MXPA01000217A

MXPA01000217A - Metodo para producir vitamina.

Info

Publication number: MXPA01000217A
Application number: MXPA01000217A
Authority: MX
Inventors: Gabriel G Saucy
Original assignee: Dcv Inc Haciendo Negocios Como
Priority date: 1998-07-06
Filing date: 1999-07-06
Publication date: 2002-11-29
Also published as: WO2000001649A1; JP2002519416A; CN1315947A; WO2000001685A1; CN1339020A; EP1095033A1; EP1095001A4; CA2332308A1; AU4862999A; US6156913A; JP2002519417A; JP2002519397A; US6262279B1; BR9911873A; EP1095001A1; EP1095034A1; CN1308623A; WO2000001686A1; US6242227B1

Abstract

La invencion proporciona un metodo para producir alfa-tocoferol y esteres de alfa- tocoferilo. El metodo comprende utilizar un sistema biologico para producir farnesol o geranilgeraniol. Despues, el farnesol o geranilgeraniol se convierte quimicamente en alfa- tocoferol o un ester de a-tocoferilo.

Description

MÉTODO PARA PRODUCIR VITAMINA REFERENCIA A LA SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reclama prioridad de la Solicitud Provisional de E.U. No. 60/091 ,868, presentada el 6 de Julio de 1998, titulada "Method of Vitamin Production".

CAMPO DE LA INVENCIÓN " La""presente invención se refiere a métodos para producir vitaminas, particularmente vitamina E y compuestos relacionados.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La vitamina E (d-a/fa-tocoferol, 13) es un complemento nutricional importante en humanos y animales. Ei compuesto 1 se obtiene comercialmente mediante el aislamiento de una variedad de aceites vegetales, o semisintéticamente mediante metilación anular del d-gam a-tocoferol 2 que ocurre naturalmente relacionado. Una fuente más importante de vitamina E es la síntesis total, que proporciona d, 1 -a/fa-tocoferol 3. Aunque una mezcla de isómeros, 3 proporciona mucha de la actividad biológica de 1 y se utiliza ampliamente debido a su bajo costo y mayor disponibilidad. Para una discusión general de la vitamina E, ver L. Machlin, ed. , "Vitamin E: A Comprehensive Treatise", Marcel Dekker, NY, 1980. d, 1 -a/fa-Tocoferol 3 se obtiene al reaccionar trimetilhidroquinona 4 con ya sea fitol 5 o isofitol 6 en la presencia"de un catalizador ácido, con frecuencia un ácido Lewis tal como cloruro de zinc. Esta tecnología se revisa por S. Kasparek en L. Machlin, ed. Vitamin E: A Comprehensive Treatise, capítulo 2, pp. 8-65, Marcel Dekker, NY, 1965. Las referencias 140-166 de este capítulo proporcionan las referencias principales para métodos detallados para preparar el compuesto 3 El isofitol 6 o fitol 5 requerido para la preparación de 3 se obtienen a través de síntesis de múltiples etapas. Los materiales iniciales típicamente incluyen acetona (ver Kasparek, en Machlin, Vitamin E: A Comprehensive Treatise, pp. 44-45, Dekker, NY, 1980, y las referencias citadas en la misma) y trímero de isopreno cíclico (Pond et al. E.U. 3,917,710 y 3,862,988 (1975)). Además, gamma-tocoferol se hizo primero mediante la síntesis total por Jacob, Steiger, Todd y Wilcox (J . Chem. Soc. 1 939, 542). Estos empleados produjeron la vitamina al reaccionar el éster de monobenzoato de 2,3-dimetilhidroquinona con bromuro de fit?lo en la presencia de cloruro de zinc, seguido por el retiro del benzoato para dar un producto bajo (22%) de gamma-tocoferol. Las síntesis publicadas de los tocoferoles y tocotrienoles se revisaron por S. Kasparek en L. Machlin, "Vitamin E - A Comprehensive Treatise", Dekker, NY, 1980; sin embargo, ningún método adicional para preparar el gamma-tocoferol se ha registrado. A pesar de los diversos métodos conocidos para preparar o aislar los miembros de la familia de compuestos de vitamina E, permanece una necesidad de métodos de producción mejorados y más eficientes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 A ilustra una representación diagramática de trayectoria biosintética de isoprenoide dependiente de mevalonato. La Figura 1 B ilustra una representación diagramática de la trayectoria biosintética de isprenoide independiente de mevalonato. La Figura 2 ilustra una modalidad de una vía para la síntesis química de vitamina E de geranilgeraniol. La Figura 3 ilustra una modalidad de una vía para la síntesis química de vitamina E de farnesol. La Figura 4 ilustra el crecimiento y producción de farnesoi de cepas derivadas de la cepa MBNA1 -1 3. La Figura 5 ilustra el crecimiento de cepas ERG9 reparadas y erg9, de tipo silvestre. La Figura 6 ilustra la producción de farnesol en microorganismo con producción amplificada de reductasa CoA HMG. La Figura 7 ilustra la producción de farnesol y GG en cepas que sobreexpresan sintasas GGPP. La Figura 8 ilustra el efecto de producción amplificada de sintasa FPP en farnesol y producción GG . La Figura 9 ilustra la trayectoria para la conversión metabólica de isoprenol y prenol en farnesoi. La Figura 1 0 ilustra una modalidad de una vía de síntesis química de gamma-tocoferol.