20反应体积的10M NaOH溶液处理含有酰基-CoA的样品以终止反应。在水解30分钟之后，加入1/20反应体积的10N H2SO4以提高酸萃取效率。通过剧烈涡旋90秒后，将所得的样品萃取到4mL乙酸乙酯中。对有机相进行分离，并在氮气流下蒸发至干燥。将残余物溶解在50μL吡啶和50μL N,O-双(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)中，并在60℃下孵育15分钟。使用配备了5977B Inert Plus Mass Selective Detector TurboEI Bundle(用于确定)和Agilent HP-5-ms毛细管柱(内径0.25mm，薄膜厚度0.25μm，长度30m)的Agilent 7890B Series Custom Gas Chromatography system，通过GC-MS对化合物进行确定和分析。样品通过GC(1μL进样，分流比为20:1)进行分析，其使用氦气作为载气，1.5mL/min的流速和以下的温度分布：初始90℃，持续3分钟；以15℃/min升温至170℃；以20℃/min升温至300℃，并保持8分钟。进样器和检测器的温度分别为250℃和350℃。
甲基酮可被用于缩合，其包括但不限于丙酮、甲基乙基酮(Cn-酮，n>3，丁酮、戊酮和庚酮为例)，羟基酮(羟基丙酮)和其他功能性酮(乙酰丙酮、支链酮、甲基乙二醛)等。JGI15可以催化测试酮的缩合，如图38B所示，这表明其他确定的HACS能够使其他酮与甲酰基-CoA缩合以产生2-羟基-2甲基酸和衍生物(参见图39)。甲基酮可被用于缩合反应，其包括但不限于丙酮、甲基乙基酮(Cn-酮，n>3、丁酮、戊酮和庚酮作为例子)、羟基化酮(羟基丙酮)和其他功能性酮(乙酰丙酮、支链酮、甲基乙二醛)等(参见图40-47)。
实施例16：ACR变体的确定、合成和筛选
本实施例展示了酰基-CoA还原酶(ACR)变体的确定、合成和筛选，该变体专门用于酰化甲醛氧化(甲醛转化至甲酰基-CoA)的反应。从通过与RuHACL偶联的乙醇酸生产率测量的已知ACR的初步筛选(参见图48A)，我们确定了自单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)(LmACR)的酰基-CoA还原酶是最活跃的(参见图48B)，其被选择作为确定具有序列相似性的新酶的起始参考。
使用实施例1(参见图19)中描述的方法，确定了44个新的ACR变体(JGIR1至440)，并且与联合基因组研究所合作合成了40种最终构建体(参见图49A，表9)。
表9：通过使用LmACR作为参考酶从具有序列相似性的基因簇中选择代表性基因来确定的酰基-CoA还原酶(ACR)变体(JGIR)的列表。
ACR变体以与实施例2中所描述的相同的静息细胞形式进行测试，但不存在HACS以降低总体反应方案的复杂性(参见图49B)。作为结果，使用高通量NASH比色测定法(Nash,Biochem J.55(3):416-421(1953))测量了由ACR变体催化的体内甲醛还原为甲酰基-CoA的反应。对每细胞密度的甲醛消耗量(OD600)进行计算，并与作为参考的LmACR活性进行比较(参见图49C)。有三种变体(JGIR2、5和14)在低甲醛(0.5mM)和高甲醛(3mM)下均显示甲醛消耗活性提高了10-20％。与LmACR相比，JGIR10在高甲醛条件下的活性显著提高(40％)，但其在低甲醛下活性降低，这可能表明更高的kcat以及更高的Km。还有其他几种变体具有与LmACR相当的活性，值得在其他条件下进一步探索。
实施例17：甲酸活化酶(ACT和ACK-PTA)变体的确定、合成和筛选
本实施例展示了酰基-CoA转移酶(ACT)变体以及酰基-CoA激酶(ACK)和磷酸酰基转移酶(PTA)变体的确定、合成和筛选，其特别是用于甲酸活化(甲酸至甲酰基-CoA)的反应(参见图50A)。从通过与JGI15L偶联的乙醇酸生产率测量的已知ACT和ACK-PTA的初始筛选(参见图50B)中，我们确定了来自氨基丁酸梭菌(Clostridium aminobutyricum)(CaAbfT)的酰基-CoA转移酶是来自ACT变体的最具有活跃的，并且来自圆柱状芽孢杆菌(Clostridium cylindrosporum)(CcAck-Pta)的酰基-CoA激酶和磷酸酰基转移酶组合是来自ACK-PTA变体的最有活性的(参见图50B)，其被选择作为确定具有序列相似性的新酶的起始参考。
使用实施例1(参见图19)中所描述的方法，与联合基因组研究所合作合成了62个新的ACT变体(JGIT1至62)和38个新的ACK-PTA变体(参见图51AB，表10)。
表10.通过使用CaAbfT和OfFrc作为参考酶从具有序列相似性的基因簇中选择代表性基因来确定的酰基-CoA转移酶(ACT)变体(JGIT)的列表。
以与实施例3(途径2)中所描述的相同的静息细胞形式测试ACT和ACK-PTA变体，其中用JGI20作为HACS和不同的甲酸活化酶变体来代替CaAbfT(参见图52A)。添加2.5mM甲醛和20mM甲酸作为碳源来测量变体的乙醇酸活性。结果显示，两种ACT变体(JGIRT45和51)显示出相同或改善的CoA转移酶活性，并且多种ACK-PTA变体显示出显著的甲酰基-CoA生成活性，这是在CcAck-Pta中从未观察到的情况(参见图52B)。这与我们之前的观察结果一致，CcAck-Pta需要高甲酸浓度(50mM)以显示出显著的乙醇酸生产率，表明了该酶的高Km(参见图52B)。一些ACK-PTA变体例如JGIK1、18和31显示出与高性能ACT变体相当的活性，即使在相对低的甲酸浓度下，高性能的ACT也可以为甲酰基-CoA的产生提供更多样化的途径(参见图52B)。
实施例18：设计和筛选具有改善的催化效率的酶的策略
本实施例展示了进一步设计HACS、ACR、ACT和ACK-PTA酶的潜在策略，以提高对所需底物的活性和选择性。实施例5和实施例6中描述的方法不仅可以应用于第二轮HACS变体，还可以应用于其他的ACR、ACT和ACK-PTA变体。如实施例5所示，随后进行同源引导比对的由AlphaFold建模的结构，其将允许确定活性位点残基。然后可以通过饱和诱变将这些关键残基作为定向进化的目标。同时诱变和迭代诱变都可以考虑用于定向进化。或者，对于具有高表达、活性或者底物特异性的多种变体的DNA重排可以被重排以确定具有更高催化效率的候选物。通过容易出错的PCR对候选基因进行随机诱变也是一种选择。
