ES2534937T3

ES2534937T3 - Procedimiento de producción de vitaminas

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Publication number: ES2534937T3
Application number: ES10180179.3T
Authority: ES
Inventors: James R. Millis; Gabriel G. Saucy; Julie Maurina-Brunker; Thomas W. Mcmullin
Original assignee: DCV Inc
Current assignee: DCV Inc
Priority date: 1998-07-06
Filing date: 1999-07-06
Publication date: 2015-04-30
Anticipated expiration: 2019-07-06
Also published as: DK1947189T3; CA2331343A1; ATE537265T1; EP2100963A1; CA2331343C; MX276941B; CA2831321A1; EP1095002A1; DK2305825T3; ATE490332T1; CA2831321C; WO2000001650A1; ES2379212T3; MX219130B; JP2002519049A; DE69943009D1; CN1330621A; EP2100963B1; EP1947189A3; DK2100963T3

Abstract

Procedimiento de fermentación para producir farnesol o geranilgeraniol, o las formas fosfato de los mismos, es decir pirofosfato de farnesilo (FPP) o pirofosfato de geranilgeranilo (GGPP), que comprende: a) proporcionar un microorganismo que ha sido modificado genéticamente para incrementar el número de copias de genes de HMG-CoA reductasa, cuyo microorganismo es capaz de producir farnesol, geranilgeraniol, FPP o GGPP en un medio de fermentación en el que el medio de fermentación comprende una fuente de carbono en una cantidad inicial entre 1 gramo por litro y 100 gramos por litro de medio de fermentación; b) cultivar el microorganismo recombinante en condiciones en las que la fuente de carbono en el medio de fermentación se agota y se reconstituye durante la fermentación; y c) recuperar dicho producto, en el que se reduce la actividad de escualeno sintasa de dicho microorganismo, y en el que si el microorganismo es capaz de producir geranilgeraniol o GGPP, el microorganismo comprende además un gen que codifica GGPP sintasa.

Description

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[00076] La etapa de oxidación selectiva del doble enlace 2,3-carbono-carbono en el geranilgeraniol produciendo 2,3-epóxido de geranilgeraniol se lleva a cabo con cualquier reactivo conocido por epoxidar selectivamente la funcionalidad olefínica de alcoholes alílicos, tal como combinaciones de hidroperóxido de tercbutilo y catalizadores de vanadio o molibdeno como se enseña por el procedimiento de Sharpless y Michaelson, J. Am. Chem. Soc. 95, 6136 (1973). El peróxido de hidrógeno u otros hidroperóxidos de alquilo podrían reemplazar al hidroperóxido de terc-butilo, y pueden usarse disolventes inertes tales como hidrocarburos aromáticos, hidrocarburos alifáticos, hidrocarburos cicloalifáticos o ésteres alifáticos. La expresión “hidrocarburo alifático” se usa para incluir alcanos de cadena lineal o ramificada que tiene de 5 a 8 átomos de carbono. El heptano es el hidrocarburo alifático más preferido. La expresión “hidrocarburo cicloalifático” se usa para incluir cicloalcanos C5-C8 y aquellos sustituidos con uno o más grupos alquilo C1-C4. La expresión “hidrocarburo aromático” se usa para incluir benceno y benceno sustituido con uno a tres grupos C1-C4. El tolueno es el hidrocarburo aromático más preferido. La expresión “ésteres alifáticos” se usa para incluir ésteres alifáticos que tienen de 3 a 9 átomos de carbono que tienen la fórmula R1CO2R2, en la que R1 y R2 representan independientemente un grupo alquilo C1-C4 de cadena lineal o ramificada, siendo el éster alifático preferido acetato de etilo.

[00077] La etapa de hidrogenación de los tres dobles enlaces carbono-carbono restantes en el epóxido 8 produciendo epoxifitol 9 puede realizarse con cualquier catalizador heterogéneo u homogéneo convencional en atmósfera de hidrógeno. Por tanto, pueden usarse catalizadores soportados tales como paladio sobre carbón, platino sobre carbón, óxido de platino, níquel Raney y similares a un nivel de aproximadamente 0,001 a 0,2 partes en peso con respecto a 8, con o sin un disolvente inerte tal como ésteres alifáticos, alcanoles, hidrocarburos aromáticos, hidrocarburos alifáticos y cicloaliféticos o éteres, a una presión de aproximadamente 101,3 kPa a aproximadamente 20.265 kPa de presión de hidrógeno a temperaturas de aproximadamente 0ºC a aproximadamente 150ºC. El término “alcanol” se usa para representar alcoholes de fórmula R3-OH y alcoholes sustituidos de fórmula R3OCH2CH2OH, en la que R3 representa un grupo alquilo C1-C4 de cadena lineal o ramificada. El término “éter” se usa para representar éteres que tienen la fórmula R1-O-R2, en la que R1 y R2 son como se definen anteriormente, y tetrahidrofurano. La etapa de desoxigenación del epoxifitol 9 produciendo una mezcla de fitol 5 e isofitol 6 mediante reacción con un aceptor de oxígeno puede ser una reacción de transferencia de oxígeno catalizada por renio y puede realizarse sin disolvente o en presencia de un disolvente inerte tal como hidrocarburos aromáticos, hidrocarburos alifáticos, hidrocarburos cicloalifáticos, ésteres alifáticos, alcanoles, éteres o agua. La reacción puede llevarse a cabo también en un sistema de agua-disolvente orgánico bifásico con o sin la adición de un catalizador de transferencia de fase. El catalizador puede ser un trióxido de renio sustituido o una forma soportada en polímero de dicho compuesto de trióxido de renio. El catalizador puede usarse a un nivel de aproximadamente 0,01-5,0% en peso basado en 9. El aceptor de oxígeno debe estar presente a un nivel de 1,0-3,0 mol por mol de 9 y puede elegirse de triarilfosfinas, trialquil-C1-C6-fosfinas, triarilfosfitos, trialquil C1-C8-fosfitos, hipofosfitos de metal alcalino o ácido hipofosfórico. Pueden usarse otros compuestos capaces de aceptar irreversiblemente oxígeno de 9, tales como sulfuros de dialquilo C1-C6 y ciertas bases nitrogenadas tales como Nalquil C1-C6-morfolinas. El término “arilo” se usa para incluir fenilo y naftilo y éstos sustituidos con uno a tres grupos alquilo C1-C6. El término “aralquilo” se usa para incluir radicales monovalentes que tienen la estructura aril(CH2)n-, en la que n= 1 a 4. La expresión “trióxido de renio sustituido” se usa para incluir compuestos de fórmula R-ReO5, en la que R es un grupo hidrocarburo seleccionado del grupo constituido por alquilo C1-C10, arilo C6-C10, aralquilo, ciclopentadienilo y ciclopentadienilo sustituido con uno a cinco grupos alquilo C1-C4.

[00078] Debería observarse que la etapa de desoxigenación del epoxifitol, tal como mediante reacción con trifenilfosfina u otro aceptor de oxígeno adecuado con catálisis por un compuesto de renio tal como trióxido de metilrrenio, es una reacción novedosa e inesperada. Se ha revisado la utilización de trióxido de metilrrenio como catalizador en una variedad de reacciones orgánicas [Schmidt (J. Prakt. Chem./Chem.-Ztg. 339, 493-496 (1997)]. Espenson y Zhu [(J. Molecular Catalysis A: Chemical 103, 87-94 (1995)] han dado 6 ejemplos de uso de MTO para

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[0105] Se somete entonces la bis(deshidro)cetona C19 10 a unas condiciones suficientes para experimentar ciclación, formando una cetona C18 cíclica 11. Las condiciones de ciclación típicas implican poner en contacto la bis(deshidro)cetona C18 10 con un ácido. Se describen anteriormente las condiciones de reacción típicas para la ciclación de un 1,5-dieno, tal como acetato de farnesilo, y pueden usarse para esta ciclación. La ciclación puede efectuarse también mediante un catalizador metálico que sea conocido por un experto en la técnica, incluyendo níquel y rodio. La bis(deshidro)cetona C18 10 puede ciclarse también usando una enzima. Dichas enzimas útiles se describen anteriormente.

[0106] Con referencia de nuevo a la figura 11, se somete una mezcla que comprende la cetona C16 cíclica 11 y un compuesto de fórmula NCCH2CO2R a unas condiciones de reacción suficientes para formar un nitrilo C20 12, en el que R es hidrógeno o hidrocarbilo C1-C10. Cuando R es hidrógeno, se pone en contacto ácido α-nitrilacético con una base para desprotonar el protón carboxílico así como el protón α del grupo carbonilo. Estos dos protones pueden retirarse usando dos bases diferentes, una para el protón carboxílico y la otra para el protón α, o pueden retirarse ambos protones usando una base que sea suficientemente fuerte para desprotonar ambos protones. Si R es hidrocarbilo C1-C10, entonces se usa una base que sea suficientemente fuerte para desprotonar el acetato de αnitrilo. Puesto que NCCH2CO2R contiene dos grupos aceptores de electrones, puede usarse una base relativamente débil, tal como un hidróxido o una amina, para desprotonar un protón α. El acetato de α-nitrilo desprotonado experimenta entonces una reacción de condensación con la cetona C18 cíclica 11, seguido de procesos de deshidratación y descarboxilación, produciendo el compuesto de nitrilo C20 12. La deshidratación puede ocurrir en las condiciones de la reacción de condensación o puede efectuarse en unas condiciones de reacción separadas. Si R es hidrocarbilo C1-C10, es necesario saponificar, concretamente hidrolizar, el grupo alquilo formando un ácido carboxílico o un anión carboxilato antes de someter el producto condensado a unas condiciones de descarboxilación. Las condiciones de descarboxilación del producto condensado requieren generalmente someter el producto condensado a una temperatura elevada.