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN 1 .0 Introducción La presente invención proporciona un método para producir esteres de a-tocoferilo y a-tocoferol en ios cuales un sistema biológico se utiliza para producir farnesol o geranilgeraniol (GG). El farnesol puede utilizarse como un material inicial para sintetizar químicamente el producto finales, esteres de a-tocoferilo. Alternativamente, el farnesol puede convertirse químicamente en GG. GG, producido biológicamente o por síntesis de farnesol, puede entonces utilizarse como un material inicial para hacer esteres de a-tocoferilo y a-tocoferilo. La presente invención también incluye varios aspectos de materiales biológicos y compuestos intermedios útiles en la producción de farnesol o GG mediante producción biológica. La presente invención también incluye métodos para producir esteres de a-tocoferilo y a-tocoferol utilizando farnesol y/o GG producido por cualquier medio como el material inicial. 2.0 Producción Biológica de Farnesol y GG Los isoprenoides son la familia más grande de productos naturales, con aproximadamente 22,000 diferentes estructuras conocidas. Todos los isoprenoides se derivan den del ¡sopentilpirofosfato (IPP) de compuesto C5. De esta manera, las estructuras de carbono de todos ios compuestos de ¡sprenoide se crean por adiciones secuenciales de las unidades C5 a la cadena de poliprenoide creciente. Aunque las etapas biosintéticas que conducen de IPP a isoprenoides son universales, existes dos trayectorias diferentes que conducen a IPP. Los hongos (tales como levadura) y animales poseen la trayectoria dependiente de mevalonato bien conocida (representada en ia Figura 1 A) que utiliza CoA de acetilo como el precursor inicial. Las bacterias y las plantas más altas, por el otro lado, poseen una trayectoria independiente de mevalonato descubierta recientemente, también se refiere en la presente como la trayectoria sin mevalonato (representada en la Figura 1 B) que conducen de piruvato y 3-fosfato de glicerilaldehído [Lois er al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 95, 21 05-21 1 0 (1 998); Rohmer et al., J. Am. Chem. Soc. 1 18, 2564-2566 (1 996); Arigoni, et al. , Proc. Nati. Acad. Sic. USA, 94, 10600-10605 (1 977); Lange er al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 95, 2100-21 04 (1998)]. En plantas, existe evidencia de que ambas trayectorias, dependiente e independiente de mevalonato, existen, el primero siendo citosólico y el último siendo plastidial [Arigoni, et al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 94, 10600-10605 (1997); Lange eí al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 95, 2100-2104 (1998)]. Varias etapas de la trayectoria independiente de mevalonato se han establecido. La primer etapa, catalizada por sintasa de D-1 -deoxixilulosa-5-fosfato, forma D-1 -deoxixiluola 5-fosfato de piruvato y glieraldehído 3-fosfato. Las etapas, segunda y tercera, catalizadas por reductoisomerasa de D-1 -deoxixilulosa 5-fosfato, catalizan la conversión de D-1 -deoxixilulosa 5-fosfato en 2-C-metil D eritritol-4-P (MEP). Varias reacciones adicionales se requieren para convertir MEP en IPP, y estas enzimas son desconocidas en este momento [Lois et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 95, 21 05-21 1 0 (1 998); Takahashi et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 95, 21 00-21 04 (1 998); Duvold eí al. , Tetrahedron Letters, 38, 4769-4772 (1 997)]. Farnesol y GG son alcoholes de prenilo producidos por desfosforilación de farnesilprirofosfato (FPP) y geranilgeranilpirofosfato (GGPP), respectivamente. FPP y GGPP son compuestos intermedios en ía biosíntesis de compuestos de isprenoide, incluyendo esteróles, ubiquinonas, heme, dolicoles y carotenoides, y se utilizan en la prenilación post-traslacional de proteínas. Tanto FPP como GGPP se derivan de IPP. Las modalidades de la presente invención incluyen la producción biológica de farnesol o GG en cultivos de célula procariótica o eucariótica y sistemas libres de célula irrespectivos de si el organismo utiliza la trayectoria dependiente o independiente de mevalonato para la biosíntesis del precursor de todos los isoprenoides, IPP. La referencia en la presente a fosfato de farnesilo o fosfato de geranilgeranilo se refiere a los compuestos de mono-, di- y tri-fosfato, al menos una forma específica se designa específicamente. 