KR101601640B1 - 고함량 유용물질을 포함하는 신규한 균주 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 고함량의 지질을 포함하는 신규한 균주에 관한 것이다.

Description

고함량 유용물질을 포함하는 신규한 균주{NOVEL STRAIN CONTAINING HIGH CONCCENTRATION OF USEFUL MATERIAL}
본 발명은 고함량의 지질을 포함하는 신규한 균주에 관한 것이다.
고도 산업화에 따른 화석연료의 사용은 다량의 온실가스를 배출하여 지구온난화의 주범으로 지목되고 있다. 아울러 과도한 화석연료의 사용에 따라 석유가 고갈되고 있다. 이에 국내외의 많은 연구자들이 화석연료의 대체 수단으로 대체에너지를 개발하고 있다. 대체에너지원으로 신 재생 에너지를 포함할 수 있으며 그 종류는 태양열, 바이오, 풍력, 수력, 해양, 폐기물, 지역, 연료전지, 수소 등이다. 그 중에서 바이오 에너지는 바이오 디젤의 원료로 사용될 수 있으며 타 원료에 비해 단위면적당 생산량이 매우 우수하다.
종래 바이오 에너지의 에너지원은 주로 콩, 사탕수수 등이 사용되었다. 그러나 이를 재배하는데 필요한 광대한 면적에 대한 바이오 디젤의 생산효율이 낮아서 어려움에 직면하고 있다. 따라서 바이오 디젤의 안정적, 경제적 생산을 위해서 바이오 매스로 미세조류의 연구가 필요한 실정이다.
대한민국 등록특허 제10-0693865호
본 발명의 목적은 지질, 특히 팔미틴산을 고농도로 함유하면서 베타카로틴을 높은 수율로 생산할 수 있는 신규한 균주를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 유로네마 속 KGE 3 (Uronema sp. KGE 3) 균주, 이의 배양액 및 배양방법을 제공한다.
본 발명은 또한 유로네마 속 KGE 3 (Uronema sp. KGE 3) 균주와 폐수를 함께 배양시키는 단계를 포함하는, 유로네마 균주 내 베타카로틴의 함량을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 신규한 균주는 고함량의 지질, 고함량의 지방산 특히, 팔미틴산을 함유하여 바이오 디젤 생산에 유용하게 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 신규한 균주는 산성 광산에서 분리되어 중금속에 대한 내성을 가지기 때문에, 폐수 내에서도 그 활성을 유지할 수 있다. 아울러, 본 발명의 신규한 균주는 고함량의 지질 고함량의 지방산 특히, 팔미트산, 팔미톨레산, 올레익산, 리노레익산(18:2n6t), 또는 g-리노레익산 (18:3n6)을 고함량으로 함유할 뿐 아니라, 폐수를 이용하여 베타카로틴을 높은 수율로 생산할 수 있어서 유용하다.
도 1은 신균주 유로네마 속KGE 3 (Uronema sp. KGE 3) 의 현미경 사진(1500배율)이다.
도 2는 신균주 유로네마 속 KGE 3 (Uronema sp. KGE 3) 의 계통도를 나타낸 것이다.
도 3은 BBM (Bold's Basal Medium)에서 신균주 유로네마 sp. KGE 3 (Uronema sp. KGE 3)의 성장에 따라 질소 및 인이 제거됨을 보인 것이다.
도 4는 신균주 유로네마 속 KGE 3 (Uronema sp. KGE 3)를 BBM (Bold's Basal Medium)에서, 또는 MBR (Membrane Bioreactor) 처리 유출수 내에서 배양시킨 경우 시간의 흐름에 따른 지질함량의 변화를 나타낸 것 이다.
도 5는 신균주 유로네마 속 KGE 3 (Uronema sp. KGE 3)를 BBM (Bold's Basal Medium)에서, 또는 MBR (Membrane Bioreactor) 처리 유출수 내에서 배양시킨 경우, 베타 카로틴의 함량 변화를 나타낸 것이다.