为了提高筛选方法的通量，可以使用基于选择的筛选方法。为了筛选ACR对甲醛氧化活性的影响，我们可以利用甲醛的毒性。甲醛解毒途径(frmA)缺失的大肠杆菌(E.coli)在亚毫摩尔浓度的甲醛下无法生存。携带具有高催化效率(kcat/Km)的ACR的细胞可以快速将甲醛转化为毒性小得多的甲酰基-CoA，从而允许细胞在其他营养物质存在的情况下生存以维持和生长。
我们还开发了一个基于选择的筛选平台，用于通过甘氨酸营养缺陷型菌株生产乙醇酸。作为选择平台的宿主，我们设计了一种基于MG1655(DE3)的大肠杆菌(E.coli)的甘氨酸营养缺陷型菌株，该菌株具有用于甘氨酸生产和利用(ΔaceAΔkblΔltaEΔglyA)的敲除，这迫使该菌株仅在补充甘氨酸的情况下生长(参见图53A)。乙醇酸可以首先被大肠杆菌(E.coli)glcD催化氧化为乙醛酸，随后异源丙氨酸脱氢酶催化乙醛酸还原为甘氨酸的混杂活性(参见图53A)。来自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculos)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的丙氨酸脱氢酶被证明具有与乙醛酸结合产生甘氨酸的活性(参见J.Bacteriol.194:1045-1054,2012；Biochemistry 20:5650-5655,1981)。
对于基因缺失，使用CRISPR是基于在Appl.Environ.Microbiol.81:2506-2514,2015中开发的方法。首先，所述宿主菌株用质粒pCas进行转化，用于Cas9和γ-red重组酶表达的载体。所得的菌株在30℃下用L-阿拉伯糖进行生长，以诱导γ-red重组酶的表达，当OD达到约0.6时，感受态细胞是经由表达靶向目标基因的插入位点和模板的sgRNA和N20间隔区的pTargetF(AddGene 62226)进行制备并转化。所述模板是与插入位点的上游和下游同源的～500bp序列的缺失基因，通过使用Phusion聚合酶重叠PCR构建或由GenScript(Piscataway,NJ)合成。切换pTargetF质的N20间隔区的方法是反向PCR，使用Phusion聚合酶将修饰后的N20序列悬挂在引物的5端，随后使用T4 DNA连接酶和T4多核苷酸激酶(NewEngland Biolabs,Ipswich,MA,USA)进行自连接。在补充有壮观霉素和卡那霉素(或其他合适的抗生素)的固体培养基(LB+琼脂)上在30℃下生长的转化体被分离，并通过PCR筛选染色体基因插入物。通过使用Phusion聚合酶PCR从基因组DNA中扩增的基因插入序列，其是通过DNA测序进一步确认。然后pTargetF可以通过IPTG诱导而固化，并且pCas可以在37-42℃等更高温度下生长来固化。
所得的甘氨酸营养缺陷型菌株是用组成型表达来自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(MtAld)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(BsAld)的丙氨酸脱氢酶的载体转化得到的。当菌株接种在含有5g/L葡萄糖的最小培养基(M9)中时，它们在没有甘氨酸补充的情况下就无法生长，表现出甘氨酸营养缺陷型。在这两个候选者中，携带BsAld的菌株开始在乙醇酸而不是甘氨酸补充的情况下生长(参见图28B)，这表明乙醇酸已通过天然glcD和异源表达的BsAld基因成功转化为甘氨酸。它还表明，仅补充少量的50mg/L的乙醇酸就足以看到生长，这表明了从C1化合物生产乙醇酸的基于选择HACS、ACR、ACT和ACK-PTA变体筛选的合适平台。
本发明描述的一些实施例和实施方案的序列信息如下：
>JGI15 HAK63664.1:
MAKSEGKVNGATLMARALQQQGVQYMFGIVGFPVIPIAIAAQREGITYIGMRNEQSASYAAQAASYLTGRPQACLVVSGPGVVHALAGLANAQVNCWPMLLIGGASAIEQNGMGAFQEERQVLLASPLCKYAHQVERPERIPYYVEQAVRSALFGRPGAAYLDMPDDVILGEVEEAAVRPAATVGEPPRSLAPQENIEAALDALQSAKRPLVIVGKGMAWSRAENEVRQFIERTRLPFLATPMGKGVMPDDHPLSVGGARSHALQEADLVFLLGARFNWILHFGLPPRYSKDVRVIQLDLSAEEIGNNRQAEVALVGDGKAIVGQLNQALSSRQWFYPAETPWREAIAAKIAGNQAAVAPMIADNTSPMNYYRVYRDIAARLPRNAIIVGEGANTMDIGRTQMPNFEPRSRLDAGSYGTMGIGLGFAVAAAAVHPGRPVIAVQGDSAFGFSGMEFETAARYGMPIKVIILNNGGIGMGSPAPRDGQPGMPHALSHDARYERIAEAFGGAGFYVTDSAELGPALDAAMAFKGPAIVNIKIAATADRKPQQFNWHG
>JGI19 OGA51379.1:
MAEINGAALIAKCLKQQGVKELFGVVGIPVTGIANAAQKEGIRYIGTRHEQAAGFAAQAVSYLRGHVGVALTVSGPGMTNAITALGNAWANCWPMLLLGGSTDLAFAHRGGFQVAPQMEAARPFCKWVAQPARVEDIPHLIEMGVRTAWYGRPGPVYIDLPADIIEAMVDEASLTYPGPVSPPIRMAAPPELVAEAVQTLRSARKPLLIVGKGAAWSDAATEVRRIVDSTNIPVLPTPMGKGVVPDDHPSIVSAARSYALKNADLIVLAGARLNWILHFGMPPRFNPETRVIQIDLAQEEIGNNLPATVGLTGDLKAILAQMVAQLEETPWKCDDRGAWKAGLAAEVAKKKTELKPALVSDEVPMGYFRPLQEIQKVLPRDAIIVSEGASTMDISRSVLENYQPRNRLDAGSWGTMGGATGFALASAVVHPERRVIALMGDASFGFSGMEVEVAARHRLPITWIVFTNGGIVSGVANLPKDGPLPVNVFQPGARYEKIMEAFGGKGFYCETPDQLARALRTAFDSGETALINVAIAPTAKKAPQTYSHWSSR
>JGI20 PWB41796.1:
MGQITGAQIVARALKQQGVEYMFGIVGIPVIPIAMFAQREGIKFYGFRNEQSASYAAAAVGYLTGRPGVCLGVSGPGMIHGVAGMANAWSNCWPMILIGGANDSYQNGQGAFQEAPQIEAARPFAKYCARPDSLARLPFYVEQAVRTSIYGRPGAVYLDLPGDIITGAMEEEDVHFPPRCPDAPRMMAPQESIDAAMAALKSAERPLVIVGKGAAYSRAENEVREFLETTQLPYLASPMGKGVMPDDHPLSIAPARSAALLGADVILLMGARLNWMMHFGHPPRFDPKVRVIQMDISAEEIGTNVPTEVALVGDAKAITTQLNASLKQQPWQYPSETTWWTGLRKKIDENGATVAEMMADESVPMSYYRVYREIRDLIPNDAIIQNEGASTMDIGRTLMPNFLPRHRLDAGSFGTMGVGLGQAIAAAAVHPDKHVFCIEGDSAFGFSGMEVETAARYGMKNITFIIINNNGIGGGPDTLDPTRVPPSAYTPNAHYEKMAEIYGGKGYFVTEPSQLRPALEEAIKADKPAIVNIMISATSQRKPQQFAWLTR
>JGI23 OWB57166.1:
MTTIDGSEVIAESLARLGVKTVFGIVGIPVVEVADALINKGIKFIGFRNEQAASYAASVYGYLTQQPGVLLVVGGPGLVHALAGIYNSQSNKWPLLVLAGSSSSSEIYRGGFQELDQVSLMTSTFAKFSAKPPSISRVPELITKAFRLSISGKPGPTYIDLPADIIQSKIDSTDGVKYLQSVIPYTIEDIPKSVAPVNKLRQAVELIKSAQYPLLVVGKGASNCPRAVRNFVAEHMIPFLPTPMGKGVVPDSSEFNVSSARSDALRHADVIILAGARLNWMLHHGDFPKFKKNVKFIQIDLDSDEFGDNSNDSLKYGLYGDIGLTIESLNIALGKEHLVNSMLPVIETAKLKNIKKLELKGSVTPEQSESLMNHNQALTIITDSLGLKYDDTVFVSEGANTMDISRVVIPINYPKQRLDAGTNATMGVGLGYAIAAKAASPEKLVIAIEGDSAFGFSAMEIETAIRSDLPLFIIVLNNSGIYRGVSDVEKYAPFTNKPLPSTALSYKTRYDELGNSLGAVGMLVNNANELKLKMKECLDLYFNENKTIVLNVLIQSGAGTKLEFGWQNKPKSKL
>JGI24 KXN72624.1:
MSQEQLTGSSILAKSLKSLGVDVIFGIVGVPVVEVAEACIAEGIRFIGCRNEQSASFAAGAWGYLNKRPGVCLTVSGPGVVNAISGLYNAQANCWPMILIGGSCETNQIGMGAFQELDQVDACRNYTKFSGKCADLETIPFIVNKAYQVSKAGRPGPTYVDLPADLIQATTSKLPKLPEPFETPYCLPHTKDLSAAIEILKNSKRPLLVVGKGATYSRCENELKALVEEFNVPFLPTPMAKGILPDNHSLNAGSARSLALRKADVIVLLGARLNWMMQFGNRLNPQTKIIHVDISPEEFNINKKIDIGLFGNIPETIELIHQGLKKSGKSYSWIHFKNELQPNIEKNQEKLQKFLTAPLSPLMNHQQALNTVEEVLSKQFNGDYFLVSEGARTMDVTRMLVSSHLPRRRLDAGTLGVMGIGLGYALAGQLTHPDKKVVAIMGDSAFGFSAMEIETAARCKLPLIIIIINNNGIYHGLDDIKSVPSDKLPSFTLMPETRYDLLANSVYGQGFLVKDSTQLQSALQKCFNFDGVSIVNVMIDHRPASEGLYWLTREFSPAGQSKL
>JGIH65 PKN81274.1:
MPEGPVAEIDGQTIIARALKQQGVEAMFGVVGIPVTGIAAAAQREGIKYVGMRHEMPATYAAQAVSYLGGRLGTALAVSGPGVLNAVAAFANAWSNRWPMILIGGSYEQTGHLMGFFQEADQLSALKPYAKYAERVERLERIPIYVAEAVKKALHGVPGPAYLELPGDIITAKIDESKVEWAPRVPDPKRTLSDPADVEAAIAALKTAQQPLIIVGKGVAASRAEVEIRAFVEKTGIPYLAMPMAKGLIPDDHDQSAAAARSFVLQNADLIFLVGARLNWMLHFGLPPRFRPDVRVVQLDFNPEEIGINVPTEVGMIGDAKATLSQLLDVLDRDGWRFPDDSEWVTAVSAEARQNAEAVQAMMQEDTQPLGYYRALRSIDERLPKDAIFVAEGASTMDISRTVINQYLPRTRLDAGSFGSMGLGHGFAIGAATQFPGKRVICLQGDGAFGFAGTECEVAVRYNLPITWIVFNNGGIGGHRAELFERDQKPVGGMSLGARYDILMQGLGGAAFNATNSDELDAAIEAALKIDGPSLINVPLDPDAKRKPQKFGWLTRTNE
>JGIH25 PFG74273.1:
MAELTGAQIVAKALKQQGVEYMFGVVGIPVVPIAVHAQREGIKFFGFRNEQAASYAAAAIGYLTGRPGVCLAVSGPGMVHGIAGMANAWANCWPMILIGGANDSYQNGQGAFQEAPQIETARPYAKYAARPDSTRRIPFFVEQAVRATIYGRPGAAYLDLPGDLITGSVDESEVHFPPRCPDPPRTLAPWENIERALEALKSAERPLVIVGKGAAYARAEEEVRKFIDATQLPFLPTPMGKGVVPDDHPLAISPARSFALQNADVVLLLGARLNWILHFGLPPRFDPKVRVIQVDIAAEEIGNNVPAEVALVGDAKAIVGQMNEALTRAPWQYPAETTWWTGLRKKIEENAATVAEMMADESVPMGYYRVYRDIREYIPRDAIIVNEGANTMDIGRTLMPNFYPRHRLDAGSFGTMGVGVGQAIAAAAVHPDKRVFCIEGDSAFGFSGMEVETAARYGLNNIVFIIINNNGIGGGPDELDPTRVPPSAYTPNAHYEKMAEIYGGKGFFVTQPSELRPALEAALACDKPAIVNIMISARSQRKPQQFAWLTR