2.1 Microorganismos Modificados Los sistemas biológicos adecuados para producir farnesol y GG incluyen cultivos de célula procariótica y eucariótica y sistemas libres de célula. Los sistemas biológicos prefe?idos incluyen sistemas fúngicos, bacteriales y microalgales. Los sistemas biológicos más preferidos son cultivos celulares fúngicos, más preferentemente un cultivo celular de levadura, y más preferentemente un cultivo celular Saccharomyces cerevisiae. Los hongos se prefieren ya que tienen una historia larga de uso en los procesos industriales y pueden manipularse tanto por tecnologías de ingeniería genética como por microbiología clásica. La levadura , en particular, se caracterizan bien genéticamente. En realidad, el genoma completo de S. cerevisiae se ha secuenciado, y los genes que codifican las enzimas en la trayectoria de isoprenoide ya se han clonado. También, S. cerevisiae crece a densidades celulares elevadas, y cantidades de escualeno y ergosterol (ver Figura 1 ) hasta 16% de peso en seco celular se han reportado en cepas sometidas genéticamente a estudio. Para un revisión más reciente de la trayectoria de isoprenoide, ver Parks y Casey, Annu. Rev. Microbiol. 49:95-1 16 (1995). El procarioto preferido es E. coli. E. coli se establece bien en un microorganismo industrial utilizado en la producción e metabolitos (aminoácidos, vitaminas) y varias proteínas recombinantes. El genoma de £. coli completo también se ha secuenciados, y los sistemas genéticos se desarrollan altamente. Como se menciona arriba, E. coli utiliza la trayectoria independiente de mevalonato para síntesis de IPP. E. coli de genes dxs, dxr, idi, e ispA, que codifican sintasa de D-1 -deoxixilulosa-5-fosfato, reductoisomerasa de D-1 -deoxixilulosa isomerasa IPP, y sintasa FPP respectivamente, se han clonado y sencuencíado [Fujisaki, eí al. , J. Biochem. 108, 995-1 000 (1990); Lois eí al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 95, 21 05-21 10 (1998); Hemmi eí al., J. Biochem. , 123, 1088- 1096 (1998)]. Las microalgas preferidas para utilizarse en la presente invención incluyen Chlorelía y Prototecha. Los organismos adecuados útiles para producir farnesol y GG se encuentran disponibles de numerosas fuentes, tales como la Colección de Cultivo Tipo Americana (ATCC), Rockville, MD, Colección de Cultivo de Algas (UTEX), Austin, TX, el Laboratorio DE Búsqueda Internacional Norte (NRRL), Peoría, IL y el Centro de Almacenamiento Genético E. coli (CGSC), New Haven, CT. En particular, estos son colecciones de cultivo de S. cerevisiae que se han utilizado para estudiar la trayectoria de isoprenoide que se encuentran disponible de, por ejemplo, Jasper Riñe en la Universidad de California, Berkeley, CA, y de Leo Parks en la Universidad del Estado de Carolina del Norte, Raleigh, NC. Preferentemente, las células utilizada en el cultivo celular se modifican genéticamente para incrementar la producción de farnesol o GG. Las células pueden modificarse genéticamente mediante técnicas de ingeniería genética (es decir, tecnología recombinante), técnicas microbiologícas clásicas, o una combinación de tales técnicas y también pueden incluir variantes genéticas que ocurren naturalmente. Algunas de tales técnicas se describen generalmente, por ejemplo, en Sambrook ef al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press. La referencia Sambrook eí a/., idid. , se incorpora para referencia en la presente en su totalidad. Un microorganismo genéticamente modificado puede incluir un microorganismo en el cual las moléculas de ácido nucleico se han insertado, borrado o modificado (es decir, mutado, por ejemplo, mediante inserción, borrado, substitución, y/o inversión de nucleótidos), de tal manera que taies modificaciones proporcionan el efecto deseado de producciones incrementadas de fanesol o GG dentro del microorganismo o en el supernatátil del cultivo. Como se utiliza en la presente, las modificaciones genéticas que resultan en una reducción en la expresión génica, en la función del gen, o en la función del producto de gen (es decir, la proteína codificada por el gen) puede referirse como inactivación (completa o parcial), borrado, interrupción, bloqueo o sub-regulación de un gen. Por ejemplo, una modificación genética en un gen que resulta en una