MXPA01000216A

MXPA01000216A - Metodo para producir vitamina.

Info

Publication number: MXPA01000216A
Application number: MXPA01000216A
Authority: MX
Inventors: Gabriel G Saucy
Original assignee: Dcv Inc Haciendo Negocios Como
Priority date: 1998-07-06
Filing date: 1999-07-06
Publication date: 2002-10-17
Also published as: DK1947189T3; CA2331343A1; ATE537265T1; EP2100963A1; CA2331343C; MX276941B; CA2831321A1; EP1095002A1; DK2305825T3; ATE490332T1; CA2831321C; WO2000001650A1; ES2379212T3; MX219130B; JP2002519049A; DE69943009D1; CN1330621A; EP2100963B1; EP1947189A3; ES2534937T3

Abstract

La invencion proporciona un metodo para producir ?-tocoferol y esteres de ?-tocoferilo, y un metodo para producir vitamina A o ?-caroteno. Los metodos comprenden utilizar un sistema biologico para producir farnesol o geranilgeraniol. Luego, el farnesol o el geranilgeraniol se convierte quimicamente en ?-tocoferol, un ester de ?-tocoferilo, vitamina A, o ?-caroteno.

Description

MÉTODO PARA PRODUCIR VITAMINA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos para producir vitaminas, particularmente vitaminas A y E, y compuestos relacionados.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La vitamina E (d-alfa-tocoferol, 1) es un complemento nutritivo importante en seres humanos y animales.

El compuesto 1 se obtiene comercialmente mediante aislamiento a partir de una variedad de aceites de plantas, o semisintéticamente mediante metilación del anillo del d-gamma-tocoferol relacionado que se presenta naturalmente 2. Una fuente más importante de vitamina E es la síntesis total, que proporciona d, 1-alfa-tocoferol 3. Aunque es una mezcla de isómeros, el 3 proporciona mucha de la actividad biológica del 1, y se utiliza ampliamente debido a su costo más bajo y a su mayor disponibilidad. Para una discusión general de la vitamina E, ver L. Machlin, Editor, "Vitamin E: A Comprehensive Treatise" , Marcel Dekker, NY, 1980.

El d, 1-alfa-tocoferol 3 se obtiene mediante la reacción de trimetilhidroquinona 4 con fitol 5 o isofitol 6 en la presencia de un catalizador ácido, con frecuencia un ácido de Lewis, tal como cloruro de zinc. Esta tecnología fue revisada por S. Kasparek en L. Machlin, editor, Vitamin E: A Comprehensive Treatise, capítulo 2, páginas 8-65, Marcel Dekker, NY, 1965. Las referencias 140-166 de este capxtulo proporcionan las referencias primarias para los métodos detallados de la preparación del compuesto 3.

El isofitol 6 o el fitol 5 requeridos para la preparación del 3, se obtienen a través de una síntesis de múltiples pasos. Los materiales de partida normalmente incluyen acetona (ver Kasparek, en Machlin, Vitamin E: A Comprehensive Treatise, páginas 44-45, Dekker, NY 1980, y las referencias citadas en el mismo) , y el trímero de isopreno cíclico (Pond y colaboradores, Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 3,917,710 y 3,862,988 (1975)). En adición, el gamma-tocoferol fue primeramente hecho mediante síntesis total por Jacob, Steiger, Todd, y Wilcox (J Chem. Soc. 1939. 542) . Estos colaboradores produjeron la vitamina mediante la reacción del éster de monobenzoato de 2 , 3-dimetilhidroquinona con bromuro de fitilo en la presencia de cloruro de zinc, seguido por la remoción del benzoato, para dar un bajo rendimiento (22 por ciento) de gamma-tocoferol . Las síntesis publicadas de los tocoferoles y los tocotrienoles fueron revisadas por S. Kasparek en L. Machlin, "Vitamin E - A Comprehensive Treatise", Dekker, NY, 1980; sin embargo, no se han registrado métodos adicionales para la preparación de gamma-tocoferol . A pesar de los diferentes métodos conocidos para la preparación o el aislamiento de miembros de la familia de compuestos de vitamina E, sigue existiendo una necesidad de métodos mejorados y más eficientes de producción. La vitamina A (retinol) y la provitamina A ß-caroteno se utilizan en productos farmacéuticos, en fortificación de alimentos, y en complementos dietéticos. El acetato de vitamina A (acetato de retinilo) , el propionato de vitamina A (propionato de retinilo) , y el palmitato de vitamina A (palmitato de retinilo) , son los derivados de vitamina A más generalmente utilizados. Toda la vitamina A, esteres de vitamina A, y ß-caroteno actualmente producidos comercialmente, se producen mediante una síntesis química total, excepto por alguna vitamina A que se aisla a partir de fuentes de alimentos. Ver en general Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, volumen 24, páginas 140-158 (tercera edición, 1984) . Sigue existiendo una necesidad de métodos mejorados y económicos de producción de vitamina A y esteres de vitamina A.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura ÍA ilustra una representación diagramática de la ruta biosintética de isoprenoide dependiente del mevalonato. La Figura IB ilustra una representación diagramática de la ruta biosintética de isoprenoide independiente del mevalonato . La Figura 2 ilustra una modalidad de una ruta para la síntesis química de vitamina E a partir de geranilgeraniol . La Figura 3 ilustra una modalidad de una ruta para la síntesis química de vitamina E a partir de farnesol .

La Figura 4 ilustra el crecimiento y la producción de farnesol de cepas derivadas a partir de la cepa MBNA1-13. La Figura 5 ilustra el crecimiento de las cepas de tipo silvestre, erg9 , y ERG9 reparada. La Figura 6 ilustra la producción de farnesol en microorganismos con una producción amplificada de HMG-CoA-reductasa. La Figura 7 ilustra la producción de farnesol y GG en cepas que sobreexpresan las sintasas GGPP. La Figura 8 ilustra el efecto de la producción amplificada de FPP-sintasa sobre la producción de farnesol y GG. La Figura 9 ilustra la ruta para la conversión metabólica de isoprenol y prenol a farnesol. La Figura 10 ilustra una ruta de síntesis química para la producción de acetato de vitamina A a partir, de farnesol . La Figura 11 ilustra una ruta de síntesis - química alternativa para la producción de acetato de vitamina A a partir de farnesol . La Figura 12 ilustra un método para la preparación de ß-caroteno a partir de retinal utilizando una reacción de acoplamiento de carbonilo. La Figura 13 ilustra un método para la preparación de ß-caroteno utilizando una reacción de alquilación.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN 1.0 Introducción La presente invención proporciona un método para la producción de a-tocoferol y esteres de a-tocoferilo, en donde se utiliza un sistema biológico para producir farnesol o geranilgeraniol (GG) . El farnesol se puede utilizar como un material de partida para sintetizar químicamente el producto final, esteres de a-tocoferilo. De una manera alternativa, el farnesol se puede convertir químicamente a GG. El GG, producido biológicamente o mediante síntesis a partir de farnesol, se puede utilizar entonces como un material de partida para hacer a-tocoferilo y esteres de a-tocoferilo . La presente invención también incluye diferentes aspectos de los materiales biológicos y los intermediarios útiles en la producción de farnesol o GG mediante producción biológica. La presente invención también incluye métodos para la producción de a-tocoferol y esteres de a-tocoferilo, utilizando farnesol y/o GG producidos por cualquier medio como el material de partida . La presente invención también se refiere a un método para la producción de vitamina A a partir de farnesol. En una modalidad preferida, el farnesol se produce biológicamente . 2.0 Producción biológica de farnesol y GG. Los isoprenoides son la familia más grande de productos naturales, con aproximadamente 22,000 diferentes estructuras conocidas. Todos los isoprenoides se derivan a partir del compuesto C5, pirofosfato de isopentilo (IPP) . Por consiguiente, los esqueletos de carbono de todos los compuestos isoprenoides son creados mediante adiciones en secuencia de las unidades C5 a la cadena poliprenoide en crecimiento . Aunque los pasos biosintéticos que conducen de IPP a los isoprenoides son universales, existen dos rutas que llevan al IPP. Los hongos (tales como levadura) y los animales poseen la ruta dependiente del mevalonato bien conocida (ilustrada en la Figura ÍA) , que utiliza acetil-CoA como el precursor inicial . Las bacterias y las plantas superiores, por otra parte, poseen una ruta independiente del mevalonato recién descubierta, también referida en la presente como la ruta sin mevalonato (ilustrada en la Figura IB) que conduce desde el piruvato y el 3 -fosfato de gliceraldehído [Lois y colaboradores, Proc . Natl . Acad. Sci . EUA, 95, 2105-2110 (1998) ; Rohmer y colaboradores, J. Am. Chem . Soc . 118, 2564-2566 (1996); Arigoni y colaboradores, Proc . Natl . Acad. Sci . EUA, 94, 10600-10605 (1997); Lange y colaboradores, Proc . Na tl . Acad. Sci . EUA, 95, 2100-2104 (1998)]. En las plantas (incluyendo microalgas) , existe evidencia de que existen ambas rutas dependiente e independiente del mevalonato, siendo la primera citosólica, y siendo la última plastídica [Arigoni y colaboradores, Proc. Na tl . Acad. Sci . EUA, 94, 10600-10605 (1997); Lange y colaboradores, Proc. Natl . Acad. Sci . EUA 95, 2100-2104 (1998)] . Se han establecido varios pasos de la ruta independiente del mevalonato. El primer paso, catalizado por D-l-desoxixilulosa/5-fosfato/sintasa, forma el 5-fosfato de D-1-desoxixilulosa a partir de piruvato y 3 -fosfato de gliceraldehído. Los segundo y tercer pasos, catalizados por ' D-l-desoxixilulosa/5-fosfato/reductoisomerasa, catalizan la conversión del 5-fosfato de D-1-desoxixilulosa a 2-C-metxl-D- eritritol-4-P (MEP) . Se requieren varias reacciones adicionales para convertir el MEP a IPP, y estas enzimas se desconocen- en este momento [Lois y colaboradores, Proc. Natl . Acad. Sci . EUA 95, 2105-2110 (1998); Takahashi y colaboradores, Proc . Natl . Acad. Sci . EUA, 95, 2100-2104 (1998); Duvold y colaboradores, Tetrahedron Letters, 38, 4769-4772 1997) ] . El farnesol y el GG son alcoholes prenílicos producidos mediante la desfosforilación de pirofosfato de farnesilo (FPP) y pirofosfato de geranilgeranilo (GGPP) , respectivamente. El FPP y el GGPP son intermediarios en la biosíntesis de los compuestos isoprenoides, incluyendo esteróles, ubiquinonas, heme, dolicoles, y carotenoides, y se utilizan en la prenilación posterior a la traducción de las proteínas. Tanto el FPP como el GGPP se derivan a partir de IPP. Las modalidades de la presente invención incluyen la producción biológica de farnesol ó GG en cultivos celulares procarióticos o eucarióticos y en sistemas exentos de células, sin importar si el organismo utiliza la ruta dependiente o independiente del mevalonato para la biosíntesis del precursor de todos los isoprenoides, IPP. La referencia en la presente a fosfato de farnesilo o fosfato de geranilgeranilo se refiere a los respectivos compuestos de mono-, di-, y tri-fosfato, a menos que se designe específicamente una forma específica. 2.1 Microorganismo Modificado Los sistemas biológicos adecuados para la producción de farnesol y GG incluyen los cultivos celulares procarióticos y eucarióticos, y los sistemas exentos de células. Los sistemas biológicos preferidos incluyen los sistemas fúngicos, bacterianos, y microalgales . Los sistemas biológicos más preferidos son los cultivos celulares fúngicos, más preferiblemente un cultivo celular de levadura, y muy preferiblemente un cultivo celular de Saccharomyces cerevisiae . Los hongos se prefieren debido a que tienen una larga historia de uso en los procesos industriales, y se pueden manipular tanto mediante técnicas microbiológicas 1 clásicas como de ingeniería genética. La levadura en particular está bien caracterizada genéticamente. En realidad, se ha secuenciado todo el genoma de S. cerevisiae, y ya se han clonado los genes que codifican para las enzimas en la ruta isoprenoide. También, S. cerevisiae crece hasta altas densidades celulares, y se han reportado cantidades de escualeno y ergosterol (ver la figura 1) hasta el 16 por ciento del peso celular seco en las cepas genéticamente diseñadas. Para una revisión reciente de la ruta isoprenoide en levadura, ver Parks y Casey, Appu. Rev. Microbiol . 49:95-116 (1995) . El procariote preferido es E. coli . E. coli está bien establecido como un microorganismo industrial utilizado en la producción de metabolitos (aminoácidos, vitaminas), y varias proteínas recombinantes. También se ha secuenciado el genoma entero .de E. coli , y los sistemas genéticos están altamente desarrollados. Como se mencionó anteriormente, E. coli utiliza la ruta independiente del mevalonato para la síntesis de IPP. Se han clonado y secuenciado los genes de E. coli , dxs , dxr, idi , e ispA, que codifican D-l-desoxixilulosa/5-fosfato/sintasa, D-l-desoxixilulosa/5-fosfato/reductoisomerasa, IPP-isomerasa, y FPP-sintasa, respectivamente [Fujisaki y colaboradores, J. Biochem. 108, 995-1000 (1990); Lois y colaboradores, Proc. Na tl . Acad . Sci . EUA 95, 2105-2110 (1998); Hemmi y colaboradores, J". Biochem. , 123, 1088-1096 1998) ] . Las microalgas preferidas para utilizarse en la presente invención incluyen Chlorella y Prototheca . Los organismos adecuados útiles en la producción de farnesol y GG están disponibles a partir de numerosas fuentes, tales como la American Type Culture Collection (ATCC) , Rockville, MD, Culture Collection of Algae (UTEX) , Austin, TX, el Northern Regional Research Laboratory (NRRL) , Peoría, IL, y el E. coli Genetics Stock Center (CGSC) , New Haven, CT. En particular, existen colecciones de cultivos de S. cerevisiae que se han utilizado para estudiar la ruta isoprenoide, que están disponibles, por ejemplo, en Jasper Riñe en la Universidad de California, Berkeley, CA, y en Leo Parks, en la Universidad del Estado de Carolina del Norte, Raleigh, NC . De preferencia, las células utilizadas en el cultivo celular se modifican genéticamente para incrementar el rendimiento de farnesol o GG. Las células se pueden modificar genéticamente mediante técnicas de ingeniería genética (es decir, tecnología recombinante) , técnicas microbiológicas clásicas, o una combinación de estas técnicas, y también pueden incluir variantes genéticas que se presenten naturalmente. Algunas de estas técnicas se dan a conocer en general, por ejemplo, en Sambrook y colaboradores, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Labs Press. La referencia de Sambrook y colaboradores, ibid. , se incorpora como referencia a la presente en su totalidad. El microorganismo genéticamente modificado puede incluir un microorganismo en donde se hayan insertado, suprimido, o modificado las moléculas de ácidos nucleicos (es decir, mutado; por ejemplo mediante inserción, supresión, sustitución, y/o inversión de nucleótidos) , de tal manera que estas modificaciones proporcionen el efecto deseado de mayores rendimientos de farnesol ó GG dentro del microorganismo ^o en el sobrenadante del cultivo. Como se utilizan en la presente, las modificaciones genéticas que dan como resultado una reducción en la expresión genética, en la función del gen, o en la función del producto genético (es decir, la proteína codificada por el gen) pueden ser referidas como inactivación (completa o parcial) , supresión, interrupción, bloqueo, o reducción de un gen. Por ejemplo, una modificación genética en un gen que dé como resultado una reducción en la función de la proteína codificada por este gen, puede ser el resultado de una supresión completa del gen (es decir, el gen no existe, y por consiguiente, la proteína no existe) , una mutación en el gen que dé como resultado una traducción incompleta o ninguna traducción de la proteína (por ejemplo, la proteína no se expresa), o una mutación en el que reduzca o elimine la función natural de la proteína (por ejemplo, se expresa una proteína que tiene una actividad enzimática reducida o ninguna actividad enzimática) . Las modificaciones genéticas que dan como resultado un incremento en la expresión o función genética, pueden ser referidas como amplificación, sobreproducción, sobreexpresión, activación, potenciamiento, adición, o aumento de un gen. La adición de genes clonados para incrementar la expresión genética puede incluir mantener los genes clonados sobre plásmidos de réplica, o integrar los genes clonados en el genoma del organismo de producción. Además, el incremento de la expresión de los genes clonados deseados puede incluir enlazar operativamente los genes clonados con elementos de control de transcripción nativos o heterólogos. 2.1.1. Modificaciones de Sintasa de Escualeno Las modalidades de la presente invención incluyen la producción biológica de farnesol ó GG, mediante el cultivo de un microorganismo, de preferencia levadura, que se haya modificado genéticamente para modular la actividad de una o más de las enzimas en su ruta biosintética isoprenoide. En una modalidad, se ha modificado genéticamente un microorganismo mediante reducción (incluyendo eliminación) de la acción de la actividad de sintasa de escualeno (ver la Figura 1) . Por ejemplo, los mutantes de levadura ergr9 que son incapaces de convertir el mevalonato en escualeno, y que acumulan farnesol, ya se han producido. Karst y Lacroute, Molec . Genet . , ISA, 269-277 (1977); Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,589,372. Como se utiliza en la presente, la referencia al mutante o mutación erg9 , se refiere en general a una modificación genética que reduce la acción de la sintasa de escualeno, tal como mediante el bloqueo o la reducción de la producción de la sintasa de escualeno, reduciendo la actividad de la sintasa de escualeno, o inhibiendo la actividad de la sintasa de escualeno, lo cual da como resultado la acumulación de difosfato de farnesilo (FPP) , a menos que el FPP se convierta ' de otra manera en otro compuesto, tal como farnesol, mediante la actividad de fosfatasa. El bloqueo o la reducción de la producción de la sintasa de escualeno puede incluir colocar el gen ERGS bajo el control de un promotor que requiera de la presencia de un compuesto inductor en el medio de cultivo. Mediante el establecimiento de las condiciones tales que el inductor llegue a agotarse del medio, se podría desactivar la expresión de ERG9 (y por consiguiente, la síntesis de sintasa de escualeno) . También, algunos promotores se desactivan mediante la presencia de un compuesto represor. Por ejemplo, los promotores a partir de los genes de levadura CTR3 ó CTR1 se pueden reprimir mediante la adición de cobre. El bloqueo o la reducción de la actividad de sintasa de escualeno, también podría incluir la utilización de un planteamiento de tecnología de separación similar al descrito en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,473,546, incorporada a la presente como referencia. En este planteamiento, se clona el gen ERG9 entre secuencias genéticas específicas que permitan la separación específica y controlada del gen ERG9 del genoma. La separación se podría provocar mediante, por ejemplo, un cambio en la temperatura de cultivo, como en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,473,546, o mediante alguna otra señal física o nutritiva. Esta modificación genética incluye cualquier tipo de modificación, e incluye específicamente las modificaciones hechas mediante tecnología recombinante y mediante mutagénesis clásica. Los inhibidores de sintasa de escualeno son conocidos (ver la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,871,721, y las referencias citadas en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,475,029), y se pueden agregar a los cultivos celulares. En otra modalidad, se modifica genéticamente un organismo que tenga la ruta independiente del mevalonato de biosíntesis de isoprenoide (tal como E. coli) , de tal manera que acumule FPP y/o farnesol. Por ejemplo, se esperaría que la reducción de la actividad de octaprenil-pirofosfato-sintasa (el producto del gen ispB) daría como resultado la acumulación de FPP en E. coli (Asai y colaboradores, Biochem. Biophys. Res. Comm. 2_Q2, 340-345 (1994) ) . La acción de una fosfatasa podría dar como resultado además la acumulación de farnesol en E. coli .

Las cepas de levadura necesitan ergosterol para la fluidez de la membrana celular, de modo que los mutantes bloqueados en la ruta de ergosterol, tales como los mutantes erg9 , necesitan de ergosterol extraño u otros esteróles agregados al medio para que las células permanezcan viables. Las células normalmente no pueden utilizar este esterol adicional, a menos que se cultiven bajo condiciones anaeróbicas. Por consiguiente, una modalidad adicional de la presente invención es el uso de una levadura, en donde se reduzca la acción de la sintasa de escualeno, tal como un mutante erg9 , y que recupere los esteróles exógenamente suministrados bajo condiciones aeróbicas. Las modificaciones genéticas que permiten a la levadura utilizar los esteróles bajo condiciones aeróbicas se demuestran más adelante en la sección de Ejemplos (ver el ejemplo 1) , y también se conocen en la materia. Por ejemplo, estas modificaciones genéticas incluyen upe (mutación de control de recuperación, que permite a las células recuperar los esteróles bajo condiciones aeróbicas) , y heml (el gen HEM1 codifica la sintasa del ácido aminolebulínico, que es el primer paso comprometido para la ruta biosintética de heme a partir de FPP, y los mutantes heml son capaces de recuperar el ergosterol bajo condiciones aeróbicas en seguida de una interrupción en la ruta biosintética de ergosterol, en el entendido de que los cultivos sean suplementados con ácidos grasos insaturados) . Se pueden producir cepas de levadura que tengan estas mutaciones utilizando técnicas conocidas, y también están disponibles con, por ejemplo, Dr. Leo Parks, Universidad del Estado de Carolina del Norte, Raleigh, NC. Se pueden utilizar células haploides que contengan estas mutaciones, para generar otros mutantes mediante cruzas genéticas con otras células haploides. También, se puede utilizar la sobreexpresión del gen SUT1 (recuperación de esterol) , para permitir la recuperación de esteróles bajo condiciones aeróbicas. El gen SÜT1 se ha clonado y secuenciado. Bourot y Karts, Gene , 1=JL_ 97-102 (1995) . En una modalidad adicional, los microorganismos de la presente invención se pueden utilizar para producir farnesol y/o GG mediante el cultivo de microorganismos en la presencia de un inhibidor de sintasa de escualeno. De esta manera, se reduce la acción de la sintasa de escualeno. Los inhibidores de sintasa de escualeno son conocidos por los expertos en este campo. (Ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,556,990). 2.1.2. Modificaciones de HMG-CoA-Reductasa Una modalidad adicional de la presente invención es el uso de un microorganismo que se haya modificado genéticamente para incrementar la acción de la HMG-CoA-reductasa. Se debe observar que la referencia al incremento de la acción de HMG-CoA-reductasa y otras enzimas discutidas en la presente, se refiere a cualquier modificación genética en el microorganismo en cuestión que dé como resultado una mayor funcionalidad de las enzimas, e incluye una actividad más alta de las enzimas, una inhibición o degradación reducida de las enzimas, y una sobreexpresión de las enzimas. Por ejemplo, se puede incrementar el número de copias genéticas ( se pueden incrementar los niveles de expresión mediante el uso de un promotor que dé más altos niveles de expresión que aquél del promotor nativo, o se puede alterar un gen mediante ingeniería genética o mediante mutagénesis clásica para incrementar la actividad de una enzima. Una de las enzimas clave en la ruta biosintética isoprenoide dependiente del mevalonato es la HMG-CoA-reductasa, que cataliza la reducción de 3 -hidroxi-3 -metilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) . Este es el primer paso primario limitante de la velocidad e irreversible en la ruta, y el incremento en la actividad de HMG-CoA-reductasa conduce a rendimientos más altos de escualeno y ergosterol en una cepa de tipo silvestre de S. cerevisiae, y farnesol en una cepa erg9. Un mecanismo mediante el cual se puede incrementar la acción de la HMG-CoA-reductasa, es mediante la reducción de la inhibición de la enzima, mediante la modificación genética de la enzima, o bien mediante la modificación del sistema para remover el inhibidor. Por ejemplo, tanto el producto de esterol como el que no es de esterol de lá retroalimentación de la ruta isoprenoide inhiben esta enzima (ver, por ejemplo, Parks y Casey, Appu. Rev. Microbiol . 49:95-116 (1995)). De una manera alternativa o en adición, los genes que codifican para la HMG-CoA-reductasa, se pueden alterar mediante ingeniería genética o mediante técnicas de mutagénesis clásica, para reducir o prevenir la inhibición. También, la acción de HMGCoA-reductasa se puede incrementar mediante el incremento del número de copias genéticas, mediante el incremento del nivel de expresión de los genes de HMG-CoA-reductasa, o mediante la alteración de los genes de HMG-CoA-reductasa mediante ingeniería genética o mutagénesis clásica, para incrementar la actividad de la enzima. Ver la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,460,949, cuyo contenido total se incorpora a la presente como referencia. Por ejemplo, se han producido HMG-CoA-reductasas truncadas, en donde se ha removido el dominio regulador, y el uso de números de copias genéticas hasta aproximadamente 6, también da una mayor actividad. Id. Ver también Downing y colaboradores, Biochem. Biophys . Res . Commun . , 94, 974-79 (1980), que describen dos mutantes de levadura que tienen niveles incrementados de HMGCoA-reductasa . Existen dos isozimas de HMG-CoA-reductasa, codificados por los genes HMGl y HMG2 en S. cerevisiae . La actividad de estas dos isozimas es regulada por varios mecanismos, incluyendo la regulación de transcripción, el IPP y el DMAPP a GGPP (ver la Figura 1) . Las modificaciones genéticas de 1 GGPP-sintasa, como se utilizan en la presente, abarcan el diseño de una FPP-GGPP-sintasa bifuncional, para mejorar el componente de la actividad de GGPP-sintasa de la enzima. Un gen de GGPP-sintasa preferido es el gen BTSl a partir de S. cerevisiae . El gen BTSl y su aislamiento se describen en Jiang y colaboradores, J. Biol . Chem. , 270, 21793-99 (1995), y en la solicitud pendiente con Número de Serie 08/761,344, presentada el 6 de diciembre de 1996, cuya divulgación completa se incorpora a la presente como referencia. Sin embargo, se pueden utilizar GGPP-sintasas de otros hospederos, y el uso de las GGPP-sintasas bifuncionales puede ser particularmente conveniente en términos de canalizar el flujo de carbono a través de FPP hasta GGPP, evitando de esta manera la pérdida de FPP hacia las reacciones competidoras en la célula. En las modalidades adicionales de la invención, en adición a las modificaciones de GGPP-sintasa descritas anteriormente, se elimina la GGPP-sintasa de tipo silvestre del organismo de producción. Esto serviría, por ejemplo, para eliminar la competencia entre la GGPP-sintasa modificada y la enzima de tipo silvestre por los sustratos, FPP e IPP. La supresión del gen de tipo silvestre que codifica la GGPP-sintasa, también podría mejorar la estabilidad del gen clonado de GGPP-sintasa, al remover las regiones de alta homología de secuencia genética, eliminando de esta manera la recombinación genética potencialmente perjudicial. 2.1.4. Modificaciones de FPP-Sintasa Una modalidad adicional de la presente invención es el uso de un microorganismo que se haya modificado genéticamente para incrementar la acción de la FPP-sintasa. Se han identificado los genes que codifican para esta enzima a partir de una variedad de fuentes. Ver Anderson y colaboradores, ". Biol . Chem. , 264, 19176-19184 (1989); Attucci y colaboradores, Arch. Biochem. Biophys . , 321, 493- 500 (1995) ; Cañe y colaboradores, J". Am. Chem . Soc . 105, 122- 124 (1983); Chambón y colaboradores, Current Genetics, 18, 41-46 (1990); Chambón y colaboradores, Lipids, 26, 633-36 (1991); Chen y colaboradores, Protein Science, 3, 600-607 (1994); Davisson y colaboradores, J. Am. Chem . Soc . , 115, 1235-45 (1993); Ding y colaboradores, Biochem . J. , 275, 61-65 (1991); Hugueney y colaboradores, FEBS Letters, 273, 235-38 (1990); Joly y colaboradores, J. Biol . Chem. , 268, 16983-89 (1993) ; Koyama y colaboradores, J. Biochem. , 113, 355-63 (1993); Sheares y colaboradores, Biochem. 28, 8129-35 (1989); Song y colaboradores, Proc . Natl . Acad. Sci . EUA 91, 3044-48 (1994); Spear y colaboradores, J. Biol . Chem. , 267, 14662-69 (1992); Spear y colaboradores, J". Biol . Chem. , 269, 25212-18 (1994). Anderson y colaboradores, J". Biol . Chem. , 264, 19176-19184 (1989) , reportaron una sobreexpresión de dos a tres veces de la FPP-sintasa con el gen de S. cerevisiae en un vector de lanzamiento de levadura. Como se describe en la sección de Ejemplos, de una manera sorprendente, se ha descubierto que la sobreexpresión de la FPP-sintasa no condujo a un incremento en_la producción de farnesol, pero inesperadamente condujo a un incremento en la producción de GG en ausencia de cualquier sobreexpresión de GGPP-sintasa. En las modalidades adicionales de la invención, en adición a las modificaciones de la FPP-sintasa descritas anteriormente, se elimina la FPP-sintasa de tipo silvestre del organismo de producción. Esto serviría, por ejemplo, para eliminar la competencia entre la FPP-sintasa modificada y la enzima de tipo silvestre por los sustratos, IPP, DMAPP, y GGPP. La supresión del gen de tipo silvestre que codifica la FPP-sintasa, también podría mejorar la estabilidad del gen clonado de FPP-sintasa, al remover las regiones de alta homología de secuencia genética, eliminando de esta manera la recombinación genética potencialmente perjudicial. 2.1.5. Modificaciones de Fosfatasa Una modalidad adicional de la presente invención es el uso de un microorganismo que se haya modificado genéticamente para incrementar la acción de fosfatasa, con el fin de incrementar la conversión de FPP a farnesol, o de GGPP a GG. Por ejemplo, tanto S. cerevisiae como E. coli contienen numerosas actividades de fosfatasa. Al probar varias fosfatasas para determinar una desfosforilación eficiente de FPP ó GGPP, se podría seleccionar una fosfatasa apropiada y expresar el gen que codifique esta enzima en un organismo de producción, para mejorar la producción de farnesol o GG. En adición a (o en lugar de) incrementar la acción de una fosfatasa deseada para mejorar la producción de farnesol ó GG, se podrían eliminar, a través de medios genéticos, las actividades de fosfatasa indeseables. Por ejemplo, se podrían eliminar a través de mutación de la actividad de una fosfatasa que actúe específicamente sobre FPP, de tal manera que estaría disponible FPP de repuesto para convertirse en GPP, y subsecuentemente en GG. 2.1.6. Modificaciones Genéticas Adicionales Modificaciones de. Otras Enzimas de la Ruta Isoprenoide . Las modificaciones que se pueden hacer para incrementar la acción de la HMG-CoA-reductasa, la GGPP-sintasa, y las fosfatasas, se describieron anteriormente. La modificación de la acción de las enzimas de la ruta isoprenoide no está limitada a esos ejemplos específicos, y se pueden aplicar estrategias similares para modificar la acción de otras enzimas de la ruta isoprenoide, tales como acetoacetil-CoA-tiolasa, HMG-CoA-sintasa, mevalonato-cinasa, fosfomevalonato-cinasa, fosfomevalonato-descarboxilasa, IPP-isomerasa, farnesil-pirofosfato-sintasa, o D-l-desoxixilulosa/5-fosfato/sintasa, D-l-desoxixilulosa/5-fosfato/reductoisomerasa. Diseño del Metabolismo Central para Incrementar el Suministro del Precursor a la Ruta Isoprenoide. En los organismos que tienen la ruta isoprenoide dependiente del mevalonato, la biosxntesis de farnesol ó GG empieza con acetol-CoA (referirse a la Figura 1) . Una modalidad de la presente invención es la modificación genética del organismo de producción, de tal manera que se incremente el nivel intracelular de acetil-CoA, poniendo de esta manera más acetil-CoA a disposición para dirigirse a la ruta isoprenoide (y por consiguiente, al farnesol y/o GG) . Por ejemplo, se puede incrementar el suministro de acetil-CoA mediante el incremento de la acción del complejo de piruvato-deshidrogenasa. El suministro de acetil-CoA se puede incrementar adicionalmente mediante el incremento del nivel de piruvato en la célula, al incrementar la acción de la piruvato-cinasa. En los organismos que tengan la ruta isoprenoide independiente del mevalonato, la biosíntesis de los isoprenoides empieza con piruvato y gliceraldehído-3-fosfato. El suministro de piruvato y gliceraldehído-3-fosfato disponible para la biosíntesis isoprenoide, se puede incrementar mediante el incremento de la acción de la piruvato-cinasa y de la tiofosfato-isomerasa, respectivamente . Los ejemplos anteriores se proporcionan solamente para ilustrar el concepto de diseñar el metabolismo central para el propósito de incrementar la producción de los compuestos isoprenoides, y no son una lista exhaustiva de los planteamientos que se pueden emprender. Se podrían aplicar con éxito otras numerosas estrategias para alcanzar esta meta. Rutas de Bloqueo que Compiten por FPP ó GGPP. En la levadura, el FPP es un intermediario de punto de ramificación que conduce a la biosíntesis de esteróles, heme, dolicol, ubiquinona, GGPP, y proteínas farnesiladas . En E. coli , el FPP sirve como el sustrato para la octaprenil-pirofosfato-sintasa en la ruta que conduce a la ubiquinona . En bacterias que sintetizan carotenoides, tales como Erwinia uredovora, el FPP se convierte a GGPP mediante GGPP-sintasa en el primer paso que conduce a los carotenoides . Para incrementar la producción de farnesol ó GG, es deseable inactivar los genes que codifiquen las enzimas que utilizan FPP ó GGPP como sustrato, o reducir la actividad de las enzimas mismas, ya sea a través de mutación, o mediante el uso de inhibidores de enzimas específicos (como se discutió anteriormente para la síntasa de escualeno) . En S. cerevisiae, por ejemplo puede ser conveniente inactivar el primer paso en la ruta desde FPP hasta heme, en adición a inactivar el ERG9. Como se discutió anteriormente, en E. coli , la inactivación parcial o completa de la octaprenil-pirofosfato-sintasa, podría incrementar la disponibilidad de FPP para convertirse en farnesol. Finalmente, en las bacterias que producen carotenoides, tales como Erwinia uredovora, la eliminación de la GGPP-sintasa puede incrementar el nivel de FPP para la conversión del farnesol, mientras que la inactivación o la reducción de la actividad de la sintasa de fitoeno (el producto del gen crtB) puede incrementar el nivel de GGPP disponible para convertirse a GG. Es posible que el bloqueo de las rutas que conducen lejos de FPP ó GGPP tenga efectos negativos sobre el crecimiento y la fisiología del organismo de producción. Además se contempla que se pueden hacer las modificaciones genéticas adicionales requeridas para compensar estas complicaciones. El aislamiento de mutantes de S. cerevisiae que se bloquean en la ruta isoprenoide y que recuperan esteróles bajo condiciones aeróbicas, como se describió anteriormente, ilustra que se pueden obtener mutaciones de compensación que superen los efectos de las modificaciones genéticas primarias . Aislamiento d Cepas de Producción que son Resistentes al Farnesol o a GG. En la sección de Ejemplos, se describe la producción de altos niveles de farnesol y GG mediante cepas genéticamente modificadas de S. cerevisiae . Se reconoce que, a medida que se hacen incrementos adicionales en la producción de farnesol o GG, estos compuestos pueden alcanzar niveles que sean tóxicos para el organismo de producción. En realidad, la toxicidad del producto es un problema común encontrado en los procesos de producción biológica. Sin embargo, igualmente comunes son las modificaciones genéticas hechas mediante métodos clásicos o tecnología recombinante que superan la toxicidad del producto. La presente invención anticipa el encuentro de la toxicidad del producto. Por consiguiente, una modalidad adicional de esta invención es el aislamiento de mutantes con una mayor resistencia al farnesol y/o GG. Aislamiento de los Organismos de Producción con Mejores Propiedades de Crecimiento. Un efecto de bloquear la ruta isoprenoide en S. cerevisiae, es que los organismos mutantes (en la presente invención, los mutantes erg9) crecen más lentamente que sus cepas progenitoras (no bloqueadas) . a pesar de la adición de ergosterol al medio de cultivo. El hecho de que el crecimiento más lento de los mutantes erg9 se debe al bloqueo en erg9 , se ilustra en el Ejemplo l.G, el cual muestra que la reparación de la mutación erg9 restablece la velocidad de crecimiento de la cepa hasta aproximadamente aquélla de la progenitora de tipo silvestre. El crecimiento más lento de los mutantes erg9 podría deberse a las diferencias relacionadas con el crecimiento en un ergosterol exógenamente suministrado contra el ergosterol sintetizado en la célula, o podría deberse a otros factores fisiológicos. Una modalidad de la presente invención es el aislamiento de variantes de las cepas productoras de farnesol ó GG con mejores propiedades de crecimiento. Esto se podría lograr, por ejemplo, mediante cultivo continuo, seleccionando variantes de más rápido crecimiento. Estas variantes podrían presentarse espontáneamente, o se podrían obtener mediante planteamientos de mutagénesis clásica o genéticos moleculares . 2.2. incQg gjra ión de Frenol e Isopyenol En una modalidad adicional de la presente invención, el farnesol o el GG se produce, mediante la introducción de isoprenol y/o prenol en un medio de fermentación. Con referencia a la Figura 9, cada uno de estos compuestos, cuando es recuperado por un organismo, se fosforila con un grupo pirofosfato, para formar, respectivamente, pirofosfato de 3 -isopentenilo y pirofosfato de 3 , 3-dimetilalilo. Estos dos compuestos se interconvierten mediante la acción de la isopentenil-pirofosfato-isomerasa. Luego estos compuestos se convierten en pirofosfato de farnesilo mediante la acción de la FPP-sintasa. El farnesol se forma mediante la desfosforilación de pirofosfato de farnesilo. El pirofosfato de farnesilo se puede convertir adicionalmente en pirofosfato de geranilgeranilo. El geranilgeraniol se forma mediante la desfosforilación del pirofosfato de geranilgeranilo. El GG se formaría a partir de FPP mediante la acción combinada de la GGPP-sintasa y una fosfatasa. El isoprenol y el prenol son compuestos comercialmente disponibles, y se pueden producir mediante métodos conocidos en la técnica. En esta modalidad, el microorganismo utilizado en la fermentación puede ser cualquier microorganismo descrito en cualquier otra parte de la presente. En adición, el microorganismo se puede modificar genéticamente para incrementar la acción de la dimetilalil-transferasa, para promover la producción de pirofosfato de geranilo y pirofosfato de farnesol. Se han identificado los genes que codifican para esta enzima a partir de una variedad de fuentes [Chen y colaboradores, Protein Sci . , 3, 600-607 (1994)]. En adición, se puede modificar genéticamente un microorganismo para incrementar la acción de la isoprenol-cinasa o de la prenol-cinasa. Aunque no se han descubierto estas enzimas, se han descrito enzimas similares al fosforilato-farnesol y al geranilgeraniol [Bentinger y colaboradores, Arch. Biochem. Biophys . , 353, 191-198 (1998); Ohnuma y colaboradores, J". Biochem. , 119, 541-547 (1996)]. 2.3. Medio y Condiciones de Fermentación En el método para la producción de farnesol ó GG, se cultiva un microorganismo que tenga una modificación genética, como se discutió anteriormente, en un medio de fermentación, para la producción de farnesol ó GG. Un medio de fermentación apropiado o efectivo se refiere a cualquier medio en donde un microorganismo genéticamente modificado de la presente invención, cuando se cultive, sea capaz de producir farnesol ó GG. Este medio normalmente es un medio acuoso que comprenda fuentes asimilables de carbono, nitrógeno, y fosfato. Este medio también puede incluir sales, minerales, metales, y otros nutrientes apropiados. En adición, cuando se bloquea un organismo en la ruta de ergosterol, y requiere de ergosteroles exógenos, el medio de fermentación debe contener estos esteróles exógenos. Los medios de ejemplo apropiados se muestran en la discusión que se encuentra más adelante, y en la sección de Ejemplos. Sin embargo, se debe reconocer que son adecuadas una variedad de condiciones de fermentación, y pueden ser seleccionadas por los expertos en este campo. Las fuentes de carbono asimilable que se pueden utilizar en un medio de fermentación adecuado incluyen, pero no se limitan a, azúcares y sus polímeros, incluyendo dextrina, sacarosa, maltosa, lactosa, glucosa, fructosa, mañosa, sorbosa, arabinosa, y xilosa; ácidos grasos; ácidos orgánicos, tales como acetato; alcoholes primarios, tales como etanol y propanol normal; y polialcoholes, tales como glicerina. Las fuentes de carbono preferidas en la presente invención incluyen monosacáridos, disacáridos, y trisacáridos . La fuente de carbono más preferida es glucosa. La concentración de una fuente de carbono, tal como glucosa, en el medio de fermentación, debe promover el crecimiento celular, pero no debe ser tan alta como para reprimir el crecimiento del microorganismo utilizado. Normalmente, las fermentaciones se ejecutan con una fuente de carbono, tal como glucosa, agregada en niveles para alcanzar el nivel deseado de crecimiento y biomasa, pero en niveles no detectables (siendo los límites de detección de aproximadamente <0.1 gramo/litro) . En otras modalidades, la concentración de una fuente de carbono, tal como glucosa, en el medio de fermentación, es mayor de aproximadamente 1 gramo/litro, de preferencia mayor de aproximadamente 2 gramos/litro, y más preferiblemente mayor de aproximadamente 5 gramos/litro. En adición, la concentración de una fuente de carbono, tal como glucosa, en el medio de fermentación, normalmente es menor de aproximadamente 100 gramos/litro, de preferencia menor de aproximadamente 50 gramos/litro, y muy preferiblemente menor de aproximadamente 20 gramos/litro. Se debe observar que las referencias a las concentraciones del componente de fermentación pueden referirse a las concentraciones iniciales y/o continuas del componente. En algunos casos, puede ser deseable permitir que el medio de fermentación llegue a agotarse de una fuente de carbono durante la fermentación. Las fuentes de nitrógeno asimilable que se pueden utilizar en un medio de fermentación adecuado incluyen, pero no se limitan a, fuentes de nitrógeno simple, fuentes de nitrógeno orgánico, y fuentes de nitrógeno complejo. Estas fuentes de nitrógeno incluyen amoniaco anhidro, sales de amonio, y sustancias de origen animal, vegetal, y/o microbiano. Las fuentes de nitrógeno adecuadas incluyen, pero no se limitan a, hidrolizados de proteína, hidrolizados de biomasa microbiana, peptona, extracto de levadura, sulfato de amonio, urea, y aminoácidos. Normalmente, la concentración de las fuentes de nitrógeno, en el medio de fermentación, es mayor de aproximadamente 0.1 gramo/litro, de preferencia mayor de aproximadamente 0.25 gramos/litro, y muy preferiblemente mayor de aproximadamente 1.0 gramo/litro. Más allá de ciertas concentraciones, sin embargo, la adición de una fuente de nitrógeno al medio de fermentación no es conveniente para el crecimiento de los microorganismos. Como resultado, la concentración de las fuentes de nitrógeno, en el medio de fermentación, es menor de aproximadamente 20 gramos/litro, de preferencia menor de aproximadamente 10 gramos/litro, y muy preferiblemente menor de aproximadamente 5 gramos/litro. Además, en algunos casos, puede ser deseable permitir que el medio de fermentación llegue a agotarse de las fuentes de nitrógeno durante la fermentación. El medio de fermentación efectivo puede contener otros compuestos, tales como sales inorgánicas, vitaminas, metales traza, o promotores del crecimiento. Estos otros compuestos también pueden estar presentes en las fuentes de carbono, nitrógeno, o minerales en el- medio efectivo, o se pueden agregar específicamente al medio. El medio de fermentación también puede contener una fuente de fosfato adecuada. Estas fuentes de fosfato incluyen fuentes tanto de fosfato inorgánico como orgánico. las fuentes de fosfato preferidas incluyen, pero no se limitan a, sales de fosfato, tales como fosfatos de sodio y potasio mono- ó di-básicos, fosfato de amonio, y mezclas de los mismos. Normalmente, la concentración de fosfato en el medio de fermentación es mayor de aproximadamente 1.0 gramo/litro, de preferencia mayor de aproximadamente 2.0 gramos/litro, y más preferiblemente mayor de aproximadamente 5.0 gramos/litro. Más allá de ciertas concentraciones, sin embargo, la adición de fosfato al medio de fermentación no es conveniente para el crecimiento d.e los microorganismos. De acuerdo con lo anterior, la concentración de fosfato en el medio de fermentación normalmente es menor de aproximadamente 20 gramos/litro, de preferencia menor de aproximadamente 15 gramos/litro, y más preferiblemente menor de aproximadamente 10 gramos/litro. Un medio de fermentación adecuado también puede incluir una fuente de magnesio, de preferencia en la forma de una sal fisiológicamente aceptable, tal como un hexahidrato de sulfato de magnesio, aunque se pueden utilizar otras fuentes de magnesio en concentraciones que contribuyan con cantidades similares de magnesio. Normalmente, la concentración de magnesio en el medio de fermentación es mayor de aproximadamente 0.5 gramos/litro, de preferencia mayor de aproximadamente 1.0 gramo/litro, y más preferiblemente mayor de aproximadamente 2.0 gramos/litro. Sin embargo, más allá de ciertas concentraciones, la adición de magnesio al medio de fermentación no es conveniente para el crecimiento de los microorganismos. De acuerdo con lo anterior, la concentración de magnesio en el medio de fermentación normalmente es menor de aproximadamente 10 gramos/litro, de preferencia menor de aproximadamente 5 gramos/litro, y más preferiblemente menor de aproximadamente 3 gramos/litro. Además, en algunos casos, puede ser deseable permitir que el medio de fermentación llegue a agotarse de una fuente de magnesio durante la fermentación. El medio de fermentación también puede incluir un agente quelante biológicamente aceptable, tal como el dihidrato de citrato de trisodio. En este caso, la concentración de un agente quelante en el medio de fermentación es mayor de aproximadamente 0.2 gramos/litro, de preferencia mayor de aproximadamente Ó.5 gramos/litro, y más preferiblemente mayor de aproximadamente 1 gramo/litro. Sin embargo, más allá de ciertas concentraciones, la adición de un agente quelante al medio de fermentación no es conveniente para el crecimiento de los microorganismos . De acuerdo con lo anterior, la concentración de un agente quelante en el medio de fermentación normalmente es menor de aproximadamente 10 gramos/litro, de preferencia menor de aproximadamente 5 gramos/litro, y más preferiblemente menor de aproximadamente 2 gramos/litro. El medio de fermentación .también puede incluir inicialmente un ácido o base biológicamente aceptable para mantener el pH deseado del medio de fermentación. Los ácidos biológicamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, y mezclas de los mismos. Las bases biológicamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, hidróxido de amonio, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, y mezclas de los mismos . En una modalidad preferida de la presente invención, la base utilizada es hidróxido de amonio. El medio de fermentación también puede incluir una fuente de calcio biológicamente aceptable, incluyendo, pero no limitándose a, cloruro de calcio. Normalmente, la concentración de la fuente de calcio, tal como cloruro de calcio, dihidrato, en el medio de fermentación, está dentro del rango de aproximadamente 5 miligramos/litro a aproximadamente 2,000 miligramos/litro, de preferencia dentro del rango de aproximadamente 20 miligramos/litro a aproximadamente 1,000 miligramos/litro, y más preferiblemente en el rango de aproximadamente. 50 miligramos/litro a aproximadamente 500 miligramos/litro. El medio de fermentación -también puede incluir cloruro de sodio. Normalmente, la concentración de cloruro de sodio en el medio de fermentación está dentro del rango de aproximadamente 0.1 gramo/litro a aproximadamente 5 gramos/litro, de preferencia dentro del rango de aproximadamente 1 gramo/litro r a _ aproximadamente 4 gramos/litro, y más preferiblemente en el rango de aproximadamente 2 gramos/litro a aproximadamente 4 gramos/litro. Como se discutió anteriormente, el medio de fermentación también puede incluir metales traza. Estos metales traza se pueden agregar al medio de fermentación como una solución de suministro que, para mayor conveniente, se puede preparar por separado del resto del medio de fermentación. Una solución de suministro de metales traza adecuada para utilizarse en el medio de fermentación se muestra más adelante en la Tabla 1. Normalmente, la cantidad de esta solución de metales traza agregada al medio de fermentación es mayor de aproximadamente 1 mililitro/litro, de preferencia mayor de aproximadamente 5 mililitros/litro, y más preferiblemente mayor de aproximadamente 10 mililitros/litro. Sin embargo, más allá de ciertas concentraciones, no es conveniente la adición de metales traza al medio de fermentación para el crecimiento de los microorganismos. De acuerdo con lo anterior, la cantidad de esta solución de metales traza agregada al medio de fermentación normalmente es menor de aproximadamente 100 mililitros/litro, de preferencia menor de aproximadamente 50 mililitros/litro, y más preferiblemente menor " de aproximadamente 30 mililitros/litro. Se debe observar que, en adición a agregar metales traza a una solución de suministro, los componentes individuales se pueden agregar por separado, cada uno dentro de los rangos correspondientes, de una manera independiente, a las cantidades de los componentes dictadas por los rangos anteriores de la solución de metales traza. Como se muestra más adelante en la Tabla 1, una solución de metales traza adecuada para utilizarse en la presente invención puede incluir, pero no limitarse a, sulfato ferroso, heptahidrato; sulfato cúprico, pentahidrato; sulfato de zinc, heptahidrato; molibdato de sodio, dihidrato; cloruro cobaltoso, hexahidrato; y sulfato manganoso, monohidrato. Se agrega ácido clorhídrico a la solución de suministro para mantener las sales de metal de traza en solución. TABLA 1 SOLUCIÓN DE SUMINISTRO DE METALES TRAZA El medio de fermentación también puede incluir vitaminas . Estas vitaminas se pueden agregar al medio de fermentación como una solución de suministro que, para mayor conveniencia, se puede preparar por separado del resto del medio de fermentación. Una solución de "suministro de vitamina adecuada para utilizarse en el medio de fermentación se muestra más adelante en la Tabla 2. Normalmente, la cantidad de esta solución de vitamina agregada al medio de fermentación es mayor de 1 mililitro/litro, de preferencia mayor de 5 mililitros/litro, y más preferiblemente mayor de 10 mililitros/litro. Sin embargo, más allá de ciertas concentraciones, la adición de vitaminas al medio de fermentación no es conveniente para el crecimiento de los microorganismos. De acuerdo con lo anterior, la cantidad de esta solución de vitamina agregada al medio de fermentación, normalmente es menor de aproximadamente 50 mililitros/litro, de preferencia menor de 30 mililitros/litro, y más preferiblemente menor de 20 mililitros/litro. Se debe observar que, en adición a agregar vitaminas a una solución de suministro, los componentes individuales se pueden agregar por separado, cada uno dentro de los rangos correspondientes de manera independiente a las cantidades de los componentes dictadas por los rangos anteriores de la solución de suministro de vitamina. Como se muestra en la Tabla 2 , una solución de vitamina adecuada para utilizarse en la presente invención puede incluir, pero no limitarse a, biotina, pantotenato de calcio, inositol, piridoxina-HCl, y tiamina-HCl.