>JGIH26WP_158065972.1:
MAELTGAQIVAKALKQQGVEYMFGVVGIPVVPIAVHAQREGIKFFGFRNEQAASYAAAAIGYLTGRPGVCLAVSGPGMVHGIAGMANAWANCWPMILIGGANDSYQNGQGAFQEAPQIETARPYAKYAARPDSTRRIPFFVEQAVRATIYGRPGAAYLDLPGDLITGTVDESEVHFPPRCPDPPRTLAPWENIERALDALKSAERPLVIVGKGAAYARAEEEVRTFIDMTQLPFLPTPMGKGVVPDDHPLAISPARSFALQNADVVLLLGARLNWILHFGLPPRFDPKVRVIQVDIAAEEIGNNVPAEVALVGDAKAIVEQMNEALSRAPWQYPAETTWWTGLRKKIEENAATVAEMMADESVPMGYYRVYRDIREYIPRDAIIVNEGASTMDIGRTLMPNFFPRHRLDAGSFGTMGVGLGQAIAAAAVHPDKRVFCIEGDSAFGFSGMEVETAARYGLNNIVFIIINNNGIGGGPDELDPTRVPPSAYTPNAHYEKMAEIYGGKGFFVTQPSELRPALEAALACDKPAIVNIMISARSQRKPQQFAWLTR
>JGIH30 HEM18354.1:
MTTLDGATLIARSLRQQGVDYMFGIVGIPVVPVAIAFQREGGKFFGMRNEQAASYAAGAVGYLTGRPGACLAVSGPGMVHAIAGLANAWANGWPMILLGGANDSYQNGQGAFQEAPQIEAARPFAKYCARPDSTRRIPFFIEQAVRYSIYGRPGPVYVDLPGDIITGTAEESEVRFPPRCPDPPRALAPEENVRAALELLKQAERPLVIVGKGMAYARAEDEVREFIDRTRLPYLPTPMGKGVIPDDHPFSVAPARSFALQNADVVFLMGARLNWILHFGLPPRFAPTVKTIQLDIEPEEIGNNVPCTVPLVGDGKAIVGQLNAVLRGEPWEYPSETTWWTALRQKAAENEEMVRQMEQDDSVPMGYYRVLREVRELLPKDAIVASEGANTMDISRTVIPNYFPRHRLDAGTFGTMGVGLAQAIAAQVVHPDKKVVAIEGDSAFGFSGMEVEVMARYRLPITVIIVNNNGISGGPTQLDPNRVPPNAYLPNAHYEKIAEAFGGKGWFVTTPQELRPALEAALNSDTFSIVNIMIDTRAGRKPQQFAWLTR
>JGIH41 MBI2761137.1:
MATINGATLLARSLKQQGVEYMFGIVGFPVQPIAGAAQREGITFIGMRNEQAASYAAHAAGYLTGRPQACLVVSGPGVVHALAGLANAQSNCWPMILIGGASPTYQNGMGAFQEAPQVKLAEPYCKYAHAVEQVDRIPYYVEQAVRSSIYGRPGATYLDMPDDIIRAEIEEEKVEAKNTVPPPPRTQALDEDVESAVAALKSAERPLVIVGKGMAWSRAENEVREFIERSQLPFLATPMGKGVMPDDHPLSVGAARSFVLQNADVVFLLGARLNWILHYGLPPRYSPNVRVVQLDIAPEEIGANVPAEVGLVGDGKAVMRQVNRVLESSPWQYPSETTWRSGIANKIAENRVSTEAMMADDSSPMNYYHVLSTIRDMIPRDTIIASEGANTMDIGRTILNNYEPRTRLDAGTFGTMGVGLGFAIAASVTNPTKRIIDVEGDSAFGFSGMEVETACRHKMPITFIIINNNGIGGGPTEFDTSKPLPPNAYTPSAHYEKMMDAFGGKGYFVTESSELKPALEAALNTDGPSLVNIMISNRATRKPQEFRWLTT
>JGIH61 MBT5774752.1:
MTDTTPATADTTNGAAAGETILGGVLLVRSLKQQGVDYMFGVVGFPVSELAGYAQDEGIKYIGMRNEQAASYAAQAASYILGRPQACIVVSGPGVIHGLAGLANAKSNCWPMILIGGASAVSQNGMGAFQEENQVEIARLVSKYAHSLDRVDRIPYYVEQAVRTSLYGRPGPAYLDAPDDILTAEIPLSQIKTVPTVPDPPRPGVPERDIKAAVAALKSAERPLVIVGKGMAWSRAENEVLEFIEKTQIPFLPTPMGKGVVDDDHPLAISPARTLALREADVVLLLGARLNWILHFGKPPRWAEDVRIIQVDIAAEEIGANVPAEVGLVGDGAAIVAQLNQALDEDGWQYPGETTWRSALKAKVDENVAVSAQLMADDSVPMNYYHPLQAIRDTLPEDTIIVSEGAGTMDIGRTVLPNHGPRTRLDAGTYGTMGIGLGFAIGAAIAKPGTRIVDVEGDAAFGFSGMEYETMVRHNLPITIVVINNNGIGGGVAELPEDRDPPPGVYLPSARYERIADMFGGRSYYVTQPEELEPALREANTGEGPAIVHIRIDPSAGRKPQQFGWHTPTN
>JGIR2 WP_185879480.1:
MDKDLLSVQQVRDLVKACKAAQKKYVEFSQEKMDKIVHEMSMEVRQYDEKLAKLAVEETGFGKWEDKVIKNRFASTYIYDFIKNMKTVGILREENEVMEVGVPVGVIAGLIPSTNPTSTTIYKILISLKAGNGIVISPHPNAKNCIIETANILKRAAIKAGAPEGLIGVIEIPTIQATDALMKHDDVSLILATGGEAMVRAAYSSGTPAIGVGPGNGPAFIERSANVKMAVKRIMQSKTFDNGTICASEQSIIAEACNRTEIMKEVENQGGYFMPREDADKLARFILRPNGTMNPAIVGKSAEVIANLAGIKIPLGTRVLLSEETTVSNSNPYSSEKLAPILAFYVEDNWEKACERSIEILNHEGRGHTMIIHSEDREVIREFALKKPVSRLLVNTPGSLGGIGATTNLAPALTLGCGAVGGSSTSDNITPMNLINIRRVAWGVRELDYFRTENVEQTNVDSKDMEELIKKVLNEILNR