reducción en la función de la proteína codificada por tal gen, puede ser el resultado de un borrado completo del gen (es decir, el gen no existe, y por lo tanto la proteína no existe), una mutación en el gen que resulta en nada de traslación o incompleta de la proteína (por ejemplo, la proteína no se expresa), o una mutación en el gen que reduce o elimina la función natural de la proteína (por ejemplo, una proteína se expresa, la cual tiene actividad enzimática reducida o no tiene nada). Las modificaciones genéticas que resultan en un incremento en la función o expresión génica pueden referirse como amplificación , sobreproducción, sobreexpresión, activación, aumento, adición o sub-regulación de un gen. La adición de genes clonados para incrementar la expresión génica puede incluir mantener el(los) gen(es) clonado(s) en plásmidos de réplica o integ rar el(Ios) gen(es) clonado(s) en el genoma del organismo de producción. Además, incrementar la expresión de genes clonados deseados puede incluir enlazar operativamente el(los) gen(es) clonado(s) a elementos de control transcripcional nativos o heterólogos. 2.1 .1 . Modificaciones de Sintasa de Escualeno Las modalidades de la presente invención incluyen producción biológica de farnesol o GG al cultivar un microorganismo, preferentemente levadura, que se ha modificado genéticamente para modular la actividad de una o más de las enzimas en su trayectoria biosintética isoprenoide. En una modalidad, un microorganismo se ha modificado genéticamente al reducir (incluyendo eliminar) la acción de la actividad de sintasa de escualeno (ver Figura 1 ). Por ejemplo, los mutantes erg9 de levadura que no son capaces de convertir mevalonato en escualeno, y que acumulan farnesol, se han producido. Karst y Lacroute, Molec. Gen. Genet., 1 54, 269-277 (1977); Patente de E.U. No. 5,589,372. Como se utiliza en la presente, la referencia a la mutación o mutante erg? se refiere a una modificación genética que reduce la acción de sintasa de escualeno, tal como al bloquear o reducir la producción de sintasa de escualeno, reducir la actividad de sintasa de escualeno, o inhibir la actividad de sintasa de escualeno, que resultan en la acumulación de disfosfato de farnesilo (FPP) al menos que el FPP se convierta de otro modo en otro compuesto, tal como farnesol mediante actividad de fosfatasa. El bloqueo o reducción de la producción de sintasa de escualeno puede incluir colocar el gen ERG9 bajo el control de un promotor que requiere la presencia de un compuesto inductor en el medio de crecimiento. Al establecer las condiciones de tal manera que el inductor se consuma del medio, la expresión de ERG9 (y por lo tanto, síntesis de sintasa de escuaieno) podría desactivarse. También los promotores se desactivan por la presencia de un compuesto represor. Por ejemplo, los promotores de los genes CTR3 o CTR1 de levadura pueden reprimirse por la adición de cobre. El bloqueo o reducción de la actividad de sintasa de escualeno podría también incluir un planteamiento de tecnología de escisión similar a aquel descrito en la Patente de E.U. No. 4,743,546 incorporado en la presente para referencia. En este planteamiento, el gen ERG9 se clona entre las secuencias genéticas específicas que permiten ia escisión controlada, específica del gen ERG9 del genoma. La escisión podría indicarse por, por ejemplo, un cambio en la temperatura de cultivación del cultivo, como en la Patente de E.U. No. 4,743,546 o por alguna otra señal nutricional o física. Tal modificación genética incluye cualquier tipo de modificación y específicamente incluye modificaciones hechas por tecnología recombinante y mediante mutagénesis clásica. Los inhibidores de sintasa de escualeno se conocen (ver Patente de E.U. No, 4,871 ,721 y las referencias citadas en la Patente de E.U. No. 5,475,029) y pueden agregarse a cultivos celulares. En otra modalidad, un organismo que tiene la trayectoria independiente de mevalonato de biosíntesis (tal como E. coli) se modifica genéticamente de manea que acumula FPP y/o farnesol. Por ejemplo, la reducción de la actividad de sintasa de pirofosfato de octaprenilo (el producto del gen ispB) podría esperarse que resulte en acumulación de FPP en £. coli (Asai, eí al., Biochem, Biophys, Res. Comm. 202. 