TABLA 2 Como se mencionó anteriormente, cuando se bloquea un organismo en la ruta de esterol, se debe agregar un esterol exógeno al medio de fermentación. Estos esteróles incluyen, pero no se limitan a, ergosterol y colesterol. Estos esteróles se pueden agregar al medio de fermentación como una solución de suministro que se prepara por separado del resto del medio de fermentación. Las soluciones de suministro de esterol se pueden preparar utilizando un detergente para ayudar a la solubilización del esterol. Una solución de suministro de ergosterol típica se describe en el Ejemplo l.D. Normalmente, se agrega una cantidad de solución de suministro de esterol al medio de fermentación, de tal manera que la concentración final del esterol en el medio de fermentación esté dentro del rango de aproximadamente 1 miligramo/litro a 3,000 miligramos/litro, de preferencia dentro del rango de aproximadamente 2 miligramos/litro a 2,000 miligramos/litro, y más preferiblemente dentro del rango de aproximadamente 5 miligramos/litro a 2,000 miligramos/litro . Los microorganismos de la presente invención se pueden cultivar en medios de fermentación convencionales, los cuales incluyen, pero no se limitan a, por lotes, por lotes alimentados, reciclo celular, y continuo. Sin embargo, se prefiere que la fermentación se realice en un modo por lotes alimentados. En este caso, durante la fermentación, se agotan algunos de los componentes del medio. Es posible iniciar la fermentación con concentraciones relativamente altas de estos componentes, de tal manera que el crecimiento sea soportado durante un período de tiempo antes de que se requieran adiciones. Los rangos _ preferidos de estos componentes se mantienen a través de toda la fermentación, haciendo adiciones a medida que se agoten los niveles por la fermentación. Los niveles de los componentes en el medio de fermentación se pueden monitorear, por ejemplo^ muestreando el medio de fermentación periódicamente, y ensayando para determinar las concentraciones. De una manera alternativa, una vez que se desarrolla un procedimiento de fermentación estándar, se pueden hacer adiciones a intervalos de tiempo correspondientes a los niveles conocidos en los tiempos particulares a través de toda la fermentación. Como será reconocido por los expertos en la materia, la velocidad de consumo de nutriente se incrementa durante la fermentación a medida que se incrementa la densidad celular del medio. Más aún, para evitar la introducción de microorganismos extraños en el medio de fermentación, se realiza la adición utilizando métodos de adición asépticos, como son bien conocidos en la técnica. En adición, se puede agregar una pequeña cantidad de agente antiespumante durante la fermentación. La temperatura del medio de fermentación puede ser cualquier temperatura adecuada para el crecimiento y la producción de farnesol o GG. Por ejemplo, antes de la inoculación del medio de fermentación con un inoculo, el medio de fermentación se puede llevar hasta, y mantener a, una temperatura en el rango de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 45 °C, de preferencia hasta una temperatura en el rango de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 40 °C, y más preferiblemente en el rango de aproximadamente 28 °C a aproximadamente 32 °C. El pH del medio de fermentación se puede controlar mediante la adición de ácido o base al medio de fermentación. En estos casos, cuando se utiliza amoniaco para controlar el pH, también sirve convenientemente como una fuente de nitrógeno en el medio de fermentación. De preferencia, el pH se mantiene de aproximadamente 3.0 a aproximadamente 8.0, más preferiblemente de aproximadamente 3.5 a aproximadamente 7.0, y muy preferiblemente de aproximadamente 4.0 a aproximadamente 6.5. El medio de fermentación también se puede mantener para tener un contenido de oxígeno disuelto durante el transcurso de la fermentación para mantener el crecimiento celular, y para mantener el metabolismo celular para la producción de farnesol ó GG. La concentración de oxígeno del medio de fermentación se puede monitorear utilizando métodos conocidos, tales como a través del uso de un electrodo de oxígeno. Se puede agregar oxígeno al medio de fermentación utilizando métodos conocidos en la materia, por ejemplo, a través de agitación y aireación del medio mediante agitación o dispersión. De preferencia, la concentración de oxígeno en el medio de fermentación está en el rango de aproximadamente el 20 por ciento a aproximadamente el 100 por ciento del valor de saturación de oxígeno en el medio, basándose en la solubilidad del oxígeno en el medio de fermentación a la presión atmosférica y a una temperatura en el rango de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 40 °C. Sin embargo, durante la fermentación se pueden presentar caídas periódicas en la concentración de oxígeno debajo de este rango, sin afectar adversamente la fermentación. Aunque en la presente se ha descrito la aireación del medio en relación con el uso de aire, se pueden utilizar otras fuentes de oxígeno. Es particularmente útil el uso de un gas aireador que contenga una fracción por volumen de oxígeno mayor que la fracción por volumen de oxígeno en el aire ambiental. En adición, estos gases de aireación pueden incluir otros gases que no afecten negativamente la fermentación. En una modalidad del proceso de fermentación de la presente invención, se prepara un medio de fermentación como se describió anteriormente y en el Ejemplo l.H. Este medio de fermentación se inocula con un cultivo de microorganismos en crecimiento activo de la presente invención, en una cantidad suficiente para producir, después de un período de crecimiento razonable, una densidad celular alta. Las densidades celulares de inoculación típicas están dentro del rango de aproximadamente 0.01 gramos/litro a aproximadamente 10 gramos/litro, de preferencia de aproximadamente 0.2 gramos/litro a aproximadamente 5 gramos/litro, y más preferiblemente de aproximadamente 0.05 gramos/litro a aproximadamente 1.0 gramo/litro, basándose en el peso seco de las células. Sin embargo, en los fermentadores a escala de producción, se prefieren mayores densidades celulares de inoculo. Luego las células se hacen crecer hasta una densidad celular en el rango de aproximadamente 10 gramos/litro a aproximadamente 100 gramos/litro, de preferencia de aproximadamente 20 gramos/litro a aproximadamente 80 gramos/litro, y más preferiblemente de aproximadamente 50 gramos/litro a aproximadamente 70 gramos/litro. Los tiempos de residencia para que los microorganismos alcancen las densidades celulares deseadas durante la fermentación normalmente son menores de aproximadamente 200 horas, de preferencia menores de aproximadamente 120 horas, y más preferiblemente menores de aproximadamente 96 horas. En un modo de operación de la presente invención, la concentración de la fuente de carbono, tal como la concentración de glucosa, del medio de fermentación, se monitorea durante la fermentación. La concentración de glucosa del medio de fermentación se puede monitorear utilizando técnicas conocidas, tales como, por ejemplo, el uso de una prueba de enzima de glucosa-oxidasa o cromatografía de líquidos de alta presión, que se puede utilizar para monitorear la concentración de glucosa en el sobrenadante, por ejemplo, un componente exento de células del medio de fermentación. Como se mencionó anteriormente, la concentración de la fuente de carbono se debe mantener debajo del nivel en el cual se presente una inhibición del crecimiento celular. Aunque esta concentración puede variar de organismo a organismo, para la glucosa como una fuente de carbono, la inhibición del crecimiento celular se presenta en concentraciones de glucosa mayores de aproximadamente 60 gramos/litro, y se puede determinar fácilmente mediante ensayo. De acuerdo con lo anterior, cuando se utiliza glucosa como una fuente de carbono, la glucosa de preferencia se alimenta al fermentador, y se mantiene debajo de los límites de detección. De una manera alternativa, la concentración de glucosa en el medio de fermentación se mantiene en el rango de aproximadamente 1 gramo/litro a aproximadamente 100 gramos/litro, más preferiblemente en el rango de aproximadamente 2 gramos/litro a aproximadamente 50 gramos/litro, y todavía más preferiblemente en el rango de aproximadamente 5 gramos/litro a aproximadamente 20 gramos/litro. Aunque la concentración de la fuente de carbono se puede mantener dentro de los niveles deseados mediante la adición de, por ejemplo, una solución de glucosa sustancialmente pura, es aceptable, y se puede preferir, mantener la concentración de la fuente de carbono del medio de fermentación mediante la adición de alícuotas del medio de fermentación original . El uso de alícuotas del medio de fermentación original puede ser deseable, debido a que se pueden mantener simultáneamente las concentraciones de otros nutrientes en el medio (por ejemplo, las fuentes de nitrógeno y fosfato) . De la misma manera, se pueden mantener concentraciones de metales traza en el medio de fermentación mediante la adición de alícuotas de la solución de metales traza. 2.4. Recuperación de Farnesol y GG Una vez que se producen farnesol ó GG mediante un sistema biológico, se recuperan o se aislan para su conversión química subsecuente hasta a-tocoferol ó esteres de a-tocoferilo. Los presentes inventores han demostrado que, tanto para farnesol como para GG, el producto puede estar presente en los sobrenadantes de cultivo, y/o puede estar asociado con las células de levadura, con respecto a las células, la recuperación de farnesol ó GG incluye algún método para permeabilizar o lisar las células. El farnesol o el GG en el cultivo se puede recuperar utilizando un proceso de recuperación, incluyendo, pero no limitándose a, cromatografía, extracción, extracción con solvente, separación de membrana, electrodiálisis, osmosis inversa, destilación, derivación química, y cristalización. Cuando el producto está en la forma de fosfato, es decir, fosfato de farnesilo o fosfato de geranilgeranilo, solamente se presenta adentro de las células, y por consiguiente, requiere de algún método para permeabilizar o lisar las células. 3.0. Síntesis Química de GG y Farnesol 3.1. Síntesis Química de GG Como se observó anteriormente, en un - modalidad de la invención, se produce GG biológicamente, y en las modalidades alternativas, se puede producir GG mediante otros métodos. Por ejemplo, también se puede producir GG a partir de farnesol mediante síntesis química. En la técnica se conocen muchos métodos adecuados. En uno de estos métodos, el farnesol se convierte en bromuro de farnesilo (PBr3 en éter) , y se somete a desplazamiento con acetoacetato de etilo. El cetoéster crudo resultante se saponifica, se descarboxila, y la cetona resultante se purifica mediante destilación. Siguiendo el procedimiento de Klinge y Demuth (Synlett 1993 , 783) , la cetona se somete a reacción de Wittig-Horner con etilfosfonoacetato de di-isopropilo (NaH, glima) para dar una mezcla de aproximadamente 80/20 de geranilgeranoato de t,t,t-y t,t,c-etilo. La reducción del geranilgeranoato de etilo con hidruro de di-isobutilaluminio proporciona GG limpiamente. La mezcla de t,t,t- y t,t,c- se puede separar en el nivel de oxidación de éster (por ejemplo, mediante destilación) , o alcohol (por ejemplo, mediante cristalización, como se describe en la Patente Europea Número EP 711749) . La producción de farnesol como un material de partida para la producción química de GG se puede realizar mediante producción .biológica, tal como mediante la utilización de un microorganismo modificado que tenga algunas de las características modificadas descritas anteriormente. 3.2. Síntesis Química de Farnesol Como se observó anteriormente, en una modalidad de la invención, se produce farnesol biológicamente, y en las modalidades alternativas, se puede producir farnesol mediante otros métodos. Por ejemplo, también se puede producir farnesol mediante síntesis química. Se conocen muchos métodos adecuados en la técnica. 4.0. Producción de Tocoferol a partir de GG mediante Síntesis En una modalidad adicional de la presente invención, se proporciona un método para producir vitamina E a partir de geranilgeraniol . El geranilgeraniol contiene cuatro fracciones de olefina. Como se utilizan en esta invención, las fracciones de olefina de geranilgeraniol están numeradas consecutivamente a partir del término hidroxilo, es decir, la primera fracción de olefina se refiere al doble enlace C2-C3, la segunda fracción de olefina se refiere al doble enlace C3-C7, la tercera fracción de olefina se refiere al doble enlace C?0-C , y la cuarta fracción de olefina se refiere al doble enlace C14-C15. El método de la presente invención involucra reducir cuando menos una fracción de olefina del geranilgeraniol para formar un alcohol alílico. De preferencia, el alcohol alílico es fitol y/o isofitol. La formación del alcohol alílico se puede lograr mediante una reducción selectiva de olefinas, que reduzca cuando menos una de las segunda, tercera, o cuarta fracciones de olefina, sin reducir la primera fracción de olefina. De preferencia, la reducción reduce todas las fracciones de olefina, excepto la primera fracción de olefina. La reducción de una fracción de olefina se puede realizar mediante cualquiera de las condiciones de reducción de alqueno conocidas, incluyendo reducción de di-imida; reducción de metal de disolución; reducción de hidruro de metal ; e hidrogenación en la presencia de un catalizador de metal, tal como paladio, rodio, níquel, platino, rutenio, cobre, cromo, o una combinación de los mismos. De preferencia, las segunda, tercera, y cuarta fracciones de olefina se reducen mediante hidrogenación. Si se desea una síntesis de vitamina E enantioméricamente enriquecida o enantioméricamente pura, se puede - efectuar la reducción de la fracción de olefina utilizando un catalizador asimétrico, tal como los conocidos en la materia para las reacciones de hidrogenación asimétrica. De una manera alternativa, se puede producir una mezcla racémica de alcohol alílico, y se puede someter a una separación quiral para proporcionar un estereoisómero deseado del alcohol alílico. En una modalidad de la presente invención, se agrega un grupo protector al geranilgeraniol antes de reducir las segunda, tercera, y/o cuarta fracciones de -olefina. Como se utiliza en esta invención, un grupo protector se refiere a cualquier compuesto que se pueda agregar al (o combinar con el) geranilgeraniol, antes de la reducción de una o más fracciones de olefina, y se remueve después de la reducción, para proporcionar un alcohol alílico a partir de geranilgeraniol. De preferencia, el grupo protector es un grupo protector de hidroxilo. El grupo protector de hidroxilo se selecciona de tal manera que se pueda lograr selectivamente la reducción de las segunda, tercera, y cuarta fracciones de olefina, sin reducir la primera fracción de olefina. Se pueden emplear una variedad de grupos protectores de hidroxilo conocidos en este campo. Los ejemplos de muchos .__> de estos posibles grupos se pueden encontrar en "Protective Groups in Organic Synthesis", por T.W. Green, John Wiley and Sons, 1981, páginas 10-86, que se incorpora a la presente como referencia en su totalidad. De preferencia, el grupo protector de hidroxilo es un éster. De una manera más preferible, el éster es un éster estéricamente impedido (es decir, voluminoso) , que proporcione una protección suficiente de la fracción de olefina C2-C3, para que no se reduzca bajo las condiciones de reducción de geranilgeraniol hasta un alcohol alílico protegido. Los grupos éster voluminosos de ejemplo incluyen isobutirato y pivaloato. La vitamina E se forma a partir del alcohol alílico y una hidroquinona. De preferencia, la hidroquinona es una trimetilhidroquinona, más preferiblemente, la hidroquinona es 2 , 3 , 5-trimetilhidroquinona. Se debe apreciar que se puede lograr la formación de compuestos relacionados con vitamina E (es decir, a-tocoferol) utilizando una hidroquinona correspondiente para un derivado de tocoferol particular. Por ejemplo, se puede sintetizar ß-, ?- , y d-tocoferol a partir del alcohol alílico y 2 , 5-dimetilhidroquinona, 2,3-dimetilhidroquinona, y 2-metilhidroquinona, respectivamente. Sin obligarnos por ninguna teoría, se cree que el contacto del alcohol alílico con un ácido genera un ion de carbonio que reacciona con la hidroquinona para formar vitamina E. Se puede generar un ion de carbonio similar a partir de un derivado de halógeno del fitol. Por ejemplo, el contacto de un fitano halogenado, tal como bromo-, cloro-, ó yodo-fitano, con un ácido de Lewis, tal como haluro de zinc, incluyendo bromuro de zinc, cloruro de zinc, y yoduro de zinc; haluro de aluminio, incluyendo bromuro de aluminio y cloruro de aluminio; haluro de boro, incluyendo tricloruro de boro y trifluoruro de boro; haluro de plata, incluyendo cloruro de plata, bromuro de plata, y yoduro de plata; haluro de níquel, tal como cloruro de níquel y bromuro de níquel; y otros ácidos de Lewis de haluro de metal, pueden generar iones de carbonio, los cuales pueden reaccionar con una hidroquinona para formar vitamina E. La Figura 2 ilustra una modalidad particularmente preferida de síntesis de vitamina E a partir de geranilgeraniol. El grupo hidroxilo del geranilgeraniol 2-1 se protege como el éster de isobutirato u otro éster voluminoso, utilizando el ácido correspondiente o su derivado, tal como anhídrido o cloruro de acilo. Luego se hidrogena selectivamente el isobutirato de geranilgeranilo 2-2 utilizando un catalizador de metal, tal como paladio sobre carbono, para producir el isobutirato de fitilo 2-3. La hidrogenación del isobutirato de geranilgeranilo 2-2 reduce las segunda, tercera, y cuarta fracciones de olefina, sin afectar a la primera fracción de olefina. Se cree que el volumen esférico del isobutirato reduce la velocidad de hidrogenación de la primera fracción de olefina en el geranilgeraniol protegido, conduciendo de esta manera a una hidrogenación selectiva de las fracciones de olefina. Luego se remueve el grupo protector de hidroxilo mediante hidrólisis bajo una condición básica, para proporcionar el fitol 2-4. La reacción del fitol 2-4 con 2,3,5-trimetilhidroquinona 2-5 en la presencia de un ácido, da como resultado entonces la formación de vitamina E 2-6. De una manera alternativa, el isobutirato de fitilo 2-3 se puede desproteger y hacer reaccionar con 2 , 3 , 5 -trimetilhidroquinona 2-5 en un solo paso mediante un catalizador ácido, para formar la vitamina E 2-6. La vitamina E 2-6 se puede transformar además hasta una vitamina E protegida, tal como acetato de vitamina E 2-7, mediante la acetilación de la fracción de hidroxilo libre. Un método alternativo de síntesis química que convierte el GG en a-tocoferol o esteres de a-tocoferilo, incluye los siguientes pasos: (a) oxidar selectivamente el doble enlace de 2 , 3 -carbono-carbono en el geranilgeraniol 7, para producir el geranilgeraniol-2 , 3 -epóxido 8; (b) hidrogenar los tres dobles enlaces de carbono-carbono restantes en el epóxido 8 para producir el epoxifitol 9; (c) desoxigenar el epoxifitol 9 para producir una mezcla del fitol 5 y el isofitol 6, mediante su reacción con un aceptor de oxígeno; y (d) hacer reaccionar la mezcla de fitol 5 e isofitol 6 con trimetilhidroquinona 4, para producir a-tocoferol 3.