[0107] Se pone entonces en contacto el nitrilo C20 12 con un primer agente reductor en unas condiciones suficientes para producir retinal 7, o puede reducirse con un agente reductor suficientemente fuerte para producir vitamina A (8). El retinal 7 puede reducirse usando un segundo agente de reducción proporcionando vitamina A. Las condiciones y agentes de reducción adecuados para estas reducciones son aquellos descritos anteriormente. La vitamina A puede convertirse adicionalmente en un derivado éster de vitamina A haciendo reaccionar la vitamina A con un agente esterificante apropiado, como se describe anteriormente.

[0108] En otra realización, el retinal 7 que se produce mediante cualquiera de los procesos anteriormente descritos se somete a unas condiciones suficientes para producir β-caroteno 13. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 12, dos moléculas de retinal 7 experimentan una reacción de acoplamiento cuando se someten a lo que se conoce comúnmente en la técnica como las condiciones de reacción de acoplamiento de McMurry. La reacción de acoplamiento de McMurry es bien conocida en la técnica de la química orgánica y se describe por John McMurry en la patente de EE.UU. nº 4.225.734. Brevemente, la reacción de acoplamiento de McMurry implica la producción de olefinas a partir de un acoplamiento reductivo de grupos carbonilo tales como cetonas y aldehídos con especies de Ti (II) y/o Ti (0) reactivas. En general, las especies reactivas se generan in situ mediante la reducción de Ti (III) o Ti

(IV) con un agente reductor seleccionado del grupo constituido por LiAlH4, Na, K, Zn, Mg, NaBH4, CaH2 y LiBH4. Las especies de Ti (III) y Ti (IV) son típicamente haluros de titanio tales como TiCl3 y TiCl4, respectivamente.

[0109] En otra realización, el β-caroteno 13 se produce a partir de vitamina A, que se produce mediante cualquiera de los procedimientos anteriormente descritos. Como se muestra en la Figura 13, el procedimiento implica en general hacer reaccionar un haluro de retinilo 15 con retinilfenilsulfona 14. Puede producirse un haluro de retinilo 15 poniendo en contacto la vitamina A que se produce mediante el proceso descrito anteriormente con una mezcla de reacción seleccionada del grupo que comprende HX, P(X)3 y una mezcla de P(R4)3 y X2 en condiciones suficientes para producir el haluro de retinilo, en las que X es un haluro, X2 es un halógeno y R4 es hidrocarbilo C1-C10. El haluro de retinilo 15 se pone entonces en contacto con un anión de retinilfenilsulfona 14 en unas condiciones suficientes para producir la sulfona C40 16. En casos en que la retinilfenilsulfona 14 se desprotona con la base antes de ponerse en contacto con el haluro de retinilo 15, la base es suficientemente fuerte para desprotonar sustancialmente toda la retinilfenilsulfona 14. Las bases ejemplares para desprotonar sustancialmente toda la retinilsulfona 14 antes de ponerla en contacto con el haluro de retinilo 15 incluyen, pero sin limitación, diisopropilamiduro de litio (LDA), hexametildisilazida de sodio (NaHMDS), metil-litio, butil-litio, terc-butil-litio, sec-butillitio, hidruro de potasio, hidruro y terc-butóxido de sodio. Como alternativa, el haluro de retinilo 15, la retinilfenilsulfona 14 y la base se combinan todos en un aparato de reacción y se deja que la base desprotone algunas moléculas de retinilfenilsulfona que pueden reaccionar con el haluro de retinilo 15, formando la sulfona C40 16, concretamente, la especie aniónica reactiva de retinilfenilsulfona 14 se genera in situ.

[0110] Con referencia de nuevo a la figura 13, la retinilfenilsulfona 14 puede producirse haciendo reaccionar un éster de retinilo tal como acetato de retinilo 9 o un haluro de retinilo 15 con una mezcla de reacción que comprende ácido fenilsulfínico en unas condiciones suficientes para producir la retinilfenilsulfona 14. Puede usarse

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MBNA1-1: 24 0,16 0 0,00

48: 1,12 1793 0,16

72: 1,26 13187 1,05

MBNA1-5: 24 2,46 0 0,00

48: 1,6 0 0,00

72: 1,06 0 0,00

MBNA1-9: 24 1,32 1122 0,00

48: 2,96 19062 0,64

72: 4,34 70625 0,00

MBNA1-10: 24 4,76 4636 0,10

48: 9,44 444 0,00

72: 7,9 166 0,00

MBNA1-11: 24 1,82 0 0,00

48: 3,58 258 0,01

72: 2,36 281 0,01

MBNA1-13: 24 0,18 0 0,00

48: 3,12 3657 0,12

72: 1,66 42187 2,54

MBNA1-14: 24 2,42 0 0,00

48: 8,98 0 0,00

72: 7,36 0 0,00

ATCC28383: 24 7,36 0 0,00

48: 8,52 0 0,00

72: 8,84 0 0,00

ATCC64031: 24 1,58 90 0,01

48: 1,84 6845 0,37

72: 1,28 4874 0,38

D. Análisis enzimático

[0127] Se cultivaron las células para todos los ensayos enzimáticos en medio YPDE (medio YPD que

5 contiene ergosterol 5 mg/l). Se recogieron las células mediante centrifugación. Se suspendió 1 g de células (peso húmedo) en 4 ml de Tris·HCl 0,1 M, pH 7,0. Se disgregó entonces la suspensión celular mediante pase a través de una prensa French (137,9 MPa). Se centrifugó entonces la suspensión celular resultante (lisada) (15.000 x g) y se usó directamente el sobrenadante (extracto exento de células) para ensayos enzimáticos a menos que se indique otra cosa.

10 [0128] Se ensayó en los mutantes la actividad escualeno sintasa. El ensayo de escualeno sintasa implicaba la incubación de un extracto exento de células con FPP en presencia de la forma reducida de dinucleótido fosfato de nicotinamida y adenina (NADPH), la extracción con acetato de etilo y la detección de escualeno por CG. Específicamente, se combinaron Tris/HCl 0,1 M pH 7 (X µl), DTT 0,1 M (2 µl), MgCl2 0,1 M (10 µl), NADPH 0,1 M (4

15 µl), FPP 1 mg/ml (6 µl) y extracto exento de células (7000 x g de sobrenadante) (Y µl), en que X + Y = 178 µl para dar 200 µl totales. Se incubó esta mezcla en tubos de vidrio a 37ºC durante 40 min. Se extrajo entonces con 0,15 ml de acetato de etilo. Se transfirió el extracto a viales de plástico y se centrifugó a 15.000 x g durante 5 min. Se analizó el extracto de acetato de etilo usando CG/EM.

20 [0129] La Tabla 4 muestra los niveles de escualeno sintasa para los mutantes MBNA1-1, MBNA1-9, MBNA113 y las cepas ATCC 64031 y 28383. La actividad escualeno sintasa era 0,12 pg de escualeno formado/min x mg de proteína para el organismo natural 28383. Los niveles de actividad para las otras 4 cepas eran menores que los límites detectables de este ensayo. Se esperarían niveles de síntesis de escualeno reducidos para MBNA1-1, MBNA1-9 y 64031, puesto que se han caracterizado por ser mutantes parcialmente bloqueados que producen

25 farnesol y bajas cantidades de ergosterol. El MBNA1-13 es un mutante productor de farnesol que no puede crecer sin esterol añadido, así que este mutante bloqueado se esperaría que no tuviera un nivel detectable de escualeno sintasa. Se volvieron a ensayar los extractos de estas cepas con mayores concentraciones de extracto exento de células y tiempos de incubación más largos. De nuevo, no se detectó escualeno sintasa en ninguno de los mutantes. TABLA 4

Cepa: Ensayo de escualeno sintasa

(µg/min x mg de proteína)

MBNA1-1: ND

MBNA1-9: ND

MBNA1-13: ND

ATCC 64031: ND

ATCC 28383: 0,12

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ND: no detectado

[0130] Se efectuó un análisis enzimático para las cepas productoras de farnesol (MBNA1-1, MBNA1-9 y MBNA1-13) y su cepa original 28283. Se compararon los niveles enzimáticos con los de acetoacetil CoA tiolasa, HMG-CoA sintasa, HMG-CoA reductasa, FPP sintasa y una fosfatasa. Se prepararon los extractos exentos de células como se describe anteriormente.

[0131] Para el ensayo de FPP sintasa, se combinaron DTT 0,1 M (2 µl), MgCl2 0,1 M (2 µl), IPP 1 mg/ml (6 µl), GPP 1 mg/ml (6 µl), extracto exento de células (Y) y Tris/HCl 0,1 M (pH 7,0) (X µl), en la que X + Y = 84 µL, y se incubó a 37ºC durante 15 min. Se extrajo entonces esta mezcla dos veces con 0,3 ml de hexano para retirar el farnesol preexistente. A continuación, se añadieron 0,1 ml de tampón 2 x glicina (glicina 0,2 M, MgCl2 2 mM, ZnCl2 2 mM), pH 10,4 y 33 unidades de fosfatasa alcalina y se incubó la mezcla a 37ºC durante 1 hora. Se extrajo la mezcla con 0,1 ml de acetato de etilo y se secó con sulfato de sodio. Se determinó el farnesol con CG. Se incluyó un control sin fosfatasa en cada ensayo.

[0132] La HMG-CoA reductasa cataliza la reacción de HMG-CoA con NADPH formando mevalonato, dinucleótido fosfato de nicotinamida y adenina (NADP) y CoA (véase la Figura 1). Para estos ensayos, se prepararon extractos exentos de células como se describe anteriormente, excepto porque las suspensiones celulares disgregadas se centrifugaron a 7.000 x g en lugar de a 15.000 x g. Se siguió la reacción monitorizando el consumo de HMG-CoA mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Para el ensayo, se incubó a 37ºC durante 15 minutos una mezcla de reacción que contenía (en un volumen final de 0,1 ml) Na2H2P2O7 0,1 M, pH 6,5, DTT 2 mM, NADPH 1 mM, HMG-CoA 0,4 mM y extracto exento de células (el volumen de extracto variaba, completando el resto de los 0,1 ml de reacción con Na2H2P2O7 0,1 M, pH 6,5). Se monitorizó la reacción con HPLC (columna en fase inversa Luna C18 (Phenomenex) usando un gradiente de 0% de disolvente B durante 1 min, seguido de 0-11% de B durante 42 min. El disolvente A era fosfato de potasio 40 mM (pH 6,0)/metanol 86:14 (v/v). El disolvente B era metanol. La longitud de onda para detección era 260 nm).

[0133] La HMG-CoA sintasa convierte acetoacetil CoA y acetil CoA en HMG-CoA y CoA. El ensayo monitoriza la producción de HMG-CoA por HPLC. Para el ensayo, se combinaron Na2H2P2O7 0,1 M, pH 6,5, (X µl), acetoacetil CoA 20 mM (4 µl), acetil CoA 20 mM (2 µl) y extracto exento de células (Y µl), en que X + Y es 94 µl (volumen total 100 µl) y se incubaron a 37ºC durante 5 minutos. Se calentó entonces la mezcla de reacción a 60ºC durante 5 minutos para inactivar la enzima, seguido de centrifugación en una microcentrífuga a velocidad máxima durante 5 minutos. Se analizó el sobrenadante mediante HPLC.

[0134] La acetoacetil CoA tiolasa cataliza una reacción reversible, con lo que, en la dirección directa, reaccionan dos moléculas de acetil CoA formando acetoacetil CoA y CoA. El ensayo monitoriza la formación de acetil CoA (reacción inversa) por HPLC. Para el ensayo, se combinaron Na2H2P2O7 0,1 M, pH 6,5, (X µl), acetoacetil CoA 20 mM (2 µl), CoA 20 mM (3 µl) y extracto exento de células (Y µl), en que X + Y es 95 µl (volumen total 100 µl) y se incubaron a 37ºC durante 5 minutos. Se centrifugó entonces la mezcla de reacción en una centrífuga Microcon10 (Amicon) para separar la enzima del producto. Se analizó el sobrenadante por HPLC.

[0135] El ensayo de fosfatasa cuantifica la actividad fosfatasa midiendo la formación de p-nitrofenol (absorbancia aumentada a 400 nm). Para el ensayo de fosfatasa, se combinaron Tris-HCl 0,1 M, pH 7 (X µl), MgCl2 1 M (2 µl), fosfato de p-nitrofenilo 50 mM (10 µl) y extracto exento de células (Y µl), en que X + Y = 1 ml, y se incubaron a 37ºC durante 15 minutos, después de lo cual se midió la absorbancia a 400 nm.

[0136] La Tabla 5 muestra los niveles para cada una de las 5 enzimas en estas 4 cepas. Los niveles de acetoacetil CoA tiolasa eran comparables en todas estas cepas. Los niveles de HMG-CoA sintasa y HMG-CoA reductasa parecían ser de 2 a 3 veces mayores en las cepas mutantes. Los niveles de FPP sintasa eran iguales o menores en los mutantes que en 28383. Los niveles de fosfatasa parecían estar elevados 3 a 4 veces en las cepas mutantes en comparación con la original. Puesto que todas estas cepas se aislaron mediante mutagénesis clásica, es posible que existan otras mutaciones en estas cepas además de la mutación erg9.

TABLA 5

MBNA1-1: MBNA1-9 MBNA113 ATCC 28383

Acetoacetil-CoA tiolasa (nmol de AcCoA/min x mg de proteína): 2,4 x 102 2,7 x 102 1,6 x 102 2,0 x 102

HMG-CoA sintasa (nmol de HMG-CoA/min x mg de proteína): 5,7 7,2 7,1 2,7

HMG-CoA reductasa (nmol de CoA/min x mg de proteína): 0,35 0,55 0,36 0,15

FPP sintasa (nmol de farnesol/min x mg de proteína): 1,3 2,0 1,6 2,2

Fosfatasa genérica (nmol de p-nitrofenol/min x mg de proteína): 82 83 91 24

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desplazamiento de fase). Los alelos erg9 de MBNA1-1 y MBNA1-9 retienen bajos niveles de actividad. Se determinó ésta transformando un mutante de deleción erg9 que requiere ergosterol con plásmidos que portan los genes erg9 mutantes de MBNA1-1 y MBNA1-9. La presencia de los genes clonados en las cepas de deleción de erg9 permitió crecer a estos transformantes, aunque lentamente, en medio que carece de ergosterol. El alelo erg9 de MBNA1-13 no mostró actividad residual cuando se ensayó de esta manera. La cepa de deleción de erg9 creció a niveles naturales cuando se transformó con el alelo ERG9 de la ATCC 28383.

F. Descripción de mutaciones secundarias

[0146] Saccharomyces cerevisiae normalmente no importa ergosterol de su entorno en condiciones aeróbicas. Sin embargo, los mutantes de erg9 aislados fueron capaces de crecer aeróbicamente cuando se complementaron con ergosterol o colesterol y, por lo tanto, deben contener mutaciones secundarias que permitan que ocurra la captación aeróbica de esterol. Los procedimientos usados para aislar mutantes de la ruta del ergosterol, tales como el mutante de erg9 de MBNA1-13, incluían no solo una selección de mutantes de la ruta del ergosterol, sino una selección de células que importan esteroles en condiciones aeróbicas también, puesto que solo los mutantes con mutaciones tanto en un gen de la ruta del esterol como en un gen de captación de esterol habrían sobrevivido.

[0147] En el ejemplo 3 siguiente, se describe la dificultad encontrada cuando se intenta obtener mutaciones por inactivación génica de erg9 mediante procedimientos moleculares, incluso en una cepa que porta la mutación upc2, que se ha notificado que permite la captación de esteroles en condiciones aeróbicas (Lewis, T.L., G.A. Keesler, G.P. Fenner y L.W. Parks, 1988, “Pleiotropic mutations in Saccharomyces cerevisiae affecting sterol uptake and metabolism”, Yeast 4: 93-106). Parece que la mutación upc2 no confiere una captación aeróbica de esterol eficaz a un mutante de erg9, y que las cepas descritas en el Ejemplo 3 adquirieron mutaciones espontáneas adicionales (a una tasa de frecuencia baja) que mejoran su capacidad de captar aeróbicamente esteroles.

