KR101244836B1 - 신규한 니트치아 푸실라 균주 및 그 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 니트치아 푸실라 YSW06 (Nitzschia cf . pusilla YSW06) 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 상기 니트치아 푸실라 YSW06 균주는 지질 함유량이 높아서 바이오디젤 생산에 매우 효과적이고, 또한 폐수 내성이 강하고 폐수 내 질소와 인을 제거할 수 있으므로 폐수 처리와 동시에 바이오 에너지 생산이 가능하다는 이점을 갖는다.
Description
본 발명은 폐수 내성 및 지질 함량이 높은 신규한 니트치아 푸실라 YSW06 (Nitzschia cf . pusilla YSW06)[기탁번호 KCTC11763BP] 균주 및 그 용도에 관한 것이다.
인류의 급격한 인구 증가 및 산업화에 따라 이산화탄소, 메탄, 프레온가스 등의 발생량 증가로 지구온난화가 가속화 되고 있다 [Mata, T.M., Martins, A.A., Caetano, N.S. 2010. Microalgae for biodiesel production and other applications: A review. Renew. Sust. Energ. Rev. 14: 217-232]. 또한, 화석연료의 고갈에 따른 대체 청정에너지 연료 즉, 신재생에너지의 개발이 시급한 실정이다. 신재생에너지 중 바이오매스는 환경에 무해 그리고 무한한 자원으로서 대체에너지원으로 각광받고 있다 [Widjaja, A., Chao-Chang Chien, Yi-Hsu Ju. 2009. Study of increasing lipid production from fresh water microalgae Chlorella vulgaris. J. Taiwan Inst. Chem. Eng. 40: 13-20].
기존 바이오매스 에너지원으로 주로 콩, 사탕수수 등에서, 트리글리세리드 오일 (triglyceride oil)과 모노하이드릭 알콜 (monohydric alcohols)로 바이오디젤을 회수했지만 광대한 면적 대비 바이오디젤 생산효율이 낮아 어려움에 직면하고 있다 [Lang, X., Dalai, A.K., Bakhshi, N.N., Reaney, M.J., Hertz, P.B., 2002. Preparation and characterization of biodiesels from various Bio-Oils. Biores. Technol. 80: 53-62].
따라서, 최근 바이오디젤을 경제적이고 안정적으로 생산할 수 있는 미세조류의 연구가 활발히 진해되고 있으며 이의 장점들은 다음과 같다. 1) 조류의 성장 시 태양광원 및 물, 대기 중 이산화탄소만으로 성장이 가능하여 경제적임. 2) 계속적으로 CO2를 고정시켜 탄소원을 이용 후 산소를 배출함. 3) 타 곡물류 보다 dry biomass (특정 조류는 건조시 50-60 %의 지질을 함유)당 lipid 생산율이 15~300배 높음 [Miller, S., 2010. Minimizing land use and nitrogen intensity of bio-energy. Environ. Sci. & Technol. 44: 3932-3939].
하지만, 현재까지 바이오연료 생산 연구는 해양조류를 중심으로 이루어졌으며, 질소와 인의 인위적 주입이란 단점을 가지고 있다. 최근 미세조류의 성장을 위해 질소와 인의 근원을 축산폐수 및 하·폐수에서 얻는 연구들이 진행되고 있는데, 현재 균주 은행에 기탁된 일반 미세조류 균주종은 폐수에서 생육 보고가 미미하며 지질 함량 및 생장 속도에 대한 자료가 부족하다. 따라서, 폐수 내성 종과 이 중 lipid 고함량 종을 확보한다면 조류를 이용한 신재생에너지 생산에 있어 경제적, 환경적으로 큰 이득이 될 것이다.
이에, 본 발명의 일례는 지질을 고함량으로 함유하는 신규한 니트치아 푸실라 (Nitzschia cf . pusilla) 균주를 제공한다.
다른 예는 상기 니트치아 푸실라 (Nitzschia cf . pusilla) 균주, 및 상기 균주의 배양물, 농축물 및 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 바이오디젤 생산용 조성물 및 이를 이용하여 바이오디젤을 생산하는 방법을 제공한다.
또 다른 예는 상기 니트치아 푸실라 (Nitzschia cf . pusilla) 균주를 포함하는 폐수 처리용 미생물제제 및 이를 이용하여 폐수로부터 인과 질소를 제거하는 폐수 처리 방법을 제공한다.
본 발명자들은 폐수에 대해 내성을 갖는 미세조류 균주를 확보하기 위해 다양한 종들을 이용한 연구를 진행하였다. 그 결과 폐수에 내성을 가지며, 폐수에서 성장이 빠르고, 인과 질소의 제거능이 우수하며, 바이오디젤 생산 물질인 지질 함량이 전체 건조 중량 대비 약 50 중량% (이 중에서 팔미트산 (C16:0)의 함량이 약 31중량%)의 미세조류 종을 자연 환경으로부터 분리하여 본 발명을 완성하였다. 상기 미세조류를 폐수에서 배양시, 폐수처리장에서 유입되는 하수 및 폐수 등을 기질로 사용하여 부영양화 및 중금속 제거 등의 환경오염 문제를 해결할 수 있고, 이와 같이 배양된 미세조류를 바이오디젤 생산용 원료로 활용하여 대체에너지 생산에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 일례는 새롭게 분리된 니트치아 푸실라 (Nitzschia cf . pusilla) 균주 제공한다.
상기 분리된 균주의 28s rDNA 염기서열을 분석하여 표준 균주들과 비교한 결과, 표준 균주 N. pusilla AF417663과 97%의 서열 유사성을 나타내어, 이 균주가 니트치아 푸실라 (Nitzschia cf . pusilla) 종에 속하는 신규한 균주임을 확인하였다.
상기 분리 동정된 신규한 균주를 니트치아 푸실라 YSW06라 명명하였으며, 2010년 9월 13일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁하여 기탁번호 (KCTC11763BP)를 부여받았다.
상기 균주는 고농도의 질소 및 인 조건 하에서도 생육이 가능하고, 폐수에서의 내성이 강하여, 폐수의 희석 배율을 크게 낮추지 않고도 배양이 가능하다. 특히, 하수, 폐수 환경 (N: 10 mg/L, P: 1.2 mg/L)에서 질소와 인의 제거 효율이 탁월하다.
또한, 이와 같이 폐수를 활용하여 배양한 상기 균주는 빠른 성장 속도와 동시에 균체 건조 중량 중의 지질 함유량이 48 중량% 이상, 바람직하게는 50 중량% 이상, 예컨대, 48 내지 60 중량%, 또는 50 내지 60 중량%인 것을 특징으로 한다. 또한 전체 지방산 중의 팔미틴산 함량이 30 중량% 이상, 바람직하게는 31중량% 이상, 예컨대 30 내지 40 중량%, 또는 31 내지 40 중량%인 것을 특징으로 한다. 지질은 바이오디젤의 생산 원료로 사용되며, 이 중에서도 팔미틴산이 바이오디젤의 생산 원료로서 특히 유용함을 고려할 때, 상기 균주는 바이오디젤 생산에 매우 유용하게 사용될 수 있다. 상기와 같은 지질 함유량은 통상적인 조류의 지질 분석 방법으로 분석할 수 있으며, 예컨대, Sulfophosphovanillin 법, Kunkel 법, Brugdon 법 등을 실시하여 추출된 지질을 분석할 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 예는 본 발명에서 새롭게 분리 동정된 니트치아 푸실라 (Nitzschia cf . pusilla) 균주의 바이오디젤 제조에 있어서 지질 공급 용도를 제공한다.
보다 구체적으로, 본 발명의 일례는 본 발명에서 새롭게 분리 동정된 니트치아 푸실라 (Nitzschia cf . pusilla) 균주, 이의 배양물, 및 상기 균주 또는 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 바이오디젤 생산용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 바이오디젤 제조에서 원료물질인 지질의 공급용 조성물로서 유용하다.
본 명세서에서 정의된 바에 따르면, 상기 배양물은 본 발명의 균주를 통상의 배지 (후술하는 배지 포함)에서 배양하여 얻어진 세포 함유 배양물을 의미하고, 상기 건조물은 상기 균주 또는 배양물을 건조시켜 얻어진 것이다. 상기 배지는 예컨대, KH2PO4, CaCl2·2H2O, MgSO4·7H2O, NaNO3, K2HPO4, NaCl, H3BO3 및 미량원소를 함유하는 배지일 수 있으며, 상기 미량원소는 ZnSO4·7H2O, MnCl2·4H2O, MoO3, CuSO4·5H2O, 및 Co(NO3)2·6H2O로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예는 바이오디젤 제조에 있어서, 반응기질로 사용되는 지질의 공급원으로서 상기 니트치아 푸실라 (Nitzschia cf . pusilla) 균주, 이의 배양물, 및 상기 균주 또는 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용하는 것을 특징으로 하는 바이오디젤 제조 방법을 제공한다.
지질 공급원으로 상기 균주, 이의 배양물, 및/또는 건조물을 사용하는 것을 제외한 다른 공정은 통상의 바이오디젤 제조 공정에 따르며, 촉매를 사용하는 화학적 공정 및 효소 또는 미생물을 이용하는 생물적 공정 모두에 적용 가능하다.
또한, 상기한 바와 같이, 상기 균주는 고농도의 질소 및 인 조건 하에서도 생육이 가능하고, 폐수에서의 내성이 강하며, 하수 또는 폐수 환경 (예컨대, N: 10 mg/L, P: 1.2 mg/L)에서 질소 및/또는 인의 제거 효율이 매우 탁월하다.
이러한 질소 및/또는 인 제거능에 근거하여, 본 발명의 다른 예는 본 발명에서 새롭게 분리 동정된 니트치아 푸실라 (Nitzschia cf . pusilla) 균주의 폐수 처리 용도를 제공한다.
보다 구체적으로, 본 발명의 일례는 상기 새롭게 분리 동정된 니트치아 푸실라 (Nitzschia cf . pusilla) 균주, 및/또는 상기 균주의 배양물을 포함하는 오수 처리용 미생물 제제를 제공한다.
또 다른 예는 오수에 니트치아 푸실라 (Nitzschia cf . pusilla) 균주 상기 균주의 배양물, 또는 이들 모두를 첨가하여 배양하는 단계를 포함하는 오수 처리 방법을 제공한다.
효과적이고 효율적인 질소 및/또는 인 제거를 위하여, 오수에 사용되는 상기 균주의 양은 1x107 내지 1x109 CFU/mL(오수 부피), 바람직하게는 1x108 내지 3x108 CFU/mL(오수 부피) 정도로 하는 것이 좋다.
본 명세서에서, 상기 오수는, 하폐수로도 표현되며, 하수와 폐수 등 질소와 인을 다량 포함하여 오염된 수질을 통칭하는 것으로, 각종 하수, 축산 폐수, 공업 폐수, 농업 폐수 등을 의미한다.
예컨대, 본 발명의 니트치아 푸실라 (Nitzschia cf . pusilla) 균주의 오수에의 이용은 다음과 같다. 국내의 하수종말처리장은 약 430여 개 이상으로 많은 양의 질소, 인의 성분이 그대로 수계에 방류된다. 기존 하수종말처리장의 질소, 인 제거는 물리, 화학, 생물학적 방법 등으로 다양하게 이용되나, 경제적 및 시간적 측면에서 많은 단점을 가지며, 제거 효율도 완벽하지 못하다는 문제점이 있다. 따라서, 조류 플랜트를 하수종말처리장 방류수 후단에 설치하면, 2차적 폐수처리와 동시에 조류 mass의 수확으로 바이오연료의 전환이 기대된다. 또한, 10 내지 20 부피%, 바람직하게는 13 내지 17 부피%, 보다 구체적으로 약 15 부피% (나머지 기체 조성은 N2)의 이산화탄소의 인위적 주입 시 훨씬 더 빠른 질소, 인 제거 및 조류 biomass 생산 증감을 할 수 있다. 이와 같은 이산화탄소의 주입은 조류 투입시에 함께 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 이 분야의 통상적인 방법 및 수단으로 투입될 수 있다. 예컨대, 회분식 공정 시 초기 1회 주입하거나, 20L이상의 bench scale 공정 시 상기 조성의 이산화탄소를 밤/낮 주기에 따라, 하루 동안 낮 12시간 정도만 주입할 수 있다. 이산화탄소의 주입 속도는 2 내지 2.5L/min 정도일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 이산화탄소 및 질소의 조성을 N:P 비율이 10:1 내지 15:1 정도가 되도록 하는 경우 조류 생장율이 높고 질소의 제거효율이 높다는 것을 확인하였다. 더욱이, 본 공정 시설에 필요한 투자비와 운전비용이 대단히 낮아 이의 상용화 가능성은 매우 높다.
본 발명의 또 다른 예는 상기 신규한 니트치아 푸실라 (Nitzschia cf . pusilla) 균주를 KH2PO4, CaCl2·2H2O, MgSO4·7H2O, NaNO3, K2HPO4, NaCl, H3BO3 및 미량원소를 포함하는 배지, 오수, 또는 이들의 혼합물에서 배양하는 단계를 포함하는 균주 배양 방법을 제공한다. 상기 미량원소는 ZnSO4·7H2O, MnCl2·4H2O, MoO3, CuSO4·5H2O 및 Co(NO3)2·6H2O로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있다. 상기 KH2PO4, CaCl2·2H2O, MgSO4·7H2O, NaNO3, K2HPO4, NaCl, 및 H3BO3 의 양은 배지 부피 기준으로 300 내지 1000 mg/L, 바람직하게는 500 내지 700 mg/L, 상기 미량원소의 양은 배지 부피 기준으로 5 내지 20 g/L, 바람직하게는 10 내지 15 g/L 정도일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 배양은 25 내지 27 ℃, 및 pH 7.2 내지 7.6의 조건 하에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 조건은 조류의 우수한 성장률 달성을 위하여 실험적으로 얻어진 값이다. 또한, 균주 배양 방법에 있어서, 배양시에 10 내지 20 부피%, 바람직하게는 13 내지 17 부피%, 보다 구체적으로 약 15 부피% (나머지 기체 조성은 N2)의 이산화탄소를 2 내지 2.5L/min의 주입속도로 주입함으로써 균주의 성장 속도 및 생체량을 보다 증진시킬 수 있다. 상기한 바와 같이, 상기 이산화탄소 및 질소의 조성은 N:P 비율이 10:1 내지 15:1 정도일 경우 조류 생장율이 높고 질소의 제거효율이 높다는 발견에 기초한 것이다.
본 발명은 니트치아 푸실라 YSW06 (Nitzschia cf . pusilla YSW06)[기탁번호 KCTC11763BP] 균주를 이용하여 폐수 내성과 바이오디젤 생산원인 지질 함유를 검토하여 폐수 처리 및 바이오디젤 생산용 신균주로서의 가능성을 확보하였다. 보다 구체적으로, 본 발명의 신균주는 폐수 내성이 강하며, 폐수에 함유된 N, P의 직접 적용이 가능하여 배양의 경제성을 크게 향상시키는 효과를 가진다. 또한, 성장된 니트치아 푸실라 YSW06 (Nitzschia cf . pusilla YSW06)[기탁번호 KCTC11763BP]는 높은 함량(약 50 중량% 이상) 지질을 함유하고 있어 바이오디젤 생산에 기여할 수 있는 잠재적 효과를 가진다.
도 1은 니트치아 푸실라 YSW06 (Nitzschia cf . pusilla YSW06)[기탁번호 KCTC11763BP]의 사진이다.
도 2는 니트치아 푸실라 YSW06 (Nitzschia cf . pusilla YSW06)[기탁번호 KCTC11763BP]의 계통수를 나타낸 것이다.
도 3a및 3b은 하폐수에서 니트치아 푸실라 YSW06 (Nitzschia cf . pusilla YSW06)[기탁번호 KCTC11763BP]의 질소(3a) 및 인(3b) 제거 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 니트치아 푸실라 YSW06 (Nitzschia cf . pusilla YSW06)[기탁번호 KCTC11763BP]의 지방산 분포를 나타낸 것이다 [팔미토레익산(C16:1), 팔미틴산(C16:0), 미리스틱산(C14:0), g-리놀렌산(C18:3n6:0)].
도 2는 니트치아 푸실라 YSW06 (Nitzschia cf . pusilla YSW06)[기탁번호 KCTC11763BP]의 계통수를 나타낸 것이다.
도 3a및 3b은 하폐수에서 니트치아 푸실라 YSW06 (Nitzschia cf . pusilla YSW06)[기탁번호 KCTC11763BP]의 질소(3a) 및 인(3b) 제거 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 니트치아 푸실라 YSW06 (Nitzschia cf . pusilla YSW06)[기탁번호 KCTC11763BP]의 지방산 분포를 나타낸 것이다 [팔미토레익산(C16:1), 팔미틴산(C16:0), 미리스틱산(C14:0), g-리놀렌산(C18:3n6:0)].
이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.
실시예
1: 신규 조류 군락의 분리 및 배양
강원도 원주 지역의 하천 주변에서 시료를 채취하였다. 채취 시료는 200 mL 시험관에 다음 표 1에 나타낸 바와 같은 BBM(Bold's Basal Medium) 액체배지를 넣고 약 2주간 정치 배양하였다. 하폐수에 질소와 인을 각각 10 mg/L, 및 1.2 mg/L 농로로 공급하며 형광등을 광원으로 하여 배양 시험관 표면에서 조도를 약 24 watt로 조절한 후 직접 배양하였다. 예비 배양한 시료 1 mL를 10 mL의 멸균 증류수가 포함된 30 mL시험관에 넣고 잘 혼합하여 미세조류 세포를 분산시켰다. 마이크로 피펫을 사용하여 상기 미세조류 세포 분산액 0.1 mL를 취한 후, 멸균 증류수 10 mL가 포함된 시험관에 넣고 혼합하였다.
이러한 조작을 5회 반복한 후 각각의 시험관에서 약 0.1 mL의 시료를 취하고, 이를 다음 표 2에 나타낸 바와 같은 조성의 BBM 배지가 놓인 페트리디쉬(Petri dish)에 접종한 다음, 온도 25 ~ 27 ℃ 및 조도 50 μmol/㎡-sec의 배양기에서 2~3주간 정치 배양하였다. 미세조류의 군락(Colony)이 나타나면 현미경으로 확인하면서 백금이를 사용하여 각각의 군락을 웰 세포 배양 플레이트(well cell culture plate)에 옮겨 분리를 시작하였다. 각각의 홀에는 조류군락과 BBM배지를 부피 기준으로 1:1로 투여 후 10 내지 14일간 배양하였다.
일부 미생물의 성장을 억제하게 위하여, 스트렙토마이신을 사용하여 조류만을 성장하도록 하였다. 이때 사용된 스트렙토마이신의 양은 배지 1L 당 0.15 μm/ mL를 사용하였다. 일정 기간 후 각각의 홀에 배양된 군락을 현미경 관찰한다. 이때 대부분의 홀에서는 특성 미세조류만 성장하며, 같은 모양을 지닌 종을 BBM 배지로 준비된 페트리디쉬에서 배양을 하였다. 일정 기간 (약 14 내지 20일) 후, 배양된 조류 군락은 한 종류의 군락으로 우세하게 배양되며, 이 군락을 10 mL 채취하여 100 mL의 BBM 배지가 들어있는 250 mL 삼각 플라스크에 이식하여 본 배양을 시작하였다.
| 성분 | 함량 (per liter) |
| KH2PO4 | 175 mg |
| CaCl2·2H2O | 25 mg |
| MgSO4·7H2O | 75 mg |
| NaNO3 | 250 mg |
| K2HPO4 | 75 mg |
| NaCl | 25 mg |
| H3BO3 | 11.42 mg |
| 미량원소 용액 (Microelement Stock Solution) | |
| ZnSO4·7H2O | 8.82 g |
| MnCl2·4H2O | 1.44 g |
| MoO3 | 0.71 g |
| CuSO4·5H2O | 1.57 g |
| Co(NO3)2·6H2O | 0.49 g |
| Solution (1) | |
| Na2EDTA | 50 g |
| KOH | 3.1 g |
| Solution (2) | |
| FeSO4 | 4.98 g |
| H2SO4 | 1 mL |
| 성분 | 함량 (per liter) |
| KH2PO4 | 175 mg |
| CaCl2·2H2O | 25 mg |
| MgSO4·7H2O | 75 mg |
| NaNO3 | 250 mg |
| K2HPO4 | 75 mg |
| NaCl | 25 mg |
| H3BO3 | 11.42 mg |
| 미량원소 용액 | |
| ZnSO4·7H2O | 8.82 g |
| MnCl2·4H2O | 1.44 g |
| MoO3 | 0.71 g |
| CuSO4·5H2O | 1.57 g |
| Co(NO3)2·6H2O | 0.49 g |
| Solution (1) | |
| Na2EDTA | 50 g |
| KOH | 3.1 g |
| Solution (2) | |
| FeSO4 | 4.98 g |
| H2SO4 | 1 mL |
| Agar | |
| Agar powder | 15 g |
실시예
2: 신규 균주 배양
상기 표 1의 BBM 배지 100mL를 이용하여 상기 실시예 1에서 분리 및 배양된 조류 군락 10 mL을 250 mL 삼각플라스크에 넣고, 25 내지 27 ℃ 및 pH 7.2 내지 7.6 조건 하에서 형광교반배양기에서 약 14일간 배양하였다. 교반 속도는 150 rpm으로 유지하고, 조도는 50 μmol/㎡-sec를 유지하였다.
실시예
3: 신규 균주의 동정
상기 배양된 조류 군락 내의 균주의 28s rDNA 염기서열을 시퀀스분석법으로 분석하였다(솔젠트, http://www.solgent.co.kr/). 샘플의 상태는 상기 액체배지에서 배양한 균주를 원심분리한 상태로 의뢰하였으며, 의뢰 내역으로는 Extraction-gDNA, PCR Amplication에 의한 PCR 생성물을 시퀀싱(sequencing) 반응을 통해 분석하였다. 분석에 사용된 프라이머는 다음과 같다.
정방향 프라이머: 5'-AGCGGAGGAAAAGAAACTA-'3 (서열번호 2)
역방향 프라이머: 5'-TACTAGA-AGGTTCGATTAGTC-'3 (서열번호 3)
28s rDNA 염기서열 분석 결과를 서열번호 1의 서열을 갖는 것으로 확인되었으며, 계통학적 결과는 쥬크-캔터(Jukes-Cantor) 모델을 적용한 네이버-조이닝(Neighbour-joining) 방법에 따라 계통수(phylogenetic tree) 결과를 도 2에 나타내었다.
상기 균주의 28s rDNA 염기서열(서열번호 1)은 NCBI에서 상동성을 조사한 결과, 다음 표 3에 나타낸 바와 같이 니트치아 푸실라로 분류되었다.
| Microalgal strain | Accession No. | Length (nta) | Closest Relative and GenBank Accession No. | Similarity |
| Nitzschia cf . pusilla YSW06 | GU732414 | 776 | N. pusilla AF417663 | 97% |
이상에서와 살펴본 바와 같이, 본 발명에서 분리한 미세 조류균은 폐수의 내성과 높은 함량의 지질을 함유하는 점을 제외하고는, 형태 및 최적 온도, pH 등의 특성을 종합 고려할 때 니트치아 푸실라 종류에 속하는 것으로 밝혀졌다.
이에, 본 발명에 따른 신규 균주를 니트치아 푸실라 YSW06 (Nitzschia cf . pusilla YSW06)으로 명명하였고, 이를 대한민국 대전시 유성구에 소재하는 한국생명공학연구원 미생물자원센터(KCTC: Korean Collection for Type Cultures)에 2010년 9월 13일자로 기탁하여, 기탁번호 KCTC11763BP를 부여받았다.
실시예
4:
하폐수
내성, 질소 및 인 제거 시험
상기 실시예2에 의해 확보된 조류 니트치아 푸실라 YSW06 (Nitzschia cf. pusilla YSW06)의 하폐수 내성 및 질소와 인의 제거능을 시험하기 위하여, 원주시 하수종말처리장에서 방출되는 폐수에 니트치아 푸실라 YSW06 균주를 적용하였다. 즉, 상기 하수종말처리장 방출수에 OD값은 1.4 내지 1.6, SS(Suspended solid) 측정 시 약 1.2 내지 1.4 g 조건의 조류 1mL/200mL (약 2*108 CFU/mL)를 씨딩(seeding)하였다. 각각의 반응조는 22 내지 25 ℃의 실내 온도를 유지하였으며, pH는 7.2 내지 7.9로 자연 상태로 유지하였고 회분 실험 형태로 진행하였다.
총 질소량(T-N)과 총 인양(T-P)은 HACH kit (http://www.hach.co.kr/)를 사용하여 분석하였으며, 비교를 위하여 Scenedesmus obliquus(HM103382), Chlorella ellips oidea(GU 732422) 및 Chlamydomonas Mexicana(GU 732420)를 사용하여 동일한 시험을 수행하였다.
상기 시험 결과 얻어진 시간에 따른 총 질소량(T-N)과 총 인양(T-P)를 아래의 표 4와 도 3a 및 3b에 각각 나타내었다.
| 0일 | 1일 | 3일 | 5일 | 7일 | |
| T-N | 8.82 | 8.23 | 1.88 | 1.11 | 0 |
| T-P | 2.95 | 2.85 | 0.8 | 0.65 | 0.45 |
| OD (Optical density) | 0.032 | 0.035 | 0.257 | 0.331 | 0.336 |
표 4와 도 3a 및 3b에서 확인되는 바와 같이, 반응이 진행된 후 3일 내로 질소와 인의 저감이 빠르게 진행되는 것을 알 수 있다.
반응기에 정상 상태(steady-state, 오염의 증상 없이 조류가 활발히 성장하고 있는 상태)의 조류를 적용 및 15부피% (나머지 기체 조성은 N2)의 인위적 이산화탄소 주입 시 보다 신속하게 인, 질소의 제거가 가능할 것으로 판단된다.
또한, 위 시험 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 조류는 하폐수 내에서 사멸하지 않고 다른 종들보다 빠르게 N, P source를 제거하는 것으로 나타났고, 하수종말처리장 폐수와 별도로 축산폐수 처리장 폐수에 적용한 결과에서도 사멸하지 않고 생존함이 관찰되어, 폐수 내성이 우수한 것으로 확인되었다.
실시예
5: 지질 생산 및 지방산 추출
조류는 탄수화물, 단백질, 지질 등으로 구성되어 있는 종속/독립영양으로 광합성 작용을 통해 성장한다. 지방산 함량 및 조성은 Lepage와 Roy[Lepage, G., C.C. Roy (1984) Improved recovery of fatty acid through direct transesterification without prior extraction or purification, Journal of Lipid Research, 25, 1391-1396]의 방법을 변형하여 분석하였다.
표준물질로 지방산 메틸 에스테르 혼합물인 Mix RM3, Mix RM5, GLC50, GLC70[Supelco, USA]와 헵타데칸산(Heptadecanoic acid), 감마-리놀렌산(gamma-Linolenic acid)[Supelco, USA]를 사용하였다.
실시예 2 및 3에서 얻어진 조류 균주 용액을 6,000rpm에서 원심분리하고 상청액을 제거하여 배지 및 기타 불순물 용액을 제거한 후, 3차 증류수로 2 내지 3회 6,000rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고 조류 mass만 수득하고, 80℃ 에서 동결건조시켜 미세조류 지질시료를 얻었다. 테프론 마개를 가진 유리 튜브[11 mL, DH.GL28020, Daihan Scientific, Korea]에 질량을 측정한 상기 미세조류 지질 시료를 넣고 클로로포름-메탄올(2:1, vol/vol) 2 mL을 주입한 후 상온에서 10분간 볼텍스 믹서(vortex mixer)[Vorex Genius 3. Ika, Italy]로 섞었다.
내부표준물질인 노나데칸산(nonadecanoic acid)[Sigma Co., USA]를 함유한 클로로포름 1 mL (500 ㎍/L), 메탄올 1 mL, 황산 300 ㎕를 순차적으로 유리튜브에 첨가한 후 5분간 믹서로 섞었다. 튜브를 항온수조에 넣고 100 ℃에서 10분간 반응시켰다. 튜브를 상온까지 냉각시킨 후 증류수 1 mL을 주입하고, 믹서로 5분 정도 격렬히 섞은 후 6,000rpm에서 10분간 원심분리하여 층분리를 시켰다. 아래층 (유기상)을 1회용 PP 재질 주사기(Norm-ject, Germany)로 뽑아 1회용 0.22 ㎛ PVDF 실린지필터[(Millex-Gv, Millipore, USA)로 여과 후 자동 주입기를 가진 가스크로마토그래피[Model 7890, Agilent, USA]로 분석하였다.
이와 같이 얻어진 분석 결과를 아래의 표 5 및 도 4에 나타내었다.
| Microalgal strain | Biomass productivity (g dwt L-1) | Lipid productivity (g L-1) |
Lipid content (% biomass) |
| N. pusilla YSW06 | 1.37±0.08 | 0.66±0.00 | 48±3.1 |
표 5에서 확인되는 바와 같이, 본 발명에 따른 니트치아 푸실라 YSW06(Nitzschia cf . pusilla YSW06) 균주는 균체 내에 건조 중량 약 50 중량%의 지질이 함유되어 있는 것으로 확인되었다
지방산 분포를 보여주는 도 4에서 확인되는 바와 같이, 니트치아 푸실라 YSW06 (Nitzschia cf . pusilla YSW06)의 지방산에는 팔미틴산(16:0)이 가장 많이 분포되어 있는 것으로 나타났다 (단위: 중량%).
특히, 현재까지 보고된 가장 안정적 미세조류의 바이오디젤생산 지방산은 올레인산(C 18:1n9c)와 팔미틴산(16:0)으로 알려져 있다. 니트치아 푸실라 YSW06 (Nitzschia cf . pusilla YSW06)의 전체 지방산 중 31%를 구성하는 팔미틴산 (16:0)은 바이오디젤 생산화를 위한 지방산으로 알려져 있으며, 산화안정성이 좋고 세탄가 (연료점화 용이성)가 높아 특히 열대기후 지역의 연료로 적합하게 사용될 수 있다. 또한, 지방산 성분 100% 중 57%는 palmitoleic acid로 구성되어 있는데, 최근 바이오연료로의 전환가능성을 보여준 연구결과가 도출되고 있다 (Knothe, G., 2010. Biodiesel derived from a model enriched in palmitoleic acid, macadamia nut oil. Energy & Fuel 24: 2098-2103).
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 니트치아 푸실라 YSW06 (Nitzschia cf . pusilla YSW06)은 전체 지방산 중 31%가 바이오디젤 생산에 적합한 팔미틴산으로 구성되어 있어서, 바이오디젤 생산에 매우 유용하다.
<110> Korea Institute of Science and Technology
<120> Novel Strain of Nitzschia cf. pusilla and Use Thereof
<130> DPP-2010-4869-KR
<160> 3
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 776
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Base sequence of 28rDNA of Nitzschia cf. pusilla YSW06
<400> 1
aaagaaacta accaggattc cctcagtaag ggcgactgaa gcgggaagag ctcaggatgt 60
gaatctgcgc cttgttgcgc cgaattgtgg tctgtcgacg gtggcattac tggccgggcc 120
aagtcctttg gaacaaggca gctgagaggg tgagactccc gtccgcctgg ctaggtgagc 180
cactagtcta cgagtcgagt tgtttgggat tgcagctcca agtgggtggt aaattccatc 240
taaagctaaa tattggtggg agaccgatag cgtacaagta ccgtgaggga aagatgcaaa 300
gaactttgaa aagagagtta aagagtacct gaaattgctg aaagggaagc gaaggaaacc 360
agtgtcggct cggtcatatt tccctgtccg cttgcggatt gggcgctgtg tccggcctcg 420
gtcgtccttg gttgggtctg ctggaagagc gcagtgagag ttgatctctg ttgctagcag 480
cgggtcctga ctgaggagga cgaaatggtt ttctttaccc cgtcttgaaa cacggaccaa 540
ggagtctaac atatgtgcga gtacaggggt ggcaaacccc cgtgcgtaat gaaagtgaca 600
gtggttggac aatttttgca caatccgccg gcctcaatcc ctcgggagaa cggtctgagt 660
gtgagcatac atgttgggac ccgaaagatg gtgaactatg cctgaatagg gtgaagccag 720
gggaaactct ggtggaggct cgtagcgatt ctgacgtgca aatcgatcgt caaatt 776
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for amplifying 28s rDNA of Nitzschia cf. pusilla
YSW06
<400> 2
agcggaggaa aagaaacta 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for amplifying 28s rDNA of Nitzschia cf. pusilla
YSW06
<400> 3
tactagaagg ttcgattagt c 21
Claims (12)
- 28s rDNA가 서열번호 1의 염기서열로 구성되고, 기탁번호 KCTC11763BP인,
니트치아 푸실라 YSW06 (Nitzschia cf. pusilla YSW06) 균주.
- 삭제
- 삭제
- 제1항의 니트치아 푸실라 YSW06 (Nitzschia cf. pusilla YSW06) 균주, 상기 균주의 배양물, 및 상기 균주 또는 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 바이오디젤 생산용 조성물.
- 지질을 반응기질로 하는 바이오디젤의 생산 방법에 있어서,
상기 지질의 공급원으로서 제1항의 니트치아 푸실라 YSW06 (Nitzschia cf. pusilla YSW06) 균주를 사용하는 것을 특징으로 하는 바이오디젤의 생산 방법.
- 제1항의 니트치아 푸실라 YSW06 (Nitzschia cf. pusilla YSW06) 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들 모두를 포함하는 오수 처리용 미생물 제제.
- 오수에 제1항의 니트치아 푸실라 YSW06 (Nitzschia cf. pusilla YSW06) 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 이들 모두를 첨가하여 배양하는 단계를 포함하는,
오수 처리 방법.
- 제7항에 있어서,
상기 배양시에 10 내지 20 부피%의 이산화탄소를 주입하는 것을 특징으로 하는,
오수 처리 방법.
- 제1항의 니트치아 푸실라 YSW06 (Nitzschia cf. pusilla YSW06) 균주를 KH2PO4, CaCl2·2H2O, MgSO4·7H2O, NaNO3, K2HPO4, NaCl, H3BO3 및 미량원소를 포함하는 배지, 오수, 또는 이들의 혼합물에서 배양하는 단계를 포함하는,
균주 배양 방법.
- 제9항에 있어서,
상기 미량원소는 ZnSO4·7H2O, MnCl2·4H2O, MoO3, CuSO4·5H2O 및 Co(NO3)2·6H2O로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인,
균주 배양 방법.
- 제9항에 있어서,
상기 배양은 25 내지 27 ℃, 및 pH 7.2 내지 7.6의 조건 하에서 수행되는 것인,
균주 배양 방법.
- 제9항에 있어서,
상기 배양시에 10 내지 20 부피%의 이산화탄소를 주입하는 것을 특징으로 하는,
균주 배양 방법.
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