JP2014518613A - メタクリル酸およびメタクリレートエステルの産生のための微生物ならびにそれに関連する方法 - Google Patents

メタクリル酸およびメタクリレートエステルの産生のための微生物ならびにそれに関連する方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、メタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路を有する、天然に存在しない微生物体を提供する。上記微生物体は、メタクリル酸経路における酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含有する。本発明は、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートを生成するための方法をさらに提供する。

Description

発明の背景
本願は、２０１１年４月１日に出願された米国仮特許出願第６１／４７１，０７８号、２０１１年６月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／５７１，２３２号、２０１１年７月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／５０９，５６０号、２０１１年７月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／５１０，０５４号、および２０１１年７月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／５１２，３４８号の優先権の利益を主張し、これらの米国仮特許出願の各々の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
本発明は、一般に生合成プロセスに、より具体的にはメタクリル酸の生合成能力を有する生物体に関する。
メチルメタクリレート（ＭＭＡ）は、式ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯ２ＣＨ３を有する有機化合物である。この無色の液体は、メタクリル酸（ＭＭＡ）のメチルエステルであり、透明なプラスチックであるポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）を生成するためのモノマーである。
メチルメタクリレートの主な適用例は、ポリメチルメタクリレートアクリルプラスチックの生産である。また、メチルメタクリレートは、ＰＶＣの改質剤として使用されるコポリマーのメチルメタクリレート−ブタジエン−スチレン（ＭＢＳ）の生産にも使用される。メチルメタクリレートポリマーおよびコポリマーは、ラテックス塗料などの水性コーティングに使用される。接着剤においても使用が見出される。現代の適用例には、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）コンピュータおよびＴＶスクリーンにわたって光の広がりを均一に維持するプレートにおける使用がある。メチルメタクリレートは、心臓の冠状動脈などの解剖学的臓器の腐食成型品（ｃｏｒｒｏｓｉｏｎ ｃａｓｔ）にも使用される。
メタクリル酸、または２−メチル−２−プロペン酸は、ローマカミツレの油中に少量で天然に存在する低分子量のカルボン酸である。それは、刺激性の不快なにおいを有する腐食性の液体である。それは、温水に溶解性であり、ほとんどの有機溶媒と混和性がある。メタクリル酸は、加熱、または触媒量のＨＣｌなどの強酸での処理後に容易に重合する。得られたポリマーは、セラミックに見えるプラスチックである。メタクリル酸は、メチルメタクリレートなど、まとめてメタクリレートとして公知であるそのエステルの調製において産業上使用される。メタクリレートは、最も顕著にはポリマーの製造において多数の用途を有する。
ほとんどの商業的生産体は、アセトンシアノヒドリン（ＡＣＨ）経路を適用してメタクリル酸（ＭＡＡ）を生成し、アセトンおよびシアン化水素を原料とする。この中間体シアノヒドリンは、硫酸を用いてメタクリルアミドの硫酸エステルに転換され、その加水分解により重硫酸アンモニウムおよびＭＡＡが得られる。一部の生産体は、イソブチレン、または同等のｔｅｒｔ−ブタノールから開始し、それは酸化されてメタクロレインになり、さらに酸化されてメタクリル酸になる。次いでＭＡＡはメタノールでエステル化されてＭＭＡになる。
アセトンシアノヒドリン経路を使用する従来の生成プロセスでは、シアン化水素（ＨＣＮ）およびアセトンがアセトンシアノヒドリンに転換され、次いで酸の補助による加水分解を受け、メタノールでのエステル化によりＭＭＡが得られる。潜在的に致死性のあるＨＣＮの取り扱いが難点であるとともに、副産物の廃棄のコストが高い（ＭＭＡ１トン当たり１．２トンの重硫酸アンモニウムが形成される）ことが、よりクリーンで経済的なプロセスを目的とする非常に多くの研究の契機となった。いくつかの新たなプロセスが過去２０年間に商業化されており、さらに多くのプロセスが商業化に近づいている。イソブチレンを酸化してメタクロレインにし、次いでそれをメタノールと混合し、空気で酸化し、エステル化してＭＭＡにする、Ａｓａｈｉの「Ｄｉｒｅｃｔ Ｍｅｔｈａ」経路が、経済的なプロセスとして記載されている。
ＭＭＡポリマー以外で、この産業の他の主要な製品は、粗製メタクリル酸であり、ＭＭＡの総生産の約２０パーセントを占める。粗製ＭＡＡは処理されてブチルメタクリレートおよび／または高度に精製された粗製ＭＡＡである「氷状」ＭＡＡとなる。氷状ＭＡＡは、様々なポリマーにおけるコモノマーとして直接使用することができ、種々の少量のメタクリレートの作製にも使用される。その一方で、ＭＡＡは、メタノールでのエステル化を介してＭＭＡに転換することもできる。
したがって、メタクリル酸などの化合物を有効に生成する代替方法の必要性が存在する。本発明はこの必要性を満たし、関連する利点も提供する。
本発明は、メタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、例として、メチルメタクリレート経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路を有する、天然に存在しない微生物体（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｏｒｇａｎｉｓｍ）を提供する。この微生物体は、メタクリル酸経路中の酵素をコードする少なくとも１つの外因性の核酸を含有する。本発明は、メタクリル酸、メタクリレートエステル、例として、メチルメタクリレート、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートを生成するための方法をさらに提供する。この方法は、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートを生成する微生物体を培養する工程を含むことができ、この微生物体は、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートを生成する条件下およびそれを生成するのに十分な期間、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートを生成するのに十分な量で、メタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を発現する。
本発明はまた、天然に存在しない微生物体であって、メタクリレートエステルまたはメチルメタクリレートを生成するのに十分な量で発現されるメタクリレートエステルの酵素またはメチルメタクリレートの酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリレートエステル経路またはメチルメタクリレート経路を含有する微生物体も提供する。該微生物体は、メタクリレートエステル経路またはメチルメタクリレート経路中の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸、および、酵素であって、（ｉ）還元的ＴＣＡ回路を介して炭素固定を増強し、かつ／あるいは（ｉｉ）気体の炭素供給源、ならびに／またはシンガス構成成分、例として、ＣＯ、ＣＯ２および／もしくはＨ２からの追加の還元当量を利用可能にすることによってメタクリレートエステルまたはメチルメタクリレートの収率を増加させる酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含有する。いくつかの態様では、天然に存在しない微生物体は、（ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸が、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される還元的ＴＣＡ経路；（ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される還元的ＴＣＡ経路；あるいは（ｉｉｉ）少なくとも１つの外因性核酸が、ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼ、およびそれらの組合せから選択される酵素をコードすることを含む。本発明は、そのような微生物体を使用して、メタクリレートエステルまたはメチルメタクリレートを生成する条件下およびそれを生成するのに十分な期間、メタクリレートエステル経路またはメチルメタクリレート経路を含有する、天然に存在しない微生物体を培養することによって、メタクリレートエステルまたはメチルメタクリレートを生成する方法をさらに提供する。
図１は、ピルベートおよびアセチルＣｏＡならびにアコニテートからメタクリル酸への例示的な経路を示す。酵素は以下である：Ａ．シトラマル酸シンターゼ、Ｂ．シトラマル酸デヒドラターゼ（シトラコネート形成）、Ｃ．シトラコン酸デカルボキシラーゼ、Ｄ．シトラマリルＣｏＡリアーゼ、Ｅ．シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、Ｆ．シトラマル酸デヒドラターゼ（メサコネート形成）、Ｇ．シトラコン酸イソメラーゼ、Ｈ．メサコン酸デカルボキシラーゼ、Ｉ．アコニット酸デカルボキシラーゼ、Ｊ．イタコン酸イソメラーゼ、Ｋ．シトラマリルＣｏＡデヒドラターゼおよびＬ．イタコニルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ。
図２は、メタクリレートからメタクリレートエステルへの例示的な経路を示す。メタクリレートは、図１に図示される経路または他のメタクリレート経路（ＷＯ２００９／１３５０７４および米国公開２００９／０２７５０９６に記載されるものなど）から形成され得る。メタクリリルＣｏＡは、メタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼまたはメタクリリルＣｏＡシンテターゼを介して、メタクリレートから形成され得る。メタクリレートエステルは、アルコールトランスフェラーゼ酵素の存在下で、メタクリリルＣｏＡおよびアルコールから形成され得る。メタクリレートエステルはまた、メタクリレートエステル形成酵素によって、または化学的転換（例えば、酸などの脱水剤の存在下での加熱）によって、メタクリレートおよびアルコールから直接形成され得る。Ｒは、以下が挙げられるが、これらに限定されない任意の有機官能基を示す：メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−プロピル、ｓｅｃ−ブチル、およびｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、またはヘキシル官能基。例えば、Ｒがメチル基を示す場合、Ｒ−ＯＨはメタノールを示し、この経路の産物は、メチルメタクリレートである。
図３は、３−ヒドロキシイソブチレートを介した、スクシニルＣｏＡからＭＭＡへの例示的な代謝経路を示す。
図４は、３−アミノ−２−メチルプロピオネートを介するスクシニルＣｏＡからＭＡＡへの例示的な経路を示す図である。「ひとまとめにした反応」（段階２〜３）は、１）メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼおよび２）メチルマロニルＣｏＡレダクターゼによって触媒される。
図５は、３−ヒドロキシイソブチレートまたはメタクリリルＣｏＡを介して進行する４−ヒドロキシブチリルＣｏＡからＭＡＡへの例示的な経路を示す図である。段階２は、３つの代替酵素：３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼによって触媒され得る。同様に、段階５は、３つの代替酵素：メタクリリルＣｏＡシンテターゼ、メタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼによって触媒され得る。
図６は、トレオ−３−メチルアスパルテートを介した、例示的なアルファ−ケトグルタレートからＭＡＡへの経路を示す。
図７は、２−ヒドロキシグルタレートを介した、例示的なアルファ−ケトグルタレートからＭＡＡへの経路を示す。
図８は、アセチルＣｏＡまたは４−ヒドロキシブチリルＣｏＡからＭＡＡまたは２−ヒドロキシイソブチレートへの転換の例示的な代謝経路を示す図である。
図９は、アセチルＣｏＡからＭＡＡへの例示的な経路を示す図である。
図１０は、ピルベートからアクリリルＣｏＡ、そしてＭＡＡへの例示的な経路を示す図である。
図１１は、２−ケトバレレートからＭＡＡへの例示的な経路を示す図である。２−ケトイソバレレートは、バリンまたはピルベートから生成することができる。ピルベートから２−ケトイソバレレートに転換する酵素の例示的なセットは、アセト乳酸シンターゼ、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ、およびジヒドロキシ酸デヒドラターゼからなる。
図１２は、基質としての炭水化物におけるＣＯ２の固定のための逆行的ＴＣＡ回路を示す。酵素的変換は、示される酵素によって行われる。
図１３は、シンガスのアセチルＣｏＡへの転換のための、一酸化炭素デヒドロゲナーゼおよびヒドロゲナーゼとカップリングされた逆行的ＴＣＡ回路についての経路を示す。
図１４は、１０マイクログラムのＡＣＳ９０細胞抽出物（レーン１）、ＡＣＳ９１細胞抽出物（レーン２）、Ｍｔａ９８／９９細胞抽出物（レーン３および４）およびサイズ標準（レーン５）ならびにＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ ＣＯＤＨ（Ｍｏｔｈ＿１２０２／１２０３）タンパク質またはＭｔｒ（Ｍｏｔｈ＿１１９７）タンパク質（５０、１５０、２５０、３５０、４５０、５００、７５０、９００、および１０００ｎｇ）である対照の、ウエスタンブロットを示す。
図１５は、ＣＯ酸化アッセイ結果を示す。細胞（ＣＯＤＨ／ＡＣＳオペロン；ＡＣＳ９０もしくはＡＣＳ９１または空のベクター：ｐＺＡ３３Ｓを有する Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａまたはＥ．ｃｏｌｉ）を、増殖させ、そして抽出物を調製した。アッセイを、５５℃にて、抽出物を調製したその日における種々の時点で、行った。メチルビオローゲンの還元を、５７８ｎｍにて、１２０秒の時間経過にわたって、追跡した。
図１６Ａは、メタクリル酸および３−ヒドロキシイソ酪酸の生合成のための経路を示す。示される酵素的変換は、以下の酵素によって実施される：（１）ヒドロゲナーゼ、（２）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、（３）スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ、スクシニルＣｏＡシンテターゼ、（４）メチルマロニルＣｏＡムターゼ、（５）メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、（６）メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、（７）メチルマロン酸セミアルデヒドレダクターゼおよび（８）３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ。
図１６Ｂは、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡ中間体を介した、グルコースからのメタクリル酸の生合成のための経路を示す。酵素的変換は、以下の酵素によって実施される：（１）ヒドロゲナーゼ、（２）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、（３）スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ、スクシニルＣｏＡシンテターゼ、（４）スクシニルＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）、（５）４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、（６）４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ、（７）ホスホトランス−４−ヒドロキシブチリラーゼ、（８）コハク酸レダクターゼ、（９）スクシニルＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）、（１０）４−ヒドロキシブチリルＣｏＡシンテターゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、（１１）４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、（１２）３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼまたはヒドロラーゼ、（１３）３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ、（１４）３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、（１５）メタクリリルＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼまたはヒドロラーゼ。
図１６Ｃは、炭素が還元的ＴＣＡ回路を介した経路を辿る場合の、グルコースに対するメタクリル酸の最大理論収率の増大を示すフラックス分布を示す。酵素的変換は、以下によって実施される：（１）ＡＴＰ−クエン酸リアーゼ；クエン酸リアーゼ、アセチルＣｏＡシンテターゼ；またはクエン酸リアーゼ、酢酸キナーゼ（ｋｉｎｓｅ）、ホスホトランスアセチラーゼ、（２）リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、（３）フマラーゼ、（４）フマル酸レダクターゼ、（５）スクシニルＣｏＡシンテターゼまたはトランスフェラーゼ、（６）アルファ−ケトグルタル酸：フェレドキシン（ｆｅｒｒｉｄｏｘｉｎ）オキシドレダクターゼ、（７）イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、（８）アコニターゼ、（９）ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ；ピルビン酸オキシダーゼ、アセチルＣｏＡシンテターゼ；またはピルビン酸オキシダーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、（１０）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、（１１）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、（１２）３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、（１３）２−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、（１４）メタクリリルＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼまたはヒドロラーゼ、（１５）２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼまたはヒドロラーゼ。
図１６Ｄは、炭素が還元的ＴＣＡ回路を介した経路を辿る場合の、シトラマレートを介したグルコースに対するメタクリル酸の最大理論収率の増大を示すフラックス分布を示す。酵素的変換は、以下によって実施される：（１）ＡＴＰ−クエン酸リアーゼ；クエン酸リアーゼ、アセチルＣｏＡシンテターゼ；またはクエン酸リアーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、（２）リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、（３）フマラーゼ、（４）フマル酸レダクターゼ、（５）スクシニルＣｏＡシンテターゼまたはトランスフェラーゼ、（６）アルファ−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、（７）イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、（８）アコニターゼ、（９）ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ；ピルビン酸オキシダーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、（１０）シトラマル酸シンターゼ、（１１）シトラマル酸デヒドラターゼおよび（１２）シトラコン酸デカルボキシラーゼ。
図１６Ｅは、アセチルＣｏＡおよびピルベートからのメタクリル酸の生合成のための経路を示す。酵素的変換は、示されるように、酵素によって実施される。酵素は、以下である：（１）シトラマル酸シンターゼ、（２）シトラマル酸デヒドラターゼ（シトラコネート形成）、（３）シトラコン酸デカルボキシラーゼ、（４）シトラマリルＣｏＡリアーゼ、（５）シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ（ｈｙｒｏｌａｓｅ）、（６）シトラマル酸デヒドラターゼ（メサコネート形成）、（７）シトラコン酸イソメラーゼ、（８）メサコン酸デカルボキシラーゼ、（９）アコニット酸デカルボキシラーゼ、（１０）イタコン酸イソメラーゼ、（１１）イタコニルＣｏＡトランスフェラーゼまたはシンテターゼおよび（１２）イタコニルＣｏＡヒドラターゼ。
図１７Ａおよび１７Ｂは、例示的な経路を示す。酵素的変換は、示されるように、酵素によって実施される。図１７Ａは、還元的ＴＣＡ回路を用いたスクシニルＣｏＡへのＣＯ２の固定のための経路を示す。図１７Ｂは、スクシニルＣｏＡからの３−ヒドロキシイソ酪酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｂｕｔｒｉｃ ａｃｉｄ）およびメタクリル酸の生合成のための例示的な経路を示す；示される酵素的変換は、以下の酵素によって実施される：Ａ．メチルマロニルＣｏＡムターゼ、Ｂ．メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、Ｃ．メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、Ｄ．メチルマロン酸セミアルデヒドレダクターゼ、Ｅ．３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ。
図１８Ａおよび１８Ｂは、例示的な経路を示す。酵素的変換は、示されるように、酵素によって実施される。図１８Ａは、還元的ＴＣＡ回路を用いたスクシネートへのＣＯ２の固定のための経路を示す。図１８Ｂは、スクシネートからの３−ヒドロキシイソ酪酸およびメタクリル酸の生合成のための例示的な経路を示す；示される酵素的変換は、以下の酵素によって実施される：Ａ．３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、Ｂ．メタクリリルＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼまたはヒドロラーゼ、Ｃ．スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼまたはシンテターゼ、Ｄ．スクシニルＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）、Ｅ．４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、Ｆ．４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ、Ｇ．ホスホトランス−４−ヒドロキシブチリラーゼ、Ｈ．コハク酸レダクターゼ、Ｉ．スクシニルＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）、Ｊ．４−ヒドロキシブチリルＣｏＡシンテターゼまたはトランスフェラーゼ、Ｋ．４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、Ｌ．３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼまたはヒドロラーゼ、Ｍ．３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ。
図１９Ａおよび１９Ｂは、例示的な経路を示す。図１９Ａは、還元的ＴＣＡ回路を用いたアセチルＣｏＡおよびピルベートへのＣＯ２の固定のための経路を示す。図１９Ｂは、アセチルＣｏＡおよびピルベートからのメタクリレートの生合成のための例示的な経路を示す；示される酵素的変換は、以下の酵素によって実施される：１．シトラマル酸シンターゼ、２．シトラマル酸デヒドラターゼ（シトラコネート形成）、３．シトラコン酸デカルボキシラーゼ、４．シトラマリルＣｏＡリアーゼ、５．シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、６．シトラマル酸デヒドラターゼ（メサコネート形成）、７．シトラコン酸イソメラーゼ、８．メサコン酸デカルボキシラーゼ、９．アコニット酸デカルボキシラーゼ、１０．イタコン酸イソメラーゼ、１１．イタコニルＣｏＡトランスフェラーゼまたはシンテターゼ、１２．イタコニルＣｏＡヒドラターゼ。
図２０Ａおよび２０Ｂは、例示的な経路を示す。図２０Ａは、還元的ＴＣＡ回路を用いたアセチルＣｏＡへのＣＯ２の固定のための経路を示す。図２０Ｂは、アセチルＣｏＡからのメタクリル酸および２−ヒドロキシイソ酪酸の生合成のための例示的な経路を示す。
図２１Ａおよび２１Ｂは、例示的な経路を示す。図２１Ａは、還元的ＴＣＡ回路を用いたアセチルＣｏＡへのＣＯ２の固定のための経路を示す。図２１Ｂは、アセチルＣｏＡからのメタクリル酸および３−ヒドロキシイソ酪酸の生合成のための例示的な経路を示す；示される酵素的変換は、以下の酵素によって実施される：１）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡからＢ）、２）３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（Ｈｂｄ）、３）クロトナーゼ（Ｃｒｔ）、４）クロトニルＣｏＡヒドラターゼ（４−Ｂｕｄｈ）、５）４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、６）３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼ、シンテターゼ、またはトランスフェラーゼ、７）３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ、８）３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、９）メタクリリルＣｏＡヒドロラーゼ、シンテターゼ、またはトランスフェラーゼ。
図２２Ａは、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｉｏｗｅｎｓｉｓ（ＧＮＭ＿７２０）由来のカルボン酸レダクターゼのヌクレオチド配列（配列番号１）を示し、そして図２２Ｂは、コードされたアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
図２３Ａは、コドン最適化されたホスフパンテテイン（ｐｈｏｓｐｈｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｅ）トランスフェラーゼのヌクレオチド配列（配列番号３）を示し、そして図２３Ｂは、コードされたアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
図２４Ａは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ｍｃ（２）１５５由来のカルボン酸レダクターゼ（８９０と名付けられる）のヌクレオチド配列（配列番号５）を示し、そして図２４Ｂは、コードされたアミノ酸配列（配列番号６）を示す。
図２５Ａは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ亜種ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｋ−１０由来のカルボン酸レダクターゼ（８９１と名付けられる）のヌクレオチド配列（配列番号７）を示し、そして図２５Ｂは、コードされたアミノ酸配列（配列番号８）を示す。
図２６Ａは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ Ｍ由来のカルボン酸レダクターゼ（８９２と名付けられる）のヌクレオチド配列（配列番号９）を示し、そして図２６Ｂは、コードされたアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。
図２７Ａは、８９１ＧＡと名付けられるカルボン酸レダクターゼのヌクレオチド配列（配列番号１１）を示し、そして図２７Ｂは、コードされたアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。
図２８は、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡを介したメタクリレートエステルへの例示的な経路を示す。Ｒ−ＯＨは、任意の有機アルコールを指す。
図２９は、２−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡを介したメタクリレートエステルへの例示的な経路を示す。Ｒ−ＯＨは、任意の有機アルコールを指す。
図３０は、例示的なメタクリレートエステル、メチルメタクリレートへの例示的な経路を示す。
本発明は、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートのための生合成的生成能力を有する細胞および生物体の設計および生成を対象とする。本明細書に開示するように、代謝経路を設計し、組換えにより工学的に操作して、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなどの微生物体、および他の細胞または生物体で、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートの生合成を行うことができる。メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートの生合成的生成は、設計された代謝遺伝子型を有する株の構築によって確認される。理論的な最大増殖に近づく条件下を含めて、代謝について工学的に操作されたこれらの細胞または生物体につき適応進化を受けさせてメタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートの生合成をさらに増強することもできる。
メタクリル酸（ＭＡＡ）を生成するための微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）が、先に記載されている（例えば、参照により本明細書に組み込まれている、ＷＯ２００９／１３５０７４および米国公開第２００９／０２７５０９６号を参照）。本発明は、微生物体を工学的に操作して、メタクリル酸（ＭＡＡ）を生成するための追加の経路を提供する。図１は、アセチルＣｏＡおよびピルベートから中間体シトラマレートを経てＭＡＡに至る例示的な経路を示す。また、アコニテートからＭＡＡに至る経路も示す。一方の経路では、最初に、アセチルＣｏＡおよびピルベートが、シトラマル酸シンターゼによりシトラマレートに変換される。シトラマレートの脱水により、シトラコネート（ステップＢ）またはメサコネート（ステップＣ）のいずれかを得ることができる。ステップＧにおいて、メサコネートとシトラコネートとが、シス／トランスイソメラーゼにより相互転換される。メサコネートの脱カルボキシル化（ステップＨ）またはシトラコネートの脱カルボキシル化（ステップＣ）により、ＭＡＡが得られる。代替の経路では、シトラマリルＣｏＡリアーゼ、およびシトラマリルＣｏＡヒドロラーゼ、トランスフェラーゼまたはシンテターゼにより触媒されるステップＤおよびＥにおいて、アセチルＣｏＡおよびピルベートから、シトラマリルＣｏＡ中間体を経てシトラマレートが形成される。
本発明はまた、アコニテートからＭＡＡに至る経路も網羅する。一方の経路では、最初に、アコニテートが、アコニット酸デカルボキシラーゼによりイタコネートに脱カルボキシル化される（ステップＩ）。次いで、イタコネートが、イタコネートデルタ−イソメラーゼによりシトラコネートに異性化される（ステップＪ）。シトラコネートのＭＡＡへの転換は、脱カルボキシル化により直接進行するか、またはメサコネートを経て間接的に進行する。代替の経路では、最初に、イタコネート中間体が、ＣｏＡトランスフェラーゼまたはシンテターゼによりイタコニルＣｏＡに転換される（ステップＬ）。イタコニルＣｏＡの水和により、シトラマリルＣｏＡが得られ、次いで、シトラマリルＣｏＡは、既に記載したように、ＭＡＡに転換することができる。さらに、例示的なＭＡＡ経路の詳細および実施形態を、本明細書下記に記載する。
本明細書で用いるように、本発明の微生物体または微生物に関して用いられる場合、用語「天然に存在しない」は、その微生物体が、その参照種の野生型株を含むその参照種の天然株で通常見られない、少なくとも１つの遺伝的変化を有することを意味するものとする。遺伝的変化には、例えば、代謝ポリペプチドをコードする発現可能な核酸を導入する改変、他の核酸の付加、核酸欠失および／または微生物体遺伝物質の他の機能的破壊が含まれる。そのような改変には、例えば、参照種の異種の、同種の、または異種および同種のポリペプチドのコード領域およびその機能的断片が含まれる。追加の改変には、例えば、その改変が遺伝子またはオペロンの発現を変化させる非コード調節領域が含まれる。例示的な代謝ポリペプチドには、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレート生合成経路内の酵素またはタンパク質が含まれる。
代謝改変は、その天然の状態から変更された生化学反応を指す。したがって、天然に存在しない微生物は、代謝ポリペプチドまたはその機能的断片をコードする核酸に対する遺伝子改変を有することができる。例示的な代謝改変が、本明細書で開示される。
本明細書で用いるように、微生物体に関して用いられる場合、用語「単離された」は、参照の微生物体が天然で見られるような少なくとも１つの成分を実質的に含まない生物体を意味するものとする。本用語は、その天然環境で見られるような一部または全ての成分が除去されている微生物体を含む。本用語は、その微生物体が天然に存在しない環境で見られるような一部または全ての成分が除去されている微生物体も含む。したがって、単離された微生物体は、それが天然で見られるか、またはそれが天然に存在しない環境で増殖され、保存されるか生存するような他の物質から一部または完全に分離される。単離された微生物体の具体例には、部分的に純粋な微生物、実質的に純粋な微生物、および天然に存在しない培地で培養された微生物が含まれる。
本明細書で用いるように、用語「微生物の」、「微生物体」または「微生物」は、古細菌、細菌または真核生物のドメインに含まれる、微視的細胞として存在する任意の生物体を意味するものとする。したがって、本用語は、顕微鏡的大きさを有する原核生物または真核生物の細胞または生物体を包含するものとし、全ての種の細菌、古細菌および真正細菌、ならびに酵母および真菌類などの真核生物の微生物を含む。本用語は、生化学物質の生成のために培養することができる、任意の種の細胞培養物も含む。
本明細書で用いるように、化学式ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯ２（図１を参照）を有する「メタクリル酸」（ＩＵＰＡＣ名２−メチル−２−プロペン酸）は、メタクリレートの酸の形態であり、メタクリル酸およびメタクリレートは、その任意の塩の形態を含めて、その中性またはイオン化形態のいずれかの化合物を指すのに全体にわたって交換可能な形で使用できることが理解される。特定の形態がｐＨに依存することが当業者により理解される。
本明細書で用いるように、「メタクリレートエステル」は、化学式ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯＯＲを有する化合物を指し（図２８および２９を参照）、式中、Ｒは、分枝鎖または直鎖のＣ１〜Ｃ６である低級アルキルであり、これには、非限定的に、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−プロピル、ｓｅｃ−ブチルおよびｔｅｒｔ−ブチル、ペンチルまたはヘキシルが含まれ、それらのいずれもが不飽和であってもよく、それにより、それらは、例えば、プロペニル、ブテニル、ペンチルおよびヘキセニルであり得る。例示的なメタクリレートエステルには、非限定的に、メチルメタクリレート、エチルメタクリレートおよびｎ−プロピルメタクリレートが含まれる。本明細書で用いるメタクリレートエステルはまた、中鎖〜長鎖の基、すなわちＣ７〜Ｃ２２である他のＲ基も含み、該メタクリレートエステルは、脂肪アルコール、例として、ヘプチルアルコール、オクチルアルコール、ノニルアルコール、デシルアルコール、ウンデシルアルコール、ラウリルアルコール、トリデシルアルコール、ミリスチルアルコール、ペンタデシルアルコール、セチルアルコール、パルミトリルアルコール、ヘプタデシルアルコール、ステアリルアルコール、ノナデシルアルコール、アラキジルアルコール、ヘンイコシルアルコールおよびベヘニルアルコールから誘導され、それらのいずれもが必要に応じて、分枝していてもよく、かつ／または不飽和を含有してもよい。
本明細書で用いるように、用語「ＣｏＡ」または「補酵素Ａ」は、活性酵素系を形成するためにその存在が多くの酵素（アポ酵素）の活性のために必要とされる、有機コファクターまたは補欠分子族（酵素の非タンパク部分）を意味するものとする。補酵素Ａは、特定の縮合酵素で機能し、アセチルまたは他のアシル基転移、ならびに脂肪酸合成および酸化、ピルベート酸化ならびに他のアセチル化で作用する。
本明細書で用いるように、培養または増殖条件に関して用いられる場合、用語「実質的に嫌気性」は、酸素の量が、液体培地中の溶存酸素の飽和量の約１０％未満であることを意味するものとする。本用語は、約１％未満の酸素の雰囲気で維持される、液体または固体培地の密封チャンバー、も含むものとする。
本明細書で用いる「外因性」は、参照分子または参照活性が宿主の微生物体に導入されることを意味するものとする。分子は、例えば、宿主染色体への組込みなどによる宿主遺伝物質へのコード核酸の導入によって、またはプラスミドなどの非染色体遺伝物質として導入することができる。したがって、コード核酸の発現に関して用いられる本用語は、微生物体への発現可能な形でのコード核酸の導入を指す。生合成活性に関して用いられる場合、本用語は、宿主参照生物体に導入される活性を指す。供給源は、例えば、宿主の微生物体への導入の後に参照活性を発現する、同種または異種のコード核酸であってよい。したがって、用語「内因性」は、宿主に存在する参照分子または活性を指す。同様に、コード核酸の発現に関して用いられる場合、本用語は、微生物体に含まれるコード核酸の発現を指す。用語「異種の」は、参照種以外の供給源に由来する分子または活性を指し、「同種の」は、宿主の微生物体に由来する分子または活性を指す。したがって、本発明のコード核酸の外因性の発現は、異種または同種のコード核酸のいずれかまたは両方を利用することができる。
２つ以上の外因性核酸が微生物体に含まれる場合、こうした２つ以上の外因性核酸は、上記で論じた参照のコード核酸または生合成活性を指すことが理解される。本明細書で開示されるように、そのような２つ以上の外因性核酸は、宿主の微生物体の別個の核酸分子上に、ポリシストロニック核酸分子上に、またはそれらを組み合わせて宿主の微生物体に導入することができ、そしてそれは依然として、２つ以上の外因性核酸とみなすことができることがさらに理解される。例えば、本明細書で開示されるように、微生物体を工学的に操作して、所望の経路の酵素またはタンパク質をコードする２つ以上の外因性核酸を発現させることができる。所望の活性をコードする２つの外因性核酸が宿主の微生物体に導入される場合、こうした２つの外因性核酸は、単一の核酸として、例えば、単一のプラスミド上にもしくは別個のプラスミド上に導入することができ、宿主染色体の単一の部位もしくは複数の部位へと組み込むこともでき、そしてそれは依然として、２つの外因性核酸とみなすことができることが理解される。同様に、３つ以上の外因性核酸は、任意の所望の組合せで、宿主の生物体へと、例えば、単一のプラスミド上にもしくは別個のプラスミド上に導入することができ、宿主染色体の単一の部位もしくは複数の部位へと組み込むことができ、そしてそれは依然として、２つ以上の外因性核酸、例えば、３つの外因性核酸とみなすことができることが理解される。したがって、参照される外因性の核酸または生合成活性の数は、宿主生物体へと導入された別々の核酸の数ではなく、コード核酸の数または生合成活性の数を指す。
本発明の天然に存在しない微生物体は安定した遺伝的変化を含むことができ、それは変化を失わずに５世代を超えて培養することができる微生物を指す。一般に、安定した遺伝的変化には、１０世代を超えて存続する改変が含まれ、特に安定した改変は約２５世代を超えて存続し、より詳しくは、安定した遺伝子改変は無期限を含めて５０世代を超える。
当業者は、本明細書で例示される代謝改変を含む遺伝的変化が、Ｅ．ｃｏｌｉなどの適切な宿主生物体およびそれらの対応する代謝反応、または所望の遺伝物質、例えば所望の代謝経路の遺伝子に適する供給源生物体に関して記載されることを理解するであろう。しかし、多種多様な生物体の完全なゲノム配列決定およびゲノミクスの領域における高レベルの技術を考慮して、当業者は、本明細書で提供される教示および指針を事実上他の全ての生物体に適用することが容易にできる。例えば、本明細書で例示したＥ．ｃｏｌｉの代謝改変は、参照種以外の種からの同じであるか類似したコード核酸を組み込むことによって、他の種に容易に適用することができる。そのような遺伝的変化には、例えば、一般には種のホモログの遺伝的変化、より詳細には、オルソログ、パラログまたは非オルソロガスな遺伝子置換が含まれる。
オルソログは、垂直伝達（ｖｅｒｔｉｃａｌ ｄｅｓｃｅｎｔ）が関係し、異なる生物体での実質的に同じか同一の機能の役割を担う１つまたは複数の遺伝子である。例えば、マウスエポキシドヒドロラーゼおよびヒトエポキシドヒドロラーゼは、エポキシドの加水分解の生物学的機能のためのオルソログと考えることができる。遺伝子は、例えば、それらが同種であるか共通祖先からの進化によって関係していることを示すのに十分な量の配列類似性をそれらが共有する場合、垂直伝達が関係している。それらが、一次配列類似性が識別可能でない程度までそれらが共通祖先から進化したことを示すのに十分な量の三次元構造を共有するが必ずしも配列類似性を共有しない場合にも、遺伝子はオルソログと考えることができる。オルソロガスである遺伝子は、約２５％〜１００％アミノ酸配列同一性の配列類似性を有するタンパク質をコードすることができる。それらの三次元構造も類似性を示す場合、２５％未満のアミノ酸類似性を共有するタンパク質をコードする遺伝子も、垂直伝達によって生じたと考えることができる。組織プラスミノーゲン活性化因子およびエラスターゼを含む、酵素のセリンプロテアーゼファミリーのメンバーは、共通祖先から垂直伝達によって生じたと考えられる。
オルソログには、例えば進化を通して構造または全体的活性が異なった、遺伝子またはそれらのコードされた遺伝子生成物が含まれる。例えば、１つの種が２つの機能を示す遺伝子生成物をコードし、そのような機能が第２の種の異なる遺伝子に分離されている場合、３つの遺伝子およびそれらの対応する生成物はオルソログであるとみなされる。生化学生成物の生成については、当業者は、天然に存在しない微生物の構築のために、導入または破壊される代謝活性を抱えているオルソロガス遺伝子が選択されるべきであることを理解するであろう。分離できる活性を示すオルソログの例は、異なる活性が２つ以上の種の間で、または単一の種の中で異なる遺伝子生成物に分離されている場合である。具体例は、セリンプロテアーゼ活性の２つの型であるエラスターゼタンパク質分解およびプラスミノーゲンタンパク質分解の、プラスミノーゲン活性化因子およびエラスターゼのような異なる分子への分離である。第２の例は、マイコプラズマ５’−３’エキソヌクレアーゼおよびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ活性の分離である。第１の種からのＤＮＡポリメラーゼは、第２の種からのエキソヌクレアーゼまたはポリメラーゼの一方または両方にオルソログであると、またはその逆とみなすことができる。
対照的に、パラログは、例えば複製とそれに続く進化的分岐によって関係があるホモログであり、類似または共通しているが、同一でない機能を有する。パラログは、例えば、同じ種または異なる種を起源とするかそれに由来することができる。例えば、ミクロソームのエポキシドヒドロラーゼ（エポキシドヒドロラーゼＩ）および可溶性のエポキシドヒドロラーゼ（エポキシドヒドロラーゼＩＩ）は、同じ種で異なる反応を触媒し、異なる機能を有する、共通祖先から共進化した２つの異なる酵素を表すので、パラログと考えることができる。パラログは、かなりの相互に配列類似性を有する同じ種からのタンパク質であり、共通祖先からの共進化を通してそれらが相同であるか関係することを示唆している。パラロガスのタンパク質ファミリー群には、ＨｉｐＡホモログ、ルシフェラーゼ遺伝子、ペプチダーゼなどが含まれる。
非オルソロガス遺伝子置換は、異なる種の参照遺伝子機能の代わりになることができる、１つの種からの非オルソロガス遺伝子である。置換には、例えば、異なる種での参照機能と比較して、起源種で実質的に同じかまたは類似した機能を発揮することができるものが含まれる。一般に、非オルソロガス遺伝子置換は、参照機能をコードする公知の遺伝子に構造的に関係することを確認することが可能であるが、より構造的に関係しないが機能的に類似した遺伝子およびそれらの対応する遺伝子生成物も、本明細書で用いられるような用語の意味の範囲内である。例えば、機能的類似性は、置換しようとする機能をコードする遺伝子と比較して、非オルソロガス遺伝子生成物の活性部位または結合性領域において少なくとも多少の構造類似性を要求する。したがって、非オルソロガス遺伝子には、例えばパラログまたは無関係な遺伝子が含まれる。
したがって、メタクリル酸生合成能力を有する本発明の天然に存在しない微生物体を特定し、構築することにおいて、特定の種に本明細書で提供される教示および指針を適用することで、当業者は、代謝改変の特定にはオルソログの特定および組入れまたは不活化を含めることができることを理解する。パラログおよび／または非オルソロガスな遺伝子置換が、類似したか実質的に類似した代謝反応を触媒する酵素をコードする参照微生物に存在する範囲内において、当業者はこれらの進化関係の遺伝子を利用することもできる。
オルソログ、パラログおよび非オルソロガスな遺伝子置換は、当業者に周知である方法によって決定することができる。例えば、２つのポリペプチドのための核酸またはアミノ酸配列の検査は、比較される配列間の配列の同一性および類似性を明らかにする。そのような類似性に基づいて、タンパク質が共通祖先からの進化を通して関係していることを示すのにその類似性が十分に高いかどうか、当業者は決定することができる。当業者に周知であるアルゴリズム、例えばＡｌｉｇｎ、ＢＬＡＳＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗなどは、生の配列の類似性または同一性を比較、決定し、さらに、重みまたはスコアを割り当てることができる配列中のギャップの存在または重要性を決定する。そのようなアルゴリズムは当技術分野でも公知であり、ヌクレオチド配列の類似性または同一性を決定することに同様に適用できる。関連性を決定するのに十分な類似性のパラメータは、統計的類似性、またはランダムなポリペプチド中で類似したマッチを見出す可能性、および決定されるマッチの有意性を計算するための周知の方法に基づいて計算される。所望により、２つ以上の配列のコンピュータによる比較を、当業者が視覚的に最適化することもできる。関係する遺伝子生成物またはタンパク質は、高い類似性、例えば２５％〜１００％の配列同一性を有すると予想することができる。無関係であるタンパク質は、十分なサイズのデータベースをスキャンする場合に偶然に起こることが予想されるのと事実上同じである同一性を有することができる（約５％）。５％から２４％の間の配列は、比較する配列が関係していると結論するのに十分な相同性を表すことができるか、表すことができない。これらの配列の関連性を決定するために、データセットのサイズを前提とするそのようなマッチの有意性を決定する追加の統計分析を実施することができる。
例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて２つ以上の配列の関連性を決定するための例示的なパラメータは、下に示すようなものでよい。簡単に述べると、アミノ酸配列アラインメントは、ＢＬＡＳＴＰバージョン２．０．８（１９９９年１月５日）および以下のパラメータを用いて実施することができる：マトリックス：０ ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップオープン：１１；ギャップ伸長：１；ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ：５０；予想：１０．０；ワードサイズ：３；フィルター：オン。核酸配列アラインメントは、ＢＬＡＳＴＮバージョン２．０．６（１９９８年９月１６日）および以下のパラメータを用いて実施することができる：マッチ：１；ミスマッチ：−２；ギャップオープン：５；ギャップ伸長：２；ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ：５０；予想：１０．０；ワードサイズ：１１；フィルター：オフ。当業者は、例えば、比較のストリンジェンシーを増加または低減させ、２つ以上の配列の関連性を決定するために、どのような改変を上記のパラメータに加えることができるかを知るであろう。
一実施形態では、本発明は、メタクリレートエステル経路を有する、天然に存在しない微生物体であって、メタクリレートエステルを生成するのに十分な量で発現されるメタクリレートエステル経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、前記メタクリレートエステル経路が、アルコールトランスフェラーゼまたはエステルを形成する酵素、およびデヒドラターゼを含む微生物体を提供する。特定の実施形態では、微生物体は、それぞれメタクリレートエステル経路の酵素をコードする２つの外因性核酸を含む。例えば、２つの外因性核酸は、アルコールトランスフェラーゼおよびデヒドラターゼ、またはそれに代わって、エステルを形成する酵素およびデヒドラターゼをコードすることができる。特定の実施形態では、少なくとも１つの外因性核酸は、異種の核酸であってよい。別の実施形態では、天然に存在しない微生物体は、実質的に嫌気性の培地中にあってよい。本発明は、メタクリレートエステルを生成するための方法であって、メタクリレートエステルを生成する条件下およびそれを生成するのに十分な期間、本明細書で開示される、メタクリレートエステル経路を有する天然に存在しない微生物体を培養する工程を含む方法をさらに提供する。
本発明は、メチルメタクリレート経路を有する、天然に存在しない微生物体であって、メチルメタクリレートを生成するのに十分な量で発現されるメチルメタクリレート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、メチルメタクリレート経路が、アルコールトランスフェラーゼまたはエステルを形成する酵素、およびデヒドラターゼを含む微生物体をさらに提供する。さらなる実施形態では、微生物体は、それぞれメチルメタクリレート経路の酵素をコードする２つの外因性核酸を含むことができる。特定の実施形態では、２つの外因性核酸は、アルコールトランスフェラーゼおよびデヒドラターゼ、またはそれに代わって、エステルを形成する酵素およびデヒドラターゼをコードすることができる。別の実施形態では、少なくとも１つの外因性核酸は、異種の核酸であってよい。別の実施形態では、天然に存在しない微生物体は、実質的に嫌気性の培地中にあってよい。本発明はまた、メチルメタクリレートを生成する条件下およびそれを生成するのに十分な期間、メチルメタクリレート経路を有する、天然に存在しない微生物体を培養することによって、メチルメタクリレートを生成するための方法も提供する。
一実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物体であって、メタクリレートエステルを生成するのに十分な量で発現されるメタクリレートエステル経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリレートエステル経路を有する微生物体を含み、前記メタクリレートエステル経路が、アルコールトランスフェラーゼまたはエステルを形成する酵素、およびデヒドラターゼを含む微生物体を提供する。一態様では、天然に存在しない微生物体は、それぞれメタクリレートエステル経路の酵素をコードする２つの外因性核酸を含む。一態様では、２つの外因性核酸は、アルコールトランスフェラーゼおよびデヒドラターゼ、またはそれに代わって、エステルを形成する酵素およびデヒドラターゼをコードする。別の態様では、少なくとも１つの外因性核酸は、異種の核酸である。別の態様では、天然に存在しない微生物体は、実質的に嫌気性の培地中にある。
一実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物体であって、前記デヒドラターゼが、３−ヒドロキシイソブチレートエステルまたは２−ヒドロキシイソブチレートエステルを前記メタクリレートエステルに転換する微生物体を提供する。一実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物体であって、前記アルコールトランスフェラーゼが、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡを３−ヒドロキシイソブチレートエステルに転換するか、または２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡを２−ヒドロキシイソブチレートエステルに転換する微生物体を提供する。
一実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物体であって、メタクリレートエステルを生成するのに十分な量で発現されるメタクリレートエステル経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリレート（ｍｅｔｈａｃｙｒｌａｔｅ）エステル経路をさらに含み、前記メタクリレートエステル経路が、（ａ）３−ヒドロキシイソ酪酸ＣｏＡトランスフェラーゼもしくは３−ヒドロキシイソ酪酸ＣｏＡシンテターゼ；アルコールトランスフェラーゼ；およびデヒドラターゼ；（ｂ）３−ヒドロキシイソブチレートエステルを形成する酵素およびデヒドラターゼデヒドラターゼ（ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）；（ｃ）２−ヒドロキシイソ酪酸ＣｏＡトランスフェラーゼもしくは２−ヒドロキシイソ酪酸ＣｏＡシンテターゼ；アルコールトランスフェラーゼ；およびデヒドラターゼ；または（ｄ）２−ヒドロキシイソブチレートエステルを形成する酵素およびデヒドラターゼから選択される経路を含む微生物体を提供する。一態様では、本発明は、メタクリレートエステルを生成する条件下およびそれを生成するのに十分な期間、本明細書で開示される天然に存在しない微生物体を培養することによって、メタクリレートエステルを生成するための方法を提供する。
一実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物体であって、メチルメタクリレートを生成するのに十分な量で発現されるメチルメタクリレート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメチルメタクリレート経路を有する微生物体を含み、前記メチルメタクリレート経路が、アルコールトランスフェラーゼまたはエステルを形成する酵素、およびデヒドラターゼを含む微生物体を提供する。一態様では、この微生物体は、それぞれメチルメタクリレート経路の酵素をコードする２つの外因性核酸を含む。別の態様では、２つの外因性核酸は、アルコールトランスフェラーゼおよびデヒドラターゼ、またはそれに代わって、エステルを形成する酵素およびデヒドラターゼをコードする。別の態様では、少なくとも１つの外因性核酸は、異種の核酸である。別の態様では、天然に存在しない微生物体は、実質的に嫌気性の培地中にある。
一実施形態では、本発明は、メチルメタクリレートを生成するための方法であって、メチルメタクリレートを生成する条件下およびそれを生成するのに十分な期間、本明細書に記載する天然に存在しない微生物体を培養する工程を含む方法を提供する。
一実施形態では、本発明は、メタクリレートエステルを生成するための方法であって、３−ヒドロキシイソブチレートエステルを生成する条件下およびそれを生成するのに十分な期間、天然に存在しない微生物体を培養する工程（前記天然に存在しない微生物体は、３−ヒドロキシイソブチレートエステルを生成するのに十分な量で発現されるアルコールトランスフェラーゼまたは３−ヒドロキシイソブチレートエステルを形成する酵素をコードする外因性核酸を含む）と、前記３−ヒドロキシイソブチレートエステルを化学的に脱水して、メタクリレートエステルを生成する工程とを含む方法を提供する。
一実施形態では、本発明は、メタクリレートエステルを生成するための方法であって、２−ヒドロキシイソブチレートエステルを生成する条件下およびそれを生成するのに十分な期間、天然に存在しない微生物体を培養する工程（前記天然に存在しない微生物体は、２−ヒドロキシイソブチレートエステルを生成するのに十分な量で発現されるアルコールトランスフェラーゼまたは２−ヒドロキシイソブチレートエステルを形成する酵素をコードする外因性核酸を含む）と、前記２−ヒドロキシイソブチレートエステルを化学的に脱水して、メタクリレートエステルを生成する工程とを含む方法を提供する。
一実施形態では、本発明は、メチルメタクリレートを生成するための方法であって、メチル−３−ヒドロキシイソブチレートを生成する条件下およびそれを生成するのに十分な期間、天然に存在しない微生物体を培養する工程（前記天然に存在しない微生物体は、メチル−３−ヒドロキシイソブチレートを生成するのに十分な量で発現されるアルコールトランスフェラーゼまたはエステルを形成する酵素をコードする外因性核酸を含む）と、前記メチル−３−ヒドロキシイソブチレートを化学的に脱水して、メチルメタクリレートを生成する工程とを含む方法を提供する。
上記の方法の一態様では、外因性核酸は、異種の核酸である。上記の方法の別の態様では、天然に存在しない微生物体は、実質的に嫌気性の培地中にある。
一実施形態では、本発明は、前記微生物体が、３−ヒドロキシイソブチレートエステルを生成するのに十分な量で発現される３−ヒドロキシイソブチレートエステル経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む３−ヒドロキシイソブチレートエステル経路をさらに含み、前記３−ヒドロキシイソブチレートエステル経路が、（ａ）３−ヒドロキシイソ酪酸ＣｏＡトランスフェラーゼもしくは３−ヒドロキシイソ酪酸ＣｏＡシンテターゼ；およびアルコールトランスフェラーゼ；または（ｂ）３−ヒドロキシイソブチレートエステルを形成する酵素から選択される経路を含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、前記微生物体が、２−ヒドロキシイソブチレートエステルを生成するのに十分な量で発現される２−ヒドロキシイソブチレートエステル経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む２−ヒドロキシイソブチレートエステル経路をさらに含み、前記２−ヒドロキシイソブチレートエステル経路が、（ａ）２−ヒドロキシイソ酪酸ＣｏＡトランスフェラーゼもしくは２−ヒドロキシイソ酪酸ＣｏＡシンテターゼ；およびアルコールトランスフェラーゼ；または（ｂ）２−ヒドロキシイソブチレートエステルを形成する酵素から選択される経路を含む方法を提供する。
本明細書で開示されるように、本発明は、メタクリル酸経路を有する、天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む微生物体を提供する。例示的な経路には、これらに限定されないが、図１に開示される経路が含まれる。例示的なメタクリル酸経路には、例えば、以下に示す、図１に示される酵素に対応する経路、すなわち、経路（１）Ａ／Ｂ／Ｃ；経路（２）Ａ／Ｂ／Ｇ／Ｈ；経路（３）Ａ／Ｆ／Ｇ／Ｃ；経路（４）Ａ／Ｆ／Ｈ；経路（５）Ｄ／Ｅ／Ｂ／Ｃ；経路（６）Ｄ／Ｅ／Ｂ／Ｇ／Ｈ；経路（７）Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｈ；経路（８）Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｃ；経路（９）Ｉ／Ｊ／Ｃ；経路（１０）Ｉ／Ｊ／Ｇ／Ｈ；経路（１１）Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｅ／Ｂ／Ｃ；経路（１２）Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｅ／Ｂ／Ｇ／Ｈ；経路（１３）Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｅ／Ｆ／Ｈ；および経路（１４）Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｃが含まれ、これらは、下記に、より詳細に論じる。
特定の実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリル酸経路を有する微生物体を含み、メタクリル酸経路が、シトラマル酸シンターゼ（Ａ）、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ（Ｂ）、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ（Ｃ）を含む微生物体を提供する（図１、経路（１）Ａ／Ｂ／Ｃ）。本明細書で開示されるように、微生物体は、メタクリル酸経路の酵素（経路中の酵素を最大で全て含む）をコードする、２つ以上の外因性核酸を含むことができ、例えば、３つの外因性核酸が、シトラマル酸シンターゼ、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼをコードする。
特定の実施形態では、ＭＡＡを生成する、本発明の天然に存在しない微生物体は、異種の核酸である少なくとも１つの外因性核酸を有することができる。別の実施形態では、ＭＡＡを生成する、天然に存在しない微生物体は、実質的に嫌気性の培地中にあってよい。
別の実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリル酸経路を含み、メタクリル酸経路が、シトラマル酸シンターゼ（Ａ）、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ（Ｂ）、シトラコン酸イソメラーゼ（Ｇ）、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ（Ｈ）を含む微生物体を提供する（図１、経路（２）Ａ／Ｂ／Ｇ／Ｈ）。その上別の実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリル酸経路を含み、メタクリル酸経路が、シトラマル酸シンターゼ（Ａ）、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ（Ｆ）、シトラコン酸イソメラーゼ（Ｇ）、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ（Ｃ）を含む微生物体を提供する（図１、経路（３）Ａ／Ｆ／Ｇ／Ｃ）。
さらなる実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリル酸経路を含み、メタクリル酸経路が、シトラマル酸シンターゼ（Ａ）、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ（Ｆ）、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ（Ｈ）を含む微生物体を提供する（図１、経路（４）Ａ／Ｆ／Ｈ）。さらにさらなる実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリル酸経路を含み、メタクリル酸経路が、シトラマリルＣｏＡリアーゼ（Ｄ）、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ（Ｅ）、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ（Ｂ）、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ（Ｃ）を含む微生物体を提供する（図１、経路（５）Ｄ／Ｅ／Ｂ／Ｃ）。
さらなる実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリル酸経路を含み、メタクリル酸経路が、シトラマリルＣｏＡリアーゼ（Ｄ）、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ（Ｅ）、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ（Ｂ）、シトラコン酸イソメラーゼ（Ｇ）、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ（Ｈ）を含む微生物体を提供する（図１、経路（６）Ｄ／Ｅ／Ｂ／Ｇ／Ｈ）。その上さらなる実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリル酸経路を含み、メタクリル酸経路が、シトラマリルＣｏＡリアーゼ（Ｄ）、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ（Ｅ）、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ（Ｆ）、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ（Ｈ）を含む微生物体を提供する（図１、経路（７）Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｈ）。
別の実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリル酸経路を含み、メタクリル酸経路が、シトラマリルＣｏＡリアーゼ（Ｄ）、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ（Ｅ）、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ（Ｆ）、シトラコン酸イソメラーゼ（Ｇ）、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ（Ｃ）を含む微生物体を提供する（図１、経路（８）Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｃ）。さらに、本発明は、天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリル酸経路を含み、メタクリル酸経路が、アコニット酸デカルボキシラーゼ（Ｉ）、イタコン酸イソメラーゼ（Ｊ）、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ（Ｃ）を含む微生物体を提供する（図１、経路（９）Ｉ／Ｊ／Ｃ）。
さらにさらなる実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリル酸経路を含み、メタクリル酸経路が、アコニット酸デカルボキシラーゼ（Ｉ）、イタコン酸イソメラーゼ（Ｊ）、シトラコン酸イソメラーゼ（Ｇ）、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ（Ｈ）を含む微生物体を提供する（図１、経路（１０）Ｉ／Ｊ／Ｇ／Ｈ）。さらなる実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリル酸経路を含み、メタクリル酸経路が、アコニット酸デカルボキシラーゼ（Ｉ）、イタコニルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ（Ｌ）、シトラマリルＣｏＡデヒドラターゼ（Ｋ）、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ（Ｅ）、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ（Ｂ）、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ（Ｃ）を含む微生物体を提供する（図１、経路（１１）Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｅ／Ｂ／Ｃ）。
本発明は、天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリル酸経路を含み、メタクリル酸経路が、アコニット酸デカルボキシラーゼ（Ｉ）、イタコニルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ（Ｌ）、シトラマリルＣｏＡデヒドラターゼ（Ｋ）、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ（Ｅ）、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ（Ｂ）、シトラコン酸イソメラーゼ（Ｇ）、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ（Ｈ）を含む微生物体も提供する（図１、経路（１２）Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｅ／Ｂ／Ｇ／Ｈ）。その上さらなる実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリル酸経路を有する微生物体を含み、メタクリル酸経路が、アコニット酸デカルボキシラーゼ（Ｉ）、イタコニルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ（Ｌ）、シトラマリルＣｏＡデヒドラターゼ（Ｋ）、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ（Ｅ）、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ（Ｆ）、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ（Ｈ）を含む微生物体を提供する（図１、経路（１３）Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｅ／Ｆ／Ｈ）。さらなる実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリル酸経路を含み、メタクリル酸経路が、アコニット酸デカルボキシラーゼ（Ｉ）、イタコニルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ（Ｌ）、シトラマリルＣｏＡデヒドラターゼ（Ｋ）、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ（Ｅ）、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ（Ｆ）、シトラコン酸イソメラーゼ（Ｇ）、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ（Ｃ）を含む微生物体を提供する（図１、経路（１４）Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｃ）。
さらなる実施形態では、本発明は、メタクリル酸経路を有する、天然に存在しない微生物体であって、本明細書に記載する反応ならびに図１に示される例示的なメタクリル酸経路中に示す基質および生成物などの、アセチルＣｏＡおよびピルベートをシトラマレートに、シトラマレートをシトラコネートに、ならびにシトラコネートをメタクリレートに；アセチルＣｏＡおよびピルベートをシトラマリルＣｏＡに、シトラマリルＣｏＡをシトラマレートに、シトラマレートをシトラコネートに、ならびにシトラコネートをメタクリレート（ｍｅｔｈｙａｃｒｙｌａｔｅ）に；アコニテートをイタコネートに、イタコネートをイタコニルＣｏＡに、イタコニルＣｏＡをシトラマリルＣｏＡに、シトラマリルＣｏＡをシトラマレートに、シトラマレートをメサコネートに、メサコネートをメタクリレートになどからなる群から選択される、基質を生成物に転換する酵素またはタンパク質をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む、天然に存在しない微生物体を提供する。当業者は、これらは単なる例示に過ぎず、本明細書に開示される基質−生成物の対のいずれもが、所望の生成物を生成するのに適していることを理解し、当業者は、本明細書の教示に基づいて、基質を生成物に変換するためには、どの適切な活性が利用可能であるかについて容易に決定することができる。したがって、本発明は、天然に存在しない微生物体であって、酵素またはタンパク質をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含有し、酵素またはタンパク質が、図１に示される経路などのメタクリル酸経路の基質および生成物を転換する微生物体を提供する。さらに、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、クロトナーゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ（またはクロトニルＣｏＡヒドラターゼ、４−ヒドロキシ）、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼを含むメタクリル酸経路も提供される（実施例ＸＸＩＩおよび図２１を参照）。また、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、クロトナーゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼを含むメタクリル酸経路も提供される（実施例ＸＸＩＩおよび図２１を参照）。
本明細書では一般に、メタクリル酸経路を含有する微生物体について記載しているが、本発明はさらに、天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸経路の中間体を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む微生物体も提供することを理解されたい。例えば、本明細書に開示されるとおり、メタクリル酸経路を、図１に例示する。したがって、メタクリル酸を生成するメタクリル酸経路を含有する微生物体に加えて、本発明はさらに、メタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む、天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸経路の中間体、例えば、シトラマリルＣｏＡ、イタコニルＣｏＡ、イタコネート、シトラコネート、シトラマレートおよびメサコネートを生成する微生物体も提供する。
実施例に記載され、図１〜３０の経路に例示されるように、いずれかの所望の経路の中間体または生成物を生成する、天然に存在しない微生物体を生成するために、本明細書に開示される経路はいずれも利用され得ることが理解される。本明細書で開示されるように、中間体を生成するそのような微生物体を、下流の経路の酵素を発現する別の微生物体と組み合わせて使用して、所望の生成物を生成することができる。しかし、所望の生成物として、中間体を生成するために、メタクリル酸経路の中間体を生成する、天然に存在しない微生物体を利用することができることを理解されたい。
また、本発明は一部には、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートに至る途上の中心的な代謝中間体を通る炭素フラックスを改善するために工学的に操作された生合成経路も対象とする。本発明は、天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートに至る途上の種々の酵素的変換を触媒することができる酵素をコードする１つまたは複数の外因性遺伝子を有する微生物体を提供する。いくつかの実施形態では、これらの酵素的変換は、還元的トリカルボン酸（ＲＴＣＡ）回路の一部であり、これに限定されないが、炭水化物に基づく炭素フィードストックからの生成物の収率を含めた、生成物の収率を改善するために使用される。
工学的に操作される多数の経路において、炭水化物フィードストックに基づく生成物の最大収率の実現が、還元当量が不十分であること、または還元当量が喪失することおよび／もしくは炭素が喪失して副産物が生じることによって妨げられる。いくつかの実施形態によれば、本発明は、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートの収率を、（ｉ）炭素固定を、還元的ＴＣＡ回路を介して増強し、かつ／あるいは（ｉｉ）気体の炭素供給源、ならびに／またはシンガス構成成分、例として、ＣＯ、ＣＯ２および／もしくはＨ２からの追加の還元当量を利用可能にすることによって増加させる。シンガスに加えて、そのような気体の他の供給源には、これらに限定されないが、大気も含まれ、そうした供給源は、自然界に見出されるか、または生成される。
ＣＯ２固定還元的トリカルボン酸（ＲＴＣＡ）回路は、ＣＯ２同化作用のエネルギー吸収性のアナボリックな経路であり、この経路は、還元当量およびＡＴＰを使用する（図１２）。ＲＴＣＡ回路が１回転すると、２モルのＣＯ２が同化されて、１モルのアセチルＣｏＡが生じるか、または４モルのＣＯ２が同化されて、１モルのオキサロアセテートが生じる。こうした、アセチルＣｏＡがさらに利用できることによって、炭水化物に基づく炭素フィードストックから誘導される生成物分子の最大理論収率が改善される。例示的な炭水化物には、これらに限定されないが、グルコース、スクロース、キシロース、アラビノースおよびグリセロールが含まれる。
いくつかの実施形態では、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ酵素および／またはヒドロゲナーゼ酵素とカップリングさせた還元的ＴＣＡ回路を利用して、微生物が、シンガス、ＣＯ２、ＣＯ、Ｈ２および／または他の気体の炭素供給源を利用するのを可能にすることができる。特に、合成ガス（シンガス）は、主としてＨ２およびＣＯの、時にはいくらかの量のＣＯ２を含む混合物であり、石炭、コールオイル、天然ガス、バイオマスまたは有機廃棄物などの任意の有機フィードストックのガス化を経て得ることができる。多数のガス化プロセスが開発されており、ほとんどの設計が、部分的酸化に基づき、この場合、酸素を制限することによって、高温（５００〜１５００℃）での有機物質の全面燃焼を回避して、シンガスを、０．５：１〜３：１のＨ２／ＣＯ混合物としてもたらす。石炭に加えて、多くのタイプのバイオマスも、シンガス生成のために使用されており、再生可能な化学物質および燃料の生物学的生成のための安価なかつ多目的のフィードストックを代表する。二酸化炭素は、大気から、もしくは、例えば、タンクボンベから圧縮された形態（ｆｒｏｍ）で、または固体のＣＯ２の昇華を経て提供され得る。同様に、ＣＯおよび水素ガスも、試薬の形態で提供してもよく、および／または任意の所望の比で混合してもよい。気体炭素の他の形態には、例えば、メタノールまたは類似の揮発性有機溶媒が含まれ得る。
合成ガスおよび／または他の炭素供給源の構成成分は、還元的ＴＣＡ回路が作動するのに十分なＣＯ２、還元当量およびＡＴＰをもたらすことができる。ＲＴＣＡ回路が１回転すると、２モルのＣＯ２が同化されて、１モルのアセチルＣｏＡが生じ、これには、２ＡＴＰおよび４還元当量が必要である。ＣＯおよび／またはＨ２はそれぞれ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ酵素およびヒドロゲナーゼ酵素により、還元当量をもたらすことができる。還元当量は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＦＡＤＨ、還元型キノン、還元型フェレドキシン、還元型フラボドキシンおよびチオレドキシンの形態をとって生じ得る。還元当量、特に、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨおよび還元型フェレドキシンは、ＲＴＣＡ回路の酵素、例えば、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、フマル酸レダクターゼ、アルファ−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（あるいは、２−オキソグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アルファ−ケトグルタル酸シンターゼまたは２−オキソグルタル酸シンターゼとしても公知である）、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、およびイソクエン酸デヒドロゲナーゼのための補因子として働くことができる。それに代わって、これらの還元当量からの電子が、イオン勾配が生成する電子伝達鎖を通過する場合もあり、この場合、電子は、酸素、ニトレート、酸化型金属イオン、プロトンなどのアクセプター、または電極に渡される。次いで、イオン勾配は、ＡＴＰシンターゼまたは類似の酵素を介するＡＴＰの生成のために使用され得る。
還元的ＴＣＡ回路は、最初に、緑色硫黄光合成細菌Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ ｌｉｍｉｃｏｌａにおいて報告された（Ｅｖａｎｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．、５５巻：９２８〜９３４頁（１９６６年））。類似の経路が、いくつかの原核生物（プロテオバクテリア、緑色硫黄細菌および好熱性水素酸化細菌（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌｉｃ Ｋｎａｌｌｇａｓ ｂａｃｔｅｒｉａ））、ならびに硫黄依存性古細菌（Ｈｕｇｌｅｒら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８７巻：３０２０〜３０２７頁（２００５年）；Ｈｕｇｌｅｒら、Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、９巻：８１〜９２頁（２００７年））においても特徴付けられている。場合によっては、還元的および酸化的（クレブス）ＴＣＡ回路が、同じ生物体中に存在する（Ｈｕｇｌｅｒら、上記（２００７年）；Ｓｉｅｂｅｒｓら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８６巻：２１７９〜２１９４頁（２００４年））。いくつかのメタン産生菌および偏性嫌気性菌が、不完全な酸化的または還元的なＴＣＡ回路を保有し、これらの回路が機能して、生合成中間体を合成することができる（Ｅｋｉｅｌら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１６２巻：９０５〜９０８頁（１９８５年）；Ｗｏｏｄら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ．、２８巻：３３５〜３５２頁（２００４年））。
還元的ＴＣＡ回路の炭素を固定する主要な酵素は、アルファ−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、およびイソクエン酸デヒドロゲナーゼである。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼもしくはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼによるホスホエノールピルベートからオキサロアセテートへの転換の間に、またはリンゴ酸酵素によるピルベートからマレートへの転換によって、追加の炭素を固定することもできる。
ＴＣＡ回路中の酵素の多くが、可逆性であり、反応を還元的な方向にも酸化的な方向にも触媒することができる。しかし、ＴＣＡ回路の反応の中には、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて不可逆的な反応があり、したがって、異なる酵素を使用して、これらの反応を逆行的ＴＣＡ回路に必要な方向に触媒する。これらの反応は、（１）シトレートからオキサロアセテートおよびアセチルＣｏＡへの転換、（２）フマレートからスクシネートへの転換、および（３）スクシニルＣｏＡからアルファ−ケトグルタレートへの転換である。ＴＣＡ回路では、シトレートが、オキサロアセテートとアセチルＣｏＡとの縮合から形成される。逆行的反応、すなわち、シトレートのオキサロアセテートおよびアセチルＣｏＡへの切断は、ＡＴＰ依存性であり、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、またはシトリルＣｏＡシンテターゼおよびシトリルＣｏＡリアーゼにより触媒される。あるいは、クエン酸リアーゼをアセチルＣｏＡシンテターゼ、アセチルＣｏＡトランスフェラーゼまたはホスホトランスアセチラーゼ、および酢酸キナーゼにカップリングさせて、シトレートからアセチルＣｏＡおよびオキサロアセテートを形成することもできる。スクシネートからフマレートへの転換は、コハク酸デヒドロゲナーゼにより触媒され、一方、逆行的反応は、フマル酸レダクターゼにより触媒される。ＴＣＡ回路では、スクシニルＣｏＡが、アルファ−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体によるアルファ−ケトグルタレートのＮＡＤ（Ｐ）＋依存性の脱カルボキシル化から形成される。逆行的反応は、アルファ−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼにより触媒される。
逆行的トリカルボン酸回路を利用して、１）ＣＯ、２）ＣＯ２およびＨ２、３）ＣＯおよびＣＯ２、４）ＣＯおよびＨ２を含む合成ガス、ならびに５）ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２を含む合成ガスまたは他の気体の炭素供給源上でのアセチルＣｏＡにより誘導される生成物の生成を可能にし得る生物体は、以下の酵素活性、すなわち、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アルファ−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、スクシニルＣｏＡシンテターゼ、スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ、フマル酸レダクターゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチルＣｏＡシンテターゼ、アセチルＣｏＡトランスフェラーゼ、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ、およびフェレドキシンのいずれかを含むことができる（図１３を参照）。これらの活性に必要な酵素（ｅｎｚｙｍｅ ｅｎｚｙｍｅｓ）および対応する遺伝子を、本明細書に記載する。
シンガスまたは他の気体の炭素供給源からの炭素を、逆行的ＴＣＡ回路およびその構成成分を介して固定することができる。具体的には、炭素ガスを利用する経路の特定の構成成分を、アセチルＣｏＡからメタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートを形成するための経路と組み合わせると、外因性に供給されるかまたはＣＯから内因性に生成される二酸化炭素中に存在する炭素を、アセチルＣｏＡ中に固定するための効率的な機構をもたらすことによって、これらの生成物の高い収率が得られる。
いくつかの実施形態では、本発明の天然に存在しない微生物体におけるメタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路は、（１）ＣＯ、（２）ＣＯ２、（３）Ｈ２の任意の組合せまたはそれらの混合物を利用して、還元的ＴＣＡ回路の推進に加わることを含めて、還元が関与する生合成ステップの収率を増強することができる。
いくつかの実施形態では、メタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路を有する、天然に存在しない微生物体は、還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む。少なくとも１つの外因性核酸は、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニターゼ、およびアルファ−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択され；少なくとも１つの外因性酵素は、（１）ＣＯ、（２）ＣＯ２、（３）Ｈ２、（４）ＣＯ２およびＨ２、（５）ＣＯおよびＣＯ２、（６）ＣＯおよびＨ２、または（７）ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２の利用を可能にするのに十分な量で発現される一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、およびフェレドキシンから選択される。
いくつかの実施形態では、ある方法は、メタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路を有し、また、還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸も含む、天然に存在しない微生物体を培養する工程を含む。少なくとも１つの外因性核酸は、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニターゼ、およびアルファ−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される。さらに、そのような生物体はまた、（１）ＣＯ、（２）ＣＯ２、（３）Ｈ２、（４）ＣＯ２およびＨ２、（５）ＣＯおよびＣＯ２、（６）ＣＯおよびＨ２、または（７）ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２の利用を可能にするのに十分な量で発現される一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、およびフェレドキシンから選択される少なくとも１つの外因性酵素も含んで、生成物を生成することができる。
いくつかの実施形態では、メタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路を有する、天然に存在しない微生物体は、アセチルＣｏＡを通る炭素フラックスを増強するのに十分な量で発現される還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸をさらに含む。少なくとも１つの外因性核酸は、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニターゼ、およびアルファ−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される。
いくつかの実施形態では、メタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路を有する、天然に存在しない微生物体は、一酸化炭素および／または水素の存在下で還元当量の利用可能性を増強するのに十分な量で発現される酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、それにより、炭水化物に基づく炭素フィードストックを介して、酸化還元により制限される生成物の収率を増加させる。少なくとも１つの外因性核酸は、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、およびフェレドキシンから選択される。いくつかの実施形態では、本発明は、一酸化炭素または水素の存在下で還元当量の利用可能性を増強し、それにより、炭水化物に基づく炭素フィードストック、例として、糖、または気体の炭素供給源を介して、酸化還元により制限される生成物の収率を増加させる方法であって、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートを生成する条件下およびそれを生成するのに十分な期間、この天然に存在しない微生物体を培養する工程を含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、メタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路を有する、天然に存在しない微生物体は、それぞれ還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする２つの外因性核酸を含む。いくつかの実施形態では、メタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路を有する、天然に存在しない微生物体は、それぞれ還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする３つの外因性核酸を含む。いくつかの実施形態では、天然に存在しない微生物体は、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする３つの外因性核酸を含む。いくつかの実施形態では、天然に存在しない微生物体は、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする３つの外因性核酸を含む。いくつかの実施形態では、天然に存在しない微生物体は、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ；ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼまたはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ；およびＨ２ヒドロゲナーゼをコードする４つの外因性核酸を含む。いくつかの実施形態では、天然に存在しない微生物体は、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼをコードする２つの外因性核酸を含む。
いくつかの実施形態では、メタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路を有する、天然に存在しない微生物体は、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニルＣｏＡシンテターゼ、スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチルＣｏＡシンテターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、およびそれらの組合せから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む。
いくつかの実施形態では、メタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路を有する、天然に存在しない微生物体は、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、アセチルＣｏＡシンターゼ、フェレドキシン、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、およびそれらの組合せから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む。
いくつかの実施形態では、メタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路を有する、天然に存在しない微生物体は、（１）ＣＯ、（２）ＣＯ２、（３）ＣＯ２およびＨ２、（４）ＣＯおよびＨ２、または（５）ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２から選択される炭素フィードストックを利用する。いくつかの実施形態では、メタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路を有する、天然に存在しない微生物体は、還元当量のために水素を利用する。いくつかの実施形態では、メタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路を有する、天然に存在しない微生物体は、還元当量のためにＣＯを利用する。いくつかの実施形態では、メタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路を有する、天然に存在しない微生物体は、還元当量のためにＣＯと水素との組合せを利用する。
いくつかの実施形態では、メタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路を有する、天然に存在しない微生物体は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、およびリンゴ酸酵素から選択される酵素をコードする１つまたは複数の核酸をさらに含む。
いくつかの実施形態では、メタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路を有する、天然に存在しない微生物体は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、フマラーゼ、フマル酸レダクターゼ、スクシニルＣｏＡシンテターゼ、およびスクシニルＣｏＡトランスフェラーゼから選択される酵素をコードする１つまたは複数の核酸をさらに含む。
いくつかの実施形態では、メタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路を有する、天然に存在しない微生物体は、クエン酸リアーゼ、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、シトリルＣｏＡシンテターゼ、シトリルＣｏＡリアーゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニルＣｏＡシンテターゼ、スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチルＣｏＡシンテターゼ、およびフェレドキシンをコードする少なくとも１つの外因性核酸を有し得るか、または必要に応じて、それらをさらに含む。
本明細書に記載する、生成物の収率を増加させるための経路を、図に示される経路を含めた、本明細書に開示される経路のいずれかと組み合わせることができることは当業者に理解される。当業者は、所望の生成物に至る経路ならびにその経路の前駆体および中間体に応じて、本明細書および実施例で論じられる生成物の収率を改善するための特定の経路またはそのような経路の組合せを所望の生成物に至る経路と組み合わせて使用して、その生成物または経路の中間体の収率を増加させることができることを理解する。