El paso de oxidar selectivamente el doble enlace de 2, 3 -carbono-carbono en el geranilgeraniol para producir el geranilgeranol-2 , 3-epóxido, se realiza con cualquier reactivo que se sepa que epoxida selectivamente la funcionalidad de olefina de los alcoholes alílicos, tales como combinaciones de hidroperóxido de butilo terciario, y catalizadores de vanadio o molibdeno, como es enseñado por el método de Sharpless y Michaelson, J. Am. Chem. Soc. 95. 6136 (1973) . Se podría utilizar peróxido de hidrógeno u otros hidroperóxidos de alquilo para reemplazar al hidroperóxido de butilo terciario, y se pueden utilizar solventes inertes, tales como hidrocarburos aromáticos, hidrocarburos alifáticos, hidrocarburos cicloalifáticos, o esteres alifáticos. El término "hidrocarburo alifático" utiliza para incluir los alcanos de cadena recta o ramificada que tengan de 5 a 8 átomos de carbono. Heptano es el hidrocarburo alifático más preferido. El término "hidrocarburo cicloalifático" se utiliza para incluir los cicloalcanos de 5 a 8 átomos de carbono, y éstos sustituidos con uno o más grupos alquilo de 1 a 4 átomos de carbono. El término "hidrocarburo aromático" se utiliza para incluir benceno, y benceno sustituido con uno a tres grupos alquilo de 1 a 4 átomos de carbono. Tolueno es el hidrocarburo aromático más preferido. El término "esteres alifáticos" se utiliza para incluir los esteres alifáticos que tengan de 3 a 9 átomos de carbono, que tengan la fórmula RXC02R2/ en donde Ri y R2 representan independientemente un grupo alquilo de 1 a 4 átomos de carbono de cadena recta o ramificada, siendo el éster alifático preferido el acetato de etilo. El paso de hidrogenar los tres dobles enlaces de carbono-carbono restantes en el epóxido 8 para producir el epoxifitol 9, se puede hacer con cualquier catalizador heterogéneo u homogéneo convencional bajo una atmósfera de hidrógeno. Por consiguiente, se pueden utilizar catalizadores soportados, tales como paladio sobre carbono, platino sobre carbono, óxido de platino, níquel de Raney, y similares, a un nivel de aproximadamente 0.001 a 0.2 partes en peso con respecto al 8, con o sin un solvente inerte, tal como esteres alifáticos, alcanoles, hidrocarburos aromáticos, hidrocarburos alifáticos y cicloalifáticos, o éteres, bajo una presión de aproximadamente 1 a aproximadamente 200 atmósferas de presión de hidrógeno, a temperaturas de aproximadamente 0°C a aproximadamente 150 °C. El término-"alcanol" se utiliza para representar alcoholes de las fórmulas R3-0H, y alcoholes sustituidos de la fórmula R3OCH2CH2OH, en donde R3 representa un grupo alquilo de 1 a 4 átomos de carbono de cadena recta o ramificada. El término "éter" se utiliza para representar los éteres que tienen la fórmula R?-0-R2, en donde Ri y R2 son como se definieron anteriormente, y tetrahidrofurano. El paso de desoxigenar el epoxitol 9 para producir una mezcla del fitol 5 y el isofitol 6 mediante su reacción con un aceptor de oxígeno, puede ser una reacción de transferencia de oxígeno catalizada por renio, y se puede hacer limpia o en la presencia de un solvente inerte, tal como hidrocarburos aromáticos, hidrocarburos alifáticos, hidrocarburos cicloalifáticos, steres alifáticos, alcanoles, esteres, o agua. La reacción también se puede realizar en un sistema de solvente orgánico-agua de dos fases, con o sin la adición de un catalizador de transferencia de fases. El catalizador puede ser un trióxido de renio sustituido, o una forma soportada por polímero de este compuesto de trióxido de renio. El catalizador se puede utilizar en un nivel de aproximadamente el 0.01 al 5.0 por ciento en peso basándose en el 9. El aceptor de oxígeno debe estar presente en un nivel de 1.0 a 3.0 moles por mol del 9, y se puede seleccionar a partir de triarilfosfinas, trialquilfosfinas de 1 a 6 átomos de carbono, fosfitos de triarilo, fosfitos de trialquilo de 1 a 18 átomos de carbono, hipofosfitos de metal alcalino, o ácido hipofosfórico. Se pueden utilizar otros compuestos capaces de aceptar de una manera irreversible el oxígeno del 9, tales como sulfuros de dialquilo de 1 a 6 átomos de carbono, y ciertas bases de nitrógeno, tales como N-alquilmorfolinas de 1 a 6 átomos de carbono. El término "arilo" se utiliza para incluir fenilo y naftilo, y éstos sustituidos con uno a tres grupos alquilo de 1 a 6 átomos de carbono. El término "aralquilo" se utiliza para incluir los radicales monovalentes que tengan la estructura arilo (CH2) n- en donde n = 1 a 4. El término "trióxido de _ renio sustituido" se utiliza para incluir los compuestos de la fórmula R-Re03, en donde R es un grupo hidrocarbilo seleccionado a partir del grupo que consiste en alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, arilo de 6 a 10 átomos de carbono, aralquilo, ciclopentadienilo, y ciclopentadienilo sustituido con uno a cinco grupos alquilo de 1.a 4 átomos de carbono . Se debe observar que el paso de desoxigenar el epoxifitol en la presente invención, tal como mediante su reacción con trifenilfosfina u otro aceptor de oxígeno adecuado bajo catalización con un compuesto de renio, tal como trióxido de metilrenio, es una reacción novedosa e inesperada. El uso de trióxido de metilrenio como un catalizador en una variedad de reacciones orgánicas ya se ha revisado [Schmidt Ü Prakt . Chem. /Chem. -Ztg. 339. 493-496 (1997)]. Espenson y Zhu [(J. Molecular Catalysis A:Chemical 2Ü2., 87-94 (1995)] dieron seis ejemplos del uso de MTO para catalizar la transferencia del oxígeno desde los epóxidos hasta la trifenilfosfina con la formación de olefinas. Se debe observar que todos los ejemplos de Espenson y Zhu de la generación de olefina a partir de epóxidos, involucraban hidrocarburos simples, no funcionales, tales como ciciohexeno, estilbeno, ciclododeceno, etcétera. Estos colaboradores no demostraron la factibilidad de realizar esta transformación _an una molécula que contuviera una funcionalidad adicional, tal como un grupo hidroxilo primario. De hecho, Espenson y Zhu subsecuentemente demostraron (J. Org. Chem. 61. 324-328 (1996)), que el MTO cataliza la deshidrogenación de los alcoholes primarios con la formación de éteres e hidrocarburos olefínicos. Por consiguiente, es inesperado y sorprendente descubrir que MTO/trifenilfosfina, al aplicarse al epoxifitol, dan un buen rendimiento de productos de alcohol alílico, tales como isofitol y fitol. El paso de hacer reaccionar la mezcla de fitol 5 e isofitol 6 con trimetilhidroquinona 4 para producir a-tocoferol 3, se conduce en la presencia de un catalizador ácido, con frecuencia un ácido de Lewis, tal como cloruro de zinc, como se hace convencionalmente en los procesos conocidos. Se ha determinado que se puede utilizar una mezcla del fitol 5 y el isofitol 6 para preparar a-tocoferol en el mismo rendimiento que cualquier precursor solo. Los compuestos de ejemplo específicos de los términos genéricos utilizados en la presente que son adecuados para utilizarse en la presente invención, son sigue. Los solventes aromáticos típicos incluyen benceno, tolueno, y o-, m- , ó p-xileno, o mezclas de los mismos. El solvente aromático preferido es tolueno. Los solventes alifáticos típicos incluyen pentano normal, hexano normal, heptano normal, y octano normal y sus isómeros; el hidrocarburo alifático preferido es heptano normal. Los hidrocarburos cicloalifáticos típicos incluyen ciclopentano, ciciohexano, metilciclohexano, y cicloheptano. Los esteres alifáticos típicos incluyen acetato de metilo, acetato de etilo, acetato de propilo normal, acetato de butilo normal, acetato de isopropilo, propionato de metilo, propionato de etilo, butirato de metilo, y butirato de etilo. El éster alifático preferido es acetato de etilo. Los alcanoles y alcanoles sustituidos típicos incluyen metanol, etanol, propanol normal, isopropanol, butanol normal, isobutanol, 2-metoxietanol, 2-etoxietanol, y 2-isopropoxietanol . Los éteres típicos incluyen dietiléter, di-isopropiléter, dibutiléter, n-butilmetiléter, t-butilmetiléter, y tetrahidrofurano. Los ácidos de Lewis útiles típicos incluyen cloruro de zinc, cloruro de aluminio, trifluoruro de boro, cloruro férrico, y ácido fosfórico. El ácido de Lewis preferido es cloruro de zinc. 5.0. Farnesol hasta Vitamina E En todavía otra modalidad de la presente invención, se proporciona un método para producir vitamina E a partir de farnesol . Este método involucra en general convertir el farnesol en un primer compuesto intermediario, el cual comprenda un número suficiente de átomos de carbono para formar cuando menos un grupo sustituyente de trimetiltridecilo de la vitamina E, cuando subsecuentemente se haga reaccionar el intermediario con una hidroquinona apropiada para formar vitamina E. El- método incluye además hacer reaccionar el compuesto intermediario con una hidroquinona para formar vitamina E. De preferencia, el compuesto intermediario contiene un número suficiente de átomos de carbono para formar los sustituyentes tanto de metilo como de trimetiltridecilo en la posición 2 de la fracción del anillo de cromano de la vitamina E. De una manera más preferible, el compuesto intermediario se selecciona a partir del grupo que consiste en fitol e isofitol. ~~ El compuesto intermediario se puede preparar mediante la oxidación de farnesol hasta farnesal . Los ejemplos de oxidación de un alcohol -hasta un aldehido se pueden encontrar en "Advanced Organic Chemistry Part B: Reactions and Synthesis" Segunda Edición, Carey y Sundberg, Plenum Press, 1983, páginas 481-490, que se incorpora a la presente como referencia en su totalidad. Por ejemplo, el farnesol se puede oxidar para obtener farnesal utilizando dióxido de manganeso; óxidos de cromo, tales como trióxido de cromo y dicromatos; óxido de plata; condiciones de oxidación de Swern; y condiciones de oxidación de Oppenauer. En adición el farnesol se puede oxidar por medio de una oxidación en aire catalítico, utilizando un catalizador como es dado a conocer por Marko y colaboradores, Science, 1996, 274, 2044.

"En general, esta oxidación con aire del farnesol para obtener farnesal, involucra utilizar cantidades catalíticas de cloruro cuproso, 1, 10-fenantrolina, di-t- butilhidrazodicarboxilato, y un exceso de carbonato de potasio, en un solvente relativamente no polar, tal como tolueno o benceno, a aproximadamente 80 °C. El método para producir vitamina E a partir de farnesol, puede incluir además formar una metilcetona a partir de farnesal. La metilcetona se puede formar mediante una variedad de métodos, incluyendo condensación de aldol con una cetona apropiada, tal como acetona o sus equivalentes. Por ejemplo, la condensación con aldol del farnesal con acetoacetato, seguida por una reacción de descarboxilación, proporciona el mismo producto de metilcetona que una condensación con aldol del farnesal con acetona. La metilcetona también se puede formar utilizando un reactivo de Wittig o de Horner-Emmons-Wadsworth apropiado. El uso de estos reactivos se da a conocer, por ejemplo, en "Advanced Organic Chemistry", Tercera Edición, J. March, John Wiley & Sons, 1985, páginas 845-854, que se incorpora a. la presente como referencia en su totalidad. El método para producir vitamina E a partir de farnesol, puede incluir además reducir las fracciones de olefina en la metilcetona, para formar una alquilmetilcetona. Una reducción de las fracciones de olefina se discute anteriormente en la sección con respecto a la producción de vitamina E a partir de GG, y se incorpora a la presente como referencia. De preferencia, la alquilmetilcetona es 6,10,14-trimetilpentadecan-2-ona. Luego la alquilmetilcetona se convierte en un alcohol alílico. El alcohol alílico se puede producir mediante la adición de un acetiliuro, tal como acetiliuro de litio, acetiliuro de sodio, y acetiliuro de haluro de magnesio, y reducir parcialmente el grupo acetileno resultante hasta un grupo vinilo. De una manera alternativa, el alcohol alílico se puede formar directamente mediante otros métodos bien conocidos en la materia, tales como mediante la reacción de la alquilmetilcetona con un anión de vinilo, tal como haluro de vinilmagnesio, vinil-litio o vinil-sodio. La formación de vitamina a partir de un alcohol alxlico se discute anteriormente con respecto a la producción de vitamina a partir de geranilgeraniol. -En la Figura 3 se ilustra una modalidad particularmente preferida de la síntesis de vitamina E a partir de farnesol. El farnesol 3-8 se oxida hasta obtener farnesal 3-9 bajo condiciones de oxidación de Oppenauer, utilizando isopropóxido de aluminio y acetona. Luego el farnesal 3-9 se convierte en deshidrofarnesilacetona 3-10 mediante una reacción de condensación con aldol, con acetona. Entonces la reducción de las fracciones de olefina sobre la deshidrofarnesilacetona 3-10 mediante hidrogenación, produce la 6, 10, 14-trimetilpentadecan-2-ona 3-11. La adición de acetiliuro a la cetona 3-11 genera entonces al alcohol propargílico 3-12, el cual se reduce parcialmente utilizando condiciones de hidrogenación de Lindlar, para producir el isofitol 3-13. La reacción del isofitol 3-13 con 2,3,5-trimetilhidroquinona 3-5 en la presencia de un catalizador ácido, produce entonces la vitamina E. 6.0 Producción Biológica de Fitol a partir de GGPP ó GG La presente invención proporciona métodos para la conversión química de GG a fitol o una mezcla de fitol e isofitol. El fitol, o una mezcla de fitol más isofitol, se puede entonces hacer reaccionar con una hidroquinona en la presencia de un ácido para formar vitamina E, como se describe en cualquier otra parte de la presente. Recientemente, se clonó el gen que codifica la enzima geranilgeranil-reductasa, a partir de Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia [Keller y colaboradores, Eur. J. Biochem. 251:413-417 (1998)]. Esta enzima cataliza la reducción por pasos de la geranilgeranil-clorofila hasta fitil-clorofila, así como la reducción de GGPP hasta difosfato de fitilo. Con respecto a la presente invención, se utiliza una geranilgeranil-reductasa en un sistema biológico para sustituir la conversión química de GG a fitol. Por ejemplo, la geranilgeranil-reductasa se expresa en una cepa mutante erg9 de S. cerevisiae, que también expresa una actividad de GGPP-sintasa. La reductasa reacciona con GGPP formado in vivo, para producir difosfato de fitilo. Luego una fosfatasa convierte el difosfato de fitilo en fitol, como ocurre en las cepas productoras de farnesol y GG descritas en las secciones anteriores. El microorganismo resultante produce fitol directamente a partir de un sustrato de cultivo, tal como glucosa, en una sola fermentación.

De una manera alternativa, para que una geranilgeranil-reductasa pueda utilizar GG como un sustrato, se proporciona un proceso biológico en donde se produce GG mediante fermentación (como se describe en las secciones anteriores) , y se purifica hasta el grado necesario para utilizarse como un suministro de alimentación para un proceso de biotransformación. La biotransformación utiliza geranilgeranil-reductasa para convertir el GG en fitol en un paso. Esta biotransformación utiliza la geranilgeranil-reductasa aislada, o bien células enteras que contengan actividad de geranilgeranil-reductasa. La enzima o las células se inmovilizan sobre un soporte o mediante reticulación para mejorar la biotransformación. Se anticipa que la geranilgeranil-reductasa se modificaría mediante manipulaciones genéticas para mejorar su actividad para la producción de fitol en un proceso biológico industrial . El fitol formado en un proceso biológico utilizando geranilgeranil-reductasa, se recupera y se purifica hasta el grado necesario para permitir la reacción con una hidroquinona en la presencia de un ácido, para proporcionar vitamina E. 7.0. Producción Química de Vitamina A a partir de Farnesol Como se observó anteriormente, el presente método incluye la preparación de un compuesto de poliencarbonilo a, ß- insaturado a partir de farnesol. Como se utiliza en esta invención, un compuesto de poliencarbonilo a, ß-insaturado se refiere a un compuesto que tiene dos o más fracciones de olefina, en donde cuando menos una de las fracciones de olefina se conjuga con el grupo carbonilo. Un grupo carbonilo se refiere a la presencia de la fracción del doble enlace de carbono-oxígeno. Los grupos carbonilo de ejemplo incluyen aldehidos, cetonas, esteres, ácidos, anhídridos, y haluros de acilo. De preferencia, el compuesto de poliencarbonilo a,ß-insaturado es de la fórmula: en donde Z es O ó CHC02R, y R es hidrógeno o hidrocarbilo de 1 a 10 átomos de carbono. Los grupos hidrocarbilo de acuerdo con la presente invención incluyen hidrocarburos alifáticos, cíclicos, o aromáticos que tengan de 1 a aproximadamente 10 átomos de carbono . Los grupos hidrocarbilo pueden ser rectos o ramificados. Además, los grupos hidrocarbilo opcionalmente pueden estar sustituidos con uno o más ?ustituyentes, tales como halógeno, arilo, hidroxilo, alcoxilo, carboxilo, oxo, y cicloalquilo. Opcionalmente se pueden insertar a lo largo del grupo hidrocarbilo, uno o más átomos de oxígeno, azufre, o de nitrógeno sustituido o insustituido. Los grupos hidrocarbilo de ejemplo incluyen metilo, etilo, isopropilo,, butilo normal, butilo terciario, pentilo normal, isopentilo, heptilo, y octilo. El compuesto de poliencarbonilo a, ß-insaturado se puede preparar a partir de farnesol en una variedad de maneras. En una modalidad particularmente preferida de la presenté invención, se oxida el farnesol para obtener farnesal, el cual entonces se convierte subsecuentemente al compuesto de poliencarbonilo a, ß-insaturado . Los ejemplos de oxidación de un alcohol (por ejemplo, farnesol) para obtener un aldehxdo (por ejemplo, farnesal) se pueden encontrar en "Advanced Organic Chemistry Part B: Reactions and Synthesis", Segunda Edición, Carey y Sundberg, Plenum Press, 1983, páginas 481-490, que se incorpora a la presente como referencia en su totalidad. Por ejemplo, el farnesol se puede oxidar para obtener farnesal utilizando dióxido de manganeso; óxidos de cromo, tales como trióxido de cromo y dicromatos; óxido de plata; condiciones de oxidación de Swern; y condiciones de oxidación de Oppenauer. En adición, el farnesol se puede oxidar por medio de una oxidación con aire catalítico utilizando un catalizador como es dado a conocer por Marko y colaboradores, Science, 1996, 274, 2044. En general, esta oxidación con aire del farnesol para obtener farnesal involucra utilizar cantidades catalíticas de cloruro cuproso, 1, 10-fenantrolina, di-t-butilhidrazodicarboxilato, y un exceso de carbonato de potasio en un solvente relativamente no polar, tal como tolueno o benceno, a aproximadamente 80 °C. El método para producir vitamina A a partir de farnesol puede incluir además ciclar el compuesto de poliencarbonilo a, ß-insaturado, o formar un compuesto de poliencarbonilo a, ß-insaturado cíclico. De preferencia, el compuesto de poliencarbonilo a, ß-insaturado cíclico es de la fórmula : en donde Z es O ó CHC02R, y R es hidrocarbilo de 1 a 10 átomos de carbono. Cuando Z es O, el método puede incluir transformar o a CHC02R ó CHCN. Esta transformación se puede lograr mediante una condensación con aldol utilizando un reactivo apropiado. Por ejemplo, la condensación con aldol del compuesto de poliencarbonilo a, ß-insaturado cíclico con NCCH2C02R, en donde R es hidrógeno o hidrocarbilo de 1 a 10 átomos de carbono, seguida por remoción de la fracción C02R, por ejemplo mediante descarboxilación, proporciona un compuesto en donde el oxígeno de carbonilo ha sido reemplazado por la fracción CHCN. De una manera alternativa, utilizando RO2CCH2C02R, en donde R y R' son independientemente hidrógeno o hidrocarbilo de 1 a 10 átomos de carbono, en lugar de NCCH2C02R, se proporciona un compuesto en donde el oxígeno de carbonilo ha sido reemplazado por la fracción C02R. El método para producir vitamina A a partir de farnesol puede incluir además un paso de reducir el grupo éster (CHC02R) o el grupo nitrilo (CHCN) hasta un alcohol. La Figura 10 ilustra una modalidad particularmente preferida de síntesis de vitamina A a partir de farnesol 1. Una condensación con aldol entre acetona y farnesal 2 , que se deriva a partir de la oxidación de farnesol 1, da como resultado la formación de deshidrofarnesilacetona 3. Hay una variedad de métodos disponibles para sintetizar deshidrofarnesilacetona 3 a partir de farnesal 2. En un aspecto de la presente invención, una mezcla que comprende farnesal 2 y acetona en la presencia de una base se somete a una condición de reacción suficiente para producir la deshidrofarnesilacetona 3. El producto inicial de la reacción de condensación con aldol es ß-hidroxicetona, que normalmente sufre eliminación bajo la condición de reacción, para producir deshidrofarnesilacetona 3. Sin embargo, en algunos casos se pueden obtener algunos o todos los intermediarios de ß-hidroxicetona como el producto. Donde es éste el caso, el simplemente someter a la ß-hidroxicetona a una condición acida o básica, puede dar como resultado la eliminación del grupo hidroxilo, para producir la deshidrofarnesilacetona 3 deseada. La deshidrofarnesilacetona 3 también se puede obtener a partir de farnesal 2 sometiendo a una mezcla de farnesal 2 y un compuesto de la fórmula R?CH2C (=0) CH2R2 a una condición de reacción suficiente para producir la deshidrofarnesilacetona 3, en donde R es una fracción de la fórmula -C02R3, R2 es hidrógeno o una fracción de la fórmula -C02R3, y R3 es un hidrocarbilo que tiene de 1 a aproximadamente 10 átomos de carbono. Con el objeto de obtener la deshidrofarnesilacetona 3 a partir de una reacción entre el farnesal 2 y una fracción de la fórmula R!CH2C (=0) CH2R2, puede ser necesario someter al producto resultante a una condición de descarboxilación para remover los grupos carboxilato R± y/o R2. Normalmente, esta descarboxilación requiere de la conversión del grupo éster hasta el ácido carboxílico o una sal del mismo, lo cual se puede lograr mediante saponificación del éster mediante una condición acida o básica. Haciendo nuevamente referencia a la Figura 10, una mezcla que comprenda deshidrofarnesilacetona 3 y un compuesto de la fórmula XCH2C02R (en donde R es hidrógeno o hidrocarbilo de 1 a 10 átomos de carbono, y X es un haluro) se somete a una condición básica suficiente para producir el éster glicídico-C20 4. De preferencia R se selecciona a partir del grupo que consiste en metilo, etilo, y butilo terciario. De preferencia X se selecciona a partir del grupo que consiste en cloro, bromo, y yodo. El éster glicídico-C20 4 se somete entonces a una condición suficiente para la reconfiguración y deshidratación, con el fin de producir el éster ácido pseudo-retinoico 5. En general, la reconfiguración es aceptada por el contacto del éster glicídico-C2o 4 con un ácido para formar un compuesto de hidroxilo-C20 (no mostrado) . El compuesto de hidroxilo-C20 se deshidrata entonces bajo las condiciones de reacción, o se somete a una condición de deshidratación separada, para producir el éster ácido pseudo-retinoico deseado 5. La deshidratación del compuesto de hidroxilo-C2o se puede lograr bajo condiciones acidas o básicas. El sometimiento del éster del ácido pseudo-retinoico 5 a una condición suficiente para la ciclación, produce el éster del ácido retinoico 6. Una condición de ciclación típica involucra poner en contacto el éster del ácido pseudo-retinoico 5 con un ácido. El ácido debe ser suficientemente fuerte—para protonar una fracción de olefina, generando de esta manera un ion de carbonio, es decir, un carbocatión, el cual puede someterse a una ciclación. También, se puede agregar un nucleófilo relativamente débil, tal como un haluro y/o un ácido carboxílico, para atrapar el carbocatión ciclado resultante. Cuando está presente un nucleófilo débil, el producto ciclado resultante puede contener un nucleófilo, el cual puede sufrir eliminación bajo las condiciones de reacción, o se puede remover mediante eliminación en una reacción separada. De preferencia, el ácido se selecciona a partir del grupo que consiste en ácido clorhídrico; ácido fosfórico; ácido fluorosulfónico; ácido sulfúrico; y ácidos carboxílicos, tales como ácido fórmico y ácido acético; y una mezcla de los mismos. Las condiciones de reacción para la ciclación de 1,5-dieno, tal como acetato de farnesilo, utilizando un ácido, se dan a conocer en Muntyan y colaboradores, Izev. Akad. Nauk SSSR, Ser. Khim. , 1973, 633, y Stork y Burgstahler, J". Amer. Chem. Soc. , 1955, 77, 5068, que se incorporan a la presente como referencia en su totalidad. De una manera alternativa, el éster del ácido pseudo-retinoico 5 se puede ciclar utilizando una enzima. Por ejemplo, es bien sabido que la licopeno-ciclasa cicla las cadenas C40 apropiadas para producir carotenoides . De una manera similar, se puede utilizar una enzima de ciclasa para ciclar el éster del ácido pseudo-retinoico o su derivado, para producir el éster del ácido rectifico o su derivado. Nuevamente haciendo referencia a la Figura 10, en una modalidad particular, el éster del ácido retinoico 6 se reduce hasta vitamina A (retinol) . Esta reducción se puede lograr mediante cualquiera de las reacciones de reducción de éster conocidas, tales como una reducción con hidruro utilizando un compuesto que incluya, pero sin limitarse a, LÍAIH4, hidruro de bis (2 -metoxietoxi) aluminio y sodio, e hidruro de di-isobutilaluminio. De una manera alternativa, el éster del ácido retinoico 6 se puede saponificar o hidrolizar bajo condiciones acidas o básicas para producir ácido retinoico, el cual entonces se puede reducir utilizando un compuesto que incluya, pero sin limitarse a, borano (B2H6) , para reducir selectivamente el grupo de ácido carboxílico en la presencia de olefinas para producir vitamina A (retinol) 8. Como se muestra en la Figura 10, en otro aspecto de la presente invención, primero se reduce el éster del ácido retinoico 6 hasta el retinal 7, poniendo en contacto el éster del ácido retinoico 6 con un primer agente reductor. Luego el retinal 7 se pone en contacto con un segundo agente reductor para producir vitamina A (8) . El primer agente reductor reduce un éster hasta un aldehido. Existen una variedad de métodos y agentes reductores actualmente disponibles para reducir un éster hasta un aldehido. Estos agentes reductores incluyen, pero no se limitan a, hidruro de diisobutilaluminio. El segundo agente reductor normalmente reduce un aldehido hasta un alcohol, pero algunos de estos agentes reductores también pueden reducir un éster directamente hasta un alcohol . Los segundos agentes reductores de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, LiAlH4, hidruro de di-isobutilaluminio, hidruro de bis (2-metoxietoxi) aluminio y sodio, y borohidruro de sodio. Un acetato 9 u otro derivado de éster de vitamina A, se puede obtener poniendo en contacto vitamina A con un agente de acetilación u otros agentes de transferencia de acilo, en una condición suficiente para producir acetato de vitamina A u otros derivados de éster de vitamina A, respectivamente. El agente acetilante de ejemplo y el agente de transferencia de acilo incluyen, pero no se limitan a, anhídridos o cloruros de acilo del ácido acético, ácido propanoico, ácido fórmico, ácido butanoico, y anhídridos mixtos. Normalmente, también se utiliza un catalizador o una base en las reacciones de transferencia de acilo. Las bases de ejemplo útiles en la transferencia de acilo incluyen, pero no se limitan a, hidróxidos; carbonatos y bicarbonatos de sodio, litio, y potasio; y aminas, tales como piridina y trietilamina. También se puede utilizar un catalizador de transferencia de acilo para facilitar la reacción y/o reducir el tiempo de reacción. Los catalizadores de transferencia de acilo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, dimetilaminopiridina (DMAP) . Otra modalidad particularmente preferida para producir vitamina A a partir de farnesal se muestra en la Figura 11. La deshidrofarnesilacetona 3 (producción descrita 77 anteriormente) se somete a una condición de deshidrogenación suficiente para producir una bis (deshidro) -cetona-C?8 10. La deshidrogenación de la deshidrofarnesilacetona 3 se puede lograr poniendo en contacto la deshidrofarnesilacetona 3 con un agente de deshidrogenación. Los agentes de deshidrogenación de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, quinonas, tales como 2 , 3-dicloro-5, 6-diciano-l, 4-benzoquinona (DDQ) ; catalizador de metal, tales como paladio, platino, y níquel; y otros agentes de deshidrogenación adecuados. La bis (deshidro) -cetona-C18 10 se somete entonces a una condición suficiente para sufrir una ciclación, con el fin de formar una cetona-C18 cíclica 11. La condición de ciclación típica involucra poner en contacto la bis (deshidro) -cetona-C18 10 con un ácido. Una condición de reacción típica para la ciclación de un 1,5-dieno, tal como acetato de farnesilo, se discute anteriormente, y se puede utilizar para esta ciclación. La ciclación también puede ser afectada por un catalizador de metal, que es conocido por un experto en la técnica, incluyendo níquel y rodio. La bis (deshidro) -cetona-C?8 10, también se puede ciclar utilizando una enzima. Las enzimas útiles se discuten anteriormente . Haciendo nuevamente referencia a la Figura 11, una mezcla que comprenda la cetona-C?8 cíclica 11 y un compuesto de la fórmula NCCH2C02R se somete a una condición de reacción suficiente para formar un nitrilo-C20 12, en donde R es hidrógeno o hidrocarbilo de 1 a 10 átomos de carbono. Cuando R es hidrógeno, se pone en contacto ácido a-nitrilacético con una base para desprotonar el protón carboxílico, así como el protón-a del grupo carbonilo. Estos dos protones se pueden remover utilizando dos bases diferentes, una para el protón carboxílico, y otra para el protón-a, o ambos protones se pueden remover utilizando una base que sea suficientemente fuerte para desprotonar ambos protones . Si R es hidrocarbilo de 1 a 10 átomos de carbono, entonces se utiliza una base que sea suficientemente fuerte para desprotonar el acetato de a-nitrilo . Debido a que NCCH2C02R contiene dos grupos de retiro de electrones, se puede utilizar una base relativamente débil, tal como un hidróxido o una amina, para desprotonar un protón-a. Luego el acetato de a-nitrilo desprotonado sufre una reacción de condensación con cetona-C18 cíclica 11, seguida por los procesos de deshidratación y descarboxilación, para producir un compuesto de nitrilo-C20 12. La deshidratación puede presentarse bajo la condición de reacción de condensación, o puede ser efectuada en una condición de reacción separada. Si R es hidrocarbilo de 1 a 10 átomos de carbono, es necesario saponificar, es decir, hidrolizar, el grupo alquilo, para formar un ácido carboxílico o un anión de carboxilato antes de someter al producto condensado a una condición de descarboxilación. La 79 condición de descarboxilación del producto condensado generalmente requiere de someter al producto condensado a una temperatura elevada. Luego el nitrilo-C20 12 se pone en contacto con un primer agente reductor en una condición suficiente para producir el retinal 7, o se puede reducir con un agente reductor suficientemente fuerte para producir vitamina A (8) . El retinal 7 se puede reducir utilizando un segundo agente reductor para proporcionar vitamina A. Las condiciones y agentes de reducción adecuados para estas reducciones son los descritos anteriormente. La vitamina A se puede convertir adicionalmente en un derivado de éster de vitamina A mediante la reacción de vitamina A con un agente esterificante apropiado, como se discutió anteriormente. En otra modalidad de la presente invención, el retinal 7 que se produce mediante cualquiera de los procesos anteriormente descritos, se somete a una condición suficiente para producir ß-caroteno 13. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 12, dos moléculas de retinal 7 sufren una reacción de acoplamiento cuando se someten a lo que comúnmente se conoce en la técnica como condición de reacción de acoplamiento de McMurry. La reacción de acoplamiento de McMurry es bien conocida en la técnica de la química orgánica, y es descrita por John McMurry en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,225,734, la cual se incorpora a la presente como referencia en su totalidad. Brevemente, la reacción de acoplamiento de McMurry involucra una producción de olefinas a partir de un acoplamiento reductivo de grupos carbonilo, tales como cetonas y aldehidos con especies reactivas Ti (II) y/o Ti(0). En general, las especies reactivas se generan en el sitio mediante reducción de Ti (III) ó Ti (IV) con el agente reductor seleccionado a partir del grupo que consiste en LiAlH , Na, K, Zn, Mg, NaBH4, CaH2, y LíBH4. Las especies de Ti (III) y Ti (IV) normalmente son haluros de titanio, tales como TiCl3 y TiCl4, respectivamente . En otra modalidad de la presente invención, se produce ß-caroteno 13 a partir de vitamina A, que se produce mediante cualquiera de los métodos anteriormente descritos . Como se muestra en J_a Figura 13 , el método involucra en general hacer reaccionar un haluro de retinilo 15 con retinilfenilsulfona 14. Se puede producir un haluro de retinilo 15 poniendo en contacto vitamina A que se produzca mediante el proceso descrito anteriormente, con la mezcla de reacción seleccionada a partir del grupo que comprenda HX, P(X)3, y una mezcla de P(R4)3 y X2 en una condición suficiente para producir el haluro de retinilo, en donde X es un haluro, X2 es un halógeno, y R4 es hidrocarbilo de 1 a 10 átomos de carbono. Luego el haluro de retinilo 15 se pone en contacto con un anión de retinilfenilsulfona 14 en una condición suficiente para producir sulfona-C40 16. En los casos en donde se desprotone la retinilfenilsulfona 14 con la base antes de ponerse en contacto con el haluro de retinilo 15, la base es suficientemente fuerte para desprotonar sustancialmente toda la retinilsulfona 14. Las bases de ejemplo para desprotonar sustancialmente toda la retinilfenilsulfona 14 antes de ponerla en contacto con el haluro de retinilo 15 incluyen, pero no se limitan a, di-isopropilamida de litio (LDA) , hexametildisilazida de sodio (NaHMDS) , metil-litio, butil-litio, t-butil-litio, sec-butil-litio, hidruro de potasio, hidruro de sodio, y t-butóxido. De una manera alternativa, el haluro de retinilo 15, la retinilfenilsulfona 14, y la base, se combinan todos en un aparato de reacción, y se deja desprotonar la base a algunas de las moléculas de retinilfenilsulfona que puedan reaccionar con el haluro de retinilo 15 para formar la sulfona-C40 16, es decir, las especies aniónicas reactivas de la retinilfenilsulfona 14 se generan en el sitio. Nuevamente haciendo referencia a la Figura 13 , la retinilfenilsulfona 14 se puede producir mediante la reacción de un retiniléster, tal como acetato de retinilo 9, o un haluro de retinilo 15, con una mezcla de reacción que comprenda ácido fenilsulfínico, en una condición suficiente para producir la retinilfenilsulfona 14. Se puede utilizar una base para desprotonar el ácido fenilsulfínico, el cual luego sufre una reacción de sustitución nucleofílica con acetato de retinilo o el haluro de retinilo 15 para producir retinilfenilsulfona 14. El ácido fenilsulfínico se puede desprotonar de una manera sustancialmente completa antes de ponerse en contacto con el acetato de retinilo o el haluro de retinilo 15, mediante la utilización de una base, tal como LDA, metil-litio, NaHMDS, t-butil-litio, sec-butil-litio, NaH, KH, ó t-butóxido. De una manera alternativa, se puede generar ácido fenilsulfínico desprotonado en el sitio mediante la utilización de una base, tal como los hidróxidos, bicarbonatos, y carbonatos de litio, sodio, y calcio, aminas, tales como trietilamina, y di-isopropiletilamina, y alcóxidos, tales como metóxido, etóxico, y t-butóxido. La sulfona-C40 16 que se produce mediante una reacción entre haluro de retinilo 15 y retinilfenilsulfona 14, se somete entonces a una condición suficiente para eliminar el ácido fenilsulfínico, con el fin de producir ß-caroteno 13. La eliminación del ácido fenilsulfínico a partir de la sulfona-C40 16, se puede lograr poniendo en contacto la sulfona-C40 16 con una base. Las bases de ejemplo útiles para la reacción de eliminación incluyen, pero no se limitan a, LDA, metil-litio, di-isopropiletilamina, hidróxidos, y alcóxidos, tales como metóxido, etóxido, y t-butóxido. Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar las modalidades de la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de la invención, como se estipula en las reivindicaciones.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Este ejemplo describe la creación de mutantes erg9 mediante mutagénesis química de S. cerevisiae cepa ATCC 28383, utilizando ácido nitroso. Como se observó anteriormente, una manera de incrementar los rendimientos de farnesol ó GG, es reducir o eliminar la actividad de sintasa de escualeno. En S. cerevisiae, la sintasa de escualeno es codificada por el gen ERG9 . A. Mutagénesis La cepa 28383 se obtuvo de la ATCC. Es la progenitora de la cepa 60431 utilizada más adelante en algunos experimentos para propósitos comparativos (también obtenida de la ATCC) . La cepa 60431 es un mutante erg9 -l que produce farnesol . Se realizó una curva de aniquilación utilizando ácido nitroso con el ATCC 28383. Utilizando la información derivada de la curva de aniquilación, se realizó una mutagénesis del ATCC 28383 son ácido nitroso como sigue. Las células 28383 se incubaron durante la noche a 30 °C en un medio YPD (extracto de Bacto-levadura al 1 por ciento, Bacto-peptona al 2 por ciento, y glucosa al 2 por ciento) con agitación. Las células se lavaron y se mutaron. Después de la mutagénesis, las células se dejaron recuperarse cultivándolas en YPDC (YPD más 4 miligramos/litro de colesterol) a 22 °C durante la noche. Luego el cultivo se lavó y se aplicó sobre agar YPDC (YPDC más Bacto-agar al 2 por ciento) conteniendo diferentes niveles de nistatina (20, 30, 40, 50 miligramos/litro) . Estos cultivos se incubaron durante dos semanas a 22 °C. El antibiótico nistatina con polieno antifúngico inhibe la síntesis de la pared celular en las células en crecimiento enlazándose específicamente con ergosterol, lo cual a su vez da como resultado una alteración de la permeabilidad selectiva. Algunas cepas gue son resistentes a la nistatina han demostrado tener una menor producción de ergosterol. La nistatina tiene poca, en su caso, afinidad para el colesterol que, cuando se suministra exógenamente, puede ser utilizado por los auxótrofos de esterol tan eficientemente como el ergosterol. Se obtuvieron aproximadamente 3,000 colonias resistentes a nistatina. Se rastrearon para determinar su sensibilidad a la temperatura (ts) y la auxotrofia de esterol. Para determinar la sensibilidad a la temperatura, se cultivaron células mutadas sobre YPDC a una temperatura permisiva (22°C), y subsecuentemente se aplicaron réplicas a YPD-agar, y se .incubaron a_ una , temperatura restrictiva (37°C) . Cualesquiera células que fracasaran para crecer a la temperatura más alta, incluirían aquéllas con tanto un defecto condicionalmente letal como constitutivamente letal en la ruta de esterol. Los mutantes sensibles a la temperatura se rastrearon para determinar la auxotrofia de esterol mediante aplicación de réplicas a YPD-agar (sin colesterol), e incubación durante la noche a 28 °C. De las 3,000 colonias resistentes a nistatina, se guardaron 170 después de la confirmación de la sensibilidad a la temperatura y la auxotrofia de esterol.