>JGIR5 WP_087641473.1:
MTTLDKDLASIQEVRNLLTEAKAAQESLAKMSQEQIDRICEAIAASAYEAREKLAKMAHQETGFGIWQDKVVKNSFASKFVWDSIKEMKTVGILNEDKEQKVIDVAVPVGVVAGLIPSTNPTSTVIYKALIAIKAGNAIVFSPHPNALQAILATVEIISKAAEKAGCPKGAIGCMLKPTMQGTAELMKHQYTSLILATGGSAMVKAAYSSGTPAIGVGPGNGPAYIEKSADIPLAVKRIMDSKTFDNGTICASEQSIIAETSNKAEVIAELKKQGAYFLSPEESAQLERYIMRPNGSMNPQIVGKSVQAIAELTHLSVPKEARVLIAEETKVGHKVPYSREKLAPILAFYTVGNWEEACELAMDILYHEGAGHTMMIHSQNDEVIRQFGLKKPVSRVLVNTPGALGGIGATTNLAPALTLGCGAVGGSSTSDNISPANLFNVRRIAYGIRELEDLREQPVSSSGFNEEQLVDTLVERILAKLQ
>JGIR10 WP_202656015.1:
MTLLDKDLRSIQEARELIGKAKAAQSQLALLSQEQIDRIVKAIAEAGYDNREELAKIAAVETGFGKWEDKVLKNAFASQAVYESLKDLKTIGILKEDMQQKVMEIGVPLGVIAALIPSTNPTSTTIYKAMISLKAGNAIIFSPHPNAINCILETVRVIKEAAVKAGCPSDAISCMSIPAIEGTETLMKHKDVSLILATGGSAMVKAAYSSGTPAIGVGPGNGPAFIERTANIPLAVKRIFDSKTFDNGVICASEQSIVVEECIREEVIEECSKQGGYFLSERERKQLEKFIMRSNGTMNPAIVGKSVEQIAKLAELNIPDGTRVLIAKESRVGRDVPYSREKLAPILAFYTEKDWQAACERCIQLLLNEGAGHTLIIHSENEEVIKQFALKKPVSRLLVNTPGALGGIGATTNLVPALTLGCGAVGGTSTSDNIGPLNLINIRRVAYGVKELEDLRENTPTCEPSFGVCDQKELIESIVKQVLAQLH
>JGIR13 MBN6206692.1:
MMEMDKDLQSIHEARTLIGQAKEAQRQLAKLGQEDIDHIVKAMAEAAYEHRERLAKLAVEDTGFGIVKDKVLKNLFASYGVYRAIKDMKTVGIINEDEQEKIVEVAVPVGVIAALVPSTNPTSTVMNKALIAIKAGNAVVFSPHPSALNCILETTRILAEAAEAAGCPKGAITSMTKPTMQGTDTLMKHRDVSLILATGGSAMVKAAYSSGTPAIGVGPGNGPAFIERSANVKQAVKRIIDSKTFDNGVICASEQSVIVEADHKEVVVEEFKRQHAYFLSKEEAAKLEKFIMRPNGTMNPQIVGKSALFLADLAGISVPSNTRVLIAEEDKVGKDVPFSREKLSPILAFYIEKDWRAALDRSIEILLNEGAGHTMTVHSEKEEIIRAFTLEVPVFRLLVNTSATLGAIGATTNLLPAYTLGCGALGNGSTSDNVGPMNLLNIKRVAIGIKDLAEIESESNNTKLSSAELNEDMVERVVEQVLRQLYVMS
>JGIR14 WP_051217603.1:
MEMLDKDLRSIQEVRDLIKKAKEAQAKLAVMTQAQIDAIVKAIADAGYAHREKLAKMANEETGFGRWEDKIVKNAFASKHVYESIKDMKTVGIINDDKAHKVMDVAVPVGVVAGLIPSTNPTSTVIYKALISLKAGNSIVFSPHPNALKSILETVKVINDAAVQAGCPEGAIASMTVPTIQGTDQLMKHKDTSVILATGGEAMVKAAYSSGTPAIGVGPGNGPAFIEKSANFELAVKRILDSKTFDNGTICASEQSVIVEACSKEAVMAEFKKQGAYFLTAEEAVQLGKFIMRANGTMNPQIVGRSVDHIAKLANLNVPAGTRVLIAEETSVGRNVPYSREKLAPILAFYTEDNWEAACARSIEILNGEGAGHTMMIHSENEEIIRQFALKQPVSRLLVNTPGALGGIGATTAIAPALTLGCGAVGGSSTSDNVSPMNLLNIRKLTYGLRELEDLVEQPTTQAAPAAATISQDDKEQLISMIVARILEKM
>JGIRT45 2G39_1:
MYRDRVRLPSLLDKVMSAAEAADLIQDGMTVGMSGFTRAGEAKAVPQALAMRAKERPLRISLMTGASLGNDLDKQLTEAGVLARRMPFQVDSTLRKAINAGEVMFIDQHLSETVEQLRNHQLKLPDIAVIEAAAITEQGHIVPTTSVGNSASFAIFAKQVIVEINLAHSTNLEGLHDIYIPTYRPTRTPIPLTRVDDRIGSTAIPIPPEKIVAIVINDQPDSPSTVLPPDGETQAIANHLIDFFKREVDAGRMSNSLGPLQAGIGSIANAVMCGLIESPFENLTMYSEVLQDSTFDLIDAGKLRFASGSSITLSPRRNADVFGNLERYKDKLVLRPQEISNHPEVVRRLGIIGINTALEFDIYGNVNSTHVGGTKMMNGIGGSGDFARNAHLAIFVTKSIAKGGNISSVVPMVSHVDHTEHDVDILVTEQGLADLRGLAPRERARVIIENCVHPSYQAPLLDYFEAACAKGGHTPHLLREALAWHLNLEERGHMLAG
>JGIRT51 SJZ60628.1:
MSTSDVLNPEEVALVLREKVSPILRGHGGDLVLSHIRGKSIYIRFTGACRGCPAALETAERTVQAVLREHFGDEDIDAVLDNGVSEDLINQAKQILQKSKKIMNEILAQYKSKIVSADDAVKVIKNGERVSLSHAAGVPQVCVDALVRNAEHFQGVEIYHMLCLGEGKYMLPEMAPHFRHVTNFVGGNSRQAVAENRADFIPAFFYEVPTLFRKGILPIDVAIVQLSMPDAEGYCSFGVSSDYTKPSTEVARVVIGEINAQTPYVHGDNKIHISKLDYIVLADYPLYTIPKAPIGPVEEAIGRNCAELVEDGSTLQLGIGAIPDAALLFLKDKKDLGIHTEMFADGVIELVRAGVITGKKKSLHPGKMVATFLMGTEEVYKFAHNNPDVELYPVDYVNDPRTVAMNDNMVSINSCIEVDLMGQVVSETIGPKQFSGTGGQVDYVRGATWSKNGKSIMAMPSTARKGAASRIVPMIAEGASVTTLRNDVDYVVTEYGIARLKGRSLRQRAEALISIAHPDFREELMKVYRERFE
JGIK1
>JGIK1-ACK AKJ38693.1:
MNWGLNMKVLVINAGSSSLKYQLIDMINESPLAVGLCERVGIDNSIITQKRFDGKKLEKQVDLPTHRVALEEVVKALTDPEFGVITDMGEINAVGHRVVHGGEKFTTSALFDAGVEEAIRDCFDLAPLHNPPNMMGITACAEIMPGTPMVIVFDTAFHQTMPAYAYMYALPYDLYEKYGVRKYGFHGTSHKYVAGRAALMLGKPIEDTKIITCHLGNGSSIAAVKGGKSIDTSMGFTPLEGVAMGTRCGSIDPAVVPFIMDKEGLSSREIDTLMNKKSGVLGVSGISNDFRDLDEAASHGNERAELALEIFAYSVKRVIGEYLAVLNGADAIVFTAGIGENSASIRKRILAGLDGLGIKIDEEKNKIRGQEIDISTPDSSVRVFVIPTNEELAIARETKEIVETEAKLRSSVPV
>JGIK-PTA AKJ38694.1:
MVTFLEKISERAKKLNKTIALPETDDIRTLQAAAKAIERGVANIVLIGDEAKIKELAGDLDLSKAKIVNPETYEKKDEYIQAFYELRKHKGITLESAAEVMKDYVYFAVMAAKLDEVDGVVSGAVHSSSDTLRPAVQIVKTAPGAALASAFFIIAVPDCEYGSDGTFLFADSGMVEMPSVEDVANIAVISAKTFELLVQDDPYVAMLSYSTKGSAHSKLTEATIASTKLAQELAPDIPIDGELQVDAAIVPKVAASKAPGSPVAGKANVFIFPDLNAGNIAYKIAQRLAKAEAYGPITQGLAKPINDLSRGCSDEDIVGAIAITCVQAAAQDK
JGIK8
>JGIK8-ACK HIX51076.1:
MKILVVNAGSSSLKYQLFDMDTESVIVKGGVERIGIRGSVLHHKWAQGEKVIEQDMPNHKVAMQAVLDALVHPEYGAIHSMSEIDAVGHRVLHSGGDFDGSVLLDDEVLKICKKNAELGPLHMPANILGIEACREVMPHTPMALVFDTAFHATMPPHAYMYAVDYDDYKNYKVRKYGFHGTSHKYVSQEAIKYLGRGAAGTKIITAHLGGGSSLSAVMDGKCVDTSMGFTPLAGVPMGTRSGDIDPAVLEFLAAKKGYTVLDCINYLNKQCGVAGISGISSDFRDLTKAAAEGNERAQLALDMFAYAVKKYIGSYIAAMDGLDCLVFTAGIGENTWQVREMICDKMDCFGIALDAEKNRLKNDGAIHDITGEGSKVKVLVIPTNEELVIARETKELVEA
>JGIK8-PTA HIX51075.1:
MADFFNKVKDKMSAVKDKLGEMIEKEEDTFLYRIKKRASELNKRIVLCEGEDSRVVKAASVAAKQGVAKIVLLGNAEQIAKDNPDIDLSAVEIVDPAASEKRAEYAALLYQLRQAKGMTQEEAEKLSYDNTYFGVLMVKAGDADGLVSGACHSTANTLRPGLQIVKAAPGVPLVSSCFFMVAPPAGNQYCEDGVFIYSDCGLNENPNSEQLAEIAIISAKTAEKIAGLEPRVAMLSFSTKGSAKHADIDKVTAAYRIAKEKAPDLALDGELQLDSAIVPAVAKSKAPGSKVAGHANVLIFPDLDAGNIGYKLTERLGGFMAVGPVCQGFAKPINDLSRGCKWEDIVATIAITALQTQM
JGIK31
>JGIK31-ACKWP_022744670.1:
MKILVINCGSSSLKYQLINMEDKGVLAQGLVERIGISGSILTQKVDGRDKYVIESPLKDHQEAIDLVLRTLVDDNQGVIKSMEEISAVGHRVVHGGEKYATSVVVTEEVIKNLEDFIKLAPLHNPPNIIGIRACQALMPNTPMVAVFDTAFHQTMPEKAFMYPLPYELYKEDHIRRYGFHGTSHKYVAGEVAKWMKKDIKDIKTITCHLGNGVSVTAVNGGQSIDTTMGFTPLDGIIMGSRSGSIDPAIVTYLVKEKGYSIDEVNEILNKKSGVLGISGLGTDFRDIRAAVEERNDKRALLTMDIYGYQIKKQIGAYAAAMAGVDAIVFTAGIGEHAPEIRVRALTDMEFLGIELDVDKNDNQNIGDGMEISKPSSKVKVFVIPTNEELMIAEETLELIQK
>JGIK31-PTA WP_022744669.1:
MNLMQKIWDAAKSDKKKIVLPEGNEERTIVAAEKINRLGLAHPILIGNKEEIINKGHALDVDLSQVEIIDPAESENLEKYITAFYELRKNKGITLEKAEKIVKDPLYFATMMVKLDDADGMVSGAVHTTGDLLRPGLQIIKTAPGVSVVSSFFIMEVPNSSYGEDGLLLFADCAVNPMPNEDQLAAIAIATAETAKRLCNMDPKVAMLSFSTKGSADHEVVDKVRNATKKANELRPDLDIDGELQLDASIVEKVANQKAPGSKVAGKANVLVFPDLQAGNIGYKLVQRFANAKAIGPVCQGFAKPINDLSRGCSSDDIIDVVALTAVQAQNIK
Claims (34)