본 발명은 일 관점에서 유로네마 속 KGE 3 (Uronema sp. KGE 3) 균주에 관한 것이다. 본 발명의 일 관점인 유로네마 속 KGE 3 (Uronema sp. KGE 3) 균주는 본 발명자들에 의해 최초로 분리 동정된 것이다. 본 발명자들은 상기 분리 동정된 신균주를 유로네마 속 KGE 3 (Uronema sp. KGE 3) 라 명명하였으며, 2013년 7월 30일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁하여 기탁번호 (KCTC 12457BP)를 부여받았다. 상기 KGE는 KIST Guengnung Enviromental의 약자이다.
본 발명의 일 관점인 상기 균주는 서열번호 1의 염기서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 관점인 균주는 건조 균주의 총 중량에 대하여 25 중량% 이상의 지질을 포함할 수 있다. 일반적인 미세조류에서 지질의 함량은 20%를 넘기기가 어렵다. 그러나 본 발명은 25%이상의 지질을 함유하고, 지방산을 다량 함유하여 바이오 매스로 활용될 수 있다. 상기와 같은 관점에서 본 발명의 유로네마 속 KGE 3 (Uronema sp. KGE 3) 균주는 25.5 중량% 이상, 26 중량% 이상, 26.5 중량% 이상, 27 중량% 이상, 27.5 중량% 이상, 28 중량% 이상, 28.5 중량% 이상, 29 중량% 이상, 29.5 중량% 이상, 30 중량% 이상, 30.5 중량% 이상 또는 31 중량% 이상의 지질을 포함할 수 있다.
발명의 일 관점인 균주는 상기 지방산의 총 함량에 대하여 31중량% 이상의 팔미틴산을 포함할 수 있고, 이에 따라 상기 균주를 바이오 매스로 활용할 수 있다는 장점이 있다. 본 발명의 일 관점인 균주는 팔미틴 산 (Palmitic acid) 외에도 팔미토레익 산 (Palmitoleic acid), 헵타디케노익 산 (Heptadecenoic acid), 올레익 산 (Oleic acid), 리노레라이딕 산 (Linolelaidic acid)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 지방산을 포함할 수 있다. 특히, 팔미틴산은 산화안정성이 좋고 세탄가 (연료점화 용이성)가 높아 열대기후 지역의 연료로 적합하다.
본 발명은 다른 관점에서 유로네마 속 KGE 3 (Uronema sp. KGE 3) 균주의 배양액에 관한 것이다. 상기 배양액은 유로네마 속 KGE 3 (Uronema sp. KGE 3) 균주를 배양하여 얻어지는 산물이 포함되어 있으며, 이외에 통상의 배양액에 포함되는 구성을 가진다. 본 발명의 일 관점인 배양액에 있어서, 상기 균주는 기탁번호 (KCTC 12457BP)를 가질 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서 유로네마 속 KGE 3 (Uronema sp. KGE 3) 균주를 배양하는 단계를 포함하는 배양방법에 관한 것이다. 구체적으로 상기 배양방법은 유로네마 속 KGE 3 (Uronema sp. KGE 3) 균주를 25 내지 30 ℃, pH 6 내지 8의 조건에서 배양시키는 단계를 포함할 수 있고, 상기 조건에서 본 발명의 신균주의 성장속도가 높을 수 있다. 상기와 같은 관점에서 상기 균주는 25.5 내지 29.5℃, 26 내지 29℃ 또는 26.5 내지 28.5 ℃의 온도에서 배양될 수 있고, pH 6.2 내지 7.8, pH 6.4 내지 7.6 또는 pH 6.4 내지 7.4의 조건에서 배양될 수 있다. 더 구체적으로, 본 발명의 일 관점인 배양방법에 있어서, 상기 배양방법은 KH2PO4, CaCl2, MgSO4, NaNO3, K2HPO4, NaCl 및 H3BO3를 포함하는 배지에서, 상기 유로네마 속 KGE 3 (Uronema sp. KGE 3) 균주를 배양시키는 단계를 포함할 수 있다. 특히, 본원발명의 유로네마 속 KGE 3 (Uronema sp. KGE 3) 균주는 대기 중의 질소를 이용하여 성장할 수 있어서, 별도의 영양염류를 첨가하지 않고 대기 공기와의 접촉만으로도 우수한 성장율을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 관점인 배양방법에 있어서, 상기 균주는 기탁번호 (KCTC 12457BP)를 가질 수 있다.
본 발명의 일 관점인 배양방법에 있어서, 상기 배지는 ZnSO4, MnCl2, MoO3, CuSO4 및 Co(NO3)2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 원소를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서 유로네마 속 KGE 3 (Uronema sp. KGE 3 균주와 폐수를 함께 배양시키는 단계를 포함하는, 베타카로틴을 생성시키는 방법에 관한 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 폐수는 광산배수, 구체적으로 산성의 광산 배수를 포함할 수 있고, 가축 분뇨를 포함하는 폐수일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에서 상기 가축분뇨는 N,P를 다량 포함하는 가축의 분뇨를 의미할 수 있다.
본 발명의 일 관점인 상기 방법에 있어서, 상기 균주는 기탁번호 (KCTC 12457BP)를 가질 수 있다.
본 발명의 일 관점인 상기 방법에 있어서, 상기 베타카로틴의 함량은 대조군에 비해 3배 이상 증가한 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 대조군은 균주의 성장에 최적의 조건을 제시하는 BBM 배지에서 본 발명의 일 관점인 균주를 배양시켰을 때 얻어지는 베타카로틴의 함량일 수 있다.
본 발명의 유로네마 균주는 폐수와 함께 배양시키면 대조군에 비해 3배 이상 증가한 양의 베타 카로틴을 생성시킬 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 유로네마 균주는 폐수와 함께 배양시키면 전혀 베타카로틴을 생산하지 못하는 대조군에 비해 3.5배 이상, 4배 이상, 4.5배 이상 또는 5배 이상 증가한 양의 베타 카로틴을 생성시킬 수 있다.
본 발명의 일 관점인 방법에 있어서, 상기 폐수는 광산배수 또는 가축분뇨를 포함하는 폐수일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
신균주의 분리 및 배양
강원도 강릉시 모전면 흥일태봉 폐광산 지역 산성광산배수에서 시료를 채취하였다. 시료 채취는 멸균된 수질 샘플팩(1L)에 토양, 수질을 채취하여 아이스박스를 이용하여 저온 보관하여 실험실로 옮겼다. 채취한 샘플은 일부를 분리하여 멸균된 DIW를 이용하여 세척 및 원심분리를 3회 반복하여 신균주를 얻었다. 분리된 신균주 샘플은 광학현미경을 통해 1500배 확대하여 관찰하였다.
상기 신균주를 표 1과 같은 조성의 BBM 액체 배지에 넣어서 2주 동안 정치 배양하였다. BBM 액체 배지는 미세조류의 최적화된 성장이 가능한 환경을 제공할 수 있다. 이러한 BBM 액체 배지의 조성을 구성하는 microelement stock solution 및 solution 1과 solution 2의 조성은 표 2와 같다. 36 와트 형광등을 광원으로 이용하였고, 배양 2주 후, 독립된 군집(single colony)을 채취하여 BBM 이 포함된 alar plate(15g/L) 에 백금이를 이용하여 골고루 퍼지게(spreading) 1차 도말하였다. 8일후, 배양된 군집을 BBM이 포함된 alar plate 에 2차 도말하였다. 12일 후, 배양된 군집을 채취하고 BBM이 포함된 액체배지가 담겨있는 삼각플라스크에 상기 미세조류를 분산시켰다. 그리고 형광등이 부착된 항온 수평 진탕기을 이용하여 미세조류를 배양한다. 이 때, 배양조건은 온도 25℃, 교반 속도 150rpm 이었다.