B. Ensayos en Tubos Las 170 cepas se evaluaron inicialmente en ensayos de tubos para ' la producción de farnesol y otros intermediarios de la ruta isoprenoide como sigue. Se cultivaron células en 10 mililitros de YPDC en tubos con tapas de rosca durante 48 horas a 28 °C con agitación. Las células se centrifugaron durante 5 a 10 minutos a 2,800 rpm, y el sobrenadante se transfirió a otro tubo. Las células se lavaron una vez con 5 mililitros de agua destilada, y se centrifugaron nuevamente durante 5 a 10 minutos a 2,800 rpm. El granulo celular se extrajo mediante la adición de 2.5 mililitros de pirovalol al 0.2 por ciento (en 'metanol) , y 1.25 mililitros de KOH al 60 por ciento (en H20 destilada) , poniendo en vórtex para mezclar, e incubando en un baño de agua a 70-75°C durante 1.5 horas. Después de esta saponificación, se agregaron 5 mililitros de hexano, y el tubo se volvió a tapar y se puso en vórtex durante 15 a 30 segundos. El tubo se centrifugó a 2,800 rpm durante 5 minutos para separar las fases. Se recuperó la capa de hexano. Si es necesario, la muestra se puede concentrar mediante evaporación del solvente bajo nitrógeno, y agregando de regreso una cantidad apropiada de hexano para el análisis. Para extraer el sobrenadante, se agregaron 5 mililitros de hexano al sobrenadante, y el tubo se volvió a tapar y se puso en vórtex durante 15 a 30 segundos. El tubo se centrifugó a 2,800 rpm durante 25 minutos para separar las fases. La capa de hexano se recuperó, y la muestra se concentró mediante evaporación bajo nitrógeno, y agregando de regreso una cantidad apropiada de hexano para el análisis. Los extractos de hexano a partir de este rastreo primario se analizaron mediante cromatografía de capa delgada (TLC) con confirmación mediante cromatografía de fases (GC) /espectrometría de masas (MS) , para determinar la presencia de farnesol y otros intermediarios de la ruta isoprenoide. La cromatografía de capa delgada se realizó sobre placas de gel de sílice Cía de fase invertida, utilizando 6:4 (volumen/volumen) de acetato de etilo/acetonitrilo (EtOAc/MeCN) como la fase móvil, y ácido fosfomolíbdico al 2 por ciento (peso/volumen) (PMA) en etanol para la detección. La GC/MS se realizó utilizando un cromatógrafo de gases Hewlett Packard 5890 y un detector selectivo de masas serie 5970. La columna utilizada fue una Restek Rtx-5MS (15 metros de longitud, 0.25 milímetros de diámetro interno, sistema de película de 1 miera) . Se identificaron trece mutantes como productores de farnesol u otros intermediarios .

C. Ensayos de Matraz de Agitación Entonces estos trece mutantes se rastrearon en matraces de agitación, junto con la cepa parental, 28383, y la cepa productora de farnesol 64031. Se inocularon 50 mililitros de un medio YPDC en 250 matraces Erlenmeyer con pantalla de 250 mililitros, con cultivos nocturnos hasta una OD inicial a 600 nanómetros de 0.05, y se incubaron con agitación a 28 °C. Los matraces se muestrearon, y se determinaron la OD a 600 nanómetros, el peso seco, y el contenido de esterol. Para medir el peso seco, se centrifugaron 5 mililitros del cultivo a 8,000 rpm. Las células se lavaron dos veces con H20 destilada, y el granulo celular se volvió a suspender en 3 a 5 mililitros de H20 destilada, y se transfirieron a una charola de peso seco, previamente pesada. La charola se colocó en un horno a 100 °C durante 24 horas, luego se enfrió en un desecador, se pesó en una balanza analítica, y se determinó el peso seco en gramos/litro a partir de la fórmula: [Peso total (charola + células) - peso de la charola] x 200 = peso seco en gramos/litro.

Para la determinación del esterol, se procesaron 20 mililitros de cultivo, se extrajo el granulo celular y el sobrenadante, y se midieron el farnesol y otros esteróles como se describió anteriormente . Siete de los trece mutantes parecieron producir intermediarios en la ruta de ergosterol, y se evaluaron adicionalmente en otros experimentos de matraz de agitación (ver más adelante) . Los trece mutantes se habían seleccionado por su resistencia a los niveles más altos de nistatina. Se utilizaron cultivos nocturnos para inocular 50 mililitros de un medio YPDC en matraces de agitación por triplicado para cada una de las siete cepas mutantes (MBNA1, MBNAl-5, MBNA1-9, MBNA1-10, MBNA1-11, MBNA1-13, MBNA1-14), la cepa parental 28383, y la cepa mutante 64031. Las células y el medio se extrajeron por separado a las 24, 48, y 72 horas en hexano, como se descubrió anteriormente. El análisis de peso seco (realizado como se describió anteriormente) se realizó en cada uno de estos puntos para determinar la densidad celular. Los extractos de hexano se analizaron mediante GC/MS para determinar sus niveles de farnesol, escualeno, colesterol, y ergosterol. Los resultados del farnesol se presentan en la Tabla 3 más adelante. Se encontraron bajos niveles de farnesol en los sobrenadantes de cultivo, acumulándose niveles muchos más altos en las células. La cepa MBNA1-1 produjo el 1 por ciento de farnesol, y también el 0.1 por ciento de ergosterol a las 72 horas. La cepa MBNA1-5 no produjo farnesol, pero produjo el 0.3 por ciento de escualeno. La cepa MBNA1-9 produjo el 0.64 por ciento de farnesol en 48 horas. Las cepas MBNA1-10, MBNA1-11, y MBNA1-14 produjeron niveles muy bajos de farnesol en las células, y parecieron producir ergosterol. La cepa MBNA1-13 mostró la producción más alta de farnesol (2.5 por ciento) , basándose en el peso seco celular (42,187 nanogramos/mililitro de cultivo) , y no mostró ninguna producción de ergosterol. Por consiguiente, entre las cepas productoras de farnesol (MBNA1-1, MBNA1-9, y MBNA1-13) , pareció haber diferentes grados de bloqueo en la ruta de ergosterol, debido a que MBNA1-1 y MBNA1-9 produjeron niveles más bajos de farnesol, y no requirieron de ergosterol para el crecimiento, y la MBNA1-13 produjo el nivel más alto de farnesol, y tuvo un requerimiento estricto de suplemento de esterol para el crecimiento. La cepa parental 28383 mostró producción de ergosterol hasta el 0.4 por ciento (ninguna producción de farnesol) , y la cepa mutante erg9 64031 mostró acumulación de farnesol hasta aproximadamente el 0.4 por ciento. TABLA 3 Caracterización de los Nuevos Mutantes en el Experimento de Matraz de Agitación D. Análisis Enzimático Para todos los ensayos de enzimas, las células se cultivaron en un medio YPDE . (Medio YPD conteniendo 5miligramos/litro de ergosterol) . Las células se cosecharon mediante centrifugación. Se suspendió 1 gramo de células (peso seco) en 4 mililitros de Tris-HCl 0.1 M, pH de 7.0. Luego la suspensión celular se alteró pasándola a través de una celda de presión French (20,000 psi) . La suspensión celular resultante (lisada) luego se centrifugó (15,000 x g) , y el sobrenadante (extracto exento de células) se utilizó directamente para los ensayos enzimáticos, a menos que se observe de otra manera .

Los mutantes se ensayaron para determinar la actividad de sintasa de escualeno. El ensayo de sintasa de escualeno involucró la incubación de un extracto exento de células con FPP en la presencia de la forma de fosfato de dinucleótido de dicotinamida-adenina, (NADPH) , extracción en acetato de etilo, y detección de escualeno mediante cromatografía de gases. Específicamente, se combinaron Tris 0.1 M/HC1, pH de 7 (X microlitros), DTT 0. ÍM (2 microlitros), MgCl2 0.1 M (10 microlitros), NADPH 0.1 M (4 microlitros), 1 miligramo/mililitro de FPP (6 microlitros) , y extracto exento de células (sobrenadante a 7,000 x g) (Y microlitros), en donde X + Y = 178 microlitros para formar 200 microlitros en total. Esta ' mezcla se incubó en tubos de vidrio a 37 °C durante 40 minutos. Luego se extrajo con 0.15 mililitros de acetato de etilo. El extracto se transfirió a frascos de plástico, y se centrifugó a 15,000 x g durante 5 minutos. El extracto de acetato de etilo se analizó utilizando GC/MS. La Tabla 4 muestra los niveles de sintasa de escualeno para los mutantes MBNA1-1, MBNA1-9, MBNA1-13, y las cepas de ATCC 64031 y 28383. La actividad de sintasa de escualeno fue de 0.12 microgramos de escualeno formado/minuto x miligramo de proteína para el organismo de tipo silvestre 28383. Los niveles de actividad para las otras cuatro cepas fueron menores que los límites detectables de este ensayo. Se esperaría niveles reducidos de sintasa de escualeno para MBNA1-1 y MBNA1-9 y 64031, debido a que se han caracterizado como mutantes parcialmente bloqueados que producen farnesol y bajas cantidades de ergosterol. MBNA1-13 es un mutante productor de farnesol que no puede crecer sin esterol agregado, de modo que se esperaría que esté mutante bloqueado no tendría un nivel detectable de sintasa de escualeno. Los extractos de estas cepas se volvieron a ensayar con concentraciones más altas de extracto exento de células y tiempos de incubación más largos. Una vez más, no se detectó sintasa de escualeno en ninguno de los mutantes.

TABLA 4 ND = No Detectada Se realizó un análisis enzimático para las cepas productoras de farnesol (MBNA1-1, MBNA1-9, y MBNA1-13) y su cepa parental 28383. Los niveles de enzima comparados fueron aquéllos de acetoacetil-CoA-tiolasa, HMG-CoA-sintasa, HMG-CoA-reductasa, FPP-sintasa, y un fosfatasa. Se prepararon los extractos exentos de células como se describió anteriormente . Para el ensayo de FPP-sintasa, se combinaron DTT 0.1 M (2 microlitros), MgCl2 0.1 M (2 microlitros), 1 miligramo/mililitro de IPP (6 microlitros) , 1 miligramo/mililitro de GPP (6 microlitros) , extracto exento de células (Y), y Tris 0.1 M/HC1 (pH de 7.0) (X microlitros), en donde X + Y = 84 microlitros, y se incubaron a 37 °C durante 15 minutos. Luego esta mezcla se extrajo dos veces con 0.3 mililitros de hexano para remover el farnesol previamente existente. En seguida, se agregaron 0.1 mililitros de regulador de glicina 2 x (glicina 0.2 M, MgCl2 2 mM, Zn Cl2 2 mM) , pH de 10.4, y 33 unidades de fosfatasa alcalina, y la mezcla se incubó a 37 °C durante 1 hora. La mezcla se extrajo con 0.1 mililitros de acetato de etilo, y se secó con sulfato de sodio. El farnesol se determinó con cromatografía de gases. Se incluyó un control sin fosfatasa en cada ensayo . La HGM-CoA-reductasa cataliza la reacción de HMGCoA con NADPH para formar mevalonato, fosfato de dinucleótido de nicotinamida-adenina (NADP) , y CoA (ver la Figura 1) . Para estos ensayos, los extractos exentos de células se prepararon como se describió anteriormente, excepto que las suspensiones 9 celulares alteradas se centrifugaron a 7,000 x g, en lugar de 15,000 x g. La reacción fue seguida por monitoreo del consumo de HMG-CoA mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) . Para el ensayo, una mezcla de reacción que contenía (en un volumen final de 0.1 mililitro) Na2H2P207 0.1 M, pH de 6.5, DTT 2 mM, NADPH 1 mM, HMG-CoA 0.4 mM, y extracto exento de células (el volumen del extracto se varió, formándose el resto de la reacción hasta 0.1 mililitro con Na2H2P207 0.1 M, pH de 6.5), se incubó a 37°C durante 15 minutos. La reacción se monitoreó con HPLC (Columna de fase invertida Luna C18 (Phenomenex) utilizando un gradiente del 0 por ciento del Solvente B durante 1 minuto, seguido por del 0 al 11 por ciento del B durante 42 minutos. El Solvente A fue 86:14 (volumen/volumen) de fosfato de potasio 40 mM (pH de 6.0) /metanol . El Solvente B fue metanol. La longitud de onda para la detección fue de 260 nanómetros) . La HMG-CoA-sintasa convierte el acetoacetil-CoA y el acetil-CoA en HMG-CoA y CoA. El ensayo monitorea la producción de HMG-CoA mediante HPLC. Para el ensayo, se combinaron Na2H2P207 0.1 M, pH de 6.5, (X microlitros), acetoacetil-CoA 20 mM (4 microlitros) , acetil-CoA 20 mM (2 microlitros) , y extracto exento de células (Y microlitros) , en donde X + Y es igual a 94 microlitros (volumen total de 100 microlitros), y se incubaron a 37°C durante 5 minutos. Luego se calentó la mezcla de reacción a 60 °C durante 5 minutos para inactivar la enzima, seguido por centrifugación en una microcentrífuga a velocidad total durante 5 minutos. El sobrenadante se analizó mediante HPLC. La acetoacetil-CoA-tiolasa cataliza una reacción reversible mediante la cual, en la dirección hacia adelante, se hacen reaccionar dos moléculas de acetil-CoA para formar acetoacetil-CoA y CoA. El ensayo monitorea la formación de acetil-CoA (reacción inversa) mediante HPLC. Para el ensayo, se combinaron Na2H2P207 0.1 M, pH de 6.5, (X microlitros), acetoacetil-CoA 20 mM (2 microlitros) , CoA 20 mM (3 microlitros) , y extracto exento de células (Y microlitros) , en donde X + Y es igual a 95 microlitros (volumen total de 100 microlitros), y se incubaron a 37°C durante 5 minutos. Luego la mezcla de reacción se centrifugó en una centrífuga Microcon-10 (Amicon), para separar la enzima del producto. El sobrenadante se analizó mediante HPLC. El ensayo de fosfatasa cuantifica la actividad de fosfatasa midiendo la formación de p-nitrofenol (mayor absorbancia a 400 nanómetros) . Para el ensayo de fosfatasa, se combinaron Tris 0.1 M-HCl, pH de 7 (X microlitros), MgCl2 1 M (2 microlitros) fosfato de p-nitrofenilo 50 mM (10 microlitros) , y extracto exento de células (Y microlitros) , en donde X + Y = 1 mililitro, y se incubaron a 37°C durante 15 minutos, después de lo cual se midió la absorbancia a 400 nanómetros .

La Tabla 5 muestra los niveles para cada una de las cinco enzimas en estas cuatro cepas . Los niveles de acetoacetil-CoA-tiolasa fueron comparables en todas estas cepas. Los niveles de HMG-CoA-sintasa y HMG-CoA-reductasa pareciexon ser dos a tres veces más altos en las cepas mutantes. Los niveles de FPP-sintasa fueron iguales o más bajos en los mutantes que en las mutantes que en la 28383. Los niveles de fosfatasa parecieron ser elevados de tres a cuatro veces en las cepas mutantes, comparándose con la progenitora. Debido a que todas estas cepas se aislaron mediante mutagénesis clásica, es posible que existan otras mutaciones en estas cepas, además de la mutación erg9. TABLA 5 98 E. Análisis Genético de ERG9 Se preparó el ADN cromosómico a partir de las cepas ATCC 28383, MBNA1-1, MBNA1-9, y MBNA1-13, de acuerdo con el método descrito en Sherman y colaboradores (Sherman, F., G.R. Fink. y J.B. Hicks, 1989, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY) . El ADN genómico se digirió con las enzimas de restricción Apal y Nsíl, y se sometió a análisis de mancha Southern utilizando un fragmento de ADN ERG9 biotinilado como una sonda. La sonda ERG9 consistió en un fragmento de ADN de ERG9 de 2044 pares de bases aislado a partir de un gel de agarosa después de la digestión del plásmido pTWM103 con ApaJ y Nsil. pTWM103 consiste en el gen ERG9 y las secuencias de flanqueo que se extienden desde la posición #10916 hasta #13868 de la secuencia GenBank Acceso #U00030. Este plásmido se construyó mediante amplificación con reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del gen ERG9 , y las regiones de flanqueo, utilizando los siguientes dos oligonucleótidos: 5' -oligo = VE107-5 CTC AGT ACG CTG GTA CCC GTC AC (denotado en la presente como SEQ ID N0:1) 3' -oligo = VE105-3 gat gga TCC CAÁ TAT GTG TAG CTC AGG (denotado en la presente como SEQ ID NO: 2) Las letras mayúsculas designan las secuencias de ADN a partir de la región de flanqueo de ERG9 , mientras que las letras minúsculas designan las bases agregadas para crear los sitios de restricción. VE107-5 contiene secuencias desde la posición #10905 hasta la posición #10928 de la secuencia GenBank Acceso #U00030. VE105-3 contiene el complemento inverso de las secuencias desde la posición #13868 hasta la posición #13847. Las condiciones de la amplificación fueron como sigue: El ADN de plantilla fue el ADN genómico aislado a partir de la cepa S288C (Yeast Genetic Stock Center, Berkeley, CA) 2 minutos a 94°C/l ciclo 1 minuto a 94 °C, 1 minuto a 52 °C, 1.5 minutos a 74°C/30 ciclos 5 minutos a 74°C/l ciclo El ?ON de ERG9 de 2969 pares de bases generado a partir de esta reacción en cadena de la polimerasa, se dirigió con Kpnl y BamHl, luego se ligó a Kpnl, YEp352 digerido con BamHl para generar el plásmido pTWM103. YEp352 es un vector de lanzamiento de levadura/E. coli (Hill, J.E., Myers, A.M. Koerner, T.J., y Tazagaloff, A., 1986, Yeast/E. coli Shuttle Vectors with Múltiple Unique Restriction Sites, Yeast 2.: 163-167) . El DNA para la sonda ERG9 descrita anteriormente, se obtuvo digiriendo TWM103 con Apal y Nsil, y purificando el fragmento de 2044 pares de bases que contenía el gen ERG9 y las secuencias de flanqueo. Luego el ADN de ERG9 se biotiniló utilizando extensión de cebador aleatorio (NEBlot Phototope Kit, New England BioLabs, Beverly, MA) . Aproximadamente 1 microgramo de la sonda ERG9 biotinilado se híbrido en la mancha Southern del ADN genómico digerido con Apal, Nsil a partir de -las cepas ATCC 28383, MBNA1-1, MBNA1-9, y MBNA1-13. La mancha reveló que las cuatro cepas contenían una sola secuencia de hibridación localizada sobre un fragmento de 2044 pares de bases. Para clonar los genes ERG9 a partir de estas cuatro cepas, nuevamente el ADN genómico de cada una se dirigió con Apal y Nsil. El vector de lanzamiento de levadura/£. coli pRS315 (Sikorski, R.S., y P. Hieter, 1989, A System of Shuttle Vectors and Yeast Host Strains Designed for Efficient Manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae, Genetics, 122. - 19-27) se digirió con Apal y PstI (Nsil y Ps ti tienen extremos cohesivos compatibles) . Los ADNs digeridos se separaron sobre un gel de agarosa, y se cortaron del gel los fragmentos de ADN cromosómicos en el rango de tamaños de aproximadamente 1.6 kb hasta aproximadamente 3 kb, así como la banda de 3895 pares de bases correspondiente al pRS316 digerido, y se purificaron utilizando GeneClean (BIO 101, Inc., Visa, CA) . Los fragmentos del ADN genómico purificados 101 de cada una de las cuatro cepas se ligaron con pRS316, y se transformaron en E. coli . Los transformantes que contenían los clones tpRS316 /ERG9 se identificaron mediante hibridación de colonias utilizando la sonda ERG9 descrita anteriormente. Los clones ERG9 derivados a partir de cada una de las cuatro cepas se aislaron de esta manera. Los genes ERG9 clonados de cada cepa fueron secuenciados por ACGT/ Inc., Northbrook, IL, utilizando un secuenciador de ADN automatizado Applied Biosystems, Inc., modelo ABI 100. La secuencia del gen ERG9 a partir de ATCC 28383 fue idéntica a la secuencia depositada en GenBank (Acceso #U00030) . Los genes erg9 a partir de MBNA1-2 y MBNA1-9 se encontraron con la misma mutación, es decir, un cambio desde G hasta A en la posición #12386 de -GenBaxik Acceso #tT00030 , que cambia un codón TGG hasta un codón de paro TGA. Esto ocasiona la terminación de la proteína ERG9 en 237 aminoácidos en lugar de los 444 aminoácidos normales encontrados en la proteína ERG9 de tipo silvestre. Se encontró que el gen erg9 a partir de MBNA1-13 contiene una supresión de C en la posición #12017 de GenBank Acceso #U00030, que ocasiona un cambio de marco y la terminación temprana de la proteína ERG9 en 116 aminoácidos, siendo los últimos dos aminoácidos diferentes de la proteína ERG9 de tipo silvestre (debido al cambio de marco) . Los alelos de erg9 a partir de MBNA1-1 y MBNA1-9 retienen bajos niveles de actividad. Esto se determinó transformando un mutante de supresión erg9 que requería ergosterol con plásmidos que llevaban los genes erg9 mutantes a partir de MBNA1-1 y MBNA1-9. La presencia de los genes clonados en las cepas de supresión erg9 permitió que estos transformantes crecieran, aunque lentamente, sobre un medio que carecía de ergosterol. El alelo ergS a partir de MBNA1-13 no mostró ninguna actividad residual cuando se probó de esta manera. La cepa de supresión de erg9 creció a los niveles del tipo silvestre cuando se transformó con el alelo erg9 a partir de ATCC 28383.

F. Descripción de Mutaciones Secundarias Sa.ccharomyces cerevisiae normalmente no importa ergosterol desde su medio ambiente bajo condiciones aeróbicas. Sin embargo, los mutantes erg9 aislados fueron capaces de crecer aeróbicamente cuando se suplementaron con ergosterol o colesterol, y por consiguiente, deben contener mutaciones secundarias que permitan que se presente la recuperación aeróbica de esterol. Los métodos utilizados para aislar los mutantes de la ruta de ergosterol, tales como el mutante de erg9 MBNA1-13, incluyeron no solamente una selección de los mutantes de la ruta de ergosterol, sino también una selección de células que importaran esteróles bajo condiciones aeróbicas, debido a que solamente habrían 103 sobrevivido los mutantes con mutaciones tanto en un gen de ruta de esterol como en un gen de recuperación de esterol . En el Ejemplo 3 más adelante, se describe la dificultad encontrada cuando se trata de obtener mutaciones de erg9 eliminado mediante métodos moleculares, inclusive cuando estén en una cepa que lleve la mutación upc2 , que se reporta que permite la recuperación de esteróles bajo condiciones aeróbicas (Lewis, T.L., G.A. Keesler, G.P. Fenner y J.W. Parks, 1988, Pleiotropic mutations in Saccharomyces cerevisiae affecting sterol uptake and metabolism, Yeast 4.: 93-106) . Parece que la mutación upc2 no confiere una recuperación aeróbica de esterol eficiente en un mutante de erg9, y que las cepas descritas en el Ejemplo 3 adquirieron mutaciones espontáneas adicionales (a un bajo Índice de frecuencia) que mejoraron su capacidad para recuperar los esteróles aeróbicamente . El tener las mutaciones apropiadas que mejoren la recuperación aeróbica de ergosterol y colesterol en una cepa de otra manera de tipo silvestre, permiten aislar mutaciones de erg9 en esa cepa a una frecuencia mucho más alta de lo que se obtenía con una cepa mutante que no recuperara el esterol . Con el objeto de demostrar que la cepa mutante de erg9 MBNA1-13 (y los derivados de esta cepa) había adquirido una mutación que mejora la recuperación de esteróles bajo condiciones aeróbicas (referidas como mutaciones de mejora de recuperación de estero! o sue) , se comparó la frecuencia de crear una eliminación de erg9 en el fondo de MBNA1-13, que contiene la mutación de recuperación de esterol, con la frecuencia de obtener la mutación de eliminación de erg9 en el fondo parental ATCC 28383, que presumiblemente carece de la mutación de recuperación de esterol. Esto se hizo con las siguientes dos cepas, representando cada uno el fondo de la cepa. SWE23-?HE9 (ura3, his3 , sue) se derivó a partir de MBNA1-13, y contiene un gen ERG9 reparado. SWY5-?H1 (ura3, his3 ) es un mutante auxotrófico derivado a partir de la cepa ATCC 28383. La construcción de SWE23- HE9 y SWY5-?H1 se describe con detalle en la sección G más adelante. Debido a que SW se derivó a partir de MBNA1-13, esta cepa sirvió como la hospedera que llevaba la mutación sue, mientras que SWY5-?H, que se derivó a partir de ATCC 28383, sirvió como la hospedera sin la mutación sue . Ambas cepas se transformaron con cantidades iguales (aproximadamente 1 microgramo) del fragmento de ADN erg9? : : HIS3 obtenido mediante digestión de pKML19-41 (construcción del plásmido descrita en el Ejemplo 3) con BamHl y Xmal, y purificando el fragmento resultante de 2.1 kb. Las células se transformaron con este fragmento de 2.1 kb utilizando el procedimiento de transformación LiAc (Gietz, R.D., R.H. Schiestl, A.R. Willems y R.A. , Woods, 1995, Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure, Yeast H: 35S-360) , y se seleccionaron los transformantes sobre un medio de SCE- ura . El medio SCE contiene base de nitrógeno de Bacto-levadura al 0.67 por ciento (sin aminoácidos), dextrosa al 2 por ciento, 20 miligramos/litro de sulfato de adenina, 20 miligramos/litro de uracilo, 20 miligramos/litro de L-triptófano, 20 miligramos/litro de L-histidina, 20 miligramos/litro de L-arginina, 20 miligramos/litro de L-metionina, 30 miligramos/litro de L-tirosina, 30 miligramos/litro de L-leucina, 30 miligramos/litro de L-isoleucina, 30 miligramos/litro de L-lisina, 50 miligramos/litro de L-fenilalanina, 100 miligramos/litro de L-ácido glutámico, 100 miligramos/litro de L-ácido aspártico, 150 miligramos/litro de L-valina, 200 miligramos/litro de L-treonina, 400 miligramos/litro de L-serina, y 5 miligramos/litro de ergosterol. Para las placas de agar, se agrega Bacto-agar al 2 por ciento al medio SCE. El medio SCE-ura es SCE careciendo de uracilo. Se presentaron un total de 24 colonias HIS+ a partir -de la transformación de SWY5-?H1, mientras que se obtuvieron 401 colonias HIS+ a partir de SWE23-?HE9. Debido a que fue posible que el gen erg9? : :HIS3 se integrara en lugares diferentes del lugar ERG9 (y por consiguiente, permitiendo que las células permanecieran fitotróficas para el ergosterol) , se probaron 20 de cada tipo de transformante para determinar un requerimiento de ergosterol aplicando sobre un medio YPD (que carece de ergosterol) . Las 20 de las colonias HIS+ derivadas a partir de SWY5-?h fueron capaces de crecer sobre YPD, lo cual indicó que todavía contenían un gen ERG 9 funcional, y sugirió que el gen erg9?: :HIS3 no estaba integrado en el lugar ERG9. Por otra parte, ninguna de las 20 colonias HIS+ derivadas a partir de SW&23 -?HE9 fueron capaces de crecer sobre YPD, indicando que el ADN de erg9? : :HIS3 había reemplazado al gen ERG9 de tipo silvestre en este fondo de cepa a una frecuencia relativamente alta. Para verificar esto, se analizaron nueve colonias HIS+ de cada cepa mediante reacción en cadena de la polimerasa, para determinar los tipos de alelos ERG9 presentes en sus genomas. Se preparó ADN genómico como se describe en Sherman y colaboradores (1989) . Los oligonucleótidos utilizados para el análisis se dan en seguida. 5' oligo = 250 UpBam gcgcatCCACGGGCTATATAAA (SEQ ID NO: 3) 3' oligo = 1764 LoBam gcggatCCTATTATGTAAGTACTTAG (SEQ ID NO: 4) Las condiciones de reacción en cadena de la polimerasa fueron como sigue: 9 °C, 3 minutos. 94°C, 30 segundos; 50°C, 30 segundos; 72°C, 3 minutos; 30 ciclos . 72 °C, 7 minutos.

El oligonucleótido 250 UpBam contiene las secuencias correspondientes a la posición #11555 a #11570 de la secuencia de GenBank Acceso #J05091. El oligonucleótido 1764 LoBam contiene el complemento inverso de las secuencias desde la posición #13409 hasta #13068 del mismo archivo de secuencias GenBank. En los nueve de los transformantes HIS+ de SWE23-?HE9, el producto de reacción en cadena de la polimerasa fue de 2.1 kbp, indicando que el gen ERG9 había sido reemplazado por el gen ERG9? : : HIS3 . En 8 de los 9 transformantes HIS+ de SWY5-?R1 , los productos de reacción en cadena de la polimerasa fueron de 2.5 kbp y de 1.5 kbp, indicando que el gen ERG9 de tipo silvestre permaneció intacto, y que el ADN de erg9? : :HIS3 _ se había integrado en cualquier otra parte del genoma. El noveno transformante HIS+ mostró solamente el producto de reacción en cadena de la polimerasa de 1.4 kbp, indicando también que el gen ERG9 estaba intacto en esta cepa. En este caso, se cree que el gen HIS3 se ha integrado en el genoma sin llevar todas las secuencias de erg9 con él . Estos resultados muestran que, durante el transcurso del aislamiento de la cepa MBNA1-13, se presentó una mutación adicional, referida en la presente como sue, en la cepa. Basándose en los resultados descritos en el Ejemplo 3 que se encuentra más adelante, la mutación sue parece ser diferente de la mutación upc2 previamente reportada, y contiene una recuperación más eficiente de esteróles.

G. Derivación de Nuevas Cepas a partir de MBNA1-13 Con el objeto de utilizar la cepa mutante de ERG9 MBNA1-13 para manipulaciones genéticas moleculares, la cepa se desarrolló adicionalmente, de tal manera que llevara marcadores auxotróficos adecuados para este propósito. Se mutó MBNA1-13 utilizando metansulfonato de etilo, utilizando procedimientos convencionales, y se obtuvieron mutantes resistentes al ácido 5-fluoro-orótico (5.-FOA) aplicando las células mutadas sobre un medio que contenía 5-FOA. El uso de la selección con 5-FOA fue descrita en Sikorski y Boeke, 1991 (Sikorski, R.S. y Boeke, J.D., 1991, In Vi tro Mutagenesis and Plasmid Shuffling: From Cloned Gene to Mutant Yeast, Methods in Enzymology 194: 302-318) . Este método de selección permitió el aislamiento de cepas que contenían mutaciones en el gen URA3 , que codificaban para la orotidina-5 ' -fosfato/descarboxilasa. Se aislaron varias cepas resistentes que exhibían resistencia a 5-FOA (es decir, un fenotipo ura" ) . Para determinar cuál de estas cepas contenía una mutación específicamente en el gen URA3 , las cepas ura" se transformaron con pRS316 (Sikorski y Hieter, 1989) , que contiene el gen URA3 intacto, utilizando el procedimiento de transformación con LiOAc (Gietz y colaboradores, 1995) . Se identificaron varias cepas cuya falta de crecimiento sobre el medio que carecía de uracilo, se restableció mediante pRS316, indicando que estas cepas llevaban la mutación ura3 . Se seleccionó una de estas cepas, EMS9-23 (ura3 , erg9) para una modificación adicional. La cepa EMS9-23 se alteró genéticamente para contener supresiones en los genes leu2 , trpl, 6 his3 , utilizando los plásmidos de transcolocación genética descritos en Sikorski y Hieter (1989) , y el procedimiento de reemplazo genético de inserción/extracción descrito en Rothstein (1991) (Rothstein, R. , 1991, Targeting, Disruption, Replacement, and Alíele Rescue; Integrative DNA Transformation in Yeast, Methods in Enzymology 194:281-301) . Los mutantes de leu2 , trpl , y his3 derivados a partir de MBNA1-13, se denominaron SWE23-?L1, SWE23-?T1, y SWE23-?H1, respectivamente. La cepa SWE23-?H1 se manipuló adicionalmente para intercambiar la mutación de cambio de marco de erg9 original (ver la sección E) con el alelo erg9? : :HIS3 . Esto se hizo transformando SWE23-?H1 (utilizando el procedimiento de LiOAc) con aproximadamente 5 microgramos de un fragmento de ADN lineal que contenía el cásete erg9? : :HIS3 (la construcción del cásete erg9? : :HIS3 se describe con detalle en el Ejemplo 3) . El cásete erg9? : :HIS3 se obtuvo digiriendo pKML19-40 con BamHl y Xmal, y purificando el fragmento de ADN de 2.1 kbp que contenía el fragmento erg9? : : HIS3 . Los transformantes de SWE23-. ?í2 en donde se había reemplazo el alelo de cambio de marco de erg9 poír el alelo de erg9? : :HIS3 se seleccionaron aplicando los transformantes sobre un medio SCE que carecía de histidina. Una de las cepas resultantes es referida como SV1E23 -?E91. La cepa SWE23-DH1 se modificó adicionalmente para contener mutaciones en los genes leu2 y trpl . Estas mutaciones se introdujeron utilizando los plásmidos de transcolocación genética (Sikorski y Hieter, 1981) , y el procedimiento de reemplazo genético de inserción/extracción (Rothstein, 1991) descrito anteriormente. Una de las cepas resultantes es referida como SW23-DH1 #42, y contiene las mutaciones erg9 , ura3 , his3 , leu2, trpl , y sue . La cepa SW23-DH1 #42 se modificó adicionalmente para intercambiar la mutación de cambio de marco de erg9 original con el alelo erg9D: :HIS3 . Esto se hizo transformando SW23-DH1 #42 (utilizando el procedimiento de LiOAc) con aproximadamente 5 miligramos de un fragmento de ADN lineal que contenía el cásete erg9D: :HIS3 como se describió anteriormente. Los transformantes HIS+ en donde la mutación de cambio de marco de erg9 había sido reemplazada por el alelo erg9D: :HIS3 se seleccionaron sobre un medio SCE-his. Una de las cepas resultantes es referida como SW23B, y lleva mutaciones en los siguientes genes: ura3 , leu2, trpl , his3 , erg9 : :HIS3 , sue . En la Tabla 6 se da un sumario de las cepas derivadas a partir de MBNA1-13 y su producción de farnesol respectiva en cultivos de matraz de agitación. Las cepas se cultivaron durante la noche en un medio YPDE (a 30°C con agitación a 180 rpm) . Estos cultivos se utilizaron para inocular 25 mililitros de un medio YPDE en un matraz de 250 mililitros, de tal manera que la OD600 inicial fue de 0.05. Las células se cultivaron durante 72 horas a 30 °C (con agitación a 180 rpm) . Se analizaron muestras del caldo entero (es decir, células más medio de cultivo) para determinar el peso celular seco y el farnesol, como se describe en la sección C anterior. Tabla 6 Crecimiento y Producción de Farnesol en Cepas Derivadas a partir de MBNA1-13 Las cepas MBNA1-13, EMS9-23, y S1ÑE23 -?E91 se evaluaron adicionalmente para determinar el crecimiento y la producción de farnesol en fermentadoxes 1-L utilizando el método descrito en la sección H más adelante. EMS9-23 y SWE23-?E_92 se transformaron cada uno con el plásmido YEp352, que contiene al gen URA3 clonado. Esto obvió la necesidad de agregar uracilo al medio de fermentación para estas dos cepas . La Figura 4 y la Tabla 7 resumen los resultados de estas fermentaciones. MBNA1-13 y EMS9-23/YEp352 se desempeñaron de una manera similar. Aunque el crecimiento de SWE23-iE9l/YEp352 se retrasó y quedó detrás de las otras dos cepas, alcanzó una densidad celular y un nivel de producción de farnesol comparables con las otras cepas .