1.一种重组2-羟基酰基-CoA合成酶，与红螺旋杆菌URHD0017的2-羟基酰基-CoA合成酶相比，其通过含羰基化合物和甲酰基-CoA酶促形成2-羟基酰基-CoA的速率能够高至少2倍、或者3倍以上。
2.根据权利要求1所述的酶，其中所述的含羰基化合物选自由醛和酮组成的组中。
3.根据权利要求1所述的酶，其中所述的2-羟基酰基-CoA合成酶选自表1或表2。
4.根据权利要求3所述的酶，其中所述的2-羟基酰基-CoA合成酶与表1或表2中的酶具有90％或更高的同一性。
5.根据权利要求1到4中任意一项所述的酶，进一步包括通过使一碳底物与酶催化剂接触来生产甲酰基-CoA。
6.根据权利要求1到4中任意一项所述的酶，进一步包括通过使底物与酶催化剂接触以将底物转化为含羰基化合物。
7.根据权利要求1到4中任意一项所述的酶，进一步包括将2-羟基酰基-CoA转化为一种有机化学产物。
8.根据权利要求1到4中任意一项所述的酶，其中所述的含羰基化合物是具有至少一个取代基的醛。
9.根据权利要求8所述的酶，其中所述的醛的取代基是羟基。
10.根据权利要求8所述的酶，其中所述的醛的取代基是羰基。
11.根据权利要求8所述的酶，其中所述的醛的取代基是羧基。
12.根据权利要求8所述的酶，其中所述的醛的取代基是烷基。
13.根据权利要求8所述的酶，其中所述的醛的取代基是烯基。
14.根据权利要求8所述的酶，其中所述的醛的取代基是炔基。
15.根据权利要求8所述的酶，其中所述的醛的取代基是胺。
16.根据权利要求1到4中任意一项所述的酶，其中所述的含羰基化合物是一种酮。
17.根据权利要求16所述的酶，其中所述的酮是甲基酮。
18.根据权利要求5所述的酶，其中所述的一碳底物是甲醛，并且产生甲酰基-CoA的所述酶催化剂是：
a.一种酰基-CoA还原酶(酰化醛脱氢酶)，其催化甲醛转化为甲酰基-CoA。
19.根据权利要求5所述的酶，其中所述的一碳底物是甲醇，并且产生甲酰基-CoA的所述酶催化剂是：
a.一种甲醇脱氢酶，其催化甲醇转化为甲醛；以及
b.一种酰基-CoA还原酶(酰化醛脱氢酶)，其催化甲醛转化为甲酰基-CoA。
20.根据权利要求5所述的酶，其中所述的一种碳底物是甲烷，并且产生甲酰基-CoA的所述酶催化剂是：
a.一种甲烷单加氧酶，其催化甲烷转化为甲醇；
b.一种甲醇脱氢酶，其催化甲醇转化为甲醛；以及
c.一种酰基-CoA还原酶(酰化醛脱氢酶)，其催化甲醛转化为甲酰基-CoA。
21.根据权利要求5所述的酶，其中所述的一种碳底物是甲酸，并且产生甲酰基-CoA的所述酶催化剂是：
a.一种酰基-CoA合成酶，其催化甲酸转化为甲酰基-CoA；或者
b.一种催化甲酸转化为甲酰基-磷酸的甲酸激酶，以及一种催化甲酰基-磷酸转化为甲酰基-CoA的磷酸甲酰基-转移酶。
22.根据权利要求5所述的酶，其中所述的一种碳底物是二氧化碳，并且产生甲酰基-CoA的所述酶催化剂是：
a.一种二氧化碳还原酶，其催化二氧化碳转化为甲酸；以及
b.一种酰基-CoA合成酶，其催化甲酸转化为甲酰基-CoA；或者
c.一种催化甲酸转化为甲酰基-磷酸的甲酸激酶，以及一种催化甲酰基-磷酸转化为甲酰基-CoA的磷酸甲酰基-转移酶。
23.根据权利要求7-8所述的酶，其中所述的衍生自2-羟基酰基-CoA的产物是醛，并且其中催化2-羟基酰基-CoA转化为所述产物的酶催化剂是：
a.一种酰基-CoA还原酶，其催化2-羟基酰基-CoA转化为醛。
24.根据权利要求7-8所述的酶，其中所述的衍生自2-羟基酰基-CoA的产物是醇，并且其中催化2-羟基酰基-CoA转化为所述产物的酶催化剂是：
a.一种酰基-CoA还原酶，其催化2-羟基酰基-CoA转化为醛；以及
b.一种醇脱氢酶(醛还原酶)，其催化醛转化为醇。
25.根据权利要求7-8所述的酶，其中所述的衍生自2-羟基酰基-CoA的产物是羧酸，并且其中催化2-羟基酰基-CoA转化为所述产物的酶催化剂是：
a.一种硫酯酶，其催化2-羟基酰基-CoA转化为羧酸。
26.根据权利要求1到7其中任一项所述的酶，其中所述的酶催化剂包含在携带用于表达每种酶的基因的重组微生物中。
27.根据权利要求26所述的酶，其中所述的底物与重组微生物接触，所述重组微生物包含在任选含有缓冲剂、盐、维生素、矿物质的水性介质中的酶催化剂。
28.根据权利要求1到7其中任一项所述的酶，其中通过将每种添加到任选含有缓冲剂、盐、维生素、矿物质和辅因子的水性反应混合物中，所述的底物与酶催化剂进行接触。
29.根据权利要求28所述的酶，其中所述的酶催化剂以粗细胞提取物的方式提供。
30.根据权利要求28所述的酶，其中所述的酶催化剂以纯化的蛋白质的方式提供。
31.一种修饰的生物体，其包含权利要求1-30中任一项所述的至少一种异源酶，其中所述的生物体能够在一碳底物上生长，并且其中所述的不含异源酶的生物体不能在一碳底物上生长。
32.根据权利要求31所述的修饰的生物体，其中所述的修饰的生物体是细菌。
33.根据权利要求31或者32所述的修饰的生物体，其中所述的细菌是大肠杆菌。
34.根据权利要求31至33中任一项所述的修饰的生物体，其中所述的生物体包含两种或更多种修饰的酶。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US202163233589P | 2021-08-16 | 2021-08-16 | |
| US63/233,589 | 2021-08-16 | ||
| PCT/US2022/040516 WO2023023097A2 (en) | 2021-08-16 | 2022-08-16 | Orthogonal metabolic framework for one-carbon utilization |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118139983A true CN118139983A (zh) | 2024-06-04 |
Family
ID=85239725
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202280068341.5A Pending CN118139983A (zh) | 2021-08-16 | 2022-08-16 | 用于一碳利用的正交代谢框架 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP4388104A2 (zh) |
| JP (1) | JP2024534042A (zh) |
| CN (1) | CN118139983A (zh) |