구성성분 함량
KH2PO4 175 mg/L
CaCl2*H2O 25 mg/L
MgSO4*7H2O 75 mg/L
NaNO3 250 mg/L
K2HPO4 75 mg/L
NaCl 25 mg/L
H3BO3 11.42 mg/L
Microelement stock solution 1 ml
Solution 1 1 ml
Solution 2 1 ml
Microelement stock solution Solution 1 Solution 2
구성성분 함량 구성성분 함량 구성성분 함량
ZnSO4*7H2O 8.82 g/L Na2EDTA 50 g/L FeSO4 4.98 g/L
MnCl2*4H2O 1.44 g/L
MoO3 0.71 g/L KOH 3.1 g/L H2SO4 1 ml/L
CuSO4*5H2O 1.57 g/L
Co(NO3)2*6H2O 0.49 g/L
분리균주의 배양
상기 표 1과 같은 조성의 BBM 배지를 이용하여 25 ℃, pH 7에서 250 mL 삼각플라스크에 본 발명의 신균주 10 mL를 넣고 형광등이 부착된 항온 수평 진탕기에서 14일 동안 배양을 하였다. 교반은 150 rpm으로 유지하였으며, 조도 50μmol/㎡-sec를 유지하였다.
분리균주의 동정 및 상동성 비교
신균주 유로네마 속 KGE 3 (Uronema sp. KGE 3)의 염기서열 분석은 28s rRNA 염기서열 시퀀스분석법으로 분석하였다.
배양 중 미세조류 일부를 채취하고 원심 분리하여 분석용 시료로 사용하였다. 상기 미세조류는 DNA 추출 키트 (SolGent, 한국)를 이용하여 추출하였고, 추출한 DNA는 PCR로 증폭시켰다. 프라이머는 28S D1D2를 사용하였다.
정방향 프라이머: 5'-AGCGGAGGAAAAGAAACTA-3'
역방향 프라이머: 5'-TACTAGA-AGGTTCGATTAGTC-3'
그 결과 얻어진 염기서열을 서열번호 1에서 기재하였고, 상기 염기서열을 이용하여 NCBI 정보를 참고하여 계통도를 작성하였다 (도 2).
[서열번호 1]
AGCGGAGGAAAAGAAACTAACAAGGATGTGCGCCCTATGATAATCGGCGAGCGAACCGGGAATAGCCCAACGTGTAAATCTCCCTCGGAGAATTGTAGTCTATAGAAGCAACTTCTGCAACGGCCGGACCTCAAGTCCCCTGGAAGGGGGCGTCAGAGAGGGTGAGAACCCCGTCGGGTCTTGGTGCGGTTGCCTCACGAAGTGCTCTCCAAGAGTCGGGTTGTTTGGGAATGCAGCCCAAATTTGGTGGTAAATCCCATCTAAGGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACCGTGAGGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTTAAAAAGTGCTTGAAATTGTTGAGGGGGAAGCGATTGGCAGCTGTGTGTGCACCTAGGCTTACGTCGCCTTAACGGGCGGCTGCATGTGCTAGGTGCTGGTCAGCATGGGTTAGCCTGGCAGGATAAACGCAGGGGTTGTTACTCTGTCTATACTGCCGGGTTGACCGAGGTGTGAAGGCCGCTCTTGTCCCTCGGGATCTGCGGCCTCAAGATGCTGGCGGAAGGCTTTCAATCGGCYCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGTCTAACATGTATGCGAGCTGGTGGGTGGCAAACCCATGAGGCGCAAGTAACCTGACTGGTGGGATGGCGTAAGCCTGCACCATCGACCGACCATGATCTTCTGTGAAAGGTTCGAGTACGAGCATACCTGTTGGGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCCTGAGCAGGGCGAAGCCAGAGGAAACTCTGGTGGAGGCTCGTAGAYGTGCTGACGTGCAAATCGCTTTTCGGACTTGGGTATAGGGGCGATAAGACTAATCGAACCTTCTAGTA
아울러, 상기 염기서열로 NCBI에서 Blast 검색을 실시하여 상동성을 분석한 결과, 표 3이 얻어졌다.
Microalgal strain Accession number Length (nta) Closest relative and
GenBank accession number		 Similarity (%)
Uronema sp. KGE3 HE861880 874 Uronema belkae FR751190.1 94
이에 본 발명자들은 상기 분리 동정된 신균주를 유로네마 속 KGE 3 (Uronema sp. KGE 3) 라 명명하였으며, 2013년 7월 30일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁하여 기탁번호 KCTC 12457BP를 부여받았다.
분리균주의 성장속도 측정
본 발명의 신균주 유로네마 속 KGE 3 (Uronema sp. KGE 3) 이 질소,인을 제거하는 속도를 파악하기 위해, BBM 배지로 상기 균주를 배양하였다. 500ml 플라스크에 250ml 배지를 충진시킨 후, 상기 균주 일부(OD 680nm 0.01)를 접종하여 사용하였다. 배양하는 동안 형광등 53.17 W/m2의 광원을 사용하였고, 28℃에서 배양시켰다.
질소, 인의 초기 농도가 50mg/L인 분석용 키트 (C-Mac, 한국)를 이용하여 초기 농도가 50mg/L인 질소와 인의 농도 변화를 관찰하였고, UV 미터기 (Hach, 미국)로 680nm에서 흡광도 (Optical Density)를 측정하여 성장속도를 파악하였다.
상기 실험은 모두 3회 반복하여 진행되었다.
그 결과 (도 3), 흡광도가 증가하고 질소와 인이 소모되어 상기 신균주가 성장하고 있음을 확인할 수 있었다.
지질 함량 분석
BBM 배지에서 21일간 잘 배양된 본 발명의 신균주 유로네마 속 KGE 3 (Uronema sp. KGE 3) 를 회수하여 스윙타입원심분리기(Hanil, 한국)에서 3500rpm 으로 원심분리한다. 원심분리된 미세조류를 동결건조기를 이용하여 3일간 동결건조하고 그 중 500mg 를 채취하여 지질 추출용 용기(원심분리가 가능한 유리용기 및 뚜껑에 테프론 라이너가 삽입된)에 넣은 후, 용매 클로로포럼 1.25m과 메탄올 2.5ml를 유리 피펫을 이용하여 첨가하였다. 그 후, 미세조류에 용매를 첨가한 시료를 고속교반기로 5분 동안 잘 섞어주고, 30분 동안 소니케이터 (sonicatier)를 이용하여 파쇄시켜서 추출을 시작하였다. 파쇄된미세조류를 150rpm, 30℃의 조건에서 항온수평진탕기로 하루 동안 교반(30℃, 150rpm) 추출하였다. 이렇게 추출된 시료에 클로로포럼 1.25ml를 유리피펫을 이용하여 첨가하고 2시간 동안 항온수평진탕기에서 추가 교반하였다. 추출한 시료에 증류수 1.25ml를 마이크로피펫을 이용하여 첨가하여 원심분리시켜후 유기층과 물층을 분리하였다. 유기층 (1차 추출물)을 파스췌피펫을 이용하여 새로운 용기(원심분리가 가능한 유리용기 및 뚜껑에 테프론 라이너가 삽입된)에 옮기고 남은 물질에 증류수 1.25ml를 첨가하여 한 번 더 원심분리시킨다. 유기층 (2차 추출물)과 물층을 분리하고 유기층을 파스췌피펫을 이용하여 분리하여 1차 추출물과 2차 추출물을 합하여 지질 추출물을 얻었다. 이렇게 얻어진 지질 추출물에 NaCl(5%) 5ml 첨가하여 혼합한 후 원심분리하여 유기층만 옮겨 담은 후, 유기층을 회전 진공 증발 농축기를 이용하여 증발시켜 순수 지질을 분리하였다. 분리한 지질의 무게를 측정하여 지질의 무게 125mg를 산출하였고, 사용된 미세조류의 무게는 500mg이었다. 이를 수학식 1에 대입하여 유로네마 균주 내 총지질함량을 계산하였다.
[ 수학식 1]
지질함량(%)=지질추출물의 건조중량(mg)/미세조류 건조중량(mg) X 100
[ 수학식 2]
지질생산성(mg/L day)=미세조류 일일 생산량(mg/L day) X 미세조류 지질함량(%)
[ 수학식 3]
미세조류 일일 생산량 = 총 배양된 미세조류 량(mg/L) / 배양기간(day)
상기 수학식에 의해 얻어진 결과는 다음 표 4와 같다.
Microalgae strain Biomass productivity
(mg/L·day)		 Lipid productivity (mg /L·day) Lipid content
(% lipid/biomass)
Uronema sp. KGE3 1110 270 24.3
지방산 추출 및 분석
지방산 함량 및 조성은 Lepage와 Roy[Lepage, G., C.C. Roy (1984) Improved recovery of fatty acid through direct transesterification without prior extraction or purification, Journal of Lipid Research, 25, 1391-1396]의 방법을 변형하여 분석하였다.
표준물질로 지방산 메틸 에스테르 혼합물인 FAME Quantitative Standard Mix 37 comps.[accuStandard, USA]를 사용하였다. 테프론 마개를 가진 유리 튜브[11 mL, DH.GL28020, Daihan Scientific, Korea]에 질량을 측정한 미세조류 지질 시료 넣고 클로로포름-메탄올(2:1, vol/vol) 2 mL을 주입한 후 상온에서 10분간 볼텍스 믹서(vortex mixer)[Vorex Genius 3. Ika, Italy]로 섞었다.
내부표준물질인 노나데칸산(nonadecanoic acid)[Sigma Co., USA]를 함유한 클로로포름 1 mL (500 ㎍/L), 메탄올 1 mL, 황산 300 ㎕를 순차적으로 유리튜브에 첨가한 후 5분간 믹서로 섞었다. 튜브를 항온수조에 넣고 100℃에서 10분간 반응시켰다. 튜브를 상온까지 냉각시킨 후 증류수 1 mL을 주입하고, 믹서로 5분 정도 격렬히 섞은 후 4,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 층분리를 시켰다. 아래층 (유기상)을 1회용 PP 재질 주사기(Norm-ject, Germany)로 뽑아 1회용 0.22 ㎛ PVDF 실린지 필터[(Millex-Gv, Millipore, USA)로 여과 후 자동 주입기를 가진 가스크로마토그래피[Model 7890, Agilent, USA]로 분석하였다.
그 결과 (표 5), 유로네마 속 KGE 3 (Uronema sp. KGE 3)에 다양한 종류의 지방산이 존재하는 것을 확인하였으며, 특히 바이오디젤의 생산에 사용할 수 있는 팔미트산이 높은 함량으로 포함되어 있는 것을 확인하였다.
지방산 종류 함량 (wt%)
Palmitic acid (C16:0) 33.4
Palmitoleic acid (C16:1) 2.5
cis-10-Heptadecenoic acid (C17:1) 11.6
Oleic acid (C18:1n9c) 4.6
Linolelaidic acid (C18:2n6t) 12
γ-Linolenic acid (C18:3n6) 29.1
Other 6.8
Total 100
균주 내 지질함량 증가 실험
가축분뇨를 혐기성으로 처리한 후, Membrane Bioreactor (MBR) 처리한 유출수를 10배 희석시켜 유로네마 속 KGE 3 (Uronema sp. KGE 3) 균주를 배양시켰다. BBM 배지와 MBR 유출수를 각각 500ml 플라스크에 충진시킨 후, 본 발명의 균주를 접종하고, 이를 28℃에서 일주일간 배양시켰다. 대조군으로는 BBM 배지에서 배양시킨 유로네마 속 KGE 3 (Uronema sp. KGE 3) 균주를 이용하였다.
그 결과, 최적 배지인 BBM 배지에서 배양시킨 경우 지질함량이 25% 증가한 반면, MBR 유출수에서 처리한 경우 지질함량이 48%까지 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 4).
균주 내 베타카로틴 생성 확인
대조군으로 BBM 배지에서, 실험군으로는 실시예 7에서 사용한 10배 희석시킨 MBR 유출수를 각각 이용하여 본 발명의 유로네마 속 KGE 3 균주를 10일간 배양하였고, 그 후 얻어진 유로네마 속 KGE 3 균주를 동결 건조하였다. 동결 건조시킨 미세조류 0.1g에 2-프로판올 3ml를 가하면서 교반하였고, 아세톤과 디클로메탄을 각각 5ml씩 더 가하여 1시간 동안 교반시켰다. 이를 원심분리 시킨 후, 상등액을 취하여 용매를 제거한 후 HPLC로 분석하였다.
그 결과 (도 5), BBM 배지에서 배양시킨 유로네마 속 KGE 3 균주는 베타카로틴을 포함하고 있지 않았지만 MBR유출수로 배양시킨 유로네마 속 KGE 3 균주는 5.8mg/g의 베타카로틴을 포함하는 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC12457BP 20130730
<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> NOVEL STRAIN CONTAINING HIGH CONCCENTRATION OF USEFUL MATERIAL <130> 13P382IND_K06694 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 874 <212> DNA <213> Uronema sp. KGE 3 <400> 1 agcggaggaa aagaaactaa caaggatgtg cgccctatga taatcggcga gcgaaccggg 60 aatagcccaa cgtgtaaatc tccctcggag aattgtagtc tatagaagca acttctgcaa 120 cggccggacc tcaagtcccc tggaaggggg cgtcagagag ggtgagaacc ccgtcgggtc 180 ttggtgcggt tgcctcacga agtgctctcc aagagtcggg ttgtttggga atgcagccca 240 aatttggtgg taaatcccat ctaaggctaa atattggcga gagaccgata gcgaacaagt 300 accgtgaggg aaagatgaaa agaactttga aaagagagtt aaaaagtgct tgaaattgtt 360 gagggggaag cgattggcag ctgtgtgtgc acctaggctt acgtcgcctt aacgggcggc 420 tgcatgtgct aggtgctggt cagcatgggt tagcctggca ggataaacgc aggggttgtt 480 actctgtcta tactgccggg ttgaccgagg tgtgaaggcc gctcttgtcc ctcgggatct 540 gcggcctcaa gatgctggcg gaaggctttc aatcggcycg tcttgaaaca cggaccaagg 600 agtctaacat gtatgcgagc tggtgggtgg caaacccatg aggcgcaagt aacctgactg 660 gtgggatggc gtaagcctgc accatcgacc gaccatgatc ttctgtgaaa ggttcgagta 720 cgagcatacc tgttgggacc cgaaagatgg tgaactatgc ctgagcaggg cgaagccaga 780 ggaaactctg gtggaggctc gtagaygtgc tgacgtgcaa atcgcttttc ggacttgggt 840 ataggggcga taagactaat cgaaccttct agta 874

Claims (8)

  1. 유로네마 속 KGE 3 (Uronema sp. KGE 3) 균주를 폐수와 함께 배양시키는 단계를 포함하며, 상기 균주는 기탁번호가 KCTC 12457BP인 균주인, 베타카로틴을 생성시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 균주인 베타카로틴을 생성시키는 방법.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 건조 균주의 총 중량에 대하여 25 중량% 이상의 지질을 포함하는 균주인 베타카로틴을 생성시키는 방법.
  5. 제1항 내지 제2항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폐수는 광산배수 또는 가축분뇨를 포함하는 폐수인, 베타카로틴을 생성시키는 방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
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