Tabla 7 Comparación de MBNA1-13 y Cepas Derivadas a partir de él en Fermentadores 1-L Las cepas ÉMS9-23 y SWE23-1H1 se manipularon adicionalmente reparando sus mutaciones erg9 de regreso hasta la función de tipo silvestre. Esto se hizo transformando las dos cepas (utilizando el procedimiento de transformación con LiOAc) con aproximadamente 5 microgramos de un fragmento de ADN que contenía al gen ERG9 intacto. El fragmento de ADN del ERG9 se obtuvo digiriendo pTWM103 (ver la Sección E anterior) con Sacl y BamHl, y purificando el fragmento de ADN de 2.5 kb que contenía el gen ERG9. Los transformantes de EMS9-23 y SWE23- 1H1 en donde la mutación de cambio de marco erg9 había sido reemplazada por el gen ERG9 de tipo silvestre, se obtuvieron a partir de cada cepa, mediante selección para las células que pudieran crecer sobre un medio YPD que careciera de ergosterol. Una cepa con ERG9-reparado derivada a partir de EMS9-23, designada como SWE23-E9, y una cepa de erg9-reparado derivada a partir de SWE23-4H1, designada como SWE23 -?HE9 , se seleccionaron para un estudio adicional. En experimentos separados, se introdujeron mutaciones auxotróficas en la cepa parental ATCC 28383. Se obtuvo un mutante ura3 espontáneo de ATCC 28383 después de aplicar las células al medio que contenía 5-FOA, como se describió anteriormente. Los mutantes resistentes a 5-FOA se transformaron con PRS-316 (descrito anteriormente) , para identificar aquéllos que hubieran adquirido espontáneamente una mutación específicamente en su gen URA3. Una cepa, SWY5 , exhibió un fenotipo ura" estable (baja frecuencia de reversión), y se seleccionó para un estudio adicional. SWY5 se manipuló adicionalmente para llevar la mutación his3 , utilizando el plásmido de transcolocación genética YRpl4/his3- 200 descrito por Sikorski y Hieter (Sikorski y Hieter, 1989) , y el procedimiento de reemplazo genético de inserción/extracción descrito por Rothstein (Rothstein, 1991) . Se seleccionó un mutante his3 derivado a partir de SWY5, designado como S1ÑY5-?H, para un estudio adicional. La tabla 8 enlista las cepas reparadas y auxotróficas descritas y sus genotipos . Tabla 8 Cepas Reparadas y Auxotróficas Relacionadas con ATCC 28383 y MBNA1-13 Para probar si el mutante de erg9 MBNA1-13 había adquirido algún requerimiento nutricional adicional durante el transcurso de su aislamiento, se condujo un experimento de crecimiento en matraces de agitación para comparar la cepa parental ATCC 28383, la cepa mutante de erg9 EMS9-23, y la cepa de erg9-reparado SWE23-E9. Los cultivos se hicieron crecer en un medio YPD a 30 °C con agitación a 180 rpm. El cultivo de EMS9-23 también fue complementado con 5 miligramos/litro de ergosterol. El crecimiento se monitoreó mediante OD6oo • Los resultados de este experimento, presentados en la Figura 5, muestran que se redujo el crecimiento del mutante erg9 , pero que el crecimiento de la cepa parental de tipo silvestre 28383, y la cepa de erg9 reparado SWE23-E9 fue similar. La OD6oo final ligeramente más baja en el cultivo de SWE23-E9 se debió probablemente al hecho de que esta cepa es un auxótrofo de uracilo, y la concentración de uracilo en el medio YPD no fue óptima. Estos resultados indican que la causa principal del defecto de crecimiento en los mutantes erg9 es la mutación erg9 misma. Otras mutaciones en los mutantes erg9, tales como la mutación sue, no tienen un efecto significativo sobre el crecimiento.

H. Fermentación de Un Litro Las cepas MBNA1-13, EMS9-23/YEp352 y SWE23- /ÚE91/YEp352 se cultivaron en termentadores de 1 litro bajo condiciones por lotes alimentados, como se describe más adelante. Bajo estas condiciones, la producción de farnesol mediante estas cepas fue del 5.5 al 6.0 por ciento del peso celular seco (datos mostrados en la sección G anterior) en 191-239 horas. Condiciones y Materiales de Fermentación: La fermentación de 1 litro se realizó pasando primero por autoclave durante 45 minutos a 121°C, en el fermentador, la siguiente solución: (NH4)2S04 10.0 g/L KH2P04 10.0 g/L CaCl2- 2H20 0.5 g/L NaCl 0.5 g/L MgS04- 7H20 3.0 g/L extracto de levadura (Difco) 2.0 g/L solución de sal 20.0 mL desespumante (Dow 1520) 4.0 gotas agua desionizada 500 mL.

Después de pasar por autoclave, se agregaron las siguientes soluciones estériles: solución de glucosa (50%) (peso/volumen) 5.0 mL solución de vitamina 15.0 mL solución de ergosterol 0.2 mL.

Las soluciones de glucosa y vitamina se esterilizaron pasándolas a través de un filtro de 0.45 mieras. La solución de ergosterol se considera estéril (ver más adelante) . Solución de alimentación de glucosa (hecha en agua desionizada) solución de glucosa (60% en peso/volumen) 360 mL solución de extracto de levadura - 80 mL (12.5% en peso/volumen) solución de ergosterol 5.8 mL La glucosa y el extracto de levadura se esterilizaron pasándolos por autoclave; el ergosterol se considera estéril .

Inoculo Un mililitro de suspensión celular congelada en glicerol al 10 por ciento inoculado en 250 mililitros de un medio YPDE en un matraz con pantalla de 1,000 mililitros, incubado durante 48 horas a 29 °C y a 150 rpm; se utilizaron 30 mililitros de inoculo por fermentador.

Condiciones de Fermentación 28°C pH de 4.5 Agitación 300-1,000 rpm, aireación 50-200 mililitros/minuto como fue requerido para mantener el oxígeno disuelto en 10-60 por ciento de saturación del aire. La solución de alimentación de glucosa se agregó después de que se agotó la glucosa inicial. La velocidad de adición para alcanzar una velocidad de crecimiento de 0.04 hr"1, considerando que el rendimiento de células con glucosa es de 0.25. Velocidad de alimentación máxima = 3.5 mililitros/hora.

Solución de sal (dada por litro en agua desionizada) FeS04-7H20 0.28 g ZnS04-7H20 0.29 g CuS04-5H20 0.08 g Na2Mo04-2H20 0.24 g CoCl2-6H20 0.24 g MnS04-H20 0.17 g HCl 0.10 mL Solución de vitamina (dada por litro en agua desionizada) biotina 10 mg pantotenato de Ca 120 mg inositol 600 mg piridoxina-HCl 120 mg tiamina-HCl 120 mg Solución de ergosterol etanol 20 mL IGEPAL 20 mL ergosterol 0.4 g Se calienta a 50°C con mezcla hasta disolverse, se almacena a -20°C. IGEPAL es 1, 3 , 3-tetrametil-butil-fenoxi (etoxi) 8-etanol (Sigma Chemical Company, St . Louis, MO, Producto IGEPAL CA-630, Cat. #1 3021) .

Ejemplo 2 Este ejemplo describe la producción de mutantes erg9 mediante mutagénesis química de S. cerevisiae cepa 64031, utilizando metansulfonato de etilo (EMS) . La cepa 64031 (obtenida de ATCC) es un mutante erg9- l que produce bajos niveles de farnesol (ver el Ejemplo 1) , y la mutagénesis adicional produjo mutantes que exhibían mejores rendimientos de farnesol . Se realizó una curva de aniquilación utilizando EMS, y se realizó una mutagénesis del 64031 como se describe en el Ejemplo 1. La selección también se realizó como se describe en el Ejemplo 1. Se encontró que un total de 163 cepas son auxótrofos de esterol resistentes a la nistatina y sensibles a la temperatura. Se cultivaron en tubos y matraces de agitación, y la producción de farnesol se determinó como se describe en el Ejemplo 1. Las cantidades de farnesol producidas en los cultivos de matraz de agitación se presentan en la Tabla 9.

TABLA 9 Ejemplo 3 En el Ejemplo l.G. anterior, se describió la creación de un mutante erg9? : :HIS3 de MBNA1-13. En este ejemplo, se describe la construcción de otras cepas haploides de S. cerevisiae (no derivadas a partir de MBNA1-13) que contienen un alelo de supresión de erg9 : : inserción de HIS3. El gen ERG9 se amplificó con reacción en cadena de la polimerasa, utilizando el ADN genómico aislado a partir de la cepa S288C (de acuerdo con el método de Sherman y colaboradores) como plantilla, y los siguientes dos cebadores . 5' oligo = gag cat CCA CGG GCT ATA TAAA (SEQ ID NO: 5) ; 250 BamUp 3' oligo = tcc ccc cg GGC GCA GAC TTC ACG CTC (SEQ ID NO: 6) ; 1712 XmaLo El ADN de ERG9 amplificado con reacción en cadena de la polimerasa, se digirió con BamHl y Xmal, y luego se ligó con pRS-316 digerido con BamHl, Xmal (vector de lanzamiento de levadura/E. coli , Sikorski y Hieter, 1989) . Las condiciones de reacción en cadena de la polimerasa fueron: 94 °C durante 1 minuto - 1 ciclo 94 °C durante 30 segundos 58 CC durante 1 minuto 30 ciclos 72 °C durante 1 minuto 72 °C durante 2 minutos 1 ciclo El gen ERG9 clonado de esta manera, se extiende desde la posición #11555 hasta la posición #13047 de GenBank Acceso #U00030, y el clon resultante se denominó pJMB98-12.

La construcción de la supresión en ERG9 y la inserción del ADN de HIS3 se hizo como sigue: El gen HIS3 se obtuvo digiriendo el plásmido pRS403 que contenía HIS3 (Stratagene, La Jolla, CA) , con Eco47III y SspI, y purificando el fragmento de 1,226 pares de bases que contenía el gen HIS3 . El plásmido pJMB98-12 se dirigió con Van91I, luego se trató con polimerasa de ADN T4 para hacer sus extremos romos. El plásmido se digirió adicionalmente con JipaI, de tal manera que se suprimió un fragmento interno de 589 pares de bases dentro de ERG9. En este sitio, se ligó el fragmento Eco47III , SspI de 1,226 pares de bases que contenía el gen HIS3. El plásmido resultante, pKML19-41, tiene el gen HIS3 clonado dentro del gen ERG9 suprimido, con la secuencia codificante de HIS3 en la misma orientación que la secuencia codificante de ERG9. Para transformar levadura con este ADN de erg9? : :HIS3 , el plásmido pKML19-41 se digirió con Smal y Xbal, y se aisló el fragmento de 2,141 pares de bases que contenía el gen erg9? : :HIS3 . El ADN se purificó a partir de rebanadas de gel de agarosa utilizando GeneClean. Se utilizaron aproximadamente 5 microgramos del ADN purificado de erg9?: :HIS3 para transformar la cepa diploide CJ3A X CJ3B (a/a, ura3/ura3, his3/his3, Ieu2/leu2, trpl/trpl, upc2/upc2 , obtenidas del Dr. L. Parks, Universidad del Estado de Carolina del Norte, Raleigh, NC) , utilizando el procedimiento de transformación con acetato de litio descrito en Gietz y colaboradores (1995) . CJ3A X CJ3B es homocigótico para la mutación upc2. Esta mutación permite la recuperación de esterol bajo condiciones aeróbicas (Lewis y colaboradores, 1988) . Se creyó que la mutación upc2 permitiría la fácil producción de una cepa haploide que llevara una mutación en el gen erg9. Era necesaria la auxotrofia de histidina para seleccionar cepas que llevaran los plásmidos que contuvieran el gen HIS3 funcional . Las células transformadas se aplicaron sobre un medio SCE (descrito en el Ejemplo 1F) que carecía de histidina (SC-His) , para seleccionar los transformantes HIS+. Se obtuvieron cientos de transformantes. Estas células HIS+ entonces se parcharon sobre SC-His, y se dejaron crecer durante dos días más. Luego los transformantes se parcharon sobre el medio de esporulación (Sherman y colaboradores, 1986) . El medio de esporulación contiene (por litro de agua destilada) : acetato de potasio al 1 por ciento, extracto de Bacto-levadura al 0.1 por ciento, dextrosa al 0.05 por ciento, y Bacto-agar al 2 por ciento. Luego los parches se dejaron crecer y esporular durante 3 a 5 días. Se removió una porción de las células, y se colocó en una solución de liticasa para digerir la pared celular ascus. Luego las células se extendieron en una línea delgada sobre una placa de YPD + 2 miligramos/litro de ergosterol (YPDE) . Las células diploides esporuladas forman tetrads que contienen cuatro esporas, y las esporas individuales se separaron utilizando un micromanipulador . Estas esporas haploides individuales germinarán, cada una conteniendo una sola copia de los cromosomas . Se esperaba una segregación de 2 : 2 para las eliminaciones de erg9? : :HIS3 en esta cepa. Dos esporas deben ser viables sobre YPD, debido a que contendrían la copia del cromosoma que no fue alterado (significando que no necesitarían de ergosterol, debido a que tienen un gen ERG9 funcionando, y serían capaces de crecer sobre YPD, debido a que está presente la histidina en el medio) . Las otras dos esporas deben crecer sobre SC-His + 2 miligramos/litro de ergosterol (SCE-His) debido a que, si se integraba el ADN de erg9?: :HIS3 en el sitio ERG9 , las células requerirían de ergosterol, pero crecerían sin histidina. Se analizaron los tetrads de algunos de los transformantes pKML19-41 para la determinación fenotípica de la eliminación de erg 9. Los resultados mostraron que solamente dos de las cuatro esporas eran viables cuando se cultivaron aeróbicamente. Cuando éstas se aplicaron en réplicas a YPD, estas dos esporas sobrevivieron, pero no sobrevivieron sobre SC-His ó SCE-His. Esto indicó una segregaron de 2:2, y que las dos esporas sobrevivientes eran del tipo parental o auxotróficas para la histidina. Esto indicó que las dos que no sobrevivieron aeróbicamente, probablemente contenían la eliminación de erg9 :HIS3 . El análisis de reacción en cadena de la polimerasa confirmó los resultados de una eliminación de erg9?: :HIS3 en varias de las cepas. Se aisló el ADN total utilizando un método de aislamiento rápido del ADN a partir de varios de los transformantes diploides que mostraron la segregaron 2:2. Luego se utilizó el ADN total como plantilla para la amplificación con reacción en cadena de la polimerasa, con cebadores que complementaban la secuencia 5 ' y 3 ' para el gen ERG9 en el cromosoma. Los oligonucleótidos utilizados para este análisis fueron como sigue : 5' -oligo = 250 Bam Up (descrito anteriormente) 3 '-oligo = 3ERG9-1 = gat ccg cg GCT CAÁ GCT AGC GGT ATT ATG CC (SEQ ID NO: 7) 3ERG9 - 1 contiene secuencias que coxxesponden al complemento inverso de las secuencias desde la posición #14812 hasta la posición #14790 de la secuencia de GenBank Acceso #U00030.

El oligonucleótido 250 Bam Up queda dentro de la secuencia del clon ERG9 utilizado para construir el alelo erg9? : :HIS3 , mientras que el oligonucleótido 3ERG9 -1 queda corriente abajo del límite del ADN de ERG9 clonado. Las secuencias de ERG9 amplificadas a partir del ADN genómico mediante estos dos cebadores, deben representar genes ERG9 localizados en el lugar cromosómico real de ERG9 , y no amplificarán las secuencias erg9?: :HIS3 que se integraron en otros lugares cromosómicos . Los resultados mostraron dos bandas en 3.271 y 3.908 kb, indicando la presencia en las cepas diploides de una copia funcional del gen ERG9 , y una copia interrumpida que es 637 pares de bases más grande, debido a la inserción del gen HIS3 . También se realizó el análisis de mancha Southern para verificar la interrupción de erg9?: :HIS3 en los diploides. El ADN genómico a partir de una cepa diploide parental que llevaba dos copias normales del gen ERG9, se comparó con tres transformantes diferentes que se creía que llevaban un gen ERG9 normal, y un gen ERG9 alterado. El ADN se digirió con Acc I ó Xba I, se separó mediante electroforesis de gel, se transfirió a una membrana Immobilon S, y se sondeó con sondas específicas para examinar los genes ERG 9 presentes . La sonda en este caso fue un fragmento de 1.4 kb que contenía una porción del gen ERG9.

La sonda utilizada para el análisis de mancha Southern del ADN genómico se preparó a partir del gen ERG9 amplificado con reacción en cadena de la polimerasa, utilizando los oligonucleótidos 250 Bam Up y 1712 Xma Lo ^descritos anteriormente ) . Se utilizó el plásmido pJMB98-12 como plantilla. Las condiciones de reacción en cadena de la polimerasa fueron: 94 °C durante 1 minuto - 1 ciclo 94 °C durante 30 segundos 58 °C durante 1 minuto 30 ciclos 72 °C durante 1 minuto J 72 °C durante 2 minutos 1 ciclo El ADN de ERG9 amplificado se purificó y se biotiniló, como se describió anteriormente. Se utilizó aproximadamente 1 microgramo de la sonda biotinilada para hibridarse en la mancha . La hibridación de la sonda en las bandas de ADN específicas bajo condiciones astringentes, identificó que estaba presente la secuencia complementaria. Para el diploide parental, CJ3AxCJ3B, se vio una sola banda en 2.1 kb para la digestión con Acc I, y se vio una sola banda en 2.8 kb con la digestión con Xba I . Las eliminaciones supuestas de erg9?: :HIS3 contenían cada una, dos bandas: las bandas en 2.1 kb y 1.3 kb para la digestión con Acc I; y las bandas en 2.8 kb y 3.4 kb para la digestión con Xba I. Estos resultados indicaron la presencia de una copia del gen ERG9 de tipo silvestre, junto con una alteración de erg9?: :HIS3 en los diploides transformados. Luego se hicieron intentos por cultivar las células haploides anaeróbicamente en YPDE-agar. Las cepas que se bloquearon en la ruta de ergosterol pueden recuperar esteróles bajo condiciones anaeróbicas. Dos de las esporas crecieron rápidamente bajo condiciones anaeróbicas (ERG9 , his-), y dos crecieron muy lentamente ( erg9? : :HIS3) . Las esporas de tres de las cepas erg9? : :HIS3 (KML505, KML510, y KML521) que crecieron anaeróbicamente en las placas, se cultivaron en un medio líquido bajo condiciones anaeróbicas, y mostraron producción de farnesol . Después de una incubación adicional de las placas de YPDE originales aeróbicamente, pareció que unas cuantas de las cepas haploides que probaron ser positivas para la producción de farnesol bajo crecimiento anaeróbico, estaban creciendo. Se presentaron tres de estas esporas viables (derivadas a partir de KML505) después de una incubación aeróbica prolongada. Estas cepas de crecimiento aeróbico, designadas como BKY1-2D, BKY1-7C, y BKY1-8D, produjeron todas farnesol bajo condiciones aeróbicas. La cepa progenitora KML510 (a/a, ura3/ura3 , his3/his3 , trpl/trpl , Ieu2/leu2, upc2/upc2, ERG9/erg9? : :HIS3) que contenía pJMB98-12 o bien pRS316, se esporularon, y los 129 tetrads se disectaron sobre placas YPDE. Las placas se incubaron bajo condiciones aeróbicas, y se observaron los siguientes patrones de crecimiento de esporas. Se hizo el análisis de tetrad de KML510/pJMB98-12 con 20 tetrads. 16 tetrads dieron lugar a dos esporas viables de rápido crecimiento, y dos esporas no viables. Todas las esporas viables fueron his", erg4". Tres tetrads dieron lugar a dos esporas viables de rápido crecimiento, una espora viable de crecimiento lento, y una espora no viable. Las viables de rápido crecimiento fueron todas his", erg+. Las esporas viables de crecimiento lento fueron todas his+, erg". Un tetrad no dio lugar a ninguna espora viable. Todas las esporas his+, erg" también fueron ura", indicando que la pJMB98-12 no se segregó en estas esporas durante la meiosis. Se utilizó una de las esporas his+, erg" para estudios adicionales, y se denominó BTY19-9C. El análisis de tetrad de KML510-pRS316 se hizo con 20 tetrads. 18 tetrads dieron lugar a dos esporas viables de rápido crecimiento, y dos esporas no viables. Dos tetrads dieron lugar a dos esporas viables de rápido crecimiento, una espora viable de crecimiento lento, y una espora no viable. Todas las esporas de rápido crecimiento fueron his", erg+. Todas las esporas de crecimiento lento fueron his+, erg". Todas las esporas his+, erg" también fueron ura", indicando que no se segregó pRS316 en estas esporas durante la meiosis.

Una de las esporas his+, erg" se estudió adicionalmente, y se denominó BTY20-2A. Para confirmar que BTY19-9C y BTY20-2A no llevaban el gen ERG9 de tipo silvestre, se condujo un experimento de reacción en cadena de la polimerasa utilizando el ADN genómico aislado a partir de las dos cepas, y los oligonucleótidos VE104-5 Y VE105-3. 5 Oligo = VE104-5 = gac tet AGA AGC GGA AAA CGT ATA CAC 3 'oligo = VE105-3 = descrito anteriormente.

VE104-5 contiene secuencias que corresponden a la posición #11631 a #116541 de la secuencia GenBank Acceso #U00030. El tamaño predicho del producto de reacción en cadena de la polimerasa para un gen ERG9 funcional de 2.23 kb, y para la alteración de erg9?: :HIS3 , de 2.87 kb. Las cepas BTY19-9C y BTY20-2A tuvieron un producto de reacción en cadena de la polimerasa de aproximadamente 2.87 kb, lo cual indicó la presencia de la alteración erg9? : :HIS3 . Se evaluaron cinco cepas (BKY1-2D, BKY1-7C, BKY1-8D, BTY19-9C, y BTY20-2A) para determinar la producción de farnesol, en matraces de agitación. Las cepas BKY1-7C y BTY20-2A dieron la mejor producción de farnesol de las cinco cepas, pero la BKY1-7C creció muy lentamente. Los transformantes KML50S, KML510, y KML521 se transfirieron al medio de esporulación. Los tetrads se disectaron en YPDE, y se dejaron crecer durante períodos de tiempo prolongados bajo condiciones aeróbicas, para buscar el crecimiento de esporas adicionales más allá de la segregación anticipada de 2:2 (viables: no viables). Dos esporas adicionales fueron viables después de una incubación adicional bajo condiciones aeróbicas. Estas dos cepas, BJY7-5D y BJY8-1A, produjeron farnesol en un rastreo de tubo. Las cepas BJY7-5D _ y BJY8-1A se evaluaron en matraces de agitación. BJY8-1A- dio la mejor producción de farnesol (0.29 miligramos/mililitro, 4.7 por ciento, basándose en el peso seco celular) después de una incubación de 72 horas. BJY7-5D dio 0.18 miligramos de f mesol/mililitro (3.1 por ciento, basándose en el peso seco celular) .

Ejemplo 4 Este ejemplo muestra la sobreexpresión de HMG-CoA-reductasa en cepas con y sin un gen ERG9 funcional. Se ha propuesto que la HMG-CoA-reductasa es la enzima clave que regula el flujo de carbono a través de la ruta isoprenoide. En S. cerevisiae, dos genes HMGl y HMG2 , codifican para las dos isozimas de HMG-CoA-reductasa, designadas como HMGlp y HMG2p. La regulación de la HMG-CoA-reductasa se logra a través de una combinación de regulación de transcripción y de traducción, así como degradación de proteína. Los segmentos de los genes HMGl y HMG2 que codifican los dominios catalíticos de las isozimas HMGlp y HMG2p se han clonado bajo el control de la transcripción del promotor fuerte a partir del gen GPD (gliceraldehído-3-fosfato/deshidrogenasa) . Los plásmidos que contienen estas construcciones (pRH127-3 y pRH124-31, que contienen los dominios catalíticos de HMGlp y HMG2p, respectivamente) se obtuvieron de R. Hampton, U.C. San Diego. Se reportó que las cepas de S. cerevisiae que sobreexpresan el dominio catalítico de HMGlp tienen un flujo elevado de carbono a través de la ruta isoprenoide. Este flujo de carbono incrementado se manifestó como una sobreproducción de escualeno y ergosterol (Donald, K.A.G. Hampton, R.Y., y Fritz, I.B., 1997, Effects of Overproduction of the Catalytic Domain of 3 -Hydroxy-3 -Methylglutaryl Coenzyme A Reductase on Squalene Synthesis in Saccharomyces cerevisiae . Applied and Environmental Microbiology 63:3341-3344).

A. Sobreexpresión de HMG-CoA-Redustasa en Cepas con un Gen ERG9 Funcional Con el objeto de confirmar que la sobreexpresión de HMG-CoA-reductasa daría como resultado un mayor flujo de carbono a través de la ruta isoprenoide en las cepas derivadas a partir de ATCC 28383, de una manera similar a otras cepas de S. cerevisiae (Donald y colaboradores, 1997), la cepa SWY5, un mutante ura3 de la cepa parental ATCC 28383, y SWE23-E9, la versión de erg9 reparado de EMS9-23 (las cepas descritas en el Ejemplo l.G. anterior), se transformaron con los plásmidos pRH127-3 y pRH124-31. Las transformaciones se realizaron utilizando el procedimiento con LiOAc (Gietz y colaboradores, 1995) . También se construyeron cepas de control que llevaban el vector vacío YEp352. Se probaron transformantes representativos para determinar la producción de escualeno y ergosterol en un experimento de matraz de agitación. Las células se cultivaron en un medio SCE-ura de 50 mililitros a 30 °C con agitación a 180 rpm durante 48 horas. A las 24 horas, se retiraron 10 mililitros del cultivo, y las células se cosecharon para los ensayos de HMG-CoA-reductasa, como se describe en el_ Ejemplo l.D. Al final del período de cultivo de 48 horas, se utilizó una alícuota de los cultivos para inocular los matraces que contenían 50 mililitros del medio YPD, de tal manera que la OD60o inicial de los cultivos fue de 0.1. Los cultivos en el medio YPD se hicieron crecer durante 72 horas a 30 °C, con agitación a 180 rpm, y luego se analizaron para determinar el peso celular seco, y la acumulación de escualeno y ergosterol. El método de extracción utilizado para este análisis fue como sigue. Se granularon 10 mililitros del cultivo mediante centrifugación a 1,500 x g durante 10 minutos. El granulo celular se volvió a suspender en 1 mililitro de agua desionizada, y se volvieron a granular las células. Los granulos celulares se volvieron a suspender en 1 mililitro de agua desionizada, y se alteraron mediante agitación con perlas de silicato de zirconio (diámetro de 0.5 milímetros) . La suspensión celular rota se saponificó con 2.5 mililitros de una solución al 0.2 por ciento de pirogalol (en metanol), y una solución de 1.25 mililitros de hidróxido de potasio al 60 por ciento a 75 °C durante 1.5 horas. Luego se extrajeron las muestras con 5 mililitros de hexano, se pusieron en _vórtex durante 3 minutos, y se centrifugaron a 1,000 x g durante 20 minutos para separar las fases. Luego se analizó la capa de hexano mediante GC-MS como se describe en el Ejemplo l.B. Los datos de este experimento se muestran en la Tabla 10. Comparándose con las cepas de control que llevan solamente el vector Yep352, las cepas que sobreexpresan los dominios Catalíticos de HMGlp ó HMG2p, contenían altos niveles de actividad de HMG-CoA-reductasa, y niveles elevados de escualeno. Sin embargo, ninguna de las cepas que sobreexpresaban HMGlp ó HMG2p contenían niveles significativamente incrementados de ergosterol. No obstante, estos datos muestran que si se incrementa la actividad de HMG-CoA-reductasa en el linaje de la cepa MBNAl-13,se incrementa el flujo de carbono a través de la ruta isoprenoide.

Tabla 10 Efecto de la Actividad de HMG-CoA-Reductasa Amplificada Sobre la Producción de Escualeno y Ergosterol en Cepas que tienen una Ruta Isoprenoide Normal B. Sobreexpresión de HMG-CoA-reductasa en un Mutante erg9 Habiendo mostrado que la amplificación de HMGlp ó HMG2p incrementó el flujo de carbono hasta escualeno, se probó si la sobreexpresión de HMGl 6 HMG2 incrementaría la producción de farnesol en una cepa que llevara la mutación erg9. La cepa SWE23-?E91 (descrita en el Ejemplo l.G.) se transformó con los plásmidos pRH127-3 ó pRH124-31. La transformación de SWE23-?E91 se realizó utilizando el procedimiento de transformación con LiOAc (Gietz y colaboradores, 1996) . Se utilizaron aproximadamente 2.5 microgramos de ADN de pRH127-3 ó pRH124-31 en cada transformación. Los transformantes se seleccionaron sobre placas de SCE-ura, y se seleccionaron varios y se volvieron a rayar para la purificación sobre placas de SCE-ura. Para probar el efecto de la HMG-CoA-reductasa amplificada sobre la producción de farnesol, se cultivaron transformantes representativos durante 48 horas en un medio líquido de SCE-ura. También se incluyó una cepa de control, SWE23-?E9l/YEp352 en el experimento. Al final del período de cultivo de 48 horas, se utilizaron alícuotas de los cultivos para inocular matraces que contenían 50 mililitros de un medio YPDE, de tal manera que la OD6oo inicial fue de 0.5. Estos cultivos se hicieron crecer durante 72 horas a 30 °C, con agitación a 180 rpm. Al final del período de incubación, se analizaron las muestras para determinar el peso celular seco y la concentración de farnesol . Para confirmar que se estaban sobreexpresando los genes de HMG-CoA-reductasa en los transformantes, se cosecharon 20 mililitros de los cultivos que crecieron en SCE-ura mediante centrifugación a 1,500 x g durante 10 minutos, y se midió la actividad de HMG-CoA- reductasa utilizando el método de células permeabilizadas descrito en el Ejemplo l.D. Los datos de este experimento se muestran en la Tabla 11. Tabla 11 Efecto de una Actividad Elevada de HMG-CoA-reductasa sobre la Producción de Farnesol en un Mutante erg9 : . -HIS3 Cultivado en Cultivos de Matraces de Agitación Tanto en SWE23- E91/ pRH127-3 como en SWE23- E9l/pRH124-31 se elevaron los niveles de la actividad de HMG-CoA-reductasa. Sin embargo, la producción de farnesol en estas cepas fue más baja que en la cepa de control SWE23- E9l/YEp352. Este resultado inesperado se observó varias veces en experimentos independientes . A pesar del fracaso de la actividad amplificada de HMG-CoA-reductasa para incrementar la producción de farnesol en la cepa erg9?: :HIS3 cultivada en cultivos de matraz agitado, las cepas enlistadas en la Tabla 12 se probaron para determinar la producción de farnesol en termentadores de 1 litro, utilizando el protocolo descrito en el Ejemplo l.H.

Bajo estas condiciones, se observó el resultado esperado; las cepas que sobreexpresaban la HMG-CoA-reductasa produjeron significativamente más farnesol que la cepa de control . Los datos se resumen en la Figura 6 y en la Tabla 12. La elevación de la actividad de HMG-CoA-reductasa en las cepas SWE23- E9l/pRH127-3 y SWE23- E9l/pRH124-31 se confirmó mediante ensayo enzimático directo, utilizando el método de células permeabilizadas. Esto se ilustra por las actividades de reductasa en tiempos del tiempo específicos durante la fermentación (mostrada en la Tabla 12) . Tabla 12 Efecto de la Actividad Elevada de HMG-CoA-reductasa sobre la Producción de Farnesol en un Mutante erg9?: :HIS3 Cultivada en Fermentadores de 1 Litro E emplo 5 Este ejemplo describe la sobreexpresión de diferentes GGPP-sintasas en mutantes erg9. Con el objeto de convertir el FPP producido en las cepas mutantes erg9 hasta GGPP (el precursor del producto deseado, GG) , se sobreexpresaron los genes que codificaban para diferentes GGPP-sintasas en mutantes erg9. Los genes clonados para este propósito fueron el gen BTSl a partir de Saccharomyces cerevisiae, el gen crtE a partir de Erwinia uredovora, el gen al-3 a partir de Neurospora crassa, y el gen ggs a partir de Gihherella fujikuoi . Los plásmidos que llevaban estos genes se construyeron como sigue. Para clonar el gen BTI1 , se preparó ADN genómico a partir de S. cerevisiae cepa S288C de acuerdo con el método descrito en Sherman y colaboradores (1986) . El gen se amplificó mediante reacción en cadena de la polimerasa utilizando los dos siguientes oligonucleótidos: 5' oligo = VE100-5 gactctAGAGTTTACGAGTCTGGAAAATC (SEQ ID NO: 8. 3 'oligo = VE101-3 gtaggATCCATGGAATTGAGCAATAGAG (SEQ ID NO: 9) Las condiciones de la reacción en cadena de la polimerasa fueron: 94°C, 3 minutos; 94°C, 1 minuto; 52°C, 1 minuto; 74 °C, 1.5 minutos, 30 ciclos; luego 74 °C, 7 minutos (1 ciclo) . El producto de reacción en cadena de la polimerasa se digirió con Xbal y Bairi?I , y se ligó con pPGK315 digerido con Xbal , BamRI para generar el pTWMÍ01. El plásmido pPGK315 contiene el promotor PGK de S. cerevisiae, y el terminador separados por un sitio de clonación múltiple. La clonación del gen BTSl en pPGK315 como se describe anteriormente, colocó el gen BTSl bajo el control del promotor PGK fuerte. El plásmido pPGK315 se construyó digiriendo el plásmido pRS315 con Sacll y Smal , y luego tratando con polimerasa de ADN T4 para crear extremos romos . El plásmido se volvió a ligar para generar pRS315-DSS. Luego el plásmido pRS315-DSS se digirió con Xhol , y se ligó con un fragmento Salí, Xhol de 994 pares de bases obtenido a partir del plásmido pPGKMCS que contenía el promotor PGK y el terminador separados por un sitio de clonación múltiple. El plásmido pPGKMCS se construyó digiriendo pPGK (Kang y colaboradores, 1990, Mol. Cell. Biol., 10:2582) con EcóRl y Bairíñl , y luego ligando con los siguientes dos oligonucleótidos templados. 5 Oligo = AATTCCAAGCTTGCGGCCGCTCTAGAACGCGTG (SEQ ID NO: 10] 3 'oligo = GATCCACGCGTTCTAGAGCGGCCGCAAGCTTG (SEQ ID NO: 11) Se construyó el plásmido pTWM110-ll ligando un fragmento Kpnl -Sall de 2,397 pares de bases que contenía el promotor PGK/BTSl/terminador PGK (obtenido mediante digestión de PTWMllO con JCpnl y Salí) en YEp352 digerido con Jpnl-SalI.

Para clonar el gen crtE, se aisló el ADN genómico a partir de E. uredovora cepa 20D3 utilizando el Estuche de Aislamiento de ADN Genómico PureGene (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN) . El gen crtE se amplificó utilizando el ADN genómico y los siguientes dos oligonucleótidos : 5 'oligo = 20D3Up gaattcGTTTATAAGGACAGCCCGA (SEQ ID NO: 12) 3 'oligo = 20D3LO ctgcagTCCTTAACTGACGGCAGCGA (SEQ ID NO: 13) El oligonucleótido 20D3Up contiene secuencias que corresponden a la posición #206 a #224 de la secuencia de GenBank Acceso #D90087. El oligonucleótido 20D3Lo contiene el complemento inverso de la secuencia desde la posición #1117 a #1136 del mismo archivo de secuencias de GenBank. El ADN amplificado se ligó en el sitio Srfl de pCR-Script SK(+) (Stratagene, La Jolla, CA) para generar el plásmido pSWl-B.

Luego este plásmido se digirió con EcoRI y Sacl , y se purificó el fragmento de 973 pares de bases que contenía el gen crtE, y se ligó en pAD314-956 digerido con EcoRI-SacJ para generar el plásmido pSW2B. El plásmido pSW2B se digirió con BairiHI para generar un fragmento de 2,199 pares de bases que contenía el promotor ADJíl, la secuencia codificante crtE, y el terminador ADJíl, y este fragmento se ligó en YEp352 digerido con .BamHl, para generar pSW4A, el cual colocó el gen crtE en la orientación opuesta a aquélla del gen ura3 en el plásmido, y pSW4B, que colocó el gen crtE en la misma orientación que el gen ura3 . El plásmido pADH313-956 se generó de la siguiente manera. El plásmido pRS313 (Sikorski y Hieter, 1989) se digirió con Sacl y Xbal , se trató con polimerasa de ADN T4 para crear extremos romos, luego se volvió a ligar para generar el plásmido pDSX313. Este plásmido se digirió con Smal y Apal, se trató con polimerasa de ADN T4 para crear extremos romos, y luego se volvió a ligar para generar pDSXSA313. El plásmido pAAH5 (Ammerer, G., 1983, Meth. Enzymol. 101:192-201), que lleva el promotor y terminador ADH1 separados por un sitio JíindIII, se digirió con JííndIII, luego se ligó con los siguientes dos oligonucleótidos templados para introducir un sitio de clonación múltiple, y crear pAAH5-MCS. 5'oligo = MCS1 AGCTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCA (SEQ ID NO:14) 3Oligo = MCS2 AGCTTGCATGCCTCCAGGTCGACTCTAGAGCCCGGGTACCGAGCTCGAATTC (SEQ ID NO:15) Se realizó una reacción en cadena de la polimerasa que contenía pADH313-MCS como plantilla, y los dos siguientes oligonucleótidos, y se obtuvo un producto de reacción en cadena de la polimerasa de 1,232 pares de bases que contenía el promotor ADJíl, el sitio de clonación múltiple, y el terminador ADH1 . 5 Oligo = ADH1A gacggatCCGTGGAATATTTCGGATATCC (SEQ ID NO: 16) 3 'oligo = ADH1B ctcggatccGGACGGATTACAACAGGTATTGTCC (SEQ ID NO: 17) El oligonucleótido ADH1A contiene secuencias que corresponden a la posición #16 a #37 de la secuencia de GenBank Acceso #V01292. El oligonucleótido ADH1B contiene el complemento inverso de las secuencias desde la posición #2092 a #2116 del mismo archivo de secuencias GenBank. El producto de reacción en cadena de la polimerasa de 1,232 pares de bases se digirió con BaxriHI, y se ligó con pDSXSA313 digerido con .BamHl, para generar el plásmido pADH313-956. Para clonar el gen al -3 de N. crassa, se aisló el ADN genómico a partir de N. crassa cepa ATCC 14692, utilizando el método descrito por Borges y colaboradores, en la sección de métodos del sitio web de Fungal Genetics Stock Center's (www. kumc . edu/research/fgsc/fgn37/borges : html) . El gen se amplificó mediante reacción en cadena de la polimerasa, utilizando los siguientes dos oligonucleótidos. 5 Oligo = VE118-5 cagaatTCACCATGGCCGTGACTTCCTCCTC (SEQ ID ?O:18) 3 'oligo = VE119-3 caagatctCATACATTCAATCCTCATGGACAC (SEQ ID NO: 19) El oligonucleótido VE118-5 contiene secuencias que corresponden a la posición #1216 a #1240 de la secuencia de GenBank Acceso #U20940. El oligonucleótido VE119-3 contiene el complemento inverso de las secuencias desde la posición #2576 hasta #2599 del mismo archivo de secuencias GenBank. El ADN amplificado se ligó en el sitio Srfl de pCR-Script SK(+) (Stratagene, La Jolla, CA) , para generar pSW7-l y pSW7-2, dos clones de reacción en cadena de la polimerasa independientes del gen al -3 . Estos dos plásmidos se digirieron entonces con J?coRI y Bglll, se purificó el fragmento de 1,393 pares de bases que contenía el gen al -3, y se ligó en pPGK digerido con EcoRI , BamHI (Kang y colaboradores, 1990) , para generar pSW9-l y pSW9-2, derivándose la secuencia de al -3 a partir de pSW7-l y pSW7-2, respectivamente. Para clonar el gen ggs, se preparó el ADN genómico a partir de Gibberella fujikuoi cepa ATCC 12617, utilizando el mismo procedimiento descrito anteriormente para Neurospora . El gen ggs se amplificó mediante reacción en cadena de la polimerasa, utilizando los siguientes dos oligonucleótidos : 5 'oligo = VE120-5gagaattCTTAACACGCATGATCCCCACGGC (SEQ ID NO : 2O) 3 '-oligo = VE121-3 ctggatcCGTCAAATCCGTGAATCGTAACGAG (SEQ ID NO: 21) El oligonucleótido VE120-5 contiene secuencias que corresponden a la posición #607 a #630 de la secuencia de GenBank Acceso #X96943. El oligonucleótido VE121-3 contiene el complemento inverso de las secuencias desde la posición #1908 hasta #1932 del mismo archivo de secuencias GenBank. El ADN amplificado se ligó en el sitio Srfl de pCR-Script SK(+), para generar pSW8-l y pSW8-2, dos clones de reacción en cadena de la polimerasa independientes del gen ggs . Estos dos plásmidos se digirieron entonces con EcoRl y BamHl, y se purificó el fragmento de 1,335 pares de bases que contenía el gen ggs, y se ligó en pPGK digerido con EcóRI, BamHl, para generar pSW10-l y pSW10-2, derivándose cada secuencia de ggs a partir de pSW8-l y pSW8-2, respectivamente. La cepa EMS9-23 ( ura3 , erg9 , descrita en el Ejemplo l.G.) se transformó con os plásmidos descritos anteriormente, utilizando el método de LiOAc, y se seleccionaron los transformantes sobre placas de SCE-ura. Los transformantes se recogieron y se volvieron a rayar sobre placas de SCE-ura para la purificación. Se probaron los transformantes representativos para determinar la producción de GG. Las cepas se cultivaron a 30 °C durante 48 horas en un medio líquido de SCE-ura, luego se utilizaron para inocular los matraces que contenían el medio YPDE, de tal manera que la OD6oo inicial fue de 0.5. Estos cultivos se incubaron a 30 °C con agitación durante 72 horas, y se analizaron para determinar el peso celular seco, y los niveles de farnesol y GG. También se inoculó un segundo conjunto de matraces que contenían 20 mililitros de medio SCE-ura a partir de los mismos cultivos iniciales, y se cultivaron durante 48 horas. Las células de estos matraces se cosecharon, se lavaron con 10 mililitros de regulador de BisTris-propano 50 mM, pH de 7.0, y se volvieron a granular. Luego se utilizaron los granulos celulares para preparar suspensiones de células permeabilizadas para los ensayos de GGPP-sintasa. Las células se permeabilizaron volviendo a suspender en 1 mililitro de regulador de Bis-Tris-propano 50 mM, pH de 7.0, conteniendo Tritón X-100 al 0.1 por ciento, y se congelaron a 80 °C hasta que se necesitaron. Después de descongelarse, las células permeabilizadas se utilizaron para los ensayos de GGPP-sintasa. La mezcla del ensayo de GGPP-sintasa contenía regulador de Bis-Tris-propano 0.05M, pH de 7.0 (X microlitros), ditioeritritol 0.1 M (1 microlitro), 1 miligramo/mililitro de FPP (5 microlitros) , 1 miligramo/mililitro de IPP (5 microlitros, y células permeabilizadas (Y microlitros) , en donde X + Y = 87 microlitros. Se incluyó una reacción de control, en donde se omitieron FPP e IPP. Las mezclas de ensayo se incubaron a 37°C durante 20 minutos. Se agregaron 0.1 mililitros de regulador de glicina 2X (glicina 0.2M, MgCl2 2 mM, ZnCl2 2 mM, pH de 10.4), y 63 unidades de fosfatasa alcalina (Sigma Chemical Co . , St . Louis, MO) , y las mezclas se incubaron durante 60 minutos a 37°C. Luego las mezclas se extrajeron con 0.2 mililitros de l.:l de hexano: acetato de etilo, y se analizaron para determinar el GG mediante GC/MS. La actividad de GGPP-sintasa se expresa como nanomoles de GGPP formados/minuto/miligramo de proteína. Los pesos celulares secos, la producción de farnesol, la producción de GG, y las actividades de GGPP-sintasa para las cepas, se resumen en la Tabla 13. La cepa de control, EMS923/YEp352 , que carece de una GGPP-sintasa clonada, produjo farnesol al 8.7 por ciento (basándose en el peso celular seco) , y esencialmente nada de GG. Las otras cuatro cepas, cada una de las cuales sobreexpresó una GGPP-sintasa clonada diferente, produjeron aproximadamente la misma cantidad de farnesol que el control (del 8.0 al 9.74 por ciento), y produjeron niveles de GG desde el 0.62 hasta el 1.73 por ciento.

Tabla 13 Producción de GG en Cultivos de Matraces de Agitación, de Cepas que Sobreexpresan 4 Genes de GGPP-Sintasa Clonados Diferentes El efecto de la amplificación de la actividad de GGPP-sintasa sobre la producción de GG se evalúa adicionalmente en termentadores de 1 litro. La cepa EMS9-23 se transformó con el plásmido pTWMI10-ll, que llevaba el gen BTSl clonado de S. cerevisiae . La cepa SWE23- E91 (descrita en el Ejemplo l.G. anterior), se transformó con Yep352 (vector de control) , o pSW4A-3 (un aislado individual del plásmido pSW4A, que lleva el gen crtE clonado) . Se cultivaron las cepas SWE23- E9l/YEp352, EMS9-23/pTWMI10-ll y SWE23- E9l/pSW4A-3 en termentadores de 1 litro, utilizando el método descrito en el Ejemplo l.H.y y se compararon el crecimiento, la producción de farnesol, y la producción de GG. Los resultados se muestran en la Figura 7 y en la Tabla 14. El crecimiento de las tres cepas fue similar. La cepa SWE23- E9l/YEp352 produjo 2.32 gramos/litro de farnesol en 236 horas, y no produjo GG detectable. La EMS9-23/pTWMI10-11 produjo 2.1 gramos/litro de farnesol en 239 horas, y también produjo 0.42 gramos/litro de GG en el mismo período de tiempo. La cepa SWE23- E91 produjo 2.47 gramos/litro de farnesol en 236 horas, y también produjo 0.59 gramos/litro de GG en el mismo período. La actividad de GGPP-sintasa en la cepa de control estuvo debajo de los límites detectables. La producción de GG por las cepas EMS9-23/pTWMI10-ll y SWE23- E9l/pSW4A-3 se correlacionó con la mayor actividad de GGPP-sintasa.

Tabla 14 Crecimiento, Producción de Farnesol y GG, en Cepas que Sobreexpresan GGPP-Sintasas, y Cultivadas en Fementadores de 1 Litro Ejemplo 5 Este ejemplo ilustra el efecto de sobreexpresar el gen ERG20 que codifica FPP-sintasa. Para determinar los efectos de elevar los niveles de FPP-sintasa en mutantes erg9 , se clonó el gen ERG20 que codifica para FPP-sintasa, a partir de Saccharomyces cerevisiae, para la sobreexpresión. El gen ERG20 se amplificó mediante reacción en cadena de la polimerasa, utilizando el ADN genómico a partir de S. cerevisiae cepa S288C (preparada de acuerdo con el método descrito en Sherman y colaboradores, 1986), y los dos siguientes oligonucleótidos: 5 Oligo = BamFPPUp ggccggatccATATTACGTAGAAATGGCTTCAG (SEQ ID NO: 22) 3 Oligo = XhoFPPLo gccgctcgagGGTCCTTATCTAGTTTG (SEQ ID NO: 23) El oligonucleótido BamFPPUp contiene secuencias que corresponden a la posición #790 a #810 de la secuencia de GenBank Acceso #J05091. El oligonucleótido XhoFPPLo contiene el complemento inverso de la secuencia desde la posición #1891 hasta #1907 del mismo archivo de secuencias GenBank. El producto de reacción en cadena de la polimerasa se digirió con BamJíI y Xhol , y se ligó en un vector que contenía el promotor GPD de S. cerevisiae (gliceraldehído-3 -fosfato/deshidrogenasa) , y el terminador PGK. El vector del promotor/terminador se obtuvo digiriendo un plásmido que contenía el dominio catalítico del gen HMG2 del gen clonado entre el promotor GPD y el terminador GPK, es decir, pRH124-31 (descrito en el Ejemplo 4), con BamHl y Salí , para remover el ADN de HMG2. La banda de 6.3 kb que correspondía al vector del promotor/terminador, se purificó y se ligó con el fragmento de 1,129 pares de bases que contenía ERG20, para generar el pJMB19-31 y el pJMB19-32. Los plásmidos pJMB19-31y pJMB19-32 se utilizaron para transformar la cepa SWE23- E91 ( ura3 , his3 , erg9? : :HIS3 ) , utilizando el método de LiOAc, y se seleccionaron los transformantes sobre placas de SCE-ura. Los transformantes se recogieron y se volvieron a rayar sobre placas de SCE-ura para la purificación. Para determinar los efectos de la sobreexpresión de FPP-sintasa en las cepas mutantes erg9 , se cultivaron transformantes representativos construidos como se describió anteriormente, en cultivos de matraces de agitación, y se compararon en relación con el crecimiento, la producción de farnesol, la producción de GG, y las actividades de FPP- síntasa y de GGPP-sintasa. Las cepas se cultivaron con agitación a 30 °C durante 48 horas en un medio líquido de SCE- ura, y luego se utilizaron para inocular los matraces que contenían el medio YPDE, de tal manera que la OD6oo inicial fue de 0.5. Estos cultivos se incubaron a 30 °C con agitación durante 72 horas adicionales, y se analizaron para determinar el peso celular seco, y los niveles de farnesol y GG. También se inoculó un segundo conjunto de matraces que contenía 20 mililitros del medio SCE-ura a partir de los mismos cultivos iniciales, y se hicieron crecer durante 48 horas. Las células de estos matraces se cosecharon, se lavaron con 10 mililitros de regulador BisTris-propano 50 mM, pH de 7.0, y se volvieron -a granular. Los granulos celulares se utilizaron entonces para preparar las suspensiones celulares permeabilizadas para los ensayos de FPP- y GGPP-sintasa. Las células se permeabilizaron volviendo a suspender en 1 mililitro de regulador de Bis-Tris-propano 50 mM, pH de 7.0, conteniendo Tritón X-100 al 0.1 por ciento, y se congelaron a 80 °C hasta que se necesitaron. Después de descongelarse, se utilizaron las células permeabilizadas para los ensayos. La mezcla del ensayo de GGPP-sintasa fue _la misma que la descrita en el Ejemplo 5. La mezcla del ensayo de FPP-sintasa contenía regulador de Bis-Tris-propano 0.05M, pH de 7.0 (X microlitros), ditioeritritol 0.1 M (1 microlitro), MgCl2 0.5M (2 microlitros) , 1 miligramo/mililitro de IPP (6 microlitros) , 1 miligramo/mililitro de difosfato de geranilo (GPP) (6 microlitros) , y células permeabilizadas (Y microlitros), en donde X + Y = 85 microlitros. Se incluyó una reacción de control en donde se omitieron IPP y GGPP. Las mezclas de ensayo se incubaron a 37 °C durante 15 minutos. Se agregaron 0.1 mililitros de regulador de glicina 2X (glicina 0.2M, MgCl2 2 mM, ZnCl2 2 mM, pH de 10.4), y 63 unidades de fosfatasa alcalina (Sigma Chemical Co. , St . Louis, MO) , y las mezclas se incubaron durante 60 minutos a 37°C. Luego las mezclas se extrajeron con 0.2 mililitros de 1:1 de hexano/acetato de etilo, y se analizaron para determinar el farnesol mediante GC/MS. La actividad de FPP-sintasa se expresa como nanomoles de FPP formados/minuto/miligramo de proteína. Los datos presentados en la Tabla 15 muestran que la sobreexpresión de FPP-sintasa no incrementó la producción de farnesol, pero, inesperadamente, sí incrementó la producción de GG en estos cultivos de matraces agitados. El nivel de GG producido por SWE23- E9l/pJMB19-31 ó SWE23- E9l/pJMB19-32 fue inclusive más alto que el observado para la cepa (EMS923/pTWM110-ll) que sobreexpresaba el gen BTSl de S. cerevisiae (GPP-sintasa) . Tabla 15 Producción de GG en Mutantes erg9 que Sobreexpresan FPP- sintasa y GGPP-sintasa El efecto de la amplificación de la actividad de FPP-sintasa sobre la producción de GG se evaluó adicionalmente en fermentadores de 1 litro. Se cultivaron las cepas SWE23- E9l/YEp352 (control), EMS9-23/pSW4A3 ( crtE, GGPP-sintasa), y SWE23- E 9 l/pJMB19-3J2 (ERG9 , FPP-sintasa) en fermentadores de 1 litro, utilizando el método descrito en el Ejemplo I.H., y se compararon el crecimiento, la producción de farnesol, la producción de GG, y la actividad de GGPP-sintasa (Figura 8 y Tabla 16) . El crecimiento de las tres cepas fue similar, aunque la SWE23- E91 /pJMB19-32 se quedó atrás antes de crecer a una velocidad similar a las otras cepas. La cepa SWE23- E 9 l/pJMB19-32 produjo 2.31 gramos/litro de farnesol en 258 horas, y no produjo GG detectable. La EMS9-23/pSW4A3 produjo 2.52 gramos/litro de farnesol, y 0.57 gramos/litro de GG en 258 horas. La cepa SWE23-E91 /pJMB19-32 produjo 1.95 gramos/litro de farnesol en 258 horas, y también produjo 0.59 gramos/litro de GG en el mismo período. La producción de GG inesperada por parte de SWE23-E91 /pJMB19-32 se correlacionó con la actividad incrementada de GGPP-sintasa en esta cepa (ver más adelante) . No se detectó ninguna actividad de GGPP-sintasa en la cepa de control SWE23- E 9 l/pJMB19-32. La cepa EMS9-23/pSW4A3, que expresaba el gen crtE de E. uredovora (GGPP-sintasa) mostró una actividad de GGPP-sintasa relativamente alta (1.7 nanomoles/minuto/miligramo en las células a partir del punto del tiempo de 258 horas) . Como se esperaba, la cepa SWE23- E9l/pJMB19-32, que sobreexpresa la FPP-sintasa de S. cerevisiae, contenía actividad de FPP-sintasa, que se elevó >10 veces en todos los puntos del tiempo a través de la fermentación, comparándose con un control que solamente tenía niveles normales de FPP-sintasa (no se muestran los datos) . Sin embargo, de una manera sorprendente, la cepa SWE23- E9l/pJMB19-32 también tuvo una actividad elevada de GGPP-sintasa (Tabla 16) . Esta actividad indudablemente cuenta para la producción inesperada de GG por parte de esta cepa. La actividad de GGPP-sintasa elevada detectada en la cepa SWE23- E9l/pJMB19-32, pudo ser un resultado de la sobreexpresión de FPP-sintasa, que induce la actividad de la GGPP-sintasa (el producto genético BTSl) . También es posible, sin embargo, que la FPP-sintasa tenga algún bajo nivel de actividad de GGPP-sintasa, que se revela en esta cepa, debido al alto grado de sobreproducción de la FPP-sintasa.

Tabla 16 Efecto de las FPP-sintasa Amplificada Sobre el Crecimiento, la Producción de Farnesol, de Cepas Cultivadas en Fermentadores de 1 Litro Ejemplo 7 Este ejemplo evalúa varios procedimientos de extracción de farnesol . En el primer experimento, se hizo una comparación entre la extracción del caldo entero (células más medio) , y extracciones separadas del granulo celular y el medio bajo diferentes condiciones para MBNA1-13 (productor de farnesol) y ATCC 28383 (productor de ergosterol) (ver el Ejemplo 1) . Se extrajo una muestra de 10 mililitros de cultivo generalmente como se describe en el Ejemplo 1, pero con los cambios indicados en la Tabla 17 más adelante. El método 1 de la Tabla 17 es el mismo que el método de extracción descrito en el Ejemplo 1. Se encontró que, para la extracción de farnesol, una extracción del caldo entero era tan eficiente como una extracción de células y medio separada para los métodos 1, 3, 5, y 7. Se extrajo más farnesol mediante el método 5, que es justamente una adición de 2 mililitros de pirogalol al 0.2 por ciento en metanol, antes de extraer el caldo entero en hexano. La segunda extracción más alta fue la del método 1.

TABLA 17 En seguida, se condujeron experimentos para determinar los efectos del tipo de solvente de extracción (método 1, caldo entero) , los tiempos utilizados para la extracción (método 1, extracción con hexano, caldo entero) , y la cantidad de metanol agregada antes de la extracción (método 1, extracción con hexano, caldo entero) . Los resultados se presentan en las Tablas 17-19 siguientes.

TABLA 17 *Pico de solvente coeluido con farnesol, haciendo imposible la cuantificación de farnesol utilizando este método.

Tabla 18 Tabla 19 Se hizo un trabajo adicional para optimizar y simplificar el procedimiento de extracción para el farnesol, y para adaptar el procedimiento para la extracción de GG a partir de los caldos de fermentación. Este trabajo dio como resultado el protocolo de extracción final descrito en seguida . 1. Se utiliza caldo de fermentación entero no diluido, o diluido apropiadamente con agua hasta un volumen final de 2.0 mililitros, en un tubo de ensayo de vidrio tapado con teflón de 15 mililitros. 2. Se agregan 2.0 mililitros de hexano. 3. Se agregan 2.0 mililitros de metanol. 4. El tubo se pone en vórtex a una alta velocidad durante 3.5 minutos . 5. La muestra se centrifuga a 2,800 rpm en una centrífuga de mesa durante 25 a 30 minutos para separar las fases . 6. El sobrenadante (fase orgánica) se remueve y se coloca en un frasco de vidrio tapado con teflón para GC/MS de 2.0 mililitros, para la determinación del farnesol y el GG medíante GC/MS.

Ejemplo 8 El siguiente ejemplo demuestra el efecto de la amplificación de HMG-CoA-reductasa sobre la producción de GG, mediante una cepa que sobreexpresa la GGPP-sintasa. En este experimento, se construyó una cepa que contenía una sola copia de un plásmido integrado en su genoma, que permite que las células sobreexpresen la GGPP-sintasa. El plásmido integrante se conoce como pSW35-42, y se construyó como sigue. El plásmido pSW4A (ver el Ejemplo 5) se digirió con BamHl, para generar un fragmento de 2,199 pares de bases que contenía una fusión del promotor ADH1 , la secuencia codificante crtE, y el terminador ADH1. Luego este fragmento se ligó en YIp351 digerido con BamHl (Hill y colaboradores, 1986, Yeast/E. coli Shuttle Vectors with Múltiple Unique Restriction Sitea, YEAST 2:163-167), para generar el pSW35-42. Para construir una cepa que contuviera pSW35-42, este plásmido se digirió con la endonucleasa de restricción BstEII , para introducir un solo corte dentro del gen LEU2. El plásmido linearizado se purificó y se utilizó para transformar la cepa SWE23-DL1 utilizando el método de LiOAc. Los transformantes en donde se había integrado el pSW35-42 en el lugar LEU2 se seleccionaron sobre un medio que carecía de leucina. Una de las cepas transformadas resultantes es referida como SWE23-DL1: :pS 35-42. Luego esta cepa se transformó con YEp352 (un vector vacío de control, Hill y colaboradores, 1986, YEAST 2:163-167), o con pRH124-31 (contiene el dominio catalítico del gen HMG2 , ver el Ejemplo 4), lo cual dio como resultado las cepas SWE23-DL1 : :pSW35-42/YEp352 y SWE23-DL1 : :pSW35-42/pRH124 , respectivamente. La cepa SWE23-DL1: :pSW35-42/YEp352 sobreexpresa la GGPP-sintasa, mientras que la SWE23-DL1 : :pSW35-42/pRH124 sobreexpresa la GGPP-sintasa y la HMG-CoA-reductasa. Se condujeron experimentos de fermentación de las cepas SWE23-DL1: :pSW35-42/pRH124 y SWE23-DL1 : :pSW35-42/YEp352 para comparar la producción de GG por parte de estas dos cepas . Las cepas se probaron para determinar la producción de GG en fermentadores de 1 litro, utilizando el protocolo descrito en el Ejemplo l.H. Los datos de la fermentación se presentan en la Tabla 20. Este experimento muestra que la fermentación de la SWE23-DL1 : :pSW35-42/pRH124 acumuló más GG que la fermentación de la SWE23-DL1 : :pSW35-42/Yep352 , y demuestra que la elevación de la actividad de HMG-CoA-reductasa en una cepa diseñada para producir GG, daba con resultado una elevación adicional de los niveles de GG, comparándose con una cepa similar con HMG-CoA-reductasa no amplificada.

TABLA 20 Se efectuó un segundo planteamiento paxa logxar la sobreexpresión de la HMG-CoA-reductasa de GGPP-sintasa en la misma cepa, mediante la clonación de ambos genes en un vector de levadura de alto número de copias, y la transformación de este plásmido en una cepa mutante erg9. El plásmido utilizado para este propósito es referido como pSW46-l, y se construyó como sigue. El plásmido pSW4A (ver el Ejemplo 5) se digirió con £7coRI y Sacl, y el fragmento de 0.9 kb que contenía el gen crtE se purificó y se ligó en pADH313-956 digerido con EcoRl , Sacl , para generar el pSW38-10. Se suprimieron dos regiones de este plásmido mediante digestión con las enzimas de restricción, rellenando los extremos del ADN utilizando polimerasa de Pfu, y ligando para reformar el plásmido circular. Las regiones suprimidas de esta manera estuvieron entre los sitios Ndel y Spel, y entre los sitios JíindIII y PstI. El plásmido resultante es referido como pSW43-5. El plásmido pSW43-5 se digirió con BamHl, y el fragmento resultante de 2,199 pares de bases que contenía el promotor ADH1, el gen crtE, y el terminador ADH1 (referido como el fragmento ADHp/crtE/ADHt) se purificó y se ligó en el sitio BamHl de YEp352. El plásmido resultante es referido como pSW44-17, y difiere del pSW4A en que contiene uno en lugar de dos sitios PstI . El plásmido pRH124-31 se digirió con Xbal y PstI, y el fragmento de 3.2 kb que contenía al promotor GPD, el gen de dominio catalítico HMG2 , y el terminador PGJC (referido como el fragmento GPDp/HMG2cat/PGKt) se clonó en el pSW44-17 digerido con Xbal , Ps i, para generar el pSW46-l. Este plásmido se replica hasta un alto número de copias en levadura, y contiene ambos genes HMG2 y crtE , proporcionando la sobreexpresión de HMG-CoA-reductasa y GGPP-sintasa. El plásmido pSW46-l se transformó en la cepa mutante de erg9 SWE-DE91, y se aislaron los transformantes URA+ . Varios de los transformantes resultantes se probaron en un experimento de matraz de agitación, y se compararon con una cepa que sobreexpresaba solamente GGPP-sintasa (EMS9-23/pSW4A) . Los resultados de este experimento se presentan en la Tabla21, y demuestran que se acumulan niveles más altos de GG en las cepas que sobreexpresan tanto HMG-CoA-reductasa como GGPP- sintasa, al compararse con una cepa que sobreexprese solamente la GGPP-sintasa.

Tabla 21 Estos datos apoyan la idea de que la sobreexpresión de HMG-CoA-reductasa en una cepa que sea capaz de producir niveles elevados de GG, conduce a un incremento adicional en la cantidad de GG producido.

Ejemplo 9 El siguiente ejemplo describe la producción de cepas más estables que sobreexpresan HMG-CoA-reductasa. Como se describe en el Ejemplo 4, se construyeron cepas que sobreexpresaban HMG-CoA-reductasa, debido a la presencia de plásmidos de réplica con alto número de copias que contenían los genes J9 Glcat ó HMG2cat . Debido a que los plásmidos replicantes con frecuencia se pueden perder durante la división celular, esta inestabilidad mitótica de los plásmidos replicantes puede conducir eventualmente a cultivos con una alta proporción de células que contengan solamente niveles normales de HMG-CoA-reductasa. Con el objeto de obtener cepas más estables que sobreexpresaran la HMG-CoA-reductasa, se integraron copias del gen que codificaba para el dominio catalítico de HMG2p en el genoma de la cepa SW23B. Esto se realizó construyendo primero un plásmido que permitió hacer integraciones múltiples del gen HMG2 en la región separadora del gen del ARNr. Este planteamiento se modela después del método de integración de ADNr descrito por Lopes y colaboradores, 1989 (Lopes, T.S. Klootwijk, J. , Veenstra, A.E., van der Aar, P.C., van Heerikhuizen, H. , Raue, H.A., y Planta, R.J. 1989. High-copy-number integration into the ribosomal DNA of Saccharomyces cerevisiae : a new vector for high-level expression. Gene 79:199-206). Se utilizó reacción en cadena de la polimerasa para amplificar dos regiones del lugar del ARNr que quedan en la región intergénica entre el gen que codifica para el ARNr 35S, y el gen que codifica para el ADNr 5S, referida en la presente como la región separadora de ADNr. Los oligonucleótidos utilizados para amplificar el primero de los dos fragmentos de la región separadora de ADNr contenían secuencias correspondientes a las bases #11161 a #11130, y el complemento inverso de #10311 a #10330 a Gene Bank Acceso #Z73326. Las secuencias de los oligonucleótidos se enlistan más adelante. Las letras minúsculas se utilizan para indicar las bases que se alteraron o se agxegaron paxa cxeax los sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción, que se indican entre paréntesis en seguida de la secuencia del oligonucleótido . SEQ ID NO: 24: R6XbaI Lo 5 ' -1ctagaGGCACCTGTCACTTTGGAAAAAAAATATACGC-3 ' (XbaI ) SEQ ID NQ:25: R7SacII Up 5 ' -ccgcggGCCGGAAATGCTCTCTGTTC-3 ' (Sacll) El fragmento de ADN generado a partir de la amplificación con reacción en cadena de la polimerasa utilizando estos dos oligonucleótidos, es referido en la presente como el fragmento R6/R7. El fragmento R6/7 generado por la reacción en cadena de la polimerasa, se clonó inicialmente en el plásmido pCR-Script, para generar el pSW48-l, luego se cortó de este plásmido mediante digestión con Xbal y Sacll . El fragmento resultante de 759 pares de bases se clonó entonces en pBluescript SK- (Stratagene) digerido con Xbal , Sacll , para generar el pSW49-l. Los oligonucleótidos utilizados para amplificar el segundo fragmento de la región separadora de ARNr, contenían secuencias correspondientes a las bases #11247 a #11272, y el complemento inverso de #12054 a #12072 de Gene Bank Acceso #Z73326. Las secuencias de estos oligonucleótidos se enlistan en seguida .

SEQ ID NO: 26: R5Sal UpB 5' -CÁCgtCgACCATTCAAACTTTACTAC-3 ' (Salí) SEO ID NO: 27: R4ApaI LoB 5 ' -GAGGGCccGGTCCAGACAT-3 ' (Apal) El fragmento de ADN generado a partir de la amplificación con reacción en cadena de la polimerasa utilizando los dos oligonucleótidos mencionados anteriormente, es referido en la presente como el fragmento R4/R5. El fragmento R4/R5 generado por la reacción en cadena de la polimerasa, se digirió con Apal y Salí , y se ligó en pSW49-l digerido con Apal, Salí para generar el pSW52-ll. Se utilizó reacción en cadena de la polimerasa para amplificar el gen TRP1 , de tal manera que el gen llevara un promotor incompleto. El_ promotor incompleto se pretendía para reducir- la expresión del gen TRP1, y de esta manera proporcionar un medio de selección para la integración de un alto número de copias del cásete de expresión final. Los oligonucleótidos utilizados para el gen TRP1 contenían secuencias correspondientes a las bases #53 a #73, y el complemento inverso de #804 a #823 de Gene Bank Acceso #J01374. Las secuencias de los oligonucleótidos se enlistan en seguida.

SEO ID NO: 28: TRP1 SmaUp 5' -cccgggTATTGAGCACGTGAGTATACG-3 ' (Smal) • SEO ID NO: 9: TRP1 BamLo -ggatccGGCAAGTGCACAAACAATAC- il -(BamHl) En el siguiente paso, se digirió pSW50-l con BamHl y Smal, y se purificó el fragmento TRP1 resultante de 779 pares de bases. El plásmido pRH124-31 se digirió con PstI y Smal para generar un fragmento de 3,261 pares de bases que contenía el promotor GPD, el gen HMG2 cat, y el terminador PGK (referido como el fragmento GPDp/HMG2cat/PGKt) , y este fragmento se purificó. El fragmento TRP1 y el fragmento GPDp/HMG2cat/PGKt se ligaron en pSW52-ll digerido con PstI , BamHl .en un ligamiento de tres fragmentos, para generar pSW58-77 y pSW58-45. El fragmento de ADN que contenía las fusiones genéticas R6/R7- TRPl -GPDp/HMG2cat/PGK t-R4/R5, se cortó a partir de pSW58-77 mediante digestión con las endonucleasas de restricción JCpnl y Sacl. El fragmento de 5671 pares de pares correspondiente a la construcción integradora, se purificó y se utilizó para transformar la cepa SW23B. los transformantes se seleccionaron sobre un medio SCE-trp. Las cepas aisladas de esta manera se xastrearon para determinar la elevación de actividad de HMG-CoA-reductasa, y mediante análisis de mancha Southern para determinar la elevación del número de copias genéticas de HMG2. Se identificaron las cepas que llevaban una copia de la construcción integradora, dos copias de la construcción integradora, tres copias de la construcción integradora, y ocho copias de la construcción integradora, y son referidas como SW23B#19, SW23B#31, SW23B#40, y SW23B#74, respectivamente. La Tabla 22 da la actividad específica de la HMG-CoA-reductasa, determinada por los ensayos enzimáticos in vi tro, y el número de copias del gen HMGcat, determinado mediante mancha Southern. El ensayo de HMG-CoA-reductasa fue previamente descrito (Quain, D.E. y Haslam, J.M. 1979. The Effects of Catabolite Derepression on the Accumulation of Steryl Esters and the Activity of ß-Hydroxymethylglutaryl-CoA Reductase in Saccharomyces cerevisiae . J. Gen. Microbiol. 111:343-351) TABLA 22 Estas cepas requiere de leucina y uracilo exógenamente suministrados para el crecimiento, debido a las mutaciones leu2 y ura3 en estas cepas. Para eliminar la necesidad de suministrar estos nutrientes durante los experimentos de fermentación, las cepas se transformaron con un plásmido, pTWM138, que contenía las copias funcionales de URA3 , LEU2 , y TRP1 . La presencia de este plásmido en estas cepas permitió que las cepas crecieran sin suplemento de leucina y uracilo. Se realizaron experimentos de fermentación para comparar la producción de farnesol por parte de estas cepas. En este experimento, también se incluyó la cepa SWE23- DE9l/pRH124-31, que contiene la fusión genética GPDp/HMG2cat/PGKt sobre un plásmido de alto número de copias (ver el Ejemplo 4.B). Las cepas se probaron para determinar la producción de farnesol én fermentadores de 1 litro, utilizando el protocolo descrito en el Ejemplo l.H, y los datos de este experimento se presentan en la Tabla 23.

TABLA 23 Estos datos apoyan la idea de que las cepas con niveles elevados de HMG-CoA-reductasa, producen más farnesol que una cepa con niveles normales de HMG-CoA-reductasa. Los datos también indican que una cepa que contenga 8 copias integradas del gen HMG2cat producen esencialmente tanto farnesol como una cepa que lleve más de 20 copias extracromosómicas del gen HMG2cat, como es el caso con la cepa SW23B/pRH124-31. Una cepa que contenía una sola copia integrada del gen HMG2 cat produjo más farnesol que la cepa de control, pero ligeramente menos que las cepas con más copias del gen HMG2cat . En adición, las cepas que contenían niveles elevados de HMC-CoA-reductasa acumularon mevalonato en el cultivo, mientras que las cepas con niveles normales de HMG-CoA-reductasa no. Esto sugiere que un paso corriente abajo de la HMG-CoA-reductasa limita el flujo de carbono en la ruta una vez que se ha elevado la actividad de la enzima HMG-CoA-reductasa (ver el Ejemplo 10) . __ El flujo de carbono a través de la ruta es restringido por la actividad de una de las enzimas corriente abajo de HMG-CoA-reductasa, dando como resultado la acumulación de mevalonato en el medio.

E-i emplo 10 Este ejemplo muestra los efectos de la sobreexpresión de múltiples genes de la ruta isoprenoide en una cepa que tiene una mutación erg9 , y . niveles elevados de HMG-CoA-reductasa . Como se muestra en los Ejemplos 4 y 9, la elevación de los " niveles de HMG-CoA-reductasa condujo a un flujo más alto de carbono a través de la ruta de isoprenoide/esterol . La sobreexpresión de otros genes de la ruta isoprenoide en cepas que contienen HMG-CoA-reductasa amplificada, puede incrementar adicionalmente el flujo de carbono a través de esta ruta. La amplificación de los genes de la ruta isoprenoide en las cepas que tienen niveles elevados de HMG-CoA-reductasa, así como un gen erg9 defectuoso, puede dar como resultado una elevación adicional de los niveles de farnesol. También, la amplificación de los genes de la ruta isoprenoide puede dar como resultado una elevación adicional de los niveles de GG en las cepas que tenga un gen erg9 defectuoso, y que tengan niveles elevados de HMG-CoA-reductasa y de GGPP-sintasa. Para probar estas ideas, se construyeron plásmidos que permitieran la sobreexpresión de múltiples genes de la ruta isoprenoide . Uno de los plásmidos proporcionó la sobreexpresión de mevalonato-cinasa, fosfomevalonato-cinasa, y difosfomevalonato-descarboxilasa, codificada por los genes ERG12, ERG8, y ERG19 , respectivamente. Este plásmido es referido como pSW77-69, y se construyó a partir de fragmentos de ADN obtenidos a partir de un número de plásmidos que contenían genes de la ruta isoprenoide individuales. Primero se describe la construcción de estos plásmidos. Se utilizó reacción en cadena de la polimerasa para amplificar el gen ERG12 para la clonación. Los oligonucleótidos utilizados para amplificar el gen ERG12 contenían las secuencias correspondientes a las bases #2827 a #2846, y el complemento inverso de #5247 a #5229 de Gene Bank Acceso #Z49809. Las secuencias de los dos oligonucleótidos se dan más adelante. Las letras minúsculas se utilizan para las bases que se alteraron o se agregaron para crear los sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción, que se indican entre paréntesis en seguida _ de la secuencia del oligonucleótido .

SEO ID NQ;3Q; E12.4SN 5 ' -CCAAATATAACtCGAGCTTTG3 (XhoI) SEO ID NO: 31: E12.SALI3 5'-GCAAAGTcCaCCACCGCAG-3 (Salí) El gen ERG12 se amplificó utilizando los dos oligonucleótidos E12.4SN y E12.SALI3, y el ADN genómico a partir de la cepa ATCC 28383. El ADN resultante se clonó en pCR-Script en el sitio Sfrl para generar pSW68. Los oligonucleótidos utilizados para amplificar el gen ERG19 contenían las secuencias correspondientes a las bases #911 a #937 de Gene Bank Acceso #Z71656, y el complemento inverso de las bases #1930 a #1962 de Gene Bank Acceso #Z71658. Las secuencias de los dos oligonucleótidos se dan en seguida .

SEO ID NO: 2: E19 SMAI 5' -GCCACGTGCCCcCGGGTTTCTCTAGCC-3' ( Smal ) SEQ ID NO: 3: E19 SACI3 5' -GGAAAAGagCtCGATAATTATTGATGATAGATC-3 ' (Sacl) El gen ERG19 se amplificó utilizando los dos oligonucleótidos E19 SMAI , E19 SACI3 , y el ADN genómico a partir de la cepa ATCC 28383. El ADN resultante se clonó el pCR-Script en el sitio Sfrl, para generar pSW69. Los oligonucleótidos amplificados para amplificar el gen ERG8 contenían las secuencias correspondientes a las bases #2729 a #2749, y el complemento inverso de #5177a #5196 de Gene Bank Acceso #Z49939. Las secuencias de los dos oligonucleótidos se dan en seguida.

SEO ID NO: 34: E8.2135N 5' -CCGTTTTGGATccTAGATCAG-3 ' (BamHl) SEO ID NO : 35: E8SMAI3 5' -gttcccGGGTTATTGTCCTGCATTTG-3' (Smal) El gen ERG8 se amplificó utilizando los dos oligonucleótidos E8.2135?, E8SMAI3, y el AD? genómico a partir de la cepa ATCC 28383. El AD? resultante se clonó en pCR-Script en el sitio Sfrl para generar pSW71. El plásmido pSW71 se digirió con Ba Hl y Smal, y el fragmento resultante de 2,459 pares de bases que contenía el gen ERG 8 , se purificó. El plásmido pSW69-3 se digirió con Smal y Sacl, y el fragmento resultante de 2,239 pares de bases que contenía el gen ERG19 se purificó. El vector de levadura de alto número de copias Yep352 (que contenía un marcador de selección URA3) se digirió con BamHl y Sacl, y se purificó. Los tres fragmentos de ADN purificados se ligaron entre sí para generar pSW76.11. En seguida, se digirió pSW68 con Salí y Xhol , y la banda de 2,400 pares de bases resultante que contenía el gen ERG12 se purificó y se ligó en pSW76-ll digerido con Salí , para generar pSW77-69. Este plásmido contiene ERG12 , ERG8 , y ERG19 , y proporciona la sobreexpresión de mevalonato-cinasa, fosfomevalonato-cinasa, y difosfomevalonato-descarboxilasa. Otro plásmido proporcionó la sobreexpresión de mevalonato-cinasa, fosfomevalonato-cinasa, difosfomevalonato-descaxboxilasa, e IPP-isomerasa, codificadas por los genes ERG12, ERG8, ERG19, e IDI1 , respectivamente. Este plásmido es referido como pSW78-68, y se construyó como sigue. El gen IDI1 se amplificó mediante reacción en cadena de la polimerasa para la clonación. Los oligonucleótidos utilizados para amplificar el gen IDI1 contenían las secuencias correspondientes a las bases #19577 a #19604, y el complemento inverso de #17477 a #17502 de Gene Bank Acceso #U43503. Las secuencias de los dos oligonucleótidos se dan en seguida .

SEO ID NO: 36: ISO SACI5 5' -AAGAGctcATCTGATAATAGATCAAGCG-3' (Sacl) SEQ ID NO: 37: ISO SACI3 5' -AGGAGCTCAACGACAATAAATGGCTG-3' (Sacl) El gen ZDJ1 se amplificó utilizando los dos oligonucleótidos ISO SACI5, ISOSACI3, y el ADN genómico a partir de la cepa ATCC 28383. El ADN resultante se clonó en pCR-Script en el sitio Sfrl, para generar pSW73. El plásmido pSW73 se digirió con Sacl, y el fragmento resultante de 2117 pares de bases que contenía el gen IDI1 , se ligó con pSW77-69 digerido con Sacl, para generar el pSW78-68. Este plásmido contiene ERG12 , ERG8 , ERG19 , e XDJ1, y proporciona la sobreexpresión de mevalonato-cinasa, fosfomevalonato-cinasa, difosfomevalonato-descarboxilasa, e IPP-isomerasa . Otro plásmido proporcionó la sobreexpresión de acetoacetil-CoA-tiolasa y HMG-CoA-sintasa, codificadas por los genes ERGI O y ERG13 , respectivamente. Este plásmido es referido como pSW79-29, y se construyó como sigue. Se utilizó reacción en cadena de la polimerasa para amplificar los genes ERG13 y ERGI O para la clonación. Los oligonucleótidos utilizados para amplificar el gen ERG13 contenían las secuencias correspondientes al complemento inverso de las bases #21104 a #21127, y las bases #18270 a #18292 de Gene Bank Acceso Z50178. Las secuencias de los dos oligonucleótidos se dan en seguida. SEO ID NO: 38: E13 XBAI5 5' -GTCCTctAGATCTTGAATGAAATC-3 ' (Xbal) SEQ ID NO: 39: E13 SACI3 5 ' -CTTTGAGCtcGTACAAGAAGCAG-3 ' (Sacl) El gen ERG13 se amplificó utilizando los dos oligonucleótidos E13 XBAI5, E13 SACI3 , y el ADN genómico a partir de la cepa ATCC 28383. El ADN resultante se clonó en pCR-Script en el sitio Sfrl para generar pSW72. Los oligonucleótidos utilizados para amplificar ERGI O contenían las secuencias correspondientes a las bases #4073a #4093, y el complemento inverso de #6542a #6565 de Gene Bank Acceso #U36624. Las secuencias de los dos oligonucleótidos se dan en seguida.

SEO ID NO: 40: E10 HIND5 5' -CTAAGCttTGCGCCCGTGAAG-3 ' (HindIII) SEO ID NO: 41: E10 XBAI3-2 5 ' -GTTCTAGAAGTTTTCAAAGCAGAG-3 ' ( Xba I ) El gen ERGIO se amplificó utilizando los dos oligonucleótidos E10 XBAI3-2, y el ADN genómico a partir de la cepa ATCC 28383. El ADN resultante se clonó en pCR-Script en el sitio Sfrl, para generar el pSW70. El plásmido pSW70 se digirió con Xbal y JíipdlII, y el fragmento resultante de 2482 pares de bases que contenía el gen ERGIO, se purificó. El plásmido pSW72-4 se digirió con Xbal y Sacl , y el fragmento resultante de 2,850 pares de bases que contenía el gen ERG13 se purificó. Los dos fragmentos de ADN purificados se ligaron entonces entre sí con YEp351 digerido con Sacl, HindIII (marcador seleccionable LEU2) , para generar el pSW7930. Este plásmido contiene los genes ERG13 y ERGIO, y permite la sobreexpresión de acetoacetil-CoA-tiolasa y de HMG-CoA-sintasa. La cepa SW23B#74 (que contiene ocho copias integradas del gen HMG2 cat, ver el Ejemplo 9) se transformó con pSW77-69 y pSW78-68, y los transformantes se seleccionaron bajo un medio SCE-ura. Las cepas resultantes son referidas como SW23B##74/pSW77-69 y SW23B#74/pSW78-68 , respectivamente. Estas cepas requieren de leucina agregada para el crecimiento, debido a la mutación LEU2. Para eliminar la necesidad de complementar estas cepas con leucina durante los experimentos de fermentación, se transformaron con un fragmento lineal de ADN que contenía un gen LEU2 funcional, y se aislaron los transformantes LEU+ . Estas cepas son referidas como SW23B#74L/pSW77-69 y SW23B#74L/pSW78-68 , respectivamente . SW23B#74 también se transformó con pSW79-30, y los transformantes se seleccionaron sobre un medio SCE-leu, SW23B#74/pSW79-30 requiere de uracilo, debido a que contiene una mutación en el gen ura3. Para eliminar la necesidad de suplementar estas cepas con uracilo durante los experimentos de fermentación, esta cepa se transformó con un fragmento lineal de ADN que contenía un gen IJRA3 funcional , y se aislaron los transformantes URA+ . Esta cepa es referida como SW23B#74U/pSW79-30. SW23B#74 también se transformó tanto con pSW78-68 como pSW79-30, y se aislaron los transformantes que eran capaces de crecer sobre un medio SCE-ura, -leu, indicando que los transformantes contenían ambos plásmidos. La cepa resultante es referida como SW23B#74/pSW78-68/pSW79-30. Se realizaron experimentos de fermentación con las cepas descritas anteriormente, para examinar el efecto de estas amplificaciones genéticas sobre la producción de farnesol. Las cepas se probaron en fermentadores de 1 litro utilizando el protocolo descrito en el Ejemplo l.H, y los datos de estos experimentos se presentan en la Tabla 24.

TABLA 24 Estos datos muestran que una cepa que sobreexprese HMG-CoA-reductasa, acumula el intermediario de la ruta isoprenoide mevalonato en el medio de cultivo. Debido a que no se observa la acumulación de mevalonato en las cepas con niveles normales de HMG-CoA-reductasa, esto demuestra que el flujo de carbono a través de la ruta isoprenoide se ha incrementado por la amplificación de HMG-CoA-reductasa, hasta el punto en donde otro paso subsecuente a la HMG-CoA-reductasa limita la conversión de los intermediarios de la ruta. Además, la sobreexpresión de las primeras tres enzimas en la ruta isoprenoide, es decir, acetoacetil-CoA-tiolasa, HMG-CoA-sintasa, y HMG-CoA-reductasa (codificadas por ERG13 , ERGIO, HMG2cat, respectivamente) condujo a una acumulación todavía más alta de mevalonato en el medio. Esto demuestra que el flujo de carbono hacia adentro de la ruta isoprenoide se ha incrementado adicionalmente mediante la amplificación de los primeros tres pasos, y enfatiza que una de las enzimas corriente abajo de la HMG-CoA-reductasa limita la conversión de los intermediarios de la ruta isoprenoide. Debido a que el mevalonato sirve como un precursor para farnesol y GG, las modificaciones descritas anteriormente se pueden utilizar para incrementar el flujo de carbono hacia la ruta isoprenoide, y si se puede metabolizar de una manera más eficiente el mevalonato, puede conducir a una mayor acumulación de farnesol y GG. Con respecto a éste último punto, se amplificaron las enzimas corriente abajo de la HMG-CoA-reductasa en una cepa que sobreexpresaba HMG-CoA-reductasa. Las enzimas amplificadas fueron HMG-CoA-reductasa, mevalonato-cinasa, fosfomevalonato-cinasa, difosfomevalonato-descarboxilasa, e IPP-isomexasa (codificadas pox HMG2cat, ERG12 , ERG8 , ERG19 , e IDI1, respectivamente) . Estas cepas acumularon menos mevalonato al compararse con las cepas que sobreexpresaban solamente HMG-CoA-reductasa, indicando que el mayor flujo a través de la ruta isoprenoide resultante de la sobreexpresión de HMG-CoA-reductasa, era acomodado por los niveles elevados de enzimas corriente abajo. Aunque no se observaron niveles de farnesol elevados en el "experimento descrito anteriormente, esto se puede deber al bajo nivel de mevalonato disponible para la conversión. Sin embargo, estos datos sugieren que la amplificación de una o más de las enzimas corriente abajo de la HMG-CoA-reductasa en una cepa con niveles amplificados de las primeras tres enzimas de la ruta, puede conducir a una mayor acumulación de farnesol y GG, debido a que se incrementa mucho el flujo para el mevalonato en estas cepas. Es posible que la sobreexpresión de uno o más genes corriente abajo de la HMG-CoA-reductasa en una cepa que sobreexprese acetoacetil-CoA-tiolasa, HMG-CoA-sintasa, y HMG-CoA-reductasa, conduzca a incrementos significativos en la acumulación de farnesol y GG.

EJEMPLO 11 Este ejemplo describe un experimento en donde se bloquea la sintasa de escualeno mediante ácido zaragózico en una cepa con una ruta intacta y funcional de esterol, incluyendo un gen ERG9 funcional, y se observa el efecto de este inhibidor de sintasa de escualeno sobre la acumulación de farnesol y GG. Los ácidos zaxagózicos son una familia de compuestos que actúan como potentes inhibidoxes de la sintasa de escualeno (Bergstrom, J.D., Dufresne, C, Bills, G.F., Nallin-Omstead, M. , y Byrne, K. 1995. Discovery, Byosynthesis, and Mechanism of Action of the Zaragozic Acids: Potent Inhibitors of Squalene Synthase. Ann. Rev. Microbiol. 49:607-639) . Son capaces de inhibir la biosíntesis de colesterol en mamíferos, y la biosíntesis de ergosterol en hongos . Debido a que el ergosterol es necesario para el crecimiento de las células fúngicas, los ácidos zaragózicos son potentes compuestos fungicidas . La cepa SWE23-E9 ( ura3 , sue; ver el Ejemplo l.G) se utilizó en este experimento, debido a que contenía la mutación sue que proporcionaba la recuperación de esteróles bajo condiciones aeróbicas. Esto permitió que la levadura creciera en un medio suplementado con ergosterol cuando se bloqueó la sintasa de escualeno mediante ácido zaragózico. Una cepa sin la mutación sue no sería capaz de recuperar esteróles, incluyendo ergosterol, del medio, y por consiguiente, no podría crecer en la presencia del ácido zaragozíco. SWE23-E9, que contiene un vector vacío (Yep352) o plásmidos que permiten la sobreexpresión de HMG-CoA-reductasa (pRH124-31) , GGPP-sintasa (pSW4A) , o tanto HMG-CoA-reductasa como GGPP-sintasa (pSW46-l) , se probó en matraces de agitación, cultivando primero las cepas en un medio SCE-ura durante 48 horas para seleccionar los plásmidos. Luego se inocularon muestras de estos cultivos en el medio YPDE, o en un medio YPDE conteniendo ácido zaragózico en 100 microgramos/mililitro. Los cultivos de YPDE (+/- ácido zaragózico) se incubaron a 30 °C durante 48 horas, y luego se analizaron para determinar el peso celular seco y la acumulación de farnesol . Los datos de este experimento se muestran en la Tabla 25. Todos los cultivos tratados con ácido zaragózico exhibieron una acumulación elevada de farnesol en relación con los cultivos no tratados. No se midió la acumulación de GG en este experimento.

TABLA 25 En un experimento separado, se probó el SWE23-E9 que contenía un vector vacío (Yep352) , o bien un plásmido que permitiera la sobreexpresión tanto de HMG-CoA-reductasa como de GGPP-sintasa (pSW46-l) en matraces de agitación, cultivando primero las cepas en un medio SCE-ura durante 48 horas para seleccionar los plásmidos . Luego se inocularon muestras de estos cultivos en un medio YPDE, o en un medio YPDE conteniendo ácido zaragózico en 100 miligramos/mililitro. Los cultivos de YPDE (+/- ácido zaragózico) se incubaron a 30 °C durante 72 horas, y luego se analizaron para determinar el peso celular seco y el GG. Los datos se presentan en la Tabla 26. El cultivo de SWE23- E9/pSW46-l tratado con ácido zaragózico, exhibió un nivel más alto de GG, comparándose con la misma cepa cultivada en ausencia de ácido zaragózico. Estos experimentos demuestran que las cepas sin mutaciones en la ruta biosintética de esterol, se pueden inducir para acumular farnesol, mediante el bloqueo de la ruta utilizando un inhibidor de sintasa de escualeno. La cantidad de farnesol ó GG acumulada por los cultivos tratados con ácido zaragózico fue mucho menor que la cantidad acumulada por las cepas con genes ERG9 completamente defectuosos, indicando que un bloqueo genético de la sintasa de escualeno es más efectivo que un bloqueo inducido por un inhibidor de sintasa de escualeno.

TABLA 26 Ejemplo 3.2 Se ha descrito una ruta alternativa que conduce hasta FPP en un número de bacterias y plantas, y es referida como una ruta que no es de mevalonato o Rohmer (Eisenreich, W., Schwarz, M., Cartayrade, A., Arigoni, D., Zenk, M.H., y Bacher, A., 1998. The Deoxyxylulose Phosphate Pathway of Terpenoid Biosynthesis in Plants and Microorganisms. Chem. Biol. 5:R221-233. Paseshnichenko, V.A. , 1998. A New Alternative Non-Mevalonate Pathway for isoprenoid Biosynthesis in Eubacteria and Plants. Biochemistry (Mosc) 63:139-148) . Algunas de las enzimas de la ruta que no es de mevalonato y sus genes se han identificado y estudiado en E. coli, y éstas incluyen la desoxixilulosa-5-fosfato/sintasa, desoxixilulosa-5-fosfato/reductasa, IPP-isomerasa, y FPP-sintasa, codificadas por los genes dxr, dxs, idi , e ispA, respectivamente . Con el objeto de construir cepas de E. coli que acumulen niveles elevados de farnesol, se construyeron plásmidos para la sobreexpresión en E. coli de los genes mencionados anteriormente. En algunos casos, se incluyeron genes adicionales adyacentes a la ruta isoprenoide conocida en el ADN clonado . El gen idi para IPP-isomerasa, se amplificó con reacción en cadena de la polimerasa, utilizando los dos oligonucleótidos mencionados más adelante, y el ADN genómico aislado a partir de E. coli cepa W3110. Los oligonucleótidos utilizados para amplificar el gen idi contenían secuencias correspondientes a las bases #42309 a #42335, y el complemento inverso de #43699 a #43726 de Gene Bank Acceso #U28375. Las letras minúsculas se utilizan para las bases que se alteraron con el fin de crear sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción, que se indican entre paréntesis en seguida de la secuencia del oligonucleótido. Se utilizó un sitio EcoRI natural en VE145.5. SEO ID NO: 42: VE145-5 5'-GGGATTCGAATTCTGTCGCGCTGTAAC-3 ' (BcoRI) SEO ID NQ:43: VE146-3 5' -TGggATCcGTAACGGCTTTAGCGAGCTG-3' (Ba Hl) El producto de reacción en cadena de la polimerasa idi se digirió con EcoRI y BamHl, y se ligó con pUC19 digerido con EcoRI , Ba Hl. El clon resultante es referido como pHS-0182. El gen dxr se amplificó con reacción en cadena de la polimerasa utilizando los dos oligonucleótidos mencionados más adelante, y el ADN genómico aislado a partir de E. coli cepa W3110. Los oligonucleótidos utilizados para amplificar una región del ADN que incluía los genes frr, dxr, e yaeS, contenían secuencias correspondientes a las bases #2131 a #2150, y el complemento inverso de #5297 a #5315 de Gene Bank Acceso #D83536. SEQ ID NO: 44: DXR17.SN GATTCCGCGTAAGgATCcCG (BamHl) SEQ ID NQ:45: DXR3179.ASN CCAGCATctAGACCACCAG (Xbal) El producto de reacción en cadena de la polimerasa resultante se digirió con BamHl y Xbal , y se ligó en pHS-0182 digerido con BamHl, Xbal , para generar el pHS-0182R. Los genes ispA y dxs parecen ser parte de un operón que posiblemente incluye otros dos genes referidos como xseB y yajO . Se utilizó reacción en cadena de la polimerasa para amplificar una región del ADN que incluía xseB, ispA, dxs, e yajO, utilizando los oligonucleótidos mencionados más adelante, y el ADN genómico aislado a partir de E. coli cepa W3110. Los oligonucleótidos contenían secuencias correspondientes a las bases #4157 a #4183, y el complemento inverso de las bases #8938 a #48956 de Gene Bank Acceso #AE000148. SEQ ID NO: 6: DXS.5619P 5 ' -gactgcagCTGGCCGCTGGGTATTCTGTCGTAGTT-3 ' (PstI ) SEQ ID NO: 47: DXS.82OX 5 ' -gatctagaTCACGCGTACGCAGAAGGTTTTGC-3 ' (Xbal ) El producto de reacción en cadena de la polimerasa resultante se digirió con Xbal y PstI , y se ligó con pUC19 digerido con Xbal, PstI para generar pHS-dxs. El fragmento de ADN que contiene el gen dxs se cortará a partir de pHS-dxs utilizando Xbal y PstI, y se ligará en pHS-0182R digerido con Xbal , PstI para generar un plásmido que contenga dxs, dxr, ispA, e idi . El plásmido resultante se transformará en E. coli, y se probará una cepa transformada que contenga el plásmido para la producción de farnesol en experimentos de matraz de agitación y de fermentación. Con el objeto de construir cepas de E. coli que acumulen niveles elevados de GG, se construyó un plásmido para la sobreexpresión en E. coli de GGPP-sintasa a partir de Erwinia herbicola . El gen crtE que codificaba para GGPP-sintasa, se amplificó mediante reacción en cadena de la polimerasa, utilizando el ADN genómico aislado a partir de Erwinia herbicola cepa EholO, y los dos siguientes oligonucleótidos. Los oligonucleótidos contenían las secuencias correspondientes a las bases #3513 a #3531, y el complemento inverso de las bases #4459 a #4481 de Gene Bank Acceso #M87280. SEO ID NO: 48: EholOE Up 5' -gaattcCAATTCAGCGGGTAACCTT-3' (EcoRI) SEQ ID NQ;49; EholOE Lo 5 ' -aagcttTGCTTGAACCCAAAAGGGCGGTA-3 ' (HindlII) El producto de reacción en cadena de la polimerasa resultante se digirió con EcoRI y HindIII , y se ligó en pET24d(+) (Novagen) , de tal manera que se controlara la expresión del gen ctrJ? mediante el promotor T7. El plásmido resultante es referido como pKL19-63. Este plásmido se puede transformar en cepas de E. coli tales como BL21(DE3) (disponible en Novagen) , que contiene un gen inducible por IPTG que codifica para polimerasa T7. Esto permite la inducción por IPTG del gen crtE en esta cepa. Se puede cortar la fusión genética de promotor T7/gen crtJ? a partir de pKL19-63 utilizando Bglll y HindIII , y se puede ligar en pACYC184 digerido con BamHl, HindlII (Acceso #X06403), para construir un plásmido que se apoya en la resistencia al cloranfenicol para la selección. Este plásmido contiene el origen de réplica pl5A, y sería compatible con plásmidos que contengan el origen de réplica ColEl, tales como los clones que llevan los genes de la ruta isoprenoide de E. coli descritos anteriormente. Estos últimos plásmidos confieren resistencia a la ampicilina, y de este modo, se pueden obtener transformantes de E. coli que lleven tanto el plásmido crtE como el plásmido que contiene los genes dxs, dxr, idi , e ispA, mediante la transformación de E. coli con ambos plásmidos, y la selección de resistencia a cloranfenicol y ampicilina. Por consiguiente, se obtendrán cepas de E. coli BL21(DE3) que contengan plásmidos para la sobreexpresión de desoxixilulosa-5-fosfato/sintasa, desoxixilulosa-5-fosfato/reductoisomerasa, IPP-isomerasa, FPP-sintasa, y GGPP-sintasa. Estas cepas se probarán para determinar la producción de GG en experimentos de matraz de agitación y de fermentació .

Ejemplo 13 El siguiente ejemplo describe la construcción de cepas de Saccharomyces cerevisiae que se diseñan para producir niveles elevados de farnesol y GG, mediante la expresión de enzimas correspondientes a las enzimas de la ruta que no es de mevalonato. La biosíntesis de IPP ocurre en muchas bacterias y plantas empezando a partir de piruvato y gliceraldehído-3 , y procediendo a través de una serie de pasos enzimáticos conocidos como la ruta que no es de mevalonato, e incluye las enzimas desoxixilulosa-5-fosfato/sintasa y desoxixilulosa-5-fosfato/reductoisomerasa. El compuesto resultante de estos dos pasos enzimáticos es 4-fosfato de 2-C-metil-D-eritritol (también conocido como MEP) , el cual se metaboliza adicionalmente mediante enzimas desconocidas, para producir IPP. Se construyen plásmidos que expresen los genes dxs y dxr de E. coli en levadura, fusionando las regiones codificantes de estos genes con los elementos promotores que permitan la expresión en levadura. Los genes dxs y dxr se amplifican mediante reacción en cadena de la polimerasa, con oligonucleótidos que incluyan sitios de restricción para permitir la clonación en vectores de expresión de levadura que contengan promotores, tales como el promotor ADH1 , el promotor PGK, o el promotor GPD. Luego se combinan las dos fusiones genéticas en un solo plásmido mediante la subclonación de una fusión genética en el otro plásmido. Luego se transforma el plásmido resultante que contiene ambos genes, en el mutante erg9 de levadura. La cepa resultante es capaz de sintetizar MEP, que además se puede metabolizar hasta IPP mediante enzimas endógenas capaces de realizar las reacciones deseadas hasta IPP. Esta capacidad puede conducir a una mayor acumulación de IPP, lo cual puede hacer que las células acumulen niveles elevados de farnesol, a través de la acción de las enzimas endógenas IPP-isomerasa y FPP-sintasa. Si se hace esto en una cepa que también sobreexprese GGPP-sintasa, entonces se pueden acumular niveles elevados de GG en estas cepas .

Ejemplo 1 Este ejemplo describe la construcción de una cepa de Saccharomyces cerevisiae, que sobreexpresa un gen ERG20 mutado para una enzima de FPP-sintasa que exhibe una especificidad alterada del producto. A diferencia de las cepas que sobreexpresan la FPP-sintasa de tipo silvestre, las cepas que expresan la FPP-sintasa mutada acumularon más GG que farnesol . La comparación de las secuencias de aminoácidos de FPP-sintasas a partir de una variedad de organismos, reveló varios dominios altamente conservados, incluyendo dos dominios ricos en aspartato, que son esenciales para la actividad catalítica. Los investigadores han reportado que las mutaciones que afectan al aminoácido localizado en la quinta posición antes del primer dominio rico en aspartato, pueden alterar la especificidad del producto de la enzima, de tal manera que la enzima cataliza fácilmente la formación de GGPP, así como de FPP. Esto se puede demostrar para FPP-sintasas tanto como de aves como Bacillus stearothermophillus (Tarshis, L.C., Proteau, P. J. , Kellogg, B.A., Sacchettini, J.C., Poulter, C.D. 1996. Regulation of Product Chain Length by Isoprenyl Diphosphate Synthases . Proc. Natl. Acad. Sci.

EUA 93:15018-15023; Ohnuma, S., Narita, K. , Nakazawa, T., Ishida, C, Takeuchi, Y., Ohto, C, y Nichino, T. 1996. A Role of the Amino Acid Residue Located on the Fifth Position Before the First Aspartate-rich Motif of Farnesyl Diphosphate Synthase on Determination of the Final Product. J. Biol. Chem. 271:30748-30754; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,766,911) . En el caso de la enzima de Bacillus, el aminoácido en la quinta posición antes del primer dominio rico en aspartato, se cambió desde tirosina hasta serina. La enzima de aves contiene una fenilalanina en esta posición. Se piensa que los aminoácidos aromáticos en esa posición bloquean la extensión de la cadena de isoprenilo mas allá de 15 átomos de carbono, y que la restricción puede ser aliviada mediante el reemplazo de la fenilalanina con un aminoácido menos voluminoso, tal como serina. Como en las FPP-sintasas de Bacillus mencionadas anteriormente, la FPP-sintasa a partir de Saccharomyces cerevisiae tiene una tirosina en la quinta posición antes del primer dominio rico en aspartato. Se utilizó mutagénesis dirigida al sitio para alterar la secuencia del gen ERG20, para codificar para una serina en lugar de una tirosina en esa posición. El método utilizado para introducir la mutación se apoyó en amplificación con reacción en cadena de la polimerasa del plásmido pJMB19-31 entero, utilizando oligonucleótidos mutagénicos que introdujeron la mutación deseada, y se describe en el folleto de instrucciones para el Estuche de Mutagénesis Dirigida al Sitio QuikChange (Stratagene) . Los oligonucleótidos contenían las secuencias correspondientes a las bases #1063 a #1097, y el complemento inverso de las bases #1063 a #1097 de Gene Bank Acceso #J05091. Las secuencias de los oligonucleótidos se dan más adelante, indicándose los cambios con letras minúsculas. Se hizo una alteración de A a T en la posición #1084 para cambiar el aminoácido codificado desde tirosina hasta serina.

También, se hizo una alteración de T a C en la posición #1074 para crear un nuevo sitio PstI , que permitió una identificación rápida del gen mutante. Esta última mutación fue silenciosa, porque no cambió el aminoácido codificado.

SEQ ID NO; 50; Y95S-SN 5 ' -GCATTGAGTTGcTGCAGGCTTcCTTCTTGGTCGCC-3 ' SEQ ID NQ;51; Y95S-ASN 5 ' -GGCGACCAAGAAGgAAGCCTGCAgCAACTCAATGC-3 ' Los oligonucleótidos se utilizaron para amplificar pJMB19-31, y el producto de reacción en cadena de la polimerasa resultante se ligó consigo mismo para reformar el plásmido circular, excepto que ahora el gen ERG20 contenía la mutación deseada. El plásmido resultante es referido como pSH31-Y95S, y este plásmido se transformó en la cepa mutante de erg9 SW23-DE91, para formar SWE23-E9l/pSH31. Y95S . Se realizaron experimentos de matraz de agitación para comparar la producción de farnesol y GG por parte de las cepas que sobreexpresaban el gen ERG20 de tipo silvestre y el gen ERG20 mutado. Se cultivaron las cepas durante la noche a SCE-ura, y éste se utilizó para inocular los matraces que contenían el medio YPDE. Estos cultivos se hicieron crecer a 30 °C durante 72 horas, y luego se cosecharon para el análisis del peso celular seco e isoprenoide. Los datos de este experimento se presentan en la Tabla 27.