| WO (1) | WO2023023097A2 (zh) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3980534A4 (en) * | 2019-06-04 | 2023-08-30 | Ramon Gonzalez | PRODUCTION OF 2-HYDROXYACYL-COA MOLECULES AND THEIR DERIVATIVES |
-
2022
- 2022-08-16 JP JP2024509068A patent/JP2024534042A/ja active Pending
- 2022-08-16 WO PCT/US2022/040516 patent/WO2023023097A2/en active Application Filing
- 2022-08-16 EP EP22859068.3A patent/EP4388104A2/en active Pending
- 2022-08-16 CN CN202280068341.5A patent/CN118139983A/zh active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP4388104A2 (en) | 2024-06-26 |
| WO2023023097A3 (en) | 2023-06-08 |
| WO2023023097A2 (en) | 2023-02-23 |
| JP2024534042A (ja) | 2024-09-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3377612B1 (en) | Functional expression of monooxygenases and methods of use | |
| US20200255840A1 (en) | High yield route for the production of 1, 6-hexanediol | |
| JP2022023169A (ja) | １，４－ブタンジオールおよびその前駆体の生合成のための組成物および方法 | |
| US20200325499A1 (en) | Methods And Microorganisms For The Production Of 1,3-Butanediol | |
| Drejer et al. | Methanol-based acetoin production by genetically engineered Bacillus methanolicus | |
| Chang et al. | Enhanced 3-hydroxypropionic acid production from acetate via the malonyl-CoA pathway in Corynebacterium glutamicum | |
| Liang et al. | Production of 3-hydroxypropionate using a novel malonyl-CoA-mediated biosynthetic pathway in genetically engineered E. coli strain | |
| JP2017534268A (ja) | 有用産物の生産のための改変微生物および方法 | |
| Singh et al. | Developing methylotrophic microbial platforms for a methanol-based bioindustry | |
| US20140134690A1 (en) | Microbes and methods for producing 1-propanol | |
| US20240229047A1 (en) | Carboxylic acid platform for fuel and chemical production at high carbon and energy efficiency | |
| WO2018203076A1 (en) | Modified microorganisms and methods for production of branched c5 carbon compounds | |
| JP2023541809A (ja) | 一炭素基質での合成的増殖 | |
| CN118139983A (zh) | 用于一碳利用的正交代谢框架 | |
| US10184138B2 (en) | Bacteria engineered for conversion of ethylene to ethanol | |
| US12104160B2 (en) | Production of 4,6-dihydroxy-2-oxo-hexanoic acid | |
| US8715973B1 (en) | Organic acid-tolerant microorganisms and uses thereof for producing organic acids | |
| Chang et al. | Enhanced 3-Hydroxypropionic Acid Production From Acetate via the Malonyl-CoA Pathway in | |
| US20200048639A1 (en) | Culture modified to convert methane or methanol to 3-hydroxyproprionate | |
| Qin et al. | Using Unnatural Protein Fusions to Engineer a Coenzyme Self-Sufficiency System for D-Phenyllactic Acid | |
| WO2024133867A1 (en) | Genetically modified microorganisms for the manufacture of compounds derived from dihydroxyacetone phosphate. | |
| WO2017168161A1 (en) | Modified enzyme |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |