ES2409329T3 - Producción de aceite en microorganismos - Google Patents

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Chung-Soon Im
Harrison F. Dillon
Anthony G. Day
Scott Franklin
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Abstract

Un método para producir combustible, que comprende: (a) cultivar una población de microalgas heterotróficamente en presencia de una fuente de carbono fija, en donde: (i) las microalgas expresan una invertasa de sacarosa exógena; (ii) las microalgas acumulan por lo menos un 10% de su peso celular seco como lípido; y (iii) la fuente de carbono fija comprende sacarosa en forma de jugo de caña de azúcar, caña de azúcar, remolacha de azúcar, melazas u otras materias primas de alimentación que contienen sacarosa; (b) aislar los componentes de lípido de las microalgas cultivadas; y (c) someter los componentes de lípido aislados a una o más reacciones químicas para generar alcanos, mediante lo cual se produce combustible.

Description

Producción de aceite en microorganismos.
REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS
Esta solicitud reclama prioridad sobre las solicitudes de patente provisionales estadounidenses N.os 60/941,581, presentada el 1 de junio de 2007; 60/959,174, presentada el 10 de julio de 2007; 60/968,291, presentada el 27 de agosto de 2007 y 61/024,069, presentada el 28 de enero de 2008.
Campo de la invención
La revelación se refiere a la producción de aceites, combustibles y productos oleoquímicos fabricados a partir de microorganismos. En particular, la revelación se refiere a microorganismos portadores de aceite, en los que se incluyen microalgas, levaduras y hongos y a métodos para cultivar tales microorganismos para la producción de compuestos útiles, en los que se incluyen lípidos, ésteres de ácido graso, ácidos grasos, aldehídos, alcoholes y alcanos, para usar en la industria o como una fuente de energía o alimento.
Los microorganismos pueden ser seleccionados o diseñados genéticamente para uso en los métodos de la invención descrita en la presente.
Antecedentes de la invención
El combustible fósil es un término general para designar a los depósitos geológicos combustibles enterrados de materiales orgánicos formados a partir de plantas y animales en descomposición que han sido convertidos en aceite crudo, carbón, gas natural o aceites pesados mediante la exposición a calor y presión en la corteza terrestre durante cientos de millones de años.
Se sabe que el combustible fósil, también conocido como combustible mineral, es usado como sinónimo con otros recursos naturales que contienen hidrocarburos tales como carbón, aceite y gas natural. La utilización de combustibles fósiles ha permitido el desarrollo industrial a gran escala y suplantado extensamente los molinos impulsados por agua, así como la combustión de madera o turba para calentamiento. Los combustibles fósiles son un recurso no renovable finito.
Cuando se genera electricidad, la energía de la combustión de combustibles fósiles es frecuentemente usada para impulsar una turbina. Las generaciones pasadas frecuentemente usaban vapor generado por el quemado de combustible para hacer girar la turbina, pero en las plantas de energía más nuevas, los gases producidos por el quemado del combustible hacen girar una turbina de gas directamente. Con la modernización global en los siglos XX y XXI, la sed de energía procedente de combustibles fósiles, especialmente gasolina derivada de petróleo, es una de las causas principales de conflictos regionales y globales.
El quemado de los combustibles fósiles por parte de los humanos es la fuente más grande de emisiones de dióxido de carbono, que es uno de los gases de efecto invernadero que permite el forzado radioactivo y contribuye al calentamiento global. En los Estados Unidos de América, más del 90% de las emisiones de gas de efecto invernadero proceden de la combustión de combustibles fósiles. Además, otros contaminantes de aire, tales como óxido de nitrógeno, dióxido de azufre, compuestos orgánicos volátiles (VOC) y metales pesados son producidos.
La actividad humana eleva los niveles de gases de efecto invernadero principalmente por la liberación de dióxido de carbono a partir de la combustión del combustible fósil, pero otros gases, por ejemplo metano, no son desdeñables. Las concentraciones de varios gases de efecto invernadero se han incrementado con el paso del tiempo debido a actividades humanas tales como el quemado de combustibles fósiles y la deforestación provocando concentraciones más altas de dióxido de carbono. De acuerdo con la hipótesis del calentamiento global, los gases de efecto invernadero de la industria y agricultura han desempeñado un papel principal en el calentamiento global observado recientemente.
La demanda incrementada de energía por parte de la economía global también ha añadido más presión al coste de los hidrocarburos. Además de la energía, muchas industrias, en las que se incluyen fabricantes de plásticos y productos químicos, dependen en gran medida de la disponibilidad de hidrocarburos como materia prima para sus procesos de fabricación. Alternativas económicas a las fuentes actuales de suministro podrían ayudar a mitigar la presión ascendente sobre la energía y estos costos de materias primas.
Breve descripción de la invención
La invención proporciona un método para producir combustible, que comprende:
(a) cultivar una población de microalgas heterotróficamente en presencia de una fuente de carbono fija, en donde:
(i)
las microalgas expresan una invertasa de sacarosa exógena;
(ii)
las microalgas acumulan por lo menos un 10% de su peso celular seco como lípido;
y
(iii) la fuente de carbono fija comprende sacarosa en forma de jugo de caña de azúcar, caña de azúcar, remolacha de azúcar, melazas u otras materias primas de alimentación que contienen sacarosa;
(b)
aislar los componentes de lípido de las microalgas cultivadas; y
(c)
someter los componentes de lípido aislados a una o más reacciones químicas para generar alcanos, mediante lo cual se produce combustible.
La célula de microalgas puede contener un gen exógeno que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en una lipasa, transportador de sacarosa, fructocinasa, enzima polisacárido-degradante, una acil-ACP tioesterasa grasa, una acil-CoA aldehído reductasa grasa, una acil-CoA reductasa grasa, un aldehído reductasa grasa, un aldehído descarbonilasa grasa y una proteína portadora de acilo (ACP). La célula de microalga puede ser seleccionada por ejemplo de la Tabla 1. En modalidades particulares, la célula es una especie del género Chlorella, tal como por ejemplo Chlorella fusca, Chlorella protothecoides, Chlorella pyrenoidosa, Chlorella kessleri, Chlorella vulgaris, Chlorella saccharophila, Chlorella sorokiniana o Chlorella ellipsoidea.
Una composición de hidrocarburos líquidos fabricados de acuerdo con el método puede ser conforme a las especificaciones de ASTM D975.
Una composición de hidrocarburos líquidos producidos de acuerdo con el método puede ser conforme a las especificaciones de ASTM D1655. Las microalgas que producen aceite pueden contener uno o más genes exógenos, en donde los genes exógenos codifican proteína(s) seleccionada(s) del grupo que consiste en una acil-ACP tioesterasa grasa, una acil-CoA reductasa grasa, un aldehído reductasa grasa, una acil-CoA/aldehído reductasa grasa, un aldehído decarbonilasa grasa y una proteína portadora de acilo. En algunos casos, la microalga es Chlorella protothecoides, Chlorella minutissima, Chlorella emersonii, Chlorella sorokiniana, Chlorella ellipsoidea o Chlorella sp. En otros casos, la microalga es otra especie como se describe en la presente. En una modalidad, el gen exógeno está en enlace operable con un promotor, que es inducible o represible en respuesta a un estímulo. En algunos casos, el estímulo es seleccionado del grupo que consiste en una molécula pequeña provista exógenamente, calor, frío y luz. En algunos casos, el gen exógeno es expresado en un compartimiento celular. En algunas modalidades, el compartimiento celular es seleccionado del grupo que consiste en un cloroplasto y una mitocondria.
En una modalidad, el gen exógeno codifica una acil-ACP tioesterasa de ácido graso. En algunos casos, la tioesterasa codificada por el gen exógeno cataliza la escisión de un ácido graso de 8 a 18 átomos de carbono de una proteína portadora de acilo (ACP). En algunos casos, la tioesterasa codificada por el gen exógeno cataliza la escisión de un ácido graso de 10 a 14 átomos de carbono de un ACP. En una modalidad, la tioesterasa codificada por el gen exógeno cataliza la escisión de un ácido graso de 12 átomos de carbono de un ACP.
En una modalidad, el gen exógeno codifica una acil-CoA/aldehído reductasa grasa. En algunos casos, la reductasa codificada por el gen exógeno cataliza la reducción de un acil-CoA graso de 20 a 30 átomos de carbono a alcohol primario correspondiente. En algunos casos, la reductasa codificada por el gen exógeno cataliza la reducción de un acil-CoA graso de 8 a 18 átomos de carbono a un alcohol primario correspondiente. En algunos casos, la reductasa codificada por el gen exógeno cataliza la reducción de un acil-CoA graso de 10 a 14 átomos de carbono a un alcohol primario correspondiente. En una modalidad, la reductasa codificada por el gen exógeno cataliza la reducción de un acil-CoA graso de 12 átomos de carbono a dodecanol.
En una modalidad, el gen exógeno codifica una acil-CoA reductasa grasa. En algunos casos, la reductasa codificada por el gen exógeno cataliza la reducción de un acil-CoA graso de 8 a 18 átomos de carbono a un aldehído correspondiente. En una modalidad, la reductasa codificada por el gen exógeno cataliza la reducción de un acil-CoA graso de 12 átomos de carbono a dodecanal.
En por lo menos una modalidad, la microalga contiene además más genes de utilización de sacarosa exógenos.
La microalga puede contener dos genes exógenos, en donde un primer gen exógeno codifica una acil-ACP tioesterasa grasa y un segundo gen exógeno codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en una acil-CoA reductasa grasa, una acil-CoA/aldehído reductasa grasa y una proteína portadora de acilo. En algunos casos, la microalga es Chlorella minutissima, Chlorella emersonii, Chlorella sorokiniana, Chlorella ellipsoidea, Chlorella sp. o Chlorella protothecoides. En otros casos, la microalga es otra especie como se describe en la presente. En algunos casos, los dos genes exógenos están cada uno en enlace operable con un promotor, que es inducible en respuesta a un estímulo. En algunos casos, cada promotor es inducible en respuesta a un estímulo idéntico.
En una modalidad, la tioesterasa codificada por el primer gen exógeno cataliza la escisión de un ácido graso de 8 a 18 átomos de carbono de un ACP. En algunas modalidades, el segundo gen exógeno codifica una acil-CoA/aldehído reductasa grasa que cataliza la reducción de un acil-CoA graso de 8 a 18 átomos de carbono a un alcohol primario correspondiente. En algunos casos, la tioesterasa codificada por el primer gen exógeno cataliza la escisión de un ácido graso de 10 a 14 átomos de carbono de un ACP y la reductasa codificada por el segundo gen exógeno cataliza la reducción de un acil-CoA graso de 10 a 14 átomos de carbono al alcohol primario correspondiente, en donde la tioesterasa y la reductasa actúan sobre la misma longitud de cadena de carbono. En una modalidad, la tioesterasa codificada por el primer gen exógeno cataliza la escisión de un ácido graso de 12 átomos de carbono de un ACP y la reductasa codificada por el segundo gen exógeno cataliza la reducción de un acil-CoA graso de 12 átomos de carbono a dodecanol. En algunas modalidades, el segundo gen exógeno codifica una acil-CoA reductasa grasa que cataliza la reducción de un acil-CoA graso de 8 a 18 átomos de carbono a un aldehído correspondiente.
En algunas modalidades, el segundo gen exógeno codifica una acil-CoA reductasa grasa y la microalga contiene además un tercer gen exógeno que codifica un aldehído descarbonilasa grasa. En algunos casos, la tioesterasa codificada por el primer gen exógeno cataliza la escisión de un ácido graso de 8 a 18 átomos de carbono de un ACP, la reductasa codificada por el segundo gen exógeno cataliza la reducción de un acil-CoA graso de 8 a 18 átomos de carbono a un aldehído graso correspondiente y la descarbonilasa codificada por el tercer gen exógeno cataliza la conversión de un aldehído graso de 8 a 18 átomos de carbono a un alcano correspondiente, en donde la tioesterasa, la reductasa y la descarbonilasa actúan sobre la misma longitud de cadena de carbonos.
En algunas modalidades, el segundo gen exógeno codifica una proteína portadora de acilo que es coexpresada naturalmente con la acil-ACP tioesterasa grasa.
En algunas modalidades, el segundo gen exógeno codifica una proteína portadora de acilo y la microalga contiene además un tercer gen exógeno que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en una acil-CoA reductasa grasa y una acil-CoA/aldehído reductasa grasa. En algunos casos, el tercer gen exógeno codifica una acil-CoA reductasa grasa y la microalga contiene además un cuarto gen exógeno que codifica un aldehído descarbonilasa grasa.
La célula de microalga puede contener un gen exógeno, en donde el gen exógeno codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en una lipasa, un transportador de sacarosa, una fructocinasa o una enzima polisacárido-degradante. En algunos casos, la célula es Chlorella minutissima, Chlorella emersonii, Chlorella sorokiniana, Chlorella ellipsoidea, Chlorella sp., o Chlorella protothecoides. En otros casos, la célula es otra especie de microalga como se describe en la presente.
En algunos casos, el gen exógeno está en enlace operable con un promotor. En algunos casos, el promotor es inducible o represible en respuesta a un estímulo. En varias modalidades, el estímulo es seleccionado del grupo que consiste en una molécula pequeña provista exógenamente, calor, frío y luz. En algunos casos, el gen exógeno es expresado en un compartimiento celular. En algunas modalidades, el compartimiento celular es seleccionado del grupo que consiste en un cloroplasto y una mitocondria.
En algunos casos, el gen codifica una lipasa que tiene por lo menos un 70% de identidad de aminoácidos con una lipasa seleccionada de la tabla 9. En una modalidad, la lipasa es novozim-435. En una modalidad, la enzima polisacárido-degradante es endógena a un virus de Chlorella.
La célula de microalga puede contener dos genes exógenos, en donde un primer gen exógeno codifica una lipasa y un segundo gen exógeno codifica una enzima polisacárido-degradante. En algunos casos, los genes exógenos están cada uno en enlace operable con un promotor. En algunos casos, los genes exógenos están cada uno en enlace operable con promotores que son inducibles en respuesta a un estímulo. En algunos casos, los genes exógenos están cada uno en enlace operable con promotores que son inducibles en respuesta al mismo estímulo. En algunos casos, los genes exógenos están cada uno en enlace operable con un promotor que es inducible en respuesta a por lo menos un estímulo que no induce al otro promotor.
La célula de microalga puede contener un gen exógeno, en donde el gen exógeno codifica un cofactor para una enzima de ruta de lípido o codifica una proteína que participa en la síntesis del cofactor.
En modalidades de los varios métodos descritos anteriormente, el microorganismo o microbio es una microalga. En algunos casos, el microorganismo es seleccionado del grupo que consiste en las microalgas enumeradas en la tabla
1. En algunos casos, el microorganismo es una especie del género Chlorella. En algunos casos, el microorganismo es seleccionado del grupo que consiste en Chlorella anitrata, Chlorella antarctica, Chlorella aureoviridis, Chlorella candida, Chlorella capsulata, Chlorella desiccata, Chlorella ellipsoidea, Chlorella emersonii, Chlorella fusca, Chlorella fusca var. Vacuolata, Chlorella glucotropha, Chlorella infusionum, Chlorella infusionum var. Actophila, Chlorella infusionum var. Auxenophila, Chlorella kessleri, Chlorella luteoviridis, Chlorella luteoviridis var. Aureoviridis, Chlorella luteoviridis var. Lutescens, Chlorella miniata, Chlorella minutissima, Chlorella mutabilis, Chlorella nocturna, Chlorella parva, Chlorella photophila, Chlorella pringsheimii, Chlorella protothecoides, Chlorella regularis, Chlorella regularis var. Minima, Chlorella regularis var. Umbricata, Chlorella reisiglii, Chlorella saccharophila, Chlorella saccharophila var. ellipsoidea, Chlorella salina, Chlorella simplex, Chlorella sorokiniana, Chlorella sp., Chlorella sphaerica, Chlorella stigmatophora, Chlorella vannielli, Chlorella vulgaris, Chlorella vulgaris, Chlorella vulgaris f. tertia, Chlorella vulgaris var. airidis, Chlorella vulgaris var. vulgaris, Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia, Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis, Chlorella xanthella y Chlorella zofingiensis.
En las varias modalidades descritas anteriormente, el microorganismo puede contener por lo menos un gen de utilización de sacarosa exógeno, además de la sacarosa invertasa. En algunos casos, el gen de utilización de sacarosa codifica un transportador de sacarosa, una hexocinasa, una glucocinasa o una fructocinasa.
En las varias modalidades descritas anteriormente, el microorganismo puede contener por lo menos un gen exógeno que codifica una enzima de ruta de lípido. En algunos casos, la enzima de ruta de lípido es seleccionada del grupo que consiste en una estearoil-ACP desaturasa, un glicerolípido desaturasa, un piruvato deshidrogenasa, una acetil-CoA carboxilasa, una proteína portadora de acilo y una glicerol-3-fosfatoaciltransferasa.
En las varias modalidades descritas anteriormente, el microorganismo puede contener por lo menos un gen exógeno que codifica una enzima de modificación de hidrocarburo. En algunos casos, la enzima de modificación de hidrocarburo es seleccionada del grupo que consiste en una acil-ACP tioesterasa grasa, una acil-CoA/aldehído reductasa grasa, una acil-CoA reductasa grasa, un aldehído reductasa grasa, un aldehído descarbonilasa grasa y/o una proteína portadora de acilo.
Cualesquiera dos o más de las varias modalidades descritas anteriormente pueden ser combinadas conjuntamente para producir modalidades adicionales abarcadas dentro del alcance de la presente invención.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra el genotipo de transformante de Chlorella protothecoides que contiene un gen exógeno.
La figura 2 muestra el uso de codón de Chlorella protothecoides.
La figura 3 muestra el uso de codón de D. salina y Chlorella pyrenoidosa.
La figura 4 muestra el cultivo de Chlorella fusca sobre sacarosa al 1%.
La figura 5 muestra el cultivo de Chlorella kessleri sobre sacarosa al 1%.
La figura 6 muestra el peso seco de célula por litro de Chlorella protothecoides cuando es cultivada en presencia de glucosa, sacarosa o una de varias muestras de melaza (designadas BS1, BS2 y HTM) en presencia o ausencia de una invertasa de sacarosa.
La figura 7 muestra el cultivo de Chlorella protothecoides cuando es cultivada en presencia de glucosa, sacarosa o una de varias muestras de melaza (designadas BS1, BS2 y HTM) en presencia o ausencia de una invertasa de sacarosa según se mide por la densidad celular relativa.
La figura 8 muestra una ilustración de varios conceptos de plásmido de invertasa de levadura (SUC2) con tres promotores diferentes (designados CMV, CV y HUP1) así como sitios de restricción útiles para la subclonación.
La figura 9 muestra el genotipo de transformantes de Chlorella protothecoides seleccionados sobre sacarosa en la oscuridad que contiene un gen de invertasa de sacarosa exógeno.
La figura 10 muestra el genotipo de células de Chlorella protothecoides transformadas con un gen que codifica una invertasa de sacarosa secretada de S. cerevisiae.
La figura 11 muestra el genotipo de células de Chlorella minutissima y Chlorella emersonii transformadas con un gen que codifica una invertasa de sacarosa secretada de S. cerevisiae.
Descripción detallada de la invención
I. Definiciones
A no ser que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos empleados en la presente tienen el significado entendido comúnmente por una persona experta en la técnica a las cual pertenece la invención. Las siguientes referencias proporcionan al experto una definición general de muchos de los términos usados en esta invención: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); y Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). Como se usa en la presente, los siguientes términos tienen los significados adscritos a ellos a no ser que se especifique de otra manera.
Como se usa con referencia a un ácido nucleico, “activo en microalgas” se refiere a un ácido nucleico que es funcional en microalgas. Por ejemplo, un promotor que ha sido usado para impulsar a un gen de resistencia a antibiótico a impartir resistencia a antibiótico a una microalga transgénica es activo en microalgas. Ejemplos de promotores activos en microalgas son promotores endógenos a ciertas especies de algas y promotores encontrados en virus de plantas.
Una “proteína portadora de acilo” o “ACP” es una proteína que se enlaza a una cadena de acilo creciente durante la síntesis de ácido graso como un tioléster en el tiol distante del resto de 4’-fosfopanteteína y comprende un componente del complejo de sintasa de ácido graso. La frase “coexpresado naturalmente” con referencia a una proteína portadora de acilo en conjunción con una acil–ACP tioesterasa grasa significa que la ACP y la tioesterasa son coexpresadas naturalmente en un tejido u organismo del cual son derivados, por ejemplo debido a que a los genes que codifican las dos enzimas los controla una secuencia regulatoria común o debido a que son expresados en respuesta al mismo estímulo.
Una “molécula de acil-CoA” o “acil-CoA” es una molécula que comprende un resto de acilo anexado covalentemente a la Coenzima A por medio de un enlace de tioléster en el tiol distante del resto de 4’-fosfopanteteína de la Coenzima A.
“Axénico” significa un cultivo de un organismo que está libre de contaminación por otros organismos vivos.
“Biodiésel” es un alquiléster de ácido graso producido biológicamente apropiado para usar como combustible en un motor diésel.
El término “biomasa” se refiere al material producido mediante el cultivo y/o propagación de células. La biomasa puede contener células y/o contenido intracelular, así como material extracelular. El material extracelular incluye pero no está limitado a compuestos secretados por una célula.
“Biorreactor” significa un envolvente o envolvente parcial en el cual las células son cultivadas, opcionalmente en suspensión.
Como se usa en la presente, “catalizador” se refiere a un agente, tal como una molécula o complejo macromolecular,
capaz de facilitar o promover una reacción química de un reactivo a un producto sin convertirse en parte del producto. Así, un catalizador incrementa la velocidad de una reacción, después de lo cual el catalizador puede actuar sobre otro reactivo para formar el producto. Un catalizador disminuye en general la energía de activación global requerida para la reacción, de tal manera que procede más rápidamente o a una temperatura más baja. Así, un equilibrio de reacción se puede obtener más rápidamente. Los ejemplos de catalizadores incluyen enzimas, que son catalizadores biológicos, calor, que es un catalizador no biológico y catalizadores de metal usados en procesos de refinación de petróleo fósil.
“Material celulósico” significa los productos de digestión de celulosa, en los que se incluye glucosa y xilosa, y
opcionalmente compuestos adicionales tales como disacáridos, oligosacáridos, lignina, furfurales y otros compuestos. Los ejemplos no limitantes de fuentes de material celulósico incluyen bagasas de caña de azúcar, pulpa de remolacha de azúcar, rastrojo de maíz, fragmentos de madera, aserrín y pasto varilla.
El término “cocultivo” y variantes del mismo, tales como “cocultivar”, se refieren a la presencia de dos o más tipos de células en el mismo biorreactor. Los dos o más tipos de células pueden ambos ser microorganismos, tales como microalgas o pueden ser una célula de microalga cultivada con un tipo de célula diferente. Las condiciones de cultivo pueden ser aquellas que refuerzan el crecimiento y/o propagación de los dos o más tipos de células o aquellos que facilitan el crecimiento y/o proliferación de una de las dos o más células, o un subconjunto de estas, a la vez que mantienen el crecimiento celular para el resto.
El término “cofactor” es usado en la presente para referirse a cualquier molécula, diferente del sustrato, que es requerida para que una enzima lleve a cabo su actividad enzimática.
Como se usa en la presente, “ADN complementario” (“ADNc”) es una representación de ADN de ARNm, obtenido normalmente mediante transcripción inversa de ARN mensajero (ARNm) o amplificación (por ejemplo, mediante la
reacción en cadena de polimerasa (“PCR”)).
El término “cultivado” y variantes del mismo, se refieren al refuerzo intencional del crecimiento (incrementos en el tamaño de célula, contenido celular, y/o actividad celular) y/o propagación (incrementos en los números de células a través de mitosis) de una o más células mediante el uso de condiciones de cultivo propuestas. La combinación tanto de cultivo como de propagación puede ser denominada proliferación. La una o más células pueden ser aquellas de un microorganismo, tales como microalgas. Los ejemplos de condiciones propuestas incluyen el uso de un medio definido (con características conocidas tales como pH, fuerza iónica y fuente de carbono), temperatura especificada, tensión de oxígeno, niveles de dióxido de carbono y crecimiento en un biorreactor. El término no se refiere al cultivo
o propagación de microorganismos en la naturaleza o de otra manera sin intervención humana directa, tal como el cultivo natural de un organismo que finalmente se convierte en fósil para producir petróleo crudo geológico.
Como se usa en la presente, el término “citólisis” se refiere a la lisis de células en un ambiente hipotónico. La citólisis
es provocada por osmosis excesiva o movimiento de agua hacia el interior de una célula (hiperhidratación). La célula no puede soportar la presión osmótica del agua en el interior y por lo tanto explota.
Como se usa en la presente, las expresiones “vector de expresión” o “constructo de expresión” se refieren a un constructo de ácido nucleico, generado recombinante o sintéticamente, con una serie de elementos de ácido nucleico especificados que permiten la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula huésped. El vector de expresión puede ser parte de un plásmido, virus o fragmento de ácido nucleico. Comúnmente, el vector de expresión incluye un ácido nucleico que va a ser transcrito enlazado operativamente a un promotor.
“Gen exógeno” se refiere a un ácido nucleico transformado en una célula. Una célula transformada puede ser denominada célula recombinante, en la cual gen(es) exógeno(s) adicional(es) puede(n) ser introducido(s). El gen exógeno puede ser de una especie diferente (y, por lo tanto, heterólogo) o de la misma especie (y, por lo tanto, homólogo) en relación con la célula que es transformada. En el caso de un gen homólogo, ocupa un sitio diferente en el genoma de la célula en relación con la copia endógena del gen. El gen exógeno puede estar presente en más de una copia en la célula. El gen exógeno puede ser mantenido en una célula como una inserción en el genoma o como una molécula episomal.
“Provisto exógenamente” describe una molécula provista al medio de cultivo de un cultivo celular.
Como se usa en la presente, una “acil-ACP tioesterasa grasa” es una enzima que cataliza la escisión de un ácido graso a partir de una proteína portadora de acilo (ACP) durante la síntesis del lípido.
Como se usa en la presente, una “acil-CoA/aldehído reductasa grasa” es una enzima que cataliza la reducción de una molécula de acil-CoA a un alcohol primario.
Como se usa en la presente, una “acil-CoA reductasa grasa” es una enzima que cataliza la reducción de una molécula de acil-CoA a un aldehído.
Como se usa en la presente, una “aldehído descarbonilasa grasa” es una enzima que cataliza la conversión de un
aldehído graso a un alcano.
Como se usa en la presente, una “aldehído reductasa grasa” es una enzima que cataliza la reducción de un aldehído
a un alcohol primario.
“Fuente de carbono fija” significa molécula(s) que contiene(n) carbono, preferiblemente orgánico, que está presente a la temperatura y presión ambiental en forma sólida o líquida.
“Homogenado” significa biomasa que ha sido sometida a disrupción físicamente.
Como se usa en la presente, “hidrocarburo” se refiere a: (a) una molécula que contiene solamente átomos de
hidrógeno y carbono, en donde los átomos de carbono están enlazados covalentemente para formar una cadena fundamental lineal, ramificada, cíclica o parcialmente cíclica a la cual los átomos de hidrógeno están unidos; o (b) una molécula que solo contiene principalmente átomos de hidrógeno y carbono y que puede ser convertida para contener solamente átomos de hidrógeno y carbono mediante de una a cuatro reacciones químicas. Los ejemplos no limitantes de los últimos incluyen hidrocarburos que contienen un átomo de oxígeno entre un átomo de carbono y un átomo de hidrógeno para formar una molécula de alcohol, así como aldehídos que contienen un solo átomo de oxígeno. Los métodos para la reducción de alcoholes a hidrocarburos que contienen solamente átomos de carbono e hidrógeno son bien conocidos. Otro ejemplo de un hidrocarburo es un éster, en el cual un grupo orgánico reemplaza un átomo de hidrógeno (o más de uno) por un oxígeno ácido. La estructura molecular de los compuestos de hidrocarburo varía de la forma más simple, en forma de metano (CH4), que es un constituyente de gas natural, a formas muy pesadas y complejas, tales como algunas moléculas como asfaltenos encontrados en petróleo crudo, petróleo y betunes. Los hidrocarburos pueden estar en forma gaseosa, líquida o sólida o cualquier combinación de estas formas y pueden tener uno o más enlaces dobles o triples entre átomos de carbono adyacentes en la cadena fundamental. Así, el término incluye alcanos lineales, ramificados, cíclicos o parcialmente cíclicos, alquenos, lípidos y parafina. Los ejemplos incluyen propano, butano, pentano, hexano, octano, trioleína y escualeno.
“Enzima de modificación de hidrocarburo” se refiere a una enzima que altera la estructura covalente de un hidrocarburo. Los ejemplos de enzimas de modificación de hidrocarburo incluyen una lipasa, una acil-ACP tioesterasa grasa, una acil-CoA/aldehído reductasa grasa, una acil-CoA reductasa grasa, un aldehído reductasa grasa y un aldehído descarbonilasa grasa. Los compuestos producidos por la actividad enzimática de enzimas de modificación de hidrocarburo, en los que se incluyen ácidos grasos, alcoholes, aldehídos, alcanos u otros compuestos derivados de los mismos son denominados en la presente de manera intercambiable como hidrocarburos o lípidos.
El término “proporción de hidrógeno:carbono” se refiere a la proporción de átomos de hidrógeno con respecto a átomos de carbono en una molécula en base de átomo a átomo. La proporción puede ser usada para referirse al número de átomos de carbono e hidrógeno en una molécula de hidrocarburo. Por ejemplo, el hidrocarburo con la proporción más alta es metano CH4 (4:1).
“Fracción hidrofóbica” se refiere a la porción o fracción, de un material que es más soluble en una fase hidrofóbica en comparación con una fase acuosa. Una fracción hidrofóbica es sustancialmente insoluble en agua y normalmente no polar.
Como se usa en la presente, la frase “incremento de rendimiento de lípido” se refiere a un incremento en la productividad de un cultivo microbiano al incrementar por ejemplo el peso seco de células por litro de cultivo, incrementar el porcentaje de células que constituyen el lípido o incrementar la cantidad global de lípido por litro de volumen de cultivo por tiempo unitario.
Un “promotor inducible” es uno que modera la transcripción de un gen enlazado operativamente en respuesta a un
estímulo particular.
Como se usa en la presente, la frase “en enlace operable” se refiere a un enlace funcional entre dos secuencias, tal como una secuencia de control (comúnmente un promotor) y la secuencia enlazada. Un promotor está en enlace operable con un gen exógeno si puede moderar la transcripción del gen.
El término “in situ” significa “en el lugar” o “en su posición original”. Por ejemplo, un cultivo puede contener una
primera microalga que segrega un catalizador y un segundo microorganismo que segrega un sustrato, en donde los primeros y segundos tipos de células producen los componentes necesarios para que una reacción química particular ocurra in situ en el cocultivo sin requerir separación adicional o procesamiento de los materiales.
Una “concentración limitante de un nutriente” es una concentración en un cultivo que limita la propagación de un organismo cultivado. Una “concentración no limitante de un nutriente” es una concentración que soporta la
propagación máxima durante un período de cultivo dado. Así, el número de células producidas durante un período de cultivo dado es menor en presencia de una concentración limitante de un nutriente que cuando el nutriente es no
limitante. Se dice que un nutriente está “en exceso” en un cultivo, cuando el nutriente está presente en una
concentración mayor que aquella que soporta la propagación máxima.
Como se usa en la presente, una “lipasa” es una enzima soluble en agua que cataliza la hidrólisis de enlaces de
éster en sustratos lípidos insolubles en agua. Las lipasas catalizan la hidrólisis de lípidos a gliceroles y ácidos grasos.
Como se usa en la presente, una “enzima de ruta de lípido” es cualquier enzima que desempeña un papel en el metabolismo del lípido, esto es, ya sea en síntesis, modificación o degradación del lípido. Este término abarca proteínas que modifican químicamente lípidos, así como proteínas portadoras.
“Lípidos” son una clase de hidrocarburos que son solubles en solventes no polares (tales como éter y cloroformo) y
son relativa o completamente insolubles en agua. Las moléculas de lípido tienen estas propiedades debido a que consisten en gran medida en colas de hidrocarburo largas que son hidrofóbicas por naturaleza. Los ejemplos de lípidos incluyen ácidos grasos (saturados e insaturados); glicéridos o glicerolípidos (tales como monoglicéridos, diglicéridos, triglicéridos o grasas neutras y fosfoglicéridos o glicerofosfolípidos); no glicéridos (esfingolípidos, esterol lípidos en los que se incluyen colesterol y hormonas esteroides, prenol lípidos en los que se incluyen terpenoides, alcoholes grasos, ceras y policétidos); y derivados de lípidos complejos (lípidos azúcar-enlazados o glicolípidos y lípidos proteína-enlazados). “Grasas” son un subgrupo de lípidos llamados “triacilglicéridos”.
Como se usa en la presente, el término “lisado” se refiere a una solución que contiene el contenido de células sometidas a lisis.
Como se usa en la presente, el término “lisis” se refiere a la rotura de la membrana de plasma y opcionalmente la pared celular de un organismo biológico suficiente para liberar por lo menos algo de contenido intracelular, frecuentemente mediante mecanismos mecánicos, virales u osmóticos que comprometen su integridad.
Como se usa en la presente, el término “someter a lisis” se refiere a la disrupción de la membrana celular y
opcionalmente la pared celular de un organismo biológico o célula suficiente para liberar por lo menos algo de contenido intracelular.
“Microalga” significa un organismo microbiano eucariótico que contiene un cloroplasto y que opcionalmente es capaz de efectuar fotosíntesis o un organismo microbiano procariótico capaz de efectuar fotosíntesis. Las microalgas incluyen fotoautótrofos obligados, que no pueden metabolizar una fuente de carbono fija como energía, así como heterótrofos, que pueden vivir solamente de una fuente de carbono fija. Las microalgas se pueden referir a organismos unicelulares que se separan de células hermanas poco después de la división celular, tales como Chlamydomonas y pueden también referirse a microbios tales como, por ejemplo, Volvox, que es un microbio fotosintético multicelular simple de dos tipos de células distintas. “Microalgas” también se puede referir a células tales como Chlorella y Dunaliella. “Microalgas” también incluyen otros organismos fotosintéticos microbianos que exhiben adhesión de célula-célula, tales como Agmenellum, Anabaena y Pyrobotrys. “Microalgas” también incluyen microorganismos heterotróficos obligados que han perdido la capacidad de efectuar fotosíntesis, tales como ciertas especies de algas dinoflageladas.
Los términos “microorganismo” y “microbio” son usados de forma intercambiable en la presente para referirse a organismos unicelulares microscópicos.
Como se usa en la presente, el término “choque osmótico” se refiere a la ruptura de células en una solución después de una reducción repentina de presión osmótica. El choque osmótico es inducido algunas veces a liberar componentes celulares de tales células a una solución.
“Fotobiorreactor” se refiere a un recipiente, por lo menos parte del cual es por lo menos parcialmente transparente
o parcialmente abierto, permitiendo de este modo que la luz pase a través del mismo, en el cual una o más células de microalgas son cultivadas. Los fotobiorreactores pueden ser cerrados, como en el caso de una bolsa de polietileno o matraz Erlenmeyer o pueden estar expuestos al medio ambiente, como en el caso de un estanque exterior.
Como se usa en la presente, una “enzima polisacárido-degradante” se refiere a cualquier enzima capaz de catalizar la hidrólisis o despolimerización de cualquier polisacárido. Por ejemplo, las celulasas catalizan la hidrólisis de celulosa.
“Polisacáridos” (también llamados “glicanas”) son carbohidratos compuestos de monosacáridos unidos
conjuntamente mediante enlaces glicosídicos. La celulosa es un ejemplo de un polisacárido que compone ciertas paredes de células de planta. La celulosa puede ser despolimerizada mediante enzimas para producir monosacáridos tales como xilosa y glucosa, así como disacáridos y oligosacáridos más grandes.
“Compuerta”, en el contexto de un biorreactor, se refiere a un orificio en el biorreactor que permite la entrada o salida de materiales tales como gases, líquidos y células. Las compuertas son conectadas normalmente a la tubería que procede del fotobiorreactor.
Un “promotor” es definido como un arreglo de secuencias de control de ácido nucleico que dirigen la transcripción de un ácido nucleico. Como se usa en la presente, un promotor incluye las secuencias de ácido nucleico necesarias cerca del sitio de inicio de transcripción, tal como en el caso de un promotor tipo polimerasa II, un elemento TATA. Un promotor también incluye opcionalmente elementos de mejorador o represor distantes, que pueden estar ubicados igual que varios miles de pares de bases del sitio de inicio de transcripción.
Como se usa en la presente, el término “recombinante” cuando es usado con referencia por ejemplo a una célula o ácido nucleico, proteína o vector indica que la célula, ácido nucleico, proteína o vector ha sido modificado mediante la introducción de un ácido nucleico exógeno o proteína o la alteración de un ácido nucleico natural o proteína o que la célula es derivada de una célula así modificada. Así, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no son encontrados en la forma natural (no recombinante) de la célula o expresan genes naturales que son de otra manera expresados anormalmente, subexpresados o no expresados de ningún modo. El término “ácido nucleico recombinante” en la presente significa ácido nucleico, originalmente formado in vitro, en general mediante la manipulación de ácido nucleico, por ejemplo utilizando polimerasas y endonucleasas en una forma no encontrada normalmente en la naturaleza. De esta manera, se obtiene el enlace operativo de diferentes secuencias. Así, un ácido nucleico aislado, en forma lineal o un vector de expresión formado in vitro mediante la ligación de moléculas de ADN que no están normalmente unidas, son ambos considerados recombinantes para los propósitos de esta invención. Se comprenderá que una vez que un ácido nucleico recombinante es elaborado y reintroducido en una célula huésped u organismo, se replicará no recombinantemente, esto es utilizando la maquinaria celular in vivo de la célula huésped, en lugar de manipulaciones in vitro; sin embargo, tales ácidos nucleicos, una vez producidos recombinantemente, aunque posteriormente replicados no recombinantemente, son todavía considerados recombinantes para los propósitos de la invención. De igual modo, una “proteína recombinante” es una proteína elaborada utilizando técnicas recombinantes, esto es, por medio de la expresión de un ácido nucleico recombinante como se ilustra anteriormente.
Como se usa en la presente, el término “diésel renovable” se refiere a alcanos (tales como C:10:0, C12:0, C:14:0, C16:0 y C18:0) producidos por medio de hidrogenación y desoxigenación de lípidos.
Como se usa en la presente, el término “sonificación” se refiere a un proceso para someter a disrupción materiales
biológicos, tales como una célula, mediante el uso de energía de ondas de sonido.
“Especie de furfural” se refiere a 2-furancarboxaldehído o un derivado del mismo que retiene las mismas características estructurales básicas.
Como se usa en la presente, “rastrojo” se refiere a estacas secas y hojas de una cosecha que quedan después de que un grano ha sido cosechado.
Un “gen de utilización de sacarosa” es un gen que cuando es expresado, ayuda a la capacidad de una célula para utilizar sacarosa como fuente de energía. Las proteínas codificadas por un gen de utilización de sacarosa son denominadas en la presente como “enzimas de utilización de sacarosa” e incluyen transportadores de sacarosa, invertasas de sacarosa y hexocinasas tales como glucocinasas y fructocinasas.
“Desperdicio de agua” es un desperdicio acuoso que contiene comúnmente agua de lavado, desperdicio de lavandería, heces, orina y otros desperdicios líquidos o semilíquidos. Incluye algunas formas de desperdicio municipal así como aguas cloacales tratadas secundariamente.
Para la comparación de secuencias para determinar el porcentaje de identidad de nucleótidos o aminoácidos, comúnmente una secuencia actúa como secuencia de referencia con la cual las secuencias de prueba son comparadas. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia son introducidas en un ordenador, se designan coordenadas de subsecuencia, si es necesario y se designan parámetros del programa de algoritmo de secuencia. Luego, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia para la(s) secuencia(s) de prueba en relación con la secuencia de referencia, en función de los parámetros de programa designados.
La alineación óptima de secuencias para la comparación se puede llevar a cabo por ejemplo mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el paquete de elementos de programación de Wisconsin Genetics (Software Package) Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspección visual (véase en general Ausubel et al, supra).
Otro algoritmo ilustrativo que es apropiado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que es descrito en Altschul et al, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). Elementos de programación para efectuar análisis de BLAST están disponibles públicamente por medio del National Center for Biotechnology Information (en la dirección web www.ncbi.nlm.nih.gov). Este algoritmo implica identificar primero pares de secuencia de alta puntuación (HSP) al identificar palabras cortas de longitud W en la secuencia de interrogación, que o bien coinciden o satisfacen alguna puntuación de umbral de valor positivo T cuando son alineadas con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T es denominado umbral de puntuación de palabra vecina (Altschul et al, supra.). Estos aciertos de palabra vecina iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largos que los contienen. Los aciertos de palabras son de este modo extendidos en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia tanto como la puntuación de alineación acumulativa pueda ser incrementada. Las puntuaciones acumulativas son calculadas utilizando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre > 0) y N (puntuación de penalización para residuos que no coinciden; siempre < 0). Para secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección son detenidas cuando: la puntuación de alineación acumulativa cae por la cantidad X de su valor máximo obtenido; la puntuación acumulativa desciende hasta cero o menos debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuo de puntuación negativos o se llega al final de una de las secuencias. Para identificar si un ácido nucleico o polipéptido está dentro del alcance de la invención, los parámetros predeterminados de los programas de BLAST son apropiados. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza como parámetros predeterminados una longitud de palabra (W) de 11, una esperanza (E) de 10, M=5, N=-4, y una comparación de ambas hebras. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza como parámetros predeterminados una longitud de palabra (W) de 3, una esperanza (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62. El programa TBLATN (utilizando una secuencia de proteínas para secuencias de nucleótidos) utiliza como parámetros predeterminados una longitud de palabra (W) de 3, una esperanza (E) de 10, y una matriz de puntuación BLOSUM 62 (véase Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)).
Además de calcular el porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST también efectúa un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin & Altschul, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Una medida de similitud provista por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual puede tener lugar una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos por probabilidad. Por ejemplo, un ácido nucleico es considerado similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menor de aproximadamente 0.1, más preferiblemente menor de aproximadamente 0.01 y más preferiblemente menor de aproximadamente 0.001.
II. General
La premisa de la invención está en parte en el concepto de que ciertos microorganismos pueden ser usados para producir aceites, combustibles y otras composiciones de hidrocarburos o lípidos económicamente y en grandes cantidades para usar en las industrias de combustible de transporte, industria petroquímica y/o de alimentos o cosméticos entre otras aplicaciones. Los microorganismos son microalgas. Un género preferido de microalgas para usar en la invención es la microalga que produce lípidos Chlorella. La transesterificación de lípidos produce ésteres de ácido graso de cadena larga útiles como biodiésel. Otros procesos enzimáticos y químicos pueden ser confeccionados para producir ácidos grasos, aldehídos, alcoholes, alcanos y alquenos. La presente solicitud describe métodos para la modificación genética de múltiples especies y cepas de microorganismos, en los que se incluyen Chlorella y microbios similares para proveer organismos que tienen características que facilitan la producción de lípido apropiado para convertirlo en aceites, combustibles y productos oleoquímicos. En algunas aplicaciones, se producen diésel renovable, combustibles de jet u otros compuestos de hidrocarburos. La presente solicitud también describe métodos para cultivar microalgas para productividad incrementada y rendimiento de lípido incrementado y/o para la producción más económica de las composiciones descritas en la presente.
En modalidades particulares, la presente solicitud describe cepas diseñadas genéticamente de microalgas con uno o más genes exógenos. Por ejemplo, microalgas que producen altos niveles de triacilglicéridos (TAG) apropiados para biodiésel pueden ser diseñados para expresar una lipasa, que puede facilitar la transesterificación de TAG de microalgas. La lipasa puede opcionalmente ser expresada utilizando un promotor inducible, de tal manera que las células pueden primero ser cultivadas a una densidad deseable en un fermentador y luego cosechadas, seguido de la inducción del promotor para expresar la lipasa, opcionalmente en presencia de alcohol suficiente para impulsar la conversión de TAG a ésteres de ácido graso.
Una parte de lípido microalgal es secuestrado en las membranas celulares y otras partes no acuosas de la célula. Por consiguiente, para incrementar el rendimiento de la reacción de transesterificación, puede ser beneficioso someter a lisis las células para incrementar el acceso de la lipasa al lípido. La disrupción celular puede ser efectuada, por ejemplo mecánicamente por medio de la adición de vapor presurizado o al emplear un virus que somete a lisis las células de microalgas, expresar un gen para producir una proteína lítica en la célula o tratar el cultivo con un agente que somete a lisis las células de microalgas. El tratamiento por vapor de microalgas para disrupción celular es descrito por ejemplo en la Patente estadounidense 6 750 048.
También se revela en la presente el diseño genético de microalgas que producen altos niveles de TAG para expresar un gen que somete a lisis células de microalgas, tales como por ejemplo, un gen de un virus lítico. Este gen puede ser expresado utilizando un promotor inducible, de tal manera que las células pueden primero ser cultivadas a una densidad deseable en un fermentador y luego cosechadas, seguido de la inducción del promotor para expresar el gen para someter a lisis las células. Un gen que codifica una enzima polisacárido-degradante, por ejemplo puede ser expresado para someter a lisis las células.
Opcionalmente, la lipasa puede ser expresada en un compartimiento intracelular, en donde permanece separada de la mayoría del lípido microalgal hasta la transesterificación. En general, es preferible llevar a cabo la transesterificación después de que el agua ha sido sustancialmente retirada de la preparación y/o se ha agregado un exceso de alcohol. Las lipasas pueden usar agua, así como alcohol, como sustrato en la transesterificación. Con agua, el lípido es conjugado a una porción de hidroxilo para producir un ácido graso polar, en lugar de un éster. Con un alcohol, tal como metanol, el lípido es conjugado a un grupo metilo, produciendo un éster de ácido graso no polar, que es comúnmente preferible para un combustible de transporte. Para limitar la exposición de la lipasa al lípido microalgal hasta que las condiciones sean apropiadas para la transesterificación para producir ésteres de ácido graso, la lipasa puede ser expresada, por ejemplo en el cloroplasto, mitocondria u otro organelo celular. Esta expresión por compartimientos da como resultado el secuestro de la lipasa de la mayoría del lípido celular hasta después de que las células hayan sido sometidas a disrupción.
En otras modalidades particulares, la presente solicitud describe cepas diseñadas genéticamente de microalgas con uno o más genes exógenos para producir varios compuestos de hidrocarburo. Por ejemplo, microalgas que naturalmente o por medio de modificación genética producirían altos niveles de lípidos pueden ser diseñadas (o diseñadas adicionalmente) para expresar una acil-ACP tioesterasa grasa exógena, que puede facilitar la escisión de ácidos grasos de la proteína portadora de acilo (ACP) durante la síntesis del lípido. Estos ácidos grasos pueden ser recuperados o, por medio de procesamiento enzimático adicional dentro de la célula, producir otros compuestos de hidrocarburo. Opcionalmente, la acil-ACP tioesterasa grasa puede ser expresada de un gen enlazado operativamente a un promotor inducible y/o puede ser expresada en un compartimiento intracelular.
La acil-ACP tioesterasa grasa puede ser escogida en función de su especificidad para un ácido graso creciente (durante la síntesis de ácido graso) que tiene una longitud de cadena de carbono particular. Por ejemplo, la acil-ACP tioesterasa grasa puede tener una especificidad para una longitud de cadena de carbonos que fluctúa de 8 a 34 átomos de carbono, preferiblemente de 8 a 18 átomos de carbono y más preferiblemente de 10 a 14 átomos de carbono. Una especificidad para un ácido graso con 12 átomos de carbono es más preferida.
Además, las microalgas pueden estar diseñadas genéticamente para expresar dos o más genes exógenos, tales como por ejemplo, una lipasa y un gen lítico, por ejemplo, uno que codifica una enzima polisacárido-degradante. Uno o ambos genes pueden ser expresados utilizando un promotor inducible, que permite que la sincronización relativa de expresión de esos genes sea controlada para mejorar el rendimiento de lípido y conversión a ésteres de ácido graso. La invención también proporciona vectores y métodos para diseñar microbios que producen lípido para metabolizar sacarosa, que es un rasgo ventajoso debido a que permite que las células diseñadas conviertan la caña de azúcar u otras materias primas de alimentación en lípidos apropiados para la producción de aceites, combustibles, productos oleoquímicos y semejantes.
Las cepas diseñadas genéticamente de microalgas pueden expresar dos o más genes exógenos, tales como por ejemplo una acil-ACP tioesterasa grasa y una acil-CoA/aldehído reductasa grasa, cuya acción combinada produce un producto de alcohol. Es posible obtener otras combinaciones de genes exógenos, en los que se incluyen sin limitación, una acil-ACP tioesterasa grasa y una proteína portadora de acilo coexpresada naturalmente para generar ácidos grasos de longitud específica o una acil-ACP tioesterasa grasa y una acil-CoA reductasa grasa para generar aldehídos. La combinación de una acil-ACP tioesterasa grasa, una acil-CoA reductasa grasa y un aldehído descarbonilasa grasa para generar alcanos o alquenos también es posible. Uno o más de los genes exógenos pueden ser expresados utilizando un promotor inducible.
Las modificaciones adicionales de microalgas pueden proveer microalgas con características de crecimiento deseadas y/o mejorar la cantidad y/o calidad de lípidos producidos. Por ejemplo, las microalgas pueden ser diseñadas para incrementar el flujo de carbono en la ruta del lípido y/o modificar la ruta del lípido para alterar de forma beneficiosa las proporciones o propiedades del lípido producido por las células.
Esta solicitud revela cepas diseñadas genéticamente de microalgas para expresar dos o más genes exógenos, uno que codifica un transportador de una fuente de carbono fija (tal como sacarosa) y un segundo que codifica una enzima de invertasa de sacarosa. Los organismos fermentables resultantes producen hidrocarburos con un costo de fabricación más bajo que aquel que ha sido obtenible mediante métodos previamente conocidos de producción de hidrocarburos biológicos. La inserción de los dos genes exógenos descritos anteriormente puede ser combinada con la disrupción de la biosíntesis del polisacárido por medio de mutagénesis dirigida y/o aleatoria, que dirige un flujo de carbono aún mayor a la producción de hidrocarburo. Individualmente y en combinación, la conversión trófica, el diseño para alterar la producción de hidrocarburo y el tratamiento con enzimas exógenas alteran la composición de hidrocarburo producida por un microorganismo. La alteración puede ser un cambio en la cantidad de hidrocarburos producidos, la cantidad de una o más especies de hidrocarburos producidas en relación con otros hidrocarburos y/o los tipos de especies de hidrocarburos producidos en el microorganismo. Por ejemplo, las microalgas pueden ser diseñadas para producir una cantidad y/o porcentaje más altos de TAG.
III. Microorganismos que producen aceite o lípido
Se puede usar cualquier especie de microalga que produce lípido o hidrocarburo apropiado, aunque las microalgas que producen de forma natural niveles altos de lípido o hidrocarburo apropiados son preferidas. La producción de hidrocarburos por parte de microorganismos es revisada por Metzger et al. Appl Microbiol Biotechnol (2005) 66: 486496 y A Look Back at the U.S. Department of Energy’s Aquatic Species Program: Biodiésel from Algae, NREL/TP580-24190, John Sheehan, Terri Dunahay, John Benemann y Paul Roessler (1998).
Las consideraciones que afectan a la selección de microorganismos para usar en la invención incluyen, además de la producción de lípidos o hidrocarburos apropiados para la producción de aceites, combustibles y productos oleoquímicos: (1) alto contenido de lípido como porcentaje de peso de célula; (2) facilidad de cultivo; (3) facilidad de diseño genético; y (4) facilidad de procesamiento de biomasa. En modalidades particulares, el microorganismo de tipo silvestre o diseñado genéticamente produce células que son por lo menos un 40%, por lo menos un 45%, por lo menos un 50%, por lo menos un 55%, por lo menos un 60%, por lo menos un 65% o por lo menos un 70% o más de lípido. Los organismos preferidos crecen heterotróficamente (sobre azúcares en ausencia de luz) o pueden ser diseñados para hacer esto utilizando, por ejemplo, los métodos revelados en la presente. La facilidad de transformación y disponibilidad de marcadores y promotores seleccionables, constitutivos y/o inducibles, que son funcionales en el microorganismo afectan a la facilidad del diseño genético. Las consideraciones de procesamiento pueden incluir, por ejemplo, la disponibilidad de medios efectivos para someter a lisis las células.
A. Algas
En los métodos de la presente invención, el microorganismo es una microalga. Los ejemplos no limitantes de microalgas que pueden ser usadas de acuerdo con la presente invención se pueden encontrar en la Tabla 1.
Tabla 1. Ejemplos de microalgas
Achnanthes orientalis, Agmenellum, Amphiprora hyaline, Amphora coffeiformis, Amphora coffeiformis linea, Amphora coffeiformis punctata, Amphora coffeiformis taylori, Amphora coffeiformis tenuis, Amphora delicatissima, Amphora delicatissima capitata, Amphora sp., Anabaena, Ankistrodesmus, Ankistrodesmus falcatus, Boekelovia hooglandii, Borodinella sp., Botryococcus braunii, Botryococcus sudeticus, Bracteococcus minor, Bracteococcus medionucleatus, Carteria, Chaetoceros gracilis, Chaetoceros muelleri, Chaetoceros muelleri subsalsum, Chaetoceros sp., Chlorella anitrata, Chlorella Antarctica, Chlorella aureoviridis, Chlorella candida, Chlorella capsulate, Chlorella desiccate, Chlorella ellipsoidea, Chlorella emersonii, Chlorella fusca, Chlorella fusca var. vacuolata, Chlorella glucotropha, Chlorella infusionum, Chlorella infusionum var. actophila, Chlorella infusionum var. auxenophila, Chlorella kessleri, Chlorella lobophora (cepa SAG 37.88), Chlorella luteoviridis, Chlorella luteoviridis var. aureoviridis, Chlorella luteoviridis var. lutescens, Chlorella miniata, Chlorella minutissima, Chlorella mutabilis, Chlorella nocturna, Chlorella ovalis, Chlorella parva, Chlorella photophila, Chlorella pringsheimii, Chlorella protothecoides (en las que se incluyen cualquiera de las cepas UTEX 1806, 411, 264, 256, 255, 250, 249, 31, 29, 25), Chlorella protothecoides var. acidicola, Chlorella regularis, Chlorella regularis var. minima, Chlorella regularis var. umbricata, Chlorella reisiglii, Chlorella saccharophila, Chlorella saccharophila var. ellipsoidea, Chlorella salina, Chlorella simplex, Chlorella sorokiniana, Chlorella sp., Chlorella sphaerica, Chlorella stigmatophora, Chlorella vanniellii, Chlorella vulgaris, Chlorella vulgaris f. tertia, Chlorella vulgaris var. autotrophica, Chlorella vulgaris var. viridis, Chlorella vulgaris var. vulgaris, Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia, Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis, Chlorella xanthella, Chlorella zofingiensis, Chlorella trebouxioides, Chlorella vulgaris, Chlorococcum infusionum, Chlorococcum sp., Chlorogonium, Chroomonas sp., Chrysosphaera sp., Cricosphaera sp., Crypthecodinium cohnii, Cryptomonas sp., Cyclotella cryptica, Cyclotella meneghiniana, Cyclotella sp., Dunaliella sp., Dunaliella bardawil, Dunaliella bioculata, Dunaliella granulate, Dunaliella maritime, Dunaliella minuta, Dunaliella parva, Dunaliella peircei, Dunaliella primolecta, Dunaliella salina, Dunaliella terricola, Dunaliella tertiolecta, Dunaliella viridis, Dunaliella tertiolecta, Eremosphaera viridis, Eremosphaera sp., Ellipsoidon sp., Euglena, Franceia sp., Fragilaria crotonensis, Fragilaria sp., Gleocapsa sp., Gloeothamnion sp., Hymenomonas sp., Isochrysis aff. galbana, Isochrysis galbana, Lepocinclis, Micractinium, Micractinium (UTEX LB 2614), Monoraphidium minutum, Monoraphidium sp., Nannochloris sp., Nannochloropsis salina, Nannochloropsis sp., Navicula acceptata, Navicula biskanterae, Navicula pseudotenelloides, Navicula pelliculosa, Navicula saprophila, Navicula sp., Nephrochloris sp., Nephroselmis sp.,
Nitschia communis, Nitzschia alexandrina, Nitzschia communis, Nitzschia dissipata, Nitzschia frustulum, Nitzschia hantzschiana, Nitzschia inconspicua, Nitzschia intermedia, Nitzschia microcephala, Nitzschia pusilla, Nitzschia pusilla elliptica, Nitzschia pusilla monoensis, Nitzschia quadrangular, Nitzschia sp., Ochromonas sp., Oocystis parva, Oocystis pusilla, Oocystis sp., Oscillatoria limnetica, Oscillatoria sp., Oscillatoria subbrevis, Parachlorella kessleri, Pascheria ácidophila, Pavlova sp., Phagus, Phormidium, Platymonas sp., Pleurochrysis carterae, Pleurochrysis dentate, Pleurochrysis sp., Prototheca wickerhamii, Prototheca stagnora, Prototheca portoricensis, Prototheca moriformis, Prototheca zopfii, Pseudochlorella aquatica, Pyramimonas sp., Pyrobotrys, Rhodococcus opacus, Sarcinoid chrysophyte, Scenedesmus armatus, Schizochytrium, Spirogyra, Spirulina platensis, Stichococcus sp., Synechococcus sp., Tetraedron, Tetraselmis sp., Tetraselmis suecica, Thalassiosira weissflogii y Viridiella fridericiana
1. Chlorella
En una modalidad preferida de la presente invención, el microorganismo es del género Chlorella, preferiblemente, Chlorella protothecoides, Chlorella ellipsoidea, Chlorella minutissima o Chlorella emersonii.
Chlorella es un género de alga verde de una sola célula, perteneciente al filo Chlorophyta. Tiene forma esférica, de aproximadamente 2 a 10 μm de diámetro y no tiene flagelos. Algunas especies de Chlorella son naturalmente heterotróficas.
Chlorella, particularmente Chlorella protothecoides, es un microorganismo preferido para usar en la invención debido a su alta composición de lípido, particularmente lípido de cadena larga apropiado para biodiésel. Además, esta microalga crece heterotróficamente y puede ser diseñada genéticamente como se demuestra en los ejemplos en la presente.
En una modalidad preferida de la presente invención, el microorganismo usado para la expresión de un transgén es del género Chlorella, preferiblemente, Chlorella protothecoides, Chlorella minutissima o Chlorella emersonii. Ejemplos de expresión de transgénes en, por ejemplo, Chlorella, se pueden encontrar en la bibliografía (véase por ejemplo Current Microbiology Vol. 35 (1997), págs. 356-362; Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 2000 Jul; 16(4):4436; Current Microbiology Vol. 38 (1999), págs. 335-341; Appl Microbiol Biotechnol (2006) 72: 197-205; Marine Biotechnology 4, 63-73, 2002; Current Genetics 39:5, 365-370 (2001); Plant Cell Reports 18:9, 778-780, (1999); Biologia Plantarium 42(2): 209-216, (1999); Plant Pathol. J 21(1): 13-20, (2005)). También véanse Ejemplos en la presente. Otras microalgas que producen lípidos pueden ser diseñadas también, en las que se incluyen microalgas procarióticas (véase Kalscheuer st al., Applied Microbiology and Biotechnology, Volumen 52, Número 4 / octubre, 1999).
2. Identificación de Especie de Chlorella
Las especies de Chlorella para usar en la invención pueden ser identificadas mediante amplificación de ciertas regiones objetivo del genoma. Por ejemplo, la identificación de una especie o cepa de Chlorella específica puede ser obtenida por medio de amplificación y secuenciación de ADN nuclear y/o de cloroplasto utilizando cebadores y metodología que emplean cualquier región del genoma, por ejemplo utilizando los métodos descritos en Wu et al., Bot. Bull. Acad. Sin. (2001) 42:115-121 Identificación de aislados de Chlorella spp. utilizando secuencias de ADN ribosomales. Los métodos bien establecidos de análisis filogenético, tales como amplificación y secuenciación de separador transcrito interno ribosomal (ITS1 e ITS2 ADNr), 18S ARNr y otras regiones genómicas conservadas pueden ser usadas por los expertos en la técnica para identificar especies no solamente de Chlorella, sino de otros organismos que producen hidrocarburos y lípidos capaces de usar los métodos revelados en la presente. Para consultar ejemplos de métodos de identificación y clasificación de algas véase también por ejemplo Genetics, agosto de 2005; 170(4):1601-10 y RNA, abril de 2005; 11(4):361-4.
IV. Métodos de cultivo de microorganismos
Los microorganismos son cultivados tanto con el objetivo de llevar a cabo manipulaciones genéticas como para la producción subsecuente de hidrocarburos (por ejemplo, lípidos, ácidos grasos, aldehídos, alcoholes y alcanos). El primer tipo de cultivo se lleva a cabo a pequeña escala e inicialmente, por lo menos, en condiciones en las cuales el microorganismo de partida puede crecer. Por ejemplo, si el microorganismo de partida es un fotoautótrofo, el cultivo inicial se lleva a cabo en presencia de luz. Las condiciones de cultivo pueden ser cambiadas si el microorganismo es desarrollado o diseñado para crecer independientemente de la luz. El cultivo con miras a la producción de hidrocarburos se lleva a cabo normalmente a gran escala. Una fuente de carbono fija está presente. El cultivo puede también ser expuesto a la luz durante un rato o todo el tiempo.
Las microalgas pueden ser cultivadas en medios líquidos. El cultivo puede contenerse dentro de un biorreactor. Opcionalmente, el biorreactor no permite que la luz entre. Como alternativa, las microalgas pueden también ser cultivadas en fotobiorreactores que contienen una fuente de carbono fija y permitir que la luz choque con las células. La exposición de las células de microalgas a la luz, incluso en presencia de una fuente de carbono fija que las células transportan y utilizan (esto es, crecimiento mixotrófico), acelera no obstante el crecimiento en comparación con el cultivo de las células en la oscuridad. Los parámetros de condiciones de cultivo pueden ser manipulados para optimizar la producción total de hidrocarburos, la combinación de especies de hidrocarburos producidas y/o la producción de una especie de hidrocarburo. En algunos casos es preferible cultivar células en la oscuridad, tal como por ejemplo cuando se usan fermentadores extremadamente grandes (de 40 000 litros y más) que no permiten que la luz choque con el cultivo.
Los medios de cultivo de microalgas contienen comúnmente componentes tales como una fuente de nitrógeno fija, elementos en trazas, opcionalmente una solución reguladora para el mantenimiento del pH y fosfato. Otros componentes pueden incluir una fuente de carbono fija tal como acetato o glucosa y sales tales como cloruro de sodio, particularmente para microalgas de agua de mar. Los ejemplos de elementos en trazas incluyen zinc, boro, cobalto, cobre, manganeso y molibdeno en por ejemplo, las formas respectivas de ZnCl 2, H3BO3, CoCl2 6H2O, CuCl2 2H2O, MnCl2 4H2O y (NH4)6Mo7O24 4H2O. La fuente de carbono fija comprende sacarosa y glucosa, fructosa, puede comprender además, por ejemplo, galactosa, xilosa, manosa, ramnosa, N-acetilglucosamina, glicerol, floridosida y/o ácido glucurónico. La una o más fuente(s) de carbono puede(n) ser suministrada(s) en una concentración de por lo menos aproximadamente 50 μM, por lo menos aproximadamente 100 μM, por lo menos aproximadamente 500 μM, por lo menos aproximadamente 5 mM, por lo menos aproximadamente 50 mM y por lo menos aproximadamente 500 mM, de una o más fuente(s) de carbono fija(s) provista(s) exógenamente. Algunas especies de microalgas pueden ser cultivadas al utilizar una fuente de carbono fija tal como glucosa o acetato en ausencia de luz. Tal cultivo es conocido como cultivo heterotrófico. Para Chlorella protothecoides, por ejemplo, el crecimiento heterotrófico da como resultado alta producción de biomasa y acumulación de alto contenido de lípido en las células.
Otros parámetros de cultivo pueden también ser manipulados, tales como el pH del medio de cultivo, la identidad y concentración de elementos en trazas y otros constituyentes del medio.
B. Cultivo heterotrófico
Las microalgas se cultivan en condiciones de cultivo heterotróficas en las cuales una fuente de carbono fija proporciona energía para el crecimiento y acumulación de lípido.
En un método de cultivo heterotrófico de acuerdo con la invención, el costo de la producción de biodiésel, glicerol crudo, parcialmente purificado o purificado producido como producto secundario de la transesterificación de lípido puede ser empleado como materia prima de alimentación para la fermentación, por ejemplo de cultivos microbianos que producen lípido. Así, la invención abarca cultivar una microalga en un primer cultivo microbiano; recuperar el lípido microbiano del cultivo; someter el lípido microbiano a transesterificación para producir éster(es) de ácido graso y glicerol, como se describe anteriormente; y agregar el glicerol a un segundo cultivo microbiano como materia prima de alimentación. Los cultivos microbianos primero y segundo pueden, pero no necesitan ser, cultivos del mismo microbio. Si se desea, se puede idear un sistema continuo mediante el cual el glicerol producido a partir del lípido recuperado de un cultivo puede ser alimentado de nuevo en el mismo cultivo.
Para la producción de hidrocarburos, las células, en las que se incluyen células recombinantes descritas en la presente, son preferiblemente cultivadas o fermentadas en grandes cantidades. El cultivo puede ser en volúmenes grandes de líquido, tales como en cultivo de suspensión, por ejemplo. Otros ejemplos incluyen iniciar con un pequeño cultivo de células que se expanden a una biomasa grande en combinación con cultivo celular y propagación así como producción de hidrocarburo. Los biorreactores o fermentadores de acero pueden ser usados para acomodar grandes volúmenes de cultivo. Un fermentador similar a aquellos usados en la producción de cerveza y/o vino es apropiado, como lo son los fermentadores extremadamente grandes usados en la producción de etanol.
Las fuentes de nutrientes apropiadas para el cultivo en un fermentador incluyen materias primas tales como una o más de las siguientes: una fuente de carbono fija tal como sacarosa, caña de azúcar, remolacha de azúcar o melazas; una fuente de grasas, tales como grasas o aceites vegetales; una fuente de nitrógeno, tal como proteína, harina de soja, licor de maíz, amoníaco (puro o en forma de sal), nitrato o sal de nitrato o nitrógeno molecular; y una fuente de fósforo, tal como sales de fosfato. Adicionalmente, un fermentador permite el control de las condiciones de cultivo tales como temperatura, pH, tensión de oxígeno y niveles de dióxido de carbono. Opcionalmente, los componentes gaseosos, como oxígeno o nitrógeno, pueden ser burbujeados a través de un cultivo líquido. Las fuentes de carbono pueden también ser provistas como una mezcla, tal como una mezcla de sacarosa y pulpa de remolacha de azúcar despolimerizada.
Preferiblemente, los microorganismos cultivados utilizando las condiciones descritas en la presente y conocidas en la técnica comprenden por lo menos aproximadamente un 20% en peso de lípido, preferiblemente por lo menos aproximadamente un 40% en peso, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 50% en peso y más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 60% en peso.
En métodos de cultivo heterotrófico de acuerdo con la presente invención, la sacarosa, producida por ejemplo a partir de caña de azúcar o remolacha de azúcar, es usada como materia prima de alimentación. Como se describe más detalladamente en la sección titulada “Diseño de Microbios”, la producción de lípido puede ser facilitada o hacerse más eficaz por medio del diseño de microbios tales como Chlorella, para utilizar sacarosa como fuente de carbono. Por ejemplo, la expresión de un transportador de sacarosa y una invertasa de sacarosa permite que Chlorella transporte sacarosa a la célula del medio de cultivo e hidrolice sacarosa para producir glucosa y fructosa. Opcionalmente, una fructocinasa puede ser expresada también en casos en donde la actividad de hexocinasa endógena es insuficiente para la fosforilación máxima de fructosa. Los ejemplos de transportadores de sacarosa apropiados son los números de acceso GenBank CAD91334, CAB92307 y CAA53390. Los ejemplos de invertasas de sacarosa apropiadas son los números de acceso GenBank CAB95010, NP_012104 y CAA06839. Los ejemplos de fructocinasas apropiadas son los números de acceso GenBank P26984, P26420 y CAA43322. Los vectores para transformación de microalgas, en los que se incluye Chlorella, que codifican uno o más de tales genes pueden ser diseñados como se describe en la presente.
La secreción de una invertasa de sacarosa puede obviar la necesidad de expresión de un transportador que puede transportar sacarosa a la célula. Esto se debe a que una invertasa secretada cataliza la conversión de una molécula de sacarosa en una molécula de glucosa y una molécula de fructosa, que pueden ambas ser transportadas y utilizadas por los microbios revelados en la presente. Por ejemplo, la expresión de una invertasa de sacarosa (tal como SEQ ID NO: 14) con una señal de secreción (tal como aquella de SEQ ID NO: 15 (de levadura), SEQ ID NO: 16 (de plantas superiores), SEQ ID NO: 17 (señal de secreción de consenso eucariótica) y SEQ ID NO: 18 (combinación de secuencias de señal de plantas superiores y consenso eucariótico) genera actividad de invertasa en el exterior de la célula. Véase Hawkins et al., Current Microbiology Vol. 38 (1999), págs. 335-341 para consultar ejemplos de señales de secreción activa en Chlorella. La expresión de tal proteína, tal como la proporciona la metodología de diseño genético revelada en la presente, permite que las células que ya son capaces de utilizar glucosa extracelular como una fuente de energía utilicen sacarosa como una fuente de energía extracelular. En células tales como Chlorella protothecoides, Chlorella minutissima y Chlorella emersonii que, como se demuestra en la presente pueden usar tanto fructosa extracelular como glucosa extracelular como fuentes de energía, la secreción de una invertasa puede proporcionar la única actividad catalítica necesaria para usar sacarosa como una fuente de energía eficiente y económica.
Por ejemplo, como se muestra en la Figura 26, Chlorella protothecoides puede ser diseñada con un gen de invertasa de sacarosa con el control regulador de uno de los tres promotores (promotor 35S del virus del mosaico de coliflor (CMV), promotor del virus de Chlorella (CV) o promotor HUP1 de Chlorella (HUP1)). El gen de invertasa de sacarosa utilizado en este ejemplo comprende una modificación en el gen SUC2 de S. cerevisiae para optimizar el uso del codón de C. protothecoides. El ADNc y las secuencias de aminoácidos del gen optimizado se corresponden con SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 19, respectivamente. Una ilustración de los constructos de plásmido usados en la transformación es mostrada en la Figura 25. La expresión de una invertasa de sacarosa secretable, tal como aquella descrita en la presente, permite el uso de melazas, zumo de caña de azúcar y otras materias primas de alimentación que contienen sacarosa para la fermentación celular.
De igual modo, las Figuras 27 y 28 muestran los resultados de transformación de Chlorella protothecoides y Chlorella minutissima y Chlorella emersonii, respectivamente, con el gen de invertasa de sacarosa de S. cerevisiae con el control del promotor de CMV.
El potencial de crecimiento de microorganismos que expresan una invertasa de sacarosa secretable exógena es ilustrado por la adición de una invertasa al medio de cultivo de Chlorella protothecoides, como se describe más detalladamente en los Ejemplos. Las Figuras 23 y 24 ilustran el resultado sorprendente de que las células de Chlorella crecen igual sobre melazas de desperdicio del procesamiento de caña de azúcar que como lo hacen sobre la glucosa pura de grado reactivo; el uso de este producto de desperdicio de valor bajo del procesamiento de caña de azúcar puede proveer ahorros significativos en los costos de la producción de hidrocarburos y otros aceites. Las melazas contienen lignina y otros productos de desperdicio celulósicos que envenenan muchos microorganismos y retrasan su crecimiento, sin embargo se descubrió que las células de Chlorella prosperan en presencia de tales venenos. Las Figuras 23-24 muestran el crecimiento de células sobre tres fuentes únicas de melazas (denominadas BS1, BS2 y HTM), en comparación con el crecimiento sobre glucosa o sacarosa en presencia o ausencia de una invertasa de sacarosa extracelular.
Como alternativa, una invertasa de sacarosa puede también ser expresada de forma intracelular en células que expresan un transportador de sacarosa, así como en células que expresan cualquier transportador de carbohidrato que permite que la sacarosa entre en la célula.
Un gen extraño fue transformado y expresado en Chlorella protothecoides, como se describe en el Ejemplo 12. La expresión de los genes de utilización de sacarosa puede conseguirse utilizando metodología y diseño de vector igual
o parecido.
Se pueden emplear biorreactores para uso en los métodos de cultivo hetrotróficos. Como se apreciará, las provisiones hechas para hacer que la luz esté disponible para las células en métodos de cultivo fotosintéticos son innecesarias cuando se usa una fuente de carbono fija en los métodos de cultivo heterotróficos descritos en la presente.
Los ejemplos específicos de condiciones de proceso y métodos de cultivo hetrotróficos descritos en la presente pueden ser combinados de cualquier manera apropiada para mejorar la eficacia del crecimiento microbiano y la producción de lípidos. Además, la invención incluye la selección y/o diseño genético de microalgas para producir microalgas que son aún más apropiadas para uso en los métodos descritos anteriormente. Por ejemplo, las microalgas que tienen una mayor capacidad para utilizar cualquiera de las materias primas de alimentación descritas anteriormente para la proliferación incrementada y/o producción de lípido (por ejemplo, ácidos grasos) están dentro
5 del alcance de la invención.
D. Medios de cultivo
Los microorganismos útiles de acuerdo con los métodos de la presente invención se encuentran en varias ubicaciones y entornos en todo el mundo. Como consecuencia de su aislamiento de otras especies y su divergencia evolutiva resultante, el medio de cultivo particular para el crecimiento óptimo y la generación de constituyentes de
10 lípido y/o hidrocarburo pueden ser difíciles de predecir. En algunos casos, ciertas cepas de microorganismos pueden ser incapaces de crecer sobre un medio de cultivo particular debido a la presencia de algún componente inhibidor o a la ausencia de algún requisito nutricional esencial solicitado por la cepa particular del microorganismo.
Los medios de cultivo sólidos y líquidos están en general disponibles a partir de una amplia variedad de fuentes, las instrucciones para la preparación de medios particulares que son apropiados para una amplia variedad de cepas de
15 microorganismos se pueden encontrar por ejemplo, en línea en http://www.utex.org/, un sitio web de la Universidad de Texas en Austin para su recogida de cultivo de algas (UTEX). Por ejemplo, varios medios de agua dulce y agua salada incluyen aquellos mostrados en la Tabla 4 a continuación.
Tabla 4. Medios de algas ilustrativos.
Medio de agua dulce
Medio de agua salada
Medio de diatomea 1/2 CHEV
1% F/2
Medio de diatomea 1/3 CHEV
Medio de agua de mar enriquecido 1/2
Medio de diatomea 1/5 CHEV
Medio Erdchreiber 1/2
DYIII/PEA + Gr+ 1:1
Medio de agua de mar + 1/2 de sustrato
Medio de diatomea 2/3 CHEV
Medio de agua de mar + 1/3 de sustrato
Medio de diatomea 2X CHEV
1/4 ERD
Medio de diatomea Ag
Medio de agua de mar + 1/4 de sustrato
Medio Allen
Medio de agua de mar + 1/5 de sustrato
Medio BG11-1
Medio de agua de mar enriquecido 2/3
Medio 1NV Negritas
20% Allen + 80% ERD
Medio 3N Negritas
Medio de Erdschreiber 2X
Medio de Botryococcus
Medio de agua de mar + sustrato 2X
Medio Bristol
Medio F/2 al 5%
Medio de diatomea CHEV
Medio de agar en agua de mar + 5/3 de sustrato
Medio de Chu
Medio de agua de mar artificial
Medio de diatomea CR1
BG11-1 + Medio de NaCl al 36%
Medio de diatomea CR1+
BG11-1 + Medio de NaCl al 1%
Medio de diatomea CR1-S
INV Negritas:Erdshreiber (1:1)
Medio de Cianidio
INV Negritas:Erdshreiber (4:1)
Medio de cianofíceas
Medio de Bristol-NaCl
Medio Desmid
Medio de agua de mar con Dasicladales
Medio DYIII
Medio de agua de mar enriquecido
Medio Euglena
Medio Erdschreiber
Medio HEPES
Medio de agua de mar enriquecido ES/10
Medio J
Medio de agua de mar enriquecido ES/2
Medio Malt
Medio de agua de mar enriquecido ES/4
Medio MES
Medio F/2
Medio modificado 3N Negritas
F/2 + NH4
Medio modificado COMBO
Medio LDM
Medio N/20
CHEV modificado 2 X
Medio Ochromonas
CHEV modificado 2 X + sustrato
Medio P49
Medio artificial modificado de agua de mar
Medio Polytomella
CHEV modificado
Medio proteosa
Medio Porphridium
Medio de alga congelada
Medio de agua de mar + sustrato
Medio con extracto de sustrato
Medio de diatomea SS
Sustrato en agua: Medio BAR
Sustrato en agua: Medio-GR
Sustrato en agua: Medio GR-/NH4
Sustrato en agua: Medio GR+
Sustrato en agua: Medio GR+/NH4
Sustrato en agua: Medio PEA
Sustrato en agua: Medio de turba
Sustrato en agua: Medio VT
Medio Spirulina
Medio de unión
Medio Trebouxia
Medio Volvocáceo
Medio volvocáceo-3N
Medio Volvox
Medio Volvox-Dextrosa
Medio Waris
Waris + medio con extracto de sustrato
En un ejemplo particular, un medio apropiado para el cultivo de Chlorella protothecoides (UTEX 31) comprende medio de proteosa. Este medio es apropiado para cultivos axénicos y un volumen de un litro del medio (pH de aproximadamente 6.8) puede ser preparado mediante la adición de un gramo de peptona proteosa a un litro de medio de Bristol. El medio de Bristol comprende NaNO3 2.94 mM, CaCl2 2H2O 0.17 mM, MgSO4 7H2O 0.3 mM, 0.43
5 mM, KH2PO4 1.29 mM y NaCl 1.43 mM en una solución acuosa. Para un medio de agar al 1.5%, se pueden agregar 15 g de agar a un litro de la solución. La solución es cubierta y puesta en autoclave y luego almacenada a una temperatura refrigerada antes de su uso.
Otros medios apropiados para uso con los métodos de la invención pueden ser identificados fácilmente al consultar la URL identificada anteriormente o al consultar otras organizaciones que trabajan con cultivos de microorganismos,
10 tales como SAG, CCAP o CCALA. SAG se refiere a la Colección de Cultivos de Algas en la Universidad de Göttingen (Göttingen, Alemania), CCAP se refiere a la colección de cultivos de algas y protozoarios gestionada por la Asociación Escocesa para las Ciencias Marinas (Escocia, Reino Unido) y CCALA se refiere a la colección de cultivos de algas en laboratorio en el Instituto de Botánica (Třeboň, República Checa).
E. Incrementar el rendimiento de lípidos
15 Las condiciones del proceso pueden ser ajustadas para incrementar el rendimiento de lípidos apropiados para un uso particular y/o para reducir el costo de producción. Por ejemplo, en ciertas modalidades, una microalga es cultivada en presencia de una concentración limitante de uno o más nutrientes, tales como por ejemplo, carbono y/o nitrógeno, fósforo o azufre, mientras se proporciona un exceso de energía de carbono fija. La limitación de nitrógeno tiende a incrementar el rendimiento del lípido microbiano con respecto al rendimiento del lípido microbiano en un
20 cultivo en el cual se proporciona nitrógeno en exceso. En modalidades particulares, el incremento en el rendimiento de lípido es de por lo menos aproximadamente: 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, 200%, 300%, 400% o 500%. El microbio puede ser cultivado en presencia de una cantidad limitante de un nutriente para una parte del período de cultivo total o para todo el período. En modalidades particulares, la concentración del nutriente es sometida a ciclos entre una concentración limitante y una concentración no limitante por lo menos dos veces durante el período de cultivo total.
Para incrementar el rendimiento del lípido, se puede usar ácido acético en la materia prima de alimentación para una microalga que produce lípido. El ácido acético se alimenta directamente en el punto de metabolismo que inicia la síntesis del ácido graso (esto es, acetil-CoA); por lo tanto, proporcionar ácido acético en el cultivo puede incrementar la producción de ácido graso. En general, el microbio es cultivado en presencia de una cantidad suficiente de ácido acético para incrementar el rendimiento de lípido microbiano y/o el rendimiento de ácido graso microbiano, específicamente, con respecto al rendimiento del lípido microbiano (por ejemplo, ácidos grasos) en ausencia del ácido acético.
En otra modalidad, el rendimiento del lípido es incrementado al cultivar una microalga que produce lípidos en presencia de uno o más cofactor(es) para una enzima de ruta de lípido (por ejemplo, una enzima sintética de ácido graso). En general, la concentración del (de los) cofactor(es) es suficiente para incrementar el rendimiento del lípido microbiano (por ejemplo, ácido graso) con respecto al rendimiento del lípido microbiano en ausencia del (de los) cofactor(es). En una modalidad particular, el (los) cofactor(es) se proporciona(n) al cultivo al incluir en el cultivo una microalga que contiene un gen exógeno que codifica el (los) cofactor(es). Como alternativa, se pueden proporcionar cofactores a un cultivo al incluir una microalga que contiene un gen exógeno que codifica una proteína que participa en la síntesis del cofactor. En ciertas modalidades, los cofactores apropiados incluyen cualquier vitamina requerida por una enzima de ruta de lípido, tal como por ejemplo: biotina, pantotenato. Los genes que codifican cofactores apropiados para uso en la invención o que participan en la síntesis de tales cofactores son bien conocidos y pueden ser introducidos a microalgas utilizando conceptos y técnicas tales como aquellos descritos anteriormente.
V. Diseño de ruta del lípido
Las microalgas se pueden modificar para alterar las propiedades y/o proporciones de lípidos producidos y/o para incrementar el flujo de carbono a los lípidos. La ruta puede además, o como alternativa, ser modificada para alterar las propiedades y/o proporciones de varias moléculas de hidrocarburo producidas por medio del procesamiento enzimático de lípidos.
A. Alteración de las propiedades o proporciones de lípidos o hidrocarburos producidos
En el caso de las microalgas, algunas células de tipo silvestre ya tienen características de crecimiento buenas pero no producen los tipos o cantidades deseados de lípidos. Los ejemplos incluyen Pyrobotrys, Phormidium, Agmenellum, Carteria, Lepocinclis, Pyrobotrys, Nitzschia, Lepocinclis, Anabaena, Euglena, Spirogyra, Chlorococcum, Tetraedron, Oscillatoria, Phagus y Chlorogonium que tienen la característica de crecimiento deseable de crecer en aguas residuales municipales o agua de desperdicio. Tales células, así como las especies de Chlorella y otros microbios, pueden ser diseñadas para tener características de producción de lípido mejoradas. Las características deseadas incluyen optimización del rendimiento de lípido por volumen unitario y/o por tiempo unitario, longitud de cadenas de carbono (por ejemplo, para producción de biodiésel o para aplicaciones industriales que requieren materia prima de alimentación de hidrocarburo), reducción del número de enlaces dobles o triples, opcionalmente a cero, retirada o eliminación de anillos y estructuras cíclicas e aumento de la proporción de hidrógeno: carbono de una especie particular de lípido o de una población de lípido distinta. Además, las microalgas que producen hidrocarburos apropiados pueden también ser diseñadas para tener salidas de hidrocarburos aún más deseables. Los ejemplos de tales microalgas incluyen especies del género Chlorella.
1. Regulación de enzimas que controlan los puntos de ramificación en la síntesis de ácido graso
En modalidades particulares, una o más enzimas clave que controlan los puntos de ramificación en el metabolismo para la síntesis de ácido graso pueden ser reguladas ascendentemente o reguladas descendentemente para mejorar la producción del lípido. La regulación ascendente puede ser obtenida por ejemplo al transformar células con los conceptos de expresión en los cuales un gen que codifica la enzima de interés es expresada, por ejemplo utilizando un promotor fuerte y/o elementos de mejorador que incrementan la transcripción. Tales conceptos pueden incluir un marcador seleccionable, de tal manera que los transformantes puedan ser sometidos a selección, lo que puede dar como resultado la amplificación del concepto y un incremento en el nivel de expresión de la enzima codificada. Los ejemplos de enzimas apropiadas para la regulación ascendente incluyen piruvato deshidrogenasa, que desempeña un papel para convertir piruvato en acetil-CoA (los ejemplos, algunos de mircoalgas, incluyen los números de acceso GenBank NP_415392; AAA53047; Q1XDM1 y CAF05587). La regulación ascendente de la piruvato deshidrogenasa puede incrementar la producción de acetil-CoA e incrementar mediante esto la síntesis de ácido graso. La acetil-CoA carboxilasa cataliza la etapa inicial en la síntesis de ácido graso. Así, esta enzima puede ser regulada ascendentemente para incrementar la producción de ácidos grasos (los ejemplos, algunos de microalgas, incluyen los números de acceso GenBank BAA94752; AAA75528; AAA81471; YP_537052; YP_536879; NP_045833 y BAA57908). La producción de ácido graso puede también ser incrementada mediante la regulación ascendente de la proteína portadora de acilo (ACP), que lleva las cadenas de acilo crecientes durante la síntesis de ácido graso (los ejemplos, algunos de microalgas, incluyen los números de acceso GenBank A0T0F8; P51280; NP_849041; YP_874433). La glicerol-3-fosfatoaciltransferasa cataliza la etapa limitante de la velocidad de la síntesis de ácido graso. La regulación ascendente de esta enzima puede incrementar la producción de ácido graso (los ejemplos, algunos de microalgas, incluyen los números de acceso GenBank AAA74319; AAA33122; AAA37647; P44857 y ABO94442). Las proteínas precedentes son candidatas para expresión en microalgas, en las que se incluyen especies del género Chlorella.
La regulación descendente de una enzima de interés puede ser obtenida utilizando por ejemplo ARN/ADN catalítico antisentido, interferencia de ARN (ARNi), “desactivación”, “apagado” u otras técnicas de mutagénesis. La expresión/función de enzima puede también ser inhibida utilizando intracuerpos. Los ejemplos de enzimas apropiadas para la regulación descendente incluyen citrato sintasa, que consume acetil-CoA como parte del ciclo de ácido tricarboxílico (TCA). La regulación descendente de citrato sintasa puede forzar más acetil-CoA en la ruta de síntesis de ácido graso.
2. Modulación de reguladores globales de genes de síntesis de ácido graso
Los reguladores globales modulan la expresión de los genes de las rutas biosintéticas de ácido graso. Así, uno o más reguladores globales de la síntesis de ácido graso pueden ser regulados ascendentemente o regulados descendentemente, como sea necesario, para inhibir o mejorar, respectivamente, la expresión de una pluralidad de genes sintéticos de ácido graso y finalmente, para incrementar la producción de lípido. Los ejemplos incluyen proteínas de enlace de elementos regulatorios de esterol (SREBP), tales como SREBP-1a y SREBP-1c (a modo de ejemplos véanse los números de acceso GenBank NP_035610 y Q9WTN3). Los reguladores globales pueden ser regulados ascendentemente o regulados descendentemente, por ejemplo, como se describe anteriormente con respecto a la regulación de enzimas de punto de control.
3. Regulación de enzimas de modificación de hidrocarburo
Los métodos de la invención también incluyen células transformantes, con uno o más genes que codifican enzimas de modificación de hidrocarburo tales como por ejemplo una acil-ACP tioesterasa grasa (véanse ejemplos en la tabla 5 con números de acceso), una acil-CoA/aldehído reductasa grasa (véanse ejemplos en la tabla 6 con números de acceso), una acil-CoA reductasa grasa (véanse ejemplos en la tabla 7 con números de acceso), una aldehído descarbonilasa grasa (véanse ejemplos en la tabla 8 con números de acceso), una aldehído reductasa grasa o un gen de escualeno sintasa (véase número de acceso GenBank AF205791). En algunas modalidades, los genes que codifican una acil-ACP tioesterasa grasa y una proteína portadora de acilo coexpresada naturalmente pueden ser transformados en una célula, opcionalmente con uno o más genes que codifican otras enzimas de modificación de hidrocarburo. En otras modalidades, la ACP y la acil-ACP tioesterasa grasa pueden tener una afinidad entre sí que imparte una ventaja cuando las dos son usadas conjuntamente, independientemente de si son coexpresadas naturalmente en un tejido u organismo particular o no. Así, la presente invención contempla tanto pares coexpresados naturalmente de estas enzimas como aquellos que comparten una afinidad para interactuar entre sí para facilitar la escisión de una cadena de carbono de longitud específica de la ACP.
En otras modalidades más, un gen exógeno que codifica una desaturasa puede ser transformado en la célula en conjunción con uno o más genes que codifican otras enzimas de modificación de hidrocarburos con el fin de proveer modificaciones con respecto a la saturación de hidrocarburo. La estearoil-ACP desaturasa (véanse, por ejemplo, los números de acceso GenBank AAF15308; ABM45911 y AAY86086), por ejemplo cataliza la conversión de estearoil-ACP a oleoil-ACP. La regulación ascendente de este gen puede incrementar la proporción de ácidos grasos monoinsaturados producidos por una célula; mientras que la regulación descendente puede reducir la proporción de monoinsaturados. Igualmente, la expresión de una o más glicerolípido desaturasas puede ser controlada para alterar la proporción de los ácidos grasos, desde los insaturados a los saturados, tales como desaturasa de ácido graso omega-6, desaturasa de ácido graso omega-3, o desaturasa omega-6-oleato. En algunas modalidades, la desaturasa puede ser seleccionada en relación con una longitud de cadena de carbono deseada, de tal manera que la desaturasa sea capaz de realizar modificaciones específicas de sitio dentro de un sustrato de longitud de carbono especificada o sustratos que tienen una longitud de carbono dentro de un intervalo especificado.
En modalidades particulares, los microbios son diseñados genéticamente para expresar uno o más genes exógenos seleccionados de una acil-ACP tioesterasa grasa, una acil-CoA/aldehído reductasa grasa, una acil-CoA reductasa grasa, un aldehído reductasa grasa, un aldehído descarbonilasa grasa o una proteína portadora de acilo coexpresada naturalmente. Los métodos de expresión apropiados son descritos anteriormente con respecto a la expresión de un gen de lipasa, en los que se incluyen, entre otros métodos, la expresión inducible y la expresión por compartimientos.
Sin pretender estar limitados por ninguna teoría particular o mecanismo celular, una acil-ACP tioesterasa grasa escinde un ácido graso de una proteína portadora de acilo (ACP) durante la síntesis de lípido. Por medio del procesmiento enzimático adicional, el ácido graso escindido es luego combinado con una coenzima para producir una molécula de acil-CoA. Esta acil-CoA es el sustrato para la actividad enzimática de una acil-CoA reductasa grasa para producir un aldehído, así como para una acil-CoA/aldehído reductasa grasa para producir un alcohol. El aldehído producido por la acción de la acil-CoA reductasa grasa identificado anteriormente es el sustrato para la actividad enzimática adicional ya sea por una aldehído reductasa grasa para producir un alcohol como por un aldehído descarbonilasa grasa para producir un alcano o alqueno.
Las enzimas descritas justo antes tienen una especificidad para actuar sobre un sustrato que incluye un número específico de átomos de carbono. Por ejemplo, una acil-ACP tioesterasa grasa puede tener una especificidad para escindir un ácido graso que tiene doce átomos de carbono de la ACP. En algunas modalidades, la ACP y la tioesterasa de longitud específica pueden tener una afinidad entre sí que las hace particularmente útiles como una 5 combinación (por ejemplo, la ACP exógena y los genes de tioesterasa pueden ser coexpresados naturalmente en un tejido u organismo particular del cual son derivados). Por consiguiente, en varias modalidades, el microbio puede contener un gen exógeno que codifica una proteína con especificidad para catalizar una actividad enzimática (por ejemplo, escisión de un ácido graso de una ACP, reducción de una acil-CoA a un aldehído o un alcohol o conversión de un aldehído en un alcano) con respecto al número de átomos de carbono contenidos en el sustrato. La
10 especificidad enzimática puede ser, en varias modalidades, para un sustrato que tiene de 8 a 34 átomos de carbono, preferiblemente de 8 a 18 átomos de carbono y más preferiblemente de 10 a 14 átomos de carbono. La especificidad más preferida es para un sustrato que tienen doce átomos de carbono. En otras modalidades, la especificidad puede ser para de 20 a 30 átomos de carbono.
Las acil-ACP tioesterasas grasas apropiadas para uso con los métodos de la invención incluyen sin limitación 15 aquellos indicados en la tabla 5.
Tabla 5. Acil-ACP tioesterasas grasas y números de acceso GenBank
Umbellularia californica acil-ACP tioesterasa grasa (GenBank n.° AAC49001) Cinnamomum camphora acil-ACP tioesterasa grasa (GenBank n.° Q39473) Umbellularia californica acil-ACP tioesterasa grasa (GenBank n.° Q41635) Myristica fragrans acil-ACP tioesterasa grasa (GenBank n.° AAB71729) Myristica fragrans acil-ACP tioesterasa grasa (GenBank n.° AAB71730) Elaeis guineensis acil-ACP tioesterasa grasa (GenBank n.° ABD83939) Elaeis guineensis acil-ACP tioesterasa grasa (GenBank n.° AAD42220) Populus tomentosa acil-ACP tioesterasa grasa (GenBank n.° ABC47311) Arabidopsis thaliana acil-ACP tioesterasa grasa (GenBank n.° NP_172327) Arabidopsis thaliana acil-ACP tioesterasa grasa (GenBank n.° CAA85387) Arabidopsis thaliana acil-ACP tioesterasa grasa (GenBank n.° CAA85388) Gossypium hirsutum acil-ACP tioesterasa grasa (GenBank n.° Q9SQI3) Cuphea lanceolata acil-ACP tioesterasa grasa (GenBank n.° CAA54060) Cuphea hookeriana acil-ACP tioesterasa grasa (GenBank n.° AAC72882) Cuphea calophylla subsp. mesostemon acil-ACP tioesterasa grasa (GenBank n.° ABB71581) Cuphea lanceolata acil-ACP tioesterasa grasa (GenBank n.° CAC19933) Elaeis guineensis acil-ACP tioesterasa grasa (GenBank n.° AAL15645) Cuphea hookeriana acil-ACP tioesterasa grasa (GenBank n.° Q39513) Gossypium hirsutum acil-ACP tioesterasa grasa (GenBank n.° AAD01982) Vitis vinifera acil-ACP tioesterasa grasa (GenBank n.° CAN81819) Garcinia mangostana acil-ACP tioesterasa grasa (GenBank n.° AAB51525) Brassica juncea acil-ACP tioesterasa grasa (GenBank n.° ABI18986) Madhuca longifolia acil-ACP tioesterasa grasa (GenBank n.° AAX51637) Brassica napus acil-ACP tioesterasa grasa (GenBank n.° ABH11710) Oryza sativa (grupo de cultivo indica) acil-ACP tioesterasa grasa (GenBank n.° EAY86877) Oryza sativa (grupo de cultivo japonica) acil-ACP tioesterasa grasa (GenBank n.° NP_001068400) Oryza sativa (grupo de cultivo indica) acil-ACP tioesterasa grasa (GenBank n.° EAY99617) Cuphea hookeriana acil-ACP tioesterasa grasa (GenBank n.° AAC49269)
Las acil-CoA/aldehído reductasas grasas apropiadas para uso con los métodos de la invención incluyen sin limitación aquellas enumeradas en la tabla 6.
Tabla 6. Acil-CoA/aldehído reductasas grasas enumeradas por números de acceso GenBank.
AAC45217, YP_047869, BAB85476, YP_001086217, YP_580344, YP_001280274, YP_264583, YP_436109, YP_959769, ZP_01736962, ZP_01900335, ZP_01892096, ZP_01103974, ZP_01915077, YP_924106, YP_130411, ZP_01222731, YP_550815, YP_983712, YP_001019688, YP_524762, YP_856798, ZP_01115500, YP_001141848, NP_336047, NP_216059, YP_882409, YP_706156, YP_001136150, YP_952365, ZP_01221833, YP_130076, NP_567936, AAR88762, ABK28586, NP_197634,
CAD30694, NP_001063962, BAD46254, NP_001030809, EAZ10132, EAZ43639, EAZ07989, NP_001062488, CAB88537, NP_001052541, CAH66597, CAE02214, CAH66590, CAB88538, EAZ39844, AAZ06658, CAA68190, CAA52019 y BAC84377
Las acil-CoA reductasas grasas apropiadas para uso con los métodos de la invención incluyen sin limitación aquellas enumeradas en la tabla 7.
Tabla 7. Acil-CoA reductasas grasas enlistadas por números de acceso GenBank
NP_187805, ABO14927, NP_001049083, CAN83375, NP_191229, EAZ42242, EAZ06453, CAD30696, BAD31814, NP_190040, AAD38039, CAD30692, CAN81280, NP_197642, NP_190041, AAL15288 y NP_190042
Las aldehído descarbonilasas grasas apropiadas para uso con los métodos de la invención incluyen sin limitación aquellas enumeradas en la tabla 8.
Tabla 8. Aldehído descarbonilasas grasas enlistadas por números de acceso GenBank.
NP_850932, ABN07985, CAN60676, AAC23640, CAA65199, AAC24373, CAE03390, ABD28319, NP_181306, EAZ31322, CAN63491, EAY94825, EAY86731, CAL55686, XP_001420263, EAZ23849, NP_200588, NP_001063227, CAN83072, AAR90847 y AAR97643
Las combinaciones de acil-ACP tioesterasas grasas coexpresadas naturalmente y proteínas portadoras de acilo son apropiadas para uso con los métodos de la invención.
Los ejemplos adicionales de enzimas de modificación de hidrocarburos incluyen secuencias de aminoácidos contenidas, a las que se hace referencia o codificadas por secuencias de ácidos nucleicos contenidas o a las que se hace referencia en cualquiera de las siguientes patentes estadounidenses: 6 610 527; 6 451 576; 6 429 014; 6 342 380; 6 265 639; 6 194 185; 6 114 160; 6 083 731; 6 043 072; 5 994 114; 5 891 697; 5 871 988; 6 265 639 y descritos adicionalmente con los números de acceso GenBank: AAO18435; ZP_00513891; Q38710; AAK60613, AAK60610; AAK60611; NP_113747; CAB75874; AAK60612; AAF20201; BAA11024; AF205791 y CAA03710.
Otras enzimas apropiadas para uso con los microbios y los métodos de la invención incluyen aquellas que tienen por lo menos un 70% de identidad de aminoácido con una de las proteínas enlistadas en las tablas 5-8 y que exhiben la actividad enzimática deseada correspondiente (por ejemplo, escisión de un ácido graso de una proteína portadora de acilo, reducción de una acil-CoA a un aldehído o un alcohol o conversión de un aldehído a un alcano). En modalidades adicionales, la actividad enzimática está presente en una secuencia que tiene por lo menos aproximadamente un 75%, por lo menos aproximadamente un 80%, por lo menos aproximadamente un 85%, por lo menos aproximadamente un 90%, por lo menos aproximadamente un 95% o por lo menos aproximadamente un 99% de identidad con una de las secuencias descritas anteriormente.
Las enzimas de modificación de hidrocarburos descritas anteriormente son útiles en la producción de varios hidrocarburos a partir de una microalga o población de microalgas, mediante lo cual una acil-ACP tioesterasa grasa escinde un ácido graso de una proteína portadora de acilo (ACP) durante la síntesis del lípido. Por medio de procesamiento enzimático adicional, el ácido graso escindido es luego combinado con una coenzima para producir una molécula de acil-CoA. Este acil-CoA es el sustrato para la actividad enzimática de una acil-CoA reductasa grasa para producir un aldehído, así como para una acil-CoA/aldehído reductasa grasa para producir un alcohol. El aldehído producido por la acción de la acil-CoA reductasa grasa identificado anteriormente es el sustrato para la actividad enzimática adicional ya sea por un aldehído reductasa grasa para producir un alcohol o un aldehído descarbonilasa grasa para producir un alcano o alqueno.
Las enzimas de modificación de hidrocarburo tienen especificidad para actuar sobre un sustrato que incluye un número específico de átomos de carbono. Por ejemplo, una acil-ACP tioesterasa grasa puede tener especificidad para escindir un ácido graso que tiene 12 átomos de carbono de la ACP. Por consiguiente, en varias modalidades, el microbio puede contener un gen exógeno que codifica una proteína con especificidad para catalizar una actividad enzimática (por ejemplo, escisión de un ácido graso de una ACP, reducción de una acil-CoA a un aldehído o un alcohol o conversión de un aldehído a un alcano) con respecto al número de átomos de carbono contenidos en el sustrato. La especificidad enzimática puede ser en varias modalidades para un sustrato que tiene de 8 a 34 átomos de carbono, preferiblemente de 8 a 18 átomos de carbono y más preferiblemente de 10 a 14 átomos de carbono. La especificidad más preferida es para un sustrato que tiene 12 átomos de carbono. En otras modalidades, la especificidad puede ser para de 20 a 30 átomos de carbono.
En algunas modalidades, los ácidos grasos o los alcoholes primarios correspondientes, aldehídos, alcanos o alquenos, generados por los métodos descritos en la presente, contienen por lo menos aproximadamente 8, por lo menos aproximadamente 10, por lo menos aproximadamente 12, por lo menos aproximadamente 14, por lo menos aproximadamente 16, por lo menos aproximadamente 18, por lo menos aproximadamente 20, por lo menos aproximadamente 22, por lo menos aproximadamente 24, por lo menos aproximadamente 26, por lo menos aproximadamente 28, por lo menos aproximadamente 30, por lo menos aproximadamente 32 o por lo menos aproximadamente 34 átomos de carbono o más. Los ácidos grasos preferidos para la producción de biodiésel, diésel renovable o combustible de jet o los alcoholes primarios correspondientes, aldehídos, alcanos y alquenos para aplicaciones industriales contienen por lo menos aproximadamente 8 átomos de carbono o más. En ciertas modalidades, los ácidos grasos anteriores, así como las otras moléculas de hidrocarburo correspondientes están saturados (sin ningún doble o triple enlace carbono-carbono); monoinsaturado (un solo enlace doble); poliinsaturados (dos o más enlaces dobles); son lineales (no cíclicos) y/o tienen poca o ninguna ramificación en sus estructuras.
Al seleccionar la combinación deseada de genes exógenos que van a ser expresados, se puede confeccionar el producto generado por el microbio, que puede luego ser extraído de la biomasa acuosa. Por ejemplo, el microbio puede contener: i) un gen exógeno que codifica una acil-ACP tioesterasa grasa y opcionalmente ii) una proteína portadora de acilo coexpresada naturalmente o una proteína portadora de acilo que tiene si no afinidad con la acil-ACP tioesterasa grasa (o inversamente) y opcionalmente (iii) un gen exógeno que codifica una acil-CoA/aldehído reductasa grasa o una acil-CoA reductasa grasa y opcionalmente (iv) un gen exógeno que codifica una aldehído reductasa grasa o una aldehído descarbonilasa grasa. El microbio, cuando es cultivado como se describe posteriormente, sintetiza un ácido graso enlazado a una ACP y la acil-ACP tioesterasa grasa cataliza la escisión del ácido graso de la ACP para producir, por medio de procesamiento enzimático adicional, una molécula de acil-CoA grasa. Cuando está presente, la acil-CoA/aldehído reductasa grasa cataliza la reducción de la acil-CoA a un alcohol. De igual modo, la acil-CoA reductasa grasa, cuando está presente, cataliza la reducción de la acil-CoA a un aldehído. En aquellas modalidades en las cuales un gen exógeno que codifica una acil-CoA reductasa grasa está presente y es expresada para producir un producto de aldehído, una aldehído reductasa grasa, codificada por el tercer gen exógeno, cataliza la reducción del aldehído a un alcohol. De igual modo, una aldehído descarbonilasa grasa cataliza la conversión del aldehído en un alcano o un alqueno, cuando está presente.
Los genes que codifican tales enzimas pueden ser obtenidos de células que ya se sabe que exhiben producción de lípidos significativa tal como Chlorella protothecoides. Los genes que ya se sabe que tienen un papel en la producción de lípidos, por ejemplo, un gen que codifica una enzima que satura enlaces dobles, puede ser transformado individualmente en células receptoras. Sin embargo, para poner en práctica la invención no es necesario hacer suposiciones a priori en cuanto a qué genes son requeridos. Una biblioteca de ADN que contiene diferentes genes, tales como ADNc de un organismo de producción de lípidos bueno, puede ser transformada en células receptoras. El ADNc está preferiblemente en enlace operable con un promotor activo en microalgas. Diferentes células de microalgas receptoras transformadas por una biblioteca reciben diferentes genes de la biblioteca. Los transformantes que tienen producción de lípido mejorada son identificados por medio de métodos de selección conocidos en la técnica, tales como por ejemplo ácido HPLC, cromatografía de gases y métodos de espectometría de masas de análisis de hidrocarburo (para consultar ejemplos de tales análisis, véase Biomass and Bioenergy Vol. 6. N.° 4. págs. 269-274 (1994); Experientia 38; 47-49 (1982); y Phytochemistry 65 (2004) 3159-3165). Estos transformantes son luego sometidos a transformación adicional con la biblioteca original y/o intercruzados opcionalmente para generar una ronda adicional de organismos que tienen producción de lípidos mejorada. Los procedimientos generales para desarrollar organismos enteros para adquirir una propiedad deseada son descritos en por ejemplo Patente Estadounidense 6 716 631. Tales métodos abarcan, por ejemplo introducir una biblioteca de fragmentos de ADN en una pluralidad de células, mediante lo cual por lo menos uno de los fragmentos sufre recombinación con un segmento en el genoma o un episoma de las células para producir células modificadas. Las células modificadas son luego seleccionadas para células modificadas que han evolucionado hacia la adquisición de la función deseada. Los vectores y métodos para transformación son análogos con aquellos analizados en relación con la expresión de genes de lipasa.
Además, se pueden usar bibliotecas sustractivas para identificar genes cuya transcripción es inducida en condiciones diferentes, especialmente condiciones empleadas en el cultivo de microorganismos para la producción de biodiésel o para la producción de hidrocarburos útiles como una materia prima de alimentación para aplicaciones industriales. Las bibliotecas sustractivas contienen secuencias de nucleótidos que reflejan las diferencias entre dos muestras diferentes. Tales bibliotecas son preparadas mediante procedimientos que incluyen las etapas de desnaturalización e hibridización de poblaciones de polinucleótidos (por ejemplo ARNm, ADNc, secuencias amplificadas) de cada muestra. Las secuencias comunes a ambas muestras se hibridizan y eliminan, dejando las secuencias que difieren entre las muestras. De esta manera, las secuencias que son inducidas en condiciones particulares pueden ser identificadas. Esta técnica puede ser empleada, por ejemplo para identificar genes útiles para incrementar la producción de lípido (por ejemplo, ácido graso) y en particular la producción de lípido en cualesquiera condiciones de cultivo deseadas. La técnica de hibridización sustractiva puede también ser empleada para identificar promotores, por ejemplo, promotores inducibles útiles en los constructos de expresión.
Así, por ejemplo, las bibliotecas sustractivas pueden ser preparadas a partir de cultivos de microorganismos cultivados autotróficamente (en la luz sin una fuente de carbono fija) o heterotróficamente (en la oscuridad en presencia de una fuente de carbono fija). En particular, los genes heterotróficos pueden ser inducidos durante el cultivo en la oscuridad en presencia de una fuente de carbono fija y pueden por consiguiente estar presentes en una biblioteca generada al sustraer secuencias de células autotróficas de secuencias de células heterotróficas oscuras. Las bibliotecas sustractivas pueden también ser preparadas a partir de cultivos a los cuales un sustrato de carbono particular, tal como glucosa, ha sido agregado para identificar genes que desempeñan un papel en metabolizar el sustrato. Las bibliotecas sustractivas preparadas a partir de cultivos cultivados en presencia de nitrógeno en exceso contralimitado pueden ser usadas para identificar genes que controlan la división celular en contraposición con la producción de acumulación de hidrocarburo. La preparación de una biblioteca sustractiva de un cultivo al cual han sido agregados lípidos (por ejemplo, ácidos grasos) puede ayudar a identificar genes cuya sobreexpresión incrementa la producción de ácido graso. Más específicamente, la adición de ácidos grasos a un cultivo de células que pueden usar los ácidos grasos agregados provocará a la regulación descendente de genes sintéticos de ácido graso para regular descendentemente la producción de ácido graso. La sobreexpresión de uno o más de tales genes tendrá el efecto contrario.
B. Flujo de Carbono Incrementado en la Ruta del Lípido.
Algunas microalgas producen cantidades significativas de metabolitos sin lípidos, tales como, por ejemplo, polisacáridos. Debido a que la biosíntesis de polisacáridos puede usar una proporción significativa de la energía metabólica total disponible para las células, la mutagénesis de células productoras de lípidos seguida por la selección para la producción de polisacáridos reducida o eliminada genera nuevas cepas que son capaces de producir rendimientos más altos de lípidos.
El análisis de fenol: ácido sulfúrico detecta carbohidratos (véase Hellebust, Handbook of Phycological Methods, Cambridge University Press, 1978; y Cuesta G., et al., J Microbiol Methods. 2003 Jan;52(l):69-73). El análisis de azul de 1,6-dimetilmetileno detecta polisacáridos aniónicos, (véase, por ejemplo Braz J Med Biol Res. 1999 May;32(5):545-50; Clin Chem. 1986 Nov;32(ll):2073-6).
Los polisacáridos pueden también ser analizados por medio de métodos tales como HPLC, cromatografía de exclusión de tamaño y cromatografía de intercambio aniónico (véase, por ejemplo Prosky L, Asp N, Schweizer TF, DeVries JW & Furda I (1988). Determination of insoluble, soluble and total dietary fiber in food and food products: Interlaboratory study. Journal of the Association of Official Analytical Chemists 71, 1017±1023; Int J Biol Macromol. 2003 Nov;33(l-3):9-18). Los polisacáridos también pueden ser detectados utilizando electroforesis de gel (véase, por ejemplo Anal Biochem. 2003 Oct 15;321(2):174-82; Anal Biochem. 2002 Jan l;300(l):53-68).
VI. Métodos de recuperación de lípidos e hidrocarburos
Los hidrocarburos (por ejemplo, lípidos, ácidos grasos, aldehídos, alcoholes y alcanos) producidos en los métodos de la invención pueden ser cosechados o, si no, recolectados mediante cualquier medio apropiado. Por ejemplo, los hidrocarburos secretados de células pueden ser centrifugados para separar los hidrocarburos en una capa hidrofóbica de contaminantes en una capa acuosa y opcionalmente de cualesquiera materiales sólidos como un precipitado después de la centrifugación. El material que contiene células o fracciones de células puede ser tratado con proteasas para degradar proteínas contaminantes antes o después de la centrifugación. En algunos casos las proteínas contaminantes están asociadas, posiblemente de manera covalente a hidrocarburos o precursores de hidrocarburos que forman hidrocarburos después de la eliminación de la proteína. En otros casos, las moléculas de hidrocarburo están en una preparación que también contiene proteínas. Se pueden agregar proteasas a preparaciones de hidrocarburos que contienen proteínas para degradar proteínas (por ejemplo, la proteasa de Streptomyces griseus puede ser usada (SigmaAldrich catalog number P5147)). Después de la digestión, los hidrocarburos son preferiblemente purificados de proteínas residuales, fragmentos de péptidos y aminoácidos. Esta purificación se puede llevar a cabo, por ejemplo mediante métodos enumerados anteriormente, tales como centrifugación y filtración.
Los hidrocarburos extracelulares pueden también ser extraídos in vivo de células de microalgas vivas que son luego devueltas a un biorreactor mediante exposición de las células en un ambiente estéril diferente, a un solvente de extracción no tóxico, seguido de la separación de la células vivas y la fracción hidrofóbica del solvente de extracción e hidrocarburos, en donde las células vivas separadas son luego devueltas a un recipiente de cultivo, tal como un fermentador de acero inoxidable o fotobiorreactor (véase Biotechnol Bioeng. 2004 Dec 5;88(5):593-600 and Biotechnol Bioeng. 2004 Mar 5;85(5):475-81).
Los hidrocarburos pueden también ser aislados mediante extracción de célula entera. Las células son primero sometidas a disrupción, como se describe en la sección titulada “Lisis de Células” y luego los hidrocarburos asociados a la membrana celular/pared celular intracelulares así como hidrocarburos extracelulares pueden ser recolectados de toda la masa de célula entera tal como mediante el uso de centrifugación como se describe anteriormente.
Varios métodos están disponibles para separar hidrocarburos y lípidos de lisados celulares producidos por los métodos anteriores. Por ejemplo, los hidrocarburos pueden ser extraídos con un solvente hidrofóbico tal como hexano (véase Frenz et al. 1989, Enzyme Microb. Technol., 11:717). Los hidrocarburos pueden también ser extraídos usando licuefacción (véase, por ejemplo Sawayama et al. 1999, Biomass and Bioenergy 17:33-39 e Inoue et al. 1993, Biomass Bioenergy 6(4):269-274); licuefacción de aceite (véase, por ejemplo Minowa et al. 1995, Fuel 74(12):1735-1738); y extracción de CO2 supercrítico (véase, por ejemplo Mendes et al. 2003, Inorganica Chimica Acta 356:328-334).
Miao y Wu describen un protocolo para la recuperación del lípido microalgal de un cultivo de Chlorella prototheocoides en el cual las células fueron cosechadas mediante centrifugación, lavadas con agua destilada y secadas mediante secado por congelación. El polvo celular resultante fue pulverizado en un mortero y luego extraído con n-hexan. Miao and Wu, Biosource Technology (2006) 97:841-846.
A. Lisis de Células
Los lípidos intracelulares e hidrocarburos producidos en microorganismos son en algunas modalidades extraídos después de la lisis de las células del microorganismo. Una vez extraídos, los lípidos y/o hidrocarburos pueden ser refinados adicionalmente para producir aceites, combustibles u oleoquímicos.
Después de la finalización del cultivo, los microorganismos pueden ser separados del caldo de fermentación. Opcionalmente, la separación es efectuada mediante centrifugación para generar una pasta concentrada. La centrifugación no elimina cantidades significativas de agua intracelular de los microorganismos y no es una etapa de secado. La biomasa puede luego ser lavada con una solución de lavado (por ejemplo, agua DI) para deshacerse del caldo de fermentación y desechos. Opcionalmente, la biomasa microbiana lavada puede también ser secada (secada en horno, liofilizada, etc.) antes de la disrupción celular. Como alternativa, las células pueden ser sometidas a lisis sin separación de una parte o la totalidad del caldo de fermentación cuando la fermentación está completa. Por ejemplo, las células pueden estar en una proporción de menos de 1:1 v:v de células a líquido extracelular cuando las células son sometidas a lisis.
Los microorganismos que contienen un lípido y/o hidrocarburo pueden ser sometidos a lisis para producir un lisado. Como se detalla en la presente, la etapa de lisis de un microorganismo (también denominada lisis celular) puede ser obtenida mediante cualquier medio apropiado, en los que se incluyen lisis inducida por calor, adición de una base, adición de un ácido, utilizando enzimas tales como proteasas y enzimas de degradación de polisacárido tales como amilasas, utilizando ultrasonido, lisis mecánica, utilizando choque osmótico, infección con un virus lítico y/o expresión de uno o más genes líticos. La lisis es efectuada para liberar moléculas intracelulares que han sido producidas por el microorganismo. Cada uno de estos métodos para la lisis de un microorganismo puede ser usado como un solo método o en combinación simultánea o secuencialmente.
La extensión de disrupción celular puede ser observada por análisis de microscopio. Utilizando uno o más de los métodos descritos en la presente, comúnmente se observa más del 70% de ruptura celular. Preferiblemente la ruptura celular es más del 80%, más preferiblemente más del 90% y más preferiblemente alrededor del 100%.
En modalidades particulares, el microorganismo es sometido a lisis después del cultivo, por ejemplo para incrementar la exposición del lípido celular y/o hidrocarburo para extracción o procesamiento adicional. La sincronización de la expresión de lipasa (por ejemplo, mediante un promotor inducible) o lisis celular puede ser ajustada para optimizar el rendimiento de lípidos y/o hidrocarburos.
B. Extracción de lípidos e hidrocarburos
Los lípidos e hidrocarburos generados por los microorganismos pueden ser recuperados mediante extracción con un solvente orgánico. En algunos casos, el solvente orgánico preferido es hexan. Comúnmente, el solvente orgánico es agregado directamente al lisado sin separación previa de los componentes del lisado. En una modalidad el lisado generado por uno o más de los métodos descritos anteriormente es puesto en contacto con un solvente orgánico por un período de tiempo suficiente para permitir que los componentes de lípido y/o hidrocarburo formen una solución con el solvente orgánico. En algunos casos, la solución puede luego ser refinada adicionalmente para recuperar componentes de lípidos o hidrocarburos deseados específicos. Los métodos de extracción por hexano son bien conocidos en la técnica.
VII.
Métodos para el procesamiento de lípidos e hidrocarburos
A.
Modificación enzimática
Los hidrocarburos (por ejemplo, lípidos, ácidos grasos, aldehídos, alcoholes y alcanos) producidos por las células como se describe en la presente pueden ser modificados mediante el uso de una o más enzimas, en las que se incluyen una lipasa, como se describe anteriormente. Cuando los hidrocarburos están en el ambiente extracelular de las células, la una o más enzimas pueden ser agregadas a aquel ambiente en condiciones en las cuales la enzima modifica el hidrocarburo o completa su síntesis de un precursor de hidrocarburo. Como alternativa, los hidrocarburos pueden estar parcial o completamente aislados del material celular antes de la adición de uno o más catalizadores tales como enzimas. Tales catalizadores son agregados exógenamente y su actividad ocurre fuera de la célula o in vitro.
B. Modificación térmica y de otros catalizadores
Los hidrocarburos producidos por células in vivo o modificados enzimáticamente in vitro, como se describe en la presente, pueden ser procesados además opcionalmente mediante medios convencionales. El procesamiento puede incluir “cracking” para reducir el tamaño y así incrementar la proporción de hidrógeno:carbono de moléculas de hidrocarburo. Los métodos de cracking y térmica son usados sistemáticamente en el procesamiento de hidrocarburos y aceite de triglicéridos. Los métodos catalíticos implican el uso de un catalizador, tal como un catalizador ácido sólido. El catalizador puede ser sílice-alúmina o una zeolita, que da como resultado una rotura heterolítica o asimétrica de un enlace carbono-carbono para dar como resultado un carbocatión y un anión hidruro. Estos intermediarios reactivos sufren luego ya sea reacomodo o transferencia de hidruro con otro hidrocarburo. Las reacciones pueden así regenerar los intermediarios para dar como resultado un mecanismo de cadena de autopropagación. Los hidrocarburos pueden también ser procesados para reducir, opcionalmente a cero, el número de enlaces dobles triples carbono-carbono en los mismos. Los hidrocarburos pueden también ser procesados para retirar o eliminar un anillo o estructura cíclica en los mismos. Los hidrocarburos pueden también ser procesados para incrementar la proporción de hidrógeno:carbono. Esto puede incluir la adición de hidrógeno (“hidrogenación”) y/o la “cracking” de hidrocarburos a hidrocarburos más pequeños.
Los métodos térmicos implican el uso de temperatura y presión elevadas para reducir el tamaño de hidrocarburos. Se pueden usar una temperatura elevada de aproximadamente 800º C y una presión de aproximadamente 700 kPa.
Estas condiciones generan “ligero”, un término que a veces es usado para referirse a moléculas de hidrocarburo
ricas en hidrógeno (distintas del flujo de fotones), mientras también generan, mediante condensación, moléculas de hidrocarburo más pesadas que están relativamente agotadas de hidrógeno. La metodología proporciona rotura homolítica o simétrica y produce alquenos que pueden opcionalmente ser saturados enzimáticamente como se describe anteriormente.
Los métodos catalíticos y térmicos son convencionales en plantas para el procesamiento de hidrocarburos y refinación del petróleo. Así, los hidrocarburos producidos por las células como se describe en la presente pueden ser recolectados y procesados o refinados a través de medios convencionales. Véase Hillen et al. (Biotechnology and Bioengineering, Vol. XXIV: 193-205 (1982)) para un informe de hidrocraking de hidrocarburos producidos por microalgas. En modalidades alternativas, la fracción es tratada con otro catalizador, tal como un compuesto orgánico, calor y/o un compuesto inorgánico. Para el procesamiento de lípidos a biodiésel, se usa un proceso de transesterificación como se describe en la Sección IV en la presente.
VIII. Métodos para producir combustibles apropiados para uso en vehículos diésel y motores a chorro
El interés cada vez mayor es dirigido al uso de componentes de hidrocarburos de origen biológico en combustible, tales como biodiésel, diésel renovable y combustible de jet, puesto que los materiales biológicos renovables de partida que pueden reemplazar los materiales de partida derivados de combustibles fósiles están disponibles y es deseable el uso de los mismos. Hay una necesidad urgente de métodos para producir componentes de hidrocarburos a partir de materiales biológicos. La presente invención satisface esta necesidad al proveer métodos para la producción de biodiésel, diésel renovable y combustible de jet utilizando los lípidos generados por los métodos descritos en la presente como material biológico para producir biodiésel, diésel renovable y combustible de jet.
Los combustibles de diésel tradicionales son destilados de petróleo ricos en hidrocarburos parafínicos. Tienen intervalos de ebullición tan amplios como de 188º C (370º F) a 415.5º C (780º F), que son apropiados para combustión en un motor de ignición por compresión, tal como un vehículo de motor diésel. La Sociedad Estadounidense de Pruebas y Materiales (ASTM por sus siglas en inglés) establece el grado de diésel de acuerdo con el intervalo de ebullición, junto con intervalos permisibles de otras propiedades de combustible, tales como número de cetanos, punto de turbidez, temperatura de inflamación, viscosidad, punto de anilina, contenido de azufre, contenido de agua, contenido de ceniza, corrosión de banda de cobre y residuos de carbono. Técnicamente, cualquier material destilado de hidrocarburos derivado de biomasa o de otro modo que cumple con la especificación de ASTM apropiada puede ser definido como combustible diésel (ASTM D975), combustible de jet (ASTM D1655) o como biodiésel (ASTM D6751).
Después de la extracción, los componentes de lípido y/o hidrocarburo recuperados de la biomasa microbiana descritos en la presente pueden ser sometidos a tratamiento químico para la fabricación de un combustible para uso en vehículos diésel y motores a chorro.
A. Biodiésel
El biodiésel es un líquido que varía en color – entre dorado y marrón oscuro – dependiendo de la materia prima de alimentación de producción. Es prácticamente inmiscible con agua, tiene un alto punto de ebullición y una baja presión de vapor. Biodiésel se refiere a un combustible procesado equivalente a diésel para uso en vehículos de motor diésel. El biodiésel es biodegradable y no tóxico. Un beneficio adicional del biodiésel con respecto al combustible diésel convencional es un desgaste más bajo del motor.
Comúnmente, el biodiésel comprende alquilésteres de C14-C18. Varios procesos convierten la biomasa o un lípido producido y aislado como se describe en la presente en combustibles de diésel. Un método preferido para producir biodiésel es mediante transesterificación de un lípido como se describe en la presente. Un alquiléster preferido para uso como biodiésel es un metiléster o etiléster.
El biodiésel producido por un método descrito en la presente puede ser usado solo o combinado con combustible diésel convencional en cualquier concentración en la mayoría de los vehículos de motor diésel modernos. Cuando es combinado con el combustible diésel convencional (diésel de petróleo), el biodiésel puede estar presente entre aproximadamente un 0.1% y aproximadamente un 99.9%. A nivel mundial se utiliza un sistema conocido como el factor “B” para establecer la cantidad de biodiésel en cualquier mezcla de combustible. Por ejemplo, el combustible que contiene un 20% de biodiésel es etiquetado como B20. El biodiésel puro es denominado como B100.
El biodiésel puede también ser usado como un combustible de calentamiento en calentadores domésticos y comerciales. Los calentadores o calderas de aceite existentes pueden contener partes de hule o caucho y pueden requerir conversión para funcionar con biodiésel. Normalmente, el proceso de conversión es relativamente simple, e implica el intercambio de partes de hule o caucho para partes sintéticas debido a que el biodiésel es un solvente fuerte. Debido a su fuerte poder como solvente, el quemado de biodiésel incrementará la eficacia de las calderas o calentadores.
El biodiésel puede ser usado como aditivo en formulaciones de diésel para incrementar la lubricidad de combustible diésel de azufre ultrabajo puro (ULSD), que es ventajoso debido a que virtualmente no tiene contenido de azufre.
El biodiésel es un solvente mejor que el petrodiésel y puede ser usado para romper depósitos de residuos en líneas de combustible de vehículos que han sido previamente puestos en marcha con petrodiésel.
1. Producción de biodiésel
El biodiésel puede ser producido mediante transesterificación de triglicéridos contenidos en biomasa rica en aceite. Un método para producir biodiésel puede comprender las etapas de: (a) cultivar un microorganismo que contiene lípidos utilizando los métodos revelados en la presente; (b) someter a lisis un microorganismo que contiene lípidos para producir un lisado; (c) aislar el lípido del microorganismo sometido a lisis y (d) transesterificar la composición del lípido, mediante lo cual se produce biodiésel.
Los métodos para el cultivo de un microorganismo, someter a lisis un microorganismo para producir un lisado, tratar el lisado en un medio que comprende un solvente orgánico para formar una mezcla heterogénea y separar el lisado tratado en una composición de lípido han sido descritos anteriormente y pueden también ser usados en el método para producir biodiésel.
Las composiciones de lípidos pueden ser sometidas a transesterificación para producir ésteres de ácidos grasos de cadena larga útiles como biodiésel. Las reacciones de transesterificación preferidas son descritas a continuación e incluyen transesterificación catalizada por base y transesterificación utilizando lipasas recombinantes.
En un proceso de transesterificación catalizado por base, los triacilglicéridos se hacen reaccionar con un alcohol, tal como metanol o etanol, en presencia de un catalizador alcalino, comúnmente hidróxido de potasio. Esta reacción forma metil o etilésteres y glicerina (glicerol) como producto secundario.
En modalidades particulares, una lipasa recombinante es expresada en los mismos microorganismos que producen lípido sobre los cuales la lipasa actúa. Las lipasas recombinantes apropiadas incluyen aquellas enumeradas anteriormente en la Tabla 9 y/o que tienen números de acceso de GenBank enumerados anteriormente en la Tabla 9 o un polipéptido que tiene por lo menos un 70% de identidad de aminoácidos con una de las lipasas enumeradas anteriormente en la tabla 9 y que exhibe actividad de lipasa. En modalidades adicionales, la actividad enzimática está presente en una secuencia que tiene por lo menos aproximadamente un 75%, por lo menos aproximadamente un 80%, por lo menos aproximadamente un 85%, por lo menos aproximadamente un 90%, por lo menos aproximadamente un 95% o por lo menos aproximadamente un 99% de identidad con una de las secuencias descritas anteriormente. El ADN que codifica la lipasa y el marcador seleccionable es preferiblemente ADNc codónoptimizado. Los métodos para recodificar genes para expresión en microalgas son descritos en la Patente Estadounidense N.° 7 135 290.
2. Estándares
El estándar internacional común para biodiésel es EN 14214. D6751 de ASTM es el estándar de biodiésel más común al que se hace referencia en los Estados Unidos de América y Canadá. Alemania usa DIN EN 14214 y el Reino Unido debe cumplir con BS EN 14214.
Las pruebas industriales básicas para determinar si los productos son conformes con estos estándares incluyen comúnmente cromatografía de gases, HPLC y otros. El biodiésel que cumple con los estándares de calidad no es tóxico en absoluto, con una clasificación de toxicidad (LD50) mayor de 50 mL/Kg.
B. Diésel renovable
El diésel renovable comprende alcanos, tales como C16:0 y C18:0 y así, son distintos del biodiésel. El diésel renovable de alta calidad es conforme con el estándar de D975 de ASTM.
Los lípidos producidos por los métodos de la presente invención pueden servir como materia prima de alimentación para producir diésel renovable. El diésel renovable puede ser producido mediante por lo menos tres procesos: procesamiento hidrotérmico (hidrotratamiento); hidroprocesamiento y licuefacción indirecta. Estos procesos producen destilados sin éster. Durante estos procesos, los triacilglicéridos producidos y aislados como se describe en la presente son convertidos en alcanos.
Un método para producir diésel renovable puede comprender a) cultivar un microorganismo que contiene lípido utilizando métodos descritos en la presente; b) someter a lisis el microorganismo para producir un lisado; c) aislar el lípido del microorganismo sometido a lisis y d) desoxigenar e hidrotratar el lípido para producir un alcano, mediante lo cual se produce diésel renovable. Los lípidos apropiados para la fabricación de diésel renovable pueden ser obtenidos mediante la extracción de biomasa microbiana utilizando un solvente orgánico tal como hexano o mediante otros métodos, tales como aquellos descritos en la patente estadounidense 5 928 696.
En algunos métodos el lípido microbiano es primero sometido a cracking junto con hidrotratamiento para reducir la longitud de cadena de carbonos y saturar los enlaces dobles, respectivamente. El material es luego isomerizado, también junto con hidrotratamiento. La fracción de naphta puede luego ser eliminada por medio de destilación, seguida por destilación adicional para vaporizar y destilar componentes deseados en el combustible diésel para cumplir con el estándar D975 mientras se dejan componentes que son más pesados de lo que se espera para cumplir con el estándar D975. Los métodos de hidrotratamiento, hidrocracking, desoxigenación e isomerización de aceites modificados químicamente, en los que se incluyen aceites de triglicérido, son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo las solicitudes de patente europeas EP1741768 (A1); EP1741767 (A1); EP1682466 (A1); EP1640437 (A1); EP1681337 (A1); EP1795576 (A1) y patentes estadounidenses 7 238 277; 6 630 066; 6 596 155; 6 977 322; 7,041 866; 6,217 746; 5 885 440; 6 881 873.
1. Hidrotratamiento
En una modalidad preferida del método para producir diésel renovable, el tratamiento del lípido para producir un alcano es efectuado mediante hidrotratamiento de la composición de lípido. En el procesamiento hidrotérmico, comúnmente, la biomasa se hace reaccionar en agua a una temperatura y presión elevadas para formar aceites y sólidos residuales. Las temperaturas de conversión son comúnmente de 149°C (300°F) a 349°C (660°F), con presión suficiente para mantener el agua principalmente como líquido, 100 a 170 atmósferas estándar (atm). Los tiempos de reacción son del orden de 15 a 30 minutos. Después de que la reacción esté completa, los orgánicos son separados del agua. Mediante esto, se produce un destilado apropiado para diésel.
2. Hidroprocesamiento
Un diésel renovable, denominado “diésel verde”, puede ser producido a partir de ácidos grasos mediante tecnología de hidroprocesamiento tradicional. Los aceites que contienen triglicérido pueden ser hidroprocesados ya sea como coalimentación con petróleo o como una alimentación dedicada. El producto es un combustible diésel que conforme con la especificación D975 de la ASTM. Así, en otra modalidad preferida del método para producir diésel renovable, se efectúa el tratamiento de la composición de lípido para producir un alcano mediante hidroprocesamiento de la composición de lípido.
En algunos métodos para fabricar diésel renovable, la primera etapa de tratamiento de un triglicérido es hidroprocesamiento para saturar enlaces dobles, seguido de desoxigenación a temperatura elevada en presencia de hidrógeno y un catalizador. En algunos métodos, la hidrogenación y desoxigenación ocurren en la misma reacción. En otros métodos, la desoxigenación ocurre antes de la hidrogenación. La isomerización es luego efectuada opcionalmente, también en presencia de hidrógeno y un catalizador. Los componentes del naphta son preferentes eliminados por medio de destilación. Por ejemplo, véanse las patentes estadounidenses 5,475,160 (hidrogenización de triglicéridos); 5,091,116 (desoxigenación, hidrogenación y remoción de gas); 6,391,815 (hidrogenación) y 5,888,947 (isomerización).
Los refinadores de petróleo utilizan hidroprocesamiento para eliminar impurezas mediante tratamiento de alimentaciones con hidrógeno. Las temperaturas de conversión de hidroprocesamiento son comúnmente de 149°C (300°F) a 361°C (700°F). Las presiones son comúnmente de 40 a 100 atmósferas. Los tiempos de reacción son comúnmente del orden de 10 a 60 minutos.
Se usan catalizadores sólidos para incrementar ciertas velocidades de reacción, mejorar la selectividad para ciertos productos y optimizar el consumo de hidrógeno.
El hidrotratamiento e hidroprocesamiento conducen finalmente a una reducción en el peso molecular de la alimentación. En el caso de aceites que contienen triglicérido, la molécula de triglicérido es reducida a cuatro moléculas de hidrocarburos en condiciones de hidroprocesamiento: una molécula de propano y tres moléculas de hidrocarburo más pesadas, comúnmente en el intervalo de C8 a C18.
3. Licuefacción indirecta
Un diésel de contenido ultrabajo de azufre tradicional puede ser producido a partir de cualquier forma de biomasa mediante un proceso de dos etapas. En primer lugar, la biomasa es convertida en un gas sintético o gas de síntesis, una mezcla gaseosa rica en hidrógeno y monóxido de carbono. Luego, el gas sintético o gas de síntesis es convertido catalíticamente en líquidos. Comúnmente, la producción de líquidos se lleva a cabo utilizando síntesis de Fischer-Tropsch (FT). Esta tecnología se aplica al carbón, gas natural y aceites pesados. Así, en aún otra modalidad preferida del método para producir diésel renovable, el tratamiento de la composición de lípido para producir un alcano es efectuado mediante licuefacción indirecta de la composición de lípido.
C. Combustible de jet
El uso en los Estados Unidos de América de combustible de jet en el año 2006 fue de aproximadamente 80 billones de litros (21 billones de galones). El combustible de avión es de color entre claro y paja. El combustible más común es un combustible basado en aceite de parafina/sin plomo clasificado como A-1 de avión, que es producido según un conjunto de especificaciones que están indexadas internacionalmente. El combustible de avión es una mezcla de un gran número de hidrocarburos diferentes, posiblemente hasta de mil o más. El intervalo de sus tamaños (pesos moleculares o números de carbonos) está restringido por los requerimientos para el producto, por ejemplo punto de congelación o punto de humo. El combustible de avión de tipo queroseno (en el que se incluye Jet A y Jet A-1) tiene una distribución de número de carbono de entre aproximadamente 8 y 16 número de carbono. El combustible de avión de corte amplio o de tipo naphta (en el que se incluye Jet B) tiene comúnmente una distribución de número de carbono de entre aproximadamente 5 y 15 carbonos.
Ambos aviones (Jet A y Jet B) pueden contener un número de aditivos. Los aditivos útiles incluyen pero no están limitados a antioxidantes, agentes antiestáticos, inhibidores de corrosión y agentes de inhibición de formación de hielo de sistema de combustible (FSII). Los antioxidantes impiden el engomado, y normalmente son a base de fenoles alquilados, por ejemplo AO-30, AO-31 o AO-37. Los agentes antiestáticos disipan la electricidad estática e impiden la formación de chispas. Stadis 450 con ácido dinonilnaftilsulfónico (DINNSA) como el ingrediente activo es un ejemplo. Los inhibidores de corrosión, por ejemplo DCI-4A son usados para combustibles civiles y militares y DCI6A es usado para combustibles militares. Los agentes de FSII incluyen por ejemplo Di-EGME.
Una solución es combinar combustibles de algas con combustibles de jet existentes. La presente invención proporciona tal solución. Los lípidos producidos por los métodos de la presente invención pueden servir como materia prima de alimentación para producir combustible de jet. Aquí dos métodos para producir combustible de jet a partir de los lípidos producidos por los métodos de la presente invención son provistos: cracking catalítico de fluido (FCC) e hidrodesoxigenación (HDO).
1. Cracking catalítico de fluido
El cracking catalítico de fluido (FCC) es un método que es usado para producir olefinas, especialmente propileno a partir de fracciones crudas pesadas. Hay reseñas en la bibliografía de que aceites vegetales tales como aceite de canola podrían ser procesados utilizando FCC para dar una corriente de hidrocarburo útil como un combustible de gasolina.
Los lípidos producidos por el método de la presente invención pueden ser convertidos en olefinas. El proceso implica hacer fluir los lípidos producidos a través de una zona FCC y recoger una corriente de productos que consiste en olefinas, que es útil como combustible de jet. Los lípidos producidos son puestos en contacto con un catalizador de cracking en condiciones de cracking para proporcionar una corriente de productos que comprende olefinas e hidrocarburos útiles como combustible de jet.
Un método para producir combustible de jet puede comprender: a) cultivar un microorganismo que contiene lípidos utilizando métodos revelados en la presente, b) someter a lisis el microorganismo que contiene lípidos para producir un lisado, c) aislar el lípido del lisado y d)tratar la composición del lípido, mediante lo cual se produce el combustible de jet.
En una modalidad preferida del método para producir un combustible de jet, la composición de lípido se puede hacer fluir a través de una zona de cracking catalítico de fluido que, en una modalidad, puede comprender poner en contacto la composición de lípido con un catalizador de cracking en condiciones de cracking para proporcionar una corriente de productos que comprende C2 - C5 olefinas.
2. Hidrodesoxigenación
En otra modalidad del método para producir un combustible de jet utilizando la composición de lípido o los lípidos producidos como se describe en la presente, la estructura de la composición de lípido o los lípidos es descompuesta mediante un proceso denominado hidrodesoxigenación (HDO).
HDO significa la eliminación de oxígeno por medio de hidrógeno, esto es, el oxígeno es eliminado mientras se rompe la estructura del material. Los enlaces dobles olefínicos son hidrogenados y cualesquiera compuestos de azufre y nitrógeno son eliminados. La eliminación de azufre es llamada hidrodesulfurización (HDS). El pretratamiento y pureza de las materias primas (composición de lípido o los lípidos) contribuyen a la vida útil del catalizador.
En general en la etapa de HDO/HDS, el hidrógeno es mezclado con la materia prima de alimentación (composición de lípido o los lípidos) y luego la mezcla se hace pasar a través de un lecho catalítico como un flujo a cocorriente, ya sea como una sola fase o como una materia prima de alimentación de dos fases. Después de la etapa de HDO/MDS, la fracción de producto es separada y se hace pasar a un reactor de isomerización separado. Un reactor de isomerización para el material de partida biológico es descrito en la bibliografía (FI 100 248) como un reactor a cocorriente.
El proceso para producir un combustible mediante hidrogenación de una alimentación de hidrocarburo, por ejemplo, la composición de lípido o los lípidos en la presente, puede también ser efectuado al hacer pasar la composición de lípido o los lípidos como un flujo a cocorriente con gas hidrógeno a través de una primera zona de hidrogenación y después de esto, el efluente de hidrocarburo es hidrogenado adicionalmente en una segunda zona de hidrogenación al hacer pasar el gas hidrógeno a la segunda zona de hidrogenación como un flujo a contra corriente en relación con el efluente de hidrocarburo. Las aplicaciones de HDO ilustrativas y catalizadores útiles para el cracking de la composición de lípido para producir C2-C5 olefinas son descritos en la patente estadounidense N.° 7 232 935.
Comúnmente, en la etapa de hidrodesoxigenación, la estructura del componente biológico, tal como la composición de lípido o lípidos en la presente, es descompuesta, los compuestos de oxígeno, nitrógeno, fósforo y azufre e hidrocarburos ligeros como gas son eliminados y los enlaces olefínicos son hidrogenados. En la segunda etapa del proceso, esto es, en la llamada etapa de isomerización, la isomerización se lleva a cabo para la ramificación de la cadena de hidrocarburos y para mejorar el rendimiento de la parafina a temperaturas bajas.
IX. Diseño de microbio
Como se indica anteriormente, en ciertas modalidades de la presente invención, es deseable modificar genéticamente un microorganismo para mejorar la producción de lípido, modificar las propiedades o proporciones de los componentes generados por el microorganismo o mejorar o proporcionar las características de crecimiento de novo sobre una variedad de materias primas de alimentación. Chlorella, particularmente Chlorella protothecoides, Chlorella minutissima, Chlorella sorokiniana, Chlorella ellipsoidea, Chlorella sp. y Chlorella emersonii son microorganismos preferidos para uso en los métodos de diseño genético descritos en la presente, aunque otras especies de Chlorella así como otras variedades de microalgas pueden ser usadas.
Los promotores, ADNc y 3’UTR, así como otros elementos de los vectores, pueden ser generados por medio de técnicas de clonación utilizando fragmentos aislados de fuentes naturales (véase por ejemplo Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al. (3a edición, 2001, Cold Spring Harbor Press; y patente estadounidense 4 683 202). Como alternativa, se pueden generar elementos sintéticamente utilizando métodos conocidos (véase por ejemplo Gene. 1995 Oct 16; 164(l):49-53).
A. Optimización de Codón para la Expresión
El ADN que codifica un polipéptido que va a ser expresado en un microorganismo, por ejemplo, una lipasa y el marcador seleccionable son preferiblemente ADNc codón-optimizados. Los métodos para recodificar genes para expresión en microalgas son descritos en la patente estadounidense 7 135 290. Existe información adicional disponible para la optimización de codón, por ejemplo, en la base de datos de uso de codón de GenBank. Como ejemplos no limitantes, el uso de codón en Chlorella pyrenoidosa, Dunaliella salina y Chlorella protothecoides son mostrados en las Tablas 10, 11 y 12, respectivamente.

Tabla 10. Uso de codón en Chlorella pyrenoidosa.
Phe
UUU 39 (0.82) Ser UCU 50 (1.04)
UUC
56 (1.18) UCC 60 (1.25)
Leu
UUA 10 (0.20) UCA 6 (0.96)
UUG
46 (0.91) UCG 43 (0.89)
Tyr
UAU 15 (0.59) Cys UGU 46 (0.77)
UAC
36 (1.41) UGC 73 (1.23)
ter UAA 9 (0.00) ter UGA 43 (0.00) ter UAG 15 (0.00) Trp UGG 69 (1.00) Leu CUU 49 (0.97) Pro CCU 80 (0.98) CUC 73 (1.45) CCC 88 (1.08) CUA 22 (0.44) CCA 93 (1.14) CUG 103 (2.04) CCG 65 (0.80) His CAU 50 (0.88) Arg CGU 39 (0.76) CAC 3 (1.12) CGC 63 (1.23) Gln CAA 59 (0.84) CGA 46 (0.90) CAG 2 (1.16) CGG 47 (0.92) Ile AUU 24 (0.69) Thr ACU 32 (0.67) AUC 61 (1.76) ACC 76 (1.60) AUA 19 (0.55) ACA 41 (0.86) Met AUG 42 (1.00) ACG 41 (0.86) Asn AAU 26 (0.75) Ser AGU 23 (0.48) AAC 3 (1.25) AGC 67 (1.39) Lys AAA 32 (0.54) Arg AGA 51 (1.00) AAG 86 (1.46) AGG 61 (1.19) Val GUU 36 (0.75) Ala GCU 57 (0.79) GUC 54 (1.13) GCC 97 (1.34) GUA 30 (0.63) GCA 89 (1.23) GUG 71 (1.49) GCG 47 (0.65) Asp GAU 60 (0.95) Gly GGU 35 (0.60) GAC 66 (1.05) GGC 78 (1.33) Glu GAA 41 (0.68) GGA 54 (0.92) GAG 80 (1.32) GGG 67 (1.15)
Tabla 11. Uso de codón preferido en Dunaliella salina.
TTC (Phe) TAC (Tyr) TGC (Cys) TAA (Stop) TGG (Trp) CCC (Pro) CAC (His) CGC (Arg) CTG (Leu) CAG (Gln) ATC (Ile) ACC (Thr) AAC (Asn) AGC (Ser) ATG (Met) AAG (Lys) GCC (Ala) GAC (Asp) GGC (Gly) GTG (Val) GAG (Glu)
Tabla 12. Uso de codón preferido en Chlorella protothecoides.
TTC (Phe)TAC (Tyr)TGC (Cys)TGA (Stop) TGG (Trp)CCC (Pro)CAC (His)CGC (Arg)
CTG (Leu)CAG (Gln)ATC (Ile)ACC (Thr) GAC (Asp)TCC (Ser)ATG (Met)AAG (Lys) GCC (Ala)AAC (Asn)GGC (Gly)GTG (Val) GAG (Glu)
B. Promotores
Muchos promotores son activos en microalgas, en los que se incluyen promotores que son endógenos a las algas que son transformadas, así como promotores que no son endógenos a las algas que son transformadas (esto es, promotores de otras algas, promotores de plantas superiores y promotores de virus de plantas o virus de algas). Los promotores exógenos y/o endógenos que son activos en microalgas y genes de resistencia a antibiótico funcionales en microalgas son descritos por ejemplo en Curr Microbiol. 1997 Dic; 35(6):356-62 (Chlorella vulgaris); Mar Biotechnol (NY). 2002 Ene; 4(l):63-73 (Chlorella ellipsoidea); Mol Gen Genet. 1996 Oct 16; 252(5):572-9 (Phaeodactylum tricornutum); Plant Mol Biol. 1996 Abr; 31(1):1-12 (Volvox carteri); Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Nov 22;91 (24): 11562-6 (Volvox carteri); Falciatore A, Casotti R, Leblanc C, Abrescia C, Bowler C, PMID: 10383998, 1999 May; l(3):239-251 (Laboratory of Molecular Plant Biology, Stazione Zoologica, Villa Comunale, I-80121 Nápoles, Italia) (Phaeodactylum tricornutum y Thalassiosira weissflogii); Plant Physiol. 2002 May; 129(l):7-12. (Porphyridium sp.); Proc Natl Acad Sci USA. 2003 Ene 21;100(2):438-42. (Chlamydomonas reinhardtii); Proc Natl Acad Sci USA. 1990 Feb; 87(3): 1228-32. (Chlamydomonas reinhardtii); Nucleic Acids Res. 1992 Jun 25;20(12):2959-65; Mar Biotechnol (NY). 2002 Ene; 4(l):63-73 (Chlorella); Biochem Mol Biol Int. 1995 Ago; 36(5): 1025-35 (Chlamydomonas reinhardtii); J Microbiol. 2005 Ago; 43(4):361-5 (Dunaliella); Yi Chuan Xue Bao. 2005 Abr; 32(4):424-33 (Dunaliella); Mar Biotechnol (NY). 1999 May; 1(3):239-251. (Thalassiosira y Phaedactylum); Koksharova, Appl Microbiol Biotechnol 2002 Feb; 58(2): 123-37 (varias especies); Mol Genet Genomics. 2004 Feb; 271(l):50-9 (Thermosynechococcus elongates); J. Bacteriol. (2000), 182, 211-215; FEMS Microbiol Lett. 2003 Abr 25; 221(2):155-9; Plant Physiol. 1994 Jun; 105(2):635-41; Plant Mol Biol. 1995 Dic; 29(5):897-907 (Synechococcus PCC 7942); Mar Pollut Bull. 2002; 45(1-12):163-7 (Anabaena PCC 7120); Proc Natl Acad Sci USA. 1984 Mar; 81(5):15615 (Anabaena (varias cepas)); Proc Natl Acad Sci USA. 2001 Mar 27; 98(7):4243-8 (Synechocystis); Wirth, Mol Gen Genet 1989 Mar; 216(l):175-7 (varias especies); Mol Microbiol, 2002 Jun; 44(6): 1517-31 y Plasmid, 1993 Sep; 30(2):90-105 (Fremyella diplosiphon); Hall et al. (1993) Gene 124: 75-81 (Chlamydomonas reinhardtii); Gruber et al. (1991). Current Micro. 22: 15-20; Jarvis et al. (1991) Current Genet. 19: 317-322 (Chlorella); para promotores adicionales véase también la Tabla 1 de la patente estadounidense 6 027 900).
El promotor usado para expresar un gen exógeno puede ser el promotor enlazado naturalmente a aquel gen o puede ser un gen heterólogo. Algunos promotores son activos en más de una especie de microalgas. Otros promotores son específicos de la especie. Los promotores preferidos incluyen promotores tales como RBCS2 de Chlamydomonas reinhardtii y promotores virales, tales como virus de mosaico de coliflor (CMV) y virus de Chlorella, que han mostrado ser activos en múltiples especies de microalgas (véase por ejemplo Plant Cell Rep. 2005 Mar; 23(10- 11):727-35; J Microbiol. 2005 Ago; 43(4):361-5; Mar Biotechnol (NY). 2002 Ene; 4(1):63-73). En otras modalidades, el promotor de malato deshidrogenasa Botryococcus, tal como un ácido nucleico que comprende cualquier parte de SEQ ID NO: 3 o el promotor RBCS2 de Chlamydomonas reinhardtii (SEQ ID NO: 4) pueden ser usados. Opcionalmente, por lo menos 10, 20, 30, 40, 50 o 60 nucleótidos o más de estas secuencias que contienen un promotor son usados. Los promotores preferidos endógenos a especies del género Chlorella son SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.
Los promotores preferidos útiles para la expresión de genes exógenos en Chlorella son enumerados en la lista de secuencias de esta solicitud, tal como el promotor del gen HUP1 de Chlorella (SEQ ID NO: 1) y el promotor de nitrato reductasa de Chlorella ellipsoidea (SEQ ID NO: 2). Los promotores de virus de Chlorella pueden también ser usados para expresar genes en Chlorella, tales como SEQ ID NO: 1-7 de la patente estadounidense 6 395 965. Los promotores adicionales activos en Chlorella pueden ser encontrados, por ejemplo en Biochem Biophys Res Commun. 1994 Oct 14; 204(l): 187-94; Plant Mol Biol. 1994 Oct; 26(l):85-93; Virology. 2004 Ago 15; 326(l):150-9; y Virology. 2004 Ene 5; 318(l):214-23.
C. Marcadores Seleccionables
Cualesquiera de una amplia variedad de marcadores seleccionables pueden ser empleados en un constructo de transgén útil para transformar Chlorella. Los ejemplos de marcadores seleccionables apropiados incluyen el gen de nitrato reductasa, el gen de higromicina fosfotransferasa (HPT), el gen de neomicina fosfotransferasa y el gen ble, que confiere resistencia a fleomicina. Los métodos para determinar la sensibilidad de microalgas a antibióticos son bien conocidos. Por ejemplo, Mol Gen Genet. 1996 Oct 16; 252(5):572-9.
Más específicamente, Dawson et al. (1997), Current Microbiology 35:356-362, describieron el uso del gen de nitrato reductasa (NR) de Chlorella vulgaris como marcador seleccionable para mutantes de Chlorella sorokiniana NRdeficientes. Kim et al. (2002), Mar. Biotechnol. 4:63-73, revelaron el uso del gen de HPT como marcador seleccionable para transformar Chorella ellipsoidea. Huang et al. (2007), Appl. Microbiol. Biotechnol. 72: 197-205, informaron sobre el uso de ble de Sh como marcador seleccionable para Chlorella sp. DT.
D. Expresión Inducible
Un promotor inducible se puede usar para expresar un gen de interés. En particular, el uso de un promotor inducible para expresar un gen de lipasa permite la producción de lipasa después del crecimiento del microorganismo cuando las condiciones han sido ajustadas, si es necesario, para mejorar la transesterificación, por ejemplo, después de la disrupción de las células, reducción del contenido de agua de la mezcla de reacción, y/o adición de alcohol suficiente para impulsar la conversión de TAG en ésteres de ácido graso.
Los promotores inducibles útiles en la invención incluyen aquellos que moderan la transcripción de un gen enlazado operativamente en respuesta a un estímulo, tal como una molécula pequeña provista exógenamente (por ejemplo, glucosa, como en SEQ ID NO: 1), temperatura (calor o frío), luz, etc. Los promotores apropiados pueden activar la transcripción de un gen esencialmente silente o regular hacia arriba, preferentemente de forma sustancial, la transcripción de un gen enlazado operativamente que es transcrito a un nivel bajo. En este caso, el nivel de transcripción de la lipasa preferiblemente no interfiere significativamente con el crecimiento del microorganismo en el cual es expresado.
La expresión de transgénes en Chlorella puede ser efectuada de forma inducible por medio de promotores tales como el promotor que impulsa el gen transportador de hexosa de Chlorella (SEQ ID NO: 1). Este promotor es fuertemente activado por la presencia de glucosa en el medio de cultivo.
E. Expresión de dos o más genes exógenos
Además, una microalga diseñada genéticamente puede comprender y expresar dos o más genes exógenos, tales como por ejemplo, una lipasa y un gen lítico, por ejemplo uno que codifica una enzima polisacárido-degradante. Uno
o ambos genes pueden ser expresados utilizando un promotor inducible, lo que permite que la temporización relativa de expresión de estos genes sea controlada para mejorar el rendimiento de lípido y conversión en ésteres de ácido graso. La expresión de los dos o más genes exógenos puede estar controlada con el mismo promotor inducible o con promotores inducibles diferentes. En este caso, la expresión de un primer gen exógeno puede ser inducida para un primer período de tiempo (durante el cual la expresión de un segundo gen exógeno puede ser inducida o no) y la expresión de un segundo gen exógeno puede ser inducida para un segundo período de tiempo (durante el cual la expresión de un primer gen exógeno puede ser inducida o no). Se proporcionan en la presente vectores y métodos para diseñar microbios que producen lípidos para metabolizar sacarosa, que es un rasgo ventajoso debido a que permite que las células diseñadas conviertan materia prima de alimentación de caña de azúcar en lípidos.
También se proporcionan en la presente cepas diseñadas genéticamente de que expresan dos o más genes exógenos, tales como por ejemplo, una acil-ACP tioesterasa grasa y una acil-CoA/aldehído reductasa grasa, cuya acción combinada produce un producto de alcohol. Se proporcionan además otras combinaciones de genes exógenos, en los que se incluyen sin limitación, una acil-ACP tioesterasa grasa y una acil-CoA reductasa grasa para generar aldehídos. Además, esta solicitud proporciona la combinación de una acil-ACP tioesterasa grasa, una acil-CoA reductasa grasa y un aldehído descarbonilasa grasa para generar alcanos. Uno o más de los genes exógenos pueden ser expresados utilizando un promotor inducible.
Los ejemplos de modificaciones adicionales apropiadas para uso en la presente invención incluyen cepas diseñadas genéticamente de microalgas para expresar dos o más genes exógenos, uno que codifica un transportador de una fuente de carbono fija (tal como sacarosa) y un segundo que codifica una enzima de invertasa de sacarosa. Los organismos fermentables resultantes producen hidrocarburos con un costo de fabricación más bajo de lo que ha sido obtenible mediante métodos previamente conocidos de producción de hidrocarburos biológicos. La inserción de los dos genes exógenos descrita anteriormente puede ser combinada con la disrupción de biosíntesis de polisacáridos por medio de mutagénesis directa y/o aleatoria, que dirige el flujo de carbono aún mayor a la producción de hidrocarburo. Individualmente y en combinación, la conversión trófica, el diseño para alterar la producción de hidrocarburo y el tratamiento con enzimas exógenas alteran la composición de hidrocarburo producida por un microorganismo. La alteración puede ser un cambio en la cantidad de hidrocarburos producidos, la cantidad de una
o más especies de hidrocarburos producidas en relación con otros hidrocarburos y/o los tipos de especies de hidrocarburo producidos en el microorganismo. Por ejemplo, las microalgas pueden ser diseñadas para producir más cantidad y/o porcentaje de TAG.
F.
Expresión por Compartimientos
La presente invención también proporciona la expresión por compartimientos de un gen de interés. En particular, puede ser ventajoso en modalidades particulares, apuntar la expresión de la lipasa a uno o más compartimientos celulares, en donde es secuestrada de la mayoría de lípidos celulares hasta el inicio de la reacción de transesterificación. Los organelos preferidos para apuntamiento son cloroplastos, mitocondria y retículo endoplásmico.
1. Expresión en Cloroplastos
La expresión de un polipéptido en un microorganismo puede apuntarse a cloroplastos. Los métodos para el apuntamiento de la expresión de un gen heterólogo al cloroplasto son conocidos y pueden ser empleados en la presente invención. Los métodos para apuntamiento de productos genéticos extraños a cloroplastos son descritos en Shrier et al., EMBO J. (1985) 4:25 32. Véase también Tomai et al. Gen. Biol. Chem. (1988) 263:15104 15109 y patente estadounidense N.° 4 940 835 para el uso de péptidos de tránsito para translocar productos genéticos nucleares al cloroplasto. Los métodos para dirigir el transporte de proteínas al cloroplasto son también estudiados en Kenauf TIBTECH (1987) 5:40 47. Las secuencias de apuntamiento de cloroplasto endógenas a Chlorella son conocidas, tales como genes en el genoma nuclear de Chlorella que codifican proteínas que son apuntadas al cloroplasto; véase por ejemplo número de acceso GenBank AY646197 y AF499684.
Wageningen UR - Plant Research International vende un vector IMPACTVECTOR1.4, que usa la señal de secreción de la proteína de subunidad pequeña de Chrysanthemum morifolium para administrar una proteína heteróloga al ambiente de estroma de cloroplasto (citoplásmico), lanzándose a través de un sistema de doble membrana. La proteína es fusionada a los primeros 11 aminoácidos de la proteína de rubisco madura con el fin de permitir el procesamiento apropiado del péptido de señal (Wong et al., Plant Molecular Biology 20: 81-93 (1992)). El péptido de señal contiene un intrón natural del gen RbcS.
En otro procedimiento, el genoma de cloroplasto es diseñado genéticamente para expresar la proteína heteróloga. Se ha descrito la transformación estable de cloroplastos de Chlamydomonas reinhardtii (un alga verde) utilizando bombardeo de células receptoras con microproyectiles de tungsteno de alta velocidad recubiertos con ADN extraño. Véase, por ejemplo, Boynton et al., Science (1988) 240: 1534 1538; Blowers et al. Plant Cell (1989) 1:123 132 y Debuchy et al., EMBO J. (1989) 8: 2803 2809. La técnica de transformación utilizando microproyectiles de tungsteno es descrita por Klein et al., Nature (London) (1987) 7:70 73. Otros métodos de transformación de cloroplasto tanto para plantas como para microalgas son conocidos. Véanse, por ejemplo las patentes estadounidenses 5 693 507; 6 680 426; y Plant Physiol. 2002 May; 129(l):7-12; y Plant Biotechnol J. 2007 May; 5(3):402-12.
Las proteínas expresadas en el genoma nuclear de Chlorella pueden ser apuntadas al cloroplasto utilizando señales de apuntamiento de cloroplasto. Las secuencias de apuntamiento de cloroplasto endógenas a Chlorella son conocidas, tales como genes en el genoma nuclear de Chlorella que codifican proteínas que son apuntadas al cloroplasto; véanse, por ejemplo números de acceso GenBank AY646197 y AF499684. Las proteínas pueden también ser expresadas en el cloroplasto de Chlorella mediante inserción de genes directamente en el genoma de cloroplasto. La transformación de cloroplasto ocurre comúnmente por medio de recombinación homóloga y puede ser efectuada si las secuencias de genoma de cloroplasto son conocidas para la creación de vectores de apuntamiento (véase, por ejemplo la secuencia de genoma completa de un cloroplasto de Chlorella; número de acceso GenBank NC_001865). Véanse secciones previas en la presente para consultar detalles de transformación de cloroplasto.
2. Expresión en mitocondrias
La expresión de un polipéptido en un microorganismo puede apuntarse a mitocondrias. Los métodos para apuntamiento de productos de gen extraño a mitocondrias (Boutry et al. Nature (London) (1987) 328:340 342) han sido descritos, incluidos en microalgas verdes (véase, por ejemplo Mol Gen Genet. 1993 Jan;236(2-3):235-44).
Por ejemplo, un vector de expresión que codifica una señal de secreción apropiada puede apuntar una proteína heteróloga a la mitocondria. El vector IMPACTVECTOR 1.5, de Wageningen UR- Plant Research International, utiliza la señal de secreción de CoxIV de levadura, que demostró administrar proteínas en la matriz mitocondrial. La proteína es fusionada a los primeros cuatro aminoácidos de la proteína CoxIV de levadura con el fin de permitir el procesamiento apropiado del péptido de señal (Kohler et al. Plant J l l : 613-621 (1997)). Otras secuencias de apuntamiento mitocondriales son conocidas, en las que se incluyen aquellas funcionales en microalgas verdes. Por ejemplo, véase FEBS Lett. 1990 Jan 29;260(2): 165-8; y J Biol Chem. 2002 Feb 22;277(8):6051-8.
Las proteínas expresadas en el genoma nuclear de Chlorella pueden ser apuntadas a la mitocondria utilizando señales de apuntamiento mitocondriales. Véanse secciones previas en la presente para consultar detalles de apuntamiento de proteína mitocondrial y transformación.
3. Expresión en Retículo Endoplásmico
La expresión de un polipéptido en un microorganismo puede apuntarse al retículo endoplásmico. La inclusión de una señal de retención o clasificación apropiada en un vector de expresión asegura que las proteínas sean retenidas en el retículo endoplásmico (ER) y no avancen corriente abajo al aparato Golgi. Por ejemplo, el vector IMPACTVECTOR1.3, de Wageningen UR- Plant Research International, incluye la señal de retención o clasificación KDEL bien conocida. Con este vector, la retención de ER tiene una ventaja práctica porque se ha revelado que mejora los niveles de expresión 5 veces o más. La razón principal por la que sucede parece ser que el ER contiene concentraciones más bajas y/o diferentes proteasas responsables de la degradación tras la traducción de proteínas expresadas que están presentes en el citoplasma. Las señales de retención de ER funcionales en microalgas verdes son conocidas. Por ejemplo, véase Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Apr 26;102(17):6225-30.
G. Transformación
Las células pueden ser transformadas mediante cualquier técnica apropiada en las que se incluyen por ejemplo, biolísticas, electroporación, transformación en lecho de vidrio y transformación en bigote de carburo de silicio. Véanse, por ejemplo, los ejemplos en la presente.
Cualquier técnica conveniente para introducir un transgén en Chlorella puede ser usada en la presente invención. Dawson et al. (1997) (supra) describió el uso de bombardeo de microproyectiles para introducir el gen de nitrato reductasa (NR) de Chlorella vulgaris en mutantes de Chlorella sorokiniana NR-deficientes, dando como resultado transformantes estables. Brevemente, perlas de tungsteno de 0.4 micras fueron recubiertas con plásmido; 3 X 107 células de c.sorokiniana fueron esparcidas en el tercio central de una placa de agar no selectiva y bombardeadas con el sistema de distribución de partículas biolísticas PDS- 1000/He Biolistic Particle Delivery© (Bio-Rad).
Un método preferido para introducir un transgén en Chlorella es el método descrito por Kim et al. (2002), Mar. Biotechnol. 4:63-73. Kim explica la transformación de protoplastos de Chlorella ellipsoidea utilizando CaCl2 y polietilenglicol (PEG). En particular, los protoplastos fueron preparados al cultivar células de C.ellipsoidea con una densidad de 1-2 X 108/M1. Las células fueron recuperadas y lavadas mediante centrifugación durante 5 minutos a 1600 g y resuspendidas en 5 Ml de solución reguladora de Ph de fosfato (Ph 6.0) que contenía sorbitol 0.6 M, manitol 0.6 M, celulosa al 4% (peso/volumen) (Calbiochem), macerasa al 2% (peso/volumen) (Calbiochem) y 50 unidades de pectinasa (Sigma). La suspensión celular fue incubada a 25°C durante 16 horas en la oscuridad con agitación moderada. Los protoplastos resultantes fueron recuperados mediante centrifugación a 400 g durante 5 minutos. El pellet fue resuspendido suavemente en 5 Ml de medio f/2 que contenía sorbitol 0.6 M y manitol 0.6 M y centrifugado en 400 g durante 5 minutos. Este pellet fue resuspendido en 1 Ml de solución de sorbitol/manitol 0.6 M que contenía CaCl2 50 Mm. Luego, se agregaron 5 mg de ADN de transgén, junto con 25 μg de ADN de timo de becerro (Sigma), a 107-108 protoplastos en 0.4 Ml. Después de 15 minutos a temperatura ambiente, se agregaron 200 μL de PNC (polietilenglicol 4000 al 40%, NaCl 0.8 M, CaCl2 50 Mm) y se mezclaron moderadamente durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de esto, 0.6 Ml de medio f/2 complementado con solución de sorbitol/manitol 0.6 M, extracto de levadura al 1% y glucosa al 1% fueron agregados y las células transformadas fueron incubadas a 25°C durante 12 horas en la oscuridad para la regeneración de pared celular. Un método similar fue usado por Huang et al. (2007) (supra) para introducir un transgén que codifica reductasa mercúrica a Chlorella sp. DT.
La electroporación también se ha empleado para transformar Chlorella. Como se describe por Maruyama et al. (2004), Biotechnology Techniques 8:821-826, esta técnica fue usada para introducir un transgén en protoplastos de Chlorella saccharophila c-211-1a preparados de las células en la fase estacionaria. La expresión transitoria del plásmido introducido fue observada con una intensidad de campo de entre 600 y 900 V/cm, y una duración de impulso de alrededor de 400 ms, en donde se determinó la alta permeabilidad de membrana a 70-kDa FITCdextrana.
Los vectores para transformación de microorganismos de acuerdo con la presente invención pueden ser preparados mediante técnicas conocidas con las que estarán familiarizados los expertos en la técnica. La secuencia de nucleótidos del constructo usado para transformación de múltiples especies de Chlorella corresponde a SEQ ID NO:25. En una modalidad, un diseño de vector ilustrativo para la expresión de un gen de lipasa en un microorganismo tal como una microalga contiene un gen que codifica una lipasa en enlace operable con un promotor activo en microalgas. Como alternativa, si el vector no contiene un promotor en enlace operable con el gen de interés, el gen puede ser transformado en las células, de tal manera que es enlazado operativamente a un promotor endógeno en el punto de integración del vector. El método de transformación sin promotor ha demostrado funcionar en microalgas (véase, por ejemplo Plant Journal 14:4, (1998), págs.441-447). El vector puede también contener un segundo gen que codifica una proteína que por ejemplo confiere resistencia a un antibiótico o herbicida, esto es, un
marcador seleccionable. Opcionalmente, uno o ambos genes son seguidos por una secuencia sin traducir 3’ que
contiene una señal de poliadenilación. Los casetes de expresión que codifican los dos genes pueden ser enlazados físicamente en el vector o sobre vectores separados. También se puede usar la cotransformación de microalgas en la cual moléculas de vector distintas son usadas simultáneamente para transformar células (véase, por ejemplo Protist 2004 Dec; 155(4):381-93). Las células transformadas pueden ser opcionalmente seleccionadas en función de la capacidad para crecer en presencia del antibiótico u otro marcador seleccionable en condiciones en las cuales las células que carecen del casete de resistencia no crecerían.
Las publicaciones mencionadas en la presente son citadas con el propósito de describir y revelar reactivos, metodologías y conceptos que pueden ser usados en relación con la presente invención. Nada en la presente será interpretado como reconocimiento de que estas referencias son parte de la técnica previa en relación con las invenciones descritas en la presente.
X. Ejemplos
Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar pero sin limitar la invención reivindicada.
Ejemplo 12
Construcción del vector
Un fragmento de BamHI-SacII que contiene el promotor CMV, un ADNc resistente a higromicina y CMV 3’ UTR (SEQ ID NO:5, una subsecuencia del vector pCAMBIA1380, Cambia, Canberra, Australia) fue clonado en los sitios BamHI y SacII de pBluescript y es denominado en la presente como pHyg.
Transformación biolística de Chlorella
Los portadores dorados de S550d de Seashell Technology fueron preparados de acuerdo con el protocolo del fabricante. El plásmido pHyg linealizado (20 g) fue mezclado con 50 l de solución reguladora de pH de enlace y 60 l (30mg) de portadores dorados S550d e incubados en hielo durante 1min. Se agregó la solución reguladora del pH de precipitación (100 l) y la mezcla fue incubada en hielo durante otro minuto. Después de haber sido
sometidas al vórtice, las partículas recubiertas con ADN fueron aglomeradas mediante centrifugación a 10 000rpm en una microfuge Eppendorf5415C durante 10seg. El pellet dorado fue lavado una vez con 500 l de etanol al 100% frío, aglomerado mediante breve centrifugación en la microfuge y resuspendido con 50 l de etanol helado. Después de una breve sonificación (1 – 2seg), 10 l de partículas recubiertas con ADN fueron transferidas inmediatamente a
la membrana del portador.
El cultivo de Chlorella protothecoides (Universidad de Texas, colección de cultivos 250) fue cultivado en un medio de proteosa (2gr/lt de extracto de levadura, NaNO3 2.94mM, CaCl2•2H2O 0.17mM, MgSO4•7H2O 0.3mM, K2HPO4
0.4mM, KH2PO4 1.28mM, NaCl 0.43mM) sobre un agitador giratorio con una luz continua a 75 mol fotones m-2 s-1 hasta que llegó a una densidad celular de 2X10 6 células/ml. Las células fueron cosechadas, lavadas una vez con
agua destilada estéril y resuspendidas en 50 l de medio. 1X107 células fueron esparcidas en el tercio central de
una placa de medios de proteosa no selectiva. Las células fueron bombardeadas con el sistema de administración de partículas biolísticas PDS-1000/He (Bio-Rad). Se utilizaron discos de ruptura (1100 y 1350 psi) y las placas fueron colocadas a 9 y 12 cm por debajo del conjunto tamiz/macroportador. Se permitió que las células se recuperaran a 25°C durante 12 – 24 hrs. Después de la recuperación, las células fueron raspadas de las placas con
una espátula de hule o caucho, mezcladas con 100 l del medio y esparcidas sobre placas que contenían
higromicina (200 g/ml). Después de 7 – 10 días de incubación a 25°C, las colonias que representaban células transformadas fueron visibles sobre las placas de los discos de ruptura de 1100 y 1350 libras fuerza/pulgada2 y desole distancias de 9 y 12 cm. Las colonias fueron recolectadas y localizadas sobre placas de agar selectivas para una segunda ronda de selección.
Transformación de Chlorella mediante Electroporación
El cultivo de Chlorella protothecoides fue cultivado en un medio de Proteosa sobre un agitador giratorio con luz
continua a 75 mol fotones m-2 s-1 hasta que llegó a una densidad celular de 2X106 células/ml. Las células fueron
cosechadas, lavadas una vez con agua destilada estéril y resuspendidas en una solución reguladora del pH de Trisfosfato (Tris-HCl 20mM, pH 7.0; fosfato de potasio 1mM) que contenía 50mM de sacarosa con una densidad de 4X108 células/ml. Una suspensión de aproximadamente 250 l de células (1X108 células) fue colocada en una cubeta de electroporación desechable con un espacio de 4mm. A la suspensión celular, 5 g de ADN del plásmido pHyg linealizado y 200 g de ADN portador (ADN de esperma de salmón sometido a esfuerzo constante) fueron
agregados. Luego, la cubeta de electroporación fue incubada en un baño de agua a 16°C durante 10min. Luego se aplicó un impulso eléctrico (1100 V/cm) a la cubeta a un capacitancia de 25 F (no se utilizó ningún receptor de
derivación para la electroporación) utilizando un aparato de electroporación Gene Pulser II (Bio-Rad Labs, Hercules, CA). Luego la cubeta fue incubada a temperatura ambiente durante 5min, después de lo cual la suspensión celular fue transferida a 50 ml de medio de Proteosa y agitada sobre un agitador giratorio durante 2 días. Tras la recuperación, las células fueron cosechadas mediante centrifugación a velocidad baja, resuspendidas en medios de
Proteosa y depositadas a baja densidad sobre placas complementadas con 200 g/ml de higromicina. Las placas
fueron incubadas con luz continua a 75 mol fotones m-2 s-1. Los transformantes aparecieron como colonias en 1 – 2
semanas. Las colonias fueron recolectadas y localizadas sobre placas de agar selectivas para una segunda ronda de selección.
Genotipo
Un subconjunto de colonias que sobrevivieron a una segunda ronda de selección fueron cultivadas en un volumen pequeño y cosechadas. Los pellets de aproximadamente 5 – 10 l de volumen fueron resuspendidos en 50
NaEDTA 10mM mediante vórtice y luego incubados a 100°C durante 10. Los tubos fueron luego sometidos a vórtice brevemente y sonificados durante 10seg, luego centrifugados a 12 000 xg durante 1min. Se usaron 2
sobrenadante como plantilla en una reacción de PCR de 50 l. Los cebadores usados para el genotipo fueron SEQ
ID NO:6 y SEQ ID NO:7. Las condiciones de PCR fueron las siguientes: 95°C 5min x 1 ciclo; 95°C 30 seg – 58°C 30 seg – 72°C, 1min, 30 seg x 35 ciclos; 72°C 10min x 1 ciclo. El fragmento de 992 pb esperado fue encontrado en 6 de 10 colonias del método biolístico y de una sola colonia de electroporación. Una banda de tamaño menor no específica estuvo presente en todos los carriles. Los resultados son mostrados en la figura 16. Para confirmar la identidad del fragmento de 992pb amplificado, dos bandas biolísticas y la banda de electroporación fueron extirpadas del gel y secuenciadas individualmente. La secuencia de las tres bandas correspondía al fragmento de 992pb esperado. (DNA ladder:Bionexus® All Purpose Hi-Lo® DNA ladder catalog#BN2050).
EJEMPLO 19
Chlorella sobre Sacarosa
Materiales y métodos: Chlorella protothecoides (UTEX 249) fue inoculada en tres matraces de 50 ml de medio de proteosa con sacarosa al 1% (2.94 mM NaNO3, 0.428 mM K2HPO4, 1.28 mM KH2PO4, 0.427 mM NaCl, 0.17 mM CaCl2-2H2O, 0.3 mM MgSO4-7H2O, Proteosa peptona 1 g/L) con una densidad celular final de 4 x 105 células por ml. Se agregó invertasa (Sigma #14504) a dos de los cultivos a 0.01 U/ml y 0.05 U/ml. Los tres cultivos fueron cultivados en la oscuridad durante ~60 hrs agitando a 150rpm.
Resultados: Se efectuaron conteos de células finales en los tres cultivos después de ~60 hrs de agitación en la oscuridad. El matraz de control llegó a 4.4x105 células por ml mientras que los matraces de 0.01 U/ml y 0.05 U/ml llegaron a densidades celulares de 1x108 y 3x108 respectivamente. Cada matraz fue verificado en busca de contaminación al final del experimento mediante análisis microscópico y todos estaban limpios.
EJEMPLO 20
Cepas de Chlorella que crecen sobre sacarosa
Los cultivos de Chlorella kessleri ((a) UTEX 397 y (b) UTEX 398) y Chlorella fusca ((a) UTEX 251 y (b) UTEX 1801) fueron inoculados de cultivos líquidos autotróficos a 10 ml de medio de proteosa + sacarosa al 1% en matraces de 50 ml a una concentración de 1 x 106 células/ml. También se inocularon cultivos de control a la misma densidad solamente con medios de proteosa. Los cultivos fueron cultivados a 28°C en la oscuridad agitando a 250 rpm durante 7 días, punto en el cual la densidad celular fue medida mediante hemocitómetro. Como se muestra en las Figuras 21-22, las cuatro cepas crecieron sobre sacarosa en comparación con la densidad celular inicial y el control solamente de proteosa.
EJEMPLO 21
Crecimiento de Chlorella protothecoides sobre melazas con una invertasa de sacarosa.
Preparación de células de Chlorella para inoculación: Se inició un cultivo de líquido de 10 ml de Chlorella tomando el inóculo de una placa de proteosa sólida. Los cultivos fueron cultivados en la luz durante aproximadamente 2 días a 26°C. El crecimiento fue medido utilizando un densitómetro óptico (OD) a 750 nm y al determinar los pesos secos de células.
Preparación de melazas y soluciones concentradas de azúcar: Una solución concentrada al 5% fue preparada con glucosa, sacarosa y 3 muestras de melazas diferentes (marcadas como BSl, BS2 y HTM) obtenidas del proceso comercial de caña de azúcar a azúcar, como se muestra en la siguiente Tabla 13. El pH de todas las soluciones concentradas fue verificado para estar en el intervalo de 6-6.6 y luego las soluciones concentradas fueron sometidas a autoclave.
Preparación de Solución de Invertasa: Una solución concentrada de 40 unidades/ml de invertasa fue preparada al reconstituir 1 mg de una invertasa de 400 unidades/mg (Sigma) en 10 ml de agua destilada.
Condiciones experimentales y montaje: Se prepararon cultivos de 10 ml, en los que cada uno consistía en una concentración final de melazas/azúcar de un 1%, 0.05 unidades/ml de invertasa y 1.0x106 células por ml de Chlorella protothecoides en un medio de proteasa base. Los cultivos fueron numerados como sigue: (1) control solamente de medios; (2) 1% HTM; (3) 1% BS1 ; (4) 1% BS2; (5) glucosa al 1%; y (6) sacarosa al 1%. También se preparó un conjunto de control similar sin la adición de invertasa. Los cultivos fueron cultivados en la oscuridad durante 5 días agitando a 250 rpm a 28°C.
Resultados: El crecimiento de las células de Chlorella protothecoides fue evaluado después de los 5 días de incubación sobre la materia prima de alimentación respectiva en la oscuridad. Como se muestra en las Figuras 2324, las células pueden ser cultivadas en melazas en presencia de una invertasa de sacarosa con rendimientos comparables a aquellos del cultivo sobre glucosa de grado reactivo pura.
EJEMPLO 22
Diseño genético de Chlorella protothecoides para expresar una Invertasa de Sacarosa Exógena.
Cepas y Medios: Chlorella protothecoides (UTEX 250) fue obtenido de la Colección de Cultivos de Algas en la Universidad de Texas (Austin, TX, Estados Unidos de América). Los cultivos concentrados fueron mantenidos sobre medio de proteosa modificado. El medio de proteosa modificado consiste en 0.25 g de NaNO3, 0.09 g de K2HPO4,
0.175 g de KH2PO4, 0.025 g de CaCl2-2H2O, 0.075 g de MgSO4-7H2O y 2 g de extracto de levadura por litro (g/L).
Construcción del plásmido: Para expresar la forma secretada de invertasa en Chlorella protothecoides, un gen SUC2 de Saccharomyces cerevisiae fue colocado para que lo controlaran tres promotores diferentes: promotor 35S de Virus de Mosaico de Coliflor (CMV), promotor de virus de Chlorella (NC-1A) y promotor HUP1 de Chlorella. Un gen SUC2 de levadura fue sintetizado para acomodar el uso de codón optimizado para C. protothecoides e incluye una secuencia de señal requerida para dirigir la secreción extracelular de invertasa. Cada constructo fue integrado en pBluescript KS+, y los sitios EcoRI/AscI, AscI/Xhol, y XhoI/BamHI fueron introducidos en cada promotor, gen de invertasa y CMV 3'UTR, respectivamente, mediante amplificación de PCR utilizando cebadores específicos. Los productos de PCR purificados fueron clonados secuencialmente. Una ilustración de los constructos finales es mostrada en la Figura 25.
Transformación de Chlorella protothecoides: Un cultivo de Chlorella protothecoides fue cultivado en medio de proteosa modificado sobre un agitador giratorio con luz continua a 75 μmol fotones m-2 S-1 hasta que alcanzó una densidad celular de 6x106 células/ml.
Para la transformación biolística, portadores dorados de S550d de Seashell Technology fueron preparados de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, un constructo linealizado (20 μg) mediante BsaI fue mezclado con 50 μl de solución reguladora del enlace y 60 μl (3 mg) de portadores dorados S550d e incubados en hielo durante 1 minuto. Se agregó solución reguladora de pH de precipitación (100 μl) y la mezcla fue incubada en hielo durante otro minuto. Después de vórtice moderado, las partículas recubiertas con ADN fueron aglomeradas mediante centrifugación a 10 000 rpm en una microfuga de Eppendorf durante 10 segundos. El pellet dorado fue lavado una vez con 500 μl de etanol al 100% frío, aglomerado mediante breve centrifugación en la microfuga y resuspendido con 50 μl de etanol helado. Después de una breve sonicación (1-2 segundos), 10 μl de partículas recubiertas con ADN fueron transferidas inmediatamente a la membrana portadora. Las células fueron cosechadas, lavadas una vez con agua destilada estéril, resuspendidas en 50 μl del medio (1 x 107 células) y fueron esparcidas en el tercio central de una placa proteosa no selectiva. Las células fueron bombardeadas con el sistema de administración de Partículas Biolísticas PDS-1000/He (Bio-Rad). Se usaron discos de ruptura (1100 y 1350 psi) y las placas fueron colocadas 9-12 cm por debajo del conjunto de tamiz/macroportador. Se permite que las células se recuperen a 25°C durante 12-24 horas. Después de la recuperación, las células fueron raspadas de las placas con una espátula de hule o caucho, mezcladas con 100 μl de medio y esparcidas sobre placas de proteosa modificada con sacarosa al 1%. Después de 7-10 días de incubación a 25°C en la oscuridad, las colonias que representan células transformadas fueron visibles sobre las placas.
Para la transformación con electroporación, las células fueron cosechadas, lavadas una vez con agua destilada estéril y resuspendidas en una solución reguladora de pH de Tris- fosfato (Tris-HCl 20 mM pH 7.0; fosfato de potasio 1 mM) que contiene sacarosa 50 mM con una densidad de 4x108 células/ml. Aproximadamente una suspensión celular de 250 μl (1x108 células) fue colocada en una cubeta de electroporación desechable con un espacio de 4 mm. A la suspensión celular, se agregaron 5 μg de ADN de plásmido linealizado y 200 μg de ADN portador (ADN de esperma de salmón sometido a esfuerzo cortante). Luego la cubeta de electroporación fue incubada en un baño de agua helada a 16°C durante 10 minutos. Luego se aplicó un impulso eléctrico (1100 V/cm) a la cubeta a una capacitancia de 25 μF (no se utilizó ningún resistor de derivación para la electroporación) utilizando un aparato de electroporación Gene Pulser II (Bio-Rad Labs, Hercules, CA). Luego la cubeta fue incubada a temperatura ambiente durante 5 minutos, después de lo cual la suspensión celular fue transferida a 50 ml de medio de proteosa modificada y agitada sobre un agitador giratorio durante 2 días. Después de la recuperación, las células fueron cosechadas a baja velocidad (4000 rpm), resuspendidas en medio de proteosa modificado y depositadas a baja densidad sobre placas de proteosa modificadas con sacarosa al 1%. Después de 7-10 días de incubación a 25°C en la oscuridad, las colonias que representan células transformadas fueron visibles sobre las placas.
Selección de Transformantes y Genotipos: Las colonias fueron escogidas de placas de proteosa modificadas cultivadas en la oscuridad con sacarosa al 1% y aproximadamente la misma cantidad de células fueron transferidas a placas de 24 cavidades que contenían 1 ml de medio líquido de proteosa modificada con sacarosa al 1%. Los cultivos fueron mantenidos en la oscuridad y agitados mediante el agitador orbital de Labnet (Berkshire, Reino Unido) a 430 rpm durante 5 días.
Para verificar la presencia del gen de invertasa introducido en transformantes de Chlorella, el ADN de cada transformante fue aislado y amplificado con un conjunto de cebadores de genes específicos (constructo de CMV: cebador delantero (CAACCACGTCTTCAAAGCAA) (SEQ ID NO:6)/ cebador inverso (TCCGGTGTGTTGTAAGTCCA) (SEQ ID NO:9), constructos de CV: cebador delantero (TTGTCGGAATGTCATATCAA) (SEQ ID NO: 10)/ cebador inverso (TCCGGTGTGTTGTAAGTCCA) (SEQ ID NO: 11), y constructo de HUP1: cebador delantero (AACGCCTTTGTACAACTGCA) (SEQ ID NO: 12)/ cebador inverso (TCCGGTGTGTTGTAAGTCCA) (SEQ ID NO: 13)). Para un aislamiento de ADN rápido, un volumen de células (de aproximadamente 5-10 uL de tamaño) fue resuspendido en 50 uL de Na-EDTA 10 mM. La suspensión celular fue incubada a 100°C durante 10 minutos y sonificada durante 10 segundos. Después de la centrifugación a 12000 g durante 1 minuto, se usaron 3 uL de sobrenadante para la reacción de PCR. La amplificación de PCR fue efectuada en un ciclizador térmico de ADN (Perkin-Elmer GeneAmp 9600). La mezcla de reacción (50 uL) contenía 3 uL de ADN extraído, 100 pmol cada uno de los cebadores respectivos descritos anteriormente, dNTP 200 uM, 0.5 unidades de ADN polimerasa de Taq (NEB), y solución reguladora de pH de ADN polimerasa Taq de acuerdo con instrucciones del fabricante. La desnaturación de ADN se llevó a cabo a 95°C durante 5 minutos para el primer ciclo y luego durante 30 segundos. El recocido del cebador y reacciones de extensión se llevaron a cabo a 58°C durante 30 segundos y 72°C durante 1 minuto, respectivamente. Los productos de PCR fueron luego visualizados sobre geles de agarosa al 1% teñidos con bromuro de etidio. La Figura 26 muestra los resultados del genotipo de PCR de transformantes de C. protothecoides utilizando los cebadores específicos de genes identificados anteriormente. Las flechas muestran el tamaño esperado del producto de PCR y las estrellas representan muestras de ADN de cada transformante que muestran el producto de PCR coincidente con el tamaño esperado (V: Vector solamente, WT: tipo silvestre).
Crecimiento en Cultivo Líquido: Después de cinco días de crecimiento en la oscuridad, los transformantes genotipopositivos mostraron crecimiento sobre medio de proteosa líquido mínimo + sacarosa al 1% en la oscuridad, mientras que las células de tipo silvestre no mostraron crecimiento en el mismo medio en la oscuridad.
EJEMPLO 23
Transformación de cepas de algas con una invertasa secretada derivada de S. cerevisiae
Invertasa Secretada: Un gen que codifica una invertasa de sacarosa secretada (número de acceso GenBank NP_012104 de Saccharomyces cerevisiae) fue sintetizado de novo como un fragmento de 1599 bp Asc I-Xho que fue posteriormente subclonado en un derivado de pUC19 que poseía el promotor 35s de Virus de Mosaico de Coliflor y 3' UTR como casetes de EcoR I/Asc I y Xho/Sac I, respectivamente.
Crecimiento de Células de Algas: Los medios usados en estos experimentos consistían en medios base líquidos (véase el EJEMPLO 1) y medios base sólidos (+ agarosa al 1.5%) que contenían carbono fijo en forma de sacarosa
o glucosa (como se designe) en una concentración final de un 1%. Las cepas usadas en este experimento no crecieron en la oscuridad sobre medio base en ausencia de una fuente de carbono fija adicional. Las especies fueron depositadas sobre las placas y cultivadas en la oscuridad a 28°C. Las colonias individuales fueron elegidas y usadas para inocular 500 mL de medios base líquidos que contenían glucosa al 1% y se les permite que crezcan en la oscuridad hasta una fase media-logarítmica, midiendo los conteos celulares cada día. Cada una de las siguientes cepas había sido previamente probada en relación con el crecimiento sobre sacarosa en la oscuridad como una sola fuente de carbono y no exhibía crecimiento y fueron así elegidas para transformación con una invertasa secretada:
(1)
Chlorella protothecoides (UTEX 31); (2) Chlorella minutissima (UTEX 2341); y (3) Chlorella emersonii (CCAP 211/15).
Transformación de Células de Algas mediante Bombardeo de Partículas: Un cultivo suficiente fue centrifugado para dar aproximadamente 1-5x108 de células totales. El pellet resultante fue lavado con medio base sin ninguna fuente de carbono fija agregada. Las células fueron centrifugadas otra vez y el pellet fue resuspendido en un volumen de medio base suficiente para dar de 5x107 a 2x108 células/ml. 250-1000 μl de células fueron luego depositadas sobre el medio base sólido complementado con sacarosa al 1% y se dejan secar sobre la placa en una campana estéril. El ADN del plásmido fue precipitado sobre partículas de oro de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Seashell Technology, La Jolla, CA). Las transformaciones se llevaron a cabo utilizando un sistema de administración de partículas BioRad PDS He-1000 utilizando discos de ruptura de 1350 libras fuerza/pulgada2 (psi) con el conjunto de macroportador ajustado a 9 cm del portador de disco de ruptura. Después de las transformaciones, las placas fueron incubadas en la oscuridad a 28°C. Todas las cepas generaron múltiples colonias transformantes. Las placas de control transformadas sin ninguna inserción de invertasa, sino preparadas de manera idéntica, no contenían colonias.
Análisis de tranformantes de Chlorella protothecoides: el ADN genómico fue extraído de células de tipo silvestre de Chlorella protothecoides y colonias transformantes como sigue: las células fueron resuspendidas en 100 ul de solución reguladora del pH de extracción (Tris Cl 87.5 mM, pH 8.0, NaCl 50 mM, EDTA 5 mM, pH 8.0, SDS al 0.25%) e incubadas a 60°C, con mezcla ocasional mediante inversión durante 30 minutos. Para PCR, las muestras fueron diluidas 1:100 en Tris Cl 20 mM, pH 8.0.
El genotipo fue efectuado sobre ADN genómico extraído de WT, los transformantes y ADN de plásmido. Las muestras fueron sometidas a genotipo para el gen marcador. Los cebadores 2383 (5' CTGACCCGACCTATGGGAGCGCTCTTGGC 3') (SEQ ID NO:20) y 2279 (5' CTTGACTTCCCTCACCTGGAATTTGTCG 3') (SEQ ID NO:21) fueron usados en esta PCR de genotipo. El perfil de PCR usado fue el siguiente: desnaturalización a 94°C durante 5 minutos; 35 ciclos de 94°C-30 segundos, 60°C-30 segundos, 72°C-3 minutos; 72°C-5 minutos. Una banda de tamaño idéntico fue amplificada de los controles positivos (plásmidos) y dos transformantes de Chlorella protothecoides (UTEX 31), como se muestra en la Figura 27.
Análisis de transformantes de Chlorella minutissima y Chlorella emersonii: el ADN Genómico fue extraído de Chlorella WT y los transformantes como sigue: las células fueron resuspendidas en 100 ul de solución reguladora del pH de extracción (Tris Cl 87.5 mM, pH 8.0, NaCl 50 mM, EDTA 5 mM, pH 8.0, SDS al 0.25%) e incubadas a 60°C con mezcla ocasional mediante inversión durante 30 minutos. Para PCR, las muestras fueron diluídas 1:100 en Tris Cl 20 mM, pH 8.0. El genotipo fue efectuado sobre ADN genómico extraído de WT, los transformantes y ADN de plásmido. Las muestras fueron sometidas a genotipo en cuanto al gen marcador. Los cebadores 2336 (5' GTGGCCATATGGACTTACAA 3') (SEQ ID NO:22) y 2279 (5' CTTGACTTCCCTCACCTGGAATTTGTCG 3') (SEQ ID NO:21) fueron designados como el conjunto de cebadores 2 (producto esperado de 1215 bp), mientras que los cebadores 2465 (5' CAAGGGCTGGATGAATGACCCCAATGGACTGTGGTACGACG 3') (SEQ ID NO:23) y 2470 (5' CACCCGTCGTCATGTTCACGGAGCCCAGTGCG 3') (SEQ ID NO:24) fueron designados como el conjunto de cebadores 4 (producto esperado de 1442 bp). El perfil de PCR usado fue el siguiente: desnaturalización a 94°C durante dos minutos; 29 ciclos de 94°C-30 segundos, 60°C-30 segundos, 72°C-1 minuto, 30 segundos; 72°C-5 minutos. Un control de plásmido que contenía la invertasa secretada fue usado como control de PCR. La Figura 28 muestra la transformación de las especies de Chlorella minutissima (UTEX 2341) y Chlorella emersonii (CCAP 211/15) de microalgas con el gen que codifica una invertasa secretada.
La secuencia del constructo de invertasa corresponde a SEQ ID NO:25.

Claims (4)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un método para producir combustible, que comprende:
    (a)
    cultivar una población de microalgas heterotróficamente en presencia de una fuente de carbono fija, en donde:
    (i)
    las microalgas expresan una invertasa de sacarosa exógena;
    (ii)
    las microalgas acumulan por lo menos un 10% de su peso celular seco como lípido; y
    (iii) la fuente de carbono fija comprende sacarosa en forma de jugo de caña de azúcar, caña de azúcar, remolacha de azúcar, melazas u otras materias primas de alimentación que contienen sacarosa;
    (b)
    aislar los componentes de lípido de las microalgas cultivadas; y
    (c)
    someter los componentes de lípido aislados a una o más reacciones químicas para generar alcanos, mediante lo cual se produce combustible.
  2. 2.
    El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado por que la o las reacciones químicas mencionadas se seleccionan del grupo que consiste en hidrotratamiento, hidrocracking, desoxigenación e isomerización.
  3. 3.
    El método como se define en cualquier reivindicación precedente, caracterizado por que las microalgas contienen (i) por lo menos un gen de utilización de sacarosa exógeno adicional seleccionado del grupo que consiste en un gen de fructocinasa, un gen de glucocinasa, un gen de hexocinasa y un gen transportador de sacarosa, y/o (ii) por lo menos un gen que codifica una enzima de ruta de lípido seleccionada del grupo que consiste en una estearoil-ACP desaturasa, una glicerolípido desaturasa, una piruvato deshidrogenasa, una acetil-CoA carboxilasa, una proteína portadora de acilo, una glicerol-3 fosfato aciltransferasa, una acil-ACP tioesterasa grasa, una acil-CoA reductasa grasa, una aldehído reductasa grasa, una acil-CoA/aldehído reductasa grasa, una aldehído descarbonilasa grasa.
  4. 4.
    El método de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado por que los microorganismos acumulan por lo menos un 50% de su peso celular seco como lípido.
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