TABLA 27 Estos datos muestran que la proporción de farnesol : GG se altera dramáticamente mediante la sobreexpresión del mutante Tyr a Ser del gen ERG20 en una cepa mutante erg9. La cepa que sobreexpresaba el gen ERG20 mutante exhibió proporcionalmente más GG que la cepa que sobreexpresaba el gen ERG20 de tipo silvestre. En adición, la cantidad total de GG producida por la cepa que sobreexpresaba ERG20 mutante, fue más alta, mientras que la cantidad total de farnesol fue más baja, al compararse con la cepa que sobreexpresaba el gen ERG20 de tipo silvestre. La reducción en el nivel de farnesol no se reflejó completamente en el grupo de GG, sugiriendo que algo del FPP se puede convertir a otros compuestos además de GG. De una manera alternativa, es posible que la inhibición de retroalimentación tenga un papel en la regulación de la cantidad de GG acumulado por estas cepas . La descripción anterior de la invención se ha presentado para propósitos de ilustración y descripción. Además, la descripción no pretende limitar la invención a la forma dada a conocer en la presente. En consecuencia, las variaciones y modificaciones conmensuradas con las enseñanzas anteriores, y la experiencia o conocimiento de la técnica pertinente, están dentro del alcance de la presente invención. Además, se pretende que las modalidades descritas anteriormente en la presente expliquen los mejores modos conocidos para practicar la invención, y hagan posible que otros expertos en este campo utilicen la invención en estas u otras modalidades, y con las diferentes modificaciones requeridas por las aplicaciones o usos particulares de la invención. Se pretende que las reivindicaciones adjuntas se interpreten para incluir las modalidades alternativas hasta el grado permitido por la técnica anterior.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Millism James R. Saucy, Gabriel G Maurina-Brunker, Julie McMullin, Thomas W. <120> MÉTODO DE PRODUCCIÓN DE VITAMINA <130> 3161-2! <140> todavía no asignado <141> 1999-07-06 <150> 60/091, 983 <151> 1998-07-06 <160> 51 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <221> características_varias <222> (1) .. (23) <223> CEBADOR <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial : CEBADOR <400> 1 ctcagtacgc tggtacccgt cae 23 <210> 2 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <221> características_varias <222> (1) .. (27) <223> CEBADOR <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial : CEBADOR <400> 2 gatggatccc aatatgtgta gctcagg 27 <210> 3 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <221> características_varias <222> (1) .. 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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir a-tocoferol o esteres de a-tocoferilo, el cual comprende: (a) producir biológicamente un compuesto seleccionado a partir del grupo que consiste en farnesol y geranilgeraniol; y (b) convertir químicamente este compuesto en a-tocoferol o un éster de a-tocoferilo.

2. El método de la reivindicación, en donde este compuesto es geranilgeraniol que tiene primera, segunda, tercera, y cuarta fracciones de olefina, y en donde el paso de convertir químicamente comprende: (a) reducir cuando menos una de las segunda, tercera, y cuarta fracciones de olefina del geranilgeraniol, para formar un alcohol alílico; y (b) formar a-tocoferol o un éster de a-tocoferilo a partir de este alcohol alílico y una hidroquinona.

3. El método de la reivindicación 2, en donde el paso de reducir (a) comprende: agregar un grupo protector al geranilgeraniol para proteger a la primera fracción de olefina del geranilgeraniol de la reducción; y reducir cuando menos una de las segunda, tercera, y cuarta fracciones de olefina del geranilgeraniol protegido; y remover el grupo protector del geranilgeraniol protegido reducido, para proporcionar el alcohol alílico.

4. El método de la reivindicación 3 , en donde el grupo pxotectox es un gxupo protector de hidroxilo.

5. El método de la reivindicación 4, en donde el grupo protector de hidroxilo es un éster.

6. El método de la reivindicación 5, en donde el éster se selecciona a partir del grupo que consiste en isobutirato y pivaloato.

7. El método de la reivindicación 2, en donde el paso de reducir comprende hidrogenación.

8. El método de la reivindicación 2, en donde el alcohol alílico comprende fitol.

9. El método de la reivindicación 2, en donde la formación del _ a-tocoferol o de un éster de a-tocoferilo, comprende poner en contacto el alcohol alílico con un ácido en la presencia de la hidroquinona.

10. El método de la reivindicación 2, en donde la hidroquinona es una trimetilhidroquinona.

11. El método de la reivindicación 10, en donde la trimetilhidroquinona es 2, 3 , 5-trimetilhidroquinona.

12. El método de la reivindicación 1, en donde el compuesto es farnesol, y en donde el paso de convertir químicamente comprende : (a) convertir el farnesol a un primer intermediario que comprenda suficientes átomos de carbono para formar un grupo sustituyente de trimetiltridecilo de vitamina E, cuando se haga reaccionar este intermediario con una hidroquinona para formar vitamina E; y (b) hacer reaccionar el compuesto intermediario con una hidroquinona para formar vitamina E.

13. El método de la reivindicación 12, en donde el paso de convertir comprende: oxidar el farnesol hasta farnesal ; y formar una metilcetona a partir de este farnesal .

14. El método de la reivindicación 13, el cual comprende además : reducir las fracciones de olefina de la metilcetona, para formar una alquilmetilcetona; y formar un alcohol alílico a partir de la alquilmetilcetona .

15. El método de la reivindicación 12 , en donde el intermediario comprende isofitol .

16. El método de la reivindicación 12, en donde la hidroquinona es una trimetilhidroquinona.

17. El método de la reivindicación 16, en donde la trimetilhidroquinona es 2, 3 , 5-trimetilhidroquinona .

18. El método de la reivindicación 1, en donde el compuesto es farnesol, y en donde el paso de convertir químicamente comprende: (a) oxidar el farnesol hasta farnesal. (b) formar una metilcetona a partir del farnesal; (c) reducir las fracciones de olefina en la metilcetona, para formar una alquilmetilcetona; (d) formar un alcohol alílico a partir de la alquilmetilcetona, en donde este alcohol alílico comprenda un número suficiente de átomos de carbono para formar cuando menos un grupo sustituyente de trimetiltridecilo de vitamina E, cuando se forme vitamina E a partir de este alcohol alílico y una hidroquinona correspondiente; y (e) formar vitamina E a partir de este compuesto y una hidroquinona.

19. El método de la reivindicación 18, en donde el alcohol alílico comprende isofitol.

20. El método de la reivindicación 18, en donde la hidroquinona es una trimetilhidroquinona.

21. El método de la reivindicación 20, en donde la trimetilhidroquinona es 2, 3 , 5-trimetilhidroquinona.

22. El método de la reivindicación 1, en donde este compuesto es farnesol.

23. El método de la reivindicación 1, en donde este compuesto es geranilgeraniol .

24. Un método para producir a-tocoferol o esteres de a-tocoferilo, el cual comprende: (a) cultivar un microorganismo en un medio de fermentación para producir un producto seleccionado a partir del grupo que consiste en fosfato de farnesilo, farnesol, fosfato de geranilgeranilo, y geranilgeraniol, en donde se reduce la acción de la sintasa de escualeno de este microorganismo; (b) recuperar el producto; y (c) convertir químicamente el producto en a-tocoferol o un éster de a-tocoferilo.

25. El método de la reivindicación 24, en donde el medio de fermentación comprende un inhibidor de sintasa de escualeno.

26. El método de la reivindicación 24, en el microorganismo se modifica genéticamente para reducir la acción de la sintasa de escualeno.

27. El método de la reivindicación 26, en donde el microorganismo se modifica además genéticamente para incrementar la acción de la HMG-CoA-reductasa.

28. El método de la reivindicación 27, en donde la acción de la HMG-CoA-reductasa se incrementa mediante la sobreexpresión de HMG-CoA-reductasa o su dominio catalítico en el microorganismo.

29. El método de la reivindicación 28, en donde este microorganismo se modifica además genéticamente para incrementar la acción de una proteína seleccionada a partir del grupo que consiste en acetoacetil-CoA-tiolasa, HMG-CoA-sintasa, mevalonato-cinasa, fosfomevalonato-cinasa, fosfomevalonato-descarboxilasa, isopentenil-pirofosfato-isomerasa, farnesil-pirofosfato-sintasa, D-1-desoxixilulosa-5-fosfato-sintasa, y l-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato-reductoisomerasa.

30. El método de la reivindicación 29, en donde el microorganismo se ha modificado genéticamente para incrementar la acción de la farnesil-pirofosfato-sintasa.

31. El método de la reivindicación 30, en donde el microorganismo se ha modificado genéticamente para sobreexpresar farnesil-pirofosfato-sintasa.

32. El método de la reivindicación 24, en donde el microorganismo es un mutante de erg? .

33. El método de la reivindicación 32, en donde el microorganismo comprende un alelo de supresión/inserción erg9?: :HIS3 .

34. El método de la reivindicación 24, en donde el paso de recuperar comprende recuperar el producto a partir de este microorganismo.

35. El método de la reivindicación 24, en donde el producto se secreta hacia el medio de fermentación mediante este microorganismo, y en donde el paso de recuperar comprende la purificación del producto a partir de este medio de fermentación.

36. El método de la reivindicación 24, en donde el microorganismo es un hongo.

37. El método de la reivindicación 36, en donde este hongo se ha modificado genéticamente para expresar cuando menos una porción de las enzimas en la ruta independiente de mevalonato.

38. El método de la reivindicación 37, en donde este hongo se ha modificado genéticamente para expresar una enzima seleccionada a partir del grupo que consiste en D-l-desoxixilulosa-5-fosfato/sintasa, y l-desoxi-D-xilulosa/5- osfato/reductoisomerasa.

39. El método de la reivindicación 36, en donde este hongo es una levadura, y la levadura se bloquea en la ruta de ergosterol, y se modifica genéticamente para recuperar los esteróles exógenos bajo condiciones aeróbicas.

40. El método de la reivindicación 34, en donde el microorganismo es una bacteria.

41. El método de la reivindicación 40, en donde esta bacteria se ha modificado genéticamente para expresar cuando menos una porción de las enzimas en la ruta de mevalonato .

42. El método de la reivindicación 41, en donde esta bacteria se ha modificado genéticamente para expresar una enzima seleccionada a partir del grupo que consiste en acetoacetil-CoA-tiolasa, HMG-CoA-sintasa, HMG-CoA-reductasa, mevalonato-cinasa, fosfomevalonato-cinasa, y fosfomevalonato-descarboxilasa .

43. El método de la reivindicación 24, en donde este microorganismo es una microalga.

44. El método de a reivindicación 43, en donde esta microalga se selecciona a partir del grupo que consiste en Chlorella y Prototheca.

45. El método de la reivindicación 24, en donde este microorganismo se ha modificado genéticamente para incrementar la acción de fosfatasa.

46. El método de la reivindicación 29, en donde este microorganismo se ha modificado genéticamente para incrementar la acción de geranilgeraniol-pirofosfato-sintasa.

47. El método de la reivindicación 46, en donde el microorganismo se ha modificado genéticamente para sobreexpresar geranilgeranil-pirofosfato-sintasa.

48. Un método para producir a-tocoferol o esteres de a-tocoferilo, el cual comprende: (a) producir biológicamente un primer compuesto seleccionado a partir del grupo que consiste en geranilgeraniol y pirofosfato de geranilgeranilo; y ib) poner en contacto el primer compuesto con una geranilgeranil-reductasa, para formar un segundo compuesto seleccionado a partir del grupo que consiste en fitol y difosfato de fitilo; y (c) convertir químicamente el segundo compuesto en a-tocoferol o un éster de a-tocoferilo.

49. Un método como se reclama en la reivindicación 48, en donde el paso de poner en contacto se conduce en vivo, utilizando un microorganismo que tenga actividad de geranilgeranil-reductasa.

50. Un método como se reclama en la reivindicación 48, en donde el paso de poner en contacto se conduce en un proceso de biotransformación.

51. Un método como se reclama en la reivindicación 48, en donde el primer compuesto es geranilgeraniol, y el segundo compuesto es fitol .

52. Un método como se reclama en la reivindicación 48, en donde el primer compuesto es pirofosfato de geranilgeranilo, y el segundo compuesto es difosfato de fitilo.

53. Un método como se reclama en la reivindicación 48, en donde el paso de convertir químicamente comprende hacer reaccionar el segundo compuesto o un derivado del mismo, con una hidroquinona, para formar a-tocoferol o un éster de a-tocoferilo.

54. Un método como se reclama en la reivindicación 48, en donde el paso de poner en contacto comprende purificar el primer compuesto, y transformar este primer compuesto con geranilgeranil-reductasa aislada, o microorganismos que tengan una actividad de geranilgeranil-reductasa.

55. El método de la reivindicación 54, en donde el microorganismo se modifica además genéticamente para incrementar la acción de la geranilgeranil-reductasa.

56. El método de la reivindicación 55, en donde la acción de la geranilgeranil-reductasa se incrementa mediante la sobreexpresión de la geranilgeranil-reductasa.

57. Un método para producir un compuesto seleccionado a partir del grupo que consiste en farnesol y geranilgeraniol, el cual comprende: (a) cultivar un microorganismo en un medio de fermentación que comprenda un compuesto seleccionado a partir del grupo que consista en isoprenol y prenol, para producir un producto seleccionado a partir del grupo que consista en fosfato de farnesilo, farnesol, fosfato de geranilgeranilo, y geranilgeraniol; y (b) recuperar el producto.

58. El método de la reivindicación 57, en donde el microorganismo se modifica además genéticamente para incrementar la acción de la dimetilalil-transferasa.

59. El método de la reivindicación 58, en donde la acción de la dimetilalil-transferasa se incrementa mediante la sobreexpresión de dimetilalil-transferasa en el microorganismo.

60. El método de la reivindicación 59, en donde el microorganismo se ha modificado genéticamente para incrementar la acción de la farnesil-pirofosfato-sintasa .

61. El método de la reivindicación 60, en donde el microorganismo se ha modificado genéticamente para sobreexpresar la farnesil-pirofosfato-sintasa.

62. El método de la reivindicación 59, en donde el microorganismo se ha modificado genéticamente para incrementar la acción de la geranilgeranil-pirofosfato-sintasa.

63. El método de la reivindicación 60, en donde el microorganismo se ha modificado genéticamente para sobreexpresar la geranilgeranil-pirofosfato-sintasa.

64. El método de la reivindicación 57, en donde el microorganismo se ha modificado genéticamente para incrementar la acción de una enzima seleccionada a partir del grupo que consiste en isoprenol-cinasa y prenol-cinasa .

65. El método de la reivindicación 57, en donde el microorganismo se ha modificado genéticamente para sobreexpresar una enzima seleccionada a partir del grupo que consiste en isoprenol-cinasa y prenol-cinasa.

66. El método de la reivindicación 57, en donde este microorganismo es un mutante de erg9.

67. Un método para producir farnesol, el cual comprende : (a) cultivar un microorganismo en un medio de fermentación para producir un producto seleccionado a partir del grupo que consiste en fosfato de farnesilo y farnesol, en donde se reduce la acción de la sintasa de escualeno de este microorganismo; y (b) recuperar el producto.

68. El método de la reivindicación 67, en donde el medio de fermentación comprende un inhibidor de sintasa de escualeno.

69. El método de la reivindicación 67, en donde este microorganismo se modifica genéticamente para reducir la acción de la sintasa de escualeno.

70. El método de la reivindicación 69, en donde este microorganismo se modifica además genéticamente para incrementar la acción de HMG-CoA-reductasa.

71. El método de la reivindicación 70, en donde se incrementa la acción de HMG-CoA-reductasa mediante la sobreexpresión de HMG-CoA-reductasa o su dominio catalítico en el microorganismo.

72. El método de la reivindicación 70, en donde este microorganismo se modifica además genéticamente para incrementar la acción de una proteína seleccionada a partir del grupo que consiste en acetoacetil-CoA-tiolasa, HMG-CoA-sintasa, mevalonato-cinasa, fosfomevalonato-cinasa, fosfomevalonato-descarboxilasa, isopentenil-pirofosfato-isomerasa, farnesil-pirofosfato-sintasa, D-l-desoxixilulosa/5-fosfato/sintasa, y l-desoxi-JD-xilulosa/5-fosfato/reductoisomerasa.

73. El método de la reivindicación 72 , en donde el microorganismo se ha modificado genéticamente para incrementar la acción de la farnesil-pirofosfato-sintasa.

74. El método de la reivindicación 73, en donde el microorganismo se ha modificado genéticamente para sobreexpresar la farnesil-pirofosfato-sintasa.

75. El método de la reivindicación 67, en donde el microorganismo es un mutante de erg9.

76. El método de la reivindicación 75, en donde este microorganismo comprende un alelo de supresión/inserción de erg9?: :HIS3 .

77. El método de la reivindicación 67, en donde el paso de recuperar comprende recuperar el producto a partir de este microorganismo .

78. El método de la reivindicación 67, en donde el producto se secreta hacia el medio de fermentación mediante este microorganismo, y en donde el paso de recuperar comprende la purificación del producto a partir de este medio de fermentación.

79. El método de la reivindicación 67, en donde el producto es fosfato de farnesilo intracelular y farnesol, y el paso de recuperar comprende aislar este fosfato de farnesilo y farnesol a partir de este microorganismo.

80. El método de la reivindicación 67, en donde el producto es fosfato de farnesilo intracelular, y el paso de recuperar comprende además desfosforilar este fosfato de farnesilo para producir farnesol .

81. El método de la reivindicación 67, en donde el microorganismo es un hongo.

82. El método de la reivindicación 81, en donde este hongo se ha modificado genéticamente para expresar cuando menos una porción de las enzimas en la ruta independiente del mevalonato.

83. El método de la reivindicación 82, en donde este hongo se ha modificado genéticamente para expresar una enzima seleccionada a partir del grupo que consiste en D-l-desoxixilulosa/5-fosfato/sintasa, y . l-desoxi-D-xilulosa/5-fosfato/reductoisomerasa .

84. El método de la reivindicación 81, en donde este hongo es una levadura, y la levadura se bloquea en la ruta de ergosterol, y se modifica genéticamente para recuperar los esteróles exógenos bajo condiciones aeróbicas.

85. El método de la reivindicación 67, en donde el microorganismo es una bacteria.

86. El método de la reivindicación 85, en donde esta bacteria se ha modificado genéticamente para expresar cuando menos una porción de las enzimas en la ruta de mevalonato .

87. El método de la reivindicación 86, en donde esta bacteria se ha modificado genéticamente para expresar una enzima seleccionada a partir del grupo que consiste en acetoacetil-CoA-tiolasa, HMG-CoA-sintasa, HMG-CoA-reductasa, mevalonato-cinasa, fosfomevalonato-cinasa, y fosfomevalonato-descarboxilasa .

88. El método de la reivindicación 67, en donde este microorganismo es una microalga.

89. El método de a reivindicación 88, en donde esta microalga se selecciona a partir del grupo que consiste en Chlorella y Prototheca .

90. Un microorganismo para producir farnesol mediante un proceso biosintético, teniendo este microorganismo una modificación genética para reducir la acción de la sintasa de escualeno en este microorganismo, y una modificación genética para incrementar la acción de una proteína seleccionada a partir del grupo que consiste en acetoacetil-CoA-tiolasa, HMG-CoA-sintasa, HMG-CoA-reductasa, mevalonato-cinasa, fosfomevalonato-cinasa, fosfomevalonato-descarboxilasa, isopentenil -pirofosfato-isomerasa, farnesil-pirofosfato-sintasa, D-l-desoxixilulosa/5-fosfato/sintasa, y l-desoxí-D-xilulosa/5-fosfato/reductoisomerasa .

91. El microorganismo de la reivindicación 90, en donde la modificación genética para incrementar la acción de una proteína, comprende integrar múltiples copias de los genes para esta proteína en el genoma del microorganismo.

92. El microorganismo de la reivindicación 91, en donde la modificación genética para incrementar la acción de una proteína, incrementa la expresión de un gen que codifique esta proteína.

93. El microorganismo de la reivindicación 92, en donde este microorganismo genéticamente modificado es un mutante de erg9.

94. Un método para producir geranilgeraniol, el cual comprende : (a) cultivar un microorganismo en un medio de fermentación, para producir un producto seleccionado a partir del grupo que consiste en fosfato de geranilgeranilo y geranilgeraniol, en donde se reduce la acción de la sintasa de escualeno de este microorganismo; y (b) recuperar el producto.

95. El método de la reivindicación 94, en donde el medio de fermentación comprende un inhibidor de sintasa de escualeno.

96. El método de la reivindicación 94, en donde este microorganismo se modifica genéticamente para reducir la acción de la sintasa de escualeno.

97. El método de la reivindicación 96, en donde este microorganismo se modifica además genéticamente para incrementar la acción de HMG-CoA-reductasa.

98. El método de la reivindicación 97, en donde la acción de la HMG-CoA-reductasa se incrementa mediante la sobreexpresión de HMG-CoA-reductasa, o su dominio catalítico, en el microorganismo.

99. El método de la reivindicación 97, en donde este microorganismo se modifica además genéticamente para incrementar la acción de una proteína seleccionada a partir del grupo que consiste en acetoacetil-CoA-tiolasa, HMG-CoA-sintasa, mevalonato-cinasa, fosfomevalonato-cinasa, fosfomevalonato-descarboxilasa, isopentenil-pirofosfato-isomerasa, farnesil-pirofosfato-sintasa, D-l-desoxixilulosa/5-fosfato/sintasa, y l-desoxi-D-xilulosa/5-fosfato/reductoisomerasa .

100. El método de la reivindicación 99, en donde el microorganismo se ha modificado genéticamente para incrementar la acción de la geranilgeranil-pirofosfato-sintasa.

101. El método de la reivindicación 100, en donde el microorganismo se ha modificado genéticamente para sobreexpresar la geranilgeranil-pirofosfato-sintasa.

102. El método de la reivindicación 94, en donde este microorganismo es un mutante de erg9.

103. El método de la reivindicación 102, en donde este microorganismo comprende un alelo de supresión/inserción de erg9?. - . • HIS3.

104. El método de la reivindicación 94, en donde el paso de recuperar comprende recuperar el producto a partir de este microorganismo.

105. El método de la reivindicación 94, en donde el producto se secreta hacia el medio de fermentación mediante este microorganismo, y en donde el paso de recuperar comprende la purificación del producto a partir de este medio de fermentación.

106. El método de la reivindicación 94, en donde este producto es fosfato de geranilgeranilo intracelular y geranilgeraniol intracelular y extracelular, y el paso de recuperar comprende aislar el fosfato de geranilgeranilo y el geranilgeraniol a partir de este microorganismo, y aislar el geranilgeraniol a partir del medio de fermentación.

107. El método de la reivindicación 94, en donde el producto es fosfato de geranilgeranilo intracelular, y el paso de recuperar comprende además desfosforilar este fosfato de geranilgeranilo, para producir geranilgeraniol.

108. El método de la reivindicación 94, en donde el microorganismo es un hongo.

109. El método de la reivindicación 108, en donde este hongo se ha modificado genéticamente para expresar cuando menos una porción de las enzimas en la ruta independiente del mevalonato.

110. El método de la reivindicación 109, en donde este hongo se ha modificado genéticamente para expresar una enzima seleccionada a partir del grupo que consiste en D-1-desoxixilulosa/5-fosfato/sintasa, y l-desoxi-D-xilulosa/5-fosfato/reductoisomerasa .

111. El método de la reivindicación 108, en donde el hongo es una levadura, y esta levadura se bloquea en la ruta de ergosterol, y se modifica genéticamente para recuperar los esteróles exógenos bajo condicionas aeróbicas.

112. El método de la reivindicación 94, en donde este microorganismo es una bacteria.

113. El método de la reivindicación 112, en donde esta bacteria se ha modificado genéticamente para expresar cuando menos una porción de las enzimas en la ruta del mevalonato.

114. El método de la reivindicación 113, en donde esta bacteria se ha modificado genéticamente para expresar una enzima seleccionada a partir del grupo que consiste en acetoacetil-CoA-tiolasa, HMG-CoA-sintasa, HMG-CoA-reductasa, mevalonato-cinasa, fosfomevalonato-cinasa, y fosfomevalonato-descarboxilasa .

115. El método de la reivindicación 94, en donde este microorganismo es una microalga.

116. El método de la reivindicación 115, en donde esta microalga se selecciona a partir del grupo que consiste en Chlorella y Prototheca .

117. Un microorganismo para producir geranilgeraniol mediante un proceso biosintético, teniendo este microorganismo una modificación genética para reducir la acción de la sintasa de escualeno en este microorganismo, y una modificación genética para incrementar la acción de una proteína seleccionada a partir del grupo que consiste en acetoacetil-CoA-tiolasa, HMG-CoA-sintasa, HMG-CoA-reductasa, mevalonato-cinasa, fosfomevalonato-cinasa, fosfomevalonato-descaxboxilasa, isopentenil-pirofosfato-isomerasa, farnesil-pirofosfato-sintasa, D-l-desoxixilulosa/5-fosfato/sintasa, y l-desoxi-D-xilulosa/5-fosfato/reductoisomerasa.

118. El microorganismo de la reivindicación 117, en donde esta modificación genética para incrementar la acción de una proteína, comprende integrar múltiples copias de genes para esta proteína en el genoma del microorganismo.

119. El microorganismo de la reivindicación 117, en donde esta modificación genética para incrementar la acción de una proteína, incrementa la expresión de un gen que codifique esta proteína.

120. El microorganismo de la ^reivindicación 117, en donde este microorganismo genéticamente modificado es un mutante de erg9.

121. Un método para producir vitamina A a partir de farnesol, el cual comprende: (a) preparar un compuesto dé poliencarbonilo a,ß-insaturado a partir de farnesol; y (b) ciclar este compuesto de poliencarbonilo a,ß-insaturado para formar un compuesto de poliencarbonilo a,ß-insaturado cíclico; y (c) convertir este compuesto de poliencarbonilo a, ß-insaturado cíclico en vitamina A.

122. El método de la reivindicación 121, en donde este paso de preparación comprende: oxidar el farnesol hasta farnesal; y formar el compuesto de poliencarbonilo a,ß-insaturado a partir de este farnesal.

123. El método de la reivindicación 121, en donde el compuesto de poliencarbonilo a, ß-insaturado es de la fórmula: en donde : Z es O ó CHC02R, y R es hidrocarbilo de 1 a 10 átomos de carbono.

124. El método de la reivindicación 121, en donde el compuesto de poliencarbonilo a, ß-insaturado cíclico es de la fórmula en donde : Z es O ó CHC02R, y R es hidrocarbilo de 1 a 10 átomos de carbono.

125. El método de a reivindicación 124, en donde Z i es CHC02R.

126. El método de la reivindicación 125, en donde el paso de convertir comprende la reducción de un grupo éster hasta un grupo alcohol .

127. El método de la reivindicación 124, en donde Z es O.

128. El método de la reivindicación 127, en donde el paso de convertir comprende : conducir una reacción química para transformar Z desde O hasta CHC02R ó CHCN; y reducir Z para formar vitamina A.

129. El método de la reivindicación 121, en donde el farnesol se produce biológicamente.

130. El método de la reivindicación 129, en donde la producción biológica comprende : (a) cultivar un microorganismo en un medio de fermentación para producir un producto seleccionado a partir del grupo que consiste en fosfato de farnesilo y farnesol, en donde se reduce la acción de la sintasa de escualeno de este microorganismo; y (b) recuperar el producto.

131. El método de la reivindicación 130, en donde este microorganismo se modifica genéticamente para reducir la acción de la sintasa de escualeno.

132. El método de la reivindicación 131, en donde este microorganismo se modifica además genéticamente para incrementar la acción de HMG-CoA-reductasa.

133. El método de la reivindicación 132, en donde se incrementa la acción de HMG-CoA-reductasa, mediante la sobreexpresión de HMG-CoA-reductasa o su dominio catalítico en el microorganismo.

134. El método de la reivindicación 132, en donde este microorganismo se modifica además genéticamente para incrementar la acción de una proteína seleccionada a partir del grupo que consiste en acetoacetil-CoA-tiolasa, HMG-CoA-sintasa, mevalonato-cinasa, fosfomevalonato-cinasa, fosfomevalonato-descarboxilasa, isopentenil-pirofosfato-isomerasa, farnesil-pirofosfato-sintasa, D-l-desoxixilulosa/5-fosfato/sintasa, y l-desoxi-D-xilulosa/5-fosfato/reductoisomerasa .

135. El método de la reivindicación 134, en donde el microorganismo se ha modificado genéticamente para incrementar la acción de la farnesil-pirofosfato-sintasa.

136. El método de la reivindicación 130, en donde este microorganismo es un mutante de erg9.

137. El método de la reivindicación 130, en donde este producto se secreta hacia el medio de fermentación mediante este microorganismo, y en donde el paso de recuperar comprende la purificación del producto a partir de este medio de fermentación.

138. El método de la reivindicación 130, en donde este producto es fosfato de farnesilo y farnesol intracelulares, y el paso de recuperar comprende aislar este fosfato de farnesilo y farnesol a partir del microorganismo.

139. El método de la reivindicación 130, en donde este producto es fosfato de farnesilo intracelular, y el paso de recuperar comprende además desfosforilar este fosfato de farnesilo para producir farnesol.

140. El método de la reivindicación 121, en donde el microorganismo es un hongo.

141. El método de la reivindicación 140, en donde este hongo se ha modificado genéticamente para expresar cuando menos una porción de las enzimas en la ruta independiente del mevalonato.

142. El método de la reivindicación 141, en donde este hongo se ha modificado genéticamente para expresar una enzima seleccionada a partir del grupo que consiste en D-l-desoxixilulosa/5-fosfato/sintasa, y l-desoxi-D-xilulosa/5-fosfato/reductoisomerasa.

143. El método de la reivindicación 140, en donde este hongo es una levadura, y la levadura se bloquea en la ruta de ergosterol, y se modifica genéticamente para recuperar los esteróles exógenos bajo condiciones aeróbicas.

144. El método de la reivindicación 130, en donde el microorganismo es una bacteria.

145. El método de la reivindicación 144, en donde esta bacteria se ha modificado genéticamente para expresar cuando menos una porción de las enzimas en la ruta del mevalonato.

146. El método de la reivindicación 145, en donde esta bacteria se ha modificado genéticamente para expresar una enzima seleccionada a partir del grupo que consiste en acetil-CoA-tiolasa, HMG-CoA-sintasa, mevalonato-cinasa, fosfomevalonato-cinasa, y fosfomevalonato-descarboxilasa.

147. El método de la reivindicación 130, en donde el microorganismo es una microalga.

148. El método de la reivindicación 147, en donde esta microalga se selecciona a partir del grupo que consiste en Chlorella y Prototheca .

149. Un método para producir ß-caroteno, el cual comprende : (a) producir químicamente retinal a partir de farnesol; y (b) someter a este retinal a una condición de acoplamiento reductivo para producir el ß-caroteno.

150. El método de la reivindicación 149, en donde este paso químico comprende : (a) preparar un compuesto de poliencarbonilo a,ß-insaturado a partir del farnesol; y (b) ciclar el compuesto de poliencarbonilo a,ß-insaturado, para formar un compuesto de poliencarbonilo a,ß-insaturado cíclico; (c) convertir este compuesto de poliencarbonilo a, ß-insaturado cíclico a retinol; y (d) oxidar este retinol para obtener el retinal.

151. El método de la reivindicación 149, en donde el farnesol se produce biológicamente.

152. El método de la reivindicación 151, en donde la producción biológica comprende : (a) cultivar un microorganismo en un medio de fermentación para producir un producto seleccionado a partir del grupo que consiste en fosfato de farnesilo y farnesol, en donde se reduce la acción de la sintasa de escualeno de este microorganismo; y (b) recuperar el producto.

153. El método de la reivindicación 152, en donde el microorganismo se modifica genéticamente para reducir la acción de la sintasa de escualeno.

154. El método de la reivindicación 153, en donde este microorganismo se modifica además genéticamente para incrementar la acción de HMG-CoA-reductasa.

155. El método de la reivindicación 154, en donde se incrementa la acción de la HMG-CoA-reductasa mediante sobreexpresión de HMG-CoA-reductasa o su dominio catalítico en el microorganismo.

156. El método de la reivindicación 155, en donde este microorganismo se modifica además genéticamente para incrementar la acción de una proteína seleccionada a partir del grupo que consiste en acetil-CoA-tiolasa, HMG-CoA-sintasa, mevalonato-cinasa, fosfomevalonato-cinasa, fosfomevalonato-descarboxilasa, isopentenil-pirofosfato-isomerasa, farnesil-pirofosfato-sintasa, D-l-desoxixilulosa/5-fosfato/sintasa, y l-desoxi-D-xilulosa/5-fosfato/reductoísomerasa .

157. El método de la reivindicación 156, en donde el microorganismo se ha modificado genéticamente para incrementar la acción de la farnesil-pirofosfato-sintasa.

158. El método de la reivindicación 152, en donde este microorganismo es un mutante de erg9.

159. El método de la reivindicación 152, en donde este producto es secretado hacia el medio de fermentación por el microorganismo, y en donde el paso de recuperar comprende la purificación del producto a partir del medio de fermentación.

160. El método de la reivindicación 152, en donde este producto es fosfato de farnesilo y farnesol intracelulares, y el paso de recuperar comprende aislar el fosfato de farnesilo y farnesol a partir de este microorganismo.

161. El método de la reivindicación 152, en donde el producto es fosfato de farnesilo intracelular, y el paso de recuperar comprende además desfosforilar este fosfato de farnesilo para producir farnesol .

162. El método de la reivindicación 152, en donde el microorganismo es un hongo.

163. El método de la reivindicación 162, en donde este hongo se ha modificado genéticamente para expresar cuando menos una porción de las enzimas en la ruta independiente del mevalonato.

164. El método de la reivindicación 162, en donde este hongo se ha modificado genéticamente para expresar una enzima seleccionada a partir del grupo que consiste en D-l-desoxixilulosa/5-fosfato/sintasa, y l-desoxi-D-xilulosa/5-fosfato/reductoisomerasa .

165. El método de la reivindicación 162, en donde este hongo es una levadura, y esta levadura se bloquea en la ruta de ergosterol, y se modifica genéticamente para recuperar los esteróles exógenos bajo condiciones aeróbicas.

166. El método de la reivindicación 152, en donde este microorganismo es una bacteria.

167. El método de la reivindicación 166, en donde esta bacteria se ha modificado genéticamente para expresar cuando menos una porción de las enzimas en la ruta del mevalonato .

168. El método de la reivindicación 167, en donde esta bacteria se ha modificado genéticamente para expresar una enzima seleccionada a partir del grupo que consiste en acetil-CoA-tiolasa, HMG-CoA-sintasa, HMG-CoA-reductasa, mevalonato-cinasa, fosfomevalonato-cinasa, y fosfomevalonato-descarboxilasa .

169. El método de la reivindicación 152, en donde este microorganismo es una microalga.

170. El método de la reivindicación 169, en donde esta microalga se seleccionada a partir del grupo que consiste ei Chlorella y Prototheca .

171. Un método para producir ß-caroteno, el cual comprende : producir sulfona-C40 a partir de un haluro de retinilo y retinilfenilsulfona; y convertir esta sulfona-C40 hasta ß-caroteno.

172. El método de la reivindicación 171, en donde el paso de producir comprende poner en contacto la retinilfenilsulfona con una base.

173. El método de la reivindicación 171, en donde el paso de convertir comprende un proceso de eliminación.