本発明はまた、天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリル酸経路を有する微生物体を含み；（ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸が、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、または必要に応じて、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニターゼ、シトリルＣｏＡシンテターゼもしくはシトリルＣｏＡリアーゼから選択される還元的ＴＣＡ経路；（ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される還元的ＴＣＡ経路；あるいは（ｉｉｉ）少なくとも１つの外因性核酸が、ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼ、およびそれらの組合せから選択される酵素をコードすることをさらに含み；前記メタクリル酸経路が、（ａ）シトラマル酸シンターゼ、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ；（ｂ）シトラマル酸シンターゼ、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、シトラコン酸イソメラーゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ；（ｃ）シトラマル酸シンターゼ、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、シトラコン酸イソメラーゼ、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ；（ｄ）シトラマル酸シンターゼ、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ；（ｅ）シトラマリルＣｏＡリアーゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ；（ｆ）シトラマリルＣｏＡリアーゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、シトラコン酸イソメラーゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ；（ｇ）シトラマリルＣｏＡリアーゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ；（ｈ）シトラマリルＣｏＡリアーゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、シトラコン酸イソメラーゼ、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ；（ｉ）アコニット酸デカルボキシラーゼ、イタコン酸イソメラーゼ、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ；（ｊ）アコニット酸デカルボキシラーゼ、イタコン酸イソメラーゼ、シトラコン酸イソメラーゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ；（ｋ）アコニット酸デカルボキシラーゼ、イタコニルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、シトラマリルＣｏＡデヒドラターゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ；（ｌ）アコニット酸デカルボキシラーゼ、イタコニルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、シトラマリルＣｏＡデヒドラターゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、シトラコン酸イソメラーゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ；（ｍ）アコニット酸デカルボキシラーゼ、イタコニルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、シトラマリルＣｏＡデヒドラターゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ；（ｎ）アコニット酸デカルボキシラーゼ、イタコニルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、シトラマリルＣｏＡデヒドラターゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、シトラコン酸イソメラーゼ、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ；（ｏ）３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ；（ｐ）メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ；（ｑ）メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ；（ｒ）メチルマロニルＣｏＡムターゼ、アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ；（ｓ）メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ；（ｔ）メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−アミノ−２−メチルプロピオン酸トランスアミナーゼ、および３−アミノ−２−メチルプロピオン酸アンモニアリアーゼ；（ｕ）メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−アミノ−２−メチルプロピオン酸トランスアミナーゼ、および３−アミノ−２−メチルプロピオン酸アンモニアリアーゼ；（ｖ）４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ；（ｗ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、グルタミン酸ムターゼ、３−メチルアスパルターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ；（ｘ）アルファ−ケトグルタル酸レダクターゼ、２−ヒドロキシグルタミン酸ムターゼ、３−メチルリンゴ酸デヒドラターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ；（ｙ）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡシンテターゼ；（ｚ）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、エノイルＣｏＡヒドラターゼ、および３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ；（ａａ）４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、ビニルアセチルＣｏＡ Δ−イソメラーゼ、クロトナーゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼのいずれか；（ｂｂ）４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼ；（ｃｃ）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、クロトナーゼ、ブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、イソブチリルＣｏＡムターゼ、イソブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、およびメタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼ；（ｄｄ）乳酸デヒドロゲナーゼ、乳酸ＣｏＡトランスフェラーゼ、ラクトイルＣｏＡデヒドラターゼ、アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ；（ｅｅ）バリンアミノトランスフェラーゼ、２−ケトイソ吉草酸デヒドロゲナーゼ、イソブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、およびメタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼ；（ｆｆ）バリンアミノトランスフェラーゼ、２−ケトイソ吉草酸デヒドロゲナーゼ、イソブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、メタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼ、アセト乳酸シンターゼ、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ、およびジヒドロキシ酸デヒドラターゼ；（ｇｇ）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、クロトナーゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ；ならびに（ｈｈ）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、クロトナーゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼ
から選択される経路を含む微生物体も提供する。
本発明は、２−ヒドロキシイソ酪酸経路を有する、天然に存在しない微生物体であって、２−ヒドロキシイソ酪酸を生成するのに十分な量で発現される２−ヒドロキシイソ酪酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む微生物体をさらに提供する。そのような天然に存在しない微生物体は、（ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸が、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、または必要に応じて、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニターゼ、シトリルＣｏＡシンテターゼもしくはシトリルＣｏＡリアーゼから選択される還元的ＴＣＡ経路；（ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される還元的ＴＣＡ経路；あるいは（ｉｉｉ）少なくとも１つの外因性核酸は、ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼ、およびそれらの組合せから選択される酵素をコードすることをさらに含み得；ここで、前記２−ヒドロキシイソ酪酸経路は、（ａ）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、および２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼまたは２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼ；ならびに（ｂ）４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、ビニルアセチルＣｏＡ Δ−イソメラーゼ、クロトナーゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、および２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼまたは２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼのいずれか、から選択される経路を含む（図１６Ｃを参照）。前記天然に存在しない微生物体は、それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードし、この経路の酵素を最大で全てコードする２、３、４または５つの外因性核酸を含むことができる。
本発明は、天然に存在しない微生物体であって、３−ヒドロキシイソ酪酸を生成するのに十分な量で発現される３−ヒドロキシイソ酪酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む３−ヒドロキシイソ酪酸経路を有する微生物体を含む、微生物体をさらに提供する。前記天然に存在しない微生物体は、（ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸が、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、または必要に応じて、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニターゼ、シトリルＣｏＡシンテターゼもしくはシトリルＣｏＡリアーゼから選択される還元的ＴＣＡ経路；（ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される還元的ＴＣＡ経路；あるいは（ｉｉｉ）少なくとも１つの外因性核酸が、ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼ、およびそれらの組合せから選択される酵素をコードすることをさらに含み得；ここで、前記３−ヒドロキシイソ酪酸経路が、（ａ）４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ；ならびに（ｂ）４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、および３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼから選択される経路を含む（図１６Ｂを参照）。前記天然に存在しない微生物体は、それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする２つの外因性核酸を含むことができる。
本発明は、天然に存在しない微生物体であって、３−ヒドロキシイソ酪酸を生成するのに十分な量で発現される３−ヒドロキシイソ酪酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡ経路を有する微生物体を含む微生物体も提供する。前記天然に存在しない微生物体は、（ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸が、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、または必要に応じて、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニターゼ、シトリルＣｏＡシンテターゼもしくはシトリルＣｏＡリアーゼから選択される還元的ＴＣＡ経路；（ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される還元的ＴＣＡ経路；あるいは（ｉｉｉ）少なくとも１つの外因性核酸が、ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼ、およびそれらの組合せから選択される酵素をコードすることをさらに含み得；ここで、前記３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡ経路が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼを含む（図１６Ｂを参照）。
さらなる実施形態では、（ｉ）を含む微生物体は、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニルＣｏＡシンテターゼ、スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチルＣｏＡシンテターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシン、およびそれらの組合せから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含み；（ｉｉ）を含む微生物体は、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニルＣｏＡシンテターゼ、スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、およびそれらの組合せから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む。
そのような微生物体は、それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードし、経路の酵素を最大で全てコードする２、３、４、５、６または７つの外因性核酸を含むことができる。例えば、この微生物体は、（ａ）シトラマル酸シンターゼ、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼをコードする３つの外因性核酸；（ｂ）シトラマル酸シンターゼ、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、シトラコン酸イソメラーゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼをコードする４つの外因性核酸；（ｃ）シトラマル酸シンターゼ、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、シトラコン酸イソメラーゼ、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼをコードする４つの外因性核酸；（ｄ）シトラマル酸シンターゼ、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼをコードする３つの外因性核酸；（ｅ）シトラマリルＣｏＡリアーゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼをコードする４つの外因性核酸；（ｆ）シトラマリルＣｏＡリアーゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、シトラコン酸イソメラーゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼをコードする５つの外因性核酸；（ｇ）シトラマリルＣｏＡリアーゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼをコードする４つの外因性核酸；（ｈ）シトラマリルＣｏＡリアーゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、シトラコン酸イソメラーゼ、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼをコードする５つの外因性核酸；（ｉ）アコニット酸デカルボキシラーゼ、イタコン酸イソメラーゼ、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼをコードする３つの外因性核酸；（ｊ）アコニット酸デカルボキシラーゼ、イタコン酸イソメラーゼ、シトラコン酸イソメラーゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼをコードする４つの外因性核酸；（ｋ）アコニット酸デカルボキシラーゼ、イタコニルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、シトラマリルＣｏＡデヒドラターゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼをコードする６つの外因性核酸；（ｌ）アコニット酸デカルボキシラーゼ、イタコニルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、シトラマリルＣｏＡデヒドラターゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、シトラコン酸イソメラーゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼをコードする７つの外因性核酸；（ｍ）アコニット酸デカルボキシラーゼ、イタコニルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、シトラマリルＣｏＡデヒドラターゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼをコードする６つの外因性核酸；あるいは（ｎ）アコニット酸デカルボキシラーゼ、イタコニルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、シトラマリルＣｏＡデヒドラターゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、シトラコン酸イソメラーゼ、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼをコードする７つの外因性核酸；（ｏ）３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼをコードする１つの外因性核酸；（ｐ）メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼをコードする４つの外因性核酸；（ｑ）メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼをコードする５つの外因性核酸；（ｒ）メチルマロニルＣｏＡムターゼ、アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼをコードする３つの外因性核酸；（ｓ）メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼをコードする４つの外因性核酸；（ｔ）メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−アミノ−２−メチルプロピオン酸トランスアミナーゼ、および３−アミノ−２−メチルプロピオン酸アンモニアリアーゼをコードする４つの外因性核酸；（ｕ）メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−アミノ−２−メチルプロピオン酸トランスアミナーゼ、および３−アミノ−２−メチルプロピオン酸アンモニアリアーゼをコードする５つの外因性核酸；（ｖ）４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼをコードする３つの外因性核酸；（ｗ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、グルタミン酸ムターゼ、３−メチルアスパルターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼをコードする４つの外因性核酸；（ｘ）アルファ−ケトグルタル酸レダクターゼ、２−ヒドロキシグルタミン酸ムターゼ、３−メチルリンゴ酸デヒドラターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼをコードする４つの外因性核酸；（ｙ）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡシンテターゼをコードする５つの外因性核酸；（ｚ）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、エノイルＣｏＡヒドラターゼ、および３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼをコードする７つの外因性核酸；（ａａ）４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、ビニルアセチルＣｏＡ Δ−イソメラーゼ、クロトナーゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼのいずれかをコードする６つの外因性核酸；（ｂｂ）４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼをコードする３つの外因性核酸；（ｃｃ）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、クロトナーゼ、ブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、イソブチリルＣｏＡムターゼ、イソブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、およびメタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼ；（ｄｄ）乳酸デヒドロゲナーゼ、乳酸ＣｏＡトランスフェラーゼ、ラクトイルＣｏＡデヒドラターゼ、アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ；（ｅｅ）バリンアミノトランスフェラーゼ、２−ケトイソ吉草酸デヒドロゲナーゼ、イソブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、およびメタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼ；（ｆｆ）バリンアミノトランスフェラーゼ、２−ケトイソ吉草酸デヒドロゲナーゼ、イソブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、メタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼ、アセト乳酸シンターゼ、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ、およびジヒドロキシ酸デヒドラターゼ；（ｇｇ）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、クロトナーゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ；ならびに（ｈｈ）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、クロトナーゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼを含むことができる。
別の実施形態では、微生物体は、それぞれ（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）の酵素をコードする２、３、４または５つの外因性核酸を含むことができる。例えば、（ｉ）を含む微生物体（ａｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｏｒｇａｎｉｓｍ）は、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする４つの外因性核酸を含むことができ；（ｉｉ）を含む微生物体は、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼをコードする５つの外因性核酸を含むことができ；または（ｉｉｉ）を含む微生物体は、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼをコードする２つの外因性核酸を含むことができる。
本発明は、天然に存在しない微生物体をさらに提供し、この微生物体は、２−ヒドロキシイソ酪酸を生成するのに十分な量で発現される２−ヒドロキシイソ酪酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む２−ヒドロキシイソ酪酸経路を有する微生物体を含み、前記２−ヒドロキシイソ酪酸経路の酵素は、図１６Ｃに示される酵素から選択され；前記天然に存在しない微生物体は、（ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸が、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、または必要に応じて、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニターゼ、シトリルＣｏＡシンテターゼもしくはシトリルＣｏＡリアーゼから選択される還元的ＴＣＡ経路；（ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される還元的ＴＣＡ経路；あるいは（ｉｉｉ）少なくとも１つの外因性核酸が、ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼ、およびそれらの組合せから選択される酵素をコードすることをさらに含む。
さらなる実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物体を提供し、この微生物体は、３−ヒドロキシイソ酪酸を生成するのに十分な量で発現される３−ヒドロキシイソ酪酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む３−ヒドロキシイソ酪酸経路を有する微生物体を含み；ここで、前記２−ヒドロキシイソ酪酸経路の酵素は、図１６Ｂに示される酵素から選択され；前記天然に存在しない微生物体は、（ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、ここで、前記少なくとも１つの外因性核酸が、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、または必要に応じて、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニターゼ、シトリルＣｏＡシンテターゼもしくはシトリルＣｏＡリアーゼから選択される還元的ＴＣＡ経路；（ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、ここで、前記少なくとも１つの外因性核酸が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される還元的ＴＣＡ経路；あるいは（ｉｉｉ）少なくとも１つの外因性核酸が、ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼ、およびそれらの組合せから選択される酵素をコードすることをさらに含む。
本発明は、一部は、シンガスまたはその構成成分である水素、二酸化炭素および一酸化炭素を還元当量の供給源として使用して、生成物の理論収率を改善することを対象とする。工学的に操作される多数の経路において、炭水化物フィードストックに基づく生成物の最大収率の実現が、還元当量が不十分であること、または還元当量が喪失することおよび／もしくは炭素が喪失して副産物が生じることによって妨げられる。水素および／または一酸化炭素から、十分な還元当量を供給することができる場合、炭水化物フィードストック上のいくつかの生成物の理論収率が実質的に増加する。例えば、ＭＡＡ、２−ヒドロキシイソブチレートおよび３−ヒドロキシイソブチレートの理論収率は、Ｈ２の存在下において、２モル／グルコース１モルまで増加する。
還元当量または電子を、合成ガスの構成成分、例として、ＣＯおよびＨ２から、それぞれ一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＣＯＤＨ）酵素およびヒドロゲナーゼ酵素を使用して抽出することができる。次いで、還元当量は、アクセプター、例として、酸化型フェレドキシン、酸化型キノン、酸化型チトクローム、ＮＡＤＰ＋、水または過酸化水素に渡されて、それぞれ還元型フェレドキシン、還元型キノン、還元型チトクローム、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、Ｈ２または水を形成する。還元型フェレドキシンおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路および還元的ＴＣＡ回路の種々の酵素のための酸化還元伝達体として働くことができるので、特に有用である。
ここで、本発明者らは、ＣＯおよび／またはＨ２からの追加の酸化還元が利用可能なことにより、どのように還元生成物、例として、メタクリル酸、２−ヒドロキシイソブチレートおよび３−ヒドロキシイソブチレートの収率が改善され得るかの具体例を示す。
メタクリル酸（ＭＡＡ）、３−ヒドロキシ酪酸および２−ヒドロキシイソ酪酸は、例示的な還元生成物である。発酵を通してのＭＡＡの生成は、グルコース１モル当たり１．３３モルのＭＡＡの理論収率を有する。ＭＡＡは最も一般に、原材料のアセトンおよびシアン化水素を原材料として使用して、アセトンシアノヒドリン（ＡＣＨ）ルートから生成される。中間体のシアノヒドリンを、硫酸を用いて、メタクリルアミドの硫酸エステルに転換し、これを加水分解して、硫酸水素アンモニウムおよびＭＡＡを得る。他の生産体は、イソブチレンから開始するか、または同等に、ｔｅｒｔ−ブタノールから開始し、これを酸化して、メタクロレインを得、再び酸化を行って、メタクリル酸を得る。次いで、ＭＡＡを、メタノールを用いてエステル化して、ＭＭＡを得る。メタクリル酸は産業上、そのエステルの調製において使用され、これらは、まとめてメタクリレートとして公知であり、例として、メチルメタクリレートがある。メタクリレートは、多数の用途、最も顕著には、ポリマーの製造における用途を有する。
Ｃ６Ｈ１２Ｏ６→１．３３Ｃ４Ｈ６Ｏ２＋０．６７ＣＯ２＋２Ｈ２Ｏ
フィードストックを組み合わせる戦略を、ＭＡＡの生成に適用する場合、シンガスから生成される還元当量（ｅｑｕｉｖｌｅｎｔ）により、グルコースからのＭＡＡの理論収率を、グルコース１モル当たり２モルのＭＡＡまで増加させることができ、この経路を、図１６Ａおよび１６Ｂに詳述する。
１Ｃ６Ｈ１２Ｏ６＋２ＣＯ２＋６Ｈ２→２Ｃ４Ｈ６Ｏ２＋６Ｈ２Ｏ
または
１Ｃ６Ｈ１２Ｏ６＋２ＣＯ＋４Ｈ２→２Ｃ４Ｈ６Ｏ２＋４Ｈ２Ｏ
同様に、３−ヒドロキシイソ酪酸の、発酵を通しての生成も、フィードストックを組み合わせる戦略により改善することができる。３−ヒドロキシイソ酪酸の、発酵を通しての生成により、グルコース１モル当たり１．３３モルの３−ヒドロキシイソ酪酸の理論収率が得られる。
３Ｃ６Ｈ１２Ｏ６→４Ｃ４Ｈ８Ｏ３＋２ＣＯ２＋２Ｈ２Ｏ
フィードストックを組み合わせる戦略を、３−ヒドロキシイソ酪酸の生成に適用する場合、シンガスから生成される還元当量により、グルコースからの３−ヒドロキシイソ酪酸の理論収率を、グルコース１モル当たり２モルの３−ヒドロキシイソ酪酸まで増加させることができ、この経路を、図１６Ａおよび１６Ｂに詳述する。
１Ｃ６Ｈ１２Ｏ６＋２ＣＯ２＋６Ｈ２→２Ｃ４Ｈ８Ｏ３＋４Ｈ２Ｏ
同様に、２−ヒドロキシイソ酪酸の、発酵を通しての生成も、フィードストックを組み合わせる戦略により改善することができる。２−ヒドロキシイソ酪酸の、発酵を通しての生成により、グルコース１モル当たり１．３３モルの２−ヒドロキシイソ酪酸の理論収率が得られる。
３Ｃ６Ｈ１２Ｏ６→４Ｃ４Ｈ８Ｏ３＋２ＣＯ２＋２Ｈ２Ｏ
フィードストックを組み合わせる戦略を、３−ヒドロキシイソ酪酸の生成に適用する場合、シンガスから生成される還元当量により、グルコースからの３−ヒドロキシイソ酪酸の理論収率を、グルコース１モル当たり２モルの２−ヒドロキシイソ酪酸まで増加させることができ、この経路を、図１６Ｂに詳述する。
１Ｃ６Ｈ１２Ｏ６＋２ＣＯ２＋６Ｈ２→２Ｃ４Ｈ８Ｏ３＋４Ｈ２Ｏ
また、本発明は、一部は、炭素固定を還元的ＴＣＡ回路を介して増強することによって、生成物分子に至る途上の中心的な代謝中間体であるアセチルＣｏＡを通る炭素フラックスを増大させることも対象とする。例示的な生成物分子には、メタクリル酸および２−ヒドロキシイソブチレートが含まれるが、本明細書において提供される教示および手引きを考慮すると、アセチルＣｏＡを基本要素として有する任意の生成物分子が、アセチルＣｏＡを通る炭素フラックスの増加を通して、生成の増強を示すことができることが、当業者により認識される。本発明は、天然に存在しない微生物体であって、アセチルＣｏＡに至る途上の種々の酵素的変換を触媒することができる酵素をコードする１つまたは複数の外因性遺伝子を有する微生物体を提供する。いくつかの実施形態では、これらの酵素的変換は、還元的トリカルボン酸（ＲＴＣＡ）回路の一部であり、炭水化物に基づく炭素フィードストックからの生成物の収率を改善するために使用される。他の実施形態では、これらの酵素的変換は、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の一部である。
ＣＯ２固定還元的トリカルボン酸（ＲＴＣＡ）回路は、ＣＯ２同化作用のエネルギー吸収性のアナボリックな経路であり、この経路は、ＮＡＤ（Ｐ）ＨおよびＡＴＰを使用する。ＲＴＣＡ回路が１回転すると、２モルのＣＯ２が同化されて、１モルのアセチルＣｏＡが生じるか、または４モルのＣＯ２が同化されて、１モルのオキサロアセテートが生じる。こうした、アセチルＣｏＡのさらなる利用可能性によって、炭水化物に基づく炭素フィードストックから誘導される生成物分子の最大理論収率が改善される。例示的な炭水化物には、これらに限定されないが、グルコース、スクロース、キシロース、アラビノースおよびグリセロールが含まれる。本明細書に記載する例示的な生成物分子のための経路は全て、アセチルＣｏＡを通って進行することに留意されたい。
糖から図１６Ｃ、１６Ｄおよび１６Ｅに示される経路を経るＭＡＡの生成は、還元的ＴＣＡ回路活性の非存在下において、消費されるグルコース１モル当たり１モルのＭＡＡの最大収率を有する。還元的ＴＣＡ回路により炭素を固定することによって、これらの経路の収率は、糖からのＭＡＡの最大理論収率まで増加する。図１６Ｃおよび１６Ｄは、還元的ＴＣＡ回路により生成される追加の炭素が、どのようにこれらの経路により生成されるメタクリル酸の収率を、１モル／グルコース１モルから１．３３モル／グルコース１モルに増加させるかを示す、例示的なフラックス分布である。
Ｃ６Ｈ１２Ｏ６→１．３３Ｃ４Ｈ６Ｏ２＋０．６７ＣＯ２＋２Ｈ２Ｏ
一実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物体であって、メタクリレートエステルを生成するのに十分な量で発現されるメタクリレートエステル経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリレートエステル経路を有する微生物体を含み；（ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、ここで、前記少なくとも１つの外因性核酸が、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、または必要に応じて、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニターゼ、シトリルＣｏＡシンテターゼもしくはシトリルＣｏＡリアーゼから選択される還元的ＴＣＡ経路；（ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、ここで、前記少なくとも１つの外因性核酸が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される還元的ＴＣＡ経路；あるいは（ｉｉｉ）少なくとも１つの外因性核酸が、ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼ、およびそれらの組合せから選択される酵素をコードすることをさらに含み；ここで、前記メタクリレートエステル経路は、アルコールトランスフェラーゼまたはエステルを形成する酵素、およびデヒドラターゼを含む、微生物体を提供する。一態様では、デヒドラターゼは、３−ヒドロキシイソブチレートエステルまたは２−ヒドロキシイソブチレートエステルを前記メタクリレートエステルに転換する。一態様では、アルコールトランスフェラーゼは、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡを３−ヒドロキシイソブチレートエステルに転換するか、または２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡを２−ヒドロキシイソブチレートエステルに転換する。
一実施形態では、本発明は、メタクリレートエステルを生成するのに十分な量で発現されるメタクリレートエステル経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリレート（ｍｅｔｈａｃｙｒｌａｔｅ）エステル経路をさらに含む微生物体であって、前記メタクリレートエステル経路が、（ａ）３−ヒドロキシイソ酪酸ＣｏＡトランスフェラーゼもしくは３−ヒドロキシイソ酪酸ＣｏＡシンテターゼ；アルコールトランスフェラーゼ；およびデヒドラターゼ；（ｂ）３−ヒドロキシイソブチレートエステルを形成する酵素およびデヒドラターゼ；（ｃ）２−ヒドロキシイソ酪酸ＣｏＡトランスフェラーゼもしくは２−ヒドロキシイソ酪酸ＣｏＡシンテターゼ；アルコールトランスフェラーゼ；およびデヒドラターゼ；または（ｄ）２−ヒドロキシイソブチレートエステルを形成する酵素およびデヒドラターゼから選択される経路を含む、微生物体を提供する。別の態様では、（ｉ）を含む微生物体は、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニルＣｏＡシンテターゼ、スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチルＣｏＡシンテターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシン、およびそれらの組合せから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む。別の態様では、（ｉｉ）を含む微生物体は、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニルＣｏＡシンテターゼ、スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、およびそれらの組合せから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む。
一態様では、この微生物体は、それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする２つの外因性核酸を含む。別の態様では、前記２つの外因性核酸は、アルコールトランスフェラーゼおよびデヒドラターゼ、またはそれに代わって、エステルを形成する酵素およびデヒドラターゼをコードする。
一実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物体（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ）を提供し、ここで、（ｉ）を含む前記微生物体が、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする４つの外因性核酸を含むか；（ｉｉ）を含む前記微生物体が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼをコードする５つの外因性核酸を含むか；または（ｉｉｉ）を含む前記微生物体が、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼをコードする２つの外因性核酸を含む。
一実施形態では、本発明は、メタクリレートエステルを生成するための方法であって、メタクリレートエステルを生成する条件下およびそれを生成するのに十分な期間、本明細書に記載する天然に存在しない微生物体を培養する工程を含む方法を提供する。
一般に、代謝反応、その反応体または生成物について言及しつつ、あるいは特に、言及する代謝反応、反応体もしくは生成物と関連があるかもしくはそれを触媒する酵素、または言及する代謝反応、反応体もしくは生成物と関連があるタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸または遺伝子に言及しつつ、本明細書において本発明を記載する。本明細書で別段明示的に述べられていない限り、反応への言及はまた、反応の反応体および生成物への言及にもなることを当業者は理解する。同様に、本明細書で別段明示的に述べられていない限り、反応体または生成物への言及はまた、反応にも言及しており、これらの代謝構成要素のいずれかへの言及は、言及する反応、反応体もしくは生成物を触媒する酵素または言及する反応、反応体もしくは生成物に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子にも言及している。同様にして、代謝生化学、酵素学およびゲノミクスの周知の分野を考慮すると、本明細書における遺伝子またはコード核酸への言及はまた、対応するコードされる酵素およびそれが触媒する反応または反応と関連があるタンパク質、ならびにその反応の反応体および生成物への言及にもなる。
本明細書で開示されるように、生成物であるメタクリル酸、および他の中間体は、カルボン酸であり、これらは、完全プロトン化形態、部分的プロトン化形態および完全脱プロトン化形態を含めた、種々のイオン化の形態をとって存在し得る。したがって、接尾語の「〜エート（−ａｔｅ）」または酸の形を互換的に使用して、遊離酸の形態および任意の脱プロトン化形態の両方を記載することができ、これは、特に、イオン化形態は、その中で、化合物が見出されるｐＨに依存することが公知であるからである。カルボン酸生成物または中間体には、カルボン酸生成物または経路の中間体のエステル形態、例として、Ｏ−カルボキシレートエステルおよびＳ−カルボキシレートエステルが含まれることを理解されたい。Ｏ−およびＳ−カルボキシレートは、Ｃ１〜Ｃ６である低級アルキルの、分枝鎖または直鎖のカルボキシレートを含むことができる。いくつかのそのようなＯ−またはＳ−カルボキシレートとして、非限定的に、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−プロピル、ｓｅｃ−ブチルおよびｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルのＯ−またはＳ−カルボキシレートが挙げられ、これらはいずれも、不飽和をさらに保有することができ、それらには、例えば、プロペニル、ブテニル、ペンチルおよびヘキセニルのＯ−またはＳ−カルボキシレートがある。Ｏ−カルボキシレートは、生合成経路の生成物である場合がある。生合成経路を介して入手される例示的なＯ−カルボキシレートとして、非限定的に、メチルメタクリレート、エチルメタクリレートおよびｎ−プロピルメタクリレートを挙げることができる。生合成により入手し得る他のＯ−カルボキシレートとして、脂肪アルコール、例として、ヘプチルアルコール、オクチルアルコール、ノニルアルコール、デシルアルコール、ウンデシルアルコール、ラウリルアルコール、トリデシルアルコール、ミリスチルアルコール、ペンタデシルアルコール、セチルアルコール、パルミトリルアルコール、ヘプタデシルアルコール、ステアリルアルコール、ノナデシルアルコール、アラキジルアルコール、ヘンイコシルアルコールおよびベヘニルアルコールから誘導される、中鎖〜長鎖の基、すなわちＣ７〜Ｃ２２のＯ−カルボキシレートエステルを挙げることができ、それらのいずれも必要に応じて、分枝していてもよく、かつ／または不飽和を含有してもよい。Ｏ−カルボキシレートエステルはまた、化学的プロセス、例として、遊離カルボン酸の生成物のエステル化、またはＯ−もしくはＳ−カルボキシレートのエステル交換反応を介して入手することもできる。Ｓ−カルボキシレートは、例えば、ＣｏＡ Ｓ−エステル、システイニルＳ−エステル、アルキルチオエステル、ならびに種々のアリールチオエステルおよびヘテロアリールチオエステルである。さらに、メタクリルＣｏＡ中間体を介するメタクリル酸エステルの形成も提案されている（ＷＯ／２００７／０３９４１５および米国特許第７，９０１，９１５号）。メタクリレートから、メタクリルＣｏＡシンテターゼをＷＯ／２００７／０３９４１５および米国特許第７，９０１，９１５号の記載のとおり使用してか、またはメタクリルＣｏＡトランスフェラーゼを適用することによって、メタクリルＣｏＡを形成することができる（図２および実施例ＩＩＩを参照）。メタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼは、これらに限定されないが、アセチルＣｏＡ、スクシニルＣｏＡ、ブチリルＣｏＡおよびプロピオニルＣｏＡを含めた、いくつかのＣｏＡ供与体から、ＣｏＡ部分をメタクリレートに移すことができる。図１に示される経路、またはＷＯ／２００９／１３５０７４もしくは米国公開第２００９／０２７５０９６号に記載されている経路から、メタクリレートを形成することができる。それに代わって、ＷＯ／２００９／１３５０７４の記載のとおり、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡ、３−ヒドロキシイソブチレートまたはイソブチリルＣｏＡから、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼまたはイソブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼを介して、メタクリリルＣｏＡを生成することもできる。
したがって、本発明は、メタクリレートエステルを生成するための微生物体をさらに提供する。そのような生物体は、メタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼを含むメタクリレートエステル経路を含むことができる。そのような微生物体は、メタクリリルＣｏＡシンテターゼおよび／またはアルコールトランスフェラーゼを含むメタクリレートエステル経路をさらに含むことができる（図２および実施例ＩＩＩを参照）。これらに限定されないが、本明細書に開示される（実施例ＩおよびＶ〜ＸＩＶ、ならびに図１〜１１を参照）か、またはＷＯ２００９／１３５０７４もしくは米国公開第２００９／０２７５０９６号に記載されているメタクリル酸経路を含めた、メタクリル酸経路またはメタクリリルＣｏＡ経路を含有する微生物体を含有するように、メタクリレートエステルを生成する、そのような生物体を工学的に作製することができることが理解される。したがって、開示される、メタクリル酸を生成する微生物体はいずれも、メタクリレートエステルを生成するのに十分な量で発現されるメタクリレートエステル経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸をさらに含むことができ、前記メタクリレートエステル経路は、メタクリリルＣｏＡシンテターゼ、メタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼ、およびアルコールトランスフェラーゼを含む。メタクリル酸からメタクリレートエステルへの例示的な酵素的および化学的な転換が、実施例ＩＶに記載される。
したがって、本発明は、メタクリレートエステル経路を含み、図１および３〜１１、ならびに実施例ＩおよびＶ〜ＸＩＶに記載されるメタクリル酸経路を含めた、本明細書に開示されるメタクリル酸経路をさらに含む微生物体をさらに提供する。特定の実施形態では、メタクリレートエステル経路を含む微生物体は、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ；メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ；メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ；メチルマロニルＣｏＡムターゼ、アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ；メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ；メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−アミノ−２−メチルプロピオン酸トランスアミナーゼ、および３−アミノ−２−メチルプロピオン酸アンモニアリアーゼ；メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−アミノ−２−メチルプロピオン酸トランスアミナーゼ、および３−アミノ−２−メチルプロピオン酸アンモニアリアーゼ；４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ；アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、グルタミン酸ムターゼ、３−メチルアスパルターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ；アルファ−ケトグルタル酸レダクターゼ、２−ヒドロキシグルタミン酸ムターゼ、３−メチルリンゴ酸デヒドラターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ；アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡシンテターゼ；アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、エノイルＣｏＡヒドラターゼ、および３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ；４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、ビニルアセチルＣｏＡ Δ−イソメラーゼ、クロトナーゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼのいずれか；ならびに４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼから選択されるメタクリル酸経路をさらに含む（ｃｏｍｍｐｒｉｓｅ）（実施例Ｖ〜ＸＩＶを参照）。
例示的な、メタクリル酸を生成することが可能である天然に存在しない微生物体を、本明細書に開示する。例えば、スクシニルＣｏＡが前駆体であるメタクリル酸経路が提供される（実施例Ｖ〜ＶＩ、図３および４を参照）。一実施形態では、天然に存在しない微生物体は、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリル酸経路を有し、メタクリル酸経路が、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼおよび３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼを含む（実施例ＶおよびＶＩならびに図３を参照）。別の実施形態では、天然に存在しない微生物体は、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリル酸経路を有し、メタクリル酸経路が、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼを含む（実施例Ｖを参照）。さらに、天然に存在しない微生物体は、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリル酸経路を有し得、メタクリル酸経路が、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−アミノ−２−メチルプロピオン酸トランスアミナーゼ、および３−アミノ−２−メチルプロピオン酸アンモニアリアーゼを含む（実施例ＶＩおよび図４を参照）。
前駆体として４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを有するメタクリル酸経路を含有する天然に存在しない微生物体がさらに提供される。１つのそのような実施形態は、メタクリル酸経路を有する天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、メタクリル酸経路が、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼを含む微生物体である（実施例ＶＩＩおよび図５を参照）。あるいは、この経路は、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ；およびメタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼを含み得る。
さらに、天然に存在しない微生物体であって、アルファ−ケトグルタル酸を前駆体として有するメタクリル酸経路を含有する微生物体も提供される。１つのそのような実施形態は、メタクリル酸経路を有する天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、メタクリル酸経路が、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、グルタミン酸ムターゼ、３−メチルアスパルターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼを含む微生物体である（実施例ＶＩＩＩおよび図６を参照）。さらに別の実施形態では、天然に存在しない微生物体は、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリル酸経路を有し、メタクリル酸経路が、アルファ−ケトグルタル酸レダクターゼ、２−ヒドロキシグルタミン酸ムターゼ、３−メチルリンゴ酸デヒドラターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼを含む（実施例ＩＸおよび図７を参照）。
さらに別の実施形態では、メタクリル酸経路を含有する天然に存在しない微生物体は、前駆体としてアセチルＣｏＡを有する。例えば、天然に存在しない微生物体は、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリル酸経路を有し得、メタクリル酸経路が、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡシンテターゼを含む（実施例Ｘおよび図８を参照）。別の実施形態では、天然に存在しない微生物体は、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリル酸経路を有し、メタクリル酸経路が、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、エノイルＣｏＡヒドラターゼ、および３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼを含む（実施例Ｘを参照）。
さらなる実施形態では、天然に存在しない微生物体は、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを前駆体として有するメタクリル酸を含有することができる。例えば、天然に存在しない微生物体は、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリル酸経路（ｐａｔｈａｙ）を有し、前記メタクリル酸経路は、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ；ビニルアセチルＣｏＡ Δ−イソメラーゼ；クロトナーゼ；３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ；２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ；およびメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼを含む（実施例ＸＩＶおよび図８を参照）。
さらに別の実施形態では、天然に存在しない微生物体は、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリル酸経路を有し、メタクリル酸経路が、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、クロトナーゼ、ブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、イソブチリルＣｏＡムターゼ、イソブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、およびメタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼを含む（実施例ＸＩおよび図９を参照）。
前駆体としてピルベートを有するメタクリル酸経路を含有する天然に存在しない微生物体がさらに提供される。例えば、天然に存在しない微生物体は、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリル酸経路を有し、メタクリル酸経路が、乳酸デヒドロゲナーゼ、ラクテートＣｏＡトランスフェラーゼ、ラクトイルＣｏＡデヒドラターゼ、アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼを含む微生物体を提供する（実施例ＸＩＩおよび図１０を参照）。
前駆体として２−ケトイソバレレートを有するメタクリル酸経路を含有する天然に存在しない微生物体も提供される。例えば、本発明は、天然に存在しない微生物体は、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリル酸経路を有し得、メタクリル酸経路が、バリンアミノトランスフェラーゼ、２−ケトイソ吉草酸デヒドロゲナーゼ、イソブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、およびメタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼを含む（実施例ＸＩＩＩおよび図１１を参照）。そのようなメタクリル酸経路は、バリンを２−ケトイソバレレートに転換（図１１）するバリンアミノトランスフェラーゼをさらに含有し得る。さらに、そのようなメタクリル酸経路は、アセト乳酸シンターゼ、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼおよびジヒドロキシ酸デヒドラターゼなど、ピルベートを２−ケトイソバレレートに転換（図１１）する酵素をさらに含有し得る（実施例ＸＩＩＩを参照）。
本発明はまた、天然に存在しない微生物体であって、メタクリレートエステルを生成するのに十分な量で発現されるメタクリレートエステル経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリレートエステル経路を有し、前記メタクリレートエステル経路が、メタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼおよびアルコールトランスフェラーゼを含む微生物体も提供する。さらなる実施形態では、そのようなメタクリレートエステル経路は、メタクリリルＣｏＡシンテターゼをさらに含むことができる。特定の実施形態では、メタクリレートエステル経路を有する微生物体は、メタクリリルＣｏＡおよびアルコールトランスフェラーゼをコードする２つの外因性核酸を含むことができる。その上さらなる実施形態では、本発明は、メタクリレートエステル経路を有する微生物体であって、メタクリリルＣｏＡシンテターゼ、メタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼ、およびアルコールトランスフェラーゼをコードする３つの外因性核酸を含むことができる微生物体を提供する。
本発明の天然に存在しない微生物体を、１つまたは複数のメタクリル酸生合成経路に関与する酵素またはタンパク質の１つまたは複数をコードする発現可能な核酸を導入することによって生成することができる。生合成のために選ばれる宿主の微生物体に応じて、特定のメタクリル酸生合成経路の一部または全部についての核酸を発現させることができる。例えば、所望の生合成経路についての１つまたは複数の酵素またはタンパク質が、選ばれた宿主に欠損している場合、欠損している酵素（複数可）またはタンパク質（複数可）のための発現可能な核酸を宿主に導入し、続いて、外因性の発現を行う。あるいは、選ばれた宿主がいくつかの経路の遺伝子の内因性の発現を示すが、他の遺伝子は欠損している場合には、メタクリル酸の生合成を達成するには、欠損している酵素（複数可）またはタンパク質（複数可）についてのコード核酸が必要である。したがって、本発明の天然に存在しない微生物体を、外因性の酵素もしくはタンパク質の活性を導入して、所望の生合成経路を得ることによって生成することができ、または１つもしくは複数の内因性の酵素もしくはタンパク質と一緒になって、所望の生成物、例として、メタクリル酸を生成する、１つもしくは複数の外因性の酵素もしくはタンパク質の活性を導入することによって、所望の生合成経路を得ることができる。
宿主の微生物体を、例えば、細菌、酵母、真菌、または発酵プロセスに適用できる多様な他の微生物のいずれかから選択することができ、天然に存在しない微生物体を、例えば、細菌、酵母、真菌、または発酵プロセスに適用できる多様な他の微生物で生成することができる。例示的な細菌には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ、Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｅｔｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａから選択される種が含まれる。例示的な酵母または真菌には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ａｒｒｈｉｚｕｓ、Ｒｈｉｚｏｂｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどから選択される種が含まれる。Ｅ．ｃｏｌｉが、特に有用な宿主の生物体である。これは、Ｅ．ｃｏｌｉが、遺伝子工学に適している、十分に特徴付けられた微生物体であるからである。他の特に有用な宿主の生物体には、酵母、例として、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが含まれる。任意の適切な宿主の微生物体を使用して、代謝および／または遺伝子の改変を導入して、所望の生成物を生成することができることが理解される。
選択される宿主の微生物体の、メタクリル酸の生合成経路、メタクリレートエステルの生合成経路、３−ヒドロキシイソブチレートの生合成経路および／または２−ヒドロキシイソブチレートの生合成経路の構成要素に応じて、本発明の天然に存在しない微生物体は、少なくとも１つの、外因性に発現されるメタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路のコード核酸、そして最大では、１つまたは複数のメタクリル酸の生合成経路、メタクリレートエステルの生合成経路、３−ヒドロキシイソブチレートの生合成経路および／または２−ヒドロキシイソブチレートの生合成経路のためのコード核酸を全て含む。例えば、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートの生合成を、経路の酵素またはタンパク質が欠損している宿主において、対応するコード核酸の外因性の発現を通して確立することができる。メタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路の全ての酵素またはタンパク質が欠損している宿主では、前記経路中の全ての酵素またはタンパク質の外因性の発現を含めることができるが、宿主が経路の酵素またはタンパク質の少なくとも１つを含有する場合でも、該経路の全ての酵素またはタンパク質を発現させることができることが理解される。例えば、メタクリル酸を生成するための、経路中の全ての酵素またはタンパク質の外因性の発現、例として、シトラマル酸シンターゼ（Ａ）、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ（Ｂ）、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ（Ｃ）（図１、経路（１）Ａ／Ｂ／Ｃ）；シトラマル酸シンターゼ（Ａ）、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ（Ｂ）、シトラコン酸イソメラーゼ（Ｇ）、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ（Ｈ）（図１、経路（２）Ａ／Ｂ／Ｇ／Ｈ）；シトラマル酸シンターゼ（Ａ）、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ（Ｆ）、シトラコン酸イソメラーゼ（Ｇ）、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ（Ｃ）（図１、経路（３）Ａ／Ｆ／Ｇ／Ｃ）；シトラマル酸シンターゼ（Ａ）、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ（Ｆ）、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ（Ｈ）（図１、経路（４）Ａ／Ｆ／Ｈ）；シトラマリルＣｏＡリアーゼ（Ｄ）、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ（Ｅ）、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ（Ｂ）、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ（Ｃ）（図１、経路（５）Ｄ／Ｅ／Ｂ／Ｃ）；シトラマリルＣｏＡリアーゼ（Ｄ）、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ（Ｅ）、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ（Ｂ）、シトラコン酸イソメラーゼ（Ｇ）、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ（Ｈ）（図１、経路（６）Ｄ／Ｅ／Ｂ／Ｇ／Ｈ）；シトラマリルＣｏＡリアーゼ（Ｄ）、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ（Ｅ）、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ（Ｆ）、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ（Ｈ）（図１、経路（７）Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｈ）；シトラマリルＣｏＡリアーゼ（Ｄ）、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ（Ｅ）、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ（Ｆ）、シトラコン酸イソメラーゼ（Ｇ）、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ（Ｃ）（図１、経路（８）Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｃ）；アコニット酸デカルボキシラーゼ（Ｉ）、イタコン酸イソメラーゼ（Ｊ）、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ（Ｃ）（図１、経路（９）Ｉ／Ｊ／Ｃ）；アコニット酸デカルボキシラーゼ（Ｉ）、イタコン酸イソメラーゼ（Ｊ）、シトラコン酸イソメラーゼ（Ｇ）、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ（Ｈ）（図１、経路（１０）Ｉ／Ｊ／Ｇ／Ｈ）；アコニット酸デカルボキシラーゼ（Ｉ）、イタコニルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ（Ｌ）、シトラマリルＣｏＡデヒドラターゼ（Ｋ）、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ（Ｅ）、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ（Ｂ）、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ（Ｃ）（図１、経路（１１）Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｅ／Ｂ／Ｃ）；アコニット酸デカルボキシラーゼ（Ｉ）、イタコニルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ（Ｌ）、シトラマリルＣｏＡデヒドラターゼ（Ｋ）、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ（Ｅ）、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ（Ｂ）、シトラコン酸イソメラーゼ（Ｇ）、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ（Ｈ）（図１、経路（１２）Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｅ／Ｂ／Ｇ／Ｈ）；アコニット酸デカルボキシラーゼ（Ｉ）、イタコニルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ（Ｌ）、シトラマリルＣｏＡデヒドラターゼ（Ｋ）、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ（Ｅ）、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ（Ｆ）、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ（Ｈ）（図１、経路（１３）Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｅ／Ｆ／Ｈ）；ならびにアコニット酸デカルボキシラーゼ（Ｉ）、イタコニルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ（Ｌ）、シトラマリルＣｏＡデヒドラターゼ（Ｋ）、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ（Ｅ）、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ（Ｆ）、シトラコン酸イソメラーゼ（Ｇ）、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ（Ｃ）（図１、経路（１４）Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｃ）を含めることができる。
本明細書において提供される教示および手引きを考慮すると、発現可能な形態で導入するコード核酸の数は少なくとも、選択される宿主の微生物体の、メタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路の欠損と平行することが当業者により理解される。したがって、本発明の天然に存在しない微生物体は、本明細書に開示されるメタクリル酸の生合成経路、メタクリレートエステルの生合成経路、３−ヒドロキシイソブチレートの生合成経路および／または２−ヒドロキシイソブチレートの生合成経路を構成する酵素またはタンパク質をコードする核酸を、経路に応じて、最大で全てを含めて、１、２、３、４、５、６または７つ有し得る。いくつかの実施形態では、前記天然に存在しない微生物体また、メタクリル酸の生合成、メタクリレートエステルの生合成、３−ヒドロキシイソブチレートの生合成および／もしくは２−ヒドロキシイソブチレートの生合成を促進もしくは最適化するまたは他の有用な機能を宿主の微生物体に付与する他の遺伝子改変を含んでもよい。１つのそのような他の機能性として、例えば、メタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路の前駆体、例として、アセチルＣｏＡ、ピルベートまたはアコニテートの１つまたは複数の合成の増大を挙げることができる。
一般に、宿主の微生物体が、メタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路の前駆体を、自然に生成した分子または工学的に操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）生成物のいずれかとして生成し、所望の前駆体の新規の生成または宿主の微生物体により自然に生成される前駆体の生成の増加のいずれかをもたらすように、宿主の微生物体は選択される。例えば、アコニテート、アセチルＣｏＡおよびピルベートは、宿主の生物体、例として、Ｅ．ｃｏｌｉで自然に生成する。本明細書で開示されるように、宿主の生物体を、前駆体の生成を増大させるように工学的に操作することができる。さらに、所望の前駆体を生成するように工学的に操作されている微生物体を、宿主の生物体として使用し、さらに工学的に操作して、メタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路の酵素またはタンパク質を発現させることもできる。
いくつかの実施形態では、本発明の天然に存在しない微生物体は、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートを合成する酵素能力を含有する宿主から生成される。この特定の実施形態では、例えば、メタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路の反応を、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートの生成に向けて推進するために、メタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路の生成物の合成または蓄積を増大させることが有用となる場合がある。合成または蓄積の増大は、例えば、本明細書に記載するメタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路の酵素またはタンパク質の１つまたは複数をコードする核酸の過剰発現によって達成することができる。メタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路の１つもしくは複数の酵素および／または１つもしくは複数のタンパク質の過剰発現を、例えば、内因性の１つもしくは複数の遺伝子の外因性の発現を通して、または異種の１つもしくは複数の遺伝子の外因性の発現を通して起こすことができる。したがって、例えば、経路中の酵素の数に応じて、１、２、３、４、５、６または７つ、すなわち、最大で全ての、メタクリル酸の生合成経路、メタクリレートエステルの生合成経路、３−ヒドロキシイソブチレートの生合成経路および／または２−ヒドロキシイソブチレートの生合成経路の酵素またはタンパク質をコードする核酸の過剰発現を通して、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートを生成する本発明の天然に存在しない微生物体に、天然に存在する生物体を容易になすことができる。さらに、天然に存在しない生物体は、メタクリル酸の生合成経路、メタクリレートエステルの生合成経路、３−ヒドロキシイソブチレートの生合成経路および／または２−ヒドロキシイソブチレートの生合成経路の酵素の活性の増大をもたらす内因性の遺伝子の変異誘発により生成することもできる。
特に有用な実施形態では、コード核酸の外因性発現が使用される。外因性発現は、発現および／または調節エレメントを宿主および用途向けに調整する能力を付与し、使用者によって制御される所望の発現レベルを達成する。しかし、誘導可能なプロモーターまたは他の調節エレメントに連結する場合、負の調節エフェクターの除去または遺伝子のプロモーターの誘導などによって、内因性発現を他の実施形態で利用することもできる。したがって、天然に存在する誘導可能なプロモーターを有する内因性遺伝子は、適当な誘導剤を提供することによって上方制御することができるか、または、内因性遺伝子の調節領域を誘導可能な調節エレメントを組み込むように工学的に処理し、それによって所望の時間における内因性遺伝子の発現の増加の調節を可能にすることができる。同様に、天然に存在しない微生物体に導入される外因性遺伝子のための調節エレメントとして、誘導可能なプロモーターを含めることができる。
本発明の方法では、１つまたは複数の外因性核酸のいずれかを微生物体に導入して、本発明の天然に存在しない微生物体を生成することができることが理解される。核酸を導入し、その結果、例えば、メタクリル酸の生合成経路、メタクリレートエステルの生合成経路、３−ヒドロキシイソブチレートの生合成経路および／または２−ヒドロキシイソブチレートの生合成経路を微生物体に付与することができる。あるいは、コード核酸を導入して、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートの生合成能力を得るのに必要な反応のいくつかを触媒する生合成能力を有する中間体の微生物体を生成することもできる。例えば、メタクリル酸の生合成経路、メタクリレートエステルの生合成経路、３−ヒドロキシイソブチレートの生合成経路および／または２−ヒドロキシイソブチレートの生合成経路を有する天然に存在しない微生物体は、所望の酵素またはタンパク質、例として、シトラマル酸シンターゼおよびシトラコン酸デカルボキシラーゼ；シトラコン酸イソメラーゼおよびメサコン酸デカルボキシラーゼ；またはイタコニルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼもしくはヒドロラーゼ、およびイタコン酸イソメラーゼなどの組合せをコードする少なくとも２つの外因性核酸を含むことができる。したがって、生合成経路の２つ以上の酵素の任意の組合せを、本発明の天然に存在しない微生物体に含めることができることが理解される。同様に、所望の生合成経路の酵素および／またはタンパク質の組合せにより、対応する所望の生成物の生成が生じる限り、所望により、生合成経路の３つ以上の酵素の任意の組合せ、例えば、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、シトラコン酸イソメラーゼおよびメサコン酸デカルボキシラーゼ；シトラマリルＣｏＡリアーゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼもしくはヒドロラーゼ、およびシトラマル酸デヒドラターゼ；またはアコニット酸デカルボキシラーゼ、イタコン酸イソメラーゼおよびメサコン酸デカルボキシラーゼなどを、本発明の天然に存在しない微生物体に含めることができることも理解される。同様に、所望の生合成経路の酵素の組合せにより、対応する所望の生成物の生成が生じる限り、４つの任意の組合せ、例えば、シトラマリルＣｏＡリアーゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼもしくはヒドロラーゼ、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ；アコニット酸デカルボキシラーゼ、イタコン酸イソメラーゼ、シトラコン酸イソメラーゼ（ｃｉｔｒａｃｏｎａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓａｅ）、およびメサコン酸デカルボキシラーゼなど、または本明細書で開示される生合成経路のより多くの酵素を、所望により、経路中の酵素を最大で全て含めて、本発明の天然に存在しない微生物体に含めることもできる。
本明細書に記載するメタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートの生合成に加えて、本発明の天然に存在しない微生物体および方法はまた、種々の組合せ、すなわち、お互いに組合せて、ならびに当技術分野で周知の他の微生物体および方法と組合せて利用して、他のルートによる生成物の生合成を達成することもできる。例えば、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートの生産体の使用に代わる、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートを生成するための１つの代替が、メタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路の中間体を、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートに転換することが可能な別の微生物体の添加によるものである。１つのそのような手順は、例えば、メタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路の中間体を生成する微生物体の発酵を含む。次いで、メタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路の中間体を、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートに転換する第２の微生物体のための基質として、メタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路の中間体を使用することができる。メタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／もしくは２−ヒドロキシイソブチレート経路の中間体を、第２の生物体の別の培養物に直接添加して、またはメタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／もしくは２−ヒドロキシイソブチレート経路の中間体の生産体の元々の培養物から、これらの微生物体を、例えば、細胞分離により枯渇させることができ、次いで、その後に、第２の生物体を発酵ブロスに添加し、これを利用して、中間体の精製ステップなしで最終生成物を生成することができる。
他の実施形態では、本発明の天然に存在しない微生物体および方法を、多種多様なサブ経路として組み立てて、例えば、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートの生合成を達成することができる。これらの実施形態では、所望の本発明の生成物の生合成経路を、異なる微生物体へと分離することができ、これらの異なる微生物体を共培養して、最終生成物を生成することができる。そのような生合成スキームでは、最終生成物が合成されるまで、１つの微生物体の生成物が、第２の微生物体のための基質となる。例えば、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートの生合成を、１つの経路の中間体を、別の経路の中間体、または生成物に転換するための生合成経路を含有する微生物体を構築することによって達成することができる。それに代わって、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートはまた、同じ槽中で２つの生物体を使用する共培養または共発酵を通して、微生物体から生合成的に生成することもでき、この場合、第１の微生物体が、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートの中間体を生成し、第２の微生物体が、その中間体を、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートに転換する。
本明細書において提供される教示および手引きを考慮すると、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートを生成するために、他の微生物体、サブ経路を有する他の天然に存在しない微生物体の共培養、ならびに当技術分野で周知の他の化学的および／または生化学的な手順の組合せを併用する、本発明の天然に存在しない微生物体および方法について、多種多様な組合せおよび置換形態が存在することが当業者により理解される。
メタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路の酵素またはタンパク質のためのコード核酸の供給源は、例えば、コードされる遺伝子産物が参照反応を触媒することが可能である任意の種を含み得る。そのような種は、原核生物および真核生物の両方を含み、それらとして、これらに限定されないが、古細菌および真正細菌を含めた、細菌、ならびに酵母、植物、昆虫、動物、およびヒトを含む哺乳動物を含めた、真核生物が挙げられる。そのような供給源の例示的な種には、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉを含む）、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｒｏｇａｎｓ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ種ＲＳ−１、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｙｄａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｄｉａ種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉを含む）、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ Ｇ３、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｏｒｔｉｆｅｒｕｍを含む）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを含む）、Ａｐｓｅｒｇｉｌｌｕｓ種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒを含む）、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｚｅａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、亜種ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ｐｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含めたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍを含む）、Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ａｒｅｎｉｃｏｌａ、 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種ＣＦ６００、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを含む）、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ種（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＪＭＰ１３４、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｐｉｃｋｅｔｔｉｉを含む）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍを含む）、Ｐｅｄｉｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ、Ｃｈｌｏｒｏｆｅｘｕｓ種（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｇｇｒｅｇａｎｓを含む）、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｒｏｇａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍを含む）、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ種（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ種ＭＲ−４を含む）、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂａｒｋｅｒｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃａｐｉｌｌｏｓｕｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ株ＩＭ２、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ種（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍを含む）、および本明細書に開示されるかまたは対応する遺伝子のための供給源生物体として利用可能である他の例示的な種が含まれる。しかし、完全ゲノム配列が現在、３９５種の微生物のゲノム、ならびに多様な酵母、真菌、植物および哺乳動物のゲノムを含めて、５５０超の種について利用可能である（これらの半分超が公共のデータベース、例として、ＮＣＢＩ上で利用可能である）ので、例えば、公知の遺伝子のホモログ、オルソログ、パラログおよび非オルソロガス遺伝子の置換物を含めた、関係のあるまたは離れた種における１つまたは複数の遺伝子について、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートの必要な生合成活性をコードする遺伝子を同定すること、ならびに生物体間で遺伝子変化物（ｇｅｎｅｔｉｃ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）を交換することは、当技術分野で日常的であり、周知である。したがって、特定の生物体、例として、Ｅ．ｃｏｌｉに言及して本明細書に記載する、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートの生合成を可能にする代謝変化は、原核生物および真核生物を一様に含めた、他の微生物に容易に適用することができる。本明細書において提供される教示および手引きを考慮すると、１つの生物体において例示される代謝変化を、他の生物体に等しく適用することができることを当業者は知る。
代替のメタクリル酸の生合成経路、メタクリレートエステルの生合成経路、３−ヒドロキシイソブチレートの生合成経路および／または２−ヒドロキシイソブチレートの生合成経路が無関係な種に存在する場合などの一部の例では、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートの生合成を、例えば、参照反応に代わる類似するが同一ではない代謝反応を触媒する、無関係な種からの１つまたは複数のパラログの外因性の発現により、宿主種に付与することができる。異なる生物体間には、代謝のネットワークの間に特定の差が存在することから、異なる生物体間においては、実際の遺伝子の使用が異なる場合があることが当業者により理解される。しかし、本明細書において提供される教示および手引きを考慮すると、本発明の教示および方法を、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートを合成する微生物体を対象種において構築するために本明細書に例示される代謝変化とコグネイトな代謝変化を使用すれば、全ての微生物体に適用することができることもまた当業者は理解する。
天然に存在しない、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートを生成する宿主を構築し、それらの発現レベルを試験するための方法を、例えば、当技術分野で周知の組換えおよび検出の方法により実施することができる。そのような方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１年）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， ＭＤ（１９９９年）に記載されているのを見出すことができる。
メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートを生成する経路に関与する外因性核酸配列は、それらに限定されないが、コンジュゲーション、エレクトロポレーション、化学的変換、形質導入、トランスフェクションおよび超音波形質転換を含む当技術分野で周知の技術を用いて、宿主細胞に安定してまたは一時的に導入することができる。Ｅ．ｃｏｌｉまたは他の原核細胞での外因性発現では、遺伝子のいくつかの核酸配列または真核生物の核酸のｃＤＮＡは、Ｎ末端ミトコンドリアなどのターゲティングシグナルまたは他のターゲティングシグナルをコードすることができ、それは、所望により、原核生物の宿主細胞への形質転換の前に除去することができる。例えば、ミトコンドリアのリーダー配列を除去すると、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現が増加した（Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８０巻、４３２９〜４３３８頁（２００５年））。酵母または他の真核細胞での外因性発現では、宿主細胞に適したミトコンドリアのターゲティングまたは分泌シグナルなどの適切なターゲティング配列を加えることによって、遺伝子は、リーダー配列を加えることなしにサイトゾルで発現させることができるか、またはミトコンドリアもしくは他のオルガネラを標的にすることができるか、または分泌を標的にすることができる。したがって、核酸配列にターゲティング配列を除去するか含めるための適当な改変を外因性核酸配列に組み込んで、望ましい特性を付与できることが理解される。さらに、当技術分野で周知の技術を用いて遺伝子にコドン最適化を行って、タンパク質の最適化された発現を達成することができる。
宿主生物体で機能的である発現調節配列に作動可能に連結されている、本明細書で例示される１つまたは複数のメタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレート生合成経路をコードする核酸を含むように、１つまたは複数の発現ベクターを構築することができる。本発明の微生物宿主生物体での使用に適用可能な発現ベクターには、例えば、宿主染色体への安定した組込みで作動可能なベクターおよび選択配列またはマーカーを含めて、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、エピソームおよび人工染色体が含まれる。さらに、発現ベクターは、１つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子および適当な発現調節配列を含むことができる。例えば、抗生物質もしくは毒素に対する耐性を提供するか、栄養要求性の欠乏を補充するか、または培地中にない重大な栄養素を供給する、選択可能なマーカー遺伝子を含めることもできる。発現調節配列は、当技術分野で周知である、構成的および誘導可能なプロモーター、転写エンハンサー、転写ターミネーターなどを含めることができる。２つ以上の外因性コード核酸を共発現させる場合、両方の核酸を、例えば、単一の発現ベクターまたは別々の発現ベクターに挿入することができる。単一ベクターの発現では、コード核酸を作動的に１つの共通の発現調節配列に連結することもでき、または異なる発現調節配列に、例えば１つの誘導可能なプロモーターおよび１つの構成的プロモーターに連結することもできる。代謝もしくは合成経路に関与する外因性核酸配列の形質転換は、当技術分野で周知である方法を用いて確認することができる。そのような方法には、例えば、ｍＲＮＡのノーザンブロットもしくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅などの核酸分析、または遺伝子産物の発現についてのイムノブロッティング、または導入された核酸配列もしくはその対応する遺伝子産物の発現を試験する他の適切な分析法が含まれる。外因性核酸は所望の産物の産生に十分な量で発現されることが当業者によって理解され、また、当技術分野で周知であり本明細書で開示される方法を用いて発現レベルを最適化して十分な発現を得ることができることがさらに理解される。
本発明は、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートを生成する方法であって、メタクリル酸経路を含む本発明の微生物体を使用する方法をさらに提供する。特定の実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリル酸経路を有する微生物体を含む微生物体を、メタクリル酸を生成する条件下およびそれを生成するのに十分な期間培養することによって、メタクリル酸を生成するための方法であって、前記メタクリル酸経路は、シトラマル酸シンターゼ（Ａ）、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ（Ｂ）、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ（Ｃ）を含む（図１、経路（１）Ａ／Ｂ／Ｃ）、方法を提供する。本明細書で開示されるように、この微生物体は、メタクリル酸経路の酵素（経路中の酵素を最大で全て含む）をコードする、２つ以上の外因性核酸を含むことができ、例えば、３つの外因性核酸が、シトラマル酸シンターゼ、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼをコードする。
特定の実施形態では、ＭＡＡを生成する、本発明の天然に存在しない微生物体は、異種の核酸である少なくとも１つの外因性核酸を有することができる。別の実施形態では、ＭＡＡを生成する、天然に存在しない微生物体は、実質的に嫌気性の培地中にあってよい。
別の実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリル酸経路を含む微生物体を、メタクリル酸を生成する条件下およびそれを生成するのに十分な期間培養することによって、メタクリル酸を生成するための方法であって、前記メタクリル酸経路は、シトラマル酸シンターゼ（Ａ）、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ（Ｂ）、シトラコン酸イソメラーゼ（Ｇ）、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ（Ｈ）を含む（図１、経路（２）Ａ／Ｂ／Ｇ／Ｈ）、方法を提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリル酸経路を含む微生物体を、メタクリル酸を生成する条件下およびそれを生成するのに十分な期間培養することによって、メタクリル酸を生成するための方法であって、前記メタクリル酸経路は、シトラマル酸シンターゼ（Ａ）、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ（Ｆ）、シトラコン酸イソメラーゼ（Ｇ）、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ（Ｃ）を含む（図１、経路（３）Ａ／Ｆ／Ｇ／Ｃ）、方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリル酸経路を含む微生物体を、メタクリル酸を生成する条件下およびそれを生成するのに十分な期間培養することによって、メタクリル酸を生成する方法であって、前記メタクリル酸経路は、シトラマル酸シンターゼ（Ａ）、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ（Ｆ）、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ（Ｈ）を含む（図１、経路（４）Ａ／Ｆ／Ｈ）、方法を提供する。さらにさらなる実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリル酸経路を含む微生物体を、メタクリル酸を生成する条件下およびそれを生成するのに十分な期間培養することによって、メタクリル酸（ｍｅｔｈａｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ）を生成するための方法であって、前記メタクリル酸経路は、シトラマリルＣｏＡリアーゼ（Ｄ）、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ（Ｅ）、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ（Ｂ）、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ（Ｃ）を含む（図１、経路（５）Ｄ／Ｅ／Ｂ／Ｃ）、方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリル酸経路を含む微生物体を、メタクリル酸を生成する条件下およびそれを生成するのに十分な期間培養することによって、メタクリル酸を生成するための方法であって、前記メタクリル酸経路は、シトラマリルＣｏＡリアーゼ（Ｄ）、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ（Ｅ）、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ（Ｂ）、シトラコン酸イソメラーゼ（Ｇ）、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ（Ｈ）を含む（図１、経路（６）Ｄ／Ｅ／Ｂ／Ｇ／Ｈ）、方法を提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリル酸経路を含む微生物体を、メタクリル酸を生成する条件下およびそれを生成するのに十分な期間培養することによって、メタクリル酸を生成するための方法であって、前記メタクリル酸経路は、シトラマリルＣｏＡリアーゼ（Ｄ）、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ（Ｅ）、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ（Ｆ）、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ（Ｈ）を含む（図１、経路（７）Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｈ）、方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリル酸経路を含む微生物体を、メタクリル酸を生成する条件下およびそれを生成するのに十分な期間培養することによって、メタクリル酸を生成するための方法であって、前記メタクリル酸経路は、シトラマリルＣｏＡリアーゼ（Ｄ）、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ（Ｅ）、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ（Ｆ）、シトラコン酸イソメラーゼ（Ｇ）、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ（Ｃ）を含む（図１、経路（８）Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｃ）、方法を提供する。さらに、本発明は、天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリル酸経路を含む微生物体を、メタクリル酸を生成する条件下およびそれを生成するのに十分な期間培養することによって、メタクリル酸を生成するための方法であって、前記メタクリル酸経路は、アコニット酸デカルボキシラーゼ（Ｉ）、イタコン酸イソメラーゼ（Ｊ）、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ（Ｃ）を含む（図１、経路（９）Ｉ／Ｊ／Ｃ）、方法を提供する。
さらにさらなる実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリル酸経路を含む微生物体を、メタクリル酸を生成する条件下およびそれを生成するのに十分な期間培養することによって、メタクリル酸を生成するための方法であって、前記メタクリル酸経路は、アコニット酸デカルボキシラーゼ（Ｉ）、イタコン酸イソメラーゼ（Ｊ）、シトラコン酸イソメラーゼ（Ｇ）、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ（Ｈ）を含む（図１、経路（１０）Ｉ／Ｊ／Ｇ／Ｈ）、方法を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリル酸経路を含む微生物体を、メタクリル酸を生成する条件下およびそれを生成するのに十分な期間培養することによって、メタクリル酸を生成するための方法であって、前記メタクリル酸経路は、アコニット酸デカルボキシラーゼ（Ｉ）、イタコニルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ（Ｌ）、シトラマリルＣｏＡデヒドラターゼ（Ｋ）、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ（Ｅ）、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ（Ｂ）、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ（Ｃ）を含む（図１、経路（１１）Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｅ／Ｂ／Ｃ）、方法を提供する。
本発明は、天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリル酸経路を含む微生物体を、メタクリル酸を生成する条件下およびそれを生成するのに十分な期間培養することによって、メタクリル酸を生成するための方法であって、前記メタクリル酸経路は、アコニット酸デカルボキシラーゼ（Ｉ）、イタコニルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ（Ｌ）、シトラマリルＣｏＡデヒドラターゼ（Ｋ）、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ（Ｅ）、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ（Ｂ）、シトラコン酸イソメラーゼ（Ｇ）、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ（Ｈ）を含む（図１、経路（１２）Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｅ／Ｂ／Ｇ／Ｈ）、方法を提供する。その上さらなる実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリル酸経路を有する微生物体を含む微生物体を、メタクリル酸を生成する条件下およびそれを生成するのに十分な期間培養することによって、メタクリル酸を生成するための方法であって、前記メタクリル酸経路は、アコニット酸デカルボキシラーゼ（Ｉ）、イタコニルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ（Ｌ）、シトラマリルＣｏＡデヒドラターゼ（Ｋ）、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ（Ｅ）、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ（Ｆ）、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ（Ｈ）を含む（図１、経路（１３）Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｅ／Ｆ／Ｈ）、方法を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリル酸経路を含む微生物体を、メタクリル酸を生成する条件下およびそれを生成するのに十分な期間培養することによって、メタクリル酸を生成するための方法であって、前記メタクリル酸経路は、アコニット酸デカルボキシラーゼ（Ｉ）、イタコニルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ（Ｌ）、シトラマリルＣｏＡデヒドラターゼ（Ｋ）、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ（Ｅ）、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ（Ｆ）、シトラコン酸イソメラーゼ（Ｇ）、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ（Ｃ）を含む（図１、経路（１４）Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｃ）、方法を提供する。
本発明はまた、３−ヒドロキシイソブチレートエステルを生成する条件下およびそれを生成するのに十分な期間、天然に存在しない微生物体を培養すること（この天然に存在しない微生物体は、３−ヒドロキシイソブチレートエステルを生成するのに十分な量で発現されるアルコールトランスフェラーゼまたは３−ヒドロキシイソブチレートエステルを形成する酵素をコードする外因性核酸を含む）と、３−ヒドロキシイソブチレートエステルを化学的に脱水して、メタクリレートエステルを生成することとによって、メタクリレートエステルを生成するための方法も提供し、これを、図２８、ならびに図３０のステップ６および７に例示する。別の実施形態では、本発明は、メチル−３−ヒドロキシイソブチレートを生成する条件下およびそれを生成するのに十分な期間、天然に存在しない微生物体を培養する工程（この天然に存在しない微生物体は、メチル−３−ヒドロキシイソブチレートを生成するのに十分な量で発現されるアルコールトランスフェラーゼまたはエステルを形成する酵素をコードする外因性核酸を含む）と、前記メチル−３−ヒドロキシイソブチレートを化学的に脱水して、メチルメタクリレートを生成する工程とによって、メチルメタクリレートを生成するための方法を提供し、これを、図３０のステップ６および７に例示する。本発明のいくつかの態様では、本明細書で開示されるメタクリレートエステルまたはメチルメタクリレートを生成するための方法は、天然に存在しない微生物体が、図１〜１１および２８〜３０に記載されるかまたはそれらの任意の組み合わせのとおりの、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むことをさらに含む。いくつかの態様では、本発明は、外因性核酸が、異種の核酸であることを条件とする。いくつかの態様では、本発明は、天然に存在しない微生物体が、実質的に嫌気性の培地中にあることを条件とする。
一実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物体であって、メチルメタクリレートを生成するのに十分な量で発現されるメチルメタクリレート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメチルメタクリレート経路を有する微生物体を含み、（ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸が、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、または必要に応じて、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニターゼ、シトリルＣｏＡシンテターゼもしくはシトリルＣｏＡリアーゼから選択される還元的ＴＣＡ経路；（ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される還元的ＴＣＡ経路；あるいは（ｉｉｉ）少なくとも１つの外因性核酸が、ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼ、およびそれらの組合せから選択される酵素をコードすることをさらに含み；ここで、前記メチルメタクリレート経路が、アルコールトランスフェラーゼまたはエステルを形成する酵素、およびデヒドラターゼを含む微生物体を提供する。別の態様では、本発明は、方法であって、（ｉ）を含む微生物体が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニルＣｏＡシンテターゼ、スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチルＣｏＡシンテターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシン、およびそれらの組合せから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む方法を提供する。別の態様では、本発明は、（ｉｉ）を含む微生物体が、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニルＣｏＡシンテターゼ、スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、およびそれらの組合せから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む方法を提供する。一態様では、この微生物体は、それぞれメチルメタクリレート酵素をコードする２つの外因性核酸を含む。さらなる態様では、２つの外因性核酸が、アルコールトランスフェラーゼおよびデヒドラターゼ、またはそれに代わって、エステルを形成する酵素およびデヒドラターゼをコードする。
一実施形態では、本発明は、方法であって、（ｉ）を含む微生物体が、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする４つの外因性核酸を含むか；（ｉｉ）を含む前記微生物体が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼをコードする５つの外因性核酸を含むか；（ｉｉｉ）を含む前記微生物体が、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼをコードする２つの外因性核酸を含む方法を提供する。
一実施形態では、本発明は、メチルメタクリレートを生成するための方法であって、メチルメタクリレートを生成する条件下およびそれを生成するのに十分な期間、本明細書で開示される天然に存在しない微生物体を培養する工程を含む方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、メタクリレートエステルを生成するための方法であって、３−ヒドロキシイソブチレートエステルを生成する条件下およびそれを生成するのに十分な期間、天然に存在しない微生物体を培養すること（前記天然に存在しない微生物体は、３−ヒドロキシイソブチレートエステルを生成するのに十分な量で発現されるアルコールトランスフェラーゼまたは３−ヒドロキシイソブチレートエステルを形成する酵素をコードする外因性核酸を含み、（ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸が、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、または必要に応じて、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニターゼ、シトリルＣｏＡシンテターゼもしくはシトリルＣｏＡリアーゼから選択される還元的ＴＣＡ経路；（ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される還元的ＴＣＡ経路；または（ｉｉｉ）ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼ、およびそれらの組合せから選択される酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸をさらに含む）と、前記３−ヒドロキシイソブチレートエステルを化学的に脱水して、メタクリレートエステルを生成することとを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、メタクリレートエステルを生成するための方法であって、２−ヒドロキシイソブチレートエステルを生成する条件下およびそれを生成するのに十分な期間、天然に存在しない微生物体を培養すること（前記天然に存在しない微生物体は、２−ヒドロキシイソブチレートエステルを生成するのに十分な量で発現されるアルコールトランスフェラーゼまたは２−ヒドロキシイソブチレートエステルを形成する酵素をコードする外因性核酸を含み、（ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸が、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、または必要に応じて、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニターゼ、シトリルＣｏＡシンテターゼもしくはシトリルＣｏＡリアーゼから選択される還元的ＴＣＡ経路；（ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される還元的ＴＣＡ経路；または（ｉｉｉ）ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼ、およびそれらの組合せから選択される酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸をさらに含む）と、前記２−ヒドロキシイソブチレートエステルを化学的に脱水して、メタクリレートエステルを生成することとを含む方法を提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、メチルメタクリレートを生成するための方法であって、メチル−３−ヒドロキシイソブチレートを生成する条件下およびそれを生成するのに十分な期間、天然に存在しない微生物体を培養すること（前記天然に存在しない微生物体は、メチル−３−ヒドロキシイソブチレートを生成するのに十分な量で発現されるアルコールトランスフェラーゼまたはエステルを形成する酵素をコードする外因性核酸を含み、（ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸が、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、または必要に応じて、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニターゼ、シトリルＣｏＡシンテターゼもしくはシトリルＣｏＡリアーゼから選択される還元的ＴＣＡ経路；（ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される還元的ＴＣＡ経路；または（ｉｉｉ）ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼ、およびそれらの組合せから選択される酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸をさらに含む）と、前記メチル−３−ヒドロキシイソブチレートを化学的に脱水して、メチルメタクリレートを生成することとを含む方法を提供する。上記の方法の一態様では、前記外因性核酸の少なくとも１つは、異種の核酸である。上記の方法の別の態様では、天然に存在しない微生物体は、実質的に嫌気性の培地中にある。
一実施形態では、本発明は、上記および本明細書に開示される方法であって、（ｉ）を含む前記微生物体が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニルＣｏＡシンテターゼ、スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチルＣｏＡシンテターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシン、およびそれらの組合せから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、上記および本明細書に開示される方法であって、（ｉｉ）を含む前記微生物体が、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニルＣｏＡシンテターゼ、スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、およびそれらの組合せから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む方法を提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、上記および本明細書に開示される方法であって、（ｉ）を含む前記微生物体が、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする４つの外因性核酸を含むか；（ｉｉ）を含む前記微生物体が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼをコードする５つの外因性核酸を含むか；（ｉｉｉ）を含む前記微生物体が、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼをコードする２つの外因性核酸を含む方法を提供する。
一態様では、本明細書で開示される方法は、３−ヒドロキシイソブチレートエステルを生成するのに十分な量で発現される３−ヒドロキシイソブチレートエステル経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む３−ヒドロキシイソブチレートエステル経路を含む微生物体を増進することができ、前記３−ヒドロキシイソブチレートエステル経路は、（ａ）３−ヒドロキシイソ酪酸ＣｏＡトランスフェラーゼもしくは３−ヒドロキシイソ酪酸ＣｏＡシンテターゼ；およびアルコールトランスフェラーゼ；または（ｂ）３−ヒドロキシイソブチレートエステルを形成する酵素から選択される経路を含む。一態様では、本明細書で開示される方法は、２−ヒドロキシイソブチレートエステルを生成するのに十分な量で発現される２−ヒドロキシイソブチレートエステル経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む２−ヒドロキシイソブチレートエステル経路を含む微生物体を増進することができ、前記２−ヒドロキシイソブチレートエステル経路は、（ａ）２−ヒドロキシイソ酪酸ＣｏＡトランスフェラーゼもしくは２−ヒドロキシイソ酪酸ＣｏＡシンテターゼ；およびアルコールトランスフェラーゼ；または（ｂ）２−ヒドロキシイソブチレートエステルを形成する酵素から選択される経路を含む。
メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートの生成について試験するのに適した精製および／またはアッセイを、周知の方法を使用して実施することができる。試験する各工学的に操作された株について、３連の培養物などの適切な複製物を増殖させることができる。例えば、工学的に操作された産生宿主における生成物および副産物の形成をモニタリングすることができる。最終生成物および中間体、ならびに他の有機化合物を、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）、ＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフィー−質量分析）およびＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析）などの方法、または当技術分野で周知である日常的な手順を用いる他の適切な分析法によって分析することができる。発酵ブロス中の生成物の放出を、培養上清で試験することもできる。副産物および残留グルコースは、例えば、グルコースおよびアルコールには屈折率検出器を、有機酸には紫外線検出器を用いるＨＰＬＣによって（Ｌｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． ９０巻、７７５〜７７９頁（２００５年））、または当技術分野で周知である他の適切なアッセイおよび検出方法によって定量化することができる。また、外因性ＤＮＡ配列から得られた個々の酵素またはタンパク質の活性も、当技術分野で周知の方法を使用してアッセイすることができる。例えば、シトラマル酸シンターゼの活性を、精製タンパク質、アセチルＣｏＡ、ピルベートおよび緩衝液の溶液中でＣｏＡの生成を経時的にモニタリングすることによってアッセイすることができる（Ａｔｓｕｍｉら、ＡＥＭ、７４巻：７８０２〜７８０８頁（２００８年））。
メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートは、当技術分野で周知である様々な方法を用いて培養物中の他の成分から分離することができる。そのような分離法には、例えば、抽出法、ならびに連続液液抽出、浸透気化法、膜濾過、膜分離、逆浸透、電気透析、蒸留、結晶化、遠心分離、抽出濾過、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィーおよび限外濾過を含む方法が含まれる。上記の方法は全て、当技術分野において周知である。
本明細書で記載される天然に存在しない微生物体のいずれかを培養して、本発明の生合成生成物を生成および／または分泌することができる。例えば、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートの生合成的生成のために、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレート生産体を培養することができる。
メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートを生成するために、組換え体の株を、炭素供給源および他の必須栄養素を有する培地で培養する。全体的なプロセスのコストを低減するために、発酵槽中の嫌気的条件を維持することが、時には望ましく、そうすることが、極めて望ましい場合がある。そのような条件は、例えば、最初に、窒素で培地をスパージし、次いで、フラスコを、セプタムおよびクリンプキャップを用いて密封することによって得ることができる。嫌気的条件で増殖が観察されない株については、微好気的または実質的に嫌気的な条件を、限定的通気のための小さな穴をセプタムに開けることによって適用することができる。例示的な嫌気的条件は、先に記載されており、当技術分野で周知である。例示的な好気的条件および嫌気的条件が、例えば、２００７年８月１０日出願の米国公開第２００９／００４７７１９号に記載されている。本明細書で開示されるように、発酵は、回分、流加または連続的な様式で実施することができる。
培地を望ましいｐＨに維持することが必要なとき、所望により、塩基、例えばＮａＯＨもしくは他の塩基、または酸の添加によって培地のｐＨを所望のｐＨ、特に中性ｐＨ、例えば約７のｐＨに維持することができる。増殖速度は、分光光度計（６００ｎｍ）を用いて光学密度を測定することによって決定することができ、グルコース取り込み速度は、炭素源枯渇を経時的にモニターすることによって決定できる。
増殖培地は、例えば、天然に存在しない微生物に炭素源を供給することができる任意の炭水化物源を含み得る。例えば、そのような供給源には、糖類、例えばグルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、スクロースおよびデンプンが含まれる。炭水化物の他の供給源には、例えば再生可能なフィードストックおよびバイオマスが含まれる。本発明の方法でフィードストックとして用いることができる例示的なバイオマスの型には、セルロースのバイオマス、ヘミセルロースのバイオマスおよびリグニンフィードストックまたはフィードストックの部分が含まれる。そのようなバイオマスフィードストックは、例えば炭素源として有用な炭水化物基質、例えばグルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトースおよびデンプンを含有する。本明細書で提供される教示および指針を考慮すると、当業者は、上記に例示されるもの以外の再生可能なフィードストックおよびバイオマスを、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートの生成のための本発明の微生物体を培養するのに用いることもできることを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、本発明は、大気中の炭素取り込みの供給源を反映する炭素−１２、炭素−１３および炭素−１４の比を有する、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／もしくは２−ヒドロキシイソブチレート、またはメタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／もしくは２−ヒドロキシイソブチレートの中間体を提供する。いくつかのそのような実施形態では、取り込みの供給源はＣＯ２である。いくつかの実施形態では、いくつかの実施形態では、本発明は、石油に基づく炭素取り込みの供給源を反映する炭素−１２、炭素−１３および炭素−１４の比を有する、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／もしくは２−ヒドロキシイソブチレート、またはメタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／もしくは２−ヒドロキシイソブチレートの中間体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、大気中の炭素取り込みの供給源と石油に基づく取り込みの供給源との組合せにより得られる炭素−１２、炭素−１３および炭素−１４の比を有する、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／もしくは２−ヒドロキシイソブチレート、またはメタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／もしくは２−ヒドロキシイソブチレートの中間体を提供する。取り込みの供給源のそのような組合せは、炭素−１２、炭素−１３および炭素−１４の比を変化させることができる１つの手段となる。
再生可能なフィードストック、例として、上記および本明細書に例示されるものに加えてまた、炭素の供給源としてのシンガスで増殖するために、本発明のメタクリル酸（ｍｅｔｈａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｍｅｔｈａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートの微生物体を改変することもできる。この特定の実施形態では、シンガスまたは他の気体の炭素供給源を利用するための代謝経路をもたらすために、１つまたは複数のタンパク質または酵素を、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートを生成する生物体で発現させる。
合成ガス（ｓｙｎｇａｓ）またはプロデューサーガスとしても公知の合成ガス（ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｇａｓ）は、石炭、ならびに炭素材、例えば農作物および残渣を含むバイオマス材のガス化の主要な生成物である。合成ガスは主としてＨ２およびＣＯの混合物であり、それらに限定されないが、石炭、石油、天然ガス、バイオマスおよび廃棄有機物を含む任意の有機フィードストックのガス化から得ることができる。ガス化は、高い燃料対酸素比の下で一般に実施される。ほとんどＨ２およびＣＯであるが、合成ガスはより少ない量のＣＯ２および他のガスをも含み得る。したがって、合成ガスはＣＯ、さらにＣＯ２などのガス状炭素の費用効果の高い供給源を提供する。
Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路は、ＣＯおよびＨ２からアセチルＣｏＡおよびアセテートなどの他の生成物への転換を触媒する。ＣＯおよび合成ガスを利用することができる生物体は一般に、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路に包含される酵素および変換の同じ基本セットを通して、ＣＯ２およびＣＯ２／Ｈ２混合物を利用する能力も有する。同じ生物体がＣＯを用いることもでき、同じ経路が含まれることが明らかにされるずっと前に、微生物によるＣＯ２からアセテートへのＨ２依存性転換が認識された。必要な還元当量を供給する水素が存在する限り、多くの酢酸生成菌がＣＯ２の存在下で増殖し、アセテートなどの化合物を生成することが示された（例えば、Ｄｒａｋｅ、Ａｃｅｔｏｇｅｎｅｓｉｓ、３〜６０頁、Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（１９９４年）参照）。これは、以下の式に要約することができる：
２ＣＯ２＋４Ｈ２＋ｎＡＤＰ＋ｎＰｉ→ＣＨ３ＣＯＯＨ＋２Ｈ２Ｏ＋ｎＡＴＰ
したがって、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を有する天然に存在しない微生物は、アセチルＣｏＡおよび他の所望の生成物の生成にＣＯ２およびＨ２混合物も利用することができる。
Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路は当技術分野で周知であり、１２個の反応からなり、それらは２つの分岐：（１）メチル分岐および（２）カルボニル分岐に分けることができる。メチル分岐はシンガスをメチルテトラヒドロ葉酸（メチルＴＨＦ）に転換し、カルボニル分岐はメチルＴＨＦをアセチルＣｏＡに転換する。メチル分岐における反応は、以下の酵素またはタンパク質によって順番に触媒される：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロデヒドラターゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼおよびメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ。カルボニル分岐における反応は、以下の酵素またはタンパク質によって順番に触媒される：メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（例えば、ＡｃｓＥ）、コリノイド鉄−硫黄タンパク質、ニッケル−タンパク質集合タンパク質（例えば、ＡｃｓＦ）、フェレドキシン、アセチルＣｏＡシンターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、およびニッケル−タンパク質集合タンパク質（例えば、ＣｏｏＣ）。十分な数のコード核酸を導入してメタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路を生成するための本明細書で提供される教示および手引きに従って、当業者は、宿主生物体に存在しないＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ酵素またはタンパク質をコードする核酸を少なくとも導入することに関して、同じ工学的設計を実施することもできることを理解する。したがって、改変された生物体が完全なＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を含むように、本発明の微生物体へ１つまたは複数のコード核酸を導入すると、シンガス利用能が付与される。
さらに、還元的（逆行性）トリカルボン酸回路が、ＣＯ、ＣＯ２および／またはＨ２を、アセチルＣｏＡ、および他の生成物、例として、アセテートに転換するために使用され、かつ／またはヒドロゲナーゼ活性もまた、そのために使用することができる。炭素を、還元的ＴＣＡ経路を介して固定することが可能な生物体は、以下の酵素の１つまたは複数を利用することができる：ＡＴＰクエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アルファ−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、スクシニルＣｏＡシンテターゼ、スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ、フマル酸レダクターゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、およびヒドロゲナーゼ。具体的には、ＣＯ２を、還元的ＴＣＡ回路を介してアセチルＣｏＡまたはアセテートに固定するために、ＣＯおよび／またはＨ２から一酸化炭素デヒドロゲナーゼおよびヒドロゲナーゼにより抽出された還元当量が利用される。アセテートを、酵素、例として、アセチルＣｏＡトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ／ホスホトランスアセチラーゼ、およびアセチルＣｏＡシンテターゼによりアセチルＣｏＡに転換することができる。アセチルＣｏＡを、メタクリル酸前駆体、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートに転換することができる。例えば、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、および糖新生の酵素により、グリセルアルデヒド−３−リン酸、ホスホエノールピルベート、およびピルベート。メタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路を生成するのに十分な数のコード核酸を導入するための、本明細書において提供される教示および手引きに従って、同じ工学的設計をまた、少なくとも、宿主の生物体中に存在しない還元的ＴＣＡ経路の酵素またはタンパク質をコードする核酸を導入することに関しても実施することができることが当業者により理解される。したがって、改変された生物体が完全な還元的ＴＣＡ経路を含有するように、１つまたは複数のコード核酸を本発明の微生物体に導入すると、シンガス利用能が付与される。
したがって、本明細書において提供される教示および手引きを考慮すると、天然に存在しない微生物体であって、炭素供給源、例として、炭水化物で増殖する場合、生合成された本発明の化合物を分泌する微生物体を生成することができることが当業者により理解される。そのような化合物には、例えば、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレート、ならびにメタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路における中間体の代謝産物のいずれかが含まれる。必要とされることは、例えば、メタクリル酸の生合成経路、メタクリレートエステルの生合成経路、３−ヒドロキシイソブチレートの生合成経路および／または２−ヒドロキシイソブチレートの生合成経路の一部または全部を含める操作を含めて、所望の化合物または中間体の生合成を達成するため、必要とされる酵素またはタンパク質の活性の１つまたは複数に関して工学的な操作を行うだけである。したがって、本発明は、天然に存在しない微生物体であって、炭水化物または他の炭素供給源で増殖する場合、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートを生成および／または分泌する微生物体、ならびに炭水化物または他の炭素供給源で増殖する場合、メタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路において示される中間体の代謝産物のいずれかを生成および／または分泌する微生物体を提供する。本発明のメタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートを生成する微生物体は、中間体、例えば、シトラマリルＣｏＡ、イタコニルＣｏＡ、イタコネート、シトラマレート、メサコネートまたはシトラコネートから合成を開始することができる。
本明細書に例示されるように、当技術分野で周知の方法を使用して、本発明の天然に存在しない微生物体は、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートを生成するのに十分な量のメタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路の酵素またはタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸を外因性に発現するように構築される。本発明の微生物体は、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートを生成するのに十分な条件下で培養されることが理解される。本明細書において提供される教示および手引きに従って、本発明の天然に存在しない微生物体は、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートの生合成を達成し、結果として、約０．１〜２００ｍＭ以上の間の細胞内濃度をもたらすことができる。一般に、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートの細胞内濃度は、約３〜１５０ｍＭの間、特に、約５〜１２５ｍＭの間、より詳細には、約１０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭ、８０ｍＭ以上を含めた、約８〜１００ｍＭの間である。これらの例示的な範囲のそれぞれの間のおよびそれらを上回る細胞内濃度もまた、本発明の天然に存在しない微生物体から達成することができる。
いくつかの実施形態では、培養条件は、嫌気的または実質的に嫌気的な増殖または維持の条件を含む。例示的な嫌気的条件が、先に記載されており、当技術分野で周知である。発酵プロセスのための例示的な嫌気的条件は、本明細書、および例えば、２００７年８月１０日出願の米国公開第２００９／００４７７１９号に記載されている。これらの条件のいずれかおよび当技術分野で周知の他の嫌気的条件を、天然に存在しない微生物体に関して用いることができる。そのような嫌気的または実質的に嫌気的な条件下で、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートの生産体は、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートを、５〜１０ｍＭ以上の細胞内濃度および本明細書に例示される全ての他の濃度で合成することができる。上記の記載は、細胞内濃度を指すにもかかわらず、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートを生成する微生物体は、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートを、細胞内で生成し、かつ／または生成物を培地中に分泌することができることが理解される。
本明細書に開示される培養および発酵の条件に加えて、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートの生合成を達成するための増殖条件に、浸透圧保護剤を培養条件に添加することを含めることもできる。特定の実施形態では、本発明の天然に存在しない微生物体を、浸透圧保護剤の存在下において、本明細書に記載されるように維持し、培養し、または発酵させることができる。手短に述べると、浸透圧保護剤は、オスモライトとして作用し、本明細書に記載する微生物体が浸透圧のストレスを生き延びるのを支援する化合物を指す。浸透圧保護剤には、これらに限定されないが、ベタイン、アミノ酸、および糖のトレハロースが含まれる。そのような浸透圧保護剤の非限定的な例が、グリシンベタイン、プロリン（ｐｒａｌｉｎｅ）ベタイン、ジメチルテチン、ジメチルスルホニオプロプリオネート（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｌｆｏｎｉｏｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ）、３−ジメチルスルホニオ−２−メチルプロプリオネート、ピペコリン酸、ジメチルスルホニオアセテート、コリン、Ｌ−カルニチンおよびエクトインである。一態様では、浸透圧保護剤は、グリシンベタインである。本明細書に記載する微生物体を浸透圧のストレスから保護するのに適している浸透圧保護剤の量およびタイプは、使用される微生物体に依存することは当業者に理解される。培養条件における浸透圧保護剤の量は、例えば、約０．１ｍＭ以下、約０．５ｍＭ以下、約１．０ｍＭ以下、約１．５ｍＭ以下、約２．０ｍＭ以下、約２．５ｍＭ以下、約３．０ｍＭ以下、約５．０ｍＭ以下、約７．０ｍＭ以下、約１０ｍＭ以下、約５０ｍＭ以下、約１００ｍＭ以下、または約５００ｍＭ以下であり得る。
いくつかの実施形態では、炭素フィードストック、ならびにホスフェート、アンモニア、サルフェート、クロリドおよび他のハロゲンなどの細胞による他の取り込み供給源を選んで、メタクリル酸、メタクリレートエステル（ｅｓｔｅ）、メチルメタクリレート、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／もしくは２−ヒドロキシイソブチレート、またはメタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、メチルメタクリレート経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路の任意の中間体に存在する原子の同位体の分布を変化させることができる。上記に列挙した種々の炭素フィードストックおよび他の取り込み供給源は、本明細書ではまとめて「取り込み供給源」を指す。取り込み供給源は、生成物としてのメタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、メチルメタクリレート経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／もしくは２−ヒドロキシイソブチレート経路の中間体に存在する任意の原子について、またはメタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、メチルメタクリレート経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路から逸脱した反応において生成される副産物について、同位体の富化をもたらし得る。同位体の富化は、例えば、炭素、水素、酸素、窒素、硫黄、リン、クロリドまたは他のハロゲンを含めた、任意の標的原子について達成することができる。
いくつかの実施形態では、取り込み供給源を選択して、炭素−１２、炭素−１３および炭素−１４の比を変化させることができる。いくつかの実施形態では、取り込み供給源を選択して、酸素−１６、酸素−１７および酸素−１８の比を変化させることができる。いくつかの実施形態では、取り込み供給源を選択して、水素、重水素および三重水素の比を変化させることができる。いくつかの実施形態では、取り込み供給源を選択して、窒素−１４および窒素−１５の比を変化させることができる。いくつかの実施形態では、取り込み供給源を選択して、硫黄−３２、硫黄−３３、硫黄−３４および硫黄−３５の比を変化させることができる。いくつかの実施形態では、取り込み供給源を選択して、リン−３１、リン−３２およびリン−３３の比を変化させることができる。いくつかの実施形態では、取り込み供給源を選択して、塩素−３５、塩素−３６および塩素−３７の比を変化させることができる。
いくつかの実施形態では、標的原子の同位体の比を、１つまたは複数の取り込み供給源を選択することによって、所望の比に変化させることができる。取り込み供給源は、自然界に見出されるような天然の供給源、または人造の供給源から得ることができ、当業者は、天然の供給源、人造の供給源、またはそれらの組合せを選択して、標的原子の同位体の所望の比を達成することができる。人造の取り込み供給源の例には、例えば、少なくとも部分的に化学的合成反応から得られる取り込み供給源が含まれる。そのような同位体が富化された取り込み供給源を、商業的に購入することもしくは実験室で調製することができ、かつ／または必要に応じて、取り込み供給源の天然の供給源と混合して、同位体の所望の比を達成することもできる。いくつかの実施形態では、所望の起源の、自然界に見出されるような取り込み供給源を選択することによって、取り込み供給源の標的原子の同位体比を達成することができる。例えば、本明細書で論じるように、天然の供給源は、バイオベースであり、生物学的有機体（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｒｇａｎｉｓｍ）に由来してもよくもしくは生物学的有機体により合成されてもよく、または石油に基づく生成物もしくは大気などの供給源であってもよい。いくつかのそのような実施形態では、炭素の供給源を、例えば、炭素−１４が枯渇している場合がある、化石燃料に由来する炭素供給源、または石油に由来する対応物よりも多くの量の炭素−１４を保有する場合がある、環境もしくは大気中の炭素供給源、例として、ＣＯ２から選択することができる。
不安定な炭素の同位体である炭素−１４または放射性炭素は、地球の大気中の１０１２個の炭素原子うちのおおよそ１個を構成し、約５７００年の半減期を有する。炭素のストックは、上層大気中で、宇宙線および通常の窒素（１４Ｎ）が関与する核反応により補充される。炭素−１４が、遠い昔に崩壊したので、化石燃料は、炭素−１４を含有しない。化石燃料の燃焼により、大気中の炭素−１４の割合が下がり、これは、いわゆる「スース効果」である。
化合物中の原子の同位体の比を決定する方法は、当業者に周知である。同位体の富化は、質量分析により、当技術分野で公知の技法、例として、加速器質量分析（ＡＭＳ）、安定同位体比質量分析（ＳＩＲＭＳ）、および核磁気共鳴による部位特異的天然同位体分配（ＳＮＩＦ−ＮＭＲ）を使用して容易に評価される。そのような質量分析の技法を、分離の技法、例として、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および／またはガスクロマトグラフィーなどと一体化することができる。
炭素の場合、ＡＳＴＭ Ｄ６８６６が、固体、液体および気体の試料のバイオベースの含有量を、放射性炭素年代測定を使用して決定するための標準化された分析方法として、米国材料試験協会（ＡＳＴＭ）インターナショナルにより米国で開発された。この標準法は、放射性炭素年代測定の使用に基づいて、生成物のバイオベースの含有量の決定を行う。ＡＳＴＭ Ｄ６８６６は、最初に２００４年に公開され、この標準法の現在有効なバージョンは、ＡＳＴＭ Ｄ６８６６−１１である（２０１１年４月１日以来有効）。本明細書に記載する技法を含めて、放射性炭素年代測定の技法は、当業者に周知である。
化合物のバイオベースの含有量は、炭素−１４（１４Ｃ）対炭素−１２（１２Ｃ）の比により推定される。具体的には、現在の割合（ｆｒａｃｔｉｏｎ ｍｏｄｅｒｎ）（Ｆｍ）は、式：Ｆｍ＝（Ｓ−Ｂ）／（Ｍ−Ｂ）から算出され、式中、Ｂ、ＳおよびＭはそれぞれ、ブランク、試料および現在の参照の１４Ｃ／１２Ｃ比を示す。現在の割合は、「現在」からの、試料の１４Ｃ／１２Ｃ比の偏差の測定値である。現在は、δ１３ＣＶＰＤＢ＝−１９／ｍｉｌに対して正規化された、国家標準局（ＮＢＳ）シュウ酸Ｉ（すなわち、標準参照（ｒｅｓｆｅｒｅｎｃｅ）物質（ＳＲＭ）４９９０ｂ）の（ＡＤ１９５０年の）放射性炭素濃度の９５％と定義される（Ｏｌｓｓｏｎ、Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ Ｏｘａｌｉｃ ａｃｉｄ ａｓ ａ Ｓｔａｎｄａｒｄ、Ｒａｄｉｏｃａｒｂｏｎ Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇｙ、Ｎｏｂｅｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ， １２ｔｈ Ｐｒｏｃ．、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７０年））。例えば、ＡＳＭにより測定された質量分析の結果は、国際的に同意されている定義、すなわち、δ１３ＣＶＰＤＢ＝−１９／ｍｉｌに対して正規化された、ＮＢＳシュウ酸Ｉ（ＳＲＭ ４９９０ｂ）の比活性の０．９５倍を使用して計算される。これは、１．１７６±０．０１０×１０−１２の、（ＡＤ１９５０年の）１４Ｃ／１２Ｃの絶対比と同等である（Ｋａｒｌｅｎら、Ａｒｋｉｖ Ｇｅｏｆｙｓｉｋ、４巻：４６５〜４７１頁（１９６８年））。標準法の計算には、１つの同位体の、別の同位体に関する識別的な取り込み、例えば、Ｃ１２＞Ｃ１３＞Ｃ１４の生物学的な系における優先的な取り込みが考慮に入れられており、これらの補正は、δ１３について補正されたＦｍとして反映されている。
シュウ酸標準物質（ＳＲＭ ４９９０ｂまたはＨＯｘ１）は、１９５５年のサトウダイコンの作物から作製された。１０００ポンドが作製されたが、このシュウ酸標準物質は最早、商業的に入手可能でない。シュウ酸ＩＩ標準物質（ＨＯｘ２；Ｎ．Ｉ．Ｓ．Ｔ 表記 ＳＲＭ ４９９０Ｃ）が、１９７７年のＦｒｅｎｃｈ ｂｅｅｔの作物の糖蜜から作製された。１９８０年代初期に、１２の研究室からなるグループが、２つの標準物質の比を測定した。シュウ酸ＩＩ対１の活性の比は、１．２９３３±０．００１（加重平均）である。ＨＯｘＩＩの同位体の比は、−１７．８／ミル（ｍｉｌｌｅ）である。ＡＳＴＭ Ｄ６８６６−１１は、現在の標準物質のために、入手可能なシュウ酸ＩＩ標準物質ＳＲＭ ４９９０Ｃ（Ｈｏｘ２）の使用を提案している（Ｍａｎｎ、Ｒａｄｉｏｃａｒｂｏｎ、２５巻（２号）：５１９〜５２７頁（１９８３年）における元々のシュウ酸標準物質対現時点で入手可能なシュウ酸標準物質についての考察を参照）。Ｆｍ＝０％は、材料中に炭素−１４原子を完全に欠くことを示し、したがって、化石（例えば、石油に基づく）炭素供給源を示す。核爆弾の試験からの大気中への炭素−１４の１９５０年以降の射出について補正した後のＦｍ＝１００％は、完全に現在の炭素供給源を示す。本明細書に記載する場合、そのような「現在の」供給源には、バイオベースの供給源が含まれる。
ＡＳＴＭ Ｄ６８６６に記載されているように、現在の炭素のパーセント（ｐｅｒｃｅｎｔ ｍｏｄｅｒｎ ｃａｒｂｏｎ）（ｐＭＣ）が、１００％よりも大きくなる場合がある。これは、減少しつつあるが継続的している１９５０年代の核試験プログラムの作用により、ＡＳＴＭ Ｄ６８６６−１１に記載されているように、大気中の炭素−１４の相当な富化が生じたことによる。全ての試料の炭素−１４活性が、「爆弾前（ｐｒｅ−ｂｏｍｂ）」の標準物質へ参照されること、およびほとんど全ての新しいバイオベースの生成物が、爆弾後の環境において生成されることから、試料の本当のバイオベースの含有量をより良好に反映するために、（同位体の割合についての補正の後の）全てのｐＭＣ値に、（２０１０年の時点では）０．９５を乗じなければならない。１０３％よりも大きいバイオベースの含有量は、分析の誤りが生じてしまった、またはバイオベースの炭素の供給源が、数年超古いものであるかのいずれかであることを示唆している。
ＡＳＴＭ Ｄ６８６６により、材料の総有機含有量と比べたバイオベースの含有量が定量化され、存在する無機炭素および炭素を含有しない他の物質は考慮されない。例えば、ＡＳＴＭ Ｄ６８６６に基づくと、５０％がデンプンに基づく材料であり、５０％が水である生成物は、バイオベースの含有量＝１００％を有するとみなされる（１００％バイオベースである、５０％の有機含有量）。別の例では、５０％がデンプンに基づく材料であり、２５％が石油に基づき、２５％が水である生成物は、バイオベースの含有量＝６６．７％を有する（有機含有量は７５％であるが、生成物の５０％のみがバイオベースである）。別の例では、５０％が有機炭素であり、石油に基づく生成物である生成物は、バイオベースの含有量＝０％を有するとみなされる（有機炭素は５０％であるが、化石供給源に由来する）。したがって、化合物または材料のバイオベースの含有量を決定するための周知の方法および公知の標準物質に基づいて、当業者は、バイオベースの含有量を容易に決定すること、および／またはバイオベースの所望の含有量を有する本発明の生成物を利用する（ｕｔｉｌｉｚｅ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）下流の生成物を調製することができる。
材料のバイオベースの含有量を定量化するための、炭素−１４年代測定の技法の適用は、当技術分野で公知である（Ｃｕｒｒｉｅら、Ｎｕｃｌｅａｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂ、１７２巻：２８１〜２８７頁（２０００年））。例えば、炭素−１４年代測定を使用して、テレフタレート含有材料中のバイオベースの含有量が定量化されている（Ｃｏｌｏｎｎａら、Ｇｒｅｅｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３巻：２５４３〜２５４８頁（２０１１年））。とりわけ、再生可能な１，３−プロパンジオールおよび石油に由来するテレフタル酸から得られたポリプロピレンテレフタレート（ＰＰＴ）ポリマーでは、、ほぼ３０％のＦｍ値が得られた（すなわち、ポリマー炭素の３／１１が、再生可能な１，３−プロパンジオールに由来し、８／１１が、化石の終点メンバーのテレフタル酸に由来するからである）（Ｃｕｒｒｉｅら、上記、２０００年）。対照的に、再生可能な１，４−ブタンジオールおよび再生可能なテレフタル酸の両方から得られたポリブチレンテレフタレートポリマーからは、９０％を上回るバイオベースの含有量が得られた（Ｃｏｌｏｎｎａら、上記、２０１１年）。
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、環境の炭素ともまた呼ばれる、大気中の炭素の取り込み供給源を反映する炭素−１２、炭素−１３および炭素−１４の比を有する、メタクリル酸、メタクリレートエステル、メチルメタクリレート、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／もしくは２−ヒドロキシイソブチレート、またはメタクリル酸経路の中間体、メタクリレートエステル経路の中間体、メチルメタクリレート経路の中間体、３−ヒドロキシイソブチレート経路の中間体および／もしくは２−ヒドロキシイソブチレート経路の中間体を提供する。例えば、いくつかの態様では、メタクリル酸、メタクリレートエステル、メチルメタクリレート、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／もしくは２−ヒドロキシイソブチレート、またはメタクリル酸の中間体、メタクリレートエステルの中間体、メチルメタクリレートの中間体、３−ヒドロキシイソブチレートの中間体および／もしくは２−ヒドロキシイソブチレートの中間体は、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％程度のＦｍ値を有し得る。いくつかのそのような実施形態では、取り込み供給源はＣＯ２である。いくつかの実施形態では、本発明は、石油に基づく炭素の取り込み供給源を反映する炭素−１２、炭素−１３および炭素−１４の比を有する、メタクリル酸、メタクリレートエステル、メチルメタクリレート、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／もしくは２−ヒドロキシイソブチレート、またはメタクリル酸の中間体、メタクリレートエステルの中間体、メチルメタクリレートの中間体、３−ヒドロキシイソブチレートの中間体および／もしくは２−ヒドロキシイソブチレートの中間体を提供する。この態様では、メタクリル酸、メタクリレートエステル、メチルメタクリレート、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／もしくは２−ヒドロキシイソブチレート、またはメタクリル酸の中間体、メタクリレートエステルの中間体、メチルメタクリレートの中間体、３−ヒドロキシイソブチレートの中間体および／もしくは２−ヒドロキシイソブチレートの中間体は、９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、または１％未満のＦｍ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本発明は、大気の炭素の取り込み供給源と石油に基づく取り込み供給源との組合せにより得られる炭素−１２、炭素−１３および炭素−１４の比を有する、メタクリル酸、メタクリレートエステル、メチルメタクリレート、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／もしくは２−ヒドロキシイソブチレート、またはメタクリル酸の中間体、メタクリレートエステルの中間体、メチルメタクリレートの中間体、３−ヒドロキシイソブチレートの中間体および／もしくは２−ヒドロキシイソブチレートの中間体を提供する。取り込み供給源のそのような組合せの使用は、炭素−１２、炭素−１３および炭素−１４の比を変化させることができる１つの方法となり、それぞれの比が、取り込み供給源の比率を反映する（ｒｅｆｅｌｅｃｔ）。
さらに、本発明は、本明細書に開示されるように、生物学的に生成された、メタクリル酸、メタクリレートエステル、メチルメタクリレート、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／もしくは２−ヒドロキシイソブチレート、またはメタクリル酸の中間体、メタクリレートエステルの中間体、メチルメタクリレートの中間体、３−ヒドロキシイソブチレートの中間体および／もしくは２−ヒドロキシイソブチレートの中間体ならびに、それらから得られる生成物にも関し、ここで、前記メタクリル酸、メタクリレートエステル、メチルメタクリレート、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／もしくは２−ヒドロキシイソブチレート、またはメタクリル酸の中間体、メタクリレートエステルの中間体、メチルメタクリレートの中間体、３−ヒドロキシイソブチレートの中間体および／もしくは２−ヒドロキシイソブチレートの中間体は、環境中に存在するＣＯ２とおよそ同じ値の炭素−１２、炭素−１３および炭素−１４の同位体比を有する。例えば、いくつかの態様では、本発明は、環境中に存在するＣＯ２とおよそ同じ値の炭素−１２対炭素−１３対炭素−１４の同位体比、または本明細書に開示される任意の他の比を有する、バイオに由来する（ｂｉｏｄｅｒｉｖｅｄ）メタクリル酸、メタクリレートエステル、メチルメタクリレート、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／もしくは２−ヒドロキシイソブチレート、またはバイオに由来するメタクリル酸の中間体、メタクリレートエステルの中間体、メチルメタクリレートの中間体、３−ヒドロキシイソブチレートの中間体および／もしくは２−ヒドロキシイソブチレートの中間体を提供する。本明細書で開示されるように、生成物が、環境中に存在するＣＯ２とおよそ同じ値の炭素−１２対炭素−１３対炭素−１４の同位体比、または本明細書に開示されるいずれかの比を有し得、生成物は、本明細書に開示されるように、バイオに由来するメタクリル酸、メタクリレートエステル、メチルメタクリレート、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／もしくは２−ヒドロキシイソブチレート、またはバイオに由来するメタクリル酸の中間体、メタクリレートエステルの中間体、メチルメタクリレートの中間体、３−ヒドロキシイソブチレートの中間体および／もしくは２−ヒドロキシイソブチレートの中間体から生成され、そのバイオに由来する生成物は化学的に改変されて、最終生成物を生成することが理解される。メタクリル酸、メタクリレートエステル、メチルメタクリレート、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／もしくは２−ヒドロキシイソブチレートのバイオに由来する生成物、またはそれらの中間体を化学的に改変して、所望の生成物を生成する方法は、本明細書に記載するように、当業者に周知である。本発明は、環境中に存在するＣＯ２とおよそ同じ値の炭素−１２対炭素−１３対炭素−１４の同位体比を有する、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、アクリルプラスチック、およびコ−ポリマー、例として、コ−ポリマーのメチルメタクリレート−ブタジエン−スチレン（ＭＢＳ）などを含む、ポリマーをさらに提供し、ポリメチルメタクリレート、アクリルプラスチック、およびコ−ポリマーのメチルメタクリレート−ブタジエン−スチレン（ＭＢＳ）を含む、前記ポリマーは、本明細書に開示されるように、バイオに由来するメタクリル酸、メタクリレートエステル、メチルメタクリレート、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／もしくは２−ヒドロキシイソブチレート、またはバイオに由来するメタクリル酸の中間体、メタクリレートエステルの中間体、メチルメタクリレートの中間体、３−ヒドロキシイソブチレートの中間体および／もしくは２−ヒドロキシイソブチレートの中間体からまたはそれらと組み合わせて直接生成される。
メタクリル酸、メタクリレートエステル、メチルメタクリレート、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートは、商業的および工業的な適用において使用される化学物質である。そのような適用の非限定的な例には、アクリルガラス、Ｌｕｃｉｔｅ（商標）またはＰｌｅｘｉｇｌａｓ（商標）ともまた呼ばれるポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、アクリルプラスチック、およびコ−ポリマー、例として、コ−ポリマーのメチルメタクリレート−ブタジエン−スチレン（ＭＢＳ）を含めた、ポリマーの生成が含まれる。さらに、メタクリル酸、メタクリレートエステル、メチルメタクリレート、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートはまた、ポリメチルメタクリレートアクリルプラスチックおよびコ−ポリマーのメチルメタクリレート−ブタジエン−スチレン（ＭＢＳ）を含めた、ポリマーを含む広い範囲の生成物の生成における原材料としても使用される。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、ポリメチルメタクリレート、アクリルプラスチック、およびメチルメタクリレート−ブタジエン−スチレン（ＭＢＳ）を含めた、コ−ポリマーを含む、バイオベースのポリマーを提供し、これらは、本発明の天然に存在しない微生物により生成されるかまたは本明細書に開示される方法を使用して生成される、１つまたは複数の、バイオに由来するメタクリル酸、メタクリレートエステル、メチルメタクリレート、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／もしくは２−ヒドロキシイソブチレート、またはバイオに由来するメタクリル酸の中間体、メタクリレートエステルの中間体、メチルメタクリレートの中間体、３−ヒドロキシイソブチレートの中間体および／もしくは２−ヒドロキシイソブチレートの中間体を含む。ポリメチルメタクリレート、アクリルプラスチック、およびメチルメタクリレート−ブタジエン−スチレンを含めた、コ−ポリマーを含む、そのようなポリマーは、上記した所望の比の、バイオに由来する前駆体と石油に基づく前駆体との混合物を有し得る。
本明細書で用いるように、用語「バイオに由来する」は、生物学的有機体から得られるまたは生物学的有機体により合成されることを意味し、生物学的有機体により生成され得ることから、再生可能な資源とみなすことができる。そのような生物学的有機体、特に、本明細書に開示される本発明の微生物体は、農業、植物、細菌または動物からの供給源から得られるフィードストックまたはバイオマス、例として、糖または炭水化物を利用することができる。あるいは、生物学的有機体は、大気中の炭素を利用することもできる。本明細書で用いるように、用語「バイオベース（ｂｉｏｂａｓｅｄ）」は、本発明のバイオに由来する化合物の全体または部分で構成される、上記した生成物を意味する。バイオベースの生成物またはバイオに由来する生成物は、石油に由来する生成物とは対照的であり、そのような生成物は、石油もしくは石油化学フィードストックから得られるかまたは石油もしくは石油化学フィードストックから合成される。
いくつかの実施形態では、本発明は、バイオに由来するメタクリル酸、メタクリレートエステル、メチルメタクリレート、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／もしくは２−ヒドロキシイソブチレート、またはバイオに由来するメタクリル酸の中間体、メタクリレートエステルの中間体、メチルメタクリレートの中間体、３−ヒドロキシイソブチレートの中間体および／もしくは２−ヒドロキシイソブチレートの中間体を含む、ポリメチルメタクリレートアクリルプラスチックおよびコ−ポリマーのメチルメタクリレート−ブタジエン−スチレン（ＭＢＳ）を含めた、ポリマーを提供し、前記バイオに由来するメタクリル酸、メタクリレートエステル、メチルメタクリレート、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／もしくは２−ヒドロキシイソブチレート、またはバイオに由来するメタクリル酸の中間体、メタクリレートエステルの中間体、メチルメタクリレートの中間体、３−ヒドロキシイソブチレートの中間体および／もしくは２−ヒドロキシイソブチレートの中間体は、ポリメチルメタクリレートアクリルプラスチックおよびコ−ポリマーのメチルメタクリレート−ブタジエン−スチレン（ＭＢＳ）を含めた、ポリマーの生成において使用されるメタクリル酸、メタクリレートエステル、メチルメタクリレート、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／もしくは２−ヒドロキシイソブチレート、またはメタクリル酸の中間体、メタクリレートエステルの中間体、メチルメタクリレートの中間体、３−ヒドロキシイソブチレートの中間体および／もしくは２−ヒドロキシイソブチレートの中間体の全部または一部を含む。したがって、いくつかの態様では、本発明は、ポリメチルメタクリレートアクリルプラスチックおよびコ−ポリマーのメチルメタクリレート−ブタジエン−スチレン（ＭＢＳ）を含めた、バイオベースのポリマーであって、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％の、本明細書で開示されるようなバイオに由来するメタクリル酸、メタクリレートエステル、メチルメタクリレート、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／もしくは２−ヒドロキシイソブチレート、またはバイオに由来するメタクリル酸の中間体、メタクリレートエステルの中間体、メチルメタクリレートの中間体、３−ヒドロキシイソブチレートの中間体および／もしくは２−ヒドロキシイソブチレートの中間体を含むバイオベースのポリマーを提供する。さらに、いくつかの態様では、本発明は、ポリメチルメタクリレートアクリルプラスチックおよびコ−ポリマーのメチルメタクリレート−ブタジエン−スチレン（ＭＢＳ）を含めた、バイオベースのポリマーであって、その生成に使用される前記メタクリル酸、メタクリレートエステル、メチルメタクリレート、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／もしくは２−ヒドロキシイソブチレート、またはメタクリル酸の中間体、メタクリレートエステルの中間体、メチルメタクリレートの中間体、３−ヒドロキシイソブチレートの中間体および／もしくは２−ヒドロキシイソブチレートの中間体が、バイオに由来する、メタクリル酸、メタクリレートエステル、メチルメタクリレート、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／もしくは２−ヒドロキシイソブチレート、またはメタクリル酸の中間体、メタクリレートエステルの中間体、メチルメタクリレートの中間体、３−ヒドロキシイソブチレートの中間体および／もしくは２−ヒドロキシイソブチレートの中間体と、石油に由来する、メタクリル酸、メタクリレートエステル、メチルメタクリレート、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／もしくは２−ヒドロキシイソブチレート、またはメタクリル酸の中間体、メタクリレートエステルの中間体、メチルメタクリレートの中間体、３−ヒドロキシイソブチレートの中間体および／もしくは２−ヒドロキシイソブチレートの中間体との組合せであるバイオベースのポリマーも提供する。例えば、５０％のバイオに由来するメタクリル酸、メタクリレートエステル、メチルメタクリレート、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／もしくは２−ヒドロキシイソブチレートと、５０％の石油に由来するメタクリル酸、メタクリレートエステル、例として、メチルメタクリレート、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／もしくは２−ヒドロキシイソブチレートとを使用するか、または生成物の少なくとも一部が、本明細書に開示される微生物体により生成された、バイオに由来する生成物を含む限り、他の所望の比、例として、６０％／４０％、７０％／３０％、８０％／２０％、９０％／１０％、９５％／５％、１００％／０％、４０％／６０％、３０％／７０％、２０％／８０％、１０％／９０％の、バイオに由来する（ｄｅｒｉｅｄ）前駆体／石油に由来する前駆体を使用して、ポリメチルメタクリレートアクリルプラスチックおよびコ−ポリマーのメチルメタクリレート−ブタジエン−スチレン（ＭＢＳ）を含めた、バイオベースのポリマーを生成することができる。本発明のバイオに由来するメタクリル酸、メタクリレートエステル、メチルメタクリレート、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／もしくは２−ヒドロキシイソブチレート、またはバイオに由来するメタクリル酸の中間体、メタクリレートエステルの中間体、メチルメタクリレートの中間体、３−ヒドロキシイソブチレートの中間体および／もしくは２−ヒドロキシイソブチレートの中間体を使用して、ポリメチルメタクリレートアクリルプラスチックおよびコ−ポリマーのメチルメタクリレート−ブタジエン−スチレン（ＭＢＳ）を含めた、ポリマーを生成するための方法は、当技術分野で周知であることが理解される。
培養条件には、例えば、液体培養法だけでなく発酵および他の大規模培養法を含めることができる。本明細書で記載されるように、本発明の生合成生成物の特に有用な収率は、嫌気的または実質的に嫌気的な培養条件下で得ることができる。
本明細書に記載するように、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートの生合成を達成するための１つの例示的な増殖条件として、嫌気的な培養または発酵の条件が挙げられる。特定の実施形態では、本発明の天然に存在しない微生物体は、嫌気的または実質的に嫌気的な条件の下で保持し、培養し、または発酵させることができる。簡単に述べると、嫌気的条件とは酸素不足の環境を指す。実質的に嫌気的な条件には、例えば、培地中の溶存酸素濃度が飽和の０〜１０％の間にとどまるような、培養、回分発酵または連続発酵が含まれる。実質的に嫌気的な条件には、１％未満の酸素の雰囲気で維持される密封チャンバー内の液体培地または固体寒天で細胞を増殖または休止させることも含まれる。酸素の割合は、例えば、培養物をＮ２／ＣＯ２混合物または他の適切な１つまたは複数の非酸素ガスでスパージすることによって維持することができる。
本明細書で記載される培養条件の規模を拡大し、連続的に増殖させてメタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートを製造することができる。例示的な増殖法には、例えば、流加回分発酵および回分分離；流加回分発酵および連続分離、または連続発酵および連続分離が含まれる。これらのプロセスは全て、当技術分野において周知である。発酵法は、商業的な量のメタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートの生合成による生成に特に有用である。一般に、また非連続的な培養法と同様に、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートの連続的および／またはほとんど連続的な生成には、指数増殖期の増殖を維持および／またはほとんど維持するのに十分な栄養素および培地で、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートを生成する本発明の天然に存在しない生物体を培養することが含まれる。そのような条件下における連続培養は、例えば、１、２、３、４、５、６または７日間以上の増殖を含むことができる。さらに、連続培養は、１、２、３、４または５週間以上、および最長数ヵ月間のより長い期間を含むこともできる。あるいは、本発明の生物体は、特定の用途に適する場合は数時間培養することができる。連続的および／またはほとんど連続的な培養条件は、これらの例示的な期間の間の全ての期間を含むこともできることを理解すべきである。本発明の微生物体を培養する時間は、所望の目的に十分な量の生成物を生成するのに十分な期間であることがさらに理解される。
発酵法は、当技術分野において周知である。簡単に述べると、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートを生合成により生成するための発酵は、例えば、流加回分発酵および回分分離；流加回分発酵および連続分離、または連続発酵および連続分離で利用することができる。回分および連続発酵法の例は、当技術分野で周知である。
本発明のメタクリル酸、メタクリレートエステル、メチルメタクリレート、３−ヒドロキシイソブチレート、３−ヒドロキシイソブチレートエステル、２−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートエステルの生産体を使用する上記の発酵法に加えて、多くの量のメタクリル酸、メタクリレートエステル、メチルメタクリレート、３−ヒドロキシイソブチレート、３−ヒドロキシイソブチレートエステル、２−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートエステルを連続的に生成するためにまた、所望により、生産体を、例えば、化学的合成手順に同時にかけて、生成物を他の化合物に転換することもでき、または前記生成物を、発酵培養物から分離し、順次、化学的もしくは酵素的な転換にかけて、生成物を他の化合物に転換することもできる。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、３−ヒドロキシイソブチレートエステル、例として、メチル−３−ヒドロキシイソブチレート、または２−ヒドロキシイソブチレートエステル、例として、メチル−２−ヒドロキシイソブチレートを化学的に脱水して、メタクリレートエステル、例として、メチルメタクリレートを得ることを提供する。そのような化合物の脱水を触媒する（ｃａｔｙｌｙｚｉｎｇ）ための方法および化合物は当技術分野で周知であることが理解される。
発酵溶液から単離された純粋な３−ヒドロキシイソブチレートまたは２−ヒドロキシイソブチレートから開始するか、または発酵溶液の運転中に単離された３−ヒドロキシイソブチレートエステルまたは２−ヒドロキシイソブチレートエステルの水溶液もしくは有機溶液から開始して、３−ヒドロキシイソブチレートエステルおよび２−ヒドロキシイソブチレートエステルを化学的に脱水して、メタクリレートエステルを形成することができる。３−ヒドロキシイソブチレートエステルまたは２−ヒドロキシイソブチレートエステルのそのような溶液はまた、脱水ステップの前に、例えば、蒸留により、必要に応じて、適切な添加溶剤の存在下において濃縮してもよい。
脱水反応は、液相または気相中で実施することができる。脱水反応は、触媒の存在下において実施することができ、用いる触媒の性質は、実施する反応が、気相または液相のいずれであるかに依存する。
適切な脱水触媒は、酸性触媒およびアルカリ性触媒の両方を含む。特に、酸性触媒は、オリゴマーを形成する傾向の減少を示し得る。脱水触媒は、均一触媒、不均一触媒、またはそれらの組合せとして用いることができる。不均一触媒は、適切な支持材料と併せて使用することができる。そのような支持体自体が、酸性であってもアルカリ性であってもよく、酸性またはアルカリ性の脱水触媒を提供することができ、または触媒を、不活性な支持体に適用することができる。
脱水触媒として働く、適切な支持体には、天然または合成のシリケート、例として、モルデナイト、モンモリロナイト、酸性ゼオライト；一塩基性、二塩基性もしくは多塩基性の無機酸、例として、リン酸でコーティングされている、または無機酸の酸性塩、例として、酸化物もしくはケイ酸塩、例えば、Ａｌ２Ｏ３、ＴｉＯ２でコーティングされている支持体；酸化物、および混合酸化物、例として、γ−Ａｌ２Ｏ３、およびＺｎＯ−Ａｌ２Ｏ３のヘテロポリ酸の混合酸化物が含まれる。脱水触媒および支持材料（ａ ｓｕｐｐｏｒｔ ａ ｓｕｐｐｏｒｔ ｍａｔｅｒｉａｌ）の両方として作用するアルカリ性物質には、アルカリ、アルカリ土類、ランタン、ランタノイド（ｌａｎｔｈｏｉｄ）、またはそれらの酸化物としてのそれらの組合せが含まれる。脱水をもたらすことができる材料のさらなるクラスが、アルカリ性または酸性のいずれかの形態で使用することができるイオン交換体である。
適切な均一脱水触媒には、無機酸、例として、リン酸などのリンを含有する酸が含まれる。無機酸を、支持材料上に浸漬または含浸により固定化することができる。
いくつかの実施形態では、脱水反応は、当技術分野で公知の従来の装置、例えば、管型反応器、サーモプレートを熱交換器として含むシェルアンドチューブ式の熱交換器および反応器を使用して、気相中で実施される。いくつかの実施形態では、気相における脱水は、単離された３−ヒドロキシイソブチレートエステル、または該エステルの溶液を利用することができ、該エステルは、固定床触媒を有する反応器へと導入される。液相中の熱による脱水を、２００℃〜３５０℃の間の温度範囲で、いくつかの実施形態では、２５０〜３００℃の間の温度範囲で実施することができる。
より良好な生産体を得るために、代謝モデリングを利用して、増殖条件を最適化することができる。モデリングを用いて、経路の利用をさらに最適化する遺伝子ノックアウトを設計することができる（例えば、米国特許公開ＵＳ２００２／００１２９３９、ＵＳ２００３／０２２４３６３、ＵＳ２００４／００２９１４９、ＵＳ２００４／００７２７２３、ＵＳ２００３／００５９７９２、ＵＳ２００２／０１６８６５４およびＵＳ２００４／０００９４６６、ならびに米国特許第７，１２７，３７９号を参照）。モデリング解析は、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートのより効率の高い生成の方向に代謝を移動させる細胞増殖に対する影響の信頼性のある予測を可能にする。
所望の生成物の生合成を有利にする代謝改変を特定し、設計するための１つのコンピュータ方法は、ＯｐｔＫｎｏｃｋコンピュータフレームワークである（Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． ８４巻、６４７〜６５７頁（２００３年））。ＯｐｔＫｎｏｃｋは、標的生成物を過剰に生産する遺伝的に安定した微生物をもたらす遺伝子欠失または破壊戦略を示唆する、代謝モデリングおよびシミュレーションプログラムである。具体的には、フレームワークは、所望の生化学物質を細胞増殖の必須の副産物になるように強制する遺伝子操作を示唆するために、微生物の完全な代謝ネットワークおよび／または生化学ネットワークを調べる。戦略的に置かれた遺伝子欠失または他の機能的遺伝子破壊を通して生化学的生成を細胞増殖と連結することによって、バイオリアクター内での長期間の後に設計製作された株に加えられる増殖淘汰圧は、強制的な増殖連結型の生化学的生成の結果として、性能の改善をもたらす。最後に、遺伝子欠失が構築されると、ＯｐｔＫｎｏｃｋによって選択された遺伝子はゲノムから完全に除去されるので、設計された株がそれらの野生型状態に戻る可能性はごくわずかである。したがって、このコンピュータ方法は、所望の生成物の生合成をもたらす代替経路を特定するために用いること、または所望の生成物の生合成のさらなる最適化のために、天然に存在しない微生物体と共に用いることができる。
簡単に述べると、ＯｐｔＫｎｏｃｋは細胞代謝のモデリングのためのコンピュータによる方法およびシステムを指すために本明細書で用いられる用語である。ＯｐｔＫｎｏｃｋプログラムは、特定の制約をフラックスバランス分析（ＦＢＡ）モデルに組み込む、モデルおよび方法のフレームワークに関する。これらの制約には、例えば、定性的動態学情報、定性的調節情報および／またはＤＮＡマイクロアレイ実験データが含まれる。ＯｐｔＫｎｏｃｋは、例えばフラックスバランスモデルを通して誘導されるフラックス境界を締め、その後、遺伝子付加または欠失の存在下で代謝ネットワークの性能限界を調査することによって、様々な代謝問題の解法も計算する。ＯｐｔＫｎｏｃｋコンピュータフレームワークは、代謝ネットワークの性能限界の効果的なクエリーを可能にするモデル式の構築を可能にし、生じる混合整数線形計画法の問題を解決する方法を提供する。ＯｐｔＫｎｏｃｋとして本明細書で言及される代謝モデリングおよびシミュレーション法は、例えば、２００２年１月１０日に出願の米国特許公開第２００２／０１６８６５４号、２００２年１月１０日に出願の国際特許ＰＣＴ／ＵＳ０２／００６６０、および２００７年８月１０日に出願の米国公開第２００９／００４７７１９号に記載されている。
生成物の生合成による生成を有利にする代謝変化を特定および設計するための別のコンピュータ方法は、ＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）と呼ばれる代謝モデリングおよびシミュレーションシステムである。このコンピュータ方法およびシステムは、例えば、２００２年６月１４日に出願の米国特許公開２００３／０２３３２１８および２００３年６月１３日に出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／１８８３８に記載されている。ＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）は、コンピュータでネットワークモデルを生成し、生物系の化学反応を通して質量、エネルギーまたは電荷のフラックスをシミュレートして、その系の化学反応のありとあらゆる可能な機能を含む解空間を定義し、それによってその生物系に許容される一連の活性を判定するのに用いることができるコンピュータシステムである。この手法は、含まれる反応の公知の化学量などの制約、ならびに反応を通して最大フラックスに関連する反応の熱力学のおよび容量制約によって解空間が定義されるので、制約に基づくモデリングと称される。これらの制約によって定義される空間を調べて、生物系またはその生化学成分の表現型能力および挙動を判定することができる。
生物系は柔軟であり、多くの異なる方法で同じ結果に到達することができるので、これらのコンピュータ手法は生物的な現実と一貫している。生物系は、全ての生物系が直面しなければならない基本的な制約によって制限されている進化機構を通して設計される。したがって、制約に基づくモデリング戦略は、これらの一般的な現実を包含する。さらに、制約の締め付けを通してさらなる制限をネットワークモデルに連続的に加える能力は、解空間のサイズの縮小をもたらし、それによって、生理的性能または表現型を予測できる精度を高める。
本明細書で提供される教示および指針を考慮すると、当業者は、代謝モデリングおよびシミュレーションのための様々なコンピュータフレームワークを適用して、宿主微生物体における所望の化合物の生合成を設計および実施することができる。そのような代謝モデリングおよびシミュレーション方法には、例えば、ＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）およびＯｐｔＫｎｏｃｋのような上で例示したコンピュータシステムが含まれる。本発明の説明のために、モデリングおよびシミュレーションのためのＯｐｔＫｎｏｃｋ計算フレームワークに関して、いくつかの方法を本明細書に記載する。当業者は、ＯｐｔＫｎｏｃｋを用いる代謝変化の特定、設計および実行を、当技術分野で周知であるそのような他の代謝モデリングおよびシミュレーションコンピュータフレームワークおよび方法のいずれかに適用する方法を知るであろう。
上記の方法は、破壊する１セットの代謝反応を提供する。セット内の各反応の除去または代謝改変は、生物体の増殖期の間の必須の生成物として、所望の生成物をもたらすことができる。反応が知られているので、２層の（ｂｉｌｅｖｅｌ）ＯｐｔＫｎｏｃｋ問題の解決は、反応セット内の各反応を触媒する１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数の関連遺伝子も提供する。反応セットおよび各反応に関与する酵素をコードするそれらの対応遺伝子の同定は、一般に自動化されたプロセスであり、その反応と、酵素およびコード遺伝子の間の関係を有する反応データベースとの相関関係を通して達成される。
同定されると、標的細胞または生物体において、所望の生成物の生成を達成するために破壊される反応セットが、セット内の各代謝反応をコードする少なくとも１つの遺伝子の機能的破壊によって実施される。反応セットの機能的破壊を達成する１つの特に有用な手段は、各コード遺伝子の欠失によるものである。しかし、一部の例では、例えば、変異、プロモーターもしくは調節因子のためのシス結合部位などの調節領域の欠失を含む他の遺伝子異常、またはいくつかの場所のいずれかにおけるコード配列の切断によって反応を破壊することが有益となることがある。例えば、生成物の連結の速やかな評価が所望され、または遺伝子復帰変異が起こる可能性がより低い場合、遺伝子セットの全体未満の欠失をもたらすこれらの後者の異常が有用なことがある。
所望の生成物の増殖連結型の生合成を含む生合成をもたらすことができる破壊すべきさらなる反応セットまたは代謝改変をもたらす上記の２層のＯｐｔＫｎｏｃｋ問題のさらなる生産的解法を特定するために、整数カットと呼ばれる最適化法を実施することができる。この方法は、各反復での整数カットと呼ばれる追加の制約の組込みで、上に例示されるＯｐｔＫｎｏｃｋ問題を反復して解決することによって進行する。整数カット制約は、解決手法が、生成物生合成を増殖に不可避的に連結する任意の前の反復で特定されるものと正確に同じ反応セットを選択することを、効果的に防止する。例えば、前に特定された増殖連結型の代謝改変が破壊のための反応１、２および３を特定する場合、以下の制約は、その後の解法で同じ反応が同時に考慮されることを防止する。整数カット法は当技術分野で周知であり、例えば、Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ． １７巻、７９１〜７９７頁（２００１年）に記載されているのを見ることができる。代謝モデリングおよびシミュレーションのためのＯｐｔＫｎｏｃｋコンピュータフレームワークと組み合わせたそれらの使用に関して本明細書で記載される全ての方法と同様に、反復性コンピュータ分析でのリダンダンシーを減らす整数カット法は、例えばＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）を含む当技術分野で周知である他のコンピュータフレームワークとともに適用することもできる。
本明細書で例示される方法は、所望の生成物を生合成的に生成する細胞および生物体の構築を可能にし、それには、特定された遺伝子改変を抱えるように設計製作された細胞または生物体の増殖への、標的生化学生成物の生成の必須の連結が含まれる。したがって、本明細書で記載されるコンピュータ方法は、ＯｐｔＫｎｏｃｋまたはＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）から選択されるコンピュータ方法によって特定される代謝改変の同定および実行を可能にする。代謝改変のセットには、例えば、１つまたは複数の生合成経路の酵素の付加および／または、例えば遺伝子欠失による破壊を含む１つまたは複数の代謝反応の機能的破壊を含めることができる。
上記のように、ＯｐｔＫｎｏｃｋ方法は、長期の増殖選択に曝した場合、変異体微生物ネットワークをコンピュータによって予測されるそれらの最大増殖表現型の方へ進化させることができるという前提で開発された。言い換えると、本手法は、選択圧の下で自己最適化する生物体の能力を導入する。ＯｐｔＫｎｏｃｋフレームワークは、ネットワーク化学量論に基づいて生化学的生成と細胞増殖との間の連結を強制する遺伝子欠失組合せの網羅的な列挙を可能にする。最適遺伝子／反応ノックアウトの同定は、生じたネットワークについての最適増殖の解法が対象とする生化学物質を過剰に生産するように活性反応セットを選択する、２層の最適化問題の解決を必要とする（Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． ８４巻、６４７〜６５７頁（２００３年））。
前に例示され、例えば米国特許公開ＵＳ２００２／００１２９３９、ＵＳ２００３／０２２４３６３、ＵＳ２００４／００２９１４９、ＵＳ２００４／００７２７２３、ＵＳ２００３／００５９７９２、ＵＳ２００２／０１６８６５４およびＵＳ２００４／０００９４６６、ならびに米国特許第７，１２７，３７９号に記載されるように、代謝経路に必要不可欠な遺伝子を同定するために、Ｅ．ｃｏｌｉ代謝のコンピュータ化学量論モデルを使用することができる。本明細書で開示されるように、ＯｐｔＫｎｏｃｋ数学フレームワークを、所望の生成物の増殖連結型生成をもたらす正確な遺伝子欠失に適用することができる。さらに、２層のＯｐｔＫｎｏｃｋ問題の解決は、１セットの欠失だけを提供する。全ての意味がある解決、すなわち増殖連結型生成の形成をもたらすノックアウトの全セットを列挙するために、整数カットと呼ばれる最適化技術を実施することができる。これは、上記のように、各反復での整数カットと呼ばれる追加の制約の組込みでＯｐｔＫｎｏｃｋ問題を反復して解決することを必要とする。
本明細書で開示されるように、メタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路の所望の活性をコードする核酸を、宿主の生物体に導入することができる。場合によっては、メタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路の酵素またはタンパク質の活性を改変して、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートの生成を増大させるのが望ましいことがある。例えば、タンパク質または酵素の活性を増大させる公知の変異を、コード核酸分子に導入することができる。さらに、最適化の方法を適用して、酵素もしくはタンパク質の活性を増大させること、および／または阻害活性を低下させる、例えば、負のレギュレーターの活性を低下させることもできる。
１つのそのような最適化の方法が、定向進化である。定向進化は、酵素の特性を改善するためおよび／または変化させるための特定の遺伝子を標的とする変異の導入が関与する、強力なアプローチである。多く（例えば、＞１０４個）の酵素バリアントの自動化スクリーニングを可能にする、感度の高い高スループットスクリーニングアッセイの開発および実行を通して、改善されたおよび／または変化した酵素を同定することができる。典型的には、変異誘発およびスクリーニングを反復して実施して、最適化された特性を有する酵素を得る。また、変異誘発のための遺伝子の領域を同定するのを支援することができる計算アルゴリズムも開発されており、これにより、生成し、スクリーニングする必要がある酵素バリアントの数を顕著に低下させることができる。多種多様なバリアントライブラリーを有効に生み出すために、多数の定向進化の技術が開発されており（総説については、Ｈｉｂｂｅｒｔら、Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ、２２巻：１１〜１９頁（２００５年）；ＨｕｉｓｍａｎおよびＬａｌｏｎｄｅ、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、７１７〜７４２頁（２００７年）、Ｐａｔｅｌ（編）、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；ＯｔｔｅｎおよびＱｕａｘ、Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ、２２巻：１〜９頁（２００５年）．；ならびにＳｅｎら、Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１４３巻：２１２〜２２３頁（２００７年）を参照）、これらの方法は、多くの酵素のクラスにわたる広い範囲の特性の改善に首尾よく適用されている。定向進化の技術により改善および／または変化が生じている酵素の特徴として、例えば、非天然の基質の転換についての選択性／特異性；ロバストな高温処理のための温度安定性；より低いまたはより高いｐＨ条件下におけるバイオ処理のためのｐＨ安定性；高い生成物タイターを達成することができるような、基質または生成物の耐性；非天然の基質を含めるための、基質結合性を広げることを含んだ、結合性（Ｋｍ）；生成物、基質または主要な中間体による阻害を除去するための阻害（Ｋｉ）；酵素反応速度を増加させて、所望のフラックスを達成するための活性（ｋｃａｔ）；タンパク質収率および全体的な経路のフラックスを増大させるための発現レベル；好気的条件において、空気に感受性の酵素を操作するための酸素安定性；ならびに酸素の非存在下において、好気的酵素を操作するための嫌気性下での活性が挙げられる。
下記に、特定の酵素の所望の特性を標的にする、遺伝子の変異誘発および多様化のために開発されている、例示的な方法をより詳細に記載する。そのような方法は、当業者に周知である。これらのいずれかを使用して、メタクリル酸経路、メタクリレートエステル経路、３−ヒドロキシイソブチレート経路および／または２−ヒドロキシイソブチレート経路の酵素またはタンパク質の活性を変化させることおよび／または最適化することができる。
ＥｐＰＣＲ（Ｐｒｉｔｃｈａｒｄら、Ｊ Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．、２３４巻：４９７〜５０９頁（２００５年））は、ＰＣＲ反応におけるＤＮＡポリメラーゼの忠実度を、Ｍｎ２＋イオンの添加により、ｄＮＴＰ濃度の偏りにより、または他の条件の変更により低下させることによって、ランダム点変異を導入する。変異誘発を対象の標的遺伝子に限定するための、５つのステップのクローニングプロセスは、１）対象の遺伝子の誤りがちのＰＣＲ増幅；２）制限酵素消化；３）所望のＤＮＡ断片のゲル精製；４）ベクターへのライゲーション；５）遺伝子バリアントの適切な宿主への形質転換、および改善された性能についてのライブラリーのスクリーニングを含む。この方法は、単一の遺伝子中に複数の変異を同時に生成することができ、所望の活性を有する、より多数の潜在的なバリアントをスクリーニングするのに有用であり得る。多数の変異体を、ＥｐＰＣＲにより生成することができ、したがって、高スループットスクリーニングアッセイ、または例えば、ロボット工学を使用する選択方法が、望ましい特徴を有する変異体を同定するのに有用である。
誤りがちのローリングサークル増幅（Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ｅｐＲＣＡ）（Ｆｕｊｉｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、３２巻：ｅ１４５頁（２００４年）；およびＦｕｊｉｉら、Ｎａｔ． Ｐｒｏｔｏｃ．、１巻：２４９３〜２４９７頁（２００６年））は、ｅｐＰＣＲと同じエレメントの多くを有し、ただし、環状プラスミド全体が、鋳型として使用され、最後の２つのヌクレオチド上にエキソヌクレアーゼ抵抗性のチオホスフェート連結を有する、ランダムな６塩基長を使用して、プラスミドを増幅し、続いて、細胞への形質転換を行い、細胞中で、該プラスミドは、タンデムリピートにおいて再環状化する。Ｍｎ２＋濃度を調節することによって、変異速度を若干変化させることができる。この技法は、３〜４つの変異／ｋｂｐを有するプラスミドの完全なコピーを生み出すために、単純な、誤りがちの、単一ステップの方法を使用する。制限酵素消化も特定のプライマーも必要としない。さらに、この方法は典型的には、商業的に入手可能なキットとして入手可能でもある。
ＤＮＡシャフリング（ＤＮＡ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）またはファミリーシャフリング（Ｆａｍｉｌｙ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９１巻：１０７４７〜１０７５１頁（１９９４年））；およびＳｔｅｍｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、３７０巻：３８９〜３９１頁（１９９４年））は、典型的には、２つ以上のバリアント遺伝子を、ヌクレアーゼ、例として、Ｄｎａｓｅ ＩまたはＥｎｄｏＶを用いて消化して、ランダムな断片のプールを生成し、これらの断片を、ＤＮＡポリメラーゼの存在下でのアニーリングおよび伸長のサイクルにより再度組み立てて、キメラ遺伝子のライブラリーを生み出すことに関与する。断片が、相互にプライムし、１つのコピーが、別のコピーとプライムする場合に、組換えが生じる（鋳型スイッチ）。この方法は、＞１ｋｂｐのＤＮＡ配列に関して使用することができる。断片の再組立てにより生み出される変異による組換え体に加えて、この方法は、伸長ステップにおいて、点変異を、誤りがちのＰＣＲに類似する率で導入する。この方法を使用して、有害変異、ランダム変異および中立変異を除去することができる。
互い違いの伸長（Ｓｔａｇｇｅｒｅｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）（ＳｔＥＰ）（Ｚｈａｏら、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６巻：２５８〜２６１頁（１９９８年））は、鋳型のプライミングを引き起こし、続いて、変性および非常に短い期間（５秒程度の短さ）のアニーリング／伸長が伴う２段階ＰＣＲのサイクルが繰り返される。成長しつつある断片が、異なる鋳型にアニールし、さらに伸長し、これを、完全長配列が作られるまで繰り返す。鋳型スイッチは、結果として生じたほとんどの断片が複数の親を有することを意味する。低い忠実度のポリメラーゼの組合せ（ＴａｑとＭｕｔａｚｙｍｅ）は、反対の変異スペクトルにより、誤りがちの偏りを低下させる。
ランダムプライミング組換え（Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｉｎｇ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）（ＲＰＲ）では、ランダムな配列のプライマーを使用して、鋳型の異なるセグメントに相補的な、多くの短いＤＮＡ断片を生成する（Ｓｈａｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、２６巻：６８１〜６８３頁（１９９８年））。ｅｐＰＣＲを介する塩基の誤った組込みおよび誤ったプライミングが、点変異をもたらす。短いＤＮＡ断片が、相同性に基づいて相互にプライムし、熱サイクリングを繰り返すことによって、組み換えられ、完全長に再度組み立てられる。このステップの前に鋳型を除去することによって、確実に、親の組換え体を減らす。この方法も、ほとんどの他の方法と同様、複数回にわたり反復して実施して、明確に異なる特性を進化させることができる。この技術は、配列の偏りを回避し、遺伝子の長さに依存せず、適用に非常に少ない親ＤＮＡしか必要としない。
ヘテロ二重鎖組換え（Ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）では、線形化プラスミドＤＮＡを使用して、ミスマッチ修復により修復されるヘテロ二重鎖を形成する（Ｖｏｌｋｏｖら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２７巻：ｅ１８頁（１９９９年）；およびＶｏｌｋｏｖら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、３２８巻：４５６〜４６３頁（２０００年））。ミスマッチ修復ステップは、少なくとも若干変異原性である。ヘテロ二重鎖は、直鎖のホモ二重鎖よりも効率的に形質転換する。この方法は、大きな遺伝子およびオペロン全体に適している。
一過性鋳型上におけるランダムキメラ形成（Ｒａｎｄｏｍ Ｃｈｉｍｅｒａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｎ Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｔｅｍｐｌａｔｅｓ）（ＲＡＣＨＩＴＴ）（Ｃｏｃｏら、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９巻：３５４〜３５９頁（２００１年））は、Ｄｎａｓｅ Ｉによる断片化および一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）のサイズ分画を用いる。相同な断片を、ポリメラーゼの非存在下において、相補的なｓｓＤＮＡ骨格にハイブリダイズさせる。オーバーラップする、ハイブリダイズしていない断片の任意の末端が、エキソヌクレアーゼにより刈り込まれる。断片間のギャップが埋められ、次いで、ライゲーションされて、増幅を妨害するＵを含有する骨格にハイブリダイズした完全長の多様な鎖のプールが生じる。次いで、骨格は破壊され、ＰＣＲ増幅により、前記多様な鎖に相補的な新しい鎖で置き換えられる。この方法は、一方の親のみに由来する１つの鎖（骨格）を必要とし、一方、プライミング断片は、他の遺伝子から得られ、親の骨格が、それに対して選択される。したがって、親の断片との再アニーリングは生じない。オーバーラップする断片を、エキソヌクレアーゼを用いて刈り込む。この点以外は、この方法は、ＤＮＡシャフリングおよびＳｔＥＰに概念的に類似する。したがって、同胞はおらず、不活性体はほとんどなく、未シャフルの親（ｐａｒｅｎｔａｌ）はないはずである。この技法には、親遺伝子が、ほとんどまたは全く生み出されず、標準的なＤＮＡシャフリングと比べて、さらに多くのクロスオーバーが生じ得るという点で利点がある。
切断型鋳型上における組換え伸長（Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｏｎ Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ）（ＲＥＴＴ）は、鋳型のプールとして使用される一方向性のｓｓＤＮＡ断片の存在下において、プライマーから一方向性に成長しつつある鎖の鋳型スイッチを引き起こす（Ｌｅｅら、Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ｃａｔａｌｙｓｉｓ、２６巻：１１９〜１２９頁（２００３年））。ＤＮＡエンドヌクレアーゼは使用されない。一方向性のｓｓＤＮＡは、ランダムプライマーを用いてＤＮＡポリメラーゼによってか、またはエキソヌクレアーゼを用いる段階的な欠失によって作製される。一方向性のｓｓＤＮＡは、鋳型に過ぎず、プライマーではない。ランダムプライミングおよびエキソヌクレアーゼによって、ＤＮＡシャフリング／ＲＡＣＨＩＴＴの酵素による切断の場合のような配列の偏りは導入されない。ＲＥＴＴは、非常に短い伸長に代わって、通常のＰＣＲ条件を使用するので、最適化するのが、ＳｔＥＰよりも容易であり得る。ＰＣＲステップの構成成分として組換えが生じ、すなわち、これは、直接的なシャフリングではない。この方法はまた、停止が存在しないことに起因して、ＳｔＥＰよりもランダムな場合もある。
縮重オリゴヌクレオチド遺伝子シャフリング（Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｇｅｎｅ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（ＤＯＧＳ）では、縮重プライマーを使用して、分子間の組換えを制御する；（ＢｅｒｇｑｕｉｓｔおよびＧｉｂｂｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、３５２巻：１９１〜２０４頁（２００７年）；Ｂｅｒｇｑｕｉｓｔら、Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ、２２巻：６３〜７２頁（２００５年）；Ｇｉｂｂｓら、Ｇｅｎｅ、２７１巻：１３〜２０頁（２００１年））。これを使用して、他の方法、例として、ＤＮＡシャフリングの、親遺伝子を再生する傾向を制御することができる。この方法を、選択された遺伝子セグメントのランダム変異誘発（ｅｐＰＣＲ）と組み合わせることができる。これは、親配列の再形成をブロックするには良い方法となり得る。エンドヌクレアーゼは必要でない。作製されたセグメントのインプット濃度を調節することによって、所望の骨格に向けて偏らせることができる。この方法により、無関係の親からのＤＮＡシャフリングが制限酵素消化なしで可能になり、ランダム変異誘発の方法の選択が可能になる。
ハイブリッド酵素の創出のための漸進的切断（Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｒｅａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｙｂｒｉｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ）（ＩＴＣＨＹ）は、対象の遺伝子または遺伝子断片の１塩基対の欠失を有するコンビナトリアルライブラリーを生み出す（Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９６巻：３５６２〜３５６７頁（１９９９年）；およびＯｓｔｅｒｍｅｉｅｒら、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７巻：１２０５〜１２０９頁（１９９９年））。切断は、２つの異なる遺伝子の一部（ｐｉｅｃｅ）で、反対の方向に導入される。これらが、一緒にライゲーションされ、融合体が、クローニングされる。この技法は、２つの親遺伝子間の相同性を必要としない。ＩＴＣＨＹを、ＤＮＡシャフリングと組み合わせる場合、この系は、ＳＣＲＡＴＣＨＹと呼ばれる（下記を参照）。両方の主要な利点は、親遺伝子間の相同性の必要性がないことである。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉとヒトの遺伝子との間の機能性融合体が、ＩＴＣＨＹを介して生み出された。ＩＴＣＨＹライブラリーを作製すると、全ての可能なクロスオーバーが獲得される。
ハイブリッド酵素の創出のためのチオ−漸進的切断（Ｔｈｉｏ−Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｒｅａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｙｂｒｉｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ）（ＴＨＩＯ−ＩＴＣＨＹ）は、ホスホチオエートｄＮＴＰを使用して切断部を生成することを除いては、ＩＴＣＨＹに類似する（Ｌｕｔｚら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、２９巻：Ｅ１６頁（２００１年））。ＩＴＣＨＹと比べて、ＴＨＩＯ−ＩＴＣＨＹは、最適化するのがより容易であり得、より高い再現性、および調節性をもたらすことができる。
ＳＣＲＡＴＣＨＹは、遺伝子を組み換えるための２つの方法、ＩＴＣＨＹとＤＮＡシャフリングとを組み合わせる（Ｌｕｔｚら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９８巻：１１２４８〜１１２５３頁（２００１年））。ＳＣＲＡＴＣＨＹにより、ＩＴＣＨＹおよびＤＮＡシャフリングの最良の特徴が組み合わさる。最初に、ＩＴＣＨＹを使用して、遺伝子の断片間の融合体の包括的なセットを、ＤＮＡ相同性に依存しない様式で生み出す。次いで、この人工的なファミリーをＤＮＡシャフリングのステップにかけて、クロスオーバーの数を増強する。最適化において、コンピュータによる予測を使用することができる。配列同一性が８０％を下回る場合に、ＳＣＲＡＴＣＨＹは、ＤＮＡシャフリングよりも有効である。
ランダムドリフト変異誘発（Ｒａｎｄｏｍ Ｄｒｉｆｔ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＲＮＤＭ）では、変異を、ｅｐＰＣＲを介して作り、続いて、使用可能な活性を維持する変異についてスクリーニング／選択を行う（Ｂｅｒｇｑｕｉｓｔら、Ｂｉｏｍｏｌ． Ｅｎｇ．、２２巻：６３〜７２頁（２００５年））。次いで、これらをＤＯＧＳにおいて使用して、複数の活性な変異体間の融合、または活性な変異体と何らかの、他の望ましい親との間の融合を有する組換え体を生成する。中立の変異の単離を促すために設計され、その目的は、触媒活性の維持についてのスクリーニングであり、この活性は、元々の遺伝子における活性よりも高くてもまたは低くても構わない。ＲＮＤＭは、高スループットアッセイにおいて使用可能であり、この場合、スクリーニングにより、バックグラウンドを上回る活性を検出することが可能になる。ＲＮＤＭは、多様性を生成するに際して、ＤＯＧＳに至る初期段階（ｆｒｏｎｔ ｅｎｄ）として使用されている。この技法には、シャフリングまたは他の続くステップの前に活性についての要件が課せられる。中立のドリフトのライブラリーは、より小さなライブラリーから、活性のより高い／より速い改善が得られることを示す。公開は、ｅｐＰＣＲを使用してなされているが、これは、他の大規模な変異誘発の方法に適用することができる。
配列飽和変異誘発（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＳｅＳａＭ）は、ランダム変異誘発の方法であり、この方法は、１）ランダムな長さの断片のプールを、ホスホチオエートヌクレオチドのランダムな組込みおよび切断を使用して生成し；このプールを鋳型として使用して、２）「ユニバーサル」塩基、例として、イノシンの存在下において伸長し、；３）イノシンを含有する相補体の複製により、ランダムな塩基の組込みをもたらし、その結果、変異誘発をもたらす（Ｗｏｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｊ．、３巻：７４〜８２頁（２００８年）；Ｗｏｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３２巻：ｅ２６頁（２００４年）；およびＷｏｎｇら、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３４１巻：１８７〜１８９頁（２００５年））。この技法を使用すれば、単純な方法を使用して、変異体の大きなライブラリーを２〜３日以内に生成することが可能になり得る。この技法は、ＤＮＡポリメラーゼの変異の偏りと比較すれば、無方向性である。このアプローチの差により、この技法は、ｅｐＰＣＲを補完する（またはｅｐＰＣＲの代替になる）。
合成シャフリング（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）では、オーバーラップするオリゴヌクレオチドが、「標的における全ての遺伝子多様性」をコードし、シャフルされた子孫について非常に高い多様性を可能にするように設計される（Ｎｅｓｓら、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０巻：１２５１〜１２５５頁（２００２年））。この技法では、断片を、シャフルされるように設計することができる。これにより、結果として生じる子孫の多様性の増大が促進される。配列／コドンの偏りを設計して、関係がより薄い配列を、より密接に関係のある配列に関して観察される率に近い率で組み換えることができる。さらに、この技法では、鋳型の遺伝子を物理的に保有する必要もない。
ヌクレオチド交換および切除技術（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｅｘｃｈａｎｇｅ ａｎｄ Ｅｘｃｉｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）ＮｅｘＴは、ｄＵＴＰの組込みの組合せを利用し、続いて、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、次いで、ピペリジンを用いて処理して、エンドポイントＤＮＡ断片化を実施する（Ｍｕｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３３巻：ｅ１１７頁（２００５年））。プルーフリーディングポリメラーゼによる内部ＰＣＲプライマー伸長を使用して、遺伝子を再度組み立てる。様々なｄＵＰＴ：：ｄＴＴＰの比を使用すれば、シャフリングのためのサイズは、直接制御可能である。これは、ウラシルの組込みおよび切断ための単純な方法を使用するエンドポイント反応である。この方法と共に、他のヌクレオチド類似体、例として、８−オキソ−グアニンを使用することができる。さらに、この技法は、非常に短い断片（８６ｂｐ）を用いても良好に働き、誤り率も低い。この技法において使用するＤＮＡの化学的切断の結果、未シャフルのクローンは非常に少数しか生じない。
配列相同性に依存しないタンパク質の組換え（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）（ＳＨＩＰＲＥＣ）では、リンカーを使用して、関係の薄いまたは無関係の２つの遺伝子間の融合を促進する。ヌクレアーゼ処理を使用して、２つの遺伝子間の様々なキメラを生成する。これらの融合体から、単一クロスオーバーハイブリッドのライブラリーが得られる（Ｓｉｅｂｅｒら、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９巻：４５６〜４６０頁（２００１年））。これにより、限定されたタイプのシャフリングが生じ、変異誘発には、別個のプロセスが必要である。さらに、相同性が必要でないことから、この技法により、２つの無関係の親遺伝子のそれぞれの各種の画分を有するキメラのライブラリーを生み出すことができる。ＳＨＩＰＲＥＣが、哺乳動物のＣＰ４５０のＮ−末端領域に融合させた、細菌のＣＰ４５０のヘム結合ドメインに関して試験された。これから、より溶解性の酵素において哺乳動物の活性が得られた。
Ｇｅｎｅ Ｓｉｔｅ Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（商標）（ＧＳＳＭ（商標））では、開始材料が、挿入部を含有するスーパーコイルｄｓＤＮＡプラスミド、および変異の所望の部位において縮重している２つのプライマーである（Ｋｒｅｔｚら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、３８８巻：３〜１１頁（２００４年））。対象の変異を担持するプライマーが、ＤＮＡの反対の鎖上の同じ配列にアニールする。典型的には、変異は、プライマーの中央にあり、変異の両側には、正しい配列のおよそ２０個のヌクレオチドが隣接する。プライマー中の配列は、ＮＮＮまたはＮＮＫ（コード）、およびＭＮＮ（非コード）である（Ｎ＝４つ全て、Ｋ＝Ｇ、Ｔ、Ｍ＝Ａ、Ｃ）。伸長の後に、ＤｐｎＩを使用して、ｄａｍ−メチル化ＤＮＡを消化し、野生型の鋳型を排除する。この技法は、所与の遺伝子座（すなわち、１つのコドン）における全ての可能なアミノ酸置換を調査する。この技法は、ナンセンスコドンを有さない単一部位における全ての可能な置換えの生成を促進し、その結果、ほとんどの可能な対立遺伝子を、等しい形からほぼ等しい形で提示する。この技法では、標的酵素の構造、機構またはドメインについての事前の知識は必要でない。この技術は、続いて、シャフリングまたは遺伝子の再組立てが行われる場合、単一部位の変異上昇（ｕｐ−ｍｕｔａｔｉｏｎ）の全ての可能な組合せを含有する組換え体の多様なライブラリーを生み出す。５０個を上回る異なる酵素の進化を成功させる場合に、また、所与の酵素に２つ以上の特性をもたらす場合にも、この技術による組合せの有用性が示されている。
コンビナトリアルカセット変異誘発（Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃａｓｓｅｔｔｅ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＣＣＭ）では、短いオリゴヌクレオチドカセットを使用して、限定的な領域を、多数の可能なアミノ酸配列の変化で置き換える（Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２０８巻：５６４〜５８６頁（１９９１年）；およびＲｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１巻：５３〜５７頁（１９８８年））。この技法を使用すれば、２または３つの部位において同時に置換することが可能になる。さらに、この方法は、限定的な範囲の部位における、非常に多数の可能な配列変化も試験する。この技法は、ラムダリプレッサーのＤＮＡ結合ドメインの情報量を調査するために使用されている。
コンビナトリアル複数カセット変異誘発（Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｃａｓｓｅｔｔｅ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＣＭＣＭ）は本質的には、ＣＣＭに類似し、ただし、これは、より大きなプログラムの一部として用いられる。すなわち、１）ｅｐＰＣＲを、高い変異率で使用して、２）ホットスポットおよびホット領域を同定し、次いで、３）ＣＭＣＭにより伸長して、タンパク質配列空間の定義された領域を網羅する（Ｒｅｅｔｚら、Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ Ｅｎｇｌ．、４０巻：３５８９〜３５９１頁（２００１年））。ＣＣＭと同様、この方法により事実上、標的領域上の全ての可能な変化を試験することができる。この方法は、ランダム変異およびシャフルされた遺伝子を生み出すための方法と併せて使用すると、多様なシャフルされたタンパク質を生成する優れた手段になる。このアプローチにより、酵素のエナンチオ選択性を５１倍増大させることに成功した。
ミューテーター株技法（Ｍｕｔａｔｏｒ Ｓｔｒａｉｎｓ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）では、条件付ｔｓミューテータープラスミドにより、選択の間に、ランダムなおよび天然の変異の頻度を２０〜４０００倍増大させることが可能になり、選択が必要でない場合、有害な変異が蓄積するのがブロックされる（Ｓｅｌｉｆｏｎｏｖａら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６７巻：３６４５〜３６４９頁（２００１年））。この技術は、プラスミド由来のｍｕｔＤ５遺伝子に基づき、この遺伝子は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩの変異体サブユニットをコードする。このサブユニットは、内因性ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩに結合し、プラスミドを有する任意の株において、ポリメラーゼＩＩＩのプルーフリーディング能力を損なう。広い範囲の塩基置換およびフレームシフト変異が起こる。有効に使用するために、所望の表現型が達成されたら、前記ミューテータープラスミドは除去すべきである。これは、４１℃においてプラスミドの除去（ｐｌａｓｍｉｄ ｃｕｒｉｎｇ）を可能にする温度感受性の（ｔｓ）複製開始点を通して達成される。ミューテーター株はかなり長い間調査されていることに留意すべきである（Ｌｏｗら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２６０巻：３５９〜３６８０頁（１９９６年）を参照）。この技法では、非常に高い自然発生の変異率が観察される。条件付特性により、望まれないバックグラウンドの変異が最小限に留められる。この技術を、適応進化と組み合わせて、変異誘発率を増強し、所望の表現型をより迅速に達成することができる。
ルックスルー変異誘発（Ｌｏｏｋ−Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＬＴＭ）は、選択されたアミノ酸のコンビナトリアル変異を評価し、最適化する、多次元の変異誘発の方法である（Ｒａｊｐａｌら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１０２巻：８４６６〜８４７１頁（２００５年））。全ての可能なアミノ酸変化で各部位を飽和させるのではなく、９つからなるセットを選んで、アミノ酸のＲ基の化学的性質の範囲を網羅する。１つの部位当たりの変化がより少ないことにより、複数の部位をこのタイプの変異誘発に付すことが可能になる。低ナノモル濃度〜ピコモル濃度の抗体についての結合親和性の＞８００倍の増加が、この方法を通して達成されている。これは、ランダムな組合せの数を最小限に留めるための合理的なアプローチであり、改善された形質を見出す能力を、スクリーニングしようとするクローンの数を大幅に減少させることによって増やすことができる。これは、抗体の工学的操作、具体的には、結合親和性を増大させること、および／または解離を低下させることとに適用されている。この技法は、スクリーニングまたは選択のいずれかと組み合わせることができる。
遺伝子の再組立て（Ｇｅｎｅ Ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ）は、複数の遺伝子に一度に適用すること、または単一の遺伝子のキメラの大きなライブラリー（複数の変異）を生み出すために適用することができる、ＤＮＡシャフリング方法である（Ｖｅｒｅｎｉｕｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより供給されるＴｕｎａｂｌｅ ＧｅｎｅＲｅａｓｓｅｍｂｌｙ（商標）（ＴＧＲ（商標））技術）。典型的には、この技術は、超高スループットスクリーニングと組み合わせて使用して、所望の改善について、提示された配列空間のクエリーを行う。この技法により、相同性に依存しない複数の遺伝子組換えが可能になる。クロスオーバー事象の正確な数および位置を、バイオインフォマティクス解析を介して設計された断片を使用してあらかじめ決定することができる。この技術により、親遺伝子を事実上再形成することなく、非常に高いレベルの多様性、および低いレベルの不活性な遺伝子がもたらされる。ＧＳＳＭ（商標）と組み合わせると、大きな範囲の変異を、改善された活性について試験することができる。この方法により、ＤＮＡシャフリングの「ブレンディング」および「微調整」が可能になり、例えば、コドンの使用を最適化することができる。
インシリコのタンパク質設計の自動化（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ）（ＰＤＡ）は、特定の折畳みを有する、構造的に定義されたタンパク質骨格をアンカーし、折畳みおよび全体的なタンパク質のエネルギー特性を安定化させることができるアミノ酸置換について、配列空間を検索する最適化アルゴリズムである（Ｈａｙｅｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９９巻：１５９２６〜１５９３１頁（２００２年））。この技術は、タンパク質のアミノ酸変異に対する構造的な許容度について検索するために、インシリコの構造に基づく、エントロピーの予測を使用する。統計力学を適用して、各位置におけるカップリング相互作用を計算する。アミノ酸置換に対する構造的な許容度が、カップリングの尺度である。最終的に、この技術は、構造的な特徴の完全性を維持しながら、タンパク質の特性の所望の改変を得るように設計される。この方法は、コンピュータによる評価を行い、非常に多数の可能な配列バリアント（１０５０個）をフィルターにかけることを可能にする。試験すべき配列バリアントの選択は、最も好ましい熱力学に基づく予測に関連する。明らかに、安定性または安定性に関連する特性のみが、この技術を用いて有効に処理され得る。この方法は、いくつかの治療用タンパク質、とりわけ、工学的に操作された免疫グロブリンにおいて首尾よく使用されている。インシリコの予測により、並外れて多数の潜在的なバリアントを試験することが回避される。現存する三次元構造に基づく予測は、仮定上の構造に基づく予測よりも成功する可能性が高い。この技術により、複数の同時変異を容易に予測することができ、複数の同時変異の、標的を定めたスクリーニングが可能になり、こうしたスクリーニングは、純粋に実験による技術では、数の指数関数的な増加に起因して幾分不可能である。
反復飽和変異誘発（Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＩＳＭ）は、１）構造／機能の知識を使用して、酵素の改善に有望な部位を選ぶこと；２）飽和変異誘発を、選ばれた部位において、変異誘発の方法、例として、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を使用して実施すること；３）所望の特性についてスクリーニング／選択すること；および４）改善されたクローン（複数可）を使用して、別の部位において再度始め、所望の活性が達成されるまで繰り返し続けることを含む（Ｒｅｅｔｚら、Ｎａｔ． Ｐｒｏｔｏｃ．、２巻：８９１〜９０３頁（２００７年）；およびＲｅｅｔｚら、Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ Ｅｎｇｌ．、４５巻：７７４５〜７７５１頁（２００６年））。これは、実績のある方法論であり、これにより確実に、所与の位置における全ての可能な置換えが、スクリーニング／選択のためになされる。
変異誘発のための上記の方法はいずれも、単独で、または任意に組み合わせて使用することができる。さらに、本明細書に記載するように、定向進化の方法は、いずれか１つを、またはそれらを組み合わせて、適応進化の技法と併せて使用してもよい。
（実施例Ｉ）
例示的なメタクリル酸経路の酵素
この実施例は、メタクリル酸の生成のための例示的な経路を記載する。
図１は、アセチルＣｏＡおよびピルベートからＭＡＡへの、中間体シトラマレートを介した例示的な経路を図示する。また、アコニテートからＭＡＡへの経路も、示される。１つの経路において、アセチルＣｏＡおよびピルベートは、まず、シトラマル酸シンターゼによって、シトラマレートに転換される。シトラマレートの脱水は、シトラコネート（ステップＢ）またはメサコネート（ステップＣ）のいずれかを生じ得る。メサコネートおよびシトラコネートは、シス／トランスイソメラーゼによって、ステップＧにおいて相互転換される。メサコネート（ステップＨ）またはシトラコネート（ステップＣ）の脱カルボキシル化は、ＭＡＡを生じる。代替の経路において、シトラマレートは、アセチルＣｏＡおよびピルベートから、シトラマリルＣｏＡ中間体を介して、ステップＤおよびＥにおいて形成され、シトラマリルＣｏＡリアーゼおよびシトラマリル−ｃｏＡヒドロラーゼ、トランスフェラーゼまたはシンテターゼによって触媒される。
また、アコニテートからＭＡＡへの経路も、例示される。１つの経路において、アコニテートは、まず、アコニット酸デカルボキシラーゼによって、イタコネートへと脱カルボキシル化される（ステップＩ）。イタコネートは、次いで、イタコン酸デルタ−イソメラーゼによって、シトラコネートへと異性体化される（ステップＪ）。シトラコネートのＭＡＡへの転換は、脱カルボキシル化によって直接進むか、またはメサコネートを介して間接的に進むかのいずれかである。代替の経路において、イタコネート中間体は、まず、ＣｏＡトランスフェラーゼまたはシンテターゼによって、イタコニルＣｏＡへと転換される（ステップＬ）。イタコニルＣｏＡの水和は、シトラマリルＣｏＡを生じ、これは、上で記載されそして図１において示されるように、次いで、ＭＡＡへと転換される。
表１は、図１において示されるステップを実施可能である酵素クラスを示す。例示的な酵素は、下でさらに詳細に記載される。
ＥＣ２．３．１．ａ シンターゼ（ステップＡ）。シトラマル酸シンターゼ（ＥＣ２．３．１．１８２）は、アセチルＣｏＡおよびピルベートのシトラマレートおよび補酵素Ａへの転換を触媒する。この酵素は、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（Ｈｏｗｅｌｌら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１巻、３３１〜３３３頁（１９９９年））、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｒｏｇａｎｓ（Ｘｕら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６巻、５４００〜５４０９頁（２００４年））およびＧｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ（Ｒｉｓｓｏら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１９０巻、２２６６〜２２７４頁（２００８年））などの古細菌に見出される、イソロイシン生合成のトレオニン非依存型経路に関わる。この酵素は、ｉｎ ｖｉｖｏで合成方向に作用するが、基質としてピルベートに対して非常に特異的であり、典型的には、イソロイシンによって阻害される。定向進化によって開発されたＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来の組換えシトラマル酸シンターゼは、非常に活性であり、イソロイシンによる阻害を欠く（Ａｔｓｕｍｉら、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７４巻、７８０２〜７８０８頁（２００８年））。シトラマル酸シンターゼ活性もまた、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍのシトラマル酸回路の酢酸同化経路において実証されたが、この活性に関連する遺伝子は、同定されなかった（Ｂｅｒｇら、Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｉａ ７８巻、２２〜３１頁（２００９年））。
ＥＣ２．８．３．ａ ＣｏＡトランスフェラーゼ（ステップＥ）。ＣｏＡトランスフェラーゼは、１つの分子から別の分子へのＣｏＡ部分の可逆的転移を、触媒する。図１における２つの変換は、ＣｏＡトランスフェラーゼを利用する：シトラマリルＣｏＡのシトラマレートへの転換（ステップＥ）およびイタコネートのイタコニルＣｏＡへの活性化（ステップＬ）。図１のステップＥにおけるシトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．７および２．８．３．１１）は、シトラマリルＣｏＡ由来のＣｏＡ部分を、供与体へと転移させる。シトラマル酸：スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ酵素は、グリオキシル酸同化の３−ヒドロキシプロピオン酸回路において活性である。この酵素は、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓにおけるｓｓｔによってコードされ、これは、シトラマリルＣｏＡリアーゼをコードする遺伝子の上流に位置する（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８８巻、６４６０〜６４６８頁（２００６年））。この酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてクローニングされ、異種性に発現させられ、特徴付けされた。この酵素はまた、イタコン酸：スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼとしても活性である。類似の酵素は、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ種ＲＳ−１およびＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｇｇｒｅｇａｎｓにおいて、配列同一性およびシトラマリルＣｏＡリアーゼ遺伝子に対する近接性によって、見出される。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種Ｂ２ａｂａにおいて特徴付けされたＣｏＡトランスフェラーゼは、シトラマリル（ｃｉｔｒａｍｌａｙｌ）ＣｏＡトランスフェラーゼ活性およびイタコニルＣｏＡトランスフェラーゼ活性の両方を示し、生物体が、イタコネートおよびシトラマレートの両方において成長することを可能にする（Ｃｏｏｐｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ ９１巻、８２〜９１頁（１９６４年））。この酵素に関連する遺伝子は、同定されていない。シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ活性もまた、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｙｄａｎｓの細胞抽出物において検出され、これは、効率的にイタコネートをシトラマレートへ転換する（Ｈｅら、Ｊ Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｅｎｇ．８９巻、３８８〜３９１頁（２０００年））。関連の遺伝子は不明であるが、この遺伝子は、最も高いタンパク質配列類似性Ｓｓｔを有する。
これらの変換を触媒するためのさらなる候補酵素としては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉのｃａｔ１、ｃａｔ２およびｃａｔ３の遺伝子産物が挙げられ、これは、それぞれ、スクシニルＣｏＡ活性、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡ活性およびブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ活性を示すことが示されている（Ｓｅｅｄｏｒｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ １０５巻、２１２８〜２１３３頁（２００８年）；Ｓｏｈｌｉｎｇら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８巻、８７１〜８８０頁（１９９６年））。類似のＣｏＡトランスフェラーゼ活性はまた、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ（ｖａｎ Ｇｒｉｎｓｖｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２８３巻、１４１１〜１４１８頁（２００８年））およびＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ（Ｒｉｖｉｅｒｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９巻、４５３３７〜４５３４６頁（２００４年））においても示される。
嫌気性細菌Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ由来のグルタコニルＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１２）酵素は、２，３−デヒドロアジピルＣｏＡと構造が似ている基質である、グルタコニルＣｏＡおよび３−ブテノイルＣｏＡと反応する（Ｍａｃｋら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２６巻、４１〜５１頁（１９９４年））。この酵素をコードする遺伝子は、ｇｃｔＡおよびｇｃｔＢである。この酵素は、他のＣｏＡ誘導体（グルタリルＣｏＡ、２−ヒドロキシグルタリルＣｏＡ、アジピルＣｏＡ、クロトニルＣｏＡおよびアクリリルＣｏＡが挙げられる）に対して、低減しているが検出可能な活性を有する（Ｂｕｃｋｅｌら、Ｅｕｒ．Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８巻、３１５〜３２１頁（１９８１年））。この酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてクローニングされ、発現されている（Ｍａｃｋら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２６巻、４１〜５１頁（１９９４年））。グルタコン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ活性もまた、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｙｍｂｉｏｓｕｍにおいて検出されている。さらなるグルタコン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ酵素は、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓタンパク質配列に対する相同性によって推測され得る。
アセチルＣｏＡをＣｏＡ供与体として利用可能であるＣｏＡトランスフェラーゼは、アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼであり、Ｅ．ｃｏｌｉ ａｔｏＡ（アルファサブユニット）およびａｔｏＤ（ベータサブユニット）遺伝子によってコードされている（Ｋｏｒｏｌｅｖら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５８巻、２１１６〜２１２１頁（２００２年）；Ｖａｎｄｅｒｗｉｎｋｅｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３３巻、９０２〜９０８頁（１９６８年））。この酵素は、広い基質範囲を有し（Ｓｒａｍｅｋら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１７１巻、１４〜２６頁（１９７５年））、そして、種々の分枝鎖状および直鎖状のアシルＣｏＡ基質（イソブチレート（Ｍａｔｔｈｉｅｓら、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５８巻、１４３５〜１４３９頁（１９９２年））、バレレート（Ｖａｎｄｅｒｗｉｎｋｅｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３３巻、９０２〜９０８頁（１９６８年））およびブタノエート（Ｖａｎｄｅｒｗｉｎｋｅｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３３巻、９０２〜９０８頁（１９６８年））が挙げられる）からＣｏＡ部分をアセテートへ転移させることが示されている。この酵素は、アセトアセテートによって転写レベルで誘導される。したがって、調節制御の改変は、この酵素を経路へと工学的に操作するために有用であり得る（Ｐａｕｌｉら、Ｅｕｒ．Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９巻、５５３〜５６２頁（１９７２年））。類似の酵素は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ １３０３２（Ｄｕｎｃａｎら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６８巻、５１８６〜５１９０頁（２００２年））、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ（Ｃａｒｙら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５６巻、１５７６〜１５８３頁（１９９０年）；Ｗｉｅｓｅｎｂｏｒｎら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５５巻、３２３〜３２９頁（１９８９年））、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ（Ｋｏｓａｋａら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．７１巻、５８〜６８頁（２００７年））に存在する。
ＥＣ３．２．１．ａ ＣｏＡヒドロラーゼ（ステップＥ）。３．１．２ ファミリーにおける酵素は、アシルＣｏＡ分子をその対応する酸へと加水分解する。広い基質範囲を有するいくつかのＣｏＡヒドロラーゼは、シトラマリルＣｏＡヒドロラーゼ活性を示す好適な候補である。例えば、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ脳由来のａｃｏｔ１２によってコードされる酵素（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７１巻、９５９〜９６５頁（１９７６年））は、ブチリルＣｏＡ、ヘキサノイルＣｏＡおよびマロニルＣｏＡと反応し得る。ａｃｏｔ８によってコードされるヒトジカルボン酸チオエステラーゼは、グルタリルＣｏＡ、アジピルＣｏＡ、スベリルＣｏＡ、セバシルＣｏＡおよびドデカンジオイルＣｏＡに対する活性を示す（Ｗｅｓｔｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０巻、３８１２５〜３８１３２頁（２００５年））。この酵素に最も近いＥ．ｃｏｌｉホモログであるｔｅｓＢもまた、ある範囲のＣｏＡチオールエステルを加水分解することができる（Ｎａｇｇｅｒｔら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６６巻、１１０４４〜１１０５０頁（１９９１年））。また、類似の酵素が、ラット肝臓において特徴付けされている（Ｄｅａｎａ Ｒ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｉｎｔ ２６巻、７６７〜７７３頁（１９９２年））。Ｅ．ｃｏｌｉにおいてヒドロラーゼ活性を有するさらなる酵素としては、ｙｂｇＣ、ｐａａＩおよびｙｂｄＢが挙げられる（Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖａら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ、２００５年、２９巻（２号）、２６３〜２７９頁；Ｓｏｎｇら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２００６年、２８１巻（１６号）、１１０２８〜３８頁）。その配列は報告されていないが、エンドウの葉のミトコンドリア由来の酵素は、広い基質特異性を有し、アセチルＣｏＡ、プロピオニルＣｏＡ、ブチリルＣｏＡ、パルミトイルＣｏＡ、オレオイルＣｏＡ、スクシニルＣｏＡおよびクロトニルＣｏＡにおいて活性が実証されている（Ｚｅｉｈｅｒら、Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．９４巻、２０〜２７頁（１９９０年））。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のアセチルＣｏＡヒドロラーゼ、ＡＣＨ１は、別の候補ヒドロラーゼを代表する（Ｂｕｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８巻、１７２０３〜１７２０９頁（２００３年））。
なお別の候補ヒドロラーゼは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ由来のグルタコン酸ＣｏＡトランスフェラーゼである。この酵素は、部位特異的変異誘発によって、グルタリルＣｏＡ、アセチルＣｏＡおよび３−ブテノイルＣｏＡに対して活性を有するアシルＣｏＡヒドロラーゼへと変換される（Ｍａｃｋら、ＦＥＢＳ．Ｌｅｔｔ．４０５巻、２０９〜２１２頁（１９９７年））。これは、スクシニルＣｏＡ：３−ケト酸ＣｏＡトランスフェラーゼおよびアセトアセチルＣｏＡ：アセチルＣｏＡトランスフェラーゼをコードする酵素はまた、適切な変異を導入してその機能を上記のように変化させることで、この反応ステップについての候補としても働き得ることを示す。
ＥＣ４．１．１．ａ デカルボキシラーゼ（ステップＣ、Ｈ、Ｊ）。図１におけるＭＡＡの最終ステップは、メサコネートまたはシトラコネートのいずれかの脱カルボキシル化である。シトラコネートデカルボキシラーゼ活性またはメサコネートデカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、現在までに同定されていないが、好適な酵素候補としては、アコニテートのイタコネートへの転換を触媒するアコニット酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６）、４−オキサロクロトネートの２−オキソペンテノエート（ｏｘｏｐｅｎｔｅｎｏａｔｅ）への転換を触媒する４−オキサロクロトン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．７７）、ならびにケイ皮酸デカルボキシラーゼファミリー（ＥＣ４．１．１．−）における酵素が、挙げられる。アコニット酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６）は、Ｃａｎｄｉｄａの株において、およびまた、糸状菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓにおいても、イタコネート生合成における最終ステップを触媒する（Ｂｏｎｎａｒｍｅら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７巻、３５７３〜３５７８頁（１９９５年）；ＷｉｌｌｋｅおよびＶｏｒｌｏｐ、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ５６巻、２８９〜２９５頁（２００１年））。シス−アコニット酸デカルボキシラーゼ（ＣＡＤ）（ＥＣ４．１．１６）は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓから精製されて、そして特徴付けされている（Ｄｗｉａｒｔｉら、Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｅｎｇ． ９４巻（１号）、２９〜３３頁（２００２年））。近年、この遺伝子は、クローニングされ、そして機能的に特徴付けされている（Ｋａｎａｍａｓａら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ８０巻、２２３〜２２９頁（２００８年））および（ＷＯ／２００９／０１４４３７）。ＣＡＤのいくつかの近いホモログが、以下に列挙される（ＥＰ２０１７３４４Ａ１；ＷＯ２００９／０１４４３７Ａ１）。ＣＡＤの遺伝子配列およびタンパク質配列は、以下に列挙されるいくつかの近いホモログと共に、以前に報告された（ＥＰ２０１７３４４Ａ１；ＷＯ２００９／０１４４３７Ａ１）。
４−オキサロクロトン酸（Ｏｘａｌｏｃｒｏｎａｔｅ）デカルボキシラーゼは、４−オキサロクロトネートの２−オキソペンタノエートへの脱カルボキシル化を触媒する。この酵素は、多くの生物体から単離され、そして特徴付けされている。この酵素をコードする遺伝子としては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種（株６００）におけるｄｍｐＨおよびｄｍｐＥ（Ｓｈｉｎｇｌｅｒら、１７４巻、７１１〜７２４頁（１９９２年））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ由来のｘｙｌＩＩおよびｘｙｌＩＩＩ（Ｋａｔｏら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １６８巻、４５７〜４６３頁（１９９７年）；Ｓｔａｎｌｅｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９巻、３５１４頁（２０００年）；Ｌｉａｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６巻、１０４０３〜１０４１１頁（１９９４年））ならびにＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＪＭＰ１３４由来のＲｅｕｔ＿Ｂ５６９１およびＲｅｕｔ＿Ｂ５６９２（Ｈｕｇｈｅｓら、１５８巻、７９〜８３頁（１９８４年））が挙げられる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種（株６００）由来の酵素をコードする遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてクローニングされ、そして発現されている（Ｓｈｉｎｇｌｅｒら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４巻、７１１〜７２４頁（１９９２年））。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａにおけるｘｙｌＩによってコードされる４−オキサロクロトネートデカルボキシラーゼは、ビニルピルビン酸ヒドラターゼと複合体を形成して機能する。ヒドラターゼ活性を欠き、野生型デカルボキシラーゼ活性を維持するこの酵素の組換え形態が、特徴付けされている（Ｓｔａｎｌｅｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９巻、７１８〜２６頁（２０００年））。類似の酵素は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｐｉｃｋｅｔｔｉｉ（正式にはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｉｃｋｅｔｔｉｉ）に見出される（Ｋｕｋｏｒら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３巻、４５８７〜９４頁（１９９１年））。
最後に、デカルボキシラーゼのクラスは、シンナメート（フェニルアクリレート）および置換シンナメート誘導体の、その対応するスチレン誘導体への転換を触媒することが、特徴付けされている。これらの酵素は、種々の生物に共通しており、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてクローニングされ、発現されているこれらの酵素をコードする特定の遺伝子としては、以下が挙げられる：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ由来のｐａｄ １（Ｃｌａｕｓｅｎら、Ｇｅｎｅ １４２巻、１０７〜１１２頁（１９９４年））、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来のｐｄｃ（Ｂａｒｔｈｅｌｍｅｂｓら、６７巻、１０６３〜１０６９頁（２００１年）；Ｑｉら、Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ ９巻、２６８〜２７６頁（２００７年）；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．５６巻、３０６８〜３０７２頁（２００８年））、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ（Ｕｃｈｉｙａｍａら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２巻、１１６〜１２３頁（２００８年）；Ｈａｓｈｉｄｏｋｏら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８巻、２１７〜２１８頁（１９９４年））、Ｐｅｄｉｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ（Ｂａｒｔｈｅｌｍｅｂｓら、６７巻、１０６３〜１０６９頁（２００１年））由来のｐｏｆＫ（ｐａｄ）、ならびにＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ由来のｐａｄＣ（Ｓｈｉｎｇｌｅｒら、１７４巻、７１１〜７２４頁（１９９２年））。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のフェルラ酸デカルボキシラーゼもまた、精製され、特徴付けされている（Ｈｕａｎｇら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６巻、５９１２〜５９１８頁（１９９４年））。このクラスの酵素は、安定であり、外因性のまたは内部的に結合する補因子を必要としない。このことは、これらの酵素を、生体内変化のために理想的に好適にする（Ｓａｒｉａｓｌａｎｉ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１巻、５１〜６９頁（２００７年））。
別の好適な酵素は、ソルビン酸を１，３−ペンタジエンに転換するソルビン酸デカルボキシラーゼである。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒによるソルビン酸脱カルボキシル化は、３つの遺伝子：ｐａｄＡ１、ｏｈｂＡ１およびｓｄｒＡを必要とする（Ｐｌｕｍｒｉｄｇｅら、Ｆｕｎｇ． Ｇｅｎｅｔ． Ｂｉｏ、４７巻、６８３〜６９２頁（２０１０年）。ＰａｄＡ１は、フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼとして注解されており、ｏｈｂＡ１は、推定４−ヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼであり、そしてｓｄｒＡは、ソルビン酸デカルボキシラーゼ調節因子である。いくつかの真菌種および酵母種を含むさらなる種が、ソルビン酸を脱カルボキシル化することが示されている（ＫｉｎｄｅｒｌｅｒｌｅｒおよびＨａｔｔｏｎ、Ｆｏｏｄ Ａｄｄｉｔ Ｃｏｎｔａｍ．、７巻（５号）、６５７〜６９頁（１９９０年）；Ｃａｓａｓら、Ｉｎｔ Ｊ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏ．、９４巻（１号）、９３〜９６頁（２００４年）；ＰｉｎｃｈｅｓおよびＡｐｐｓ、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１６巻、１８２〜１８５頁（２００７年））。例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅおよびＮｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｆｉｓｃｈｅｒｉは、ソルビン酸を脱カルボキシル化すること、およびｐａｄＡ１、ｏｈｂＡ１およびｓｄｒＡに近いホモログを有することが、示されている。
上で挙げられたデカルボキシラーゼのそれぞれは、メサコネートまたはシトラコネートを脱カルボキシル化するための可能性のある好適な酵素を代表する。前記酵素の所望の活性または産生性が所望の転換において観察されない場合、このデカルボキシラーゼ酵素は、公知のタンパク質の工学的操作方法を用いて、必要な性能を達成するように進化させられ得る。重要なことには、このことは、デカルボキシラーゼのＣ末端領域が基質特異性を担うとみられるキメラ酵素の使用を通して、示された（Ｂａｒｔｈｅｌｍｅｂｓら、ＡＥＭ ６７巻、１０６３〜１０６９頁（２００１年））。したがって、メサコネートまたはシトラコネートに対する活性を取得するためにデカルボキシラーゼの特異性を拡大する定向進化実験は、これらの酵素のＣ末端領域に、焦点をあわせ得る。
ＥＣ４．１．３．ａ リアーゼ（ステップＤ）。シトラマリルＣｏＡリアーゼ（ＥＣ４．１．３．２５）は、アセチルＣｏＡおよびピルベートを、シトラマリルＣｏＡへと転換する（図１のステップＤにおいて示される）。この酵素は、グリオキシル酸同化の３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ＨＰ）回路に関わり、ここで、シトラマリルＣｏＡ分解方向において作用する。この酵素は、緑色非硫黄光栄養細菌Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓにおけるｃｃｌ遺伝子によってコードされ（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８９巻、２９０６〜２９１４頁（２００７年））、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子の下流に位置する。ｃｃｌ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、クローニングされ、異種性に発現された。類似の遺伝子クラスターは、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ種ＲＳ−１およびＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｇｇｒｅｇａｎｓに見出されるが、この酵素は、現在までに特徴付けされていない。３−ＨＰ回路はまた、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ（そのゲノムは、ｃｃｌ遺伝子産物に対して高い配列類似性を有するタンパク質をコードする）において活性である（Ｆｉｌａｔｏｖａら、Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｉａ ７４巻、３１９〜３２８頁（２００５年））。Ｂａｃｉｌｌｕｓ種由来のシトラマリルＣｏＡリアーゼは、可逆的であることが示されたが、関連の遺伝子は、現在までに同定されていない（Ｓａｓａｋｉら、Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．７３巻、５９９〜６０８頁（１９７３年））。
ＥＣ４．２．１．ａ デヒドラターゼ（ステップＢ、Ｆ）。図１のステップＢにおけるシトラマレートのシトラコネートへの脱水は、シトラマル酸デヒドラターゼ（シトラコネート形成）活性を有する酵素（ＥＣ４．２．１．３５）によって触媒される。この酵素は、シトラマル酸シンターゼと共に、トレオニン非依存型イソロイシン生合成経路（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉおよびＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｒｏｇａｎｓにおいて特徴付けされた）に関わる。これらの生物体におけるシトラマレートの脱水は、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ（ＩＰＭＩ）によって触媒され、この酵素は、シトラマレートのシトラコネートへの脱水とその後の水のシトラコネートへのトランス付加によるメチルマレートの形成との両方を触媒する（Ｘｕら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６巻、５４００〜５４０９頁（２００４年）；Ｄｒｅｖｌａｎｄら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８９巻、４３９１〜４４００頁（２００７年））。ｈａｃＡＢによってコードされるＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉホモアコニターゼ（ＥＣ４．２．１．１１４）もまた、好適な候補であり、改変された基質特異性およびイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ活性を有するこの酵素の変異体は、特徴付けされている（Ｊｅｙａｋａｎｔｈａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４９巻、２６８７〜２６９６頁（２０１０年））。Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ ＩＰＭＩ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ内にクローニングされ、ここで、この遺伝子は、共に発現された場合、ネイティブのアコニターゼ活性を欠損する株を補うことができる（Ｘｕら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８６巻、５４００〜５４０９頁（２００４年））。シトラマル酸デヒドラターゼもまた、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａにおいて特徴付けされており、ここで、この酵素は、３，５−キシレノール分解に関わる。この経路の酵素（シトラマル酸デヒドラターゼを含む）をコードする遺伝子は、伝達性プラスミドｐＲＡ５００に位置し、Ｅ．ｃｏｌｉ内にクローニングされている（Ｊａｉｎ、Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４５巻、５０２〜５０８頁（１９９６年））。シトラコネートはまた、ＬＥＵ１によってコードされるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．３３）酵素の基質でもある（Ｋｏｈｌｈａｗ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １６６巻、４２３〜４２９頁（１９８８年））。Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａの３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼＬＥＵ１は、ネイティブの基質よりも、シトラコネートに対してより高い活性を示す（Ｂｏｄｅ， Ｒ．およびＢｉｒｎｂａｕｍ， Ｄ．、Ｊ． Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３１巻、２１〜２６頁（１９９１年））。シトラコネートのメチルマレートへの水和活性の減弱化または選択的阻害は、シトラコネート中間体の蓄積の増大に必要とされ得る。
別の好適なシトラマル酸デヒドラターゼ候補は、シス−２−メチルアコニテート（ＥＣ４．２．１．７９）およびトランス−２−メチルアコニテート（ＥＣ４．２．１．１１７）を形成する２−メチルクエン酸デヒドラターゼ酵素である。ｐｒｐＤによってコードされるＥ．ｃｏｌｉの２−メチルクエン酸シス−デヒドラターゼは、基質としてのシトラマレートにおいて活性である（Ｂｌａｎｋら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４８巻、１３３〜１４６頁（２００２年））。シトラコネートも、メサコネートもまた、基質として活性ではなく、このことは、ＰｒｐＤが、厳密に、イソメラーゼよりもむしろデヒドラターゼ酵素であることを示す。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ ＴｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのＰｒｐＤ酵素もまた、特徴付けされているが、シトラマレートにおける活性は、実証されていない（Ｈｏｒｓｗｉｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０巻、４７０３〜４７１３頁（２００１年））。ａｃｎＢおよびａｃｎＤによってコードされる、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓの２−メチルクエン酸デヒドラターゼ酵素もまた、候補である（Ｇｒｉｍｅｋら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８６巻、４５４〜４６２頁（２００４年））。ＡｃｎＤ酵素は、ｉｎ ｖｉｖｏで機能するために、ｐｒｐＦによってコードされる補因子を必要とする。アコニテートとの複合体におけるＰｒｐＦの結晶構造研究は、この酵素が、アコニテートおよび２−メチルアコニテートのシス／トランス異性体を相互転換する、シス／トランスイソメラーゼとして機能することを示す（Ｇａｒｖｅｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ １６巻、１２７４〜１２８４頁（２００７年））。Ｓ．ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ由来のさらなる候補は、ｌｅｕＣＤによってコードされた、予測されたイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼである。
ステップＦにおいて、シトラマレートのメサコネートへの脱水は、２−メチルリンゴ酸デヒドラターゼまたはメサコナーゼとも呼ばれる、シトラマル酸デヒドラターゼによって触媒される（メサコネート形成、ＥＣ４．２．１．３４）。この酵素は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｏｍｏｒｐｈｕｍにおいて部分的にのみ特徴付けされていて、現在、遺伝子候補は利用可能ではない。活性は、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍの細胞抽出物において実証されている（ここでは、アセテート利用のシトラマル酸回路において関わっている）（ＢｅｒｇおよびＩｖａｎｏｖｓｋｉｉ、Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｉａ ７８巻、２２〜３１頁（２００９年））が、関連の遺伝子は、同定されていない。
イタコニルＣｏＡは、イタコニルＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．５６）によってシトラマリルＣｏＡに転換される（図１のステップＫ）。イタコニルＣｏＡヒドラターゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種Ｂ２ａｂａ（ＣｏｏｐｅｒおよびＫｏｒｎｂｅｒｇ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ ９１巻、８２〜９１頁（１９６４年））、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｙｄａｎｓ（Ｈｅら、Ｊ Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｅｎｇ．８９巻、３８８〜３９１頁（２０００年））およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（Ｎａｇａｉ， Ｊ．、Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ、５３巻、１８１〜７頁（１９６３年））などの生物体におけるイタコン酸同化経路に関わる酵素である。この酵素活性は、現在まで、遺伝子に関連づけられていない。
ＥＣ５．２．１．ａ シス／トランスイソメラーゼ（ステップＧ）。メサコネートおよびシトラコネートのシス／トランス異性体化は、シトラコン酸イソメラーゼ活性を有する酵素によって触媒される。好適な候補としては、アコニット酸イソメラーゼ（ＥＣ５．３．３．７）、マレイン酸シス，トランス−イソメラーゼ（ＥＣ５．２．１．１）、マレイルアセトンシス，トランス−イソメラーゼおよび不飽和脂肪酸のシス，トランス−イソメラーゼ（Ｃｔｉ）が挙げられる。
アコニット酸イソメラーゼは、シス−およびトランス−アコニテートを相互転換する。ｐｒｐＦによってコードされるＳｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓのアコニット酸イソメラーゼは、アコニテートおよび２−メチルアコニテートのシス／トランス異性体を相互転換する（Ｇａｒｖｅｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ １６巻、１２７４〜１２８４頁（２００７年））。この酵素は、メチルクエン酸デヒドラターゼ、ＡｃｎＤとの複合体で作用する。アコニット酸イソメラーゼ活性は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａを含む多くのグラム陰性細菌において検出されたが、グラム陽性細菌においては検出されていない（Ｗａｔａｎａｂｅら、Ｃｕｒｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３５巻、９７〜１０２頁（１９９７年））。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａから精製された酵素は、特徴付けされている（Ｋｌｉｎｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １０巻、２２５３〜２２５９頁（１９７１年））。アコニット酸イソメラーゼ酵素もまた、植物において研究されているが、現在までに、遺伝子は同定されていない（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８４巻、３９〜４７頁（１９９０年））。ｐｒｐＦタンパク質に対して高い配列相同性を有する、いくつかの予測されるタンパク質は、以下に列挙される。
したがって、シス，トランスイソメラーゼの添加は、テレフタル酸（ｔｅｒｅｐｔｈａｌｉｃ ａｃｉｄ）の収率を改善することを助け得る。類似の異性体転換のための酵素としては、マレイン酸シス，トランス−イソメラーゼ（ＥＣ５．２．１．１）、マレイルアセトンシス−トランス−イソメラーゼ（ＥＣ５．２．１．２）および不飽和脂肪酸のシス，トランス−イソメラーゼ（Ｃｔｉ）が挙げられる。
マレイン酸シス，トランス−イソメラーゼ（ＥＣ５．２．１．１）は、シス型のマレイン酸のトランス型のフマレートへの転換を触媒する（Ｓｃｈｅｒら、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２４４巻、１８７８〜１８８２頁（１９６９年））。Ａｌｃａｌｉｄｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ｍａｉＡ遺伝子産物が、クローニングされ、そして特徴付けされている（Ｈａｔａｋｅｙａｍａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３９巻、７４〜７９頁（１９９７年））。他のマレイン酸シス，トランス−イソメラーゼは、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ（Ｈａｔａｋｅｙａｍａら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４巻、１４７７〜１４８５頁（２０００年））、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａおよびＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓにおいて利用可能である。
マレイルアセトン シス，トランス−イソメラーゼ（ＥＣ５．２．１．２）は、４−マレイル−アセトアセテートの４−フマリル−アセチアセテート（４−ｆｕｍａｒｙｌ−ａｃｅｔｙａｃｅｔａｔｅ）への転換、シスからトランスへの転換を触媒する。この酵素は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｃａｎｏｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３巻、３２９〜３３７頁（１９９８年））およびＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ（Ｓｅｌｔｚｅｒ、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４８巻、２１５〜２２２頁（１９７３年））において、ｍａｉＡによってコードされる。類似の酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７において、配列相同性によって同定された。
ｃｔｉ遺伝子産物は、シス−不飽和脂肪酸（ＵＦＡ）のトランス−ＵＦＡへの転換を触媒する。酵素は、Ｐ．ｐｕｔｉｄａにおいて特徴付けされている（Ｊｕｎｋｅｒら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１巻、５６９３〜５７００頁（１９９９年））。類似の酵素は、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ種ＭＲ−４およびＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅに見出される。
ＥＣ５．３．３．ａ デルタ−イソメラーゼ（ステップＩ）。イタコネートのシトラコネートへの転換は、イタコン酸デルタ−イソメラーゼによって触媒される。この活性を有する酵素は、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂａｒｋｅｒｉのメチルイタコン酸デルタ−イソメラーゼ（ＥＣ５．３．３．６）（Ｖｅｌａｒｄｅら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９１巻、６０９〜６２０頁（２００９年））である。この酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて異種性に発現され、そして特徴付けされた。高いタンパク質配列類似性を有するホモログは、以下に列挙される。
ＥＣ６．２．１ ＣｏＡシンテターゼ（ステップＥ）。シトラマリルＣｏＡのシトラマレートへの転換（図１、ステップＥ）およびイタコネートのイタコニルＣｏＡへの転換（図１、ステップＬ）は、酵素の６．２．１ファミリーにおけるＣｏＡ酸−チオールリガーゼまたはＣｏＡシンテターゼによって触媒され得る。イタコニルＣｏＡシンテターゼ（ＥＣ６．２．１．４）活性を有するスクシニルＣｏＡシンテターゼ酵素は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種Ｂ２ａｂａにおいて特徴付けされたが、遺伝子は、同定されていない（ＣｏｏｐｅｒおよびＫｏｒｎｂｅｒｇ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ ９１巻、８２〜９１頁（１９６４年））。さらなるＣｏＡリガーゼ酵素候補としては、スクシニルＣｏＡシンテターゼ（ＥＣ６．３．１．４）、アセチルＣｏＡシンテターゼ（ＥＣ６．２．１．１３）、アシルＣｏＡリガーゼおよびマロニルＣｏＡシンテターゼ（ＥＣ６．３．４．９）が挙げられる。広い基質範囲を有するいくつかの酵素が、文献において記載されている。ＡＤＰ−形成アセチルＣｏＡシンテターゼ（ＡＣＤ、ＥＣ６．２．１．１３）は、アシルＣｏＡエステルのその対応する酸への転換を、相伴うＡＴＰの合成とカップリングする酵素である。Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ由来のＡＣＤ Ｉ（ＡＦ１２１１によってコードされる）は、イソブチレート、イソペンタノエートおよびフマレートを含む、種々の直鎖状および分枝鎖状の基質に作用することが示された（Ｍｕｓｆｅｌｄｔら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４巻、６３６〜６４４頁（２００２年））。Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓにおける第２の可逆的ＡＣＤ（ＡＦ１９８３によってコードされる）もまた、環状化合物であるフェニルアセテートおよびインドールアセテートに対し高い活性を有する、広い基質範囲を有することが示されている（ＭｕｓｆｅｌｄｔおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４巻、６３６〜６４４頁（２００２年））。Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ由来の酵素（スクシニルＣｏＡシンテターゼとして注解される）は、プロピオネート、ブチレートおよび分枝鎖状の酸（イソバレレートおよびイソブチレート）を基質として受け入れ、そして順方向および逆方向に作用することが示された（Ｂｒａｓｅｎら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １８２巻、２７７〜２８７頁（２００４年））。超好熱性のクレン古細菌Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来のＰＡＥ３２５０によってコードされたＡＣＤは、アセチルＣｏＡ、イソブチリルＣｏＡ（好ましい基質）およびフェニルアセチルＣｏＡと反応する全ての特徴付けされたＡＣＤの中で最も広い基質範囲を示した（ＢｒａｓｅｎおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １８２巻、２７７〜２８７頁（２００４年））。定向進化または工学的操作は、宿主生物体の生理学的温度で作用するようにこの酵素を改変するために使用され得る。Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉおよびＰ．ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来の酵素が、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてクローニングされ、機能的に発現され、そして特徴付けされている（ＢｒａｓｅｎおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １８２巻、２７７〜２８７頁（２００４年）；ＭｕｓｆｅｌｄｔおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４巻、６３６〜６４４頁（２００２年））。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ由来のアシルＣｏＡリガーゼ（ｐａａＦによってコードされる）は、いくつかの脂肪族基質（酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸およびオクタン酸を含む）および芳香族化合物（フェニル酢酸およびフェノキシ酢酸など）に対して働くことが実証されている（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｖａｌｖｅｒｄｅら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９巻、１１４９〜１１５４頁（１９９３年））。関連の酵素、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ由来のマロニルＣｏＡシンテターゼ（６．３．４．９）は、いくつかの二酸、すなわち、エチル−、プロピル−、アリル−、イソプロピル−、ジメチル−、シクロプロピル−、シクロプロピルメチレン−、シクロブチル−、およびベンジル−マロネートを、その対応するモノチオエステルに転換し得る（Ｐｏｈｌら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３巻、５８２２〜５８２３頁（２００１年））。さらなる候補は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｓｕｃＣＤおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＬＳＣ１２によってコードされるスクシニルＣｏＡシンテターゼ酵素であり、これは、１つのＡＴＰ（ｏｎｅ ＡＴＰ）の相伴う消費とともに、スクシネートからのスクシニルＣｏＡの形成を天然に触媒し、この反応は、ｉｎ ｖｉｖｏで可逆的である（Ｂｕｃｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４巻、６２４５〜６２５２頁（１９８５年））。
（実施例ＩＩ）
アセチル（Ａｃｔｙｌ）ＣｏＡからＭＡＡへの経路を有するＭＡＡ産生微生物体の調製
この実施例は、アセチルＣｏＡおよびピルベートからＭＡＡを産生可能な微生物体の生成を記載する。この例示的な経路は、図１のステップＡ／Ｂ／Ｃにおいて示される。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉは、図１におけるステップＡ、ＢおよびＣにおいて示されるアセチルＣｏＡおよびピルベートからのＭＡＡ産生経路を工学的に操作するための、標的生物体として使用される。Ｅ．ｃｏｌｉは、ＭＡＡを産生可能な、天然的に存在しない微生物を生成するための良い宿主を提供する。Ｅ．ｃｏｌｉは、遺伝子操作を受け入れ可能であり、エタノール、酢酸、ギ酸、乳酸、コハク酸および１，４−ブタンジオールなどの種々の産物を、嫌気性または微好気性条件下で効率的に産生することが可能であることが、公知である。
アセチルＣｏＡからＭＡＡを産生するように工学的に操作されたＥ．ｃｏｌｉ株を生成するために、図１の経路において使用される酵素をコードする核酸（既に記載されている）は、周知の分子生物学技術を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版（２００１年）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９年）参照）。詳細には、Ｅ．ｃｏｌｉ株は、工学的に操作されて、図１に概説されたルート（ステップＡ／Ｂ／Ｃ）を介してアセチルＣｏＡからＭＡＡを産生する。アセチルＣｏＡをＭＡＡへと変換させる酵素をコードする遺伝子を、ベクター上に構築する。詳細には、遺伝子ｃｉｍＡ（Ｑ５８７８７．１）、ｌｅｕＣＤ（Ｐ８１２９１．１およびＱ５８６７３．１）ならびにｃａｄ（ＸＰ＿００１２０９２７３）（それぞれ、シトラマル酸シンターゼ、シトラマル酸デヒドラターゼおよびシトラコン酸デカルボキシラーゼをコードする）を、ｐＺＥ１３ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ、Ｒｕｅｌｚｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に、ＰＡ１／ｌａｃＯプロモーターの制御下にクローニングする。次いで、このプラスミドを、ｌａｃＩＱ（イソプロピル−ベータ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加による誘導性の発現を可能にする）を含む宿主株Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５内に形質転換させる。得られた株は、アセチルＣｏＡからのＭＡＡの合成に必要なタンパク質および酵素を発現する。
得られた遺伝子操作された生物体を、グルコース含有培地で、当該分野で周知の手順にしたがって培養する（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、２００１年参照）。ＭＡＡ経路遺伝子の発現を、ポリペプチド発現または酵素活性を決定するための当該分野で周知の方法（例えば、ノーザンブロット、ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅およびイムノブロッティングが挙げられる）を用いて裏付ける。発現された酵素の酵素活性を、個々の活性について特異的なアッセイを用いて確認する。ＭＡＡを産生するよう工学的に操作されたＥ．ｃｏｌｉ株の能力を、ＨＰＬＣ、ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣＭＳ）または液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣＭＳ）を用いて確認する。
機能的ＭＡＡ合成経路を有するように工学的に操作された微生物株を、この経路の効率的利用のために最適化することによって、さらに増大させる。簡潔には、前記工学的に操作された株を、評価し、任意の外因性遺伝子が、律速レベルで発現されるかどうかを決定する。この経路を通るフラックスを制限し得る、低レベルで発現される任意の酵素について、例えば、さらなる遺伝子コピー数の導入またはコドン最適化の導入により、発現が増大される。ＭＡＡ経路酵素の活性、調節および／または発現を変えるために、変異誘発および／または定向進化などの戦略も適用され得る。
より良い生産体を生成するために、代謝モデリングを使用し、増殖条件を最適化する。モデリングはまた、経路の利用をさらに最適化する任意選択の遺伝子ノックアウトを設計するためにも使用される（例えば、米国特許公開ＵＳ２００２／００１２９３９、ＵＳ２００３／０２２４３６３、ＵＳ２００４／００２９１４９、ＵＳ２００４／００７２７２３、ＵＳ２００３／００５９７９２、ＵＳ２００２／０１６８６５４およびＵＳ２００４／０００９４６６、ならびに米国特許第７，１２７，３７９号参照）。モデリング分析は、ＭＡＡのより効率的な産生に向けて代謝を変化させる細胞増殖に対する効果の、信頼性のある予測を可能にする。１つのモデリング方法は、２層の最適化アプローチである、ＯｐｔＫｎｏｃｋ（Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ．８４巻、６４７〜６５７頁（２００３年））であり、これは、ＭＡＡのより良い産生を集団的に生じる遺伝子ノックアウトを選択するように適用される。適応進化もまた、例えば、シトラコネート中間体またはＭＡＡ産物のより良い生産体を生成するために使用され得る。適応進化は、耐性、増殖および産生の特性を改善するために実施される（ＦｏｎｇおよびＰａｌｓｓｏｎ、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．３６巻、１０５６〜１０５８頁（２００４年）；Ａｌｐｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１４巻、１５６５〜１５６８頁（２００６年））。結果に基づき、さらに産生を増大させるために、モデリングのその後のラウンドである遺伝子操作および適応進化が、ＭＡＡ生産体に適用され得る。
ＭＡＡの大規模産生のために、上記のＭＡＡ経路を含む生物体を、嫌気性条件下でこの生物体の増殖を支持する当該分野で公知の培地を用い、発酵槽内で培養する。発酵は、回分様式、流加−回分様式または連続様式のいずれかで実施される。嫌気性条件を、最初に培地に窒素をスパージし、次いで、培養容器を密封する（例えば、フラスコは、セプタムおよびクリンプキャップで密封され得る）ことによって維持する。微好気性条件もまた、限定的通気のための小さな穴を提供することによって使用され得る。培地のｐＨを、酸、例えばＨ２ＳＯ４の添加によって、ｐＨ７に維持する。増殖速度を、分光光度計（６００ｎｍ）を使用して光学濃度を測定すること、およびグルコース取り込み速度を、炭素供給源の枯渇を経時的にモニタリングすることによって測定することによって、決定する。望まないアルコール、有機酸などの副産物および残留グルコースを、ＨＰＸ−０８７カラム（ＢｉｏＲａｄ）を用い、グルコースおよびアルコールに屈折率検出器および有機酸にＵＶ検出器を使用して、ＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）によって定量化し得る（Ｌｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．、７７５〜７７９頁（２００５年））。
（実施例ＩＩＩ）
メタクリレートおよびアルコールからのメタクリレートエステルの形成のための例示的な酵素
この実施例は、メタクリレートエステルの産生のための例示的な経路のための酵素を記載する。
図２は、ＭＡＡおよびアルコールからメタクリレートエステルへの例示的な経路を示す。メタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼは、メタクリレートからメタクリリルＣｏＡを形成するために適用され得る。アルコールトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、メタクリリルＣｏＡおよびアルコールからメタクリレートエステルを形成するために適用され得る。
メタクリレートのメタクリリルＣｏＡへの転換は、酵素の６．２．１ファミリーにおけるＣｏＡ酸−チオールリガーゼまたはＣｏＡシンテターゼによって触媒され得る。この活性を有する例示的な酵素は、実施例Ｉにおいて提供される。あるいは、メタクリレートのメタクリリルＣｏＡへの転換は、酵素の２．８．３ファミリーにおけるトランスフェラーゼ酵素によって触媒され得る。ＣｏＡトランスフェラーゼは、１つの分子から別の分子へのＣｏＡ部分の転移を触媒する。この活性を有する例示的な酵素は、実施例Ｉに提供される。
メタクリリルＣｏＡおよびアルコールからのメタクリレートエステルの形成は、アルコールトランスフェラーゼ活性を有する酵素によって触媒される。アルコールトランスフェラーゼ活性を有するいくつかの酵素は、米国特許第７，９０１，９１５号の実施例１〜１０において実証されている。これらとしては、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ ４３５（Ｓｉｇｍａ製のＣａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ由来の固定化リパーゼＢ）、Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ由来のリパーゼＣ２（Ａｌｐｈａｍｅｒｉｘ Ｌｔｄ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のリパーゼ（Ａｌｐｈａｍｅｒｉｘ Ｌｔｄ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．由来のＬ−アミノアシラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来のプロテアーゼが挙げられる。このような酵素は、アクリリルＣｏＡおよびメタノールまたはエタノールから、それぞれメチルアクリレートおよびエチルアクリレートを形成することが示された。したがって、このようなトランスフェラーゼ酵素が、メタクリレートエステルを形成するために使用され得る。
他の好適な酵素としては、Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ由来のｃａｌＢによってコードされるリパーゼ（Ｅｆｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９９巻、１３９２〜１４０６頁（２００８年））およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のＥｓｔＦ１エステラーゼ（Ｋｈａｌａｍｅｙｚｅｒら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５巻、４７７〜４８２頁（１９９９年））が挙げられる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のｌｉｐＢおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｅｓｔＡによってコードされるリパーゼ酵素もまた、この変換を触媒し得る。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ遺伝子は、トリアシルグリセロールリパーゼ酵素をコードし、これは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてクローニングされ、そして特徴付けされている（Ｄａｒｔｏｉｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１３１巻、２５３〜２６０頁（１９９２年）；Ｔａｎら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８巻、１４０２〜１４０７頁（１９９２年））。
メタクリリルＣｏＡおよびアルコールからメタクリレートエステルを形成するための酵素をコードするさらなる候補遺伝子としては、ワックスエステルシンターゼ（ＷＳ）活性およびアシルＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）活性の両方を有する二機能性酵素をコードするＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種ＡＤＰｌ ａｔｆＡ （Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒら、ＡＪ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００３年、２７８巻、８０７５〜８０８２頁）；ホホバ種子においてワックスを蓄積するために必要な酵素をコードするＳｉｍｍｏｎｄｓｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ遺伝子ＡＡＤ３８０４１（Ｌａｒｄｉｚａｂａｌら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２０００年、１２２巻、６４５〜６５５頁）；二機能性ＷＳ／ＤＧＡＴ酵素をコードするＡｌｃａｎｉｖｏｒａｘ ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ ａｔｆＡｌおよびａｔｆＡ２（Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ２００７年、１８９巻、９１８〜９２８頁）；アルコールアセチルトランスフェラーゼをコードするＦｒａｇａｒｉａ ｘ ａｎａｎａｓｓａ ＡＡＴ（Ｎｏｉｃｈｉｎｄａら、ＦｏｏｄＳｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｒｅｓ １９９９年、５巻、２３９〜２４２頁）；アルコールアセチルトランスフェラーゼをコードするＲｏｓａハイブリッド培養変種ＡＡＴｌ（Ｇｕｔｅｒｍａｎら、Ｐｌａｎｔ ＭｏＩ Ｂｉｏｌ ２００６年、６０巻、５５５〜５６３頁）；アルコールアセチルトランスフェラーゼをコードするＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＴＦｌおよびＡＴＦ２（Ｍａｓｏｎら、Ｙｅａｓｔ ２０００年、１６巻、１２８７〜１２９８頁）；ならびにＭａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ由来のＷｓ１およびＷｓ２（Ｈｏｌｔｚａｐｐｌｅ，Ｅ．およびＳｃｈｍｉｄｔ−Ｄａｎｎｅｒｔ，Ｃ．、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８９巻（１０号）、３８０４〜３８１２頁、２００７年）が挙げられる。Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ由来のカルボキシルエステラーゼ（ｅｓｔＡによってコードされる）は、アセチルＣｏＡおよびアルコール（エタノールおよびメタンチオールなど）からのエステルの形成を触媒する（Ｎａｒｄｉら、Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９３巻、９９４〜１００２頁（２００２年））。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍ由来のアルコールＯ−アセチルトランスフェラーゼは、分枝鎖状アルコールを含む広い範囲のアルコール基質を、その対応する酢酸エステルに転換する（ＹｏｓｈｉｏｋａおよびＨａｓｈｉｍｏｔｏ、Ａｇｒｉｃｕｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、４５巻、２１８３〜２１９１頁（１９８１年）。これらの遺伝子によってコードされる酵素のタンパク質配列は、以下に提示される。
（実施例ＩＶ）
メタクリレートおよびアルコールからのメタクリレートエステルの形成のための例示的な酵素
この実施例は、メタクリレートエステルの産生のための例示的な経路のための酵素を記載する。
図２は、ＭＡＡおよびアルコールからメタクリレートエステルへの例示的な経路を図示する。メタクリレートエステルは、例えば、アルコールまたは多価アルコールの存在下で酸触媒のような脱水剤の存在下で、メタクリレートを加熱することによって、化学的に生成され得る。メタクリレートエステル−形成活性を有する酵素もまた、メタクリレートおよびアルコールから直接メタクリレートエステルを形成するために適用され得る。このような酵素をコードする遺伝子は、メタクリレート合成経路を含む生物体において発現され得る。メタクリレート合成経路を含むいくつかのこのような生物体が、本明細書中およびＷＯ／２００９／１３５０７４において開示されている。メタクリレートエステル−形成酵素は、サイトゾルを標的として、アルコールおよびメタクリレートのメタクリレートエステルへの細胞内転換を可能にする。あるいは、メタクリレートエステル−形成酵素は、発酵培地中に分泌されてもよく、アルコールおよびメタクリレートからメタクリレートエステルへの細胞外転換を可能にする。別の選択肢は、メタクリレートエステル−形成酵素を、メタクリレートおよびアルコールを含む混合物（発酵ブロスなど）に添加することである。メタクリレート−エステル形成活性を有するいくつかの酵素が、以下に記載される。
Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ種Ｒ３１２（ＥＣ３．５．１．４）由来のアミダーゼは、メタクリレートエステル−形成活性を有する有望な酵素である。この酵素は、エチルアクリレートを加水分解することが示された（Ｔｈｉｅｒｙら、Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１３２巻、２２０５〜８頁、１９８６年；Ｓｏｕｂｒｉｅｒら、Ｇｅｎｅ、１１６巻、９９〜１０４頁、１９９２年）。Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ＥＣ３．３．２．９）由来のミクロソームのエポキシドヒドロラーゼは、グリシジルメタクリレートを加水分解する活性を有し、そして別の好適な酵素である（Ｇｕｅｎｇｅｒｉｃｈら、Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｔｏｘｉｃｏｌ．４巻、５〜３０頁、１９８２年）。これらの遺伝子のタンパク質配列は、以下に提示される。
潜在的メタクリレートエステル−形成酵素をコードするさらなる遺伝子としては、ワックスエステルシンターゼ（ＷＳ）活性およびアシルＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）活性の両方を有する二機能性酵素をコードするＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種ＡＤＰｌ ａｔｆＡ（Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒら、ＡＪ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００３年、２７８巻、８０７５〜８０８２頁）；ホホバ種子においてワックスを蓄積するために必要な酵素をコードするＳｉｍｍｏｎｄｓｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ遺伝子ＡＡＤ３８０４１（Ｌａｒｄｉｚａｂａｌら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２０００年、１２２巻、６４５〜６５５頁）；二機能性ＷＳ／ＤＧＡＴ酵素をコードするＡｌｃａｎｉｖｏｒａｘ ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ ａｔｆＡｌおよびａｔｆＡ２（Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ２００７年、１８９巻、９１８〜９２８頁）；アルコールアセチルトランスフェラーゼをコードするＦｒａｇａｒｉａ ｘ ａｎａｎａｓｓａ ＡＡＴ（Ｎｏｉｃｈｉｎｄａら、ＦｏｏｄＳｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｒｅｓ １９９９年、５巻、２３９〜２４２頁）；アルコールアセチルトランスフェラーゼをコードするＲｏｓａハイブリッド培養変種ＡＡＴｌ（Ｇｕｔｅｒｍａｎら、Ｐｌａｎｔ ＭｏＩ Ｂｉｏｌ ２００６年、６０巻、５５５〜５６３頁）；およびアルコールアセチルトランスフェラーゼをコードするＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＴＦｌおよびＡＴＦ２（Ｍａｓｏｎら、Ｙｅａｓｔ ２０００年、１６巻、１２８７〜１２９８頁）；ならびにＭａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ由来のＷｓ１およびＷｓ２（Ｈｏｌｔｚａｐｐｌｅ，Ｅ．およびＳｃｈｍｉｄｔ−Ｄａｎｎｅｒｔ，Ｃ．、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８９巻（１０号）、３８０４〜３８１２頁、２００７年）が挙げられる。Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ由来のカルボキシルエステラーゼ（ｅｓｔＡによってコードされる）は、アセチルＣｏＡおよびアルコール（エタノールおよびメタンチオールなど）からのエステルの形成を触媒する（Ｎａｒｄｉら、Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９３巻、９９４〜１００２頁（２００２年））。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍ由来のアルコールＯ−アセチルトランスフェラーゼは、分枝鎖状アルコールを含む広い範囲のアルコール基質を、その対応する酢酸エステルに転換する（ＹｏｓｈｉｏｋａおよびＨａｓｈｉｍｏｔｏ、Ａｇｒｉｃｕｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、４５巻、２１８３〜２１９１頁（１９８１年）。この活性に関連する遺伝子は、現在までに同定されていない。これらの遺伝子によってコードされる酵素のタンパク質配列は、以下に提示される。
Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓパラオキソナーゼ酵素ＰＯＮ１、ＰＯＮ１（Ｇ３Ｃ９）およびＰＯＮ３（ＥＣ３．１．８．１）は、アリールエステラーゼ活性およびオルガノホスファターゼ活性の両方を有し、また、メタクリレートエステル−形成活性をも有し得る。ＰＯＮ１は、残基１９２において、グルタミン（Ｒ）またはアルギニン（Ｑ）の共通多型部位を有し、これにより、質的相違がもたらされる。例えば、Ｒ異性体は、Ｓ異性体よりもＧＢＬに対する高いエステラーゼ活性を有する（Ｂｉｌｌｅｃｋｅら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｐｏｓ．２８巻、１３３５〜１３４２頁（２０００年））。Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ細胞において、ＰＯＮ１は、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）粒子に存在し、その活性および安定性は、この環境を必要とする。野生型および組換えのＰＯＮ１酵素は、他の生物体において、機能的に発現されている（Ｒｏｃｈｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３５巻、１６１６〜１６２０頁（２００７年）；Ｍａｒｔｉｎら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００９年））。ＰＯＮ１の定向進化研究は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて改善された溶解性および触媒性質を有するいくつかの変異体酵素を生じた（ヌクレオチド受託番号ＡＹ４９９１８８〜ＡＹ４９９１９９）（Ａｈａｒｏｎｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ １０１巻、４８２〜４８７頁（２００４年））。本研究の１つの組換えバリアントＧ３Ｃ９（Ａｈａｒｏｎｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ １０１巻、４８２〜４８７頁（２００４年））は、近年、レブリネートからの４−バレロラクトンのｐＨ依存的産生のための統合されたバイオプロセスにおいて使用された（Ｍａｒｔｉｎら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００９年））。ヒトＰＯＮ３は、メタクリレートエステル−形成活性を有し得る、なお別な好適な酵素である（Ｄｒａｇａｎｏｖら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４６巻、１２３９〜１２４７頁（２００５年））。
さらに、Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼＢは、メタクリレートエステル−形成活性を有する別の好適な候補酵素である（Ｅｆｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９９巻、１３９２〜１４０６頁（２００８年））。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のエステラーゼ（ＥｓｔＦ１によってコードされる）は、なお別の好適な酵素である（Ｋｈａｌａｍｅｙｚｅｒら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５巻、４７７〜４８２頁（１９９９年））。生物体、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓに由来する他のリパーゼ酵素もまた、この変換を触媒する。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてクローニングされ、そして特徴付けされているトリアシルグリセロールリパーゼ酵素をコードする（Ｄａｒｔｏｉｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１３１巻、２５３〜２６０頁（１９９２年）；Ｔａｎら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８巻、１４０２〜１４０７頁（１９９２年））。
メタクリレートエステルの形成もまた、環状ラクトンと非環式ヒドロキシカルボン酸との間の相互転換のために、カルボキシルエステル結合分子に作用する、３．１．１ファミリーの酵素によって触媒され得る。Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ ＥＣＵ２００２由来のＬ−ラクトナーゼは、種々のラクトン基質に対する、ラクトナーゼ活性およびエステラーゼ活性を示す（Ｚｈａｎｇら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７５巻、１０８７〜１０９４頁（２００７年））。１，４−ラクトンヒドロキシアシルヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．１．２５）（１，４−ラクトナーゼまたはガンマ−ラクトナーゼとしても公知である）は、４〜８個の炭素原子を有する１，４−ラクトンに特異的である。ヒト血液およびラット肝臓のミクロソームにおけるガンマラクトナーゼは、精製され（Ｆｉｓｈｂｅｉｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２４１巻、４８３５〜４８４１頁（１９６６年））、そしてそのラクトナーゼ活性は、カルシウムイオンによって活性化され、そして安定化された（Ｆｉｓｈｂｅｉｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２４１巻、４８４２〜４８４７頁（１９６６年））。最適なラクトナーゼ活性は、ｐＨ６．０において観察され、高いｐＨは、加水分解活性をもたらした（ＦｉｓｈｂｅｉｎおよびＢｅｓｓｍａｎ、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２４１巻、４８４２〜４８４７頁（１９６６年））。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒおよびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍに由来する遺伝子は、１，４−ラクトナーゼとして注解され、４−ヒドロキシブチレートのＧＢＬへの変換を触媒するために使用され得る（Ｚｈａｎｇら、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ７５巻、１０８７〜１０９４頁（２００７年））。
（実施例Ｖ）
３−ヒドロキシイソブチレートを介したスクシニルＣｏＡのＭＡＡへの転換のための経路
この実施例は、３−ヒドロキシイソブチレートを介した、スクシニルＣｏＡからメタクリル酸への例示的なＭＡＡ合成経路を記載する。
ＭＡＡ合成のための１つの例示的な経路は、スクシニルＣｏＡから進行する（図３参照）。この経路は、スクシニルＣｏＡからＭＡＡを形成するために、少なくとも３つの、多くとも５つの、酵素的ステップを使用する。この経路中（図３参照）、スクシニルＣｏＡは最初に（Ｒ）−メチルマロニルＣｏＡに転換され、これはエピメラーゼによって（Ｓ）−メチルマロニルＣｏＡに転換される可能性がある。メチルマロニルＣｏＡの（Ｒ）−または（Ｓ）−のいずれかの立体異性体は、（図３中に示すような）一対の酵素、またはアシルＣｏＡレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を示す一種の酵素のいずれかによって、次いでそれぞれ（Ｒ）−または（Ｓ）−３−ヒドロキシイソブチレートに還元される。スクシニルＣｏＡから３−ヒドロキシイソブチレートへの経路はＷＯ２００７／１４１２０８中にも記載されている。最終ステップ中、３−ヒドロキシイソブチレートが脱水してＭＡＡが形成される。
この経路の首尾良い工学的操作は、十分な活性および特異性を有する適切な酵素のセットの同定を含む。これは、適切な酵素のセットの同定、生成宿主へのそれらの対応する遺伝子のクローニング、発酵条件の最適化、および発酵後の生成物形成に関するアッセイを伴う。メタクリル酸の生成用の生成宿主を工学的に操作するために、１つまたは複数の外因性ＤＮＡ配列を微生物中で発現させる。さらに、微生物は機能的に欠失した（１つまたは複数の）内因性遺伝子を有することができる。これらの改変は、再生可能なフィードストックを使用したメタクリル酸の生成を可能にする。
所望経路のそれぞれのステップを触媒する酵素をコードすることができる、いくつかの生化学的に特徴付けた候補遺伝子を以下および本明細書中に記載する。経路を工学的に操作するための宿主生物体としてのＥ．ｃｏｌｉの使用を記載するが、本質的に任意の適切な宿主生物体を使用することができる。具体的に挙げるのは、Ｅ．ｃｏｌｉに固有である遺伝子、および適切にクローニングおよび発現したときに適切な変換を触媒するために適用することができる他の生物体中の遺伝子である。
図３を参照すると、ステップ１はメチルマロニルＣｏＡムターゼ（ＥＣ５．４．９９．２）が関与する。最初のステップでは、メチルマロニルＣｏＡムターゼ（ＭＣＭ）によってスクシニルＣｏＡがメチルマロニルＣｏＡに転換される。メチルマロニルＣｏＡムターゼは、スクシニルＣｏＡをメチルマロニルＣｏＡへと転換する、コバラミン依存型酵素である。Ｅ．ｃｏｌｉでは、可逆性アデノシルコバラミン依存性ムターゼが３ステップ経路に関与し、プロピオネートへのスクシネートの転換をもたらす（Ｈａｌｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９巻、４６２２〜４６２９頁（２０００年））。ＹｇｆＧの欠失と共にＭＣＭ遺伝子候補の過剰発現を使用して、プロピオニルＣｏＡへのメチルマロニルＣｏＡの脱カルボキシル化を妨げること、およびＭＡＡ合成に利用可能なメチルマロニルＣｏＡを最大にすることができる。ＭＣＭはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉでは遺伝子ｓｃｐＡによってコードされており（ＢｏｂｉｋおよびＲａｓｃｈｅ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、３７５巻、３４４〜３４９頁（２００３年）；Ｈａｌｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９巻、４６２２〜４６２９頁（２０００年））、およびＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓではｍｕｔＡによってコードされている（ＰａｄｏｖａｎｉおよびＢａｎｅｒｊｅｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４５巻、９３００〜９３０６頁（２００６年））。いくつかの他の生物体において、ＭＣＭは、アルファサブユニットおよびベータサブユニットを含み、２つの遺伝子によってコードされている。２−サブユニットタンパク質をコードする例示的な遺伝子候補は、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ種ｓｈｅｒｍａｎｉ ｍｕｔＡおよびｍｕｔＢ（ＫｏｒｏｔｋｏｖａおよびＬｉｄｓｔｒｏｍ、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２７９巻、１３６５２〜１３６５８頁（２００４年））、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ ｍｃｍＡおよびｍｃｍＢ（Ｋｏｒｏｔｋｏｖａおよび Ｌｉｄｓｔｒｏｍ、前出、２００４年）ならびにＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ｓｂｍ１およびｓｂｍ２（Ｐｅｐｌｉｎｓｋｉら、Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．８８巻、１１４５〜５９頁（２０１０年））である。Ｅ．ｃｏｌｉ ｓｐｃＡ遺伝子産物に対する高い相同性に基づいて同定されるさらなる酵素候補もまた、以下に列挙される。
これらの配列を使用して、配列類似性検索（例えば、ＢＬＡＳＴｐ）によりＧｅｎＢａｎｋまたは他のデータベース中のホモログタンパク質を同定することができる。得られたホモログタンパク質およびそれらの対応する遺伝子配列は、生成宿主を作製するためのＥ．ｃｏｌｉまたは他の適切な宿主微生物への形質転換用の追加的な外因性ＤＮＡ配列をもたらす。追加的な遺伝子候補には、Ｅ．ｃｏｌｉのｓｐｃＡ遺伝子産物との高い相同性に基づいて同定した以下のものがある。
メチルマロニルＣｏＡムターゼ触媒遺伝子と隣接する遺伝子は、最大活性に寄与するという証拠がさらに存在する。例えば、Ｍ．ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ由来のｍｅａＢ遺伝子はメチルマロニルＣｏＡムターゼと複合体を形成し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでムターゼ活性を刺激し、かつ不可逆的失活からおそらくそれを保護することが実証されている（ＫｏｒｏｔｋｏｖａおよびＬｉｄｓｔｒｏｍ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９巻、１３６５２〜１３６５８頁（２００４年））。Ｍ．ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓのｍｅａＢ遺伝子産物は、染色体上でｓｃｐＡと隣接するＥ．ｃｏｌｉのａｒｇＫ遺伝子（ＢＬＡＳＴｐ：４５％同一、ｅ値：４ｅ−６７）の生成物と非常に類似している。Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ中のｍｅａＢホモログに関する配列はＧｅｎＢａｎｋに載っていない。しかしながら、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓのＫＰＡ１７１２０２遺伝子産物、ＹＰ＿０５５３１０．１はＭ．ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓのｍｅａＢタンパク質と５１％同一であり、かつその遺伝子も染色体上でメチルマロニルＣｏＡムターゼ遺伝子と隣接する。類似の遺伝子は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６のＨ１６＿Ｂ１８３９によってコードされる。
Ｅ．ｃｏｌｉはアデノシルコバラミン、中間体コビナミドまたはコバラミンと供給される時だけこの反応に必要な補因子を合成することができる（ＬａｗｒｅｎｃｅおよびＲｏｔｈ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７巻、６３７１〜６３８０頁（１９９５年）；ＬａｗｒｅｎｃｅおよびＲｏｔｈ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１４２巻、１１〜２４頁（１９９６年））。あるいは、ｄｅ ｎｏｖｏでコバラミンを合成する能力が、異種遺伝子の発現後にＥ．ｃｏｌｉにおいて付与されている（Ｒａｕｘら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７８巻、７５３〜７６７頁（１９９６年））。
図３を参照すると、ステップ２は、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ（ＥＣ５．１．９９．１）が関与する。この経路における第２の酵素、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ（ＭＭＣＥ）は、（Ｒ）−メチルマロニルＣｏＡと（Ｓ）−メチルマロニルＣｏＡとを相互転換する。ＭＭＣＥは、奇数鎖（ｏｄｄ ｎｕｍｂｅｒｅｄ）脂肪酸、およびアミノ酸バリン、イソロイシン、およびメチオニンの分解において必要な酵素である。メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ活性はＥ．ｃｏｌｉのゲノム中にコードされるとは考えられないが（Ｂｏｙｎｔｏｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７８巻、３０１５〜３０２４頁（１９９６年））、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（ＹｑｊＣ）（ＦｕｌｌｅｒおよびＬｅａｄｌａｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２１３巻、６４３〜６５０頁（１９８３年））、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（Ｍｃｅｅ）（ＢｏｂｉｋおよびＲａｓｃｈｅ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６巻、３７１９４〜３７１９８頁（２００１年））、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｒｍａｎｉｉ（ＡＦ４５４５１１）（Ｆｕｌｌｅｒ．およびＬｅａｄｌａｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２１３巻、６４３〜６５０頁（１９８３年）；Ｈａｌｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３９巻、４６２２〜４６２９頁（２０００年）；ＭｃＣａｒｔｈｙら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、９巻、６３７〜６４６頁、２００１年））およびＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ（ｍｍｃｅ）（Ｋｕｈｎｌら、ＦＥＢＳ Ｊ．、２７２巻、１４６５〜１４７７頁（２００５年））などの他の生物体中には存在する。さらなる遺伝子候補、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓにおけるＡＥ０１６８７７は、他の特徴付けされた酵素に対して高い配列相同性を有する。この酵素的ステップは、メチルマロニルＣｏＡの３−ヒドロキシイソブチレートへの転換のために使用される単数または複数の酵素の立体特異性に依存してもよく、必ずしも依存しなくてもよい（図３におけるステップ３〜４）。これらの遺伝子／タンパク質は、以下に記載される。
図３を参照すると、ステップ３はメチルマロニルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．−）が関与する。図３中に示すように、その対応するアルコール、３−ヒドロキシイソブチレートへのメチルマロニルＣｏＡの還元は、２つの酵素ステップによって進行し得る。最初のステップ、メチルマロン酸セミアルデヒドへのメチルマロニルＣｏＡの転換は、ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼによって実施される。Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ由来のマロニルＣｏＡレダクターゼ遺伝子によってコードされる酵素（Ａｌｂｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８８巻、２４号、８５５１〜８５５９頁（２００６年））は、その対応するアルデヒドへのメチルマロニルＣｏＡの転換を触媒することが示されている（ＷＯ２００７１４１２０８）。同様の酵素がＭｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ ｓｅｄｕｌａ中に存在する（Ａｌｂｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８８巻、２４号、８５５１〜８５５９頁（２００６年））。いくつかの追加的なＣｏＡデヒドロゲナーゼは、その対応するアルデヒドにアシルＣｏＡを還元することもできる。メチルマロニルＣｏＡのその対応するアルデヒドであるメチルマロン酸セミアルデヒドへの還元は、ＣｏＡ−依存型アルデヒドデヒドロゲナーゼによって触媒される。例示的な酵素としては、脂肪酸アシルＣｏＡレダクターゼ（ｆａｔｔｙ ａｃｙｌ ＣｏＡ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、スクシニルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．７６）、アセチルＣｏＡレダクターゼおよびブチリルＣｏＡレダクターゼが挙げられる。例示的な脂肪酸アシルＣｏＡレダクターゼ酵素は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓのａｃｒ１（ＲｅｉｓｅｒおよびＳｏｍｅｒｖｉｌｌｅ．、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９巻、２９６９〜２９７５頁（１９９７年））、およびＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種Ｍ−１脂肪酸アシルＣｏＡレダクターゼ（Ｉｓｈｉｇｅら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８巻、１１９２〜１１９５頁（２００２年））によってコードされる。ＣｏＡ−依存型およびＮＡＤＰ−依存型のコハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（スクシニルＣｏＡレダクターゼとも呼ばれる）もまた、公知であり、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉにおけるｓｕｃＤ遺伝子（ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８巻、８７１〜８８０頁（１９９６年）；ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７８巻、８７１〜８８０頁（１９９６年））ならびにＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのｓｕｃＤ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８２巻、４７０４〜４７１０頁（２０００年））によってコードされる。さらなるスクシニルＣｏＡレダクターゼ酵素は、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ ｓｅｄｕｌａ（Ｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８巻、１７８２〜１７８６頁（２００７年））およびＴｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｕｓ（Ｒａｍｏｓ−Ｖｅｒａら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１９１巻、４２８６〜４２９７頁（２００９年））を含む好熱性古細菌の３−ヒドロキシプロピオン酸／４−ヒドロキシ酪酸回路に関わる。Ｍ．ｓｅｄｕｌａ酵素（Ｍｓｅｄ＿０７０９によってコードされる）は、厳密にＮＡＤＰＨ−依存型であり、また、マロニルＣｏＡレダクターゼ活性をも有する。Ｔ．ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｕｓ酵素は、ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＨの両方に対して活性である。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種における酵素アシル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｂｐｈＧによってコードされる）もまた、良い候補であり、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、ホルムアルデヒドおよび分枝鎖状化合物イソブチルアルデヒドを酸化およびアシル化することが実証されている（Ｐｏｗｌｏｗｓｋｉら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５巻、３７７〜３８５頁（１９９３年））。アセチルＣｏＡをエタノールへと還元することに加えて、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓにおいてこの酵素（ａｄｈＥによってコードされる）は、分枝鎖状化合物イソブチルアルデヒドをイソブチリルＣｏＡへと酸化することが示されている（Ｋａｚａｈａｙａ、Ｊ． Ｇｅｎ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８巻、４３〜５５頁（１９７２年）；およびＫｏｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ．２７巻、５０５〜５１０頁（２００５年））。ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼは、ソルベント産生（ｓｏｌｖｅｎｔｏｇｅｎｉｃ）生物体（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍなど）において、類似の反応であるブチリルＣｏＡからブチルアルデヒドへの転換を触媒する（Ｋｏｓａｋａら、Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、７１巻、５８〜６８頁（２００７年））。
アシルＣｏＡをその対応するアルデヒドへと転換するさらなる酵素型は、マロニルＣｏＡをマロン酸セミアルデヒドへと変換させるマロニルＣｏＡレダクターゼである。マロニルＣｏＡレダクターゼは、好熱好酸性古細菌における３−ヒドロキシプロピオン酸回路を介した独立栄養性炭素固定において、重要な酵素である（Ｂｅｒｇ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８巻、１７８２〜１７８６頁（２００７年）；およびＴｈａｕｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８巻、１７３２〜１７３３頁（２００７年））。この酵素は、ＮＡＤＰＨを補因子として用い、ＭｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａおよびＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ種において特徴付けされている（Ａｌｂｅｒら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８８巻、８５５１〜８５５９頁（２００６年）；およびＨｕｇｌｅｒ、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４巻、２４０４〜２４１０頁（２００２年））。この酵素は、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ ｓｅｄｕｌａにおいて、Ｍｓｅｄ＿０７０９によってコードされる（Ａｌｂｅｒら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８８巻、８５５１〜８５５９頁（２００６年）；およびＢｅｒｇ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８巻、１７８２〜１７８６頁（２００７年））。Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ由来のマロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてクローニングされ、異種性に発現された（Ａｌｂｅｒら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８８巻、８５５１〜８５５９頁（２００６年）。この酵素はまた、メチルマロニルＣｏＡのその対応するアルデヒドへの転換を触媒することが示されている（ＷＯ２００７１４１２０８（２００７年））。これらの酵素のアルデヒドデヒドロゲナーゼ機能性は、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来の二機能性デヒドロゲナーゼと類似しているが、僅かな配列類似性しか存在しない。両マロニルＣｏＡレダクターゼ酵素候補は、アスパルチル−４−ホスフェートのアスパラギン酸セミアルデヒドへの還元および同時の脱リン酸化を触媒する酵素である、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼに対して高い配列類似性を有する。さらなる遺伝子候補は、他の生物体（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓおよびＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓならびに以下に列挙されている生物体）において、タンパク質に対する配列相同性によって見出され得る。ＣｏＡ−アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼについてのなお別の候補は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ由来のａｌｄ遺伝子である（Ｔｏｔｈ、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５巻、４９７３〜４９８０頁（１９９９年）。この酵素は、アセチルＣｏＡおよびブチリルＣｏＡをその対応するアルデヒドに還元することが報告されている。この遺伝子は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍおよび Ｅ．ｃｏｌｉのアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするｅｕｔＥに対して非常に類似している（Ｔｏｔｈ、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５巻、４９７３〜４９８０頁（１９９９年）。
アシルＣｏＡレダクターゼ活性およびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する二機能性酵素は、メチルマロニルＣｏＡを３−ヒドロキシイソブチレートへと直接転換し得る。アシルＣｏＡをアルコールへ転換する例示的な二機能性オキシドレダクターゼとしては、アセチルＣｏＡなどの基質をエタノールへ変換するもの（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のａｄｈＥ（Ｋｅｓｓｌｅｒら、ＦＥＢＳ．Ｌｅｔｔ．２８１巻、５９〜６３頁（１９９１年）））およびブチリルＣｏＡをブタノールへ変換するもの（例えば、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来のａｄｈＥ２（Ｆｏｎｔａｉｎｅら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４巻、８２１〜８３０頁（２００２年））が挙げられる。ｂｄｈ Ｉおよびｂｄｈ ＩＩによってコードされるＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ酵素（Ｗａｌｔｅｒ，ら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４巻、７１４９〜７１５８頁（１９９２年））は、アセチルＣｏＡおよびブチリルＣｏＡを、エタノールおよびブタノールへそれぞれ還元する。アセチルＣｏＡのエタノールへの還元に加えて、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓにおけるａｄｈＥによってコードされる酵素は、分枝鎖状化合物イソブチルアルデヒドをイソブチリルＣｏＡへ酸化することが示されている（Ｋａｚａｈａｙａら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８巻、４３〜５５頁（１９７２年）；Ｋｏｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ、２７巻、５０５〜５１０頁（２００５年））。別の例示的な酵素は、マロニルＣｏＡを３−ＨＰへ転換し得る。この活性を有するＮＡＤＰＨ−依存型酵素は、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓにおいて特徴付けされており、ここでは、この酵素は、３−ヒドロキシプロピオン酸回路に関わる（Ｈｕｇｌｅｒら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１８４巻、２４０４〜２４１０頁（２００２年）；Ｓｔｒａｕｓｓら、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ、２１５巻、６３３〜６４３頁（１９９３年））。３００ｋＤａの質量を有するこの酵素は、非常に基質特異的であり、他の公知のオキシドレダクターゼに対して僅かな配列類似性しか示さない（Ｈｕｇｌｅｒら、前出）。他の生物体におけるどの酵素も、この特異的反応を触媒することが示されていない；しかし、他の生物体が類似の経路を有し得るという生物情報学的証拠が存在する（Ｋｌａｔｔら、Ｅｎｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、９巻、２０６７〜２０７８頁（２００７年））。Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ ｃａｓｔｅｎｈｏｌｚｉｉ、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ種ＮＡＰ１および海洋性のガンマプロテオバクテリアＨＴＣＣ２０８０を含む他の生物体における酵素候補は、配列類似性によって推測され得る。
図３を参照すると、ステップ４は、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．３１）が関与する。３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼは、３−ヒドロキシイソブチレートのメチルマロン酸セミアルデヒドへの可逆的酸化を触媒する。メチルマロン酸セミアルデヒドの３−ヒドロキシイソブチレートへの還元は、メチルマロン酸セミアルデヒドレダクターゼまたは３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼによって触媒される。この酵素はバリン、ロイシンおよびイソロイシンの分解と関係があり、細菌、真核生物、および哺乳動物中で同定されている。Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来のＰ８４０６７によってコードされる酵素は、構造的に特徴付けられている（Ｌｏｋａｎａｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３５２巻、９０５〜９１７頁（２００５年））。ヒト３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼの可逆性は、同位体標識した基質を使用して実証された（ＭａｎｎｉｎｇおよびＰｏｌｌｉｔｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２３１巻、４８１〜４８４頁（１９８５年））。この酵素をコードする追加的な遺伝子には、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（Ｈａｗｅｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、３２４巻、２１８〜２２８頁（２０００年））およびＯｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６０巻、２０４３〜２０４７頁（１９９６年）；Ｈａｗｅｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、３２４巻、２１８〜２２８頁（２０００年））における３ｈｉｄｈ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａにおけるｍｍｓｂ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａにおけるｄｈａｔ（ＡｂｅｒｈａｒｔおよびＨｓｕ．．Ｊ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．［Ｐｅｒｋｉｎ１］６巻、１４０４〜１４０６頁（１９７９年）；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６７巻、４３８〜４４１頁（２００３年）；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６０巻、２０４３〜２０４７頁（１９９６年））がある。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のｍｍｓＢ（Ｇｏｋａｒｎら、米国特許第７，３９３，６７６号（２００８年））およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ由来のｍｍｓＢを含むいくつかの３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ酵素は、還元の方向において特徴付けされている。
図３を参照すると、代替として、ステップ３および４は、組合せアルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．−）を含むことができる。デュアルアシルＣｏＡレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する多機能酵素による１ステップ中で、メチルマロニルＣｏＡを３−ヒドロキシイソブチレートに還元することができる。３−ヒドロキシイソブチレートへのメチルマロニルＣｏＡの直接転換に関する証拠は報告されていないが、この反応は、アルコールデヒドロゲナーゼ活性とアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の両方を有するＣｏＡ依存性酵素によって触媒される、アセチルＣｏＡからエタノールおよびブチリルＣｏＡからブタノールなどの一般的な転換と類似する。遺伝子候補には、Ｅ．ｃｏｌｉのａｄｈＥ（Ｋｅｓｓｌｅｒら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、２８１巻、５９〜６３頁（１９９１年））、およびそれぞれアセチルＣｏＡおよびブチリルＣｏＡをエタノールおよびブタノールに還元することができる、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍのｂｄｈＩおよびｂｄｈＩＩ（Ｗａｌｔｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７４巻、７１４９〜７１５８頁（１９９２年））がある。アセチルＣｏＡをエタノールに還元する以外に、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ中でａｄｈＥによってコードされる酵素は、分岐鎖状化合物イソブチルアルデヒドをイソブチリルＣｏＡに酸化することが示されている（Ｋａｚａｈａｙａら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１８巻、４３〜５５頁（１９７２年）；Ｋｏｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．、２７巻、５０５〜５１０頁（２００５年））。メチルマロニルＣｏＡを直接３−ヒドロキシイソブチレートに転換するための追加的候補酵素は、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来のマロニルＣｏＡレダクターゼによってコードされる（Ｈｕｅｇｌｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４巻、９号、２４０４〜２４１０頁（２００２年）。
図３を参照すると、ステップ５は、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．−）が関与する。最終ステップは、３−ヒドロキシイソブチレートのメタクリル酸への脱水に関わる。３−ヒドロキシイソブチレートのメチルアクリル酸への脱水は、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ活性を有する酵素によって触媒される。この特異的酵素的変換についての直接的な証拠は同定されていないが、ほとんどのデヒドラターゼは、水のα，β−脱離を触媒し、これは、電子吸引性のカルボニル、カルボキシレートまたはＣｏＡ−チオールエステル基によるα−水素の活性化およびβ−位からのヒドロキシル基の除去に関わる（ＢｕｃｋｅｌおよびＢａｒｋｅｒ、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１７巻、１２４８〜１２６０頁（１９７４年）；Ｍａｒｔｉｎｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０１巻、１５６４５〜１５６４９頁（２００４年））。これは、まさに、メタクリレート経路における最終ステップに提案される変換の型である。加えて、提案される変換は、２−ヒドロキシメチルグルタレートの２−メチレングルタレートへの転換を触媒し得るＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂａｒｋｅｒｉの２−（ヒドロキシメチル）グルタル酸デヒドラターゼに非常に類似している。この酵素は、ニコチネート異化に関して研究されており、ｈｍｄによってコードされる（Ａｌｈａｐｅｌら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０３巻、１２３４１〜１２３４６頁（２００６年））。高い配列相同性を有する類似の酵素は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃａｐｉｌｌｏｓｕｓ、Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ ｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓおよびＮａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｓに見出される。いくつかの酵素は、ヒドロキシル基のアルファ、ベータ脱離を触媒することが公知である。例示的な酵素としては、２−（ヒドロキシメチル）グルタル酸デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．−）、フマラーゼ（ＥＣ４．２．１．２）、２−ケト−４−ペンテン酸デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．８０）、シトラマル酸ヒドロリアーゼおよびジメチルマレイン酸ヒドラターゼが挙げられる。
２−（ヒドロキシメチル）グルタル酸デヒドラターゼは、２−（ヒドロキシメチル）グルタレートを２−メチレン−グルタレートに脱水する［４Ｆｅ−４Ｓ］含有酵素であり、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂａｒｋｅｒｉ（正式には、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂａｒｋｅｒｉ）におけるニコチネート異化におけるその役割について研究されている（Ａｌｈａｐｅｌら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０３巻、１２３４１〜１２３４６頁（２００６年））。高い配列相同性を有する類似の酵素が、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃａｐｉｌｌｏｓｕｓ、Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ ｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓおよびＮａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｓに見出される。これらの酵素もまた、［４Ｆｅ−４Ｓ］含有細菌性セリンデヒドラターゼのα−サブユニットおよびβ−サブユニットに対して相同である（例えば、ｔｄｃＧ、ｓｄｈＢおよびｓｄａＡによってコードされるＥ．ｃｏｌｉ酵素）。Ｅ．ｂａｒｋｅｒｉにおいて類似の機能性を有する酵素は、アコニターゼファミリーにおける可逆的Ｆｅ２＋依存型および酸素感受性酵素であるジメチルマレイン酸ヒドラターゼであり、これは、ジメチルマレート（ｄｉｍｅｔｈｙｌｍａｅａｔｅ）を水和して、（２Ｒ，３Ｓ）−２，３−ジメチルマレートを形成する。この酵素は、ｄｍｄＡＢによってコードされる（Ａｌｈａｐｅｌら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０３巻、１２３４１〜６頁（２００６年）；Ｋｏｌｌｍａｎｎ−Ｋｏｃｈら、Ｈｏｐｐｅ Ｓｅｙｌｅｒｓ．Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｈｅｍ．３６５巻、８４７〜８５７頁（１９８４年））。
フマル酸ヒドラターゼ酵素は、フマレートのマレートへの可逆的水和を天然に触媒する。フマル酸ヒドラターゼの、３−オキソブタノールを基質として用いる分枝鎖状基質に対して反応する能力は記載されていないが、豊富な構造情報が、この酵素について利用可能であり、他の研究者らは、成功裏にこの酵素を工学的に操作し、活性、阻害および局在を改変させてきた（Ｗｅａｖｅｒ、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｄ Ｂｉｏｌ． Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６１巻、１３９５〜１４０１頁（２００５年））。Ｅ．ｃｏｌｉは、３つのフマラーゼを有する：ＦｕｍＡ、ＦｕｍＢおよびＦｕｍＣであり、これらは、増殖条件によって調節される。ＦｕｍＢは、酸素感受性であり、嫌気性条件下でのみ活性である。ＦｕｍＡは、微嫌気性条件下で活性であり、そしてＦｕｍＣは、好気性増殖においてのみ活性な酵素である（Ｔｓｅｎｇら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３巻、４６１〜４６７頁（２００１年）；Ｗｏｏｄｓら、Ｂｉｏｃｈｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ９５４巻、１４〜２６頁（１９８８年）；Ｇｕｅｓｔら、Ｊ Ｇｅｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １３１巻、２９７１〜２９８４頁（１９８５年））。例示的な酵素候補としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のｆｕｍＣによってコードされるもの（Ｅｓｔｅｖｅｚら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１１巻、１５５２〜１５５７頁（２００２年）；ＨｏｎｇおよびＬｅｅ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇ．９巻、２５２〜２５５頁（２００４年）；ＲｏｓｅおよびＷｅａｖｅｒ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０１巻、３３９３〜３３９７頁（２００４年））、ならびにＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ（Ｓｍｉｔｈら、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３１巻、９６１〜９７５頁（１９９９年））、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｍｉｚｏｂａｔａら、Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５５巻、４９〜５５頁（１９９８年））およびＲａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．８９巻、１９２３〜１９３１頁（１９８１年））に見出される酵素が挙げられる。高い配列相同性を有する類似の酵素としては、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来のｆｕｍ１、およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のｆｕｍＣが挙げられる。Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ由来のＭｍｃＢＣフマラーゼは、２つのサブユニットを有する別のクラスのフマラーゼである（Ｓｈｉｍｏｙａｍａら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．２７０巻、２０７〜２１３頁（２００７年））。
４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートの２−オキソペンテノエートへの脱水は、４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸ヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．８０）によって触媒される。この酵素は、芳香族分解経路に関わり、典型的には、４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸アルドラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子と共転写される。例示的な遺伝子産物は、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｈｐＤ（Ｆｅｒｒａｎｄｅｚら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９巻、２５７３〜２５８１頁（１９９７年）；Ｐｏｌｌａｒｄら、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５１巻、９８〜１０６頁（１９９８年））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａのｔｏｄＧおよびｃｍｔＦ（Ｌａｕら、Ｇｅｎｅ １４６巻、７〜１３頁（１９９４年）；Ｅａｔｏｎ、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８巻、１３５１〜１３６２頁（１９９６年））、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ種ＣＮＢ−１のｃｎｂＥ（Ｍａら、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７３巻、４４７７〜４４８３頁（２００７年））ならびにＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓのｍｈｐＤ（Ｗａｎｇら、ＦＥＢＳ Ｊ ２７２巻、９６６〜９７４頁（２００５年））によってコードされる。密接に関連する酵素である２−オキソヘプタ−４−エン−１，７−二酸ヒドラターゼは、４−ヒドロキシフェニル酢酸分解に関わり、ここで、マグネシウムを補因子に用いて、２−オキソ−ヘプタ−４−エン−１，７−ジオエート（ＯＨＥＤ）を２−オキソ−４−ヒドロキシ−ヘプタ−１，７−ジオエートへと転換する（Ｂｕｒｋｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０巻、（１９９８年））。ＯＨＥＤヒドラターゼ酵素候補は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ（Ｒｏｐｅｒら、Ｇｅｎｅ １５６巻、４７〜５１頁（１９９５年）；Ｉｚｕｍｉら、Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７０巻、８９９〜９１１頁（２００７年））およびＥ．ｃｏｌｉ Ｗ（Ｐｒｉｅｔｏら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８巻、１１１〜１２０頁（１９９６年））において同定され、そして特徴付けされている。配列比較は、広い範囲の細菌、植物および動物におけるホモログを明らかにする。非常に類似の配列を有する酵素は、とりわけ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ（９１％同一、ｅ値（ｅｖａｌ）＝２ｅ−１３８）およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ（９１％同一、ｅ値＝４ｅ−１３８）に含まれる。
別の酵素候補は、天然に２−メチルマレートをメサコネートに脱水する酵素である、シトラマル酸ヒドロリアーゼ（ＥＣ４．２．１．３４）である。この酵素は、２−オキソブタノエートへのピルベート経路に関してＭｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉにおいて研究されており、ここで、広い基質特異性を有することが示されている（Ｄｒｅｖｌａｎｄら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８９巻、４３９１〜４４００頁（２００７年））。この酵素活性もまた、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｏｍｏｒｐｈｕｍ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓにおいて検出されたが、ここでは、グルタメート分解に関わると考えられる（Ｋａｔｏら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １６８巻、４５７〜４６３頁（１９９７年））。Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉタンパク質配列は、これらの生物体における遺伝子に対して有意な相同性を有さない。
ジメチルマレイン酸ヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．８５）は、アコニターゼファミリーにおける、可逆的Ｆｅ２＋依存型かつ酸素感受性の酵素であり、ジメチルマレートを水和して（２Ｒ，３Ｓ）−２，３−ジメチルマレートを形成する。この酵素は、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂａｒｋｅｒｉにおけるｄｍｄＡＢによってコードされる（Ａｌｈａｐｅｌら、前出；Ｋｏｌｌｍａｎｎ−Ｋｏｃｈら、Ｈｏｐｐｅ Ｓｅｙｌｅｒｓ．Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｈｅｍ．３６５巻、８４７〜８５７頁（１９８４年））。
この実施例は、スクシニルＣｏＡからのＭＡＡ産生のための生合成経路を記載する。
（実施例ＶＩ）
３−アミノ−２−メチルプロパノエートを介した、スクシニルＣｏＡのＭＡＡへの転換のための経路
この実施例は、３−アミノ−メチルプロパノエートを介した、スクシニルＣｏＡからＭＡＡへの例示的なＭＡＡ合成経路を記載する。
ＭＡＡ生合成のための別の例示的な経路は、スクシニルＣｏＡから３−アミノ−２−メチルプロパノエートを介して進行する（図４参照）。メチルマロン酸セミアルデヒドへのスクシニルＣｏＡの転換を含む、この経路の最初の３ステップは、実施例ＩＶ中に記載したスクシニルＣｏＡからＭＡＡへの経路と同一である（図３参照）。この経路はステップ４で分岐し、そこでメチルマロン酸セミアルデヒドはトランスアミナーゼによって３−アミノ−２−メチルプロピオネートに転換される。最終経路のステップは、メタクリル酸への３−アミノ−２−メチルプロピオネートの脱アミノ化を伴う。
最初の３経路ステップを触媒するための酵素および遺伝子候補は、実施例ＩＶ中に記載する。ステップ４および５の遺伝子候補は以下で論じる。
図４を参照すると、ステップ４は３−アミノ−２−メチルプロピオン酸トランスアミナーゼ（ＥＣ２．６．１．２２）に関与する。３−アミノ−２−メチルプロピオン酸トランスアミナーゼは、メチルマロン酸セミアルデヒドから３−アミノ−２−メチルプロピオネートへの変換を触媒する。Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓおよびＳｕｓ ｓｃｒｏｆａにおいて特徴付けられＡｂａｔによってコードされる酵素は、経路中の対象とする方向にこの変換を触媒することが示されている（Ｋａｋｉｍｏｔｏら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１５６巻、３７４〜３８０頁（１９６８年）；Ｔａｍａｋｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、３２４巻、３７６〜３８９頁（２０００年））。３−アミノ−２−メチルプロピオン酸トランスアミナーゼと高い配列相同性を有する、他の生物における酵素候補には、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ中のＧｔａ−１およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｕｓ中のｇａｂＴがある。さらに、遺伝子ｇａｂＴによってコードされるＥ．ｃｏｌｉ中の天然ＧＡＢＡアミノトランスフェラーゼの１つは、広範囲の基質特異性を有することが示されており、基質として３−アミノ−２−メチルプロピオネートを利用することができる（Ｌｉｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４３巻、１０８９６〜１０９０５頁（２００４年）；Ｓｃｈｕｌｚら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５６巻、１〜６頁（１９９０年））。
図４を参照すると、ステップ５は３−アミノ−２−メチルプロピオン酸アンモニアリアーゼ（ＥＣ４．３．１．−）が関与する。この経路の最終ステップ中、３−アミノ−２−メチルプロピオネートはメタクリル酸に脱アミノ化される。この正確な変換を触媒する酵素は実験によって実証されていないが、しかしながら、天然Ｅ．ｃｏｌｉ酵素、アスパラギン酸アンモニアリアーゼ（ＥＣ４．３．１．１）は、この反応を触媒することができる可能性がある。Ｅ．ｃｏｌｉ中でａｓｐＡによってコードされるアスパラギン酸アンモニアリアーゼは、アスパルテートを脱アミノ化してフマレートを形成するが、別の基質アスパラギン酸フェニルメチルエステル、アスパラギン、ベンジル−アスパルテートおよびマレートと反応することもできる（Ｍａら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６７２巻、６０〜６５頁（１９９２年））。別の研究では、定方向進化をこの酵素に利用して基質特異性を変えていた（Ａｓａｎｏら、Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．２２巻、９５〜１０１頁（２００５年））。他の生物体中のアスパルターゼをコードする遺伝子には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｕｓ中のａｎｓＢ（Ｓｊｏｓｔｒｏｍら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１３２４巻、１８２〜１９０頁（１９９７年））、ならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（Ｔａｋａｇｉら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、９６巻、５４５〜５５２頁（１９８４年）；Ｔａｋａｇｉら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１００巻、６９７〜７０５頁（１９８６年））およびＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ（Ｔａｋａｇｉら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１６１巻、１〜６頁（１９８５年））中のａｓｐＡがある。
この実施例は、スクシニルＣｏＡからのＭＡＡ生合成経路を記載する。
（実施例ＶＩＩ）
４−ヒドロキシブチリルＣｏＡの３−ヒドロキシイソ酪酸またはＭＡＡへの転換のための経路
この実施例は、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡからの例示的な３−ヒドロキシイソ酪酸またはＭＡＡ合成経路を記載する。
別の例示的な経路はＭＡＡへの４ＨＢ−ＣｏＡの転換を伴う（図５参照）。最初のステップ中、４ＨＢ−ＣｏＡはメチルムターゼによって３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡ（３−Ｈｉｂ−ＣｏＡ）に転換される。次いで３−Ｈｉｂ−ＣｏＡは、ＣｏＡヒドロラーゼ、シンターゼまたはトランスフェラーゼによって３−ヒドロキシイソブチレートに転換され得る。３−ヒドロキシイソブチレートが分泌され、生成物として、またはメタクリル酸の生成における最終ステップとして回収される可能性がある。３−ヒドロキシブチレートを脱水させてメタクリル酸を形成することが可能である。あるいは、３−Ｈｉｂ−ＣｏＡをメタクリリルＣｏＡに脱水させて、次いでヒドロラーゼ、シンターゼ、またはトランスフェラーゼによってＭＡＡに転換することが可能である。トリカルボン酸回路中間体、アルファ−ケトグルタレート、スクシネート、またはスクシニルＣｏＡを４ＨＢ−ＣｏＡに転換するのに必要な酵素は十分文書化されている（２００８年３月１４日出願のＢｕｒｋら、米国出願第１２／０４９，２５６号；Ｌｕｔｋｅ−ＥｖｅｒｓｌｏｈおよびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、１８１巻、６３〜７１頁（１９９９年）；ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２１２巻、１２１〜１２７頁（１９９３年）；ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７８巻、８７１〜８８０頁（１９９６年）；Ｖａｌｅｎｔｉｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２２７巻、４３〜６０頁（１９９５年）；ＷｏｌｆｆおよびＫｅｎｅａｌｙ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．、６巻、２０６〜２１２頁（１９９５年））。
図５を参照すると、ステップ１は４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ（ＥＣ５．４．９９．−）が関与する。３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡへの４ＨＢ−ＣｏＡの転換は未だ実験によって実証されていない。しかしながら、２つのメチルムターゼ、すなわち類似の反応を触媒するイソブチリルＣｏＡムターゼ（ＩＣＭ）およびメチルマロニルＣｏＡムターゼ（ＭＣＭ）は、それらの対応する基質の構造類似性を考慮すると優れた候補である。メチルマロニルＣｏＡムターゼは、スクシニルＣｏＡをメチルマロニルＣｏＡに転換するコバラミン依存性酵素である。この酵素および適切な遺伝子候補はスクシニルＣｏＡからＭＡＡの経路中で論じた（実施例Ｖ参照）。
あるいは、イソブチリルＣｏＡ（ＩＣＭ，ＥＣ５．４．９９．１３）は、提案される変換を触媒し得る。ＩＣＭは、ブチリルＣｏＡの炭素骨格をイソブチリルＣｏＡに可逆的に転位する、ＭＣＭファミリーにおけるコバラミン依存性メチルムターゼである（Ｒａｔｎａｔｉｌｌｅｋｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４巻、３１６７９〜３１６８５頁（１９９９年））。Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍにおける新規なＩＣＭの近年の研究は、以前の仕事と共に、活性部位近辺の１つのアミノ酸の変化はその酵素の基質特異性を変えるという証拠を与える（Ｒａｔｎａｔｉｌｌｅｋｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４巻、３１６７９〜３１６８５頁（１９９９年）；Ｒｏｈｗｅｒｄｅｒら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、７２巻、４１２８〜４１３５頁（２００６年））。このことは、ネイティブの酵素は、４ＨＢ−ＣｏＡの３ＨＩＢ−ＣｏＡへの転換を触媒できないか、またはこれについて低い活性を示すならば、この酵素は、この活性を増大するために合理的に工学的に操作され得ることを示している。ホモ二量体酵素をコードする例示的なＩＣＭ遺伝子には、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３におけるｉｃｍＡ（Ａｌｈａｐｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０３巻、１２３４１〜１２３４６頁（２００６年））およびＭｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ ＰＭ１におけるＭｐｅ＿Ｂ０５４１（Ｒａｔｎａｔｉｌｌｅｋｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４巻、３１６７９〜３１６８５頁（１９９９年）；Ｒｏｈｗｅｒｄｅｒら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、７２巻、４１２８〜４１３５頁（２００６年））が挙げられる。ヘテロ二量体酵素をコードする遺伝子には、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓにおけるｉｃｍおよびｉｃｍＢ（Ｒａｔｎａｔｉｌｌｅｋｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４巻、３１６７９〜３１６８５頁（１９９９年）；Ｖｒｉｊｂｌｏｅｄら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８１巻、５６００〜５６０５頁（１９９９年）；Ｚｅｒｂｅ−Ｂｕｒｋｈａｒｄｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３巻、６５０８〜６５１７頁（１９９８年））が挙げられる。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ ＭＡ−４６８０におけるｉｃｍＡおよびｉｃｍＢ遺伝子によってコードされる酵素は、公知のＩＣＭに対し、高い配列類似性を示す。これらの遺伝子／タンパク質は、以下で同定される。
図５を参照すると、ステップ２は３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．４）、シンテターゼ（ＥＣ６．２．１．−）または３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）が関与する。ステップ５は、メタクリリルＣｏＡヒドロラーゼ、シンテターゼ、またはトランスフェラーゼが関与する。これらの変換は、ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）、ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）、およびＣｏＡシンテターゼ（ＥＣ６．１．２．−）を含めた異なるクラスの酵素によって実施することができる。初期に論じたように、ＣｏＡトランスフェラーゼまたはＣｏＡシンテターゼを利用してこの変換を実施する場合（表１）、経路のエネルギー特性は最も好ましい。
ＣｏＡ−トランスフェラーゼファミリー中、アセテート−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．８）としても公知である、Ｅ．ｃｏｌｉの酵素アシルＣｏＡ：アセテート−ＣｏＡトランスフェラーゼは、イソブチレート（ＭａｔｔｈｉｅｓおよびＳｃｈｉｎｋ、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８巻、１４３５〜１４３９頁（１９９２年））、バレレート（Ｖａｎｄｅｒｗｉｎｋｅｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３３巻、９０２〜９０８頁（１９６８年））およびブタノエート（Ｖａｎｄｅｒｗｉｎｋｅｌら、上記、１９６８年）を含めた、様々な分岐状および直鎖状アシルＣｏＡ基質由来のアセテートにＣｏＡ成分を移動させることが示されている。この酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉ種Ｋ１２中のａｔｏＡ（αサブユニット）およびａｔｏＤ（βサブユニット）（Ｋｏｒｏｌｅｖら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５８巻、２１１６〜２１２１頁（２００２年）；Ｖａｎｄｅｒｗｉｎｋｅｌら、上記、１９６８年）、ならびにＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ １３０３２中のａｃｔＡおよびｃｇ０５９２（Ｄｕｎｃａｎら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８巻、５１８６〜５１９０頁（２００２年））によってコードされ、図５、ステップ２および５中に示す、望ましい３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼ生体内変化を触媒するための理想的な候補となる。配列相同性による候補遺伝子にはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＵＴ１８９中のａｔｏＤおよびａｔｏＡがある。類似した酵素はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ中にも存在する。
さらなる例示的なトランスフェラーゼの変換は、スクシニルＣｏＡ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡ、およびブチリルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ活性をそれぞれ示すことが示されているＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉのｃａｔ１、ｃａｔ２、およびｃａｔ３の遺伝子産物によって触媒される（ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７８巻、３号、８７１〜８８０頁（１９９６年）；Ｓｅｅｄｏｒｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０５巻、６号、２１２８〜２１３３頁（２００８年））。
嫌気性細菌Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ由来のグルタコネートＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１２）酵素は、二酸グルタコニルＣｏＡおよび３−ブテノイルＣｏＡと反応する（ＭａｃｋおよびＢｕｃｋｅｌ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４０５巻、２０９〜２１２頁（１９９７年））。この酵素をコードする遺伝子はｇｃｔＡおよびｇｃｔＢである。この酵素は、グルタリルＣｏＡ、２−ヒドロキシグルタリルＣｏＡ、アジピルＣｏＡおよびアクリリルＣｏＡを含めた他のＣｏＡ誘導体と共に、低減しているが検出可能な活性を有する（Ｂｕｃｋｅｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１１８巻、３１５〜３２１頁（１９８１年））。この酵素はクローニングされＥ．ｃｏｌｉにおいて発現された（Ｍａｃｋら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２２６巻、４１〜５１頁（１９９４年））。
さらなる酵素候補は、ＣｏＡアクセプターとしてスクネシートを利用するスクシニルＣｏＡ：３−ケト酸ＣｏＡトランスフェラーゼを含む。例示的なスクシニルＣｏＡ：３−ケト酸ＣｏＡトランスフェラーゼは、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（Ｃｏｒｔｈｅｓｙ−Ｔｈｅｕｌａｚら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２巻、２５６５９〜２５６６７頁（１９９７年））およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｓｔｏｌｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．、５３巻、３９６〜４０３頁（２００７年））に存在する。
候補ＡＴＰシンテターゼは、ＡＤＰ形成アセチルＣｏＡシンテターゼ（ＡＣＤ、ＥＣ６．２．１．１３）、それらの対応する酸へのアシルＣｏＡエステルの転換とＡＴＰの同時合成を連結する酵素である。この酵素が基質としての３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡまたはメタクリリルＣｏＡと反応することは示されていないが、広範囲の基質特異性を有するいくつかの酵素は文献中に記載されている。ＡＦ１２１１によってコードされるＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ由来のＡＣＤＩは、イソブチレート、イソペンタノエート、およびフマレートを含めた、様々な直鎖状および分岐鎖状基質に作用することが示された（ＭｕｓｆｅｌｄｔおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４巻、６３６〜６４４頁（２００２年））。Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ由来の酵素（スクシニルＣｏＡシンテターゼとして注釈をつける）は基質としてのプリオピオネート、ブチレート、分岐鎖状の酸（イソバレレートおよびイソブチレート）を受け入れ、正方向および逆方向に作用することが示された（ＢｒａｓｅｎおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８２巻、２７７〜２８７頁（２００４年））。超好熱性クレン古細菌Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来のＰＡＥ３２５０によってコードされるＡＣＤは全ての特徴付けられたＡＣＤの最も広い基質範囲を示し、アセチルＣｏＡ、イソブチリルＣｏＡ（好ましい基質）およびフェニルアセチルＣｏＡと反応した（ＢｒａｓｅｎおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ、上記、２００４年）。しかしながら、定方向進化または工学的操作を使用してこの酵素を改変し、宿主生物体の生理的温度において働かせることができる。Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉおよびＰ．ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来の酵素はいずれもクローニングされ、機能的に発現され、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて特徴付けされた（ＢｒａｓｅｎおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ、上記、２００４年；ＭｕｓｆｅｌｄｔおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４巻、６３６〜６４４頁（２００２年））。
ＣｏＡヒドロラーゼファミリー中、酵素３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼは３−ＨＩＢＣｏＡに特異的であり、バリン分解中の所望の変換を効率よく触媒することが記載されている（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９巻、１４２４８〜１４２５３頁（１９９４年））。この酵素をコードする遺伝子には、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９巻、１４２４８〜１４２５３頁（１９９４年）；Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、３２４巻、２２９〜２４０頁（２０００年））およびＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら、上記、２０００年）のｈｉｂｃｈがある。配列相同性による候補遺伝子にはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｈｉｂｃｈおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓのＢＣ＿２２９２がある。
図５を参照すると、ステップ３は３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．−）が関与する。これは、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼによるＭＡＡへの３−ヒドロキシイソブチレートの脱水を伴う。この酵素の遺伝子候補はスクシニルＣｏＡからＭＡＡの経路中に記載する（実施例Ｖ参照）。さらに図６を参照すると、ステップ４は３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．−）が関与する。メタクリリルＣｏＡへの３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡの脱水は、クロトナーゼなどの可逆的３−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドラターゼ（３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、ＥＣ４．２．１．５５とも呼ばれる）またはエノイルＣｏＡヒドラターゼ（３−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドラターゼ、ＥＣ４．２．１．１７とも呼ばれる）によって実施することができる。これらの酵素は一般に可逆的である（ＭｏｓｋｏｗｉｔｚおよびＭｅｒｒｉｃｋ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、８巻、２７４８〜２７５５頁（１９６９年）；Ｄｕｒｒｅら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、１７巻、２５１〜２６２頁（１９９５年））。クロトナーゼ酵素をコードする例示的な遺伝子は、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ（Ｂｏｙｎｔｏｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８巻、１１号、３０１５〜３０２４頁（１９９６年））、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ（ＨｉｌｌｍｅｒおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、２１巻、３号、３５１〜３５４頁（１９７２年））、およびＭｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ ｓｅｄｕｌａ（Ｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１８巻、５８５７号、１７８２〜１７８６頁（２００７年））中で見ることはできるが、後者の遺伝子の配列は公知ではない。脂肪酸β酸化および／または様々なアミノ酸の代謝と関係があるエノイルＣｏＡヒドラターゼも、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを形成するためのクロトニルＣｏＡの水和を触媒することができる（ＡｇｎｉｈｏｔｒｉおよびＬｉｕ、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１１巻、１号、９〜２０頁（２００３年）；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１１７巻、１号、９９〜１０８頁（１９７８年）；Ｃｏｎｒａｄら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１１８巻、１号、１０３〜１１１頁（１９７４年））。Ｐ．ｐｕｔｉｄａのエノイルＣｏＡヒドラターゼ、ｐｈａＡおよびｐｈａＢは、フェニル酢酸の異化中に二重結合のヒドロキシル化を実施すると考えられる（Ｏｌｉｖｅｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５巻、６４１９〜６４２４頁（１９９８年））。Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のｐａａＡおよびｐａａＢは類似した変換を触媒する（Ｏｌｉｖｅｒａら、上記、１９９８年）。最後に、ｍａｏＣ（ＰａｒｋおよびＬｅｅ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８５巻、５３９１〜５３９７頁（２００３年））、ｐａａＦ（Ｉｓｍａｉｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７０巻、３０４７〜３０５４頁（２００３年）；ＰａｒｋおよびＬｅｅ、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１１３〜１１６頁：３３５〜３４６頁（２００４年）；ＰａｒｋおよびＹｕｐ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、８６巻、６８１〜６８６頁（２００４年））、およびｐａａＧ（Ｉｓｍａｉｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７０巻、３０４７〜３０５４頁（２００３年）；ＰａｒｋおよびＬｅｅ、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１１３〜１１６頁：３３５〜３４６頁（２００４年）；ＰａｒｋおよびＹｕｐ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、８６巻、６８１〜６８６頁（２００４年））を含めた、いくつかのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの遺伝子は、エノイルＣｏＡヒドラターゼの機能性を示すことが示されている。
この実施例は、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡから３−ヒドロキシイソ酪酸またはメタクリル酸を生成するための生合成経路を記載する。
（実施例ＶＩＩＩ）
トレオ−３−メチルアスパルテートを介したＭＡＡへのアルファ−ケトグルタレートの転換のための経路
この実施例は、アルファ−ケトグルタレートからトレオ−３−メチルアスパルテートへの例示的なＭＡＡの合成経路を記載する。
ＭＡＡの生合成に関する別の例示的な経路は、ＴＣＡ回路で生成されるＥ．ｃｏｌｉにおける代謝産物であるアルファ−ケトグルタレートを介して進行する（図６参照）。
酵素アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼによって触媒されるこの経路の最初のステップは、アミノ基をアスパラギン酸からアルファ−ケトグルタレートに移動させ、グルタミン酸およびオキサロ酢酸を形成する。その後の２ステップは、炭素骨格の転位およびメサコン酸形成のためのその後の脱アミノ化を含む。これらの転換を触媒する酵素は、アミノ酸の発酵が可能である土壌中のＣｌｏｓｔｒｉｄｉａおよび他の生物体中でのグルタミン酸のエネルギー生成発酵において見られる（ＢｕｃｋｅｌおよびＢａｒｋｅｒ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１１７巻、１２４８〜１２６０頁（１９７４年））。これらの生物体中の経路の方向性は、生合成経路中のＭＡＡ合成に必要な方向と一致する。最終経路のステップは、メタクリル酸を生成するためのメサコン酸の脱カルボキシル化を伴う。
図６を参照すると、ステップ１はアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．１）が関与する。経路の最初のステップは、アミノ基をアスパラギン酸からアルファ−ケトグルタレートに移動させ、グルタミン酸およびオキサロ酢酸を形成する。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来の遺伝子ａｓｐＣ（Ｙａｇｉら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１００巻、８１〜８４頁（１９７９年）；Ｙａｇｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１１３巻、８３〜８９頁（１９８５年））、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＡＡＴ２（Ｙａｇｉら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、９２巻、３５〜４３頁（１９８２年））、およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来のＡＳＰ５（ｄｅ ｌａ Ｔｏｒｒｅら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、４６巻、４１４〜４２５頁（２００６年）；ＫｗｏｋおよびＨａｎｓｏｎ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．、５５巻、５９５〜６０４頁（２００４年）；ＷｉｌｋｉｅおよびＷａｒｒｅｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．、１２巻、３８１〜３８９巻（１９９８年））は、この転換を触媒する酵素、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする。
図６を参照すると、ステップ２はグルタミン酸ムターゼ（ＥＣ５．４．９９．１）が関与する。ステップ２中、グルタミン酸の炭素直鎖をトレオ−３−メチルアスパルテートの分岐状構造に転位する。この変換は、グルタミン酸ムターゼ、２つのサブユニットで構成されるコバラミン依存性酵素によって触媒される。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｃｈｌｅａｒｉｕｍおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｏｍｏｒｐｈｕｍ由来の２つのグルタミン酸ムターゼは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてクローニングされ機能的に発現されている（ＨｏｌｌｏｗａｙおよびＭａｒｓｈ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９巻、２０４２５〜２０４３０頁（１９９４年）；Ｒｅｉｔｚｅｒら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、５４巻、１０３９〜１０４２頁（１９９８年））。この２つのサブユニットタンパク質をコードする遺伝子は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｃｈｌｅａｒｉｕｍ由来のｇｌｍＥおよびｇｌｍＳ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｏｍｏｒｐｈｕｍ由来のｍａｍＡおよびｇｌｍＥ、ならびにＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ由来のｍｕｔＥおよびｍｕｔＳである（Ｓｗｉｔｚｅｒ、Ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｍｕｔａｓｅ、２８９〜３０５頁、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２年））。
図６を参照すると、ステップ３は３−メチルアスパルターゼ（ＥＣ４．３．１．２）が関与する。β−メチルアスパルターゼまたは３−メチルアスパラギン酸アンモニアリアーゼとも呼ばれる３−メチルアスパルターゼは、メサコン酸へのトレオ−３−メチルアスパルテートの脱アミノ化を触媒する。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｏｍｏｒｐｈｕｍ由来の３−メチルアスパルターゼが、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてクローニングされ機能的に発現され、結晶化されている（Ａｓｕｎｃｉｏｎら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、５７巻、７３１〜７３３頁（２００１年）；Ａｓｕｎｃｉｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７巻、８３０６〜８３１１頁（２００２年）；Ｂｏｔｔｉｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７巻、２９５３〜２９５５頁（１９８８年）；Ｇｏｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１巻、１０７４７〜１０７５６頁（１９９２年））。Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓでは、この酵素はＢＡＡ２８７０９によってコードされる（ＫａｔｏおよびＡｓａｎｏ、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１６８巻、４５７〜４６３頁（１９９７年））。Ｅ．ｃｏｌｉＹＧ１００２由来の３−メチルアスパルターゼも結晶化されているが（ＡｓａｎｏおよびＫａｔｏ、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、１１８巻、２５５〜２５８頁（１９９４年））、そのタンパク質配列はＧｅｎＢａｎｋなどの公のデータベース中には挙げられていない。配列相同性を使用して、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ中のＣＴＣ＿０２５６３およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７中のＥＣｓ０７６１を含めた追加的候補遺伝子を同定することができる。
図６を参照すると、ステップ４はメサコン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．−）が関与する。経路の最終ステップはメタクリル酸へのメサコネートの脱カルボキシル化を伴う。この正確な反応を触媒する酵素は実験によって実証されていない。しかしながら、非常に類似した反応を触媒するいくつかの酵素が存在する。密接に関連した機能を有する１つの酵素はアコニット酸デカルボキシラーゼである。この酵素は、Ｃａｎｄｉｄａのある株および糸状真菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓにおける、イタコネートの生合成中の最終ステップを触媒する（Ｂｏｎｎａｒｍｅら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７７巻、３５７３〜３５７８頁（１９９５年）；ＷｉｌｌｋｅおよびＶｏｒｌｏｐ、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、５６巻、２８９〜２９５頁（２００１年））。イタコネートはバイオテクノロジーの対象とする化合物であるが、アコニット酸デカルボキシラーゼ遺伝子を同定またはクローニングするための努力はこれまでなされていない。
類似した機能を有する第２の酵素は４−オキサロクロトン酸（ｏｘａｌｏｃｒｏｎａｔｅ）デカルボキシラーゼである。この酵素は様々な生物体において一般的であり、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種（株６００）由来の酵素をコードする遺伝子はＥ．ｃｏｌｉにおいてクローニングされ発現されている（Ｓｈｉｎｇｌｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７４巻、７１１〜７２４頁（１９９２年））。メサコネート中のメチル基は立体障害を引き起こす可能性があるが、この問題は定方向進化またはタンパク質工学によって克服される可能性がある。４−オキサロクロトン酸デカルボキシラーゼは２つのサブユニットから構成される。この酵素をコードする遺伝子には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種（株６００）中のｄｍｐＨおよびｄｍｐＥ（Ｓｈｉｎｇｌｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７４巻、７１１〜７２４頁（１９９２年））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ由来のｘｙｌＩＩおよびｘｙｌＩＩＩ（ＫａｔｏおよびＡｓａｎｏ、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１６８巻、４５７〜４６３頁（１９９７年）；Ｓｔａｎｌｅｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３９巻、７１８〜７２６頁（２０００年））、ならびにＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＪＭＰ１３４由来のＲｅｕｔ＿Ｂ５６９１およびＲｅｕｔ＿Ｂ５６９２（Ｈｕｇｈｅｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１５８巻、７９〜８３頁（１９８４年））がある。
この実施例は、アルファ−ケトグルタレートからＭＭＡを生成するための生合成経路を記載する。
（実施例ＩＸ）
２−ヒドロキシグルタレートを介したＭＡＡへのアルファ−ケトグルタレートの転換のための経路
この実施例は、２−ヒドロキシグルタレートを介したＭＡＡへのアルファ−ケトグルタレートからの例示的なＭＡＡの合成経路を記載する。
ＭＡＡの生合成に関する別の例示的な経路は実施例ＶＩＩＩに記載した経路と類似したスキームを有するが、それは、アミン置換中間体（図６参照）ではなく、ヒドロキシル化中間体である２−ヒドロキシグルタレートおよび３−メチルマレート（図７参照）を通過する。
図７を参照すると、ステップ１はα−ケトグルタル酸レダクターゼ（ＥＣ１．１．９９．２）が関与する。この経路の最初のステップは、天然酵素α−ケトグルタル酸レダクターゼによる、２−ヒドロキシグルタレートへのアルファ−ケトグルタレートの還元を伴う。この酵素は、ｓｅｒＡ、中心代謝中の３−ホスホグリセリン酸の還元も触媒する多機能酵素によってコードされる（ＺｈａｏおよびＷｉｎｋｌｅｒ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７８巻、２３２〜２３９頁（１９９６年））。Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ中の遺伝子Ｌ２ＨＧＤＨ（ＪａｎｓｅｎおよびＷａｎｄｅｒｓ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１２２５巻、５３〜５６頁（１９９３年））、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ中のＦＮ０４８７におけるＬ２ｈｇｄｈ（Ｈａｙａｓｈｉら、Ｊ．Ｎｉｈｏｎ Ｕｎｉｖ．Ｓｃｈ．Ｄｅｎｔ．、２８巻、１２〜２１頁（１９８６年））、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ中の予想Ｌ２ｈｇｄｈ（ＪａｎｓｅｎおよびＷａｎｄｅｒｓ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１２２５巻、５３〜５６頁（１９９３年））はこの酵素をコードする。高い配列相同性を有する遺伝子候補には、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ中のＬ２ｈｇｄｈおよびＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ中のＬ２ＨＧＤＨがある。高濃度で、２−ヒドロキシグルタレートは、競合阻害によりα−ケトグルタル酸レダクターゼ活性をフィードバックすることが示されている（ＺｈａｏおよびＷｉｎｋｌｅｒ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７８巻、２３２〜２３９頁（１９９６））。
図７を参照すると、ステップ２は２−ヒドロキシグルタミン酸ムターゼ（ＥＣ５．４．９９．−）が関与する。経路の第２ステップ中、炭素骨格はグルタミン酸ムターゼ酵素による転位を経る。このような酵素により触媒される最も一般的な反応は、図６のステップ２中に示す、トレオ−３−メチルアスパルテートへのグルタミン酸の転換である。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｃｈｌｅａｒｉｕｍ由来のアデノシルコバラミン依存性グルタミン酸ムターゼも、別の基質として２−ヒドロキシグルタレートと反応することが示されているが（Ｒｏｙｍｏｕｌｉｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３９巻、１０３４０〜１０３４６頁（２０００年））、天然基質グルタミン酸を用いた速度と比較して、この反応の速度は２−ヒドロキシグルタレートを用いると２桁低い。酵素の定方向進化を使用して、２−ヒドロキシグルタレートに対するグルタミン酸ムターゼの親和性を増大することができる。グルタミン酸ムターゼをコードするタンパク質配列のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は、実施例ＶＩＩＩ、経路のステップ２中で見られる。
図７を参照すると、ステップ３は３−メチルリンゴ酸デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．−）が関与する。第３ステップ中、３−メチルマレートを脱水してメサコネートを形成する。この正確な変換を触媒する酵素は文献中に記載されていないが、いくつかの酵素は類似の反応を触媒することができる。１つのこのような酵素は、２−メチルマレートをメサコネートに転換する、シトラリンゴ酸ヒドロリアーゼとも呼ばれる２−メチルリンゴ酸デヒドラターゼである。２−メチルマレートと３−メチルマレートは密接に関連があり、構造の唯一の違いはヒドロキシル基の位置である。２−メチルリンゴ酸デヒドラターゼの活性は、グルタミン酸分解ＶＩ経路の状況でＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｏｍｏｒｐｈｕｍ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓにおいて検出されたが（ＫａｔｏおよびＡｓａｎｏ、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６８巻、４５７〜４６３頁（１９９７年））、しかしながら、この酵素をコードする遺伝子は今日まで配列決定されていない。
第２の候補酵素は、フマレートへのマレートの脱水を触媒するフマル酸ヒドラターゼである。実施例Ｖ（ステップ５）中に記載したように、この酵素に関する大量の構造情報が入手可能であり、他の研究ではこの酵素を首尾良く工学的に操作して、活性、阻害および局在を変えている（Ｗｅａｖｅｒ、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、６１巻、１３９５〜１４０１頁（２００５年））。遺伝子候補は実施例Ｖ、経路のステップ５中に論じる。
図７を参照すると、ステップ４はメサコン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．−）が関与する。最終経路のステップは、メタクリル酸へのメサコネートの脱カルボキシル化が関与する。この反応は、実施例ＶＩＩＩ中に記載した経路の最終ステップと同一である。
この実施例は、アルファ−ケトグルタレートからＭＭＡを生成する生合成経路を記載する。
（実施例Ｘ）
アセチルＣｏＡの２−ヒドロキシイソ酪酸またはＭＡＡへの転換のための経路
この実施例は、アセチルＣｏＡからの例示的な２−ヒドロキシイソ酪酸またはＭＡＡの合成経路を記載する。
ＭＡＡの生合成は、少なくとも５つの酵素ステップでアセチルＣｏＡから進行し得る（図８参照）。この経路では、２分子のアセチルＣｏＡが組み合わさってアセトアセチル−ｃｏＡを形成し、次いでこれが３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに還元される。あるいは、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼおよびクロトナーゼによって、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに転換することができる（Ｍａｒｔｉｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０１巻、４４号、１５６４５〜１５６４９頁（２００４年）；ＪｏｎｅｓおよびＷｏｏｄｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、５０巻、４８４〜５２４頁（１９８６年）；Ｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１８巻、５８５７号、１７８２〜１７８６頁（２００７年））。次いでメチルムターゼが３−ヒドロキシブチリルＣｏＡの炭素骨格を２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡに転位して、次いでそれを脱水してメタクリリルＣｏＡを形成する。あるいは、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡを２−ヒドロキシイソブチレートに転換し、分泌させ、生成物として回収することが可能である。メタクリリルＣｏＡをＭＡＡに転換する最終ステップは、１つの酵素（図８中に示す）または一連の酵素によって実施することができる。
図８を参照すると、ステップ１はアセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）が関与する。２つのアセチルＣｏＡ単位からのアセトアセチルＣｏＡの形成は、アセチルＣｏＡチオラーゼによって触媒される。この酵素はＥ．ｃｏｌｉに本来備わっており、遺伝子ａｔｏＢによってコードされ、典型的には脂肪酸酸化の間にアセトアセテート分解方向に作用する（ＤｕｎｃｏｍｂｅおよびＦｒｅｒｍａｎ、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１７６巻、１５９〜１７０頁（１９７６年）；ＦｒｅｒｍａｎおよびＤｕｎｃｏｍｂｅ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ５８０巻、２８９〜２９７（１９７９年））。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来の遺伝子ｔｈｌＡをＥ．ｃｏｌｉのイソプロパノール生成株へと工学的に操作した（Ｈａｎａｉら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、７３巻、７８１４〜７８１８頁（２００７年）；Ｓｔｉｍ−Ｈｅｒｎｄｏｎら、Ｇｅｎｅ、１５４巻、８１〜８５頁（１９９５年））。さらなる遺伝子候補としては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ由来のｔｈｌ（ＭｅｎｇおよびＬｉ、Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｌｅｔｔ．２８巻、１２２７〜１２３２頁（２００６年））およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ 由来のＥＲＧ１０（Ｈｉｓｅｒら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９巻、３１３８３〜８９頁（１９９４年））が挙げられる。
図８を参照すると、ステップ２はアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ＃：１．１．１．３５）が関与する。第２ステップは、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼによる３−ヒドロキシブチリルＣｏＡへのアセトアセチルＣｏＡの還元を伴う。この酵素は数種のＣｌｏｓｔｒｉｄｉａにおいてブチレートへのアセチルＣｏＡの発酵経路に関与し、詳細に研究されている（ＪｏｎｅｓおよびＷｏｏｄｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、５０巻、４８４〜５２４頁（１９８６年））。ｈｂｄによってコードされるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来の酵素が、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてクローニングされ機能的に発現されている（Ｙｏｕｎｇｌｅｓｏｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７１巻、６８００〜６８０７頁（１９８９年））。さらに、ｆａｄＢおよびｆａｄＪによってコードされる、Ｅ．ｃｏｌｉにおける２つの脂肪酸酸化複合体のサブユニットは、３−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼとして機能する（ＢｉｎｓｔｏｃｋおよびＳｃｈｕｌｚ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、７１巻ＰｔＣ、４０３〜４１１頁（１９８１年））。アセトアセチルＣｏＡを３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに還元することが証明されているなお他の遺伝子は、Ｚｏｏｇｌｏｅａ ｒａｍｉｇｅｒａ由来のｐｈｂＢ（Ｐｌｏｕｘら、Ｅｕｒ．Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７４巻、１７７〜１８２頁（１９８８年））およびＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ由来のｐｈａＢ（Ａｌｂｅｒら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６１巻、２９７〜３０９頁（２００６年））である。前者の遺伝子は、ＮＡＤＰＨ−依存型であり、そのヌクレオチド配列は、決定されていて（Ｐｅｏｐｌｅｓら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３巻、３４９〜３５７頁（１９８９年））、この遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現されている。この遺伝子における基質特異性研究は、アセトアセチルＣｏＡのほかに３−オキソプロピオニルＣｏＡを基質として受け入れ得るという結論に導いた（Ｐｌｏｕｘら、Ｅｕｒ．Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７４巻、１７７〜１８２頁（１９８８年））。さらなる遺伝子候補としては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉにおけるＨｂｄ１（Ｃ末端ドメイン）およびＨｂｄ２（Ｎ末端ドメイン）（ＨｉｌｌｍｅｒおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ３３３４巻、１２〜２３頁（１９７４年））ならびにＢｏｓ ｔａｕｒｕｓにおけるＨＳＤ１７Ｂ１０（Ｗａｋｉｌら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２０７巻、６３１〜６３８頁（１９５４年））が挙げられる。Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ由来の酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、機能的に発現され、特徴付けされている（Ｙａｂｕｔａｎｉら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１３３巻、８５〜９０頁（１９９５年））。一群の類似の酵素が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの他の種およびＭｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ ｓｅｄｕｌａに見出されている（Ｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．３１８巻、１７８２〜１７８６頁（２００７年））。Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来の酵素は、ペルオキシソームの脂肪酸ベータ−酸化多機能性酵素２型（ＭＦＥ−２）の構成要素である。このタンパク質のデヒドロゲナーゼＢドメインは、アセトアセチルＣｏＡに対して触媒的に活性である。このドメインは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて機能的に発現されていて、結晶構造は利用可能であり、触媒メカニズムは十分に理解されている（Ｙｌｉａｎｔｔｉｌａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３２４巻、２５〜３０頁（２００４年）；Ｙｌｉａｎｔｔｉｌａら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３５８巻、１２８６〜１２９５頁（２００６年））。
図８を参照すると、ステップ３は３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ（ＥＣ５．４．９９．−）が関与する。次のステップでは、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼにより、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを転位して２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡ（２−ＨＩＢＣｏＡ）を形成する。この酵素は近年発見された新規のＩＣＭ様メチルムターゼであり、Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍにおいて特徴付けられている（Ｒａｔｎａｔｉｌｌｅｋｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４巻、３１６７９〜３１６８５頁（１９９９年）；Ｒｏｈｗｅｒｄｅｒら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７２巻、４１２８〜４１３５頁（２００６年））。Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ ＰＭ１におけるＭｐｅ＿Ｂ０５４１によってコードされるこの酵素は、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓにおけるＲｓｐｈ１７０２９＿３６５７およびＸａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓにおけるＸａｕｔ＿５０２１を含めた他の生物体におけるメチルマロニルＣｏＡムターゼの大サブユニットと高い配列相同性を有する。実施例ＶＩＩ（ステップ１）において議論されるように、活性部位の近くの１つのアミノ酸に対する変化は、その酵素の基質特異性を変える（Ｒａｔｎａｔｉｌｌｅｋｅら、前出、１９９９年；Ｒｏｈｗｅｒｄｅｒら、前出、２００６年）ので、この部位において類似の酵素（先に記載されたメチルマロニルＣｏＡムターゼまたはイソブトリリル（ｉｓｏｂｕｔｒｙｒｙｌ）ＣｏＡムターゼなど）の工学的操作を指向することが、所望の反応性を達成するために使用され得る。
図８を参照すると、ステップ４は、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼが関与する。２−ヒドロキシアシルＣｏＡ（例えば、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡ）の脱水は、２−ヒドロキシアシルＣｏＡ誘導体をラジカル機構を介して脱水する特別なクラスの酸素感受性酵素によって触媒され得る（ＢｕｃｋｅｌおよびＧｏｌｄｉｎｇ、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０巻、２７〜４９頁（２００６年）；Ｂｕｃｋｅｌら、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．８巻、４６２〜４６７頁（２００４年）；Ｂｕｃｋｅｌら、Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．３８６巻、９５１〜９５９頁（２００５年）；Ｋｉｍら、ＦＥＢＳ Ｊ．２７２巻、５５０〜５６１頁（２００５年）；Ｋｉｍら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ．２８巻、４５５〜４６８頁（２００４年）；Ｚｈａｎｇら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４５巻（Ｐｔ９）、２３２３〜２３３４頁（１９９９年））。このような酵素の一例は、ラクトイルＣｏＡの脱水を触媒してアクリルＣｏＡを形成する、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ由来のラクチルＣｏＡデヒドラターゼである（ＫｕｃｈｔａおよびＡｂｅｌｅｓ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６０巻、１３１８１〜１３１８９頁（１９８５年）；ＨｏｆｍｅｉｓｔｅｒおよびＢｕｃｋｅｌ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０６巻、５４７〜５５２頁（１９９２年））。さらなる例は、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ由来のｈｇｄＡＢＣによってコードされる２−ヒドロキシグルタリルＣｏＡデヒドラターゼである（ＭｕｅｌｌｅｒおよびＢｕｃｋｅｌ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２３０巻、６９８〜７０４頁（１９９５年）；Ｓｃｈｗｅｉｇｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１６９巻、４４１〜４４８頁（１９８７年））。さらに別の例は、ｈａｄＢＣによって触媒されｈａｄＩによって活性化されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の２−ヒドロキシイソカプロイルＣｏＡデヒドラターゼである（Ｄａｒｌｅｙら、ＦＥＢＳ Ｊ．、２７２巻、５５０〜６１頁（２００５年））。Ａ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓおよびＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅについての対応する配列は、以下に列挙されるとおり見出され得る。完全なＣ．ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｕｍラクトイルＣｏＡデヒドラターゼの配列は、公に利用可能なデータベースにおいて未だ列挙されていない。しかし、ベータ−サブユニットの配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ２７６５５３（Ｓｅｌｍｅｒ ら、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ、２６９巻、３８２〜８０頁（２００２年））に対応する。
図８を参照すると、ステップ５または６は、それぞれメタクリル酸または２−ヒドロキシイソ酪酸に対する活性を有する、トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）、ヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）、またはシンテターゼ（ＥＣ６．２．１．−）が関与する。メタクリリルＣｏＡからＭＡＡへの直接転換、または２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡから２−ヒドロキシイソブチレートへの直接転換は、ＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼによって実施することができる。実施例ＶＩＩ中で論じたように、ＣｏＡトランスフェラーゼまたはＣｏＡシンテターゼを利用してこの変換を実施する場合、経路のエネルギー特性は最も好ましい。トランスフェラーゼファミリー中、アセテート−ＣｏＡトランスフェラーゼとしても公知である酵素アシルＣｏＡ：アセテート−ＣｏＡトランスフェラーゼは、分岐状アシルＣｏＡ基質を含めたその広範囲の基質特異性のため、望ましい２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡまたはメタクリルＣｏＡトランスフェラーゼ活性を触媒するのに適した候補である（ＭａｔｔｈｉｅｓおよびＳｃｈｉｎｋ、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５８巻、１４３５〜１４３９頁（１９９２年）；Ｖａｎｄｅｒｗｉｎｋｅｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、３３巻、９０２〜９０８頁（１９６８年））。ＡＤＰ形成アセチルＣｏＡシンテターゼ（ＡＣＤ）は、構造上類似した分岐鎖状化合物に作用するＣｏＡシンテターゼファミリー中の有望な酵素である（ＢｒａｓｅｎおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ、Ａｒｃｈ．．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１８２巻、２７７〜２８７頁（２００４年）；ＭｕｓｆｅｌｄｔおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８４巻、６３６〜６４４頁（２００２年））。ＣｏＡ−ヒドロラーゼファミリー中、酵素３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼは、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡ、メチルマロニルＣｏＡ、および３−ヒドロキシ−２−メチルブタノイルＣｏＡを含めた、様々な分岐鎖状アシルＣｏＡ基質に作用することが示されている（Ｈａｗｅｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、３２４巻、２１８〜２２８頁（２０００年）；Ｈａｗｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１巻、２６４３０〜２６４３４頁（１９９６年）；Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９巻、１４２４８〜１４２５３頁（１９９４年））。ＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼおよびヒドロラーゼのための他の例示的な遺伝子候補は、実施例ＶＩＩ（ステップ２および５）中に論じる。
図８を参照すると、別のステップ５はＭＡＡへの間接的転換が関与する。ＭＡＡへのＭＡＡ−ＣｏＡの直接転換の代替として、メタクリリルＣｏＡをＭＡＡに転換するための別の戦略は、３−ヒドロキシイソブチレートを介してＭＡＡ−ＣｏＡをＭＡＡに転換する多段階プロセスを伴う。このプロセスによって、ＭＡＡ−ＣｏＡは最初に３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡに転換され、それは後に実施例ＶＩＩ中に記載したようにＭＡＡに転換され得る。
この間接的経路の最初のステップは、エノイルＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１７および４．２．１．７４）による、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡ（３ＨＩＢ−ＣｏＡ）へのＭＡＡ−ＣｏＡの転換を伴う。Ｅ．ｃｏｌｉでは、ｆａｄＡおよびｆａｄＢの遺伝子産物は、エノイルＣｏＡヒドラターゼ活性を示す脂肪酸酸化に関与する多酵素複合体をコードする（ＮａｋａｈｉｇａｓｈｉおよびＩｎｏｋｕｃｈｉ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１８巻、４９３７頁（１９９０年）；Ｙａｎｇ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７３巻、７４０５〜７４０６頁（１９９１年）；Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５巻、１０４２４〜１０４２９頁（１９９０年）；Ｙａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０巻、６７８８〜６７９５頁（１９９１年））。ｆａｄＲによってコードされる負のレギュレーターのノックアウトを利用して、ｆａｄＢ遺伝子産物を活性化することができる（Ｓａｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ．、１０３巻、３８〜４４頁（２００７年））。ｆａｄＩ遺伝子とｆａｄＪ遺伝子は類似した機能をコードし、嫌気的条件下で天然に発現される（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４７巻、７９３〜８０５頁（２００３年））。
エノイルＣｏＡヒドラターゼをコードする追加的な天然遺伝子候補には、ｍａｏＣ（ＰａｒｋおよびＬｅｅ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８５巻、５３９１〜５３９７頁（２００３年））、ｐａａＦ（Ｉｓｍａｉｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７０巻、３０４７〜３０５４頁（２００３年）；ＰａｒｋおよびＬｅｅ、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１１３〜１１６巻、３３５〜３４６頁（２００４年）；ＰａｒｋおよびＹｕｐ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、８６巻、６８１〜６８６頁（２００４年））、およびｐａａＧ（Ｉｓｍａｉｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７０巻、３０４７〜３０５４頁（２００３年）；ＰａｒｋおよびＬｅｅ、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１１３〜１１６巻：３３５〜３４６頁（２００４年）；ＰａｒｋおよびＹｕｐ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、８６巻、６８１〜６８６頁（２００４年））がある。他の候補には、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ（Ｏｌｉｖｅｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５巻、６４１９〜６４２４頁（１９９８年））およびＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（Ｄｉ Ｇｅｎｎａｒｏら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１８８巻、１１７〜１２５頁（２００７年））由来のｐａａＡ、ｐａａＢ、およびｐａａＮがある。Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来のｃｒｔの遺伝子産物は別の候補である（Ａｔｓｕｍｉら、Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．、２００７年９月１４日電子出版；Ｂｏｙｎｔｏｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７８巻、３０１５〜３０２４頁（１９９６年））。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａのエノイルＣｏＡヒドラターゼ（ｅｃｈによってコードされる）は、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡのクロトニルＣｏＡへの転換を触媒する（Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １１７巻、９９〜１０８頁（１９７８年））。この変換はまた、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍのｃｒｔ遺伝子産物、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉおよび他のクロストリジウム生物体のｃｒｔ１遺伝子産物によっても、触媒される（Ａｔｓｕｍｉら、Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ １０巻、３０５〜３１１頁（２００８年）；Ｂｏｙｎｔｏｎら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８巻、３０１５〜３０２４頁（１９９６年）；Ｈｉｌｌｍｅｒら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１巻、３５１〜３５４頁（１９７２年））。さらなるエノイルＣｏＡヒドラターゼ候補は、Ｐ．ｐｕｔｉｄａの ｐｈａＡおよびｐｈａＢ、ならびにＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のｐａａＡおよびｐａａＢである（Ｏｌｉｖｅｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ ９５巻、６４１９〜６４２４頁（１９９８年））。
この実施例は、アセチルＣｏＡからの２−ヒドロキシイソブチレートまたはＭＡＡの産生のための生合成経路を記載する。
（実施例ＸＩ）
この実施例は、クロトノイルＣｏＡを介したアセチルＣｏＡからの例示的なＭＡＡの合成経路を記載する。
少なくとも７つの酵素ステップでＭＡＡにアセチルＣｏＡを転換するための別の経路を記載する（図９参照）。好気的および嫌気的条件下でのこの経路の収率は、実施例ＸＩ中に記載した経路と類似している。
経路の最初の２ステップは、実施例Ｘ中に記載した経路中のステップ１および２と同一である。第３ステップでは、クロトナーゼ（ＥＣ＃：４．２．１．５５）によって３−ＨＢＣｏＡを脱水してクロトニルＣｏＡを形成する。クロトニルＣｏＡ中の二重結合はブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ＃：１．３．９９．２）によって還元される。これらの酵素の両方が、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼと全く同様に、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ種における酪酸へのアセチルＣｏＡの発酵経路の一部である（ＪｏｎｅｓおよびＷｏｏｄｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、５０巻、４８４〜５２４頁（１９８６年））。後のステップ中、イソブチリルＣｏＡムターゼ（５．４．９９．１２）、イソブチリルＣｏＡにブチリルＣｏＡを可逆的に転換することができる酵素によって、ブチリルＣｏＡをイソブチリルＣｏＡに転換する。この酵素はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓからクローニングおよび配列決定されており、組換え酵素がＥ．ｃｏｌｉにおいて特徴付けられている（Ｒａｔｎａｔｉｌｌｅｋｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４巻、３１６７９〜３１６８５頁（１９９９年））。経路中の次のステップは、２−メチル−アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ＃：１．３．９９．１２）によるメタクリリルＣｏＡへのイソブチリルＣｏＡの転換を伴う。メタクリリルＣｏＡへのこの変換はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種において観察されており、関連酵素はＥ．ｃｏｌｉにおいて単離および発現されている（Ｙｏｕｎｇｌｅｓｏｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７１巻、６８００〜６８０７頁（１９８９年））。最終ステップでは、実施例Ｘ（ステップ５）中に記載したように、１つの酵素または一連の酵素のいずれかによって、メタクリリルＣｏＡをＭＡＡに転換する。
この実施例は、アセチルＣｏＡからＭＡＡを生成する生合成経路を記載する。
（実施例ＸＩＩ）
ＭＡＡへのアクリリルＣｏＡの転換のための経路
この実施例は、アクリリルＣｏＡからの例示的なＭＡＡの合成経路を記載する。
高収率のＭＡＡはアクリリルＣｏＡ経路によって得ることができる（図１０参照）。この経路は、ラクトイルＣｏＡへのラクテートの活性化、次にこの活性化ＣｏＡ分子をＭＡＡに転換するための５、または場合によっては６、それより多くのステップを必要とする。この経路を使用したグルコースからのＭＡＡ収率はグルコース１ｍｏｌ当たり１．２８ｍｏｌであり、酸素の取り込みがこれらの収率を得るのに必要とされる。酸素の不在下では、予想収率は消費するグルコース１ｍｏｌ当たり１．２８ｍｏｌから１．０９ｍｏｌに低下する。好気的経路と嫌気的経路は両方共に最大ＭＡＡ収率でエネルギーが制限され、いかなるＡＴＰも生成しない。
アクリリルＣｏＡ経路を介したＭＡＡの生合成は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２８）、Ｅ．ｃｏｌｉおよび多くの他の生物体に固有の酵素によるラクテートへのピルベートの転換を最初に必要とする。ラクテートをプロピオニルＣｏＡに転換する３つの後のステップは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍおよびＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉなどのいくつかの無関係な細菌中のピルビン酸発酵経路における酵素によって触媒される（ＭｅｔａＣｙｃ）。プロピネートＣｏＡトランスフェラーゼとしても公知されているラクテートＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１）はラクテートをラクトイルＣｏＡに転換し、基質としてプロピオネートとラクテートの両方を使用することができる。この酵素は精製および特徴付けられている（Ｓｃｈｗｅｉｇｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１６９巻、４４１〜４４８頁（１９８７年））。ラクトイルＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．５４）、多数の研究の対象となっている酵素を使用して、ラクトイルＣｏＡをアクリリルＣｏＡに脱水する（ＨｏｆｍｅｉｓｔｅｒおよびＢｕｃｋｅｌ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０６巻、５４７〜５５２頁（１９９２年）；ＫｕｃｈｔａおよびＡｂｅｌｅｓ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６０巻、１３１８１〜１３１８９頁（１９８５年））。その後アクリリルＣｏＡは、アクリロイルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．３．２．２、以前は１．３．９９．３）を使用してプロピオニルＣｏＡに還元する（Ｈｅｔｚｅｌら、Ｅｕｒ．Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７０巻、９０２〜９１０頁（２００３年）；ＫｕｃｈｔａおよびＡｂｅｌｅｓ、上記、１９８５年）。
図１０を参照すると、ステップ５中、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ（６．４．１．３）によってプロピオニルＣｏＡがＳ−メチルマロニルＣｏＡに転換される。プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼはラット肝臓から精製されており（Ｂｒｏｗｎｅｒら、Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４巻、１２６８０〜１２６８５頁（１９８９年）；Ｋｒａｕｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５８巻、７２４５〜７２４８頁（１９８３年））、ヒト肝臓からも単離され特徴付けられている（Ｋａｌｏｕｓｅｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５５巻、６０〜６５頁（１９８０年））。この酵素によるスクシニルＣｏＡへのプロピオニルＣｏＡのカルボキシル化は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプロピネート代謝の機構の１つとして確認されているが（Ｅｖａｎｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２９１巻、Ｐｔ３号、９２７〜９３２頁（１９９３年））、この経路の遺伝的性質に関してはほとんど公知でない。
この経路の最終ステップは、ＭＡＡへのメチルマロニルＣｏＡの転換を伴う（図１０中のひとまとめにした反応）。これらの反応を触媒する酵素は実施例Ｖ中に記載する。
この実施例は、ピルベートからＭＡＡを生成する生合成経路を記載する。
（実施例ＸＩＩＩ）
２−ケトイソバレレートのＭＡＡへの転換のための経路
この実施例は、２−ケトイソバレレートからの例示的なＭＡＡ合成経路を記載する。
上記経路（図１１参照）は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、および数種のＰｓｅｕｏｄｏｍｏｎａｓを含めたいくつかの生物体において記載されるが、Ｅ．ｃｏｌｉ中またはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中に存在することは公知でない、バリン分解経路の多数のステップを利用する。バリン分解経路の最初のステップ中、分岐鎖状アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．２４）、Ｅ．ｃｏｌｉにも固有である酵素によって、バリンは２−ケトイソバレレートに転換される（ＭａｔｔｈｉｅｓおよびＳｃｈｉｎｋ、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５８巻、１４３５〜１４３９頁（１９９２年）；ＲｕｄｍａｎおよびＭｅｉｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００巻、５９１〜６０４頁（１９５３年））。分岐鎖状ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＥＣ１．２．１．２５）によって触媒される、イソブチリルＣｏＡへの２−ケトイソバレレートのその後の転換は、この経路によるＭＡＡ生合成の実行ステップである。次に、イソブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．３．９９．１２）によって、イソブチリルＣｏＡをメタクリリルＣｏＡに転換する。このステップに関する詳細は実施例ＸＩ中に記載する。最終ステップ、ＭＡＡへのＭＡＡ−ＣｏＡの転換は実施例Ｖ中に記載する。
この実施例は、２−ケトイソバレレートからＭＭＡを生成する生合成経路を記載する。
（実施例ＸＩＶ）
２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡを介した、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡの２−ヒドロキシイソブチレートまたはＭＡＡへの転換のための経路
この実施例は、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡから進行し、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡを通る例示的な２−ヒドロキシイソブチレートまたはＭＡＡ合成経路を記載する。
この経路は最初にビニルアセチルＣｏＡへの４−ヒドロキシブチリルＣｏＡの脱水を伴い、それは後にクロトノイルＣｏＡに異性体化される。クロトニルＣｏＡを水和して３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを形成し、それは２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡに転位される。２−ヒドロキシイソブチレート経路の最終ステップは、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡからのＣｏＡ官能基の除去が関与する。ＭＡＡ合成中の最終ステップは、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡの脱水、次にメタクリリルＣｏＡからのＣｏＡ官能基の除去が関与する。図８の最初の３経路のステップ、ステップ７、８、および９の遺伝子候補は以下に記載する。図８のステップ３、４、５、および６の遺伝子候補は実施例Ｘ中に論じる。
図８を参照すると、ステップ７および８は４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ酵素によって実施する。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｕｍとＣ．ｋｌｕｙｖｅｒｉの両方由来の酵素は、クロトニルＣｏＡへの４−ヒドロキシブチリルＣｏＡの可逆的転換を触媒し、さらに固有のビニルアセチルＣｏＡΔ−イソメラーゼ活性を有する（ＳｃｈｅｒｆおよびＢｕｃｋｅｌ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２１５巻、４２１〜４２９頁（１９９３年）；Ｓｃｈｅｒｆら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１６１巻、２３９〜２４５頁（１９９４年））。Ｎ末端アミノ酸配列を含めて両方の天然酵素が精製および特徴付けられている（ＳｃｈｅｒｆおよびＢｕｃｋｅｌ、上記、１９９３年；Ｓｃｈｅｒｆら、上記、１９９４年）。Ｃ．ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｕｍおよびＣ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ由来のａｂｆＤ遺伝子はこれらのＮ末端アミノ酸配列が正確に一致し、したがって４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ／ビニルアセチルＣｏＡΔ−イソメラーゼをコードする。さらに、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来のａｂｆＤ ＡＴＣＣ３３２７７は、相同性によって同定することができる別の例示的な４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼである。Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来のａｂｆＤ遺伝子産物およびＭｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ ｓｅｄｕｌａ由来のＭｓｅｄ＿１２２０遺伝子産物は、クロストリジウムの遺伝子産物に対して、配列相同性によって、密接に関連している。
図８のステップ９はクロトナーゼ酵素によって実施する。このような酵素はいくつかの生物体、特にＣｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ種中のｎ−ブタノール形成に必要とされ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ、およびＭｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ属の好熱好酸性古細菌中の３−ヒドロキシプロピオン酸／４−ヒドロキシ酪酸回路の１ステップをさらに含む。クロトナーゼ酵素をコードする例示的な遺伝子は、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ（Ｂｏｙｎｔｏｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７８巻、１１号、３０１５〜３０２４頁（１９９６年））、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ（ＨｉｌｌｍｅｒおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、２１巻、３号、３５１〜３５４頁（１９７２年））、およびＭｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ ｓｅｄｕｌａ（Ｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１８巻、５８５７号、１７８２〜１７８６頁（２００７年））中で見ることができるが、後者の遺伝子の配列は公知ではない。脂肪酸β酸化および／または様々なアミノ酸の代謝に関与するエノイルＣｏＡヒドラターゼは、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを形成するためのクロトニルＣｏＡの水和も触媒することができる（ＡｇｎｉｈｏｔｒｉおよびＬｉｕ、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．１１巻、１号、９〜２０頁（２００３年）；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ａｒｃｈ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１１７巻、１号、９９〜１０８頁（１９７８年）；Ｃｏｎｒａｄら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１１８巻、１号、１０３〜１１頁（１９７４年））。Ｐ．ｐｕｔｉｄａのエノイルＣｏＡヒドラターゼ、ｐｈａＡおよびｐｈａＢは、フェニル酢酸異化中に二重結合のヒドロキシル化を実施すると考えられる（Ｏｌｉｖｅｒａら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９５巻、１１号、６４１９〜６４２４頁（１９９８年））。Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のｐａａＡおよびｐａａＢは同様の変換を触媒する（Ｏｌｉｖｅｒａら、上記、１９９８年）。最後に、ｍａｏＣ（ＰａｒｋおよびＬｅｅ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８５巻、１８号、５３９１〜５３９７頁（２００３年））、ｐａａＦ（ＰａｒｋおよびＬｅｅ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、８６巻、６号、６８１〜６８６頁（２００４年ａ））；ＰａｒｋおよびＬｅｅ、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１１３〜１１６頁：３３５〜３４６頁（２００４年ｂ））；Ｉｓｍａｉｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７０巻、１４号、３０４７〜３０５４頁（２００３年）、およびｐａａＧ（ＰａｒｋおよびＬｅｅ、上記、２００４年；ＰａｒｋおよびＬｅｅ、上記、２００４年ｂ；Ｉｓｍａｉｌら、上記、２００３年）を含めた、いくつかのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの遺伝子はエノイルＣｏＡヒドラターゼの機能性を示すことが示されている。
この実施例は、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡからの２−ヒドロキシイソブチレートまたはメタクリル酸のための生合成経路を記載する。
（実施例ＸＶ）
シンガスから還元当量を抽出するための例示的なヒドロゲナーゼおよびＣＯデヒドロゲナーゼ酵素ならびに例示的な還元的ＴＣＡ回路の酵素
本発明の天然に存在しない微生物体において有用である還元的ＴＣＡ回路の酵素としては、１つ以上のＡＴＰクエン酸リアーゼならびに３つのＣＯ２固定酵素：イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アルファ−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼが挙げられる。ＡＴＰクエン酸リアーゼまたはクエン酸リアーゼおよびアルファ−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼの存在は、ある生物体における活性な還元的ＴＣＡ回路の存在を示す。還元的ＴＣＡ回路の各ステップについての酵素は、以下に示され、本明細書中で記載される。
ＡＴＰクエン酸リアーゼ（ＡＣＬ、ＥＣ２．３．３．８）はまた、ＡＴＰクエン酸シンターゼとも呼ばれ、シトレートからオキサロアセテートおよびアセチルＣｏＡへのＡＴＰ依存型切断を触媒する。ＡＣＬは、緑色硫黄細菌Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ ｌｉｍｉｃｏｌａおよびＣｈｌｏｒｏｂｉｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍにおいて研究されているＲＴＣＡ回路の酵素である。Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ ｌｉｍｉｃｏｌａ由来のアルファ（４）ベータ（４）ヘテロマー酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてクローニングされ、そして特徴付けされた（Ｋａｎａｏら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９巻、３４０９〜３４１６頁（２００２年）。ａｃｌＡＢによってコードされるＣ．ｌｉｍｉｃｏｌａ酵素は、不可逆的であり、その酵素の活性は、ＡＤＰ／ＡＴＰの比によって調節される。Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍ由来の組換えＡＣＬはまた、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、触媒メカニズムにおけるアルファサブユニットおよびベータサブユニットの役割を明らかにする研究において、ホロ酵素は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで再構成された（ＫｉｍおよびＴａｂｉｔａ、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８８巻、６５４４〜６５５２頁（２００６年）。ＡＣＬ酵素はまた、Ｂａｌｎｅａｒｉｕｍ ｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｓｕｌｆｕｒｉｈｙｄｒｏｇｅｎｉｂｉｕｍ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅｕｍおよびＡｑｕｉｆｉｃａｅ門の細菌の他のメンバーにおいても同定されている（Ｈｕｇｌｅｒら、Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９巻、８１〜９２頁（２００７年））。この活性は、幾種類かの真菌においても報告されている。例示的な生物体としては、Ｓｏｒｄａｒｉａ ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ（Ｎｏｗｒｏｕｓｉａｎら、Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ．３７巻、１８９〜９３頁（２０００年））、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（ＨｙｎｅｓおよびＭｕｒｒａｙ、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｃｅｌｌ， ７月号、１０３９〜１０４８頁、（２０１０年）およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ（Ｍｅｉｊｅｒら、Ｊ． Ｉｎｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６巻、１２７５〜１２８０頁（２００９年））が挙げられる。他の候補は、配列相同性に基づいて見出され得る。これらの酵素に関連する情報は、以下に表にまとめられる：
いくつかの生物体において、シトレートのオキサロアセテートおよびアセチルＣｏＡへの転換は、シトリルＣｏＡ中間体を通して進行し、２つの別個の酵素、シトリルＣｏＡシンテターゼ（ＥＣ６．２．１．１８）およびシトリルＣｏＡリアーゼ（ＥＣ４．１．３．３４）によって触媒される（Ａｏｓｈｉｍａ， Ｍ．、Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７５巻、２４９〜２５５頁（２００７年）。シトリルＣｏＡシンテターゼは、シトレートのシトリルＣｏＡへの活性化を触媒する。Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの酵素は、それぞれｃｃｓＡおよびｃｃｓＢによってコードされる大サブユニットおよび小サブユニットからなる（Ａｏｓｈｉｍａら、Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｂｉｏｌ．５２巻、７５１〜７６１頁（２００４年））。Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓのシトリルＣｏＡシンテターゼは、ｓｕｃＣ１およびｓｕｃＤ１によってコードされるアルファサブユニットおよびベータサブユニットからなる（Ｈｕｇｌｅｒら、Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９巻、８１〜９２頁（２００７年））。シトリルＣｏＡリアーゼは、シトリルＣｏＡを、オキサロアセテートとアセチルＣｏＡとに分ける。この酵素は、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓにおけるｃｃｌ（Ａｏｓｈｉｍａら、Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５２巻、７６３〜７７０頁（２００４年））およびＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓにおけるａｑ＿１５０（Ｈｕｇｌｅｒら、前出（２００７））によってコードされるホモトリマーである。シトレートをオキサロアセテートとシトリルＣｏＡとに転換するメカニズムについての遺伝子はまた、近年、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍにおいて報告されている（Ｅｉｓｅｎら、ＰＮＡＳ ９９巻（１４号）、９５０９〜１４頁（２００２年）。
オキサロアセテートは、順方向および逆方向の両方において機能する酵素であるリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．３７）によって、マレートに変換される。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの３つのコピー、ＭＤＨ１（ＭｃＡｌｉｓｔｅｒ−ＨｅｎｎおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９巻、５１５７〜５１６６頁（１９８７年）、ＭＤＨ２（ＭｉｎａｒｄおよびＭｃＡｌｉｓｔｅｒ−Ｈｅｎｎ、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．１１巻、３７０〜３８０頁（１９９１年）；ＧｉｂｓｏｎおよびＭｃＡｌｉｓｔｅｒ−Ｈｅｎｎ、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２７８巻、２５６２８〜２５６３６頁（２００３年））、ならびにＭＤＨ３（ＳｔｅｆｆａｎおよびＭｃＡｌｉｓｔｅｒ−Ｈｅｎｎ、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２６７巻、２４７０８〜２４７１５頁（１９９２年））を有し、これらは、それぞれ、ミトコンドリア、サイトゾルおよびペルオキシソームに局在する。Ｅ．ｃｏｌｉは、ｍｄｈによってコードされる活性型リンゴ酸デヒドロゲナーゼを有することが公知である。
フマル酸ヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．２）は、フマレートのマレートへの可逆的水和を触媒する。Ｅ．ｃｏｌｉの３つのフマラーゼ（ｆｕｍＡ、ｆｕｍＢおよびｆｕｍＣによってコードされる）は、酸素利用性の異なる条件下で調節される。ＦｕｍＢは、酸素感受性であり、嫌気性条件下で活性である。ＦｕｍＡは、微嫌気性条件下で活性であり、ＦｕｍＣは、好気性増殖条件下で活性である（Ｔｓｅｎｇら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３巻、４６１〜４６７頁（２００１年）；Ｗｏｏｄｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ９５４巻、１４〜２６頁（１９８８年）；Ｇｕｅｓｔら、Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３１巻、２９７１〜２９８４頁（１９８５年））。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、フマラーゼ−コード遺伝子であるＦＵＭ１の１つのコピーを含み、この産物は、サイトゾルおよびミトコンドリアの両方に局在する（Ｓａｓｓら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２７８巻、４５１０９〜４５１１６頁（２００３年））。さらなるフマラーゼ酵素は、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ（Ｓｍｉｔｈら、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．３１巻、９６１〜９７５頁（１９９９年））、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｍｉｚｏｂａｔａら、Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５５巻、４９〜５５頁（１９９８年））およびＲａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．８９巻、１９２３〜１９３１頁（１９８１年））に見出される。高い配列相同性を有する類似の酵素としては、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来のｆｕｍ１およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のｆｕｍＣが挙げられる。Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ由来のＭｍｃＢＣフマラーゼは、２つのサブユニットを有する別のクラスのフマラーゼである（Ｓｈｉｍｏｙａｍａら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． ２７０巻、２０７〜２１３頁（２００７年））。
フマル酸レダクターゼは、フマレートのスクシネートへの還元を触媒する。Ｅ．ｃｏｌｉのフマル酸レダクターゼは、ｆｒｄＡＢＣＤによってコードされる４つのサブユニットからなり、膜結合型であり、嫌気性条件下で活性である。この反応のための電子供与体は、メナキノンであり、この反応において生成する２つのプロトンは、プロトン勾配に寄与しない（Ｉｖｅｒｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４巻、１９６１〜１９６６頁（１９９９年））。酵母ゲノムは、２つの可溶性フマル酸レダクターゼアイソザイムをコードし、このアイソザイムは、ＦＲＤＳ１（Ｅｎｏｍｏｔｏら、ＤＮＡ Ｒｅｓ．３巻、２６３〜２６７頁（１９９６年））およびＦＲＤＳ２（Ｍｕｒａｔｓｕｂａｋｉら、Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５２巻、１７５〜１８１頁（１９９８年））によってコードされ、それぞれサイトゾルおよびプロミトコンドリアに局在し、グルコースでの嫌気性増殖の間に使用される（Ａｒｉｋａｗａら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ．１６５巻、１１１〜１１６頁（１９９８年））。
スクシネートのスクシニルＣｏＡへのＡＴＰ依存型アシル化は、スクシニルＣｏＡシンテターゼ（ＥＣ６．２．１．５）によって触媒される。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＬＳＣ１およびＬＳＣ２遺伝子の産物ならびにＥ．ｃｏｌｉのｓｕｃＣおよびｓｕｃＤ遺伝子の産物は、天然に、スクシニルＣｏＡシンテターゼ複合体を形成し、これは、１つのＡＴＰの相伴う消費と共に、スクシネートからのスクシニルＣｏＡの形成を触媒し、この反応は、ｉｎ ｖｉｖｏで可逆的である（Ｂｕｃｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４巻、６２４５〜６２５２頁（１９８５年））。これらのタンパク質は、以下に同定される：
アルファ−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＥＣ１．２．７．３）は、２−オキソグルタル酸シンターゼもしくは２−オキソグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＯＦＯＲ）としても公知であり、２当量の還元型フェレドキシンの消費を伴って、ＣＯ２およびスクシニルＣｏＡから、アルファ−ケトグルタレートを形成する。ＯＦＯＲおよびピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＦＯＲ）は、チアミンピロホスフェート、ＣｏＡおよび鉄−硫黄クラスターを補因子として、ならびにフェレドキシン、フラボドキシンおよびＦＡＤを電子伝達体として利用する、２−オキソ酸：フェレドキシン（フラボドキシン）オキシドレダクターゼの多様なファミリーのメンバーである（Ａｄａｍｓら、Ａｒｃｈａｅａ． Ａｄｖ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．４８巻、１０１〜１８０頁（１９９６年））。このクラスの酵素は、可逆的であり、ＲＴＣＡ回路によって炭素を固定する生物体（例えば、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈｉｌｕｓおよびＣｈｌｏｒｏｂｉｕｍ種）におけるカルボキシル化方向において機能する（Ｓｈｉｂａら、１９８５年；Ｅｖａｎｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． ＳｃＩ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ５５巻、９２９３４頁（１９６６年）；Ｂｕｃｈａｎａｎ、１９７１年）。Ｈ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の２サブユニットの酵素（ｔｗｏ−ｓｕｂｕｎｉｔ ｅｎｚｙｍｅ）（ｋｏｒＡＢによってコードされる）は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてクローニングされ、そして発現されている（Ｙｕｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．２８２巻、５８９〜５９４頁（２００１年））。スクシニルＣｏＡについての厳密な基質特異性を有する同じ生物体由来の５サブユニットのＯＦＯＲ（ｆｏｒＤＡＢＧＥによってコードされる）は、近年、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて同定され、そして発現された（Ｙｕｎら、２００２年）。Ｈ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの両ＯＦＯＲ酵素のＣＯ２固定の動態は、特徴付けされている（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ １４巻、７９〜８５頁（２０１０年））。Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ ｔｈｉｏｓｕｌｆａｔｏｐｈｉｌｕｍ由来のＣＯ２固定ＯＦＯＲは、精製され、そして特徴付けされているが、この酵素をコードする遺伝子は、現在までに同定されていない。Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ種における酵素候補は、Ｈ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ遺伝子に対する配列類似性によって推測され得る。例えば、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ ｌｉｍｉｃｏｌａゲノムは、２つの類似のタンパク質をコードする。Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのような酢酸産生性細菌は、２つのＯＦＯＲ酵素をコードすることが予測される。Ｍｏｔｈ＿００３４によってコードされる酵素は、ＣＯ２同化方向で機能することが予測される。この酵素に関連する遺伝子、Ｍｏｔｈ＿００３４は、現在までに実験的に検証されていないが、公知のＯＦＯＲ酵素に対する配列類似性によって推測され得る。
生理学的条件下で脱カルボキシル化方向で機能するＯＦＯＲ酵素はまた、逆反応を触媒する。好熱好酸性古細菌Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ種の株７由来のＯＦＯＲ（ＳＴ２３００によってコードされる）は、広範囲にわたって研究されている（Ｚｈａｎｇら、１９９６年）。プラスミドベースの発現系は、このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて効率的に発現するために開発されており（Ｆｕｋｕｄａら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８巻、５６３９〜５６４６頁（２００１年））、基質特異性に関与する残基は、決定された（ＦｕｋｕｄａおよびＷａｋａｇｉ、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １５９７巻、７４〜８０頁（２００２年））。Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ Ｋ１株（ｓｔｒ．）由来のＡｐｅ１４７２／Ａｐｅ１４７３によってコードされるＯＦＯＲは、近年、Ｅ．ｃｏｌｉ内にクローニングされ、特徴付けされ、そして２−オキソグルタレートおよび広い範囲の２−オキソ酸と反応することが見出された（Ｎｉｓｈｉｚａｗａら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５７９巻、２３１９〜２３２２頁（２００５年））。別の例示的なＯＦＯＲは、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉにおいてｏｏｒＤＡＢＣによってコードされる（Ｈｕｇｈｅｓら、１９９８年）。アルファ−ケトグルタレートに対して特異的な酵素は、Ｔｈａｕｅｒａ ａｒｏｍａｔｉｃａにおいて報告されている（ＤｏｒｎｅｒおよびＢｏｌｌ、Ｊ， Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４巻（１４号）、３９７５〜８３頁（２００２年）。類似の酵素は、配列相同性によって、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍに見出され得る。２サブユニットの酵素はまた、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍにおいても同定されている（Ｅｉｓｅｎら、ＰＮＡＳ ９９巻（１４号）、９５０９〜１４頁（２００２年））。
イソクエン酸デヒドロゲナーゼは、ＮＡＤ（Ｐ）＋の還元とカップリングしたイソシトレートの２−オキソグルタレートへの可逆的脱カルボキシル化を触媒する。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおけるＩＤＨ酵素は、ＩＤＰ１およびｉｃｄによってそれぞれコードされる（ＨａｓｅｌｂｅｃｋおよびＭｃＡｌｉｓｔｅｒ−Ｈｅｎｎ、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２６６巻、２３３９〜２３４５頁（１９９１年）；Ｎｉｍｍｏ， Ｈ．Ｇ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．２３４巻、３１７〜２３３２頁（１９８６年））。還元的ＴＣＡ回路における逆反応である、２−オキソグルタレートのイソシトレートへの還元的カルボキシル化は、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ ｌｉｍｉｃｏｌａ由来のＮＡＤＰＨ依存型ＣＯ２固定ＩＤＨによって有利に働き、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて機能的に発現された（Ｋａｎａｏら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９巻、１９２６〜１９３１頁（２００２年））。９５％配列同一性を有する類似の酵素は、以下に列挙されるいくつかの他の候補に加えて、Ｃ．ｔｅｐｉｄｕｍゲノムに見出される。
Ｈ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓにおいて、２−オキソグルタレートのイソシトレートへの還元的カルボキシル化は、２つの酵素：２−オキソグルタル酸カルボキシラーゼおよびオキサロコハク酸レダクターゼによって触媒される。２−オキソグルタル酸カルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．７）は、アルファ−ケトグルタレートのオキサロスクシネートへのＡＴＰ依存型カルボキシル化を触媒する（ＡｏｓｈｉｍａおよびＩｇａｒａｓｈｉ， Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６２巻、７４８〜７５９頁（２００６年））。この酵素は、２つのサブユニットからなる大型の複合体である。大（Ａ）サブユニットのビオチン化が、酵素機能に必要である（Ａｏｓｈｉｍａら、Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５１巻、７９１〜７９８頁（２００４年））。オキサロコハク酸レダクターゼ（ＥＣ１．１．１．−）は、オキサロスクシネートのＤ−トレオ−イソシトレートへのＮＡＤ依存型転換を触媒する。この酵素は、Ｈ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓにおけるｉｃｄによってコードされるホモダイマーである。この酵素の動態学パラメータは、この酵素が、他の生物体におけるイソクエン酸デヒドロゲナーゼ酵素とは対照的に、ｉｎ ｖｉｖｏで、還元的カルボキシル化方向でのみ作用することを示す（ＡｏｓｈｉｍａおよびＩｇａｒａｓｈｉ， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９０巻、２０５０〜２０５５頁（２００８年））。配列相同性に基づき、遺伝子候補は、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓおよびＴｈｅｒｍｏｃｒｉｎｉｓ ａｌｂｕｓにおいても見出されている。
アコニターゼ（ＥＣ４．２．１．３）は、中間体シス−アコニテートを介したシトレートおよびイソシトレートの可逆的異性体化を触媒する、鉄−硫黄含有タンパク質である。２つのアコニターゼ酵素が、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムのａｃｎＡおよびａｃｎＢによりコードされている。ＡｃｎＢは、主な異化酵素であり、一方、ＡｃｎＡは、より安定的であり、酸化ストレスまたは酸ストレスの条件下で活性であると見られる（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４３巻（Ｐｔ１２）、３７９５〜３８０５頁（１９９７年））。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍにおけるアコニターゼの２つのアイソザイムは、ａｃｎＡおよびａｃｎＢによってコードされる（ＨｏｒｓｗｉｌｌおよびＥｓｃａｌａｎｔｅ−Ｓｅｍｅｒｅｎａ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０巻、４７０３〜４７１３頁（２００１年））。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのアコニターゼ（ＡＣＯ１によってコードされる）は、ミトコンドリア（ここで、それはＴＣＡ回路に関わる）（Ｇａｎｇｌｏｆｆら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．１０巻、３５５１〜３５６１頁（１９９０年））およびサイトゾル（ここで、それはグリオキシレートシャントに関わる）（Ｒｅｇｅｖ−Ｒｕｄｚｋｉら、Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｃｅｌｌ．１６巻、４１６３〜４１７１頁（２００５年））に局在する。
ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＦＯＲ）はピルベートの可逆的酸化を触媒して、アセチルＣｏＡを形成する。Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ由来のＰＦＯＲは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてクローニングされ、発現されて、酸素の存在下で数日間安定的である活性型組換え酵素を生じている（Ｐｉｅｕｌｌｅら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９巻、５６８４〜５６９２頁（１９９７年））。酸素安定性は、ＰＦＯＲにおいて比較的まれであり、Ｄ．ａｆｒｉｃａｎｕｓ酵素のポリペプチド鎖における６０残基の延長によって付与されると考えられる。この酵素の２つのシステイン残基はジスルフィド結合を形成し、このジスルフィド結合が酸素の形態の不活性化に対してこの酵素を保護する（ｐｒｔｏｔｅｃｔ）。このジスルフィド結合および酸素の存在下での安定性は、他のＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ種においても見出されている（Ｖｉｔａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４７巻、９５７〜６４頁（２００８年））。Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのＰＦＯＲもまた、十分に特徴付けされていて（ＭｅｎｏｎおよびＲａｇｓｄａｌｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６巻、８４８４〜８４９４頁（１９９７年））、独立栄養性増殖の間のピルベート合成の方向において高い活性を有することが示された（ＦｕｒｄｕｉおよびＲａｇｓｄａｌｅ、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２７５巻、２８４９４〜２８４９９頁（２０００年））。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉは、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのＰＦＯＲに対して５１％同一であるタンパク質をコードする、特徴付けされていないオープンリーディングフレームｙｄｂＫを有する。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるピルビン酸オキシドレダクターゼ活性についての証拠は、記載されている（Ｂｌａｓｃｈｋｏｗｓｋｉら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２３巻、５６３〜５６９頁（１９８２年））。ＰＦＯＲは、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔａｓ（ＹａｋｕｎｉｎおよびＨａｌｌｅｎｂｅｃｋ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １４０９巻（１９９８年）３９〜４９頁（１９９８年））およびＣｈｏｌｏｂｏｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍ（Ｅｉｓｅｎら、ＰＮＡＳ ９９巻（１４号）、９５０９〜１４頁（２００２年））を含む他の生物体においても記載されている。Ｈ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の５サブユニットのＰＦＯＲ（ｐｏｒＥＤＡＢＧによってコードされている）は、Ｅ．ｃｏｌｉ内にクローニングされ、脱カルボキシル化方向およびＣＯ２同化方向の両方において機能することが示された（Ｉｋｅｄａら、２００６；Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ １４巻、７９〜８５頁（２０１０年））。ホモログもまた、Ｃ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ Ｐ７に存在する。いくつかのさらなるＰＦＯＲ酵素が、以下の総説に記載される（Ｒａｇｓｄａｌｅ， Ｓ．Ｗ．、Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ．１０３巻、２３３３〜２３４６頁（２００３年））。最終的に、フラボドキシンレダクターゼ（例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉまたはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ由来のｆｑｒＢ）（Ｓｔ Ｍａｕｒｉｃｅら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８９巻、４７６４〜４７７３頁（２００７年））またはＲｎｆ型タンパク質（Ｓｅｅｄｏｒｆら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５巻、２１２８〜２１３３頁（２００８年）；およびＨｅｒｒｍａｎｎ、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９０巻、７８４〜７９１頁（２００８年））は、ＰＦＯＲによって生成された還元型フェレドキシンからＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを生成する手段を提供する。これらのタンパク質は、以下に同定される。
ピルベートのアセチルＣｏＡへの転換は、いくつかの他の酵素またはそれらの組合せによって触媒され得る。例えば、ピルビン酸デヒドロゲナーゼは、ＮＡＤの１分子のＮＡＤＨへの同時の還元を伴って、ピルベートをアセチルＣｏＡに変換し得る。これは、ピルベートのアシル化酸化的脱カルボキシル化（ａｃｙｌａｔｉｎｇ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔｉｏｎ）をもたらす一連の部分的反応を触媒する、多酵素複合体である。この酵素は、３つのサブユニット：ピルビン酸デカルボキシラーゼ（Ｅ１）、ジヒドロリポアミドアシルトランスフェラーゼ（Ｅ２）およびジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（Ｅ３）からなる。この酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを含むいくつかの生物体において天然に存在する。Ｅ．ｃｏｌｉ酵素において、Ｅ１構成要素における特定の残基が、基質特異性を担う（Ｂｉｓｓｗａｎｇｅｒ， Ｈ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２５６巻、８１５〜８２頁（１９８１年）；Ｂｒｅｍｅｒ， Ｊ．、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．８巻、５３５〜５４０頁（１９６９年）；Ｇｏｎｇら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２７５巻、１３６４５〜１３６５３頁（２０００年））。酵素工学的操作の試みは、嫌気性条件下でのＥ．ｃｏｌｉのＰＤＨ酵素活性を改善させてきた（Ｋｉｍら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９０巻、３８５１〜３８５８頁（２００８年）；Ｋｉｍら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７３巻、１７６６〜１７７１頁（２００７年）；Ｚｈｏｕら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｌｅｔｔ．３０巻、３３５〜３４２頁（２００８年））。Ｅ．ｃｏｌｉのＰＤＨとは対照的に、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ複合体は、嫌気性条件下で活性であり、増殖のために必要とされる（Ｎａｋａｎｏら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９巻、６７４９〜６７５５頁（１９９７年））。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＰＤＨ（グリセロールでの増殖の過程で特徴付けされる）もまた、嫌気性条件下で活性である（５）。ウシ腎臓由来の酵素複合体の結晶構造（１８）およびＡｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ由来のＥ２触媒ドメインの結晶構造が、利用可能である（４）。この転換を触媒し得るなお別の酵素は、ピルビン酸ギ酸リアーゼである。この酵素は、ピルベートおよびＣｏＡのアセチルＣｏＡおよびホルメートへの転換を触媒する。ピルビン酸ギ酸リアーゼは、嫌気性酸化還元バランスをモジュレートすることを助けるために使用される、原核生物において共通の酵素である。例示的な酵素は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ｐｆｌＢによってコードされる）（ＫｎａｐｐｅおよびＳａｗｅｒｓ、ＦＥＭＳ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．６巻、３８３〜３９８頁（１９９０年））、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ（Ｍｅｌｃｈｉｏｒｓｅｎら、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ５８巻、３３８〜３４４頁（２００２年））、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ−Ａｂｂｅら、Ｏｒａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８巻、２９３〜２９７頁（２００３年））において見出すことができる。Ｅ．ｃｏｌｉは、ｔｄｃＥによってコードされるさらなるピルビン酸ギ酸リアーゼを有し、これは、ピルベートまたは２−オキソブタノエートの、アセチルＣｏＡまたはプロピオニルＣｏＡへの転換をそれぞれ触媒する（Ｈｅｓｓｌｉｎｇｅｒら、Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２７巻、４７７〜４９２頁（１９９８年））。Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｐｆｌＢおよびｔｄｃＥの両方は、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素（ｐｆｌＡによってコードされる）の存在を必要とする。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてｙｆｉＤによってコードされる短タンパク質は、酸素で切断したピルビン酸ギ酸リアーゼに会合し、そしてこれに対する活性を回復し得る（Ｖｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５巻、１６１３７〜１６１４１頁（２００８年））。Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｐｆｌＡおよびｐｆｌＢは、ＷＯ／２００８／０８０１２４］において記載されるように、ブタノール産生のためにサイトゾルのアセチルＣｏＡを増大するための手段として、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて発現されたことに留意されたい。さらなるピルビン酸ギ酸リアーゼおよび活性化酵素候補（それぞれｐｆｌおよびａｃｔによってコードされる）は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍに見出される（Ｗｅｉｄｎｅｒら、 Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８巻、２４４０〜２４４４頁（１９９６年））。
さらに、ピルベートをアセチルＣｏＡへ転換するために、異なる酵素が組み合わされて使用され得る。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは、まず、ピルベートを脱カルボキシル化してアセトアルデヒドを形成し；後者をアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼによってアセテートに酸化し、その後、アセチルＣｏＡシンテターゼによって活性化して、アセチルＣｏＡを形成することにより、サイトゾルにおいてアセチルＣｏＡが得られる。アセチルＣｏＡシンテターゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｋｕｍａｒｉら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７巻、２８７８〜２８８６頁（１９９５年））、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ（Ｓｔａｒａｉら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １５１巻、３７９３〜３８０１頁（２００５年）；Ｓｔａｒａｉら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２８０巻、２６２００〜２６２０５頁（２００５年））およびＭｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ（既に記載される）を含むいくつかの他の生物体において天然の酵素である。あるいは、酢酸キナーゼおよびホスホトランスアセチラーゼによってアセテートが活性化され、アセチルＣｏＡを形成することができる。酢酸キナーゼは、まず、ＡＴＰ分子の使用を伴って、アセテートをアセチルホスフェートに転換する。次いで、アセチルホスフェートおよびＣｏＡは、ホスホトランスアセチラーゼによって１つのホスフェート（ｏｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を放出して、アセチルＣｏＡに転換される。酢酸キナーゼおよびホスホトランスアセチラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓａｃｅｔｌｙａｓｅ）の両方は、いくつかのＣｌｏｓｔｒｉｄｉａおよびＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａにおいて、十分に研究された酵素である。
ピルベートをアセチルＣｏＡに転換するなお別の方法は、ピルビン酸オキシダーゼを介する。ピルビン酸オキシダーゼは、電子受容体としてユビキノンを用いて、ピルベートをアセテートに転換する。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、この活性は、ｐｏｘＢによってコードされる。ＰｏｘＢは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＺｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓのピルビン酸デカルボキシラーゼに対して類似性を有する。この酵素は、チアミンピロホスフェート補因子（ＫｏｌａｎｄおよびＧｅｎｎｉｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１巻、４４３８〜４４４２頁（１９８２年））；Ｏ’Ｂｒｉｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６巻、３１０５〜３１０９頁（１９７７年）；Ｏ’ＢｒｉｅｎおよびＧｅｎｎｉｓ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２５５巻、３３０２〜３３０７頁（１９８０年））ならびにフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）補因子を有する。次いで、アセテートは、上記したように、アセチルＣｏＡシンテターゼまたは酢酸キナーゼおよびホスホトランスアセチラーゼのいずれかによってアセチルＣｏＡへと転換され得る。これらの酵素のいくつかは、アセチルＣｏＡからピルベートへの逆反応もまた触媒し得る。
ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの形態の還元当量を使用する酵素について、これらの還元型伝達体は、還元型フェレドキシンから電子を転移することによって、生成され得る。２つの酵素は、還元型フェレドキシンからＮＡＤ（Ｐ）＋への電子の可逆的転移を触媒する、フェレドキシン：ＮＡＤ＋オキシドレダクターゼ（ＥＣ１．１８．１．３）およびフェレドキシン：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ（ＦＮＲ、ＥＣ１．１８．１．２）である。フェレドキシン：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ（ＦＮＲ、ＥＣ１．１８．１．２）は、ＮＡＤＰＨからフェレドキシンまたはフラボドキシンなどの低電位受容体への電子の可逆的転移を容易にする、非共有結合ＦＡＤ補因子を有する（Ｂｌａｓｃｈｋｏｗｓｋｉら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２３巻、５６３〜５６９頁（１９８２年）；Ｆｕｊｉｉら、１９７７年）。Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ＦＮＲ（ＨＰ１１６４（ｆｑｒＢ）によってコードされる）は、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＦＯＲ）の活性とカップリングされて、ＮＡＤＰＨのピルベート依存型生成をもたらす（Ｓｔら、２００７年）。類似の酵素は、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉに見出される（Ｓｔら、２００７年）。フェレドキシン：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムにおいて、ｆｐｒによってコードされる（Ｂｉａｎｃｈｉら、１９９３年）。フェレドキシン：ＮＡＤ＋オキシドレダクターゼは、ＮＡＤ＋からＮＡＤＨを生成するために、還元型フェレドキシンを利用する。Ｅ．ｃｏｌｉを含むいくつかの生物体において、この酵素は、多機能性ジオキシゲナーゼ酵素複合体の構成要素である。Ｅ．ｃｏｌｉのフェレドキシン：ＮＡＤ＋オキシドレダクターゼ（ｈｃａＤによってコードされる）は、３−フェニルプロピオネート（３−ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐｐｉｏｎａｔｅ）ジオキシゲナーゼ系の構成要素であり、芳香族酸利用に関与する（Ｄｉａｚら、１９９８年）。ＮＡＤＨ：フェレドキシンレダクターゼ活性は、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＴＫ−６の細胞抽出物において検出されたが、この活性を有する遺伝子は、未だ示されていない（Ｙｏｏｎら、２００６年）。最終的に、エネルギー保存膜結合Ｒｎｆ型タンパク質（Ｓｅｅｄｏｒｆら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５巻、２１２８〜２１３３頁（２００８年）；Ｈｅｒｒｍａｎｎら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９０巻、７８４〜７９１頁（２００８年））は、還元型フェレドキシンからＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを生成する手段を提供する。さらなるフェレドキシン：ＮＡＤ（Ｐ）＋オキシドレダクターゼは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ Ｐ７において注解される。
フェレドキシンは、低い還元電位を有する細胞内電子伝達体として機能する１つ以上の鉄−硫黄クラスターを含む小さい酸性タンパク質である。還元型フェレドキシンは、Ｆｅ依存型酵素（例えば、フェレドキシンＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＦＯＲ）および２−オキソグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＯＦＯＲ））に対して電子を供与する。Ｈ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ遺伝子ｆｄｘ１は、ＯＦＯＲおよびＰＦＯＲによる２−オキソグルタレートおよびピルベートの可逆的カルボキシル化にそれぞれ必要である［４Ｆｅ−４Ｓ］型フェレドキシンをコードする（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ １４巻、７９〜８５頁（２０１０年））。Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ ２−オキソ酸：フェレドキシンレダクターゼに関連するフェレドキシンは、モノマージクラスター［３Ｆｅ−４Ｓ］［４Ｆｅ−４Ｓ］型フェレドキシンである（Ｐａｒｋら、２００６年）。このタンパク質に関連する遺伝子は、完全に配列決定されていないが、Ｎ末端ドメインは、Ｓ．ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ由来のｚｆｘフェレドキシンに対し９３％の相同性を有する。Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは、生理的機能が不明である可溶性フェレドキシン、ｆｄｘをコードする。いくつかの証拠は、このタンパク質が、鉄−硫黄クラスター集合において機能し得ることを示す（ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＮａｋａｍｕｒａ、１９９９年）。さらなるフェレドキシンタンパク質は、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙら、２００３年）およびＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ（ｖａｎ Ｖｌｉｅｔら、２００１年）において特徴付けされている。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ由来の２Ｆｅ−２Ｓフェレドキシンは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてクローニングされ、そして発現されている（ＦｕｊｉｎａｇａおよびＭｅｙｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、１９２巻（３号）、（１９９３年））。Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ Ｐ７およびＲｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍなどの酢酸産生性細菌は、以下の列挙されるいくつかのフェレドキシンをコードすることが予測される。
スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼは、スクシニルＣｏＡのスクシネートへの転換を触媒し、その一方で、ＣｏＡ部分をＣｏＡ受容体分子に転移する。多くのトランスフェラーゼは、広い特異性を有し、以下のように多様なＣｏＡ受容体を利用し得る：とりわけ、アセテート、スクシネート、プロピオネート、ブチレート、２−メチルアセトアセテート、３−ケトヘキサノエート、３−ケトペンタノエート、バレレート、クロトネート、３−メルカプトプロピオネート、プロピオネート、ビニルアセテート、およびブチレート。
スクシネートのスクシニルＣｏＡへの転換は、ＡＴＰまたはＧＴＰの直接消費を必要としないトランスフェラーゼによって行われ得る。この型の反応は、多くの生物体に共通である。スクシネートのスクシニルＣｏＡへの転換はまた、スクシニルＣｏＡ：アセチルＣｏＡトランスフェラーゼによっても触媒され得る。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉのｃａｔ１の遺伝子産物は、スクシニルＣｏＡ：アセチルＣｏＡトランスフェラーゼ活性を示すことが示されている（ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７８巻、８７１〜８８０頁（１９９６年））。加えて、この活性は、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ（ｖａｎ Ｇｒｉｎｓｖｅｎら、２００８年）およびＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ（Ｒｉｖｉｅｒｅら、２００４年）に存在する。Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ由来のスクシニルＣｏＡ：酢酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（ａａｒＣによってコードされる）は、バリアントＴＣＡ回路におけるスクシニルＣｏＡシンテターゼを置き換える（Ｍｕｌｌｉｎｓら、２００８年）。類似のスクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ活性はまた、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ（ｖａｎ Ｇｒｉｎｓｖｅｎら、２００８年）、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ（Ｒｉｖｉｅｒｅら、２００４年）およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉ（ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ、１９９６年ｃ）に存在する。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａにおけるｐｃａＩおよびｐｃａＪによってコードされるベータ−ケトアジピン酸：スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼもまた、なお別の候補である（Ｋａｓｃｈａｂｅｋら、２００２年）。上記のタンパク質は、以下に同定される。
スクシネートをスクシニルＣｏＡに転換し、その一方で３−ケトアシルＣｏＡを３−ケト酸に転換するさらなる例示的なトランスフェラーゼは、スクシニルＣｏＡ：３：ケト酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．５）である。例示的なスクシニルＣｏＡ：３：ケト酸ＣｏＡトランスフェラーゼは、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（Ｃｏｒｔｈｅｓｙ−Ｔｈｅｕｌａｚら、１９９７年）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（Ｆｕｋａｏら、２０００年；Ｔａｎａｋａら、２００２年）に存在する。上記のタンパク質は、以下に同定される。
スクシニルＣｏＡ：３：ケト酸ＣｏＡトランスフェラーゼによってスクシネートをスクシニルＣｏＡに転換することは、３−ケトアシルＣｏＡ（アセトアセチルＣｏＡなど）の３−ケト酸（アセトアセテートなど）への同時の転換を必要とする。３−ケト酸の３−ケトアシルＣｏＡへの戻し転換は、アセトアセチルＣｏＡ：酢酸：ＣｏＡトランスフェラーゼによって触媒され得る。アセトアセチルＣｏＡ：酢酸：ＣｏＡトランスフェラーゼは、アセトアセチルＣｏＡおよびアセテートをアセトアセテートおよびアセチルＣｏＡへ転換し、またはその逆の転換を行う。例示的な酵素としては、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のａｔｏＡＤ（Ｈａｎａｉら、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７３巻、７８１４〜７８１８頁（２００７年）、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来のｃｔｆＡＢ（Ｊｏｊｉｍａら、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ７７巻、１２１９〜１２２４頁（２００８年）およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ由来のｃｔｆＡＢ（Ｋｏｓａｋａら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．７１巻、５８〜６８頁（２００７年））の遺伝子産物が挙げられ、以下に示される。
なお別の可能性のあるＣｏＡ受容体は、ベンジルスクシネートである。スクシニルＣｏＡ：（Ｒ）−ベンジルコハク酸ＣｏＡトランスフェラーゼは、Ｔｈａｕｅｒａ ａｒｏｍａｔｉｃａなどの生物におけるトルエンについての嫌気性分解経路の一部分として機能する（Ｌｅｕｔｗｅｉｎおよび Ｈｅｉｄｅｒ、Ｊ． Ｂａｃｔ．１８３巻（１４号）４２８８〜４２９５頁（２００１年））。ホモログは、Ａｚｏａｒｃｕｓ種Ｔ、Ａｒｏｍａｔｏｌｅｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｕｍ ＥｂＮ１、およびＧｅｏｂａｃｔｅｒ ｍｅｔａｌｌｉｒｅｄｕｃｅｎｓ ＧＳ−１５に見出され得る。上記のタンパク質は、以下に同定される。
さらに、ｙｇｆＨは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてプロピオニルＣｏＡ：コハク酸ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする（Ｈａｌｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３９巻（１６号）４６２２〜４６２９頁）。密接なホモログは、例えば、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｙｏｕｎｇａｅ ＡＴＣＣ ２９２２０、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ亜種ａｒｉｚｏｎａｅ ｓｅｒｏｖａｒおよびＹｅｒｓｉｎｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＡＴＣＣ ２９９０９に見出され得る。上記のタンパク質は、以下に同定される。
クエン酸リアーゼ（ＥＣ４．１．３．６）は、シトレートのアセテートおよびオキサロアセテートへの切断をもたらす一連の反応を触媒する。この酵素は、嫌気性条件下で活性であり、３つのサブユニット：アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ、ガンマ）、ＡＣＰトランスフェラーゼ（アルファ）およびアシルリアーゼ（ベータ）からなる。酵素活性化は、稀な補欠分子族２’−（５”−ホスホリボシル）−３−‘−デホスホＣｏＡ（アセチルＣｏＡと構造が類似している）の共有結合およびアセチル化を使用する。アシル化は、ＣｉｔＣ、クエン酸リアーゼシンテターゼによって触媒される。２つのさらなるタンパク質、ＣｉｔＧおよびＣｉｔＸは、アポ酵素を活性型ホロ酵素に転換するために使用される（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９巻、９４３８〜９４５０頁（２０００年））。野生型Ｅ．ｃｏｌｉは、クエン酸リアーゼ活性を有さない；しかし、モリブデン補因子合成を欠損する変異体は、活性型クエン酸リアーゼを有する（Ｃｌａｒｋ， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ．５５巻、２４５〜２４９頁（１９９０年））。Ｅ．ｃｏｌｉの酵素は、ｃｉｔＥＦＤによってコードされ、クエン酸リアーゼシンテターゼは、ｃｉｔＣによってコードされる（ＮｉｌｅｋａｎｉおよびＳｉｖａＲａｍａｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２巻、４６５７〜４６６３頁（１９８３年））。Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓクエン酸リアーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてクローニングされ、特徴付けされ、かつ発現されている（Ｂｅｋａｌら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０巻、６４７〜６５４頁（１９９８年））。クエン酸リアーゼ酵素はまた、シトレートを炭素およびエネルギーの供給源として利用する腸内細菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを含む）において同定されている（Ｂｏｔｔ， Ａｒｃｈ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６７巻、７８〜８８頁（１９９７年）；ＢｏｔｔおよびＤｉｍｒｏｔｈ， Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４巻、３４７〜３５６頁（１９９４年））。上記のタンパク質は、以下に表にまとめられる。
酢酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１）は、アセテートのアセチルホスフェートへの可逆的ＡＴＰ依存型リン酸化を触媒する。例示的な酢酸キナーゼ酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍおよびＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａを含む多くの生物において特徴付けされている（Ｉｎｇｒａｍ−Ｓｍｉｔｈら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８７巻、２３８６〜２３９４頁（２００５年）；ＦｏｘおよびＲｏｓｅｍａｎ、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２６１巻、１３４８７〜１３４９７頁（１９８６年）；Ｗｉｎｚｅｒら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｙ １４３巻（Ｐｔ１０）、３２７９〜３２８６頁（１９９７年））。酢酸キナーゼ活性はまた、Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｕｒＴの遺伝子産物において実証されている（Ｍａｒｏｌｅｗｓｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３巻、２５３１〜２５３７頁（１９９４年）。いくつかの酪酸キナーゼ酵素（ＥＣ２．７．２．７）、例えばＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来のｂｕｋ１およびｂｕｋ２もまた、アセテートを基質として受容する（Ｈａｒｔｍａｎｉｓ， Ｍ．Ｇ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２６２巻、６１７〜６２１頁（１９８７年））。
アセチルホスフェートからのアセチルＣｏＡの形成は、ホスホトランスアセチラーゼ（ＥＣ２．３．１．８）によって触媒される。Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｐｔａ遺伝子は、アセチルＣｏＡをアセチルホスフェートへ可逆的に転換する酵素をコードする（Ｓｕｚｕｋｉ， Ｔ．、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １９１巻、５５９〜５６９頁（９６９））。さらなるアセチルトランスフェラーゼ酵素は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＲａｄｏおよびＨｏｃｈ、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ３２１巻、１１４〜１２５頁（１９７３年））、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉ（Ｓｔａｄｔｍａｎ， Ｅ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １巻、５８９６〜５９９頁（１９５５年））およびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｂｏｃｋら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８１巻、１８６１〜１８６７頁（１９９９年））において特徴付けされている。この反応はまた、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来のｐｔｂ遺伝子産物を含むいくつかのホスホトランスブチリラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｂｕｔｙｒｙｌａｓｅ）酵素（ＥＣ２．３．１．１９）によって触媒される（Ｗｉｅｓｅｎｂｏｒｎら、Ａｐｐ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５５巻、３１７〜３２２頁（１９８９年）；Ｗａｌｔｅｒら、Ｇｅｎｅ １３４巻、１０７〜１１１頁（１９９３年））。さらなるｐｔｂ遺伝子は、ブチレート産生細菌Ｌ２−５０（Ｌｏｕｉｓら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６巻、２０９９〜２１０６頁（２００４年））およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ（Ｖａｚｑｕｅｚら、Ｃｕｒｒ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２巻、３４５〜３４９頁（２００１年））に見出される。
アセテートのアセチルＣｏＡへのアシル化は、アセチルＣｏＡシンテターゼ活性を有する酵素によって触媒される。この反応を触媒する２つの酵素は、ＡＭＰ形成アセチルＣｏＡシンテターゼ（ＥＣ６．２．１．１）およびＡＤＰ形成アセチルＣｏＡシンテターゼ（ＥＣ６．２．１．１３）である。ＡＭＰ形成アセチルＣｏＡシンテターゼ（ＡＣＳ）は、アセテートのアセチルＣｏＡへの活性化のための、主要な酵素である。例示的なＡＣＳ酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｂｒｏｗｎら、Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １０２巻、３２７〜３３６頁（１９７７年））、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ（ＰｒｉｅｆｅｒｔおよびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４巻、６５９０〜６５９９頁（１９９２年））、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ（Ｉｎｇｒａｍ−ＳｍｉｔｈおよびＳｍｉｔｈ、Ａｒｃｈａｅａ ２巻、９５〜１０７頁（２００７年））、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ（Ｇｕｌｉｃｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２巻、２８６６〜２８７３頁（２００３年））およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＪｏｇｌおよびＴｏｎｇ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３巻、１４２５〜１４３１頁（２００４年））に見出される。ＡＤＰ形成アセチルＣｏＡシンテターゼは、一般に広い基質範囲を有する可逆的酵素である（ＭｕｓｆｅｌｄｔおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８４巻、６３６〜６４４頁（２００２年））。ＡＤＰ形成アセチルＣｏＡシンテターゼの２つのアイソザイムは、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓゲノムにおいて、ＡＦ１２１１およびＡＦ１９８３によってコードされる（ＭｕｓｆｅｌｄｔおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ， 前出（２００２年））。Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ由来の酵素（スクシニルＣｏＡシンテターゼとして注解される）もまた、アセテートを基質として受け入れ、この酵素の可逆性は、実証された（ＢｒａｓｅｎおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ、Ａｒｃｈ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １８２巻、２７７〜２８７頁（２００４年））。超好熱性クレン古細菌Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来のＰＡＥ３２５０によってコードされるＡＣＤは、全ての特徴付けされたＡＣＤの最も広い基質範囲を示し、アセテート、イソブチリルＣｏＡ（好ましい基質）およびフェニルアセチルＣｏＡと反応した（ＢｒａｓｅｎおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ、前出（２００４年））。定向進化または工学的操作は、この酵素が宿主生物体の生理学的温度において作用するように、この酵素を改変するために使用され得る。Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉおよびＰ．ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来の酵素は、全て、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてクローニングされ、機能的に発現され、そして特徴付けされている（ＢｒａｓｅｎおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ、前出（２００４年）；ＭｕｓｆｅｌｄｔおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ、前出（２００２年））。さらなる候補としては、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｓｕｃＣＤによってコードされるスクシニルＣｏＡシンテターゼ（Ｂｕｃｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４巻、６２４５〜６２５２頁（１９８５年））およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ由来のアシルＣｏＡリガーゼ（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｖａｌｖｅｒｄｅら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５９巻、１１４９〜１１５４頁（１９９３年））が挙げられる。上記のタンパク質は、以下に表にまとめられる。
還元型発酵産物（例えば、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレート）を合成する微生物細胞の基質のＣ−ｍｏｌ当たりの産物の収率は、炭水化物フィードストックにおける不十分な還元当量によって限定される。還元当量、または電子は、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＣＯＤＨ）およびヒドロゲナーゼ酵素を用いて合成ガス構成要素（ＣＯおよびＨ２など）から、それぞれ抽出され得る。次いで、還元当量は、酸化型フェレドキシン、酸化型キノン、酸化型シトクロム、ＮＡＤ（Ｐ）＋、水または過酸化水素などの受容体に渡され、それぞれ、還元型フェレドキシン、還元型キノン、還元型シトクロム、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、Ｈ２または水を形成する。還元型フェレドキシンおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、種々のＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路および還元的ＴＣＡ回路の酵素のための酸化還元伝達体として寄与し得るので、特に有用である。
ＣＯおよび／またはＨ２由来のさらなる酸化還元の利用可能性により、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートなどの還元産物の収率が改善される。グルコースからメタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートを産生する最大理論収率は、好気性条件下で本明細書中で開示される経路を介して、グルコース１モル当たり１．３３モルのＭＡＡである：
Ｃ６Ｈ１２Ｏ６→１．３３Ｃ４Ｈ６Ｏ２＋０．６７ＣＯ２＋２Ｈ２Ｏ
糖およびシンガスのフィードストックの両方が使用可能である場合、シンガスの構成要素ＣＯおよびＨ２は、ヒドロゲナーゼおよびＣＯデヒドロゲナーゼを使用することによって、還元当量を生成するために使用され得る。シンガス構成要素から生成される還元当量は、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートの産生経路へグルコースを向けるために利用される。理論的には、グルコース中の全ての炭素は、転換され、それにより、本明細書中で記載されたとおりの好気性条件下または嫌気性条件下で、グルコース１モル当たりの２ｍｏｌのメタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートでの、グルコースからメタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートを産生する最大の理論的収率をもたらす。
１Ｃ６Ｈ１２Ｏ６＋２ＣＯ２＋６Ｈ２→２Ｃ４Ｈ６Ｏ２＋６Ｈ２Ｏ
または
１Ｃ６Ｈ１２Ｏ６＋２ＣＯ＋４Ｈ２→２Ｃ４Ｈ６Ｏ２＋４Ｈ２Ｏ。
上の例において示された通り、シンガスが糖ベースのフィードストックまたは他の炭素基質と組み合わせられる組合せフィードストック戦略は、理論的収率を多いに改善し得る。この共栄養補給（ｃｏ−ｆｅｅｄｉｎｇ）アプローチにおいて、シンガスの構成要素であるＨ２およびＣＯは、ヒドロゲナーゼおよびＣＯデヒドロゲナーゼによって利用されて、還元当量を生成することができ、これは、糖または他の炭素基質由来の炭素が最大に保存され、理論的収率が改善される、化学的産生経路に力を与えるために使用され得る。グルコースまたは糖からのメタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートの産生の場合、理論的収率は、グルコース１ｍｏｌ当たり１．３３ｍｏｌのメタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートから、グルコース１ｍｏｌ当たり２ｍｏｌのメタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートにまで改善する。このような改善は、環境的および経済的な利益、ならびに持続可能な化学的産生の大幅な増大をもたらす。
本明細書中で、シンガス（ｓｙｎａｇｓ）構成要素から酸化還元を引き出すことのために使用される酵素および対応する遺伝子が、記載される。ＣＯＤＨは、ＣＯとＣＯ２とを電子の消費または獲得によって相互転換する可逆的酵素である。ＡＣＳ／ＣＯＤＨ複合体におけるＣＯＤＨの天然の生理学的役割は、アセチルＣｏＡシンターゼによるアセチルＣｏＡへの組込みのためにＣＯ２をＣＯへ転換することである。それでも、このようなＣＯＤＨ酵素は、このような酵素の可逆的性質ゆえに、ＣＯから還元当量を引き出すために好適である。ＡＣＳの非存在下でこのようなＣＯＤＨ酵素を発現することは、これらが、その天然の生理学的な役割（すなわち、ＣＯ酸化）と反対の方向に作用することを可能にする。
Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｃ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｃ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ Ｐ７およびいくつかの他の生物体において、さらなるＣＯＤＨコード遺伝子が、ＡＣＳ／ＣＯＤＨオペロンの外に位置する。これらの酵素は、一酸化炭素の二酸化炭素への転換から、電子（または還元当量）を引き出すための手段を提供する。Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＹＰ＿４３０８１３）は、オペロンにおいてそれ自体で発現され、「ピンポン」反応でフェレドキシンなどの外部媒介因子へ、ＣＯから電子を転移すると考えられている。次いで、この還元型媒介因子は、他の還元型ニコチンアミド（ｎｉｃｏｌｉｎａｍｉｄｅ）アデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）伝達体もしくはフェレドキシン依存型細胞性プロセスにカップリングする（Ｒａｇｓｄａｌｅ、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １１２５巻、１２９〜１３６頁（２００８年））。Ｃ． ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ ＣＯＤＨ−ＩＩおよび隣接するタンパク質ＣｏｏＦをコードする遺伝子は、クローニングされ、配列決定された（ＧｏｎｚａｌｅｚおよびＲｏｂｂ、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１９１巻、２４３〜２４７頁（２０００年））。得られた複合体は、膜結合型であったが、ＣＯＤＨ−ＩＩの細胞質画分は、ＮＡＤＰＨの形成を触媒することが示され、これにより同化の役割が示唆された（Ｓｖｅｔｌｉｔｃｈｎｙｉら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３巻、５１３４〜５１４４頁（２００１年））。ＣＯＤＨ−ＩＩの結晶構造もまた、利用可能である（Ｄｏｂｂｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３巻、１２８１〜１２８５頁（２００１年））。類似のＡＣＳ非含有ＣＯＤＨ酵素は、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｍｅｔａｌｌｉｒｅｄｕｃｅｎｓ ＧＳ−１５、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ ｐｈａｅｏｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ＤＳＭ ２６６、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ Ｈ１０、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ亜種ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ株 ＡＴＣＣ ２７７７４、Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒ ｃａｒｂｉｎｏｌｉｃｕｓ ＤＳＭ ２３８０およびＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｕｒｖｕｓ ５２５．９２を含む一群の生物体に見出され得る。
いくつかの場合、ヒドロゲナーゼコード遺伝子は、ＣＯＤＨの隣に位置する。Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍにおいて、コードされたＣＯＤＨ／ヒドロゲナーゼタンパク質は、プロトン勾配の形態のエネルギーがＣＯおよびＨ２ＯからＣＯ２およびＨ２への転換から生成される部位であることが示されている、膜結合型酵素複合体を形成する（Ｆｏｘら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８巻、６２００〜６２０８頁（１９９６年））。Ｃ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓのＣＯＤＨ−Ｉおよびその隣接遺伝子は、Ｒ．ｒｕｂｒｕｍ ＣＯＤＨ／ヒドロゲナーゼ遺伝子クラスターに対するその類似性に基づく類似の機能的役割を触媒すると提唱されている（Ｗｕら、ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．１巻、ｅ６５（２００５年））。Ｃ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ ＣＯＤＨ−Ｉはまた、電極に連結した場合、激しいＣＯ酸化活性およびＣＯ２還元活性を示すことが示された（Ｐａｒｋｉｎら、Ｊ Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． １２９巻、１０３２８〜１０３２９頁（２００７年））。例示的なＣＯＤＨ遺伝子およびヒドロゲナーゼ遺伝子のタンパク質配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋ受託番号によって同定され得る。
４つまでのヒドロゲナーゼをコードする複数の遺伝子が、Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の腸内細菌に本来備わっている（Ｓａｗｅｒｓ， Ｇ．、Ａｎｔｏｎｉｅ Ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ ６６巻、５７〜８８頁（１９９４年）；Ｓａｗｅｒｓら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６４巻、１３２４〜１３３１頁（１９８５年）；ＳａｗｅｒｓおよびＢｏｘｅｒ、Ｅｕｒ．Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５６巻、２６５〜２７５頁（１９８６年）；Ｓａｗｅｒｓら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６８巻、３９８〜４０４頁（１９８６年））。酵素活性の多様性を考慮すると、Ｅ．ｃｏｌｉまたは他の宿主生物体は、入ってくる分子状水素を分け、対応する受容体を還元する十分なヒドロゲナーゼ活性を提供し得る。Ｅ．ｃｏｌｉは、２種の取り込みヒドロゲナーゼであるＨｙｄ−１およびＨｙｄ−２を有し、これらはそれぞれ、ｈｙａＡＢＣＤＥＦおよびｈｙｂＯＡＢＣＤＥＦＧの遺伝子クラスターにコードされる（Ｌｕｋｅｙら、Ｈｏｗ Ｅ． ｃｏｌｉ ｉｓ ｅｑｕｉｐｐｅｄ ｔｏ ｏｘｉｄｉｚｅ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒｅｄｏｘ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２００９年１１月１６日オンライン公開）。Ｈｙｄ−１は、酸素耐性であり、不可逆的であり、そしてｈｙａＣシトクロムを介したキノン還元とカップリングしている。Ｈｙｄ−２は、Ｏ２に感受性であり、可逆的であり、ペリプラズムのフェレドキシンｈｙｂＡに電子を転移し、次に、ｈｙｂＢ内在性膜タンパク質を介してキノンを還元する。還元型キノンは、ＴＣＡ回路の還元分枝においてフマル酸レダクターゼのための電子の供給源として寄与する。還元型フェレドキシンは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼなどの酵素によって使用され、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨを生成し得る。これらは、あるいは、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ＡＫＧフェレドキシンオキシドレダクターゼおよび５，１０−メチレン−Ｈ４葉酸レダクターゼなどの反応のための電子供与体として使用され得る。
Ｅ．ｃｏｌｉの水素−リアーゼ系は、フェレドキシンを受容体として用いる膜結合型酵素複合体であるヒドロゲナーゼ３、ならびにやはりフェレドキシン受容体を用いるヒドロゲナーゼ４を含む。ヒドロゲナーゼ３および４は、それぞれ、ｈｙｃおよびｈｙｆの遺伝子クラスターによってコードされる。ヒドロゲナーゼ３は、可逆的酵素であることが示されている（Ｍａｅｄａら、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ７６巻（５号）、１０３５〜４２頁（２００７年））。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるヒドロゲナーゼ活性はまた、ｈｙｐ遺伝子（その対応するタンパク質がヒドロゲナーゼ複合体の集合に関与する）の発現にも依存する（Ｊａｃｏｂｉら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １５８巻、４４４〜４５１頁（１９９２年）；Ｒａｎｇａｒａｊａｎら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９０巻、１４４７〜１４５８頁（２００８年））。
Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａヒドロゲナーゼは、充分な内因性ヒドロゲナーゼ活性を有さない宿主にとって、好適である。Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａは、排他的炭素供給源としてのＣＯ２によって増殖し得、このことは、還元当量は、Ｈ２から引き出されて、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を介したアセチルＣｏＡ合成を可能にすることを示している（Ｄｒａｋｅ， Ｈ． Ｌ．、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５０巻、７０２〜７０９頁（１９８２年）；ＤｒａｋｅおよびＤａｎｉｅｌ、Ｒｅｓ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５５巻、８６９〜８８３頁（２００４年）；ＫｅｌｌｕｍおよびＤｒａｋｅ、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６０巻、４６６〜４６９頁（１９８４年））（図１２および１３を参照）。Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のいくつかのｈｙｐ遺伝子、ｈｙｃ遺伝子およびｈｙｆ遺伝子に対するホモログを有する。これらの遺伝子によってコードされるタンパク質配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋ受託番号によって同定されている。
遺伝子がＥ．ｃｏｌｉ ｈｙｐ遺伝子に対し相同である、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａにおけるタンパク質は、以下に示される。
Ｅ．ｃｏｌｉヒドロゲナーゼ３および／または４タンパク質に対し相同である、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａにおけるタンパク質が、以下に列挙される。
さらに、ヒドロゲナーゼ機能性をコードするいくつかの遺伝子クラスターが、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａに存在し、その対応するタンパク質配列は、以下に提示される。
Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６は、エネルギー供給源として水素を、末端電子受容体としての酸素と共に使用する。その膜結合型取り込み［ＮｉＦｅ］ヒドロゲナーゼは、「Ｏ２耐性」ヒドロゲナーゼ（Ｃｒａｃｋｎｅｌｌら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ、１０６巻（４９号）２０６８１〜２０６８６頁（２００９年））であり、ペリプラズムの方向に向いており、ｂ型シトクロムを介して呼吸鎖に接続される（ＳｃｈｉｎｋおよびＳｃｈｌｅｇｅｌ、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ、５６７巻、３１５〜３２４頁（１９７９年）；Ｂｅｒｎｈａｒｄら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４８巻、１７９〜１８６頁（１９９７年））。Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａもまた、ＨｏｘオペロンによってコードされるＯ２耐性可溶性ヒドロゲナーゼを含み、これは、細胞質性であり、水素を消費してＮＡＤ＋を直接還元する（ＳｃｈｎｅｉｄｅｒおよびＳｃｈｌｅｇｅｌ、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ４５２巻、６６〜８０頁（１９７６年）；Ｂｕｒｇｄｏｒｆ、Ｊ． Ｂａｃｔ．１８７巻（９号）３１２２〜３１３２頁（２００５年））。可溶性ヒドロゲナーゼ酵素は、さらに、以下を含むいくつかの他の生物体に存在する：Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ（Ｃｏｐｐｉ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １５１巻、１２３９〜１２５４頁（２００５年））、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ株ＰＣＣ６８０３（Ｇｅｒｍｅｒ、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２８４巻（５２号）、３６４６２〜３６４７２頁（２００９年））、およびＴｈｉｏｃａｐｓａ ｒｏｓｅｏｐｅｒｓｉｃｉｎａ（Ｒａｋｈｅｌｙ、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０巻（２号）７２２〜７２８頁（２００４年））。Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ酵素は、水素からＮＡＤＰＨを生成することが可能である。Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ株ＰＣＣ６８０３由来のＨｏｘオペロンおよびＮｏｓｔｏｃ種ＰＣＣ７１２０由来のＨｙｐオペロンによってコードされるアクセサリー遺伝子の両方の過剰発現は、Ｈｏｘ遺伝子単独の発現と比較して、増大したヒドロゲナーゼ活性に導いた（Ｇｅｒｍｅｒ、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８４巻（５２号）、３６４６２〜３６４７２頁（２００９年））。
ピルベートまたはホスホエノールピルベートのいずれかへと二酸化炭素を固定してＴＣＡ回路中間体であるオキサロアセテートまたはマレートを形成するために使用されるいくつかの酵素および対応する遺伝子は、以下に記載される。
ホスホエノールピルベートのオキサロアセテートへのカルボキシル化は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼによって触媒される。例示的なＰＥＰカルボキシラーゼ酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｐｐｃ（Ｋａｉら、Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．４１４巻、１７０〜１７９頁（２００３年）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ ＡＭ１におけるｐｐｃＡ（Ａｒｐｓら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５巻、３７７６〜３７８３頁（１９９３年）、およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるｐｐｃ（Ｅｉｋｍａｎｎｓら、Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．２１８巻、３３０〜３３９頁（１９８９年）によってコードされる。
ホスホエノールピルベートをオキサロアセテートへ転換するための代替の酵素は、ＰＥＰカルボキシキナーゼであり、これは、ＰＥＰのカルボキシキル化と同時に、ＡＴＰを形成する。ほとんどの生物体において、ＰＥＰカルボキシキナーゼは、糖新生機能の役割を担い、そして１つのＡＴＰを消費してオキサロアセテートをＰＥＰに転換する。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、天然のＰＥＰカルボキシキナーゼであるＰＣＫ１が糖新生の役割を果たす生物体の１つである（Ｖａｌｄｅｓ−Ｈｅｖｉａら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２５８巻、３１３〜３１６頁（１９８９年）。Ｅ．ｃｏｌｉは、別のこのような生物体であり、オキサロアセテートの産生におけるＰＥＰカルボキシキナーゼの役割はＰＥＰカルボキシキナーゼのバイカーボネートについてのより高いＫｍゆえに、、ＡＴＰを形成しないＰＥＰカルボキシラーゼと比較した場合に主要ではないと考えられる（Ｋｉｍら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０巻、１２３８〜１２４１頁（２００４年））。それでも、天然のＥ．ｃｏｌｉ ＰＥＰカルボキシキナーゼのＰＥＰからオキサロアセテートへの活性は、近年、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２のｐｐｃ変異体において実証されている（Ｋｗｏｎら、Ｊ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６巻、１４４８〜１４５２頁（２００６年））。これらの株は、増殖欠損がないことを示し、高いＮａＨＣＯ３濃度において増大したスクシネート産生を有した。Ｅ．ｃｏｌｉの変異株は、Ｐｃｋを、適応進化後に、主要なＣＯ２固定酵素として取り入れ得る（Ｚｈａｎｇら、２００９年）。いくつかの生物体（特にルーメン細菌）において、ＰＥＰカルボキシキナーゼは、ＰＥＰからオキサロアセテートを産生すること、およびＡＴＰを生成することにおいて、非常に効率的である。Ｅ．ｃｏｌｉ内にクローニングされているＰＥＰカルボキシキナーゼ遺伝子の例としては、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ（Ｌｅｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇ．７巻、９５〜９９頁（２００２年））、Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ（Ｌａｉｖｅｎｉｅｋｓら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３巻、２２７３〜２２８０頁（１９９７年）、およびＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ（Ｋｉｍら、前出）におけるものが挙げられる。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａによってコードされるＰＥＰカルボキシキナーゼ酵素は、ＰＥＰからのオキサロアセテートの形成において有効である。
ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．１）は、１つのＡＴＰを消費して、ピルベートをオキサロアセテートへ直接転換する。ピルビン酸カルボキシラーゼ酵素は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＰＹＣ１（Ｗａｌｋｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．１７６巻、１２１０〜１２１７頁（１９９１年）およびＰＹＣ２（Ｗａｌｋｅｒら、前出）、ならびにＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓにおけるｐｙｃ（ＭｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙおよびＰｕｒｗａｎｔｉｎｉ、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １４７５巻、１９１〜２０６頁（２０００年））によってコードされる。
リンゴ酸酵素は、１還元当量の消費によりＣＯ２およびピルベートをマレートに転換するために適用され得る。この目的のためのリンゴ酸酵素としては、限定されないが、リンゴ酸酵素（ＮＡＤ依存型）およびリンゴ酸酵素（ＮＡＤＰ依存型）が挙げられる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉリンゴ酸酵素のうちの１つ（Ｔａｋｅｏ、Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６巻、３７９〜３８７頁（１９６９年））またはより高い活性を有する類似の酵素は、ピルベートおよびＣＯ２のマレートへの転換を可能にするために発現され得る。ＰＥＰとは対照的に、炭素をピルベートへ固定することにより、リンゴ酸酵素は、ＰＥＰからの高エネルギーリン酸結合をピルビン酸キナーゼによって保存する（それにより、ピルベートの形成においてＡＴＰが生成する）か、または、グルコース輸送のためのホスホトランスフェラーゼ系によって保存することを可能にする。リンゴ酸酵素は、典型的には、マレートからのピルベートの形成の方向で作用すると考えられるが、ｍａｅＡによってコードされるＮＡＤ依存型酵素の過剰発現は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてスクシネート産生を増大する一方で、炭素固定方向で作用することにより、嫌気性条件下で致死性のΔｐｆｌ−ΔｌｄｈＡ表現型を回復することが実証されている（ＳｔｏｌｓおよびＤｏｎｎｅｌｌｙ、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３巻（７号）２６９５〜２７０１頁（１９９７年））。類似の観察は、Ａｓｃａｒｉｓ ｓｕｕｍ由来のリンゴ酸酵素のＥ．ｃｏｌｉにおける過剰発現によってなされた（Ｓｔｏｌｓら、Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６３〜６５巻（１号）、１５３〜１５８頁（１９９７年））。ｍａｅＢによってコードされる第２のＥ．ｃｏｌｉリンゴ酸酵素は、ＮＡＤＰ依存型であり、オキサロアセテートおよび他のアルファ−ケト酸を脱カルボキシル化する（Ｉｗａｋｕｒａら、Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．８５巻（５号）、１３５５〜６５頁（１９７９年））。
ＴＣＡ回路の還元分枝を介してオキサロアセテート（例えば、ＰＥＰカルボキシラーゼ、ＰＥＰカルボキシキナーゼまたはピルビン酸カルボキシラーゼから形成される）またはマレート（例えば、リンゴ酸酵素またはリンゴ酸デヒドロゲナーゼから形成される）をスクシニルＣｏＡに転換するために使用される酵素は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、フマル酸デヒドラターゼ（フマラーゼ）、フマル酸レダクターゼおよびスクシニルＣｏＡトランスフェラーゼである。この酵素それぞれについての遺伝子は、本明細書中上で記載される。
スクシニルＣｏＡから種々の産物への経路を微生物内で工学的に操作するための酵素、遺伝子および方法は、今や当該分野で公知である。本明細書中で開示されるようにＣＯおよび／またはＨ２から得られるさらなる還元当量は、炭水化物ベースのフィードストックを利用する場合、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートの収率を改善する。例えば、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートは、スクシニルＣｏＡから産生され得る（図を参照）。スクシニルＣｏＡのメタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートへの転換のための例示的な酵素としては、本明細書中に開示される酵素が挙げられる。
解糖中間体から種々の産物への経路を微生物内で工学的に操作するための酵素、遺伝子および方法は、当該分野で公知である。本明細書中で記載されるようにＣＯおよびＨ２から得られるさらなる還元当量は、炭水化物におけるこれらの全ての産物の収率を改善する。例えば、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートは、解糖中間体であるスクシネートから産生され得る。スクシネートのＭＡＡへの転換のための例示的な酵素としては、スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ、スクシニルＣｏＡシンテターゼ、スクシニルＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）、４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ、ホスホトランス−４−ヒドロキシブチリラーゼ、コハク酸レダクターゼ、スクシニルＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡシンテターゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼ、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、メタクリリルＣｏＡシンテターゼ、メタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼおよびメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼが挙げられる。
（実施例ＸＶＩ）
ＣＯおよび嫌気性培養を操作するための方法
この実施例は、ＣＯおよび嫌気性培養の操作に使用される方法を記載する。
Ａ．アッセイおよび少量培養のための少量でのＣＯの操作。ＣＯは、有毒である無臭無色無味のガスである。したがって、ＣＯを利用する培養およびアッセイは、特別な操作を必要とした。小回分培養におけるＣＯ酸化、アセチルＣｏＡ合成、ミオグロビンを用いるＣＯ濃度、およびＣＯ耐性／利用を含むいくつかのアッセイ（少量のＣＯガスを必要とする）を、換気フード内で施行し、操作した。生化学アッセイは、非常に少量（２ｍＬ未満）の生化学アッセイ培地または緩衝液をＣＯで飽和させることを必要とし、その後、アッセイを実施した。ＣＯ操作ステップの全てを、適切な高さに設定されたサッシを有する換気フード内で、ブロワを作動させて行った；ＣＯを、圧縮ガス筒およびシュレンクラインに接続したレギュレーターから分配した。後者は、等濃度のＣＯを、いくつかの予定のキュベットまたはバイアルのそれぞれに分配することを確実にする。シュレンクラインを、酸素スクラバーをインプット側に、油圧解放バブラー（ｏｉｌ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｂｕｂｂｌｅｒ）およびベントを他の側に含むように設定した。アッセイキュベットは、いずれも嫌気性かつＣＯ含有であった。したがって、アッセイキュベットを、ゴム栓によって固く密閉し、試薬を、気密針およびシリンジを用いて添加し、または除去した。次に、少量（約５０ｍＬ）培養物を、固く密閉した血清ボトル内で飽和ＣＯによって増殖させた。生化学アッセイのように、このＣＯ飽和微生物培養物を、シュレンクライン装備を用いて換気フード内で平衡化させた。生化学分析物（ａｓｓａｙｓ）および微生物培養物の両方とも、持ち運び可能な、密閉容器内に存在し、少体積であることは、換気フードの外での安全な操作に寄与した。圧縮ＣＯタンクを、換気フードに隣接させた。
典型的には、シュレンクラインを使用して、ＣＯをキュベットに分配し、それぞれベントした。キュベット上のゴム栓を、１９または２０ゲージの使い捨てシリンジ針で突き通し、同様にベントした。油バブラーをＣＯタンクおよび酸素スクラバーと共に使用した。ガラスまたは水晶の分光光度計キュベットは、頂部に円形の穴を有し、この中に、Ｋｏｎｔｅｓ栓スリーブＳｚ７ ７７４２５０−０００７をはめた。ＣＯ検出ユニットを、換気フードに近接して配置した。
Ｂ．大規模培養物へのより大量の流加（ｆｅｄ）におけるＣＯの操作。発酵培養物に、発酵産生におけるフィードストックとして、ＣＯまたはシンガスを模倣するＣＯとＨ２との混合物のいずれかを供給する。したがって、１リットルから数リットルまでの範囲の細胞の量は、培地中のＣＯの溶存濃度を増大させるためのＣＯガスの添加を含み得る。これらの環境において、非常に大きなかつ継続的に適用される量のＣＯガスを、培養物に添加する。異なる点において、培養物を収穫し、サンプルを取り出す。あるいは、細胞を、発酵槽の一部である組み込まれた連続フロー遠心分離機によって収穫する。
発酵プロセスを、嫌気性条件下で実施する。いくつかの場合、酸素または空気を発酵槽に送り込んで、適切な酸素飽和を確実にし、呼吸環境を提供することは、非経済的である。加えて、嫌気性発酵の間に生み出される還元力は、呼吸よりもむしろ産物形成に必要とされ得る。さらに、種々の経路についての多くの酵素が、種々の程度で酸素感受性である。古典的アセトゲン、例えばＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａは、偏性嫌気性菌であり、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路における酵素は、分子状酸素による不可逆的不活性化に対し非常に感受性である。酸素耐性アセトゲンが存在する一方で、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路における酵素のレパートリーは、ほとんどが金属酵素であり、不可欠の構成要素がフェレドキシンであるため、酸素の存在と不適合であり得、調節は、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路からエネルギー獲得の最大化へと代謝を転じ得る。同時に、培養中の細胞は、大量細胞増殖の存在下で、過度の手段（ｅｘｔｒｅｍｅ ｍｅａｓｕｒｅ）の必要性を加減する、酸素スカベンジャーとして作用する。
Ｃ．嫌気性チャンバーおよび条件。例示的な嫌気性チャンバーは、市販されている（例えば、Ｖａｃｕｕｍ Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｅｓ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ ＣＡ；ＭＢｒａｕｎ、Ｎｅｗｂｕｒｙｐｏｒｔ ＭＡを参照）。条件は、１ｐｐｍ以下のＯ２濃度、１ａｔｍの純粋Ｎ２を含んだ。１つの例において、３酸素スクラバー／触媒リジェネレーターを使用し、チャンバーは、Ｏ２電極（例えば、Ｔｅｌｅｄｙｎｅ；Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ ＣＡ）を備えた。ほぼ全ての項目（ｉｔｅｍ）および試薬を、内部チャンバー扉を開ける前に、チャンバーのエアロック内で、４回反復した。５ｍＬを超える試薬に、チャンバーへの導入前に、純粋Ｎ２をスパージした。グローブを年２回交換し、酸素レベルの変化に対しチャンバーが鈍い応答を示すことが多くなると、触媒コンテナを定期的に再生した。チャンバーの圧力を、ソレノイドによって活性化した１方向バルブを通して制御した。この特徴により、チャンバー圧を周囲よりも高く設定することが可能になり、パージバルブを通って非常に小さな管の移動が可能になる。
嫌気性チャンバーは、継続的に非常に低く、高度に酸素感受性な嫌気性条件が必要とされるＯ２レベルを達成した。しかし、細胞の増殖および操作は、通常、このような用心を必要としない。代替の嫌気性チャンバー構成において、白金またはパラジウムが、混合物中にいくらかの水素ガスを必要とする触媒として使用され得る。電磁弁を使用する代わりに、圧力放出を、バブラーによって制御し得る。装置ベースのＯ２モニタリングを用いる代わりに、試験片を使用し得る。
Ｄ．嫌気性微生物学。少量培養物を、ＣＯ操作について上記したように操作した。詳細には、血清ボトルまたは培地ボトルに、厚いゴム栓をはめ、ボトルを密閉するために、アルミニウムクリンプを使用する。培地（例えばＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ）を、従来様式で作り、適切な大きさの血清ボトルに分配する。ボトルは、約３０分間にわたって、適度にバブリングしながら、窒素をスパージする。これにより、酸素のほとんどを培地から除去し、このステップの後に、各ボトルに、ゴム栓で蓋をし（例えば、Ｂｅｌｌｃｏ ２０ｍｍセプタム栓；Ｂｅｌｌｃｏ、Ｖｉｎｅｌａｎｄ、ＮＪ）、およびクリンプ密閉する（Ｂｅｌｌｃｏ ２０ｍｍ）。次いで、培地のボトルを、低速（液体）排出サイクルを用いてオートクレーブした。少なくとも時折、オートクレーブの間、針は、栓を貫いて排出をもたらす；針は、オートクレーブから取り出す際に直ちに取り除かれる必要がある。滅菌培地は、シリンジおよび針によって添加された残りの培地構成要素（例えば、緩衝液または抗生物質）を有する。還元剤を添加する前に、ボトルを、３０〜６０分間にわたって、窒素（または使用に依存してＣＯ）で平衡化する。還元剤（例えば、１００×１５０ｍＭの硫化ナトリウム、２００ｍＭのシステイン−ＨＣｌ）を添加する。これは、乾燥したビーカー内の硫化ナトリウムおよび血清ボトル内のシステインを秤量し、両方を嫌気性チャンバーに入れ、硫化ナトリウムを嫌気性水中に溶解し、次いで、これを血清ボトル中のシステインに添加することによって行われる。硫化ナトリウム溶液はシステインとの接触の際に硫化水素を生成するので、このボトルに、直ちに栓をする。培養物に注入する際、溶液を滅菌するために、シリンジフィルターを使用する。他の構成要素、例えば、Ｂ１２（１０μＭシアノコバラミン）、塩化ニッケル（ＮｉＣｌ２、４０ｍＭストックからの終濃度２０μＭ、嫌気性水においてチャンバー内にて作製し、オートクレーブによってまたは培養物への注入の際にシリンジフィルターを使用することによって滅菌する）および硫酸鉄（ＩＩ）アンモニウム（必要とされる終濃度は１００μＭであり、１００〜１０００×のストック溶液によって嫌気性水においてチャンバー内で作製し、オートクレーブによってまたは培養物への注入の際にシリンジフィルターを使用することによって滅菌する）を、シリンジ針を通して添加する。嫌気性条件下でのより早い増殖を容易にするために、１リットルのボトルに、５０ｍＬの嫌気性増殖させた事前培養物を接種した。ベクターへのｐＡ１−ｌａｃＯ１プロモーターの導入を、終濃度０．２ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によって実施し、約３時間にわたって行った。
大量培養物を、連続的なガス添加をバブリングしながら用いて、より大きなボトル内で増殖させ得る。培地添加および３０分間以上の窒素スパージの後に、金属バブラーを備えたゴム栓をボトルに配置し、その後に残りのボトルで始める。滅菌フィルターがバブリングするガスを滅菌し、ボトル上のホースが小Ｃクランプによって圧縮可能なように、各ボトルをまとめる。培地および細胞を、磁気撹拌棒によって撹拌する。一旦全ての培地構成要素および細胞が添加されたら、ボトルを、室内空気中のインキュベーター内であるが、ボトル内に連続的に窒素をスパージしながら、インキュベートする。
（実施例ＸＶＩＩＩ）
ＣＯ酸化（ＣＯＤＨ）アッセイ
この実施例は、ＣＯ酸化（ＣＯデヒドロゲナーゼ；ＣＯＤＨ）を測定するためのアッセイ方法を記載する。
Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａの７遺伝子ＣＯＤＨ／ＡＣＳオペロンを、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクター内にクローニングした。完全な約１０ｋｂｐのＤＮＡ断片をクローニングしたが、この領域における遺伝子のいくつかは、それ自身の内因性プロモーターから発現され、かつ全ては、内因性リボソーム結合部位を含むという可能性がある。これらのクローンを、ＣＯＤＨ活性を定量的に測定するアッセイを用いて、ＣＯ酸化についてアッセイした。Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ遺伝子産物に対する抗血清を、比活性を推定するためのウエスタンブロットのために使用した。Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａは、グラム陽性であり、リボソーム結合部位エレメントは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて十分に働くことが予測される。以下でより詳細に記載されるこの活性を、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａの比活性の約１／５０であると推定した。組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞のＣＯＤＨ活性は、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ酵素が、約５５℃の最適温度を有するという事実によって制限される可能性がある。したがって、中温性のＣＯＤＨ／ＡＣＳ経路は、中温性であり、明らかに完全なＣＯＤＨ／ＡＣＳオペロンおよびＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を有する、Ｍｏｏｒｅｌｌａの近縁であるＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｆｎｉｅｎｓｅのように、有利であり得る。潜在的な宿主生物体であるアセトゲンとしては、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａおよびＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｆｎｉｅｎｓｅが挙げられるが、これらに限定されない。
ＣＯ酸化は、ＣＯＤＨ／ＡＣＳアッセイで最も感度が高く、そして最も堅固である。Ｅ．ｃｏｌｉベースのシンガスを使用する系は最終的にクロストリジウムの（すなわち、Ｍｏｏｒｅｌｌａの）系と、特に最大活性についてほぼ同程度に嫌気性である必要があるという可能性がある。ＣＯＤＨにおける改善は、可能であるはずであるが、最終的には、水中でのＣＯガスの溶解度によって制限される。
最初に、遺伝子のそれぞれを、発現ベクター内に個々にクローニングした。複数のサブユニット／１複合体についての組合せ発現ユニットを、生成した。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるタンパク質レベルでの発現を、決定した。組合せＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ ＣＯＤＨ／ＡＣＳオペロンと、個々の発現クローンとの両方を、作製した。
ＣＯ酸化アッセイ。このアッセイは、より単純で、信頼性があり、より多目的な、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路内の酵素活性のアッセイであり、ＣＯＤＨを試験する（Ｓｅｒａｖａｌｌｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３巻、３９４４〜３９５５頁（２００４年））。Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ ＣＯＤＨ比活性の典型的な活性は、５５℃で５００Ｕ、または２５℃で約６０Ｕである。このアッセイは、ＣＯの存在下で、メチルビオロゲンの還元を使用する。これは、５７８ｎｍにおいて、密閉された、嫌気性のガラスキュベットにおいて測定される。
より詳細には、ゴム栓されたガラスキュベットを、まずキュベットを４回脱イオン水で、１回アセトンで洗浄した後に調製した。少量の真空グリースをゴムガスケットの頂部に塗った。２２Ｇａ．の針および排気針によってキュベットにＣＯを通気し、１０分間乾燥させた。０．９８ ｍｌＬの反応緩衝液（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ８．５、２ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）を、２２Ｇａ．針および排気針、ならびに１００％ＣＯを用いて添加した。メチルビオロゲン（ＣＨ３ビオロゲン）ストックは、水中１Ｍであった。各アッセイは、２０マイクロリットルを、２０ｍＭの最終濃度で使用した。メチルビオロゲンが添加された際、１８Ｇａ針（部分的）を、ＣＨ３ビオロゲンを回収するためのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジの使用を容易にするためのジャケットとして、使用した。４〜５のアリコートを、引き出し、廃棄して、洗浄し、シリンジをガス平衡化した。少量の亜ジチオン酸ナトリウム（０．１Ｍストック）を、ＣＨ３ビオロゲンストックを作製する際に、ＣＨ３ビオロゲンを僅かに還元させるために、加えた。温度を、加熱したＯｌｉｓ分光光度計（Ｂｏｇａｒｔ ＧＡ）において、５５℃で平衡化した。まず、ブランク反応（ＣＨ３ビオロゲン＋緩衝液）を行って、ＣＨ３ビオロゲン還元の基本速度を測定した。ＡＣＳ９０およびＡＣＳ９１（それぞれ、第１のｃｏｏＣを有するか有さない、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのＣＯＤＨ−ＡＣＳオペロン）の粗Ｅ．ｃｏｌｉ細胞抽出物。１０マイクロリットルの抽出物を、一度に加え、混合し、アッセイした。還元されたＣＨ３ビオロゲンは、紫色になる。アッセイの結果を、表２に示す。
Ｍｔａ９８／Ｍｔａ９９は、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉａ由来のメタノールメチルトランスフェラーゼ遺伝子を発現する Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５株であり、したがって、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ ＣＯＤＨオペロンを含むＡＣＳ９０ ＡＣＳ９１ Ｅ．ｃｏｌｉ株についての陰性対照である。
約１％の細胞タンパク質がＣＯＤＨである場合、これらの図は、純粋なＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ ＣＯＤＨの５００Ｕ／ｍｇ活性より約１００倍少ない。ウエスタンブロットに基づく実際の推定は、細胞タンパク質の０．５％であり、したがって、活性は、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ ＣＯＤＨに対して約５０倍少ない。それでも、この実験は、陰性対照におけるよりもずっと少量で組換えＥ．ｃｏｌｉにおけるＣＯ酸化活性を実証する。陰性対象において認められる少量のＣＯ酸化（ＣＨ３ビオロゲン還元）は、Ｅ．ｃｏｌｉがＣＨ３ビオロゲンを還元する限定的な能力を有し得ることを示す。
ＣＯＤＨおよびＭｔｒタンパク質の終濃度を推定するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびその後のウエスタンブロット分析を、ＣＯ酸化アッセイ、ＡＣＳアッセイ、メチルトランスフェラーゼアッセイおよびコリノイドＦｅ−Ｓアッセイにおいて使用された物と同じ細胞抽出物において行った。使用した抗血清は、精製Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ ＣＯＤＨ−ＡＣＳおよびＭｔｒタンパク質に対するポリクローナルであり、アルカリホスファターゼ結合したヤギ抗ウサギ二次抗体を用いて可視化した。ウエスタンを実施した、そして結果を図１４に示す。ＡＣＳ９０およびＡＣＳ９１におけるＣＯＤＨの量を対照レーンと比較して、５０ｎｇと推定した。２ＣＯＤＨサブユニットおよびメチルトランスフェラーゼを含むＣＯＤＨ−ＡＣＳオペロン遺伝子の発現を、ウエスタンブロット分析を介して確認した。したがって、組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞は、７遺伝子オペロンの複数の構成要素を発現する。加えて、メチルトランスフェラーゼとコリノイド鉄硫黄タンパク質との両方は、同じ組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞において活性であった。これらのタンパク質は、同じ細胞内にクローニングされた同じオペロンの部分である。
Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ細胞の抽出物を陽性対照として用いて、ＣＯ酸化アッセイを繰り返した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＣＳ９０およびＡＣＳ９１におけるＣＯＤＨ活性は測定可能であったが、これは、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ対照より約１３０〜１５０倍の低さであった。アッセイの結果を、図１５に示す。簡潔には、細胞（ＣＯＤＨ／ＡＣＳオペロン；ＡＣＳ９０もしくはＡＣＳ９１または空のベクター：ｐＺＡ３３Ｓを有するＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａまたはＥ．ｃｏｌｉ）を増殖させ、そして上記のように抽出物を調製した。上記のように、アッセイを、抽出物を調製した日の種々の時点で、５５℃で実施した。メチルビオロゲンの還元を、５７８ｎｍにて、１２０秒間の時間経過にわたって追跡した。
これらの結果は、ＣＯ酸化（ＣＯＤＨ）アッセイおよび結果を記載する。組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞は、メチルビオロゲン還元アッセイによって測定されたように、ＣＯ酸化活性を発現した。
（実施例ＸＶＩＩＩ）
Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＯ耐性実験およびＣＯ濃度アッセイ（ミオグロビンアッセイ）
この実施例は、高濃度のＣＯに対するＥ．ｃｏｌｉの耐性を記載する。
飽和量のＣＯの存在下でＥ．ｃｏｌｉが嫌気的に増殖し得るか否かを試験するために、培養物を、小容量での嫌気的微生物学において上記したように、５０ｍｌのＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地（還元溶液、ＮｉＣｌ２、Ｆｅ（ＩＩ）ＮＨ４ＳＯ４、シアノコバラミン、ＩＰＴＧおよびクロラムフェニコールを加えた）を含む１２０ｍｌの血清ボトル中に提供した。これらのボトルのうちの半分を、窒素ガスによって３０分間平衡化させ、もう半分を、ＣＯガスによって３０分間平衡化させた。空のベクター（ｐＺＡ３３）を、対照として使用し、ｐＺＡ３３空ベクターおよびＡＣＳ９０とＡＣＳ９１との両方を含む培養物を、Ｎ２およびＣＯの両方で試験した。全てに接種し、振とうしながら（２５０ｒｐｍ）３７℃にて、３６時間にわたって増殖させた。３６時間の期間の最後における、フラスコの試験は、全てにおいて、多量の増殖を示した。観察した増殖の大部分（ｂｕｌｋ）は、長いラグ（ｌａｇ）をもって一晩で起こった。
全ての培養物はＣＯの存在下で十分に増殖したようであることを考慮して、ＣＯ終濃度を確認した。これは、ＣＯへの曝露の際のミオグロビンのスペクトルシフトのアッセイを用いて行った。亜ジチオン酸ナトリウムによって還元されたミオグロビンは、４３５ｎｍにおいて吸光度のピークを有する；このピークは、ＣＯによって４２３ｎｍにシフトする。低波長および３００ｎｍより上の全スペクトルを記録する必要性ゆえに、水晶のキュベットが使用されなければならない。ＣＯ濃度は、標準曲線に対して測定され、２０℃および１気圧において、ＣＯの最大水溶性についてのヘンリーの法則の定数＝９７０マイクロモル濃度に依存する。
ＣＯ濃度についてのミオグロビン試験のために、キュベットを、水で１０回、アセトンで１回洗浄し、次いでＣＯＤＨアッセイにおけるように栓をした。Ｎ２を、キュベット内に約１０分間にわたって吹き込んだ。１ｍｌの容量の嫌気性緩衝液（ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、２ｍＭ ＤＴＴ）を、Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジによってブランクに添加した（ＣＯによって平衡化しない）。１０マイクロリットルの容量のミオグロビン（約１ｍＭ、変動し得るが、非常に大量に必要）および１マイクロリットルのジチオナイト（２０ｍＭストック）を、添加した。ＣＯ標準曲線を、１マイクロリットルの増加量で加えたＣＯ飽和緩衝液を用いて作製した。ピークの高さおよびシフトを、各増加量について記録した。試験した培養物は、ｐＺＡ３３／ＣＯ、ＡＣＳ９０／ＣＯおよびＡＣＳ９１／ＣＯであった。これらのそれぞれに、同じキュベットに対し、１マイクロリットルの増加量を加えた。実験の半ばで、第２のキュベットを用意し、使用した。結果を、表３に示す。
表３に示される結果は、株がＣＯの存在下または非存在下で培養されたか否かに関わらず、培養物が増殖したことを示す。これらの結果は、Ｅ．ｃｏｌｉが、嫌気性条件下でのＣＯに対する曝露に耐性であり、ＣＯＤＨ−ＡＣＳオペロンを発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞は、ＣＯのいくらかを代謝し得ることを示す。
これらの結果は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞が、ＣＯＤＨ／ＡＣＳを発現していようといまいと、飽和量のＣＯの存在下で増殖可能であったことを実証する。さらに、これらは、ＣＯの代わりの窒素中での対照と等しく良好に増殖した。この実験は、Ｅ．ｃｏｌｉの研究室株が、通常の大気圧において実施されるシンガスプロジェクトにおいて達成可能なレベルでＣＯに対して非感受性であることを実証した。加えて、予備的実験は、ＣＯＤＨ／ＡＣＳを発現する組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞が、実際にいくらかＣＯを消費した（おそらくは酸化によって二酸化炭素になった）ことを示した。
（実施例ＸＶＩＸ）
メチルマロニルＣｏＡを介したスクシネートからのＭＡＡおよび３−ヒドロキシイソ酪酸の産生のための経路
還元的ＴＣＡ回路は、炭水化物ベースのフィードストックを用いた場合、メタクリル酸（ＭＡＡ）の収率を改善する。ＭＡＡ産生は、図１６Ａに示される経路によって、組換え生物体によって達成され得る。
例えば、ＭＡＡおよび／または３−ヒドロキシイソ酪酸は、図１６Ａにおいて示されるように、スクシネートからメチルマロニルＣｏＡ中間体を介して産生され得る。この経路によるスクシネートのＭＡＡまたは３−ヒドロキシイソ酪酸への転換のための例示的な酵素としては、スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ、スクシニルＣｏＡシンテターゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、メチルマロン酸セミアルデヒドレダクターゼおよび３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼが挙げられる。
この経路において、主な代謝中間体は、まず、スクシネートに向けられる。スクシネートの形成のために、ホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）は、ＰＥＰカルボキシキナーゼまたはＰＥＰカルボキシラーゼのいずれかを介してオキサロアセテートに転換される。あるいは、ＰＥＰは、まずピルビン酸キナーゼによってピルベートに転換され、次いで、メチルマロニルＣｏＡカルボキシトランスフェラーゼまたはピルビン酸カルボキシラーゼによってオキサロアセテートに転換される。次いで、オキサロアセテートは、還元的ＴＣＡ回路によってスクシネートに転換される。
次いで、スクシネートは、スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼまたはシンテターゼによってスクシニルＣｏＡに活性化される。次いで、メチルマロニルＣｏＡムターゼは、スクシニルＣｏＡからメチルマロニルＣｏＡを形成する。次いで、メチルマロニルＣｏＡは、メチルマロン酸セミアルデヒドに還元される。メチルマロン酸セミアルデヒドのさらなる還元は、３−ヒドロキシイソ酪酸を生じ、これは、産物として分泌されるか、または脱水を介してＭＡＡにさらに変換され得る。
図１６Ａに示される変換のための例示的な酵素候補は、以下に記載される。スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼおよびシンテターゼ酵素は、先に実施例ＸＶ（ＲＴＣＡ回路）において記載された。
メチルマロニルＣｏＡムターゼ。メチルマロニルＣｏＡムターゼは、スクシニルＣｏＡをメチルマロニルＣｏＡへ転換するコバラミン依存型酵素である。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、可逆的アデノシルコバラミン依存型ムターゼは、スクシネートのプロピオネートへの転換に導く３ステップ経路に関わる。例示的なＭＣＭ酵素は、実施例Ｖにおいて記載される。
あるいは、イソブチリルＣｏＡムターゼ（ＩＣＭ）は、提案される変換を触媒し得る。ＩＣＭは、ブチリルＣｏＡの炭素骨格をイソブチリルＣｏＡへ可逆的に転位するＭＣＭファミリーにおける、コバラミン依存型メチルムターゼである（Ｒａｔｎａｔｉｌｌｅｋｅ、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７４巻、３１６７９〜３１６８５頁（１９９９年））。例示的なＩＣＭ酵素は、実施例ＶＩＩにおいて記載される。
メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ。メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ（ＭＭＣＥ）は、（Ｒ）−メチルマロニルＣｏＡと（Ｓ）−メチルマロニルＣｏＡとを相互転換する酵素である。ＭＭＣＥは、奇数鎖脂肪酸およびバリン、イソロイシンおよびメチオニンのアミノ酸の分解において必須の酵素である。例示的なＭＭＣＥ酵素は、実施例Ｖにおいて記載される。
メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ。メチルマロニルＣｏＡの対応するアルデヒドであるメチルマロン酸セミアルデヒドへの還元は、ＣｏＡ依存型アルデヒドデヒドロゲナーゼによって触媒される。例示的な酵素は、実施例Ｖにおいて記載される。
メチルマロン酸セミアルデヒドレダクターゼ。メチルマロン酸セミアルデヒドの３−ヒドロキシイソブチレートへの還元は、メチルマロン酸セミアルデヒドレダクターゼまたは３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼによって触媒される。この酵素は、バリン、ロイシンおよびイソロイシンの分解に関わり、細菌、真核生物および哺乳動物において同定されている。例示的なメチルマロン酸セミアルデヒドレダクターゼ酵素は、実施例Ｖにおいて記載される。
３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ。３−ヒドロキシイソブチレートのメチルアクリル酸への脱水は、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ活性を有する酵素によって触媒される。例示的な３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ酵素は、実施例Ｖにおいて記載される。
活性な還元的ＴＣＡ回路は、図１７の例示的な経路において示されるように、アセチルＣｏＡ誘導産物であるメタクリル酸（ＭＡＡ）の収率を改善する。還元的ＴＣＡ回路の経路およびスクシニルＣｏＡのメタクリル酸への転換は、本明細書中で記載されている（また、図３および１６Ａならびに実施例Ｖを参照）。図１７Ａおよび１７Ｂは、例示的な経路を示す。酵素的変換は、示される酵素によって実施される。図１７Ａは、還元的ＴＣＡ回路を用いたＣＯ２のスクシニルＣｏＡへの固定のための経路を示す。図１７Ｂは、スクシニルＣｏＡからの３−ヒドロキシイソ酪酸およびメタクリル酸の生合成のための例示的な経路を示す；示される酵素的変換は、以下の酵素によって実施される：Ａ．メチルマロニルＣｏＡムターゼ、Ｂ．メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、Ｃ．メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、Ｄ．メチルマロン酸セミアルデヒドレダクターゼ、Ｅ．３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ。
（実施例ＸＸ）
スクシネートからの４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを介したＭＡＡおよび３−ヒドロキシイソ酪酸の産生のための経路
還元的ＴＣＡ回路は、炭水化物ベースのフィードストックを用いる場合、メタクリル酸（ＭＡＡ）の収率を改善する。ＭＡＡ産生は、図１６Ｂにおいて示される組換え生物体において達成され得る。
例えば、ＭＡＡおよび／または３−ヒドロキシイソ酪酸は、図１６Ｂに図示される多くの代替の経路によって、スクシネートから、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡ中間体を介して産生され得る。これらの経路のための例示的な酵素としては、以下が挙げられる：スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ、スクシニルＣｏＡシンテターゼ、スクシニルＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）、４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ、ホスホトランス−４−ヒドロキシブチリラーゼ、コハク酸レダクターゼ、スクシニルＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡシンテターゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼ、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、メタクリリルＣｏＡシンテターゼ、メタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼおよびメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼ。
スクシネートからの４−ヒドロキシブチリルＣｏＡ中間体の形成は、図１６Ｂに図示されるいくつかの経路を介して進行する。スクシネートは、まずＣｏＡトランスフェラーゼまたはシンテターゼによって、スクシニルＣｏＡに転換される。次いで、スクシニルＣｏＡは、ＣｏＡ依存型アルデヒドデヒドロゲナーゼによってコハク酸セミアルデヒドに転換される。あるいは、スクシネートは、酸レダクターゼによってコハク酸セミアルデヒドに直接転換される。コハク酸セミアルデヒド中間体は、４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼによって、４−ヒドロキシブチレート（４−ＨＢ）に還元される。二機能性アルデヒドデヒドロゲナーゼ／アルコールデヒドロゲナーゼは、スクシニルＣｏＡを４−ＨＢに直接転換する。４−ＨＢのそのアシルＣｏＡへの活性化は、ＣｏＡトランスフェラーゼまたはシンテターゼによって触媒される。あるいは、４−ＨＢは、４−ヒドロキシブチリル−ホスフェート中間体に転換され得、その後、ホスホトランス−４−ヒドロキシブチリラーゼによって４−ＨＢＣｏＡに変換され得る。
４−ヒドロキシブチリルＣｏＡの３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡへの異性体化は、４−ＨＢＣｏＡメチルムターゼによって触媒される。３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡのＣｏＡ部分の除去は、３−ヒドロキシイソブチレートを生じ、これは、産物として分泌されるか、または脱水によりＭＡＡへさらに変換され得る。３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡのメタクリリルＣｏＡへの脱水、その後のＣｏＡヒドロラーゼ、トランスフェラーゼまたはシンテターゼによるＣｏＡ部分の除去は、ＭＡＡ形成のための別の経路である。
図１６Ａおよび１６Ｂにおいて示される変換のための例示的な酵素候補は、下に記載される。スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼおよびシンテターゼ酵素は、実施例Ｉ（ＲＴＣＡ回路）において先に記載された。メチルマロニルＣｏＡムターゼおよびメチルマロニルＣｏＡエピメラーゼは、実施例ＩＩＩにおいて記載された。３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ酵素候補は、実施例ＩＩＩに記載された。
表４は、図１６Ｂにおいて図示されるステップを実施し得る酵素クラスを示す。例示的な酵素は、以下にさらに詳細に記載される。
１．１．１．ａ． ４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性を示す酵素（ＥＣ１．１．１．６１）は、コハク酸セミアルデヒドを４−ヒドロキシブチレートに還元する（図１６Ｂのステップ５）。このような酵素は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ（Ｂｒａｖｏら、Ｊ Ｆｏｒｅｎｓ Ｓｃｉ、４９巻、３７９〜３８７頁（２００４年））、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉ（Ｗｏｌｆｆら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６巻、２０６〜２１２頁（１９９５年））およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（Ｂｒｅｉｔｋｒｅｕｚら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７８巻、４１５５２〜４１５５６頁（２００３年））において特徴付けされている。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ 酵素は、酵母においてクローニングし、そして特徴付けされた（Ｂｒｅｉｔｋｒｅｕｚら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７８巻、４１５５２〜４１５５６頁（２００３年））。なお別の遺伝子は、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ由来のアルコールデヒドロゲナーゼａｄｈＩである（Ｊｅｏｎら、Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １３５巻、１２７〜１３３頁（２００８年））。
１．１．１．ｃ． アシルＣｏＡレダクターゼ活性とアルコールデヒドロゲナーゼ活性とを有する二機能性酵素は、スクシニルＣｏＡを４−ヒドロキシブチレートに直接転換することができる。アシルＣｏＡをアルコールに転換する例示的な二機能性オキシドレダクターゼとしては、基質、例えば、アセチルＣｏＡをエタノールに変換する酵素（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のａｄｈＥ（Ｋｅｓｓｌｅｒら、ＦＥＢＳ．Ｌｅｔｔ．２８１巻、５９〜６３頁（１９９１年）））およびブチリルＣｏＡをブタノールに変換する酵素（例えば、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来のａｄｈＥ２（Ｆｏｎｔａｉｎｅら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４巻、８２１〜８３０頁（２００２年）））が挙げられる。ｂｄｈＩおよびｂｄｈＩＩによってコードされるＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ酵素（Ｗａｌｔｅｒ，ら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４巻、７１４９〜７１５８頁（１９９２年））は、アセチルＣｏＡおよびブチリルＣｏＡをそれぞれエタノールおよびブタノールに還元する。アセチルＣｏＡをエタノールに還元することに加え、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓにおけるａｄｈＥによってコードされる酵素は、分枝鎖状化合物イソブチルアルデヒドをイソブチリルＣｏＡに酸化することが示されている（Ｋａｚａｈａｙａら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８巻、４３〜５５頁（１９７２年）；Ｋｏｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ、２７巻、５０５〜５１０頁（２００５年））。別の例示的な酵素は、マロニルＣｏＡを３−ＨＰに転換し得る。この活性を有するＮＡＤＰＨ依存型酵素は、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓにおいて特徴付けされていて、ここでは、それは、３−ヒドロキシプロピオン酸回路に関わる（Ｈｕｇｌｅｒら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１８４巻、２４０４〜２４１０頁（２００２年）；Ｓｔｒａｕｓｓら、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ、２１５巻、６３３〜６４３頁（１９９３年））。３００ｋＤａの質量を有するこの酵素は、高度に基質特異的であり、他の公知のオキシドレダクターゼに対し、僅かな配列類似性しか示さない（Ｈｕｇｌｅｒら、前出）。他の生物体において、この特異的反応を触媒することが示されている酵素はない；しかし、他の生物体が類似の経路を有し得ることの生物情報学的証拠が存在する（Ｋｌａｔｔら、Ｅｎｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、９巻、２０６７〜２０７８頁（２００７年））。Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ ｃａｓｔｅｎｈｏｌｚｉｉ、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ種ＮＡＰ１および海洋性のガンマプロテオバクテリアＨＴＣＣ２０８０を含む他の生物体における酵素候補が、配列類似性によって推定され得る。
長鎖アシルＣｏＡ分子は、アルコール形成脂肪族アシルＣｏＡレダクターゼをコードするホホバ（Ｓｉｍｍｏｎｄｓｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）ＦＡＲなどの酵素によって、その対応するアルコールに還元され得る。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるその過剰発現は、ＦＡＲ活性および脂肪族アルコールの蓄積を生じた（Ｍｅｔｚら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ、１２２巻、６３５〜６４４頁（２０００年））。
１．２．１．ｂ． スクシニルＣｏＡの、対応するアルデヒドであるコハク酸セミアルデヒドへの還元は、スクシニルＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）によって触媒される。例示的な酵素としては、スクシニルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．７６）、アセチルＣｏＡレダクターゼ、ブチリルＣｏＡレダクターゼおよび脂肪族アシルＣｏＡレダクターゼが挙げられる。スクシニルＣｏＡレダクターゼ活性を有する酵素は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉのｓｕｃＤ（Ｓｏｈｌｉｎｇ、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８巻、８７１〜８８０頁（１９９６年））およびＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのｓｕｃＤ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８２巻、４７０４〜４７１０頁（２０００年））によってコードされる。さらなるスクシニルＣｏＡレダクターゼ酵素は、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ ｓｅｄｕｌａ（Ｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８巻、１７８２〜１７８６頁（２００７年））およびＴｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｕｓ（Ｒａｍｏｓ−Ｖｅｒａら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１９１巻、４２８６〜４２９７頁（２００９年））を含む好熱性古細菌の３−ヒドロキシプロピオン酸／４−ヒドロキシ酪酸回路に関わる。Ｍｓｅｄ＿０７０９によってコードされるＭ．ｓｅｄｕｌａ酵素は、厳密にＮＡＤＰＨ依存型であり、マロニルＣｏＡレダクターゼ活性をも有する。Ｔ．ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｕｓ酵素は、ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＨの両方に対して活性である。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種においてアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをアシル化する酵素（ｂｐｈＧによってコードされる）は、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒドおよびホルムアルデヒドを酸化しそしてアシル化することが実証されているので、それはなお別である（Ｐｏｗｌｏｗｓｋｉ、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５巻、３７７〜３８５頁（１９９３年））。アセチルＣｏＡのエタノールへの還元に加え、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓにおいてａｄｈＥによってコードされる酵素は、分枝鎖状化合物イソブチルアルデヒドをイソブチリルＣｏＡに酸化することが示されている（Ｋａｚａｈａｙａ、Ｊ． Ｇｅｎ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８巻、４３〜５５頁（１９７２年）；およびＫｏｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ．２７巻、５０５〜５１０頁（２００５年））。ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ（Ｋｏｓａｋａら、Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、７１巻、５８〜６８頁（２００７年））のようなソルベント産生生物体において、類似の反応である、ブチリルＣｏＡのブチルアルデヒドへの転換を触媒する。例示的な脂肪族アシルＣｏＡレダクターゼ酵素は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ（Ｒｅｉｓｅｒ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７９巻、２９６９〜２９７５頁（１９９７年））およびＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種Ｍ−１（Ｉｓｈｉｇｅら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８巻、１１９２〜１１９５頁（２００２年））のａｃｒ１によってコードされる。
１．２．１．ｅ． スクシネートのコハク酸セミアルデヒドへの直接転換は、カルボン酸レダクターゼによって触媒される。例示的な酵素としては、カルボン酸レダクターゼ、アルファ−アミノアジピン酸レダクターゼおよびレチノイン酸レダクターゼが挙げられる。Ｎｏｃａｒｄｉａ ｉｏｗｅｎｓｉｓに見出されたカルボン酸レダクターゼ（ＣＡＲ）は、カルボン酸のその対応するアルデヒドへの、マグネシウム、ＡＴＰおよびＮＡＤＰＨ依存型の還元を触媒する（Ｖｅｎｋｉｔａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２巻、４７８〜４８５頁（２００７年））。この酵素の天然の基質は、ベンゾエートであり、この酵素は、ｐ−トルエンを含む芳香族基質の広い受容能を示す（Ｖｅｎｋｉｔａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら、「Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ」、ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ（２００６年））。Ｎｏｃａｒｄｉａ ｉｏｗｅｎｓｉｓ由来のこの酵素（ｃａｒによってコードされる）は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてクローニングされ、機能的に発現されている（Ｖｅｎｋｉｔａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２巻、４７８〜４８５頁（２００７年））。ＣＡＲは、ホスホパンテテイントランスフェラーゼ（ＰＰＴアーゼ）による翻訳後活性化（不活性型アポ酵素を活性型ホロ酵素に転換する）を必要とする（Ｈａｎｓｅｎら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７５巻、２７６５〜２７７４頁（２００９年））。ｎｐｔ遺伝子（特定のＰＰＴアーゼをコードする）の発現は、産物が酵素の活性を改善した。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓに見出されるさらなる酵素候補は、ｇｒｉＣおよびｇｒｉＤ遺伝子によってコードされる。この酵素は、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を３−アミノ−４−ヒドロキシベンズアルデヒドに転換し、ｇｒｉＣまたはｇｒｉＤのどちらかの欠失が、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸代謝のシャント産物である３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸の細胞外蓄積をもたらすと考えられている（Ｓｕｚｕｋｉら、Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ．６０巻（６号）、３８０〜３８７頁（２００７年））。ｇｒｉＣおよびｇｒｉＤのＳＧＲ＿６６５（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｉｏｗｅｎｓｉｓ ｎｐｔに対し配列において類似している酵素である）との共発現は、有益であり得る。
さらなるｃａｒ遺伝子およびｎｐｔ遺伝子は、配列相同性に基づいて同定され得る。
類似の特性を有する酵素、アルファ−アミノアジピン酸レダクターゼ（ＡＡＲ、ＥＣ１．２．１．３１）は、いくつかの真菌種において、リシン生合成経路に関わる。この酵素は、アルファ−アミノアジペートを、アルファ−アミノアジピン酸セミアルデヒドに、天然で還元する。カルボキシル基は、まず、アデニレートのＡＴＰ依存型の形成を通して活性化され、次いで、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈによって還元されて、前記アルデヒドおよびＡＭＰを生じる。ＣＡＲのように、この酵素は、マグネシウムを利用し、ＰＰＴアーゼによる活性化を必要とする。ＡＡＲおよびその対応するＰＰＴアーゼについての酵素候補は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｍｏｒｒｉｓら、Ｇｅｎｅ ９８巻、１４１〜１４５頁（１９９１年））、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｇｕｏら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２６９巻、２７１〜２７９頁（２００３年））およびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（Ｆｏｒｄら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２８巻、１３１〜１３７頁（１９９５年））に見出される。Ｓ．ｐｏｍｂｅ由来のＡＡＲは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現された際に有意な活性を示した（Ｇｕｏら、Ｙｅａｓｔ ２１巻、１２７９〜１２８８頁（２００４年））。Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のＡＡＲは、Ｓ−カルボキシメチル−Ｌ−システインを代替の基質として受け入れるが、アジペート、Ｌ−グルタメートまたはジアミノピメレートと反応しなかった（Ｈｉｊａｒｒｕｂｉａら、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８巻、８２５０〜８２５６頁（２００３年））。Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ＰＰＴアーゼをコードする遺伝子は、現在までに同定されておらず、配列比較相同性調査によって、高い信頼性のヒットは同定されなかった。
２．３．１．ａ． ホスホトランス−４−ヒドロキシブチリラーゼ活性を有する酵素は、４−ヒドロキシブチリル−ホスフェートを４−ヒドロキシブチリルＣｏＡに転換することが必要とされる。例示的なリン酸転移アシルトランスフェラーゼとしては、ホスホトランスアセチラーゼ（ＥＣ２．３．１．８）およびホスホトランスブチリラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）が挙げられる。Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｐｔａ遺伝子は、ホスホトランスアセチラーゼをコードし、ホスホトランスアセチラーゼは、アセチルＣｏＡをアセチルホスフェートに可逆的に転換する（Ｓｕｚｕｋｉ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １９１巻、５５９〜５６９頁（１９６９年））。この酵素はまた、プロピオニルＣｏＡを基質として利用し得、プロセスにおいてプロピオネートを形成する（Ｈｅｓｓｌｉｎｇｅｒら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２７巻、４７７〜４９２頁（１９９８年））。プロピオニルＣｏＡに対する活性を示す他のリン酸アセチルトランスフェラーゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｒａｄｏら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ３２１巻、１１４〜１２５頁（１９７３年））、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉ（Ｓｔａｄｔｍａｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １巻、５９６〜５９９頁（１９５５年））およびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｂｏｃｋら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１巻、１８６１〜１８６７頁（１９９９年））に見出される。同様に、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来のｐｔｂ遺伝子は、ブチリルＣｏＡをブチリルホスフェートに可逆的に転換する酵素であるホスホトランスブチリラーゼをコードする（Ｗｉｅｓｅｎｂｏｒｎら、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５５巻、３１７〜３２２頁（１９８９年）；Ｗａｌｔｅｒら、Ｇｅｎｅ １３４巻、１０７〜１１１頁（１９９３年））。さらなるｐｔｂ遺伝子は、ブチレート産生細菌Ｌ２−５０（Ｌｏｕｉｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６巻、２０９９〜２１０６頁（２００４年））およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ（Ｖａｚｑｕｅｚら、Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４２巻、３４５〜３４９頁（２００１年））に見出される。
２．７．２．ａ． ＥＣクラス２．７．２におけるキナーゼまたはホスホトランスフェラーゼ酵素は、１つのＡＴＰの同時の加水分解と共にカルボン酸をホスホン酸に変換する。例示的な４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ酵素候補としては、酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）、イソ酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１４）、アスパルトキナーゼ（ＥＣ２．７．２．４）、酢酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１）およびガンマ−グルタミルキナーゼ（ＥＣ２．７．２．１１）が挙げられる。酪酸キナーゼは、クロストリジウム種における酸産生の間に、ブチリルホスフェートのブチレートへの可逆的転換を触媒する（Ｃａｒｙら、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５６巻、１５７６〜１５８３頁（１９９０年））。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ酵素は、２つのｂｕｋ遺伝子産物のいずれかによってコードされる（Ｈｕａｎｇら、Ｊ Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２巻、３３〜３８頁（２０００年））。他の酪酸キナーゼ酵素は、Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍおよびＣ．ｔｅｔａｎｏｍｏｒｐｈｕｍに見出される（Ｔｗａｒｏｇら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ８６巻、１１２〜１１７頁（１９６３年））。関連の酵素、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来のイソ酪酸キナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、結晶化された（Ｄｉａｏら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９１巻、２５２１〜２５２９頁（２００９年）；Ｄｉａｏら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５９巻、１１００〜１１０２頁（２００３年））。アスパルトキナーゼは、アスパルテートのＡＴＰ依存型リン酸化を触媒し、いくつかのアミノ酸の合成に関与する。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるアスパルトキナーゼＩＩＩ酵素（ｌｙｓＣによってコードされる）は、広い基質範囲を有し、基質特異性に関与する触媒残基は、明らかにされている（Ｋｅｎｇら、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３３５巻、７３〜８１頁（１９９６年））。Ｅ．ｃｏｌｉにおける２つのさらなるキナーゼはまた、酢酸キナーゼおよびガンマ−グルタミルキナーゼである。Ｅ．ｃｏｌｉ酢酸キナーゼ（ａｃｋＡによってコードされる）（Ｓｋａｒｓｔｅｄｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１巻、６７７５〜６７８３頁（１９７６年））は、プロピオネートを、アセテートに加えてリン酸化する（Ｈｅｓｓｌｉｎｇｅｒら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２７巻、４７７〜４９２頁（１９９８年））。Ｅ．ｃｏｌｉガンマ−グルタミルキナーゼ（ｐｒｏＢによってコードされる）（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５７巻、５４５〜５５１頁（１９８４年））は、グルタメートのガンマカルボン酸基をリン酸化する。
２．８．３．ａ． ＣｏＡトランスフェラーゼは、１つの分子から別の分子へのＣｏＡ部分の可逆的転移を触媒する。図１６Ｂにおけるいくつかの変換は、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性：スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼおよびメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼを必要とする。スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼについての酵素候補は、本明細書中で先に記載されており、この経路にも適用可能である。さらなる例示的なＣｏＡトランスフェラーゼ酵素としては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉのｃａｔ１、ｃａｔ２およびｃａｔ３の遺伝子産物（それぞれスクシニルＣｏＡ活性、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡ活性、およびブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ活性を示すことが示されている）が挙げられる（Ｓｅｅｄｏｒｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ １０５巻、２１２８〜２１３３頁（２００８年）；Ｓｏｈｌｉｎｇら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８巻、８７１〜８８０頁（１９９６年））。類似のＣｏＡトランスフェラーゼ活性はまた、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ（ｖａｎ Ｇｒｉｎｓｖｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３巻、１４１１〜１４１８頁（２００８年））およびＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ（Ｒｉｖｉｅｒｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９巻、４５３３７〜４５３４６頁（２００４年））に存在している。
嫌気性細菌Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ由来のグルタコニルＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１２）酵素は、２，３−デヒドロアジピルＣｏＡと類似の構造の基質であるグルタコニルＣｏＡおよび３−ブテノイルＣｏＡ（Ｍａｃｋら、２２６巻、４１〜５１頁（１９９４年））と反応する。この酵素をコードする遺伝子は、ｇｃｔＡおよびｇｃｔＢである。この酵素は、グルタリルＣｏＡ、２−ヒドロキシグルタリルＣｏＡ、アジピルＣｏＡ、クロトニルＣｏＡおよびアクリリルＣｏＡを含む他のＣｏＡ誘導体に対して、減少しているが検出可能な活性を有する（Ｂｕｃｋｅｌら、Ｅｕｒ．Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １１８巻、３１５〜３２１頁（１９８１年））。この酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてクローニングされ、発現されている（Ｍａｃｋら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２２６巻、４１〜５１頁（１９９４年））。グルタコン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ活性はまた、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｙｍｂｉｏｓｕｍにおいて検出されている。さらなるグルタコン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ酵素は、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓタンパク質配列と相同性であることによって推定され得る。
アセチルＣｏＡをＣｏＡ供与体として利用し得るＣｏＡトランスフェラーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ ａｔｏＡ遺伝子（アルファサブユニット）およびａｔｏＤ遺伝子（ベータサブユニット）によってコードされる、アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼである（Ｋｏｒｏｌｅｖら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５８巻、２１１６〜２１２１頁（２００２年）；Ｖａｎｄｅｒｗｉｎｋｅｌら、３３巻、９０２〜９０８頁（１９６８年））。この酵素は、広い基質範囲を有し（Ｓｒａｍｅｋら、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ １７１巻、１４〜２６頁（１９７５年））、イソブチレート（Ｍａｔｔｈｉｅｓら、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５８巻、１４３５〜１４３９頁（１９９２年））， バレレート（Ｖａｎｄｅｒｗｉｎｋｅｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３３巻、９０２〜９０８頁（１９６８年））およびブタノエート（Ｖａｎｄｅｒｗｉｎｋｅｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３３巻、９０２〜９０８頁（１９６８年））を含む種々の分枝鎖状および直鎖状のアシルＣｏＡ基質からアセテートへＣｏＡ部分を転移させることが示されている。この酵素は、アセトアセテートによって転写レベルで誘導され、調節制御の改変は、この酵素を経路へと工学的に操作するために必要であり得る（Ｐａｕｌｉら、Ｅｕｒ．Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９巻、５５３〜５６２頁（１９７２年））。類似の酵素は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２（Ｄｕｎｃａｎら、６８巻、５１８６〜５１９０頁（２００２年））、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ（Ｃａｒｙら、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５６巻、１５７６〜１５８３頁（１９９０年）；Ｗｉｅｓｅｎｂｏｒｎら、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５５巻、３２３〜３２９頁（１９８９年））およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ（Ｋｏｓａｋａら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．７１巻、５８〜６８頁（２００７年））に存在している。
３．１．２．ａ． ３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼは、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡの３−ヒドロキシイソブチレートへの転換を触媒する。この酵素は、バリン分解経路に関わる（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６９巻、１４２４８〜１４２５３頁（１９９４年））。この酵素をコードする遺伝子としては、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２４巻、２２９〜２４０頁（２０００年））およびＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら、前出）のｈｉｂｃｈが挙げられる。類似の遺伝子候補もまた、配列相同性によって同定され得、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｈｉｂｃｈおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓのＢＣ＿２２９２が挙げられる。
メチルマロニルＣｏＡは、メチルマロニルＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．７）によって、メチルマロネートへ転換される。Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ肝臓から単離されるこの酵素はまた、代替の基質として、マロニルＣｏＡおよびプロピオニルＣｏＡにおいても活性である（Ｋｏｖａｃｈｙら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２５８巻、１１４１５〜１１４２１頁（１９８３年））。この酵素に関連する遺伝子は、現在までに同定されていない。広い基質範囲を有する例示的なＣｏＡヒドロラーゼは、好適な候補であり、３−ＨＩＢＣｏＡヒドロラーゼ酵素が上で記載されている。Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ脳由来のａｃｏｔ１２によってコードされる酵素（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７１巻、９５９〜９６５頁（１９７６年））は、ブチリルＣｏＡ、ヘキサノイルＣｏＡおよびマロニルＣｏＡと反応し得る。ヒトジカルボン酸チオエステラーゼ（ａｃｏｔ８によってコードされる）は、グルタリルＣｏＡ、アジピルＣｏＡ、スベリルＣｏＡ、セバシルＣｏＡおよびドデカンジオイルＣｏＡに対して活性を示す（Ｗｅｓｔｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２８０巻、３８１２５〜３８１３２頁（２００５年））。この酵素に対して最も近いＥ．ｃｏｌｉホモログであるｔｅｓＢもまた、一連のＣｏＡチオールエステルを加水分解し得る（Ｎａｇｇｅｒｔら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６６巻、１１０４４〜１１０５０頁（１９９１年））。類似の酵素はまた、ラット肝臓においても特徴付けされている（Ｄｅａｎａ Ｒ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｉｎｔ ２６巻、７６７〜７７３頁（１９９２年））。Ｅ．ｃｏｌｉにおいてヒドロラーゼ活性を有するさらなる酵素としては、ｙｂｇＣ、ｐａａＩおよびｙｂｄＢが挙げられる（Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖａら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ、２００５年、２９巻（２号）、２６３〜２７９頁；Ｓｏｎｇら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２００６年、２８１巻（１６号）、１１０２８〜３８頁）。その配列は報告されていないが、エンドウの葉のミトコンドリア由来の酵素は、広い基質範囲を有し、アセチルＣｏＡ、プロピオニルＣｏＡ、ブチリルＣｏＡ、パルミトイルＣｏＡ、オレオイルＣｏＡ、スクシニルＣｏＡおよびクロトニルＣｏＡにおいて活性を実証されている（Ｚｅｉｈｅｒら、Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．９４巻、２０〜２７頁（１９９０年））。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のアセチルＣｏＡヒドロラーゼ、ＡＣＨ１は、別の候補ヒドロラーゼを代表する（Ｂｕｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８巻、１７２０３〜１７２０９頁（２００３年））。
なお別の候補ヒドロラーゼは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ由来のグルタコン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼである、この酵素は、部位特異的変異誘発により、グルタリルＣｏＡ、アセチルＣｏＡおよび３−ブテノイルＣｏＡに対して活性を有するアシルＣｏＡヒドロラーゼに変換された（Ｍａｃｋら、ＦＥＢＳ．Ｌｅｔｔ．４０５巻、２０９〜２１２頁（１９９７年））。このことは、スクシニルＣｏＡ：３−ケト酸ＣｏＡトランスフェラーゼおよびアセトアセチルＣｏＡ：アセチルＣｏＡトランスフェラーゼをコードする酵素はまた、この反応ステップについての候補としても働き得るが、その機能を変えるために、ある特定の変異を必要とする。
４．２．１．ａ． 図１６Ｂにおける２つの変換は、デヒドラターゼ酵素を必要とする。３−ヒドロキシイソブチレートのＭＡＡへの脱水は、３−ヒドロキシイソブチレートによって触媒される。この変換のための酵素候補は、実施例ＶＩＩにおいて記載される。３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡのメタクリリルＣｏＡへの脱水は、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ活性を有する酵素によって触媒される。例示的な酵素としては、エノイルＣｏＡヒドラターゼおよびクロトナーゼが挙げられる。
エノイルＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１７）は、一連の３−ヒドロキシアシルＣｏＡ基質の脱水を触媒する（Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １１７巻、９９〜１０８頁（１９７８年）；Ａｇｎｉｈｏｔｒｉら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ． １１巻、９〜２０頁（２００３年）；Ｃｏｎｒａｄら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１８巻、１０３〜１１１頁（１９７４年））。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａのエノイルＣｏＡヒドラターゼ（ｅｃｈによってコードされる）は、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡのクロトニルＣｏＡへの転換を触媒する（Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １１７巻、９９〜１０８頁（１９７８年））。この変換はまた、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍのｃｒｔ遺伝子産物、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉおよび他のクロストリジウム生物体のｃｒｔ１遺伝子産物によっても触媒される（Ａｔｓｕｍｉら、Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ １０巻、３０５〜３１１頁（２００８年）；Ｂｏｙｎｔｏｎら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８巻、３０１５〜３０２４頁（１９９６年）；Ｈｉｌｌｍｅｒら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１巻、３５１〜３５４頁（１９７２年））。さらなるエノイルＣｏＡヒドラターゼ候補は、Ｐ．ｐｕｔｉｄａのｐｈａＡおよびｐｈａＢ、ならびにＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のｐａａＡおよびｐａａＢである（Ｏｌｉｖｅｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ ９５巻、６４１９〜６４２４頁（１９９８年））。Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓにおけるｐｉｍＦの遺伝子産物は、ピメロイルＣｏＡ分解に関わるエノイルＣｏＡヒドラターゼをコードすることが予測される（Ｈａｒｒｉｓｏｎら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １５１巻、７２７〜７３６頁（２００５年））。最後に、多くのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ遺伝子は、以下を含むエノイルＣｏＡヒドラターゼ機能性を実証することが示されている：ｍａｏＣ（Ｐａｒｋら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８５巻、５３９１〜５３９７頁（２００３年））、ｐａａＦ（Ｉｓｍａｉｌら、Ｅｕｒ．Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０巻、３０４７〜３０５４頁（２００３年）；Ｐａｒｋら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １１３〜１１６巻、３３５〜３４６頁（２００４年）；Ｐａｒｋら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８６巻、６８１〜６８６頁（２００４年））およびｐａａＧ（Ｉｓｍａｉｌら、Ｅｕｒ．Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０巻、３０４７〜３０５４頁（２００３年）；ＰａｒｋおよびＬｅｅ、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １１３〜１１６巻、３３５〜３４６頁（２００４年）；Ｐａｒｋ およびＹｕｐ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８６巻、６８１〜６８６頁（２００４年））。
あるいは、ｆａｄＡおよびｆａｄＢのＥ．ｃｏｌｉ遺伝子産物は、エノイルＣｏＡヒドラターゼ活性を示す脂肪酸酸化に関与する多酵素複合体をコードする（Ｙａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０巻、６７８８〜６７９５頁（１９９１年）；Ｙａｎｇ、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３巻、７４０５〜７４０６頁（１９９１年）；Ｎａｋａｈｉｇａｓｈｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８巻、４９３７頁（１９９０年））。ｆａｄＲによってコードされる負の調節因子をノックアウトすることは、ｆａｄＢ遺伝子産物を活性化するために利用され得る（Ｓａｔｏら、Ｊ Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ １０３巻、３８〜４４頁（２００７年））。ｆａｄＩおよびｆａｄＪ遺伝子は、類似の機能をコードし、嫌気性条件下で天然に発現される（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４７巻、７９３〜８０５頁（２００３年））。
５．４．９９．ａ． ４−ヒドロキシブチリルＣｏＡは、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ活性を有する酵素によって、転位されて３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡを形成する。この活性は、現在まで実証されていない。メチルマロニルＣｏＡムターゼおよびイソブチリルＣｏＡムターゼは、類似の変換を触媒する。例示的なメチルマロニルＣｏＡムターゼおよびイソブチリルＣｏＡムターゼ酵素候補は、実施例ＶおよびＶＩＩにおいて記載される。
６．２．１．ａ． アシルＣｏＡ基質のその酸産物への転換は、６．２．１ファミリーの酵素におけるＣｏＡ酸−チオールリガーゼまたはＣｏＡシンテターゼによって触媒され得る。このクラスにおける図１６Ｂの酵素としては、スクシニルＣｏＡシンテターゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡシンテターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼおよびメタクリリルＣｏＡシンテターゼが挙げられる。スクシニルＣｏＡシンテターゼ酵素候補は、先に記載されている。４−ヒドロキシブチリルＣｏＡシンテターゼ活性、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼ活性およびメタクリリルＣｏＡシンテターゼ活性を触媒するための例示的な酵素は、本明細書中および以下で記載される。ＡＤＰ形成アセチルＣｏＡシンテターゼ（ＡＣＤ、ＥＣ６．２．１．１３）は、アシルＣｏＡエステルのその対応する酸への転換を、相伴うＡＴＰの合成とカップリングする酵素である。Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ由来のＡＣＤ Ｉ（ＡＦ１２１１によってコードされる）は、イソブチレート、イソペンタノエートおよびフマレートを含む種々の直鎖状および分枝鎖状の基質に作用することが示された（Ｍｕｓｆｅｌｄｔら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４巻、６３６〜６４４頁（２００２年））。Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓにおける第２の可逆的ＡＣＤ（ＡＦ１９８３によってコードされる）もまた、環状化合物であるフェニルアセテートおよびインドールアセテートに高い活性を有し、広い基質範囲を有することが示された（ＭｕｓｆｅｌｄｔおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４巻、６３６〜６４４頁（２００２年））。Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ由来の酵素（スクシニルＣｏＡシンテターゼと注解される）は、プロピオネート、ブチレートおよび分枝鎖状の酸（イソバレレートおよびイソブチレート）を基質として受容し、順方向および逆方向に作用することが示された（Ｂｒａｓｅｎら、Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １８２巻、２７７〜２８７頁（２００４年））。超好熱性クレン古細菌Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来のＰＡＥ３２５０によってコードされるＡＣＤは、全ての特徴付けされたＡＣＤのうちで最も広い基質範囲を示し、アセチルＣｏＡ、イソブチリルＣｏＡ（好ましい基質）およびフェニルアセチルＣｏＡと反応した（Ｂｒａｓｅｎら、前出）。定向進化または工学的操作は、この酵素を宿主生物体の生理学的温度において作用するように改変するために使用され得る。Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉおよびＰ．ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来の酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、全てクローニングされ、機能的に発現され、そして特徴付けされている（ＢｒａｓｅｎおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ、前出；ＭｕｓｆｅｌｄｔおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４巻、６３６〜６４４頁（２００２年））。さらなる候補は、スクシニルＣｏＡシンテターゼであり、Ｅ．ｃｏｌｉのｓｕｃＣＤならびにＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＬＳＣ１およびＬＳＣ２遺伝子によってコードされる。これらの酵素は、ｉｎ ｖｉｖｏで可逆的である反応において１つのＡＴＰの消費を伴う、スクシネートからのスクシニルＣｏＡの形成を触媒する（Ｂｕｃｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４巻、６２４５〜６２５２頁（１９８５年））。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ由来のアシルＣｏＡリガーゼは、いくつかの脂肪族基質（酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸およびオクタン酸を含む）および芳香族化合物（例えば、フェニル酢酸およびフェノキシ酢酸）に対して働くことが実証されている（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｖａｌｖｅｒｄｅら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９巻、１１４９〜１１５４頁（１９９３年））。Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ由来の関連の酵素であるマロニルＣｏＡシンテターゼ（６．３．４．９）は、いくつかの二酸、すなわち、エチル−、プロピル−、アリル−、イソプロピル−、ジメチル−、シクロプロピル−、シクロプロピルメチレン−、シクロブチル−、およびベンジル−マロネートを、その対応するモノチオエステルに転換することができる（Ｐｏｈｌら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３巻、５８２２〜５８２３頁（２００１年））。
活性な還元的ＴＣＡ回路は、図１８の例示的な経路で示されたように、アセチルＣｏＡ誘導産物であるメタクリル酸（ＭＡＡ）の収率を改善する。還元的ＴＣＡ回路の経路およびスクシネートの４−ヒドロキシブチリルＣｏＡおよびメタクリル酸への転換は、本明細書中で記載される（また、図５および１６Ｂならびに実施例ＶＩＩを参照）。図１８Ａおよび１８Ｂは、例示的な経路を示す。酵素的変換は、示されるような酵素によって実施される。図１８Ａは、還元的ＴＣＡ回路を用いたＣＯ２のスクシネートへの固定のための経路を示す。図１８Ｂは、スクシネートからの３−ヒドロキシイソ酪酸およびメタクリル酸の生合成のための例示的な経路を示す；示される酵素的変換は、以下の酵素によって実施される：Ａ．３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、Ｂ．メタクリリルＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼまたはヒドロラーゼ、Ｃ．スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼまたはシンテターゼ、Ｄ．スクシニルＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）、Ｅ．４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、Ｆ．４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ、Ｇ．ホスホトランス−４−ヒドロキシブチリラーゼ、Ｈ．コハク酸レダクターゼ、Ｉ．スクシニルＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）、Ｊ．４−ヒドロキシブチリルＣｏＡシンテターゼまたはトランスフェラーゼ、Ｋ．４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、Ｌ．３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼまたはヒドロラーゼ、Ｍ．３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ。
（実施例ＸＸＩ）
アセチルＣｏＡからのＭＡＡおよび２−ヒドロキシイソ酪酸の産生のための経路
活性な還元的ＴＣＡ回路は、図１６Ｃのフラックス分布で示されるように、アセチルＣｏＡ誘導産物であるメタクリル酸（ＭＡＡ）の収率を改善する。この経路において、ＭＡＡは、５つの酵素的ステップにおいてアセチルＣｏＡから産生される。第１のステップにおいて、アセチルＣｏＡの２つの分子は、組み合わされて、アセトアセチルＣｏＡを形成する。アセトアセチルＣｏＡは、その後、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに還元される。次いで、メチルムターゼは、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡの炭素骨格を、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡに転位し、これは、次いで、脱水されて、メタクリリルＣｏＡを形成する。あるいは、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡは、２−ヒドロキシイソブチレートに転換され、分泌されて、産物として回収され得る。メタクリリルＣｏＡをＭＡＡに転換する最終ステップは、１つの酵素または一連の酵素によって行われ得る。メタクリリルＣｏＡをＭＡＡに転換するための代替の戦略は、ＭＡＡ−ＣｏＡが３−ヒドロキシイソブチレートを介してＭＡＡに転換される多ステッププロセスを必要とする。このプロセスによって、ＭＡＡ−ＣｏＡは、まず、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡに転換され、これは、その後、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼによって、３−ヒドロキシイソブチレートに転換され得る。３−ヒドロキシイソブチレートは、次いで、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼを介してＭＡＡに生物触媒的に転換されるか、または分泌され、化学的脱水によってＭＡＡに転換され得る。
各経路ステップについての酵素候補は、本明細書中で記載される。メタクリリルＣｏＡのＭＡＡへの転換を触媒するＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼおよびヒドロラーゼ酵素は、上の実施例ＶＩＩにおいて記載された。メタクリリルＣｏＡの３−ヒドロキシイソブチレートおよびメタクリル酸への間接的転換を説明する酵素もまた、上で記載される。
アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ。２つのアセチルＣｏＡ単位からのアセトアセチルＣｏＡの形成はアセチルＣｏＡチオラーゼによって触媒される。例示的な酵素は、実施例Ｘにおいて記載される。
（実施例ＸＸＩＩ）
ピルベートおよびアセチルＣｏＡからのＭＡＡの産生のための経路
活性な還元的ＴＣＡ回路は、アセチルＣｏＡ誘導産物であるメタクリル酸（ＭＡＡ）の収率を改善する。この改善された収率を示すフラックス分布は図１６Ｄにおいて示される。
図１６Ｅ（図１および実施例Ｉも参照）は、アセチルＣｏＡおよびピルベートから中間体であるシトラマレートを介したＭＡＡへの例示的な経路を図示する。また、アコニテートからＭＡＡへの経路も、示される。１つの経路において、アセチルＣｏＡおよびピルベートは、シトラマル酸シンターゼによってシトラマレートに転換される。シトラマレートの脱水は、シトラコネートまたはメサコネートのどちらかを生じ得る。メサコネートおよびシトラコネートは、シス／トランスイソメラーゼによって相互転換される。メサコネートまたはシトラコネートの脱カルボキシル化は、ＭＡＡをもたらす。代替の経路において、シトラマレートは、シトラマリルＣｏＡリアーゼおよびシトラマリルＣｏＡヒドロラーゼ、トランスフェラーゼまたはシンテターゼにより触媒されて、アセチルＣｏＡおよびピルベートから、シトラマリルＣｏＡ中間体を介して、形成される。また、アコニテートからＭＡＡへの経路も、示される。１つの経路において、アコニテートは、まず、アコニット酸デカルボキシラーゼによって、イタコネートに脱カルボキシル化される。次いで、イタコネートは、イタコン酸デルタ−イソメラーゼによってシトラコネートに異性体化される。シトラコネートのＭＡＡへの転換は、直接脱カルボキシル化によって、または間接的にメサコネートを介して進行する。代替の経路において、イタコネート中間体は、まず、ＣｏＡトランスフェラーゼまたはシンテターゼによってイタコニルＣｏＡに転換される。イタコニルＣｏＡの水和は、シトラマリルＣｏＡを生じ、これは、次いで、上記のようにＭＡＡに転換され得る。
実施例Ｉにおいて提供される表１は、図１６Ｅにおいて図示されるステップを行い得る酵素クラスを示す。例示的な酵素は、以下に記載され、より詳細には、実施例Ｉに記載される。
ＥＣ２．３．１．ａ シンターゼ。シトラマル酸シンターゼ（ＥＣ２．３．１．１８２）は、アセチルＣｏＡおよびピルベートのシトラマレートおよび補酵素Ａへの転換を触媒する。例示的な酵素は、実施例Ｉに記載される。
ＥＣ２．８．３．ａ ＣｏＡトランスフェラーゼ（ステップＥ）。ＣｏＡトランスフェラーゼは、１つの分子から別の分子へのＣｏＡ部分の可逆的転移を触媒する。図１６Ｅにおける２つの変換が、ＣｏＡトランスフェラーゼを利用する：シトラマリルＣｏＡのシトラマレートへの転換およびイタコネートのイタコニルＣｏＡへの活性化。シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．７および２．８．３．１１）は、シトラマリルＣｏＡから供与体へとＣｏＡ部分を転移する。シトラマル酸：スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ酵素は、グリオキシル酸同化の３−ヒドロキシプロピオン酸回路において活性である。例示的な酵素は、実施例Ｉにおいて記載される。
ＥＣ３．２．１．ａ ＣｏＡヒドロラーゼ。３．１．２ファミリーにおける酵素は、アシルＣｏＡ分子をその対応する酸に加水分解する。広い基質範囲を有するいくつかのＣｏＡヒドロラーゼは、シトラマリルＣｏＡヒドロラーゼ活性を示すための好適な候補である。例示的な酵素は、実施例Ｉにおいて記載される。
ＥＣ４．１．１．ａ デカルボキシラーゼ。図１６ＥにおけるＭＡＡ合成の最終ステップは、メサコネートまたはシトラコネートのいずれかの脱カルボキシル化である。例示的な酵素は、実施例Ｉに記載される。
ＥＣ４．１．３．ａ リアーゼ。シトラマリルＣｏＡリアーゼ（ＥＣ４．１．３．２５）は、アセチルＣｏＡおよびピルベートを、シトラマリルＣｏＡに転換する。この酵素は、グリオキシル酸同化の３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ＨＰ）回路に関わり、ここで、それは、シトラマリルＣｏＡ分解方向に作用する。例示的な酵素は、実施例Ｉに記載される。
ＥＣ４．２．１．ａ デヒドラターゼ。シトラマレートのシトラコネートへの脱水は、シトラマル酸デヒドラターゼ（シトラコネート形成）活性（ＥＣ４．２．１．３５）を有する酵素によって触媒される。この酵素は、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉおよびＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｒｏｇａｎｓにおいて特徴付けされているトレオニン非依存型イソロイシン生合成経路に、シトラマル酸シンターゼと共に関わる。これらの生物におけるシトラマレートの脱水は、シトラマレートのシトラコネートへの脱水と、その後の水のシトラコネートへのトランス付加によるメチルマレートの形成との両方を触媒する、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ（ＩＰＭＩ）によって触媒される（Ｘｕら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６巻、５４００〜５４０９頁（２００４年）；Ｄｒｅｖｌａｎｄら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８９巻、４３９１〜４４００頁（２００７年））。例示的な酵素は、実施例Ｉに記載される。
ＥＣ５．２．１．ａ シス／トランスイソメラーゼ。メサコネートおよびシトラコネートのシス／トランス異性体化は、シトラコン酸イソメラーゼ活性を有する酵素によって触媒される。好適な候補としては、アコニット酸イソメラーゼ（ＥＣ５．３．３．７）、マレイン酸シス，トランス−イソメラーゼ（ＥＣ５．２．１．１）、マレイルアセトンシス，トランス−イソメラーゼおよび不飽和脂肪酸のシス，トランス−イソメラーゼ（Ｃｔｉ）が挙げられる。アコニット酸イソメラーゼは、シス−およびトランス−アコニテートを、相互転換する。例示的な酵素は、実施例Ｉに記載される。
ＥＣ５．３．３．ａ デルタ−イソメラーゼ。イタコネートのシトラコネートへの転換は、イタコン酸デルタ−イソメラーゼによって触媒される。例示的な酵素は、実施例Ｉに記載される。
ＥＣ６．２．１ ＣｏＡシンテターゼ。シトラマリルＣｏＡのシトラマレートへの転換およびイタコネートのイタコニルＣｏＡへの転換は、酵素の６．２．１ファミリーにおけるＣｏＡ酸−チオールリガーゼまたはＣｏＡシンテターゼによって触媒され得る。例示的な酵素は、実施例Ｉに記載される。
図１９の例示的な経路で示されるように、活性な還元的ＴＣＡ回路は、アセチルＣｏＡ誘導産物であるメタクリル酸（ＭＡＡ）の収率を改善する。還元的ＴＣＡ回路の経路およびアセチルＣｏＡおよび／またはピルベートの中間体シトラマレートを介したメタクリル酸への転換は、本明細書中で記載される（図１および１６Ｅならびに実施例Ｉも参照）。図１９Ａおよび１９Ｂは、例示的な経路を示す。図１９Ａは、還元的ＴＣＡ回路を用いるＣＯ２のアセチルＣｏＡおよびピルベートへの固定のための経路を示す。図１９Ｂは、アセチルＣｏＡおよびピルベートからのメタクリレートの生合成のための例示的な経路を示す；示される酵素的変換は、以下の酵素によって実施される：１．シトラマル酸シンターゼ、２．シトラマル酸デヒドラターゼ（シトラコネート形成）、３．シトラコン酸デカルボキシラーゼ、４．シトラマリルＣｏＡリアーゼ、５．シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、６．シトラマル酸デヒドラターゼ（メサコネート形成）、７．シトラコン酸イソメラーゼ、８．メサコン酸デカルボキシラーゼ、９．アコニット酸デカルボキシラーゼ、１０．イタコン酸イソメラーゼ、１１．イタコニルＣｏＡトランスフェラーゼまたはシンテターゼ、１２．イタコニルＣｏＡヒドラターゼ。
図２０の例示的な経路において示されるように、活性な還元的ＴＣＡ回路は、アセチルＣｏＡ誘導産物であるメタクリル酸（ＭＡＡ）の収率を改善する。還元的ＴＣＡ回路の経路およびアセチルＣｏＡのメタクリル酸または２−ヒドロキシイソ酪酸への転換は、本明細書中で記載される（図８および実施例Ｘも参照）。図２０Ａおよび２０Ｂは、例示的な経路を示す。図２０Ａは、還元的ＴＣＡ回路を用いる、ＣＯ２のアセチルＣｏＡへの固定のための経路を示す。図２０Ｂは、アセチルＣｏＡからのメタクリル酸および２−ヒドロキシイソ酪酸の生合成のための例示的な経路を示す。
図２１の例示的な経路において示されるように、活性な還元的ＴＣＡ回路は、アセチルＣｏＡ誘導産物であるメタクリル酸（ＭＡＡ）の収率を改善する。還元的ＴＣＡ回路の経路およびアセチルＣｏＡの中間体３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡを介したメタクリル酸への転換は、本明細書中で記載される（また、図５、８および９ならびに実施例ＶＩＩ、Ｘ、ＸＩおよびＸＩＶも参照）。図２１Ａおよび２１Ｂは、例示的な経路を示す。図２１Ａは、還元的ＴＣＡ回路を用いるＣＯ２のアセチルＣｏＡへの固定のための経路を示す。図２１Ｂは、アセチルＣｏＡからのメタクリル酸および３−ヒドロキシイソ酪酸の生合成のための例示的な経路を示す；示される酵素的変換は、以下の酵素によって実施される：１）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡからＢへ）、２）３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（Ｈｂｄ）、３）クロトナーゼ（Ｃｒｔ）、４）クロトニルＣｏＡヒドラターゼ（４−Ｂｕｄｈ）、５）４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、６）３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼ、シンテターゼ、またはトランスフェラーゼ、７）３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ、８）３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、９）メタクリリルＣｏＡヒドロラーゼ、シンテターゼ、またはトランスフェラーゼ。クロトニルＣｏＡヒドラターゼ（４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを形成する）は、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡのクロトニルＣｏＡへの可逆的転換を触媒する４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼの、逆反応である（実施例ＸＩＶを参照されたい）。したがって、本発明の実施形態において、メタクリル酸経路は、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（本明細書中で３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼとも呼ばれる）（図９および２１を参照されたい）、クロトナーゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ（本明細書中でクロトニルＣｏＡヒドラターゼとも呼ばれる）、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼを含む。あるいは、メタクリル酸経路は、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、クロトナーゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼを含む（図２１を参照）。
（実施例ＸＸＩＩＩ）
例示的なカルボン酸レダクターゼ
この実施例は、カルボン酸のアルデヒドへの転換を実施するための、カルボン酸レダクターゼの使用を記載する。
１．２．１．ｅ 酸レダクターゼ。不活性型の酸のアルデヒドへの転換は、酸レダクターゼによって実施される。このような転換の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：４−ヒドロキシブチレート、スクシネート、アルファ−ケトグルタレート、および４−アミノブチレートの、それぞれ４−ヒドロキシブタナール、コハク酸セミアルデヒド、２、５−ジオキソペンタノエート、および４−アミノブタナールへの転換。１つの顕著なカルボン酸レダクターゼが、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｉｏｗｅｎｓｉｓに見出され得、これは、カルボン酸のその対応するアルデヒドへの、マグネシウム、ＡＴＰおよびＮＡＤＰＨ依存型還元を触媒する（Ｖｅｎｋｉｔａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２８２巻、４７８〜４８５頁（２００７年））。この酵素は、ｃａｒ遺伝子によってコードされ、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてクローニングされ、機能的に発現された（Ｖｅｎｋｉｔａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２８２巻、４７８〜４８５頁（２００７年））。ｎｐｔ遺伝子産物の発現は、転写後修飾を介して酵素の活性を改善した。ｎｐｔ遺伝子は、不活性型アポ酵素を活性型ホロ酵素に転換する特異的なホスホパンテテイントランスフェラーゼ（ＰＰＴアーゼ）をコードする。この酵素の天然の基質は、バニリン酸であり、この酵素は、芳香族および脂肪族の基質の広い受容能を示す（Ｖｅｎｋｉｔａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら、「Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｄｕｓｔｉｒｅｓ」、Ｒ．Ｎ． Ｐａｔｅｌ編、第１５章、４２５〜４４０頁、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ＬＬＣ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ．（２００６年））。
さらなるｃａｒ遺伝子およびｎｐｔ遺伝子が、配列相同性に基づいて同定され得る。
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓに見出されるさらなる酵素候補は、ｇｒｉＣおよびｇｒｉＤ遺伝子によってコードされる。ｇｒｉＣまたはｇｒｉＤのいずれかの欠失が、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸代謝のシャント産物である３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸の細胞外蓄積をもたらすので、この酵素は、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を３−アミノ−４−ヒドロキシベンズアルデヒドに転換すると考えられている（Ｓｕｚｕｋｉら、Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ．６０巻（６号）、３８０〜３８７頁（２００７年））。ｇｒｉＣおよびｇｒｉＤとＳＧＲ＿６６５（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｉｏｗｅｎｓｉｓ ｎｐｔに対し配列が類似している酵素）との共発現は、有益であり得る。
類似の特性を有する酵素、アルファ−アミノアジピン酸レダクターゼ（ＡＡＲ、ＥＣ１．２．１．３１）は、いくつかの真菌種において、リシン生合成経路に関わる。この酵素は、アルファ−アミノアジペートを、アルファ−アミノアジピン酸セミアルデヒドに、天然で還元する。カルボキシル基は、まず、アデニレートのＡＴＰ依存型の形成を通して活性化され、次いで、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈによって還元されて、アルデヒドおよびＡＭＰを生じる。ＣＡＲのように、この酵素は、マグネシウムを利用し、ＰＰＴアーゼによる活性化を必要とする。ＡＡＲおよびその対応するＰＰＴアーゼについての酵素候補は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｍｏｒｒｉｓら、Ｇｅｎｅ ９８巻、１４１〜１４５頁（１９９１年））、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｇｕｏら、Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２６９巻、２７１〜２７９頁（２００３年））、およびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（Ｆｏｒｄら、Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ．２８巻、１３１〜１３７頁（１９９５年））に見出される。Ｓ．ｐｏｍｂｅ由来のＡＡＲは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現された際に有意な活性を示した（Ｇｕｏら、Ｙｅａｓｔ ２１巻、１２７９〜１２８８頁（２００４年））。Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のＡＡＲは、Ｓ−カルボキシメチル−Ｌ−システインを代替の基質として受け入れるが、アジペート、Ｌ−グルタメートまたはジアミノピメレートとは反応しなかった（Ｈｉｊａｒｒｕｂｉａら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２７８巻、８２５０〜８２５６頁（２００３年））。Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ＰＰＴアーゼをコードする遺伝子は、現在までに同定されていない。
カルボン酸レダクターゼのクローニングおよび発現。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートのためての経路を工学的に操作するための標的生物体として使用する。Ｅ．ｃｏｌｉは、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートの産生が可能な天然に存在しない微生物を生成するための、良い宿主を提供する。Ｅ．ｃｏｌｉは、遺伝子操作を受容可能であり、種々の酸素化条件下で、種々の中間体および産物を効率的に産生可能であることが公知である。
メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレート］を産生するために工学的に操作された、Ｅ．ｃｏｌｉ株などの微生物体株を生成するために、カルボン酸レダクターゼおよびホスホパンテテイントランスフェラーゼをコードする核酸を、周知の分子生物学技術を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前出、２００１年；Ａｕｓｕｂｅｌ前出、１９９９年を参照）。詳細には、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｉｏｗｅｎｓｉｓに由来するｃａｒ遺伝子（７２０と名付けられる）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ｍｃ（２）１５５（８９０と名付けられる）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ 亜種 ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｋ−１０（８９１と名付けられる）およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ Ｍ（８９２と名付けられる）を、ｐＺＳ＊１３ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ、Ｒｕｅｌｚｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にＰＡ１／ｌａｃＯプロモーターの制御下ででクローニングした。ｎｐｔ（ＡＢＩ８３６５６．１）遺伝子（すなわち、７２１）を、ｐＫＪＬ３３Ｓベクター（元のｍｉｎｉ−ＦプラスミドベクターＰＭＬ３１の誘導体）に、ｐＺＳ＊１３において使用されるものと類似のプロモーターおよびリボソーム結合部位の制御下にてクローニングした。
ｃａｒ遺伝子（ＧＮＭ＿７２０）を、ＮｏｃａｒｄｉａゲノムＤＮＡからのＰＣＲによってクローニングした。その核酸およびタンパク質配列は、それぞれ図２２Ａおよび図２２Ｂにおいて示される。ｎｐｔ遺伝子（ＧＮＭ＿７２１）のコドン最適化バージョンは、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成された。その核酸配列およびタンパク質配列を、それぞれ図２３Ａおよび２３Ｂ示す。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ｍｃ（２）１５５（８９０と名付けられる），Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ亜種ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｋ−１０（８９１と名付けられる）およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ Ｍ（８９２と名付けられる）の遺伝子および酵素についての核酸配列およびタンパク質配列は、図２４、２５および２６においてそれぞれ見出される。プラスミドは、メタクリル酸、メタクリレートエステル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレートの産生のために必要とされるタンパク質および酵素を発現するように、宿主細胞に形質転換させる。
さらなるＣＡＲバリアントを、作製した。ＣＡＲ８９１のコドン最適化バージョンを作製し、８９１ＧＡと名付けた。ＣＡＲ８９１ＧＡの核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれ図２７Ａおよび２７Ｂにおいて示される。２０００を超えるＣＡＲバリアントを、作製した。詳細には、全ての２０アミノ酸の組み合わせを、Ｖ２９５、Ｍ２９６、Ｇ２９７、Ｇ３９１、Ｇ４２１、Ｄ４１３、Ｇ４１４、Ｙ４１５、Ｇ４１６、およびＳ４１７の位置において作製し、さらなるバリアントを、同様に試験した。例示的なＣＡＲバリアントとしては以下が挙げられる：Ｅ１６Ｋ；Ｑ９５Ｌ；Ｌ１００Ｍ；Ａ１０１１Ｔ；Ｋ８２３Ｅ；Ｔ９４１Ｓ；Ｈ１５Ｑ；Ｄ１９８Ｅ；Ｇ４４６Ｃ；Ｓ３９２Ｎ；Ｆ６９９Ｌ；Ｖ８８３Ｉ；Ｆ４６７Ｓ；Ｔ９８７Ｓ；Ｒ１２Ｈ；Ｖ２９５Ｇ；Ｖ２９５Ａ；Ｖ２９５Ｓ；Ｖ２９５Ｔ；Ｖ２９５Ｃ；Ｖ２９５Ｖ；Ｖ２９５Ｌ；Ｖ２９５Ｉ；Ｖ２９５Ｍ；Ｖ２９５Ｐ；Ｖ２９５Ｆ；Ｖ２９５Ｙ；Ｖ２９５Ｗ；Ｖ２９５Ｄ；Ｖ２９５Ｅ；Ｖ２９５Ｎ；Ｖ２９５Ｑ；Ｖ２９５Ｈ；Ｖ２９５Ｋ；Ｖ２９５Ｒ；Ｍ２９６Ｇ；Ｍ２９６Ａ；Ｍ２９６Ｓ；Ｍ２９６Ｔ；Ｍ２９６Ｃ；Ｍ２９６Ｖ；Ｍ２９６Ｌ；Ｍ２９６Ｉ；Ｍ２９６Ｍ；Ｍ２９６Ｐ；Ｍ２９６Ｆ；Ｍ２９６Ｙ；Ｍ２９６Ｗ；Ｍ２９６Ｄ；Ｍ２９６Ｅ；Ｍ２９６Ｎ；Ｍ２９６Ｑ；Ｍ２９６Ｈ；Ｍ２９６Ｋ；Ｍ２９６Ｒ；Ｇ２９７Ｇ；Ｇ２９７Ａ；Ｇ２９７Ｓ；Ｇ２９７Ｔ；Ｇ２９７Ｃ；Ｇ２９７Ｖ；Ｇ２９７Ｌ；Ｇ２９７Ｉ；Ｇ２９７Ｍ；Ｇ２９７Ｐ；Ｇ２９７Ｆ；Ｇ２９７Ｙ；Ｇ２９７Ｗ；Ｇ２９７Ｄ；Ｇ２９７Ｅ；Ｇ２９７Ｎ；Ｇ２９７Ｑ；Ｇ２９７Ｈ；Ｇ２９７Ｋ；Ｇ２９７Ｒ；Ｇ３９１Ｇ；Ｇ３９１Ａ；Ｇ３９１Ｓ；Ｇ３９１Ｔ；Ｇ３９１Ｃ；Ｇ３９１Ｖ；Ｇ３９１Ｌ；Ｇ３９１Ｉ；Ｇ３９１Ｍ；Ｇ３９１Ｐ；Ｇ３９１Ｆ；Ｇ３９１Ｙ；Ｇ３９１Ｗ；Ｇ３９１Ｄ；Ｇ３９１Ｅ；Ｇ３９１Ｎ；Ｇ３９１Ｑ；Ｇ３９１Ｈ；Ｇ３９１Ｋ；Ｇ３９１Ｒ；Ｇ４２１Ｇ；Ｇ４２１Ａ；Ｇ４２１Ｓ；Ｇ４２１Ｔ；Ｇ４２１Ｃ；Ｇ４２１Ｖ；Ｇ４２１Ｌ；Ｇ４２１ＩＧ４２１Ｍ；Ｇ４２１Ｐ；Ｇ４２１Ｆ；Ｇ４２１Ｙ；Ｇ４２１Ｗ；Ｇ４２１Ｄ；Ｇ４２１Ｅ；Ｇ４２１Ｎ；Ｇ４２１Ｑ；Ｇ４２１Ｈ；Ｇ４２１Ｋ；Ｇ４２１Ｒ；Ｄ４１３Ｇ；Ｄ４１３Ａ；Ｄ４１３Ｓ；Ｄ４１３Ｔ；Ｄ４１３Ｃ；Ｄ４１３Ｖ；Ｄ４１３Ｌ；Ｄ４１３Ｉ；Ｄ４１３Ｍ；Ｄ４１３Ｐ；Ｄ４１３Ｆ；Ｄ４１３Ｙ；Ｄ４１３Ｗ；Ｄ４１３Ｄ；Ｄ４１３Ｅ；Ｄ４１３Ｎ；Ｄ４１３Ｑ；Ｄ４１３Ｈ；Ｄ４１３Ｋ；Ｄ４１３Ｒ；Ｇ４１４Ｇ；Ｇ４１４Ａ；Ｇ４１４Ｓ；Ｇ４１４Ｔ；Ｇ４１４Ｃ；Ｇ４１４Ｖ；Ｇ４１４Ｌ；Ｇ４１４Ｉ；Ｇ４１４Ｍ；Ｇ４１４Ｐ；Ｇ４１４Ｆ；Ｇ４１４Ｙ；Ｇ４１４Ｗ；Ｇ４１４Ｄ；Ｇ４１４Ｅ；Ｇ４１４Ｎ；Ｇ４１４Ｑ；Ｇ４１４Ｈ；Ｇ４１４Ｋ；Ｇ４１４Ｒ；Ｙ４１５Ｇ；Ｙ４１５Ａ；Ｙ４１５Ｓ；Ｙ４１５Ｔ；Ｙ４１５Ｃ；Ｙ４１５Ｖ；Ｙ４１５Ｌ；Ｙ４１５Ｉ；Ｙ４１５Ｍ；Ｙ４１５Ｐ；Ｙ４１５Ｆ；Ｙ４１５Ｙ；Ｙ４１５Ｗ；Ｙ４１５Ｄ；Ｙ４１５Ｅ；Ｙ４１５Ｎ；Ｙ４１５Ｑ；Ｙ４１５Ｈ；Ｙ４１５Ｋ；Ｙ４１５Ｒ；Ｇ４１６Ｇ；Ｇ４１６Ａ；Ｇ４１６Ｓ；Ｇ４１６Ｔ；Ｇ４１６Ｃ；Ｇ４１６Ｖ；Ｇ４１６Ｌ；Ｇ４１６Ｉ；Ｇ４１６Ｍ；Ｇ４１６Ｐ；Ｇ４１６Ｆ；Ｇ４１６Ｙ；Ｇ４１６Ｗ；Ｇ４１６Ｄ；Ｇ４１６Ｅ；Ｇ４１６Ｎ；Ｇ４１６Ｑ；Ｇ４１６Ｈ；Ｇ４１６Ｋ；Ｇ４１６Ｒ；Ｓ４１７Ｇ；Ｓ４１７Ａ；Ｓ４１７Ｓ；Ｓ４１７Ｔ；Ｓ４１７Ｃ；Ｓ４１７ＶＳ４１７Ｌ；Ｓ４１７Ｉ；Ｓ４１７Ｍ；Ｓ４１７Ｐ；Ｓ４１７Ｆ；Ｓ４１７Ｙ；Ｓ４１７Ｗ；Ｓ４１７Ｄ；Ｓ４１７Ｅ；Ｓ４１７Ｎ；Ｓ４１７Ｑ；Ｓ４１７Ｈ；Ｓ４１７Ｋ；ａｎｄＳ４１７Ｒ。
ＣＡＲバリアントを、活性についてスクリーニングし、多くのＣＡＲバリアントが、ＣＡＲ活性を示すことを見出した。
この実施例は、カルボン酸をアルデヒドに転換するためのＣＡＲの使用を記載する。
（実施例ＸＸＩＶ）
４−ヒドロキシブチリルＣｏＡのメチルメタクリレートへの転換のための経路
この実施例は、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを例示的なメタクリレートエステルとしてのメチルメタクリレートへ転換するための経路を記載する。
メチルメタクリレートへの例示的な経路は、図３０に示される。簡潔には、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡは、上記のように、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに転換され得る。３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡは、図３０に示されるように、上記のようにアルコールトランスフェラーゼを、詳細にはメチルトランスフェラーゼを用いて、３−ヒドロキシイソブチレートメチルエステルに転換され得る（実施例ＩＩＩを参照；また、ＷＯ／２００７／０３９４１５および米国特許第７，９０１，９１５号も参照）。３−ヒドロキシイソブチレートメチルエステルは、デヒドラターゼによって、または化学的転換によって、例えば、メタクリレートのメタクリレートエステルへの転換について上記されるように（図２を参照）、メチルメタクリレートに転換され得る。例示的なデヒドラターゼとしては、上記のもの、例えば実施例Ｖ、ＶＩ、ＸおよびＸＩＩに記載されるものが挙げられる。
ＣｏＡ部分の除去の下で、本明細書中で規定されるようなアルコール開始材料からのアルコール部分の（メタ）アクリリルＣｏＡへの転移をもたらすことが可能な酵素、例えば、トランスフェラーゼ（ＥＣ２）またはヒドロラーゼ（ＥＣ３）クラスの酵素、例えば、リパーゼ、エステラーゼ（例えば、アセチルコリンエステラーゼ）、トランスフェラーゼ（例えば、コリンアセチルトランスフェラーゼ）、プロテアーゼまたはアシラーゼ（例えば、アミノアシラーゼ）をコードする核酸（特に、ＤＮＡ）（１つ以上のこのような酵素のコーディングを含む）。
ＥＣグループ２の酵素（すなわち、トランスフェラーゼ）としては、例えば、トランスアミナーゼ、トランスアミダーゼ、トランスケトラーゼ、トランスホスホリラーゼ、またはコリンアセチルトランスフェラーゼが挙げられ、これらは、１つの化合物から他の化合物への化学基の移動を触媒することが公知である。ＥＣクラス３；トランスエステル化反応を触媒し得るヒドロラーゼであって、例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｔｉｃａに由来するリパーゼ（ＣＡＬ Ｂ）、ブタ膵臓リパーゼ（ＰＰＬ）、Ｃａｎｄｉｄ ｒｕｇｏｓａ（ＣＲＬ）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ（ＰＣＬ）など；エステラーゼ、例えばブタ肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ）アセチルコリンエステラーゼ；また、スブチリシンなどのプロテアーゼ、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種．、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ種由来のプロテアーゼが挙げられ、他のヒドロラーゼ、例えばペニリシンアミダーゼまたは、例えば、Ｌ−アミノアシラーゼが、転移を触媒するための好適な酵素であり得る。
これらの酵素は、細菌などの原核生物、真核生物またはより高等な生物体に由来し得、例えば、Ｃａｎｄｉｄａ種由来のリパーゼ、哺乳動物細胞由来のエステラーゼまたはコリンアセチルトランスフェラーゼであり得、これらは、このような反応のために供給され得る。あるいは、これは、バイオマスに由来する適切な開始材料から生合成的に産生され得る。
この実施例はメチルメタクリレートへの転換を記載するが、当業者は、他のメタクリレートエステルが、類似の経路を用い、所望のエステルのために適切なトランスフェラーゼを選択して、作製され得ることを、理解する。
（実施例ＸＸＶ）
３−ヒドロキシイソブチレート、２−ヒドロキシイソブチレート、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡまたは２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡの、メタクリレートエステルへの転換
この実施例は、３−ヒドロキシイソブチレート、２−ヒドロキシイソブチレート、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡまたは２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡの、メタクリレートエステルへの転換を記載する。
本明細書中に含まれる代替のシナリオは、以下である：
（１）Ａ．糖から３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡへ（酵素的、上記の経路）、Ｂ．アルコールトランスフェラーゼによる３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡから３−ヒドロキシイソブチレートエステルへ、Ｃ．デヒドラターゼ酵素または化学的転換による、３−ヒドロキシイソブチレートエステルからメタクリレートエステルへ
（２）Ａ．糖から２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡへ（酵素的、上記の経路）、Ｂ．アルコールトランスフェラーゼによる２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡから２−ヒドロキシイソブチレートエステルへ、Ｃ．デヒドラターゼ酵素または化学的転換による、２−ヒドロキシイソブチレートエステルからメタクリレートエステルへ
（３）Ａ．糖から３−ヒドロキシイソブチレートへ（酵素的、上記の経路）、Ｂ．３−ヒドロキシイソブチレートエステル形成酵素による、３−ヒドロキシイソブチレートから３−ヒドロキシイソブチレートエステルへ、Ｃ．デヒドラターゼ酵素または化学的転換による、３−ヒドロキシイソブチレートエステルからメタクリレートエステルへ
（４）Ａ．糖から２−ヒドロキシイソブチレートへ（酵素的、上記の経路）、Ｂ．２−ヒドロキシイソブチレートエステル形成酵素による、２−ヒドロキシイソブチレートから２−ヒドロキシイソブチレートエステルへ、Ｃ．デヒドラターゼ酵素または化学的転換による、２−ヒドロキシイソブチレートエステルからメタクリレートエステルへ
（５）Ａ．生物体に供給された外因性３−ヒドロキシイソブチレート（別の生物体の産物（すなわち、共培養または分離発酵（ｓｅｐａｒａｔｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ））であってもよく、または、他の供給源由来でもよい）、Ｂ．３−ヒドロキシイソブチレートエステル形成酵素による、３−ヒドロキシイソブチレートから２−ヒドロキシイソブチレートエステルへ、Ｃ．デヒドラターゼ酵素または化学的転換による、３−ヒドロキシイソブチレートエステルからメタクリレートエステルへ
（６）Ａ．生物体に供給された外因性３−ヒドロキシイソブチレート（別の生物体の産物（すなわち、共培養または分離発酵）であってもよく、または、他の供給源由来でもよい）、Ｂ．ＣｏＡトランスフェラーゼまたはシンテターゼによる、３−ヒドロキシイソブチレートから３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡへ、Ｃ．アルコールトランスフェラーゼ酵素による３−ヒドロキシイソブチレートエステルの形成、Ｃ．デヒドラターゼ酵素または化学的転換による、３−ヒドロキシイソブチレートエステルからメタクリレートエステルへ
（７）Ａ．生物体に供給された外因性２−ヒドロキシイソブチレート（別の生物体の産物（すなわち、共培養または分離発酵）であってもよく、または、他の供給源由来でもよい）、Ｂ．２−ヒドロキシイソブチレートエステル形成酵素による２−ヒドロキシイソブチレートから２−ヒドロキシイソブチレートエステルへ、Ｃ．デヒドラターゼ酵素または化学的転換による、２−ヒドロキシイソブチレートエステルからメタクリレートエステルへ
（８）Ａ．生物体に供給された外因性２−ヒドロキシイソブチレート（別の生物体の産物（すなわち、共培養または分離発酵）であってもよく、または、他の供給源由来でもよい）、Ｂ．ＣｏＡトランスフェラーゼまたはシンテターゼによる、２−ヒドロキシイソブチレートから２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡへ、Ｃ．アルコールトランスフェラーゼ酵素による、２−ヒドロキシイソブチレートエステルの形成、Ｃ．デヒドラターゼ酵素または化学的転換による２−ヒドロキシイソブチレートエステルからメタクリレートエステルへ
３−ヒドロキシブチレート、２−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡおよび２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡからメタクリレートエステルへの経路は、図２８および２９において示されている。これらのメタクリレートエステル前駆体への例示的な経路は、本出願において先に記載されており、図３、５および８において示されている。３−ヒドロキシブチレートは、図３において示される経路によってスクシニルＣｏＡから形成され得るか、図５に示されるように４−ヒドロキシブチリルＣｏＡから形成され得る。３−ヒドロキシブチリルＣｏＡは、図５において示される経路によって４−ヒドロキシブチリルＣｏＡから形成され得る。２−ヒドロキシイソブチレートおよび２−ヒドロキシブチリルＣｏＡは、図８に記載される経路によって形成され得る。
２−ヒドロキシイソブチレートおよびそのＣｏＡエステルである、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡは、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼまたは２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼによって相互転換され得る。同様に、３−ヒドロキシイソブチレートおよびそのＣｏＡエステルである、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡは、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼによって相互転換され得る。例示的なＣｏＡトランスフェラーゼおよびシンテターゼ酵素は、実施例ＩおよびＶＩＩにおいて記載される。
３−ヒドロキシイソ酪酸エステルのメタクリル酸エステルへの脱水は、３−ヒドロキシイソ酪酸のメタクリル酸への脱水と類似の条件下で行い得る。これらの反応条件は、温和である（参照：米国特許出願第２０１０００６８７７３号）。
２−ヒドロキシイソブチレートエステルのメタクリレートエステルへの化学的脱水は、２−ヒドロキシイソ酪酸のメタクリル酸への脱水と類似であり、これは、例えば米国特許第３，６６６，８０５号および同第５，２２５，５９４号において開示される。これらの参照文献において、２−ヒドロキシイソ酪酸は、金属酸化物および水酸化物、イオン交換樹脂、アルミナ、シリカ、アミン、ホスフィン、アルカリ金属アルコキシドまたはカルボキシレートを反応温度（典型的には、１６０〜２５０℃の間）で用いて、脱水する。１つの方法において（米国特許第５，２２５，５９４号）、２−ヒドロキシイソ酪酸および水酸化ナトリウムを、１８５〜１９５℃にて真空下（３００ｔｏｒｒ）で撹拌しながら反応させ、２−ヒドロキシイソ酪酸の９７．１％の転換およびメタクリル酸の９６％の収率を得た。類似のアプローチは、２−ヒドロキシイソ酪酸エステルをメタクリル酸エステルに脱水するために適用され得る。
本出願を通して、種々の刊行物が、参照されている。これらの刊行物の開示は、ＧｅｎＢａｎｋおよびＧＩ番号公開を含めて、その全体が、本発明が属する分野の技術水準をより完全に記載するために、本出願において本明細書中で参考として組み込まれる。本発明は、上で提供された実施例を参照して記載されているが、種々の変更は、本発明の趣旨から逸脱することなくなされ得ることが理解されるべきである。

Claims (46)

  1. メタクリル酸経路を有する、天然に存在しない微生物体であって、該微生物体は、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、該メタクリル酸経路が、
    （ａ）シトラマル酸シンターゼ、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｂ）シトラマル酸シンターゼ、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、シトラコン酸イソメラーゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｃ）シトラマル酸シンターゼ、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、シトラコン酸イソメラーゼ、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｄ）シトラマル酸シンターゼ、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｅ）シトラマリルＣｏＡリアーゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｆ）シトラマリルＣｏＡリアーゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、シトラコン酸イソメラーゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｇ）シトラマリルＣｏＡリアーゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｈ）シトラマリルＣｏＡリアーゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、シトラコン酸イソメラーゼ、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｉ）アコニット酸デカルボキシラーゼ、イタコン酸イソメラーゼ、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｊ）アコニット酸デカルボキシラーゼ、イタコン酸イソメラーゼ、シトラコン酸イソメラーゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｋ）アコニット酸デカルボキシラーゼ、イタコニルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、シトラマリルＣｏＡデヒドラターゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｌ）アコニット酸デカルボキシラーゼ、イタコニルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、シトラマリルＣｏＡデヒドラターゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、シトラコン酸イソメラーゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｍ）アコニット酸デカルボキシラーゼ、イタコニルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、シトラマリルＣｏＡデヒドラターゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｎ）アコニット酸デカルボキシラーゼ、イタコニルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、シトラマリルＣｏＡデヒドラターゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、シトラコン酸イソメラーゼ、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｏ）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、クロトナーゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ；ならびに
    （ｐ）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、クロトナーゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼ
    から選択される経路を含む、微生物体。
  2. それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする、２、３、４、５、６または７つの外因性核酸を含む、請求項１に記載の天然に存在しない微生物体。
  3. （ａ）〜（ｐ）から選択される前記経路のうちの少なくとも１つの前記酵素のそれぞれをコードする外因性核酸を含む、請求項２に記載の天然に存在しない微生物体。
  4. 請求項１に記載の天然に存在しない微生物体であって、メタクリレートエステルを生成するのに十分な量で発現されるメタクリレートエステル経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むメタクリレートエステル経路をさらに含み、該メタクリレートエステル経路が、メタクリリルＣｏＡシンテターゼ、メタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼ、およびアルコールトランスフェラーゼを含む、微生物体。
  5. それぞれメタクリレートエステル経路の酵素をコードする２または３つの外因性核酸を含む、請求項４に記載の天然に存在しない微生物体。
  6. 前記３つの外因性核酸が、メタクリリルＣｏＡシンテターゼ、メタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼ、およびアルコールトランスフェラーゼをコードする、請求項４に記載の天然に存在しない微生物体。
  7. メタクリレートエステル経路を有する、天然に存在しない微生物体であって、メタクリレートエステルを生成するのに十分な量で発現されるメタクリレートエステル経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、該メタクリレートエステル経路がメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼを含む、微生物体。
  8. 前記メタクリレートエステル経路が、メタクリリルＣｏＡシンテターゼおよびアルコールトランスフェラーゼをさらに含む、請求項７に記載の天然に存在しない微生物体。
  9. それぞれメタクリレートエステル経路の酵素をコードする２または３つの外因性核酸を含む、請求項７に記載の天然に存在しない微生物体。
  10. 前記３つの外因性核酸が、メタクリリルＣｏＡシンテターゼ、メタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼ、およびアルコールトランスフェラーゼをコードする、請求項７に記載の天然に存在しない微生物体。
  11. 請求項７に記載の天然に存在しない微生物体であって、
    （ａ）シトラマル酸シンターゼ、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｂ）シトラマル酸シンターゼ、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、シトラコン酸イソメラーゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｃ）シトラマル酸シンターゼ、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、シトラコン酸イソメラーゼ、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｄ）シトラマル酸シンターゼ、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｅ）シトラマリルＣｏＡリアーゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｆ）シトラマリルＣｏＡリアーゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、シトラコン酸イソメラーゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｇ）シトラマリルＣｏＡリアーゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｈ）シトラマリルＣｏＡリアーゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、シトラコン酸イソメラーゼ、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｉ）アコニット酸デカルボキシラーゼ、イタコン酸イソメラーゼ、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｊ）アコニット酸デカルボキシラーゼ、イタコン酸イソメラーゼ、シトラコン酸イソメラーゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｋ）アコニット酸デカルボキシラーゼ、イタコニルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、シトラマリルＣｏＡデヒドラターゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｌ）アコニット酸デカルボキシラーゼ、イタコニルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、シトラマリルＣｏＡデヒドラターゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、シトラコン酸イソメラーゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｍ）アコニット酸デカルボキシラーゼ、イタコニルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、シトラマリルＣｏＡデヒドラターゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｎ）アコニット酸デカルボキシラーゼ、イタコニルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、シトラマリルＣｏＡデヒドラターゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、シトラコン酸イソメラーゼ、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｏ）３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ；
    （ｐ）メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ；
    （ｑ）メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ；
    （ｒ）メチルマロニルＣｏＡムターゼ、アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ；
    （ｓ）メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ；
    （ｔ）メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−アミノ−２−メチルプロピオン酸トランスアミナーゼ、および３−アミノ−２−メチルプロピオン酸アンモニアリアーゼ；
    （ｕ）メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−アミノ−２−メチルプロピオン酸トランスアミナーゼ、および３−アミノ−２−メチルプロピオン酸アンモニアリアーゼ；
    （ｖ）４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ；
    （ｗ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、グルタミン酸ムターゼ、３−メチルアスパルターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｘ）アルファ−ケトグルタル酸レダクターゼ、２−ヒドロキシグルタミン酸ムターゼ、３−メチルリンゴ酸デヒドラターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｙ）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡシンテターゼ；
    （ｚ）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、エノイルＣｏＡヒドラターゼ、および３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ；
    （ａａ）４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、ビニルアセチルＣｏＡ Δ−イソメラーゼ、クロトナーゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼのいずれか；
    （ｂｂ）４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼ；
    （ｃｃ）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、クロトナーゼ、ブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、イソブチリルＣｏＡムターゼ、イソブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、およびメタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼ；
    （ｄｄ）乳酸デヒドロゲナーゼ、乳酸ＣｏＡトランスフェラーゼ、ラクトイルＣｏＡデヒドラターゼ、アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ；
    （ｅｅ）バリンアミノトランスフェラーゼ、２−ケトイソ吉草酸デヒドロゲナーゼ、イソブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、およびメタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼ；
    （ｆｆ）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、クロトナーゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ；ならびに
    （ｇｇ）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、クロトナーゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼ
    から選択されるメタクリル酸経路をさらに含む、微生物体。
  12. メタクリル酸経路を有する、天然に存在しない微生物体であって、メタクリル酸を生成するのに十分な量で発現されるメタクリル酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み；
    （ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、該少なくとも１つの外因性核酸が、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、または必要に応じて、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニターゼ、シトリルＣｏＡシンテターゼもしくはシトリルＣｏＡリアーゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；
    （ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、該少なくとも１つの外因性核酸が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；あるいは
    （ｉｉｉ）少なくとも１つの外因性核酸が、ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼ、およびそれらの組合せから選択される酵素をコードすること
    をさらに含み；
    該メタクリル酸経路が、
    （ａ）シトラマル酸シンターゼ、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｂ）シトラマル酸シンターゼ、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、シトラコン酸イソメラーゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｃ）シトラマル酸シンターゼ、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、シトラコン酸イソメラーゼ、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｄ）シトラマル酸シンターゼ、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｅ）シトラマリルＣｏＡリアーゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｆ）シトラマリルＣｏＡリアーゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、シトラコン酸イソメラーゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｇ）シトラマリルＣｏＡリアーゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｈ）シトラマリルＣｏＡリアーゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、シトラコン酸イソメラーゼ、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｉ）アコニット酸デカルボキシラーゼ、イタコン酸イソメラーゼ、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｊ）アコニット酸デカルボキシラーゼ、イタコン酸イソメラーゼ、シトラコン酸イソメラーゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｋ）アコニット酸デカルボキシラーゼ、イタコニルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、シトラマリルＣｏＡデヒドラターゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｌ）アコニット酸デカルボキシラーゼ、イタコニルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、シトラマリルＣｏＡデヒドラターゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、（シトラコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、シトラコン酸イソメラーゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｍ）アコニット酸デカルボキシラーゼ、イタコニルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、シトラマリルＣｏＡデヒドラターゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｎ）アコニット酸デカルボキシラーゼ、イタコニルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、シトラマリルＣｏＡデヒドラターゼ、シトラマリルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、（メサコネートを形成する）シトラマル酸デヒドラターゼ、シトラコン酸イソメラーゼ、およびシトラコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｏ）３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ；
    （ｐ）メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ；
    （ｑ）メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ；
    （ｒ）メチルマロニルＣｏＡムターゼ、アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ；
    （ｓ）メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ；
    （ｔ）メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−アミノ−２−メチルプロピオン酸トランスアミナーゼ、および３−アミノ−２−メチルプロピオン酸アンモニアリアーゼ；
    （ｕ）メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−アミノ−２−メチルプロピオン酸トランスアミナーゼ、および３−アミノ−２−メチルプロピオン酸アンモニアリアーゼ；
    （ｖ）４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ；
    （ｗ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、グルタミン酸ムターゼ、３−メチルアスパルターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｘ）アルファ−ケトグルタル酸レダクターゼ、２−ヒドロキシグルタミン酸ムターゼ、３−メチルリンゴ酸デヒドラターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ；
    （ｙ）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡシンテターゼ；
    （ｚ）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、エノイルＣｏＡヒドラターゼ、および３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ；
    （ａａ）４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、ビニルアセチルＣｏＡ Δ−イソメラーゼ、クロトナーゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼのいずれか；
    （ｂｂ）４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼ；
    （ｃｃ）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、クロトナーゼ、ブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、イソブチリルＣｏＡムターゼ、イソブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、およびメタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼ；
    （ｄｄ）乳酸デヒドロゲナーゼ、乳酸ＣｏＡトランスフェラーゼ、ラクトイルＣｏＡデヒドラターゼ、アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ；
    （ｅｅ）バリンアミノトランスフェラーゼ、２−ケトイソ吉草酸デヒドロゲナーゼ、イソブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、およびメタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼ；
    （ｆｆ）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、クロトナーゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、および３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ；ならびに
    （ｇｇ）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、クロトナーゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼ
    から選択される経路を含む、
    微生物体。
  13. それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする２、３、４、５、６または７つの外因性核酸を含む、請求項１２に記載の天然に存在しない微生物体。
  14. （ａ）〜（ｇｇ）から選択される前記経路のうちの少なくとも１つの前記酵素のそれぞれをコードする外因性核酸を含む、請求項１３に記載の天然に存在しない微生物体。
  15. ２−ヒドロキシイソ酪酸経路を有する、天然に存在しない微生物体であって、２−ヒドロキシイソ酪酸を生成するのに十分な量で発現される２−ヒドロキシイソ酪酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み；
    （ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、該少なくとも１つの外因性核酸が、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、または必要に応じて、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニターゼ、シトリルＣｏＡシンテターゼもしくはシトリルＣｏＡリアーゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；
    （ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、該少なくとも１つの外因性核酸が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；あるいは
    （ｉｉｉ）少なくとも１つの外因性核酸が、ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼ、およびそれらの組合せから選択される酵素をコードすること
    をさらに含み；
    該２−ヒドロキシイソ酪酸経路が、
    （ａ）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、および２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼまたは２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼ、または２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼ；ならびに
    （ｂ）４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、ビニルアセチルＣｏＡ Δ−イソメラーゼ、クロトナーゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、および２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼまたは２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼのいずれか
    から選択される経路を含む、
    微生物体。
  16. それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする２、３、４または５つの外因性核酸を含む、請求項１５に記載の天然に存在しない微生物体。
  17. （ａ）〜（ｂ）から選択される前記経路のうちの少なくとも１つの前記酵素のそれぞれをコードする外因性核酸を含む、請求項１５に記載の天然に存在しない微生物体。
  18. ３−ヒドロキシイソ酪酸経路を有する、天然に存在しない微生物体であって、３−ヒドロキシイソ酪酸を生成するのに十分な量で発現される３−ヒドロキシイソ酪酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み；
    （ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、該少なくとも１つの外因性核酸が、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、または必要に応じて、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニターゼ、シトリルＣｏＡシンテターゼもしくはシトリルＣｏＡリアーゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；
    （ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、該少なくとも１つの外因性核酸が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；あるいは
    （ｉｉｉ）少なくとも１つの外因性核酸が、ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼ、およびそれらの組合せから選択される酵素をコードすること
    をさらに含み；
    該３−ヒドロキシイソ酪酸経路が、
    （ａ）４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ；ならびに
    （ｂ）４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼおよび３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ；
    から選択される経路を含む、
    微生物体。
  19. それぞれメタクリル酸経路の酵素をコードする２つの外因性核酸を含む、請求項１８に記載の天然に存在しない微生物体。
  20. （ａ）〜（ｂ）から選択される前記経路のうちの少なくとも１つの前記酵素のそれぞれをコードする外因性核酸を含む、請求項１８に記載の天然に存在しない微生物体。
  21. ３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡ経路を有する、天然に存在しない微生物体であって、３−ヒドロキシイソ酪酸を生成するのに十分な量で発現される３−ヒドロキシイソ酪酸経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み；
    （ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、該少なくとも１つの外因性核酸が、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、または必要に応じて、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニターゼ、シトリルＣｏＡシンテターゼもしくはシトリルＣｏＡリアーゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；
    （ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、前記少なくとも１つの外因性核酸が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；あるいは
    （ｉｉｉ）少なくとも１つの外因性核酸が、ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼ、およびそれらの組合せから選択される酵素をコードすること
    をさらに含み；
    該３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡ経路が４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼを含む、
    微生物体。
  22. メタクリレートエステル経路を有する、天然に存在しない微生物体であって、メタクリレートエステルを生成するのに十分な量で発現されるメタクリレートエステル経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、該メタクリレートエステル経路が、アルコールトランスフェラーゼまたはエステルを形成する酵素、およびデヒドラターゼを含む、微生物体。
  23. それぞれメタクリレートエステル経路の酵素をコードする２つの外因性核酸を含む、請求項２２に記載の天然に存在しない微生物体。
  24. 前記２つの外因性核酸が、アルコールトランスフェラーゼおよびデヒドラターゼ、またはエステルを形成する酵素およびデヒドラターゼをコードする、請求項２２に記載の天然に存在しない微生物体。
  25. 前記デヒドラターゼが、３−ヒドロキシイソブチレートエステルもしくは２−ヒドロキシイソブチレートエステルを前記メタクリレートエステルに転換する；または前記アルコールトランスフェラーゼが、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡを３−ヒドロキシイソブチレートエステルに転換するか、もしくは２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡを２−ヒドロキシイソブチレートエステルに転換する、請求項２２に記載の天然に存在しない微生物体。
  26. 請求項２２に記載の天然に存在しない微生物体であって、
    （ａ）３−ヒドロキシイソ酪酸ＣｏＡトランスフェラーゼもしくは３−ヒドロキシイソ酪酸ＣｏＡシンテターゼ；アルコールトランスフェラーゼ；およびデヒドラターゼ；
    （ｂ）３−ヒドロキシイソブチレートエステルを形成する酵素およびデヒドラターゼ；
    （ｃ）２−ヒドロキシイソ酪酸ＣｏＡトランスフェラーゼもしくは２−ヒドロキシイソ酪酸ＣｏＡシンテターゼ；アルコールトランスフェラーゼ；およびデヒドラターゼ；または
    （ｄ）２−ヒドロキシイソブチレートエステルを形成する酵素およびデヒドラターゼ
    を含むメタクリレートエステル経路を含む、
    微生物体。
  27. メチルメタクリレート経路を有する、天然に存在しない微生物体であって、メチルメタクリレートを生成するのに十分な量で発現されるメチルメタクリレート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、該メチルメタクリレート経路が、アルコールトランスフェラーゼまたはエステルを形成する酵素、およびデヒドラターゼを含む、微生物体。
  28. それぞれメチルメタクリレート経路の酵素をコードする２つの外因性核酸を含む、請求項２７に記載の天然に存在しない微生物体。
  29. 前記２つの外因性核酸が、アルコールトランスフェラーゼおよびデヒドラターゼ、またはエステルを形成する酵素およびデヒドラターゼをコードする、請求項２７に記載の天然に存在しない微生物体。
  30. 請求項７から１１および請求項２１から２９のいずれかに記載の天然に存在しない微生物体であって、
    （ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、該少なくとも１つの外因性核酸が、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、または必要に応じて、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニターゼ、シトリルＣｏＡシンテターゼもしくはシトリルＣｏＡリアーゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；
    （ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、該少なくとも１つの外因性核酸が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；あるいは
    （ｉｉｉ）少なくとも１つの外因性核酸が、ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼ、およびそれらの組合せから選択される酵素をコードすること
    をさらに含む、微生物体。
  31. 請求項１２、１５、１８、２１または３０のいずれかに記載の天然に存在しない微生物体であって、
    （ｉ）を含む該微生物体が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニルＣｏＡシンテターゼ、スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチルＣｏＡシンテターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシン、およびそれらの組合せから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む、微生物体。
  32. 請求項１２、１５、１８、２１または３０のいずれかに記載の天然に存在しない微生物体であって、
    （ｉｉ）を含む該微生物体が、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニルＣｏＡシンテターゼ、スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、およびそれらの組合せから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む、微生物体。
  33. それぞれ（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）の酵素をコードする２、３、４または５つの外因性核酸を含む、請求項１２、１５、１８、２１または３０のいずれかに記載の天然に存在しない微生物体。
  34. 請求項１２、１５、１８、２１または３０のいずれかに記載の天然に存在しない微生物体（ｏｒｇｎａｉｓｍ）であって、
    （ｉ）を含む該微生物体が、ＡＴＰクエン酸リアーゼもしくはクエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする３つの外因性核酸を含むか；
    （ｉｉ）を含む該微生物体が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼもしくはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼをコードする４つの外因性核酸を含むか；または
    （ｉｉｉ）を含む該微生物体が、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼをコードする２つの外因性核酸を含む、
    微生物体。
  35. 請求項１から３４のいずれかに記載の天然に存在しない微生物体であって、
    前記少なくとも１つの外因性核酸が、異種の核酸であるか、または該天然に存在しない微生物体が、実質的に嫌気性の培地中にある、微生物体。
  36. メタクリレートエステルを生成するための方法であって、３−ヒドロキシイソブチレートエステル、２−ヒドロキシイソブチレートエステルまたはメチル−３−ヒドロキシイソブチレートを生成する条件下および３−ヒドロキシイソブチレートエステル、２−ヒドロキシイソブチレートエステルまたはメチル−３−ヒドロキシイソブチレートを生成するのに十分な期間、天然に存在しない微生物体を培養する工程であって、該天然に存在しない微生物体が、３−ヒドロキシイソブチレートエステル、２−ヒドロキシイソブチレートエステルまたはメチル−３−ヒドロキシイソブチレートを生成するのに十分な量で発現される外因性核酸であって、アルコールトランスフェラーゼ；または３−ヒドロキシイソブチレートエステルを形成する酵素、２−ヒドロキシイソブチレートエステルを形成する酵素もしくはメチル−３−ヒドロキシイソブチレートエステルを形成する酵素をコードする外因性核酸を含む、工程と、該３−ヒドロキシイソブチレートエステルもしくは２−ヒドロキシイソブチレートエステルを化学的に脱水してメタクリレートエステルを生成する工程または該メチル−３−ヒドロキシイソブチレートを化学的に脱水してメチルメタクリレートを生成する工程、とを含む方法。
  37. 前記微生物体が、
    （ａ）３−ヒドロキシイソ酪酸ＣｏＡトランスフェラーゼもしくは３−ヒドロキシイソ酪酸ＣｏＡシンテターゼ；およびアルコールトランスフェラーゼ；または
    （ｂ）３−ヒドロキシイソブチレートエステルを形成する酵素
    を含む３−ヒドロキシイソブチレートエステル経路；あるいは
    （ａ）２−ヒドロキシイソ酪酸ＣｏＡトランスフェラーゼもしくは２−ヒドロキシイソ酪酸ＣｏＡシンテターゼ；およびアルコールトランスフェラーゼ；または
    （ｂ）２−ヒドロキシイソブチレートエステルを形成する酵素
    を含む２−ヒドロキシイソブチレートエステル経路
    を含む、請求項３６に記載の方法。
  38. メタクリレートエステルを生成するための方法であって、３−ヒドロキシイソブチレートエステル、２−ヒドロキシイソブチレートエステルまたはメチル−３−ヒドロキシイソブチレートを生成する条件下および３−ヒドロキシイソブチレートエステル、２−ヒドロキシイソブチレートエステルまたはメチル−３−ヒドロキシイソブチレートを生成するのに十分な期間、天然に存在しない微生物体を培養する工程であって、該天然に存在しない微生物体が、３−ヒドロキシイソブチレートエステル、２−ヒドロキシイソブチレートエステルまたはメチル−３−ヒドロキシイソブチレートを生成するのに十分な量で発現される外因性核酸であって、アルコールトランスフェラーゼ；または３−ヒドロキシイソブチレートエステルを形成する酵素、２−ヒドロキシイソブチレートエステルを形成する酵素もしくはメチル−３−ヒドロキシイソブチレートエステルを形成する酵素をコードする外因性核酸を含み、該天然に存在しない微生物体が、
    （ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、該少なくとも１つの外因性核酸が、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、または必要に応じて、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニターゼ、シトリルＣｏＡシンテターゼもしくはシトリルＣｏＡリアーゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；
    （ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む還元的ＴＣＡ経路であって、該少なくとも１つの外因性核酸が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；あるいは
    （ｉｉｉ）ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼ、およびそれらの組合せから選択される酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸
    をさらに含む、工程と、
    該３−ヒドロキシイソブチレートエステルまたは２−ヒドロキシイソブチレートエステルを化学的に脱水してメタクリレートエステルを生成する工程；または該メチル−３−ヒドロキシイソブチレートを化学的に脱水してメチルメタクリレートを生成する工程、
    とを含む方法。
  39. 前記微生物体が、
    （ａ）３−ヒドロキシイソ酪酸ＣｏＡトランスフェラーゼもしくは３−ヒドロキシイソ酪酸ＣｏＡシンテターゼ；およびアルコールトランスフェラーゼ；または
    （ｂ）３−ヒドロキシイソブチレートエステルを形成する酵素
    を含む３−ヒドロキシイソブチレートエステル経路；あるいは
    （ａ）２−ヒドロキシイソ酪酸ＣｏＡトランスフェラーゼもしくは２−ヒドロキシイソ酪酸ＣｏＡシンテターゼ；およびアルコールトランスフェラーゼ；または
    （ｂ）２−ヒドロキシイソブチレートエステルを形成する酵素
    を含む２−ヒドロキシイソブチレートエステル経路
    を含む、請求項３８に記載の方法。
  40. 請求項３８または３９のいずれかに記載の方法であって、
    （ｉ）を含む前記微生物体が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニルＣｏＡシンテターゼ、スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチルＣｏＡシンテターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシン、およびそれらの組合せから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む、方法。
  41. 請求項３８または３９のいずれかに記載の方法であって、
    （ｉｉ）を含む前記微生物体が、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニルＣｏＡシンテターゼ、スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、およびそれらの組合せから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む、方法。
  42. 請求項３８または３９のいずれかに記載の方法であって、
    （ｉ）を含む前記微生物体が、ＡＴＰクエン酸リアーゼもしくはクエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする３つの外因性核酸を含むか；
    （ｉｉ）を含む前記微生物体が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼもしくはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼをコードする４つの外因性核酸を含むか；または
    （ｉｉｉ）を含む前記微生物体が、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼをコードする２つの外因性核酸を含む、
    方法。
  43. メタクリル酸を生成するための方法であって、メタクリル酸を生成する条件下およびメタクリル酸を生成するのに十分な期間、請求項１から６、請求項１２から１４または請求項３０から３５のいずれかに記載の天然に存在しない微生物体を培養する工程を含む方法。
  44. メタクリレートエステルを生成するための方法であって、メタクリレートエステルを生成する条件下およびメタクリレートエステルを生成するのに十分な期間、請求項７から１１、請求項２２から２９または請求項３０から３５のいずれかに記載の天然に存在しない微生物体を培養する工程を含む方法。
  45. ２−ヒドロキシイソ酪酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡを生成するための方法であって、２−ヒドロキシイソ酪酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡを生成する条件下および２−ヒドロキシイソ酪酸、３−ヒドロキシイソ酪酸または３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡを生成するのに十分な期間、請求項１５から２１または請求項３０から３５のいずれかに記載の天然に存在しない微生物体を培養する工程を含む方法。
  46. 前記外因性核酸の少なくとも１つが、異種の核酸であるか；または前記天然に存在しない微生物体が、実質的に嫌気性の培地中にある、請求項３６から４５のいずれか一項に記載の方法。
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