[0148] Tener las mutaciones apropiadas que potencian la captación aeróbica de ergosterol y colesterol a una cepa por lo demás natural permite aislar mutaciones de erg9 en esa cepa a una frecuencia mucho mayor que la que se obtendría con una cepa mutante sin captación de esterol. Para demostrar que la cepa mutante de erg9 MBNA113 (y derivados de esta cepa) había adquirido una o unas mutaciones que potencian la captación de esteroles en condiciones aeróbicas (designado como potenciación de la captación de esterol o mutaciones sue), se comparó la frecuencia de creación de una inactivación génica de erg9 en el trasfondo de MBNA1-13, que contiene la mutación de captación de esterol, con la frecuencia de obtención de la mutación de inactivación génica de erg9 en el trasfondo original de ATCC 28383, que presuntamente carece de la mutación de captación de esterol. Esto se hizo con las dos siguientes cepas que representan el trasfondo de cada cepa. SWE23-∆HE9 (ura3, his3, sue) derivaba de MBNA1-13 y contiene un gen ERG9 reparado. SWY5-∆H1 (ura3, his3) es un mutante auxotrófico derivado de la cepa ATCC 28383. Se describe con detalle la construcción de SWE23-∆HE9 y SWY5-∆H1 en la Sección G a continuación. Puesto que SWE29-∆HE9 derivaba de MBNA1-13, esta cepa servía como hospedador que portaba la mutación sue, mientras que SWY5-∆H, que derivaba de ATCC 28383, servía como hospedador sin la mutación sue. Se transformaron ambas cepas con cantidades iguales (aproximadamente 1 µg) del fragmento de ADN erg9:: ∆HIS3 obtenido mediante digestión de pKML19-41 (construcción plasmídica descrita en el Ejemplo 3) con BamHI y XmaI y purificación del fragmento de 2,1 kb resultante. Se transformaron las células con este fragmento de 2,1 kb usando el procedimiento de transformación con LiAc (Gietz, R.D., R.H. Schiestl, A.R. Willems y R.A. Woods, 1995, “Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure”, Yeast 11: 355-360), y se seleccionaron los transformantes en medio SCE-ura. El medio SCE contiene 0,67% de base nitrogenada de levadura Bacto (sin aminoácidos), 2% de dextrosa, sulfato de adenina 20 mg/l, uracilo 20 mg/l, L-triptófano 20 mg/l, L-histidina 20 mg/l, L-arginina 20 mg/l, L-metionina 20 mg/l, L-tirosina 30 mg/l, L-leucina 30 mg/l, L-isoleucina 30 mg/l, L-lisina 30 mg/l, Lfenilalanina 50 mg/l, L-ácido glutámico 100 mg/l, L-ácido aspártico 100 mg/l, L-valina 150 mg/l, L-treonina 200 mg/l, L-serina 400 mg/l y ergosterol 5 mg/l. Para placas de agar, se añade un 2% de agar Bacto al medio SCE. El medio SCE-ura es SCE que carece de uracilo.

[0149] Se obtuvieron un total de 24 colonias HIS+ surgidas de la transformación de SWY5-∆H1, mientras que se obtuvieron 401 colonias HIS+ a partir de SWE23-∆HE9. Puesto que era posible que el gen erg9∆::HIS3 se integrara en loci distintos del locus de ERG9 (y permitiendo por lo tanto a las células permanecer prototróficas de ergosterol), se ensayó en 20 de cada tipo de transformante el requisito de ergosterol sembrando en medio YPD (carece de ergosterol). Las 20 colonias HIS+ derivadas de SWY5-∆H eran capaces de crecer en YPD, lo que indicaba que seguían conteniendo un gen ERG9 funcional y sugería que el gen erg9∆::HIS3 no estaba integrado en el locus de ERG9. Por otro lado, ninguna de las 20 colonias HIS+ derivadas de SWE23-∆HE9 era capaz de crecer en YPD, indicando que el ADN de erg9∆::HIS3 había reemplazado al gen ERG9 natural en este trasfondo de cepa a una frecuencia relativamente alta. Para verificar esto, se analizaron por HPLC 9 colonias HIS+ de cada cepa para determinar los tipos de alelos de ERG9 presentes en sus genomas. Se preparó el ADN genómico como se describe en Sherman y col. (1989). Los oligonucleótidos usados para el análisis se dan a continuación.

5’ oligo = 250 UpBam gcgcatCCACGGGCTATATAAA (SEQ ID NO:3)

3’ oligo = 1764 LoBam gcggatCCTATTATGTAAGTACTTAG (SEQ ID NO:4)

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respectiva en cultivos de matraz agitado. Se cultivaron las cepas durante una noche en medio YPDE (30ºC con agitación a 180 rpm). Se usaron estos cultivos para inocular 25 ml de medio YPDE en un matraz de 250 ml de tal modo que la DO600 inicial fuera de 0,05. Se cultivaron las células durante 72 horas a 30ºC (con agitación a 180 rpm). Se analizaron en muestras del caldo entero (concretamente, células más medio de cultivo) el peso celular seco y el farnesol como se describe en la Sección C anterior.

TABLA 6

Crecimiento y producción de farnesol en cepas derivadas de MBNA1-13

Cepa: Genotipo Farnesol (% en peso celular seco)

MBNA-1-13: erg9, sue 7,9

EMS9-23: erg9, ura3, sue 8,0

SWE23-∆H1: erg9, ura3, his3-∆200, sue 7,9

SWE23-∆L1: erg9, ura3, leu2-∆1, sue 9,3

SWE23-∆T1: erg9, ura3, trp1-∆63, sue 10,8

SWE23-∆E91: erg9∆::HIS3, ura3, his3, sue 8,0

[0156] Se evaluaron adicionalmente en las cepas MBNA1-13, EMS9-23 y SWE23-∆E91 el crecimiento y la producción de farnesol en fermentadores de 1 l usando el procedimiento descrito en la Sección H siguiente. Se transformaron EMS9-23 y SWE23-∆E91 cada una con el plásmido YEp352, que contiene el gen URA3 clonado. Eso obvió la necesidad de añadir uracilo al medio de fermentación para estas dos cepas. La Figura 4 y la Tabla 7 resumen los resultados de estas fermentaciones. MBNA1-13 y EMS9-23/YEp352 actuaron de forma similar. Aunque el crecimiento de SWE23-∆E91/YEp352 quedó por detrás de las otras dos cepas, alcanzó una densidad celular y un nivel de producción de farnesol comparable a las demás cepas.

TABLA 7

Comparación de MBNA1-13 y cepas derivadas de ella en fermentadores de 1 l

Cepa/plásmido: Tiempo (h) Peso celular seco (g/l) Farnesol

(g/l): (% en peso celular seco)

MBNA1-13: 191 40,08 2,25 5,5

EMS9-23/YEp352: 191 42,6 2,46 5,8

SWE23-∆E91/YEp352: 239 37,2 2,23 6,0

[0157] Se manipularon adicionalmente las cepas EMS9-23 y SWE23-∆H1 reparando las mutaciones erg9 de nuevo a la función natural. Esto se realizó transformando las dos cepas (usando el procedimiento de transformación con LiOAc) con aproximadamente 5 µg de un fragmento de ADN que contenía el gen ERG9 intacto. Se obtuvo el fragmento de ADN del gen ERG9 mediante la digestión de pTWM103 (véase la Sección E anterior) con SacI y BamHI, y purificando el fragmento de ADN de 2,5 kb que contenía el gen ERG9. Se obtuvieron los transformantes de EMS9-23 y SWE23-∆H1, en que se había reemplazado la mutación de desplazamiento de fase erg9 por el gen ERG9 natural, de cada cepa mediante la selección de células que podían crecer en medio YPD carente de ergosterol. Se eligieron para estudio adicional una cepa con erg9 reparado derivada de EMS9-23, designada SWE23-E9, y una cepa con erg9 reparado derivada de SWE23-∆H1, designada SWE23-∆HE9. En experimentos separados, se introdujeron mutaciones auxotróficas en la cepa original ATCC 28383. Se obtuvo una mutación ura3 espontánea de ATCC 28383 después de sembrar células en medio que contenía 5-FOA como se describe anteriormente. Se transformaron los mutantes resistentes a 5-FOA con pRS316 (descrito anteriormente) para identificar a aquellos que habían adquirido espontáneamente una mutación en su gen URA3. Una cepa, SWY5, exhibía un fenotipo ura-estable (baja frecuencia de reversión) y se eligió para estudio adicional. Se manipuló adicionalmente SWY5 para portar la mutación his3 usando el plásmido de transposición génica YRp14/his3-∆200 descrito por Sikorski y Hieter (Sikorski y Hieter, 1989) y el procedimiento de reemplazo de inserción/escisión descrito por Rothstein (Rothstein, 1991). Se eligió un mutante his3 derivado de SWY5, designado como SWY5-∆H, para estudio adicional.

[0158] La Tabla 8 enumera las cepas reparadas y auxotróficas descritas y sus genotipos. TABLA 8

Cepas reparadas y auxotróficas relacionadas con ATCC 28383 y MBNA113

Cepa: Genotipo Original

SWE23-E9: ura3, sue EMS9-23

SWE23-∆HE9: ura3, his3, sue SWE23-∆H1

SWY5: ura3 ATCC 28383

SWY5-∆H: ura3, his3 SWY5

[0159] Para ensayar si el mutante erg9 de MBNA1-13 había adquirido algún requisito nutricional adicional durante el curso de su aislamiento, se realizó un experimento de crecimiento en matraces agitados para comparar la

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MBEMS8-35: 0,000 0,000 0 0

ATCC64031: 0,018 0,005 0,9 0,3

ATCC28383: 0,000 0,000 0 0

Ejemplo 3

[0172] En el Ejemplo 1.G. anterior, se describió la creación de un mutante erg9∆::HIS3 de MBNA1-13. En 5 este ejemplo, se describe la construcción de otras cepas haploides de S. cerevisiae (no derivadas de MBNA1-13) que contienen un alelo de deleción/inserción de erg9::HIS3.

[0173] Se amplificó por PCR el gen ERG9 usando ADN genómico aislado de la cepa S288C (según el procedimiento de Sherman y col.) como molde y los dos siguientes cebadores: 10 5’ oligo = gag cat CCA CGG GCT ATA TAAA (SEQ ID NO:5); 250 BamUp 3’ oligo = tcc ccc cg GGC GCA GAC TTC ACG CTC (SEQ ID NO:6); 1712 XmaLo

[0174] Se digirió con BamHI y XmaI ADN de ERG9 amplificado por PCR, y se ligó entonces a pRS316 digerido con BamHI, XmaI (vector lanzadera de levadura/E. coli, Sikorski y Hieter, 1989). Las condiciones de PCR

15 fueron: 94ºC durante 1 min-1 ciclo 94ºC durante 30 s ┐ 58ºC durante 1 min │ 30 ciclos 72ºC durante 1 min ┘

20 72ºC durante 2 min-1 ciclo

[0175] El gen ERG9 clonado de esta manera se extiende desde la posición nº 11555 a la posición nº 13047 del nº de acceso a GenBank U00030, y el clon resultante se denominó pJMB98-12. La construcción de la deleción de ERG9 y la inserción de ADN de HIS3 se realizó como sigue:

25 Se obtuvo el gen HIS3 mediante digestión del plásmido pRS403 que contiene HIS3 (Stratagene, LaJolla, CA) con Eco47III y SspI, y purificación del fragmento de 1226 pb que contiene el gen HIS3.

[0176] Se digirió el plásmido pJMB98-12 con Van91I y se trató entonces con ADN polimerasa T4 para hacerlo de extremos romos. Se digirió adicionalmente el plásmido con HpaI de modo que se eliminara un fragmento

30 interno de 589 pb en ERG9. Se ligó en este sitio el fragmento Eco47111, SspI de 1226 pb que contenía el gen HIS3. El plásmido resultante, pKML19-41, tiene el gen HIS3 clonado en el gen ERG9 eliminado, con la secuencia de codificación de HIS3 en la misma orientación que la secuencia de codificación de ERG9.

[0177] Para transformar levadura con este ADN de erg9∆::HIS3, se digirió el plásmido pKML19-41 con SmaI

35 y XbaI, y se aisló el fragmento de 2141 pb que contenía el gen erg9∆::HIS3. Se purificó el ADN de cortes de gel de agarosa usando GeneClean.

[0178] Se usaron aproximadamente 5 µg de ADN de erg9∆::HIS3 purificado para transformar la cepa diploide CJ3A X CJ3B (a/α, ura3/ura3, his3/his3, leu2/leu2, trp1/trp1, upc2/upc2, obtenida del Dr. L. Parks, “N.C. State

40 University”, Raleigh, NC) usando el procedimiento de transformación con acetato de litio descrito en Gietz, y col. (1995). CJ3A X CJ3B es homocigótico de la mutación upc2. Esta mutación permite la captación de esterol en condiciones aeróbicas (Lewis, y col., 1988). Se creía que la mutación upc2 permitiría la fácil producción de una cepa haploide que portara una mutación en el gen erg9. La auxotrofia de histidina era necesaria para seleccionar las cepas que portan los plásmidos que contienen el gen HIS3 funcional.

45 [0179] Se sembraron células transformadas en medio SCE (descrito en el Ejemplo 1.F.) carente de histidina (SC-His) para seleccionar los transformantes HIS+.

[0180] Se obtuvieron cientos de transformantes. Se inocularon zonalmente entonces estas células HIS+ sobre

50 SC-HIS y se dejaron crecer durante dos días más. Se inocularon zonalmente entonces los transformantes sobre el medio de esporulación (Sherman, y col., 1986). El medio de esporulación contiene (por litro de agua destilada): 1% de acetato de potasio, 0,1% de extracto de levadura Bacto, 0,05% de dextrosa y 2% de agar Bacto. Se dejaron entonces crecer y esporular las zonas durante 3-5 días. Se retiró una porción de las células y se dispuso en una disolución de liticasa para digerir la pared celular del asca. Se extendieron entonces las células en una línea fina

55 sobre una placa de YPD + ergosterol 2 mg/l (YPDE). Las células diploides esporuladas forman tétradas que contienen cuatro esporas, y se separaron las esporas individuales usando un micromanipulador. Estas esporas haploides individuales germinarán, conteniendo cada una una sola copia de los cromosomas.

[0181] Se esperaba una segregación 2:2 para inactivaciones génicas erg9∆::HIS3 en esta cepa. Dos esporas

60 deberían ser viables en YPD, puesto que contendrían la copia del cromosoma que no se había perturbado (lo que significa que no necesitarían ergosterol puesto que tienen un gen ERG9 funcional y serían capaces de crecer en

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las cepas haploides que se probaron positivas para la producción de farnesol con crecimiento anaeróbico. Tres de dichas esporas viables (derivadas de KML505) surgieron después de una incubación aeróbica prolongada. Estas cepas de crecimiento aeróbico, designadas como BKY1-2D, BKY1-7C y BKY1-8D, producían todas farnesol en condiciones aeróbicas.

[0191] Se esporuló la cepa original KML510 (a/α, ura3/ura3, his3/his3, trp1/trp1, leu2/leu2, upc2/upc2, ERG9/erg9∆::HIS3) que contenía pJMB98-12 o pRS316 y se disecaron las tétradas sobre placas de YPDE. Se incubaron las placas en condiciones aeróbicas y se observaron los siguientes patrones de crecimiento de espora.

[0192] Se realizaron los análisis de tétrada de KML510/pJMB98-12 cpm con 20 tétradas. 16 tétradas dieron lugar a dos esporas viables de crecimiento rápido y dos esporas no viables. Todas las esporas viables eran his-, erg+. Tres tétradas dieron lugar a dos esporas viables de crecimiento rápido, una espora viable de crecimiento lento y una espora no viable. Las viables de crecimiento rápido eran todas his-, erg+. Las esporas viables de crecimiento lento eran todas his+, erg -. Una tétrada no dio lugar a ninguna espora viable. Todas las esporas his+, erg -eran también ura-, indicando que pJMB98-12 no segregaba en estas esporas durante la meiosis. Se usó una de estas esporas his+, erg -para estudios adicionales, y se denominó BTY19-9C.

[0193] Se realizó el análisis de tétrada de KML510/pRS316 con 20 tétradas. 18 tétradas dieron lugar a dos esporas viables de crecimiento rápido y dos esporas no viables. Dos tétradas dieron lugar a dos esporas viables de crecimiento rápido, una espora viable de crecimiento lento y una espora no viable. Todas las esporas de crecimiento rápido eran his-, erg+. Todas las esporas de crecimiento lento eran his+, erg -. Todas las esporas his+, erg -eran también ura-, indicando que pRS316 no segregaba en estas esporas durante la meiosis. Se estudió adicionalmente una de las esporas his+, erg -, y se denominó BTY20-2A.

[0194] Para confirmar que BTY19-9C y BTY20-2A no portaban el gen ERG9 natural, se realizó un

experimento de PCR usando ADN genómico aislado de las dos cepas y los oligonucleótidos VE104-5 y VE105-3.

5’oligo = VE104-5 = gac tct AGA AGC GGA AAA CGT ATA CAC

3’oligo = VE105-3 = descrito anteriormente

VE104-5 contiene secuencias correspondientes a la posición nº 11631 a 116541 de la secuencia de nº de acceso a GenBank U00030.

[0195] El tamaño de producto de PCR predicho para un gen ERG9 funcional era de 2,23 kb, y para la perturbación erg9∆::HIS3, de 2,87 kb. Las cepas BTY19-9C y BTY20-2A tenían un producto de PCR de aproximadamente 2,87 kb, que indicaba la presencia de la perturbación erg9∆::HIS3.

[0196] Se evaluó en cinco cepas (BKY1-2D, BKY1-7C, BKY1-8D, BTY19-9C y BTY20-2A) la producción de farnesol en matraces agitados. Las cepas BKY1-7C y BTY20-2A dieron la mejor producción de farnesol de las cinco cepas, pero BKY1-7C crecía muy lentamente.

[0197] Se transfirieron los transformantes KML505, KML510 y KML521 a medio de esporulación. Se disecaron tétradas sobre YPDE y se dejaron crecer durante periodos prolongados de tiempo en condiciones aeróbicas para buscar el crecimiento de esporas adicionales más allá de la segregación 2:2 anticipada (viable:no viable). Dos esporas adicionales fueron viables después de incubación adicional en condiciones aeróbicas. Estas dos cepas, BJY7-5D y BJY8-1A, producían farnesol en un cribado en tubo.

[0198] Se evaluaron las cepas BJY7-5D y BJY8-1A en matraces agitados. BJY8-1A dio la mejor producción de farnesol (0,29 mg/ml, 4,7% basado en el peso celular seco) después de 72 horas de incubación. BJY7-5D dio 0,18 mg de farnesol/ml, (3,5% basado en el peso celular seco).

Ejemplo 4

[0199] Este ejemplo muestra la sobreexpresión de HMG-CoA reductasa en cepas con y sin un gen ERG9 funcional.

[0200] La HMG-CoA reductasa se ha propuesto que es la enzima clave que regula el flujo de carbono a través de la ruta de isoprenoides. En S. cerevisiae, dos genes, HMG1 y HMG2, codifican las dos isozimas de la HMG-CoA reductasa, designadas HMGlp y HMG2p. Se consigue la regulación de la HMG-CoA reductasa mediante una combinación de regulación transcripcional y traduccional así como degradación de proteína. Los segmentos de los genes HMG1 y HMG2 que codifican los dominios catalíticos de las isozimas HMGlp y HMG2p se han clonado bajo el control transcripcional del promotor fuerte del gen GPD (3-fosfato de gliceraldehído deshidrogenasa). Se obtuvieron los plásmidos que contienen estas construcciones (pRH127-3 y pRH124-31, que contienen los dominios catalíticos de HMGlp y HMG2p, respectivamente) de R. Hampton, U.C. San Diego. Se ha notificado que las cepas de S. cerevisiae que sobreexpresan el dominio catalítico de HMGlp tienen un flujo elevado de carbono a través de la ruta de isoprenoides. Este flujo aumentado de carbono se manifestó como sobreproducción de escualeno y

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KpnI-SalI.

[0209] Para clonar el gen crtE, se aisló ADN genómico de E. uredovora cepa 2OD3 usando el kit de aislamiento de ADN genómico PureGene (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN). Se amplificó el gen crtE usando

5 ADN genómico y los dos siguientes oligonucleótidos. 5’oligo = 20D3Up gaattcGTTTATAAGGACAGCCCGA (SEQ ID NO:12) 3’oligo = 20D3Lo ctgcagTCCTTAACTGACGGCAGCGA (SEQ ID NO:13)

El oligo 20D3Up contiene las secuencias correspondientes a la posición nº 206 a la nº 224 de la secuencia de acceso a GenBank nº D90087. El oligo 20D3Lo contiene el complemento inverso de las secuencias de la posición nº 10 1117 a la nº 1136 del mismo fichero de secuencia de Genbank. Se ligó el ADN amplificado en el sitio SrfI de pCR-Script SK(+) (Stratagene, La Jolla, CA) generando el plásmido pSW1-B. Se digirió entonces este plásmido con EcoRI y SacI, se purificó el fragmento de 973 pb que contenía el gen crtE y se ligó con pAD314-956 digerido con EcoRI-SacI generando el plásmido pSW2B. Se digirió el plásmido pSW2-B con BamHI generando un fragmento de 2199 pb que contiene el promotor ADH1, la secuencia de codificación de crtE y el terminador ADH1, y se ligó este

15 fragmento en YEp352 digerido con BamHI generando pSW4A, que dispuso el gen crtE en la orientación opuesta a la del gen URA3 en el plásmido, y pSW4B, que dispuso el gen crtE en la misma orientación que el gen URA3.

[0210] Se generó el plásmido pADH313-956 de la siguiente manera. Se digirió el plásmido pRS313 (Sikorski y Hieter, 1989) con SacI y XbaI, se trató con ADN polimerasa T4 para crear extremos romos y se religó entonces

20 generando el plásmido pDSX313. Se digirió este plásmido con SmaI y ApaI, se trató con ADN polimerasa T4 creando extremos romos y se religó entonces generando pDSXSA313. El plásmido pAAH5 (Ammerer, G., 1983, Meth. Enzymol. 101: 192-201), que porta el promotor y terminador ADH1 separados por un sitio HindIII, se digirió con HindIII y se ligó entonces con los dos siguientes oligonucleótidos asociados para introducir un sitio de clonación múltiple y crear pAAH5-MCS.

25 5’ oligo =MCS1 AGCTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGCTCTAGAGTC GACCTGCAGGCATGCA (SEQ ID NO:14) 3’ oligo = MCS2 AGCTTGCATGCCTCCAGGTCGACTCTAGAGCC CG GGTACCGAGCTCGAATTC (SEQ ID NO:15)

30 [0211] Se efectuó una reacción de PCR que contenía pADH313-MCS como molde y los dos siguientes oligonucleótidos, y se obtuvo un producto de PCR de 1231 pb que contenía el promotor ADH1, el sitio de clonación múltiple y el terminador ADH1.

5’ oligo = ADH1A gacggatCCGTGGAATATTTCGGATATCC (SEQ ID NO:16) 3’ oligo = ADH1B ctcggatccGGACGGATTACAACAGGTATTGTCC (SEQ ID NO:17)

35 [0212] El oligo ADH1A contiene las secuencias correspondientes a la posición nº 16 a la nº 37 de la secuencia de nº de acceso a Genbank V01292. El oligo ADH1B contiene el complemento inverso de las secuencias de la posición nº 2092 a la nº 2116 del mismo fichero de secuencia de Genbank. Se digirió el producto de PCR de 1232 pb con BamHI y se ligó con pDSXSA313 digerido con BamHI, generando el plásmido pADH313-956.

40 [0213] Para clonar el gen a1-3 de N. crassa, se aisló ADN genómico de N. crassa cepa ATCC 14692 usando el procedimiento descrito por Borges y col. en la sección de procedimientos del sitio web del “Fungal Genetics Stock Center” (www.kumc.edu/research/fgsc/fgn37/borges.html). Se amplificó el gen mediante PCR usando los dos siguientes oligonucleótidos.

45 5’ oligo = VE118-5 cagaatTCACCATGGCCGTGACTTCCTCCTC (SEQ ID NO:18) 3’ oligo = VE119-3 caagatctCATACATTCAATCCTCATGGACAC (SEQ ID NO:19)

[0214] El oligo VE118-5 contiene las secuencias correspondientes a la posición nº 1216 a la nº 1240 de la secuencia de nº de acceso a Genbank U20940. El oligo VE119-3 contiene el complemento inverso de las

50 secuencias de la posición nº 2576 a la nº 2599 del mismo fichero de secuencia de Genbank. Se ligó el ADN amplificado en el sitio SrfI de pCR-Script SK(+) (Stratagene, La Jolla, CA) generando pSW7-1 y pSW7-2, dos clones de PCR independientes del gen a1-3. Se digirieron entonces estos dos plásmidos con EcoRI y BglII, se purificó el fragmento de 1393 pb que contiene el gen a1-3 y se ligó en pPGK digerido con EcoRI, BamHI (Kang y col., 1990) generando pSW9-1 y pSW9-2, con la secuencia al-3 en cada uno derivada de pSW7-1 y pSW7-2, respectivamente.

55 [0215] Para clonar el gen ggs, se preparó ADN genómico a partir de Gibberella fujikuoi cepa ATCC 12617, usando el mismo procedimiento descrito anteriormente para Neurospora. Se amplificó el gen ggs mediante PCR usando los dos siguientes oligonucleótidos.

5’ oligo = VE120-5 gagaattCTTAACACGCATGATCCCCACGGC (SEQ ID NO:20) 60 3’ oligo = VE121-3 ctggatcCGTCAAATCCGTGAATCGTAACGAG (SEQ ID NO:21)

[0216] El oligo VE120-5 contiene las secuencias correspondientes a la posición nº 607 a la nº 630 de la secuencia de acceso a Genbank VX96943. El oligo VE121-3 contiene el complemento inverso de las secuencias de la posición nº 1908 a la nº 1932 del mismo fichero de secuencia de Genbank. Se ligó el ADN amplificado en el sitio

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1. Se usa el caldo de fermentación completo no diluido o diluido apropiadamente con agua hasta un volumen final de 2,0 ml en un tubo de ensayo de vidrio tapado con teflón de 15 ml.

2.: Se añaden 2,0 ml de hexano.

3.: Se añaden 2,0 ml de metanol.

5 4. Se agita con vórtex el tubo a alta velocidad durante 3,5 minutos.

5.: Se centrifuga la muestra a 2.800 rpm en una centrífuga de mesa durante 25-30 minutos para separar las fases.

6.: Se retira el sobrenadante (fase orgánica) y se dispone en un vial de CG/EM de vidrio tapado con teflón de 2,0 ml para la determinación de farnesol y GG por CG/EM.

10 Ejemplo 8

[0233] El siguiente ejemplo demuestra el efecto de la amplificación de HMG-CoA reductasa sobre la producción de GG por una cepa que sobreexpresa GGPP sintasa.

15 [0234] En este experimento, se construyó una cepa que contenía una sola copia de un plásmido integrado en su genoma que permita a las células sobreexpresar la GGPP sintasa. El plásmido integrante es conocido como pSW35-42, y se construyó como sigue. Se digirió el plásmido pSW4A (véase el Ejemplo 5) con BamHI generando un fragmento de 2199 pb que contenía una fusión del promotor ADH1, la secuencia de codificación de crtE y el

20 terminador ADH1. Se ligó entonces este fragmento en YIp351 digerido con BamHI (Hill y col., 1986, “Yeast/E. coli Shuttle Vectors with Multiple Unique Restriction Sites”, YEAST 2:163-167) generando pSW35-42.

[0235] Para construir una cepa que contiene pSW35-42, se digirió este plásmido con la endonucleasa de restricción BstEII para introducir un solo corte en el gen LEU2. Se purificó el plásmido linealizado y se usó para 25 transformar la cepa SWE23-DL1 usando el procedimiento de LiOAc. Se seleccionaron los transformantes en que pSW35-42 se había integrado en el locus LEU2 en medio exento de leucina. Una de las cepas transformadas resultantes se designa como SWE23-DL1::pSW35-42. Se transformó entonces esta cepa con YEp352 (un vector de control vacío, Hill y col., 1986, YEAST 2: 163-167) o con pRH124-31 (contiene el dominio catalítico del gen HMG2, véase el Ejemplo 4), que dio como resultado las cepas SWE23-DL1::pSW35-42/YEp352 y SWE23-DL1::pSW35

30 42/pRH124, respectivamente. La cepa SWE23-DL1::pSW35-42/YEp352 sobreexpresa GGPP sintasa, mientras que la SWE23-DL1::pSW35-42/pRH124 sobreexpresa GGPP sintasa y HMG-CoA reductasa.

[0236] Se realizaron experimentos de fermentación de las cepas SWE23-DL1::pSW35-42/pRH124 y SWE23DL1::pSW35-42/Yep352 para comparar la producción de GG por estas dos cepas. Se ensayó en las cepas la

35 producción de GG en fermentadores de 1 l usando el protocolo descrito en el Ejemplo 1.H. Se presentan los datos de fermentación en la Tabla 20. Este experimento muestra que la fermentación de SWE23-DL1::pSW35-42/pRH124 acumulaba más GG que la fermentación de SWE23-DL1::pSW35-42/Yep352, y demuestra que la elevación de la actividad HMG-CoA reductasa en una cepa diseñada para producir GG daba como resultado una elevación adicional de los niveles de GG en comparación con una cepa similar con HMG-CoA reductasa no amplificada.

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TABLA 20

Cepa: Peso celular seco a las 192 h Farnesol a las 192 h GG a las 192 h

g/l
g/l: % de peso seco g/l % de peso seco

SWE23-∆L1::pSW3542/Yep352: 41,4 2,04 4,9 0,30 0,72

SWE23-∆L1::pSW3542/pRH124: 44,0 3,27 7,4 0,60 1,36

[0237] Se realizó un segundo enfoque para conseguir la sobreexpresión de HMG-CoA reductasa y GGPP sintasa en la misma cepa clonando ambos genes en un vector de levadura de alto número de copias y 45 transformando este plásmido en una cepa mutante erg9. El plásmido usado con este fin se designa como pSW46-1, y se construyó éste como sigue. Se digirió el plásmido pSW4A (véase el Ejemplo 5) con EcoRI y SacI, se purificó el fragmento de 0,9 kb que contenía el gen crtE y se ligó con pADH313-956 digerido con EcoRI, SacI generando pSW38-10. Se eliminaron dos regiones de este plásmido mediante digestión con enzimas de restricción, rellenando los extremos del ADN usando polimerasa Pfu y ligando para volver a formar el plásmido circular. Las regiones

50 eliminadas de esta manera estaban entre sitios NdeI y SpeI y entre sitios HindIII y PstI. El plásmido resultante se designa como pSW43-5. Se digirió el plásmido pSW43-5 con BamHI, se purificó el fragmento de 2199 pb resultante que contenía el promotor ADH1, el gen crtE y el terminador ADH1 (designado fragmento ADHp/crtE/ADHt) y se ligó en el sitio BamHI de YEp352. El plásmido resultante se designa como pSW44-17, y difiere de pSW4A en que contiene uno en lugar de dos sitios PstI.

55 [0238] Se digirió el plásmido pRH124-31 con XbaI y PstI y se clonó el fragmento de 3,2 kb que contiene el promotor GPD, el gen del dominio catalítico de HMG2 y el terminador PGK (designado fragmento

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[0270] Se digirió el plásmido pSW70 con XbaI y HindIII, y se purificó el fragmento de 2482 pb resultante que contenía el gen ERG10. Se digirió el plásmido pSW72-4 con XbaI y SacI y se purificó el fragmento de 2850 pb resultante que contenía el gen ERG13. Se ligaron entonces conjuntamente los dos fragmentos de ADN purificados con YEp351 digerido con SacI, HindIII (marcador seleccionable LEU2) generando pSW79-30. Este plásmido contiene los genes ERG13 y ERG10 y permite la sobreexpresión de acetoacetil CoA tiolasa y HMG-CoA sintasa.

[0271] Se transformó la cepa SW23B nº 74 (contiene 8 copias integradas del gen HMG2 cat, véase el Ejemplo 9) con pSW77-69 y pSW78-68, y se seleccionaron transformantes en medio SCE-ura. Las cepas resultantes se designan como SW23B nº 74/pSW77-69 y SW23B nº 74/pSW78-68, respectivamente. Estas cepas requieren leucina añadida para el crecimiento debido a la mutación leu2. Para eliminar la necesidad de suplementar estas cepas con leucina durante los experimentos de fermentación, se transformaron con un fragmento lineal de ADN que contenía un gen LEU2 funcional, y se aislaron los transformantes LEU+. Estas cepas se designan como SW23B nº 74L/pSW77-69 y SW23B nº 74L/pSW78-68, respectivamente.

[0272] Se transfomró la SW23B nº 74 también con pSW79-30, y se seleccionaron los transformantes en medio SCE-leu. La SW23B nº 74/pSW79-30 requiere uracilo puesto que contiene una mutación en el gen ura3. Para eliminar la necesidad de suplementar estas cepas con uracilo durante los experimentos de fermentación, se transformó esta cepa con un fragmento lineal de ADN que contenía un gen URA3 funcional, y se aislaron transformantes URA3+. Esta cepa se designa como SW23B nº 74U/pSW79-30.

[0273] Se transformó la SW23B nº 74 también tanto con pSW78-68 como con pSW79-30, y se aislaron transformantes que eran capaces de crecer en medio SCE-ura,-leu, indicando que los transformantes contenían ambos plásmidos. La cepa resultante se designa como SW23B nº 74/pSW78-68/pSW79-30.

[0274] Se llevaron a cabo experimentos de fermentación con las cepas descritas anteriormente para examinar el efecto de estas amplificaciones génicas sobre la producción de farnesol. Se ensayaron las cepas en fermentadores de 1 l usando el protocolo descrito en el Ejemplo 1.H, y se presentan los datos de estos experimentos en la Tabla 24.

TABLA 24

Cepa: Genes ampli- Tiempo de ferm. Peso celular seco Farnesol Mevalonato

ficados: (h) g/l g/l % de peso seco g/l % de peso seco

SW23B nº 74/pTWM138: HMG2cat 215 45,5 4,95 10,88 0,2 0,4

SW23B nº: HMG2cat, 287 41,6 4,67 11,23 0 0

74L/pSW77-69: ERG8,

ERG12,

ERG19

SW23B nº: HMG2cat, 215 46,4 4,87 10,50 0 0

74L/pSW78-68: ERG8, ERG12,

ERG19,

IDI1

SW23B nº 74U/: HMG2cat, 215 46,1 4,63 10,04 5,4 11,7

pSW79-30: ERG10,

ERG13

[0275] Estos datos muestran que una cepa que sobreexpresa HMG-CoA reductasa acumula el intermedio de la ruta de isoprenoides mevalonato en el medio de cultivo. Puesto que la acumulación de mevalonato no se observa en cepas con niveles normales de HMG-CoA reductasa, esto demuestra que ha aumentado el flujo de carbono a través de la ruta de isoprenoides por la amplificación de HMG-CoA reductasa hasta el punto en que otra etapa posterior a la HMG-CoA reductasa limita la conversión de los intermedios de la ruta. Además, la sobreexpresión de las primeras tres enzimas de la ruta de isoprenoides, a saber acetoacetil CoA tiolasa, HMG-CoA sintasa y HMG-CoA reductasa (codificadas por ERG13, ERG10 y HMG2cat, respectivamente) conducía a una acumulación aún mayor de mevalonato en el medio. Esto demuestra que el flujo de carbono en la ruta de isoprenoides ha aumentado adicionalmente por la amplificación de las tres primeras etapas, y destaca que una de las enzimas más adelante de la HMG-CoA reductasa limita la conversión de los intermedios de la ruta de isoprenoides. Puesto que el mevalonato sirve como precursor de farnesol y GG, las modificaciones descritas anteriormente pueden usarse para incrementar el flujo de carbono en la ruta de isoprenoides y, si el mevalonato puede metabolizarse más eficazmente, puede conducir a una acumulación de farnesol y GG aumentada.

[0276] Con respecto a este último punto, se amplificaron las enzimas más adelante de HMG-CoA reductasa en una cepa que sobreexpresaba HMG-CoA reductasa. Las enzimas amplificadas eran HMG-CoA reductasa,

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menos uno de dichos segundo, tercero y cuarto restos olefínicos de dicho geranilgeraniol para formar un alcohol alílico; y (b) formar α-tocoferol o un éster de α-tocoferilo a partir de dicho alcohol alílico y una hidroquinona.

3. El procedimiento del párrafo 2, en el que dicha etapa de reducción (a) comprende: añadir un grupo protector a

5 dicho geranilgeraniol para proteger de la reducción el primer resto olefínico de dicho geranilgeraniol; y reducir al menos uno de los segundo, tercero y cuarto restos olefínicos de dicho geranilgeraniol protegido; y eliminar dicho grupo protector de dicho geranilgeraniol protegido para proporcionar dicho alcohol alílico.

4. El procedimiento del párrafo 3, en el que dicho grupo protector es un grupo protector de hidroxilo. 10

5.: El procedimiento del párrafo 4, en el que dicho grupo protector de hidroxilo es un éster.

6.: El procedimiento del párrafo 5, en el que dicho éster se selecciona del grupo que consiste en isobutirato y

pivaloato. 15

7.: El procedimiento del párrafo 2, en el que dicha etapa de reducción comprende la hidrogenación.

8.: El procedimiento del párrafo 2, en el que dicho alcohol alílico comprende fitol.

20 9. El procedimiento del párrafo 2, en el que la formación de dicho α-tocoferol o un éster de α-tocoferilo comprende poner en contacto dicho alcohol alílico con un ácido en presencia de dicha hidroquinona.

10. El procedimiento del párrafo 2, en el que dicha hidroquinona es una trimetil hidroquinona.

25 11. El procedimiento del párrafo 10, en el que dicha hidroquinona de trimetilo es la 2,3,5-trimetil hidroquinona.

12. El procedimiento del párrafo 1, en el que dicho compuesto es farnesol y en el que dicha etapa de convertir químicamente comprende: (a) convertir farnesol a un primer intermedio que comprende átomos de carbono suficientes para formar un grupo sustituyente trimetiltridecilo de vitamina E cuando dicho intermedio se hace

30 reaccionar con una hidroquinona para formar la vitamina E; y (b) hacer reaccionar dicho compuesto intermedio con una hidroquinona para formar la vitamina E.

13. El procedimiento del párrafo 12, en el que dicha etapa de conversión comprende: oxidar dicho farnesol a

farnesal; y formar una metil cetona a partir de dicho farnesal. 35

14. El procedimiento del párrafo 13, que comprende además: reducir restos olefínicos en dicha metil cetona para formar una alquil metil cetona; y formar un alcohol alílico a partir de dicha alquil metil cetona.

15. El procedimiento del párrafo 12, en el que dicho intermedio comprende isofitol. 40

16.: El procedimiento del párrafo 12, en el que dicha hidroquinona es una trimetil hidroquinona.

17.: El procedimiento de la sección 16, en el que dicha trimetil hidroquinona es la 2,3,5-trimetil hidroquinona.

45 18. El procedimiento del párrafo 1, en el que dicho compuesto es farnesol y en el que dicha etapa de convertir químicamente comprende: (a) oxidar dicho farnesol a farnesal; (b) formar una metil cetona a partir de dicho farnesal;

(c) reducir restos olefínicos en dicha metil cetona para formar una alquil metil cetona; (d) formar un alcohol alílico a partir de dicha alquil metil cetona, en el que dicho alcohol alílico comprende un número suficiente de átomos de carbono para formar al menos un grupo sustituyente trimetiltridecilo de vitamina E cuando la vitamina E se forma a

50 partir de dicho alcohol alílico y una hidroquinona correspondiente; y (e) formar la vitamina E a partir de dicho compuesto y una hidroquinona.

19. El procedimiento del párrafo 18, en el que dicho alcohol alílico comprende isofitol.

55 20. El procedimiento del párrafo 18, en el que dicha hidroquinona es una trimetil hidroquinona.

21. El procedimiento del párrafo 20, en el que dicha trimetil hidroquinona es 2,3,5-trimetil hidroquinona.

22. El procedimiento del apartado 1, en el que dicho compuesto es farnesol. 60

23.: El procedimiento del apartado 1, en el que dicho compuesto es geranilgeraniol.

24.: Un procedimiento para producir α-tocoferol o ésteres de α-tocoferilo que comprende: (a) cultivar un microorganismo en un medio de fermentación para producir un producto seleccionado del grupo que consiste en

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102.: El procedimiento del párrafo 94, en el que dicho microorganismo es un mutante erg9.

103.: El procedimiento del párrafo 102, en el que dicho microorganismo comprende un alelo de supresión/inserción

erg9a::HIS3. 5

104.: El procedimiento del párrafo 94, en el que dicha etapa de recuperación comprende la recuperación de dicho producto de dicho microorganismo.

105.: El procedimiento del párrafo 94, en el que dicho producto se secreta en dicho medio de fermentación por dicho

10 microorganismo y en el que dicha etapa de recuperación comprende la purificación de dicho producto de dicho medio de fermentación.

106. El procedimiento del párrafo 94, en el que dicho producto es fosfato de geranilgeranilo intracelular y

geranilgeraniol intracelular y extracelular y dicha etapa de recuperación comprende aislar dicho fosfato de 15 geranilgeranilo y geranilgeraniol de dicho microorganismo y aislar geranilgeraniol de dicho medio de fermentación.

107. El procedimiento del párrafo 94, en el que dicho producto es fosfato de geranilgeranilo intracelular y dicha etapa de recuperación comprende además desfosforilar dicho fosfato de geranilgeranilo para producir geranilgeraniol.

20 108. El procedimiento del párrafo 94, en el que dicho microorganismo es un hongo.

109. El procedimiento del párrafo 108, en el que dicho hongo ha sido modificado genéticamente para expresar al menos una parte de las enzimas en la ruta independiente de mevalonato.

25 110. El procedimiento del párrafo 109, en el que dicho hongo ha sido modificado genéticamente para expresar una enzima seleccionada del grupo que consiste en D-1-desoxixilulosa 5-fosfato sintasa, y 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato reductoisomerasa.

111.: El procedimiento del párrafo 108, en el que dicho hongo es una levadura y dicha levadura es bloqueada en la 30 ruta de ergosterol y se modifica genéticamente para captar esteroles exógenos en condiciones aeróbicas.

112. El procedimiento del párrafo 94, en el que dicho microorganismo es una bacteria.

113.: El procedimiento del párrafo 112, en el que dicha bacteria ha sido modificada genéticamente para expresar al 35 menos una parte de las enzimas en la ruta del mevalonato.

114. El procedimiento del párrafo 113, en el que dicha bacteria ha sido modificada genéticamente para expresar una enzima seleccionada del grupo que consiste en acetoacetil Co-A tiolasa, HMG-CoA sintasa, HMG-CoA reductasa, mevalonato quinasa, fosfomevalonato quinasa, y fosfomevalonato descarboxilasa.

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115.: El procedimiento del párrafo 94, en el que dicho microorganismo es una microalga.

116.: El procedimiento del párrafo 115, en el que dicha microalga se selecciona del grupo que consiste en Chlorella y

Prototheca. 45

117. Un microorganismo para la producción de geranilgeraniol mediante un proceso biosintético, teniendo dicho microorganismo una modificación genética para reducir la acción de la escualeno sintasa en dicho microorganismo y una modificación genética para incrementar la acción de una proteína seleccionada del grupo que consiste en acetoacetil Co-A tiolasa, HMG-CoA sintasa, HMG-CoA reductasa, mevalonato quinasa, fosfomevalonato quinasa,

50 fosfomevalonato descarboxilasa, isopentenil pirofosfato isomerasa, farnesil pirofosfato sintasa, D-1-desoxixilulosa 5fosfato sintasa, y 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato reductoisomerasa.

118. El microorganismo del párrafo 117, en el que dicha modificación genética para incrementar la acción de una

proteína comprende integrar múltiples copias de genes para dicha proteína en el genoma de dicho microorganismo. 55

119. El microorganismo del párrafo 117, en el que dicha modificación genética para incrementar la acción de una proteína aumenta la expresión de un gen que codifica dicha proteína.

120. El microorganismo del párrafo 117, en el que dicho microorganismo modificado genéticamente es un mutante 60 erg9.

121. Un procedimiento para producir vitamina A a partir de farnesol que comprende: (a) preparar un compuesto polienocarbonilo α,β-insaturado a partir de farnesol; y (b) ciclar dicho compuesto polienocarbonilo α,β-insaturado para formar un compuesto polienocarbonilo α,β-insaturado cíclico; y (c) convertir dicho compuesto polienocarbonilo

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