340-345 (1 994)). La acción de una fosfatasa podría resultar además en acumulación de farnesol en E. coli. Las cepas de levadura necesitan ergosterol para la fluidez de la membrana celular, así los mutantes bloqueados en la trayectoria de ergosterol, tales como mutantes erg9, necesitan ergosterol extraño u otros esteróles agregados al medio para que las células permanezcan estables. Las células normalmente no pueden utilizar este esterol adicional al menos que crezcan bajo condiciones anaeróbicas. Por lo tanto, una modalidad adicional de la presente invención es el uso de una levadura, en la cual la acción de sintasa de escaleno se reduce, tal como un mutante erg9, y que toma esteróles exogenósamente suministrados bajo condiciones aeróbicas. Las modificaciones genéticas que permiten que la levadura utilice esteróles bajo condiciones aeróbicas se demuestran abajo en la sección de Ejemplos (ver Ejemplo 1 ) y también se conocen en ia materia. Por ejemplo, tales modificaciones genéticas incluyen upe (mutación de control de toma que permite que las células tomen esteróles bajo condiciones aeróbicas) y heml (el gen HEM1 codifica la sintasa de ácido aminolevulínico que es ia primer etapa comprometida a la trayectoria biosintética heme de FPP, y los mutantes hm1 son capaces de tomar ergosterol bajo condiciones aeróbicas siguiendo una interrupción en la trayectoria biosintética de ergosterol, estipulando que los cultivos se complementan con ácidos grasos no saturados). Las cepas de levadura que tienen estas mutaciones pueden producirse utilizando técnicas conocidas y también disponibles de, por ejemplo, Dr. Leo Parks, Universidad del Estado de Carolina del Norte, Raleigh , NC. Las células hapioides que contienen estas mutaciones pueden utilizarse para generar otros mutantes mediante cruzadas genéticas con otras células hapioides. También, la sobreexpresión del gen SUT1 (toma de esterol) puede utilizarse para permitir la toma de esteróles bajo condiciones aeróbicas. El gen SUT1 se ha clonado y secuenciado. Burot y Karst, Gene, 165: 97-102 (1995). En una modalidad adicional, los microorganismos de la presente invención pueden utilizare para producir farnesol y/o GG al cultivar microorganismos en la presencia de un inhibidor de sintasa de escualeno. De esta manera, la acción de sintasa de escualeno se reduce. Los inhibidores de sintasa de escualeno se conocen por aquellos expertos en la materia. (Ver, por ejemplo, Patente de E. U. No. 5,556,990, 2.1 .2 Modificaciones de Reductasa HMF-CoA Una modalidad adicional de la presente invención es el uso de un microorganismo que se ha modificado genéticamente para incrementar la acción de reductasa HMG-CoA. Debe notarse que la referencia para incrementar la acción de reductasa HMG-CoA y otras enzimas tratadas en la presente se refiere a cualquier modificación genética en el microorganismo en cuestión que resulta en funcionalidad incrementada de las enzimas e incluye actividad más elevada de las enzimas y sobreexpresión de las enzimas. Por ejemplo, el número de copias de gen puede incrementarse, los niveles de expresión pueden incrementarse mediante el uso de un promotor que da niveles elevados de expresión que aquel del promotor nativo, o un gen que puede alterarse mediante ingeniería genética o mutagénesis clásica para incrementar la actividad de una enzima. Una de las enzimas clave en la trayectoria biosintética de isoprenoide dependiente de mevalonato es reductasa HMG-CoA que cataliza la reducción de 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A (HMG-CoA). Esta es la primer etapa irreversible y limitante de velocidad principal en la trayectoria, y el incremento de la actividad de reductasa HMG-CoA conduce a producciones elevadas de escualeno y ergosterol en una cepa tipo silvestre de S. cerevisiae, y farnesol en una cepa erg9. Un mecanismo mediante el cual la acción de reductasa HMG-CoA puede incrementarse es al reducir la inhibición de la enzima ya sea modificando genéticamente la enzima o modificando el sistema para remover el inhibidor. Por ejemplo, tanto los productos de esterol como sin esterol de la retroalimentación de la trayectoria de isoprenoíde muestran esta enzima (ver, por ejemplo, Parks y Casey, Annu. Rev. Microbiol. 49:95-1 16 (1 995). Alternativamente o en adición, el(los) gen(es) que codifican la reductasa HMG-CoA puede alterarse mediante ingeniería genética o técnicas de mutagénesis clásicas para reducir o prevenir la inhibición . También, la acción de reductasa HMG-CoA, puede incrementar al incrementar el número de copias de gen, al incrementar el nivel de expresión de (los) gen(es) de reductasa HMG-CoA mediante ingeniería genética o mutagénesis clásica para incrementar la actividad de la enzima. Ver Patente de E.U. No. 5,460, 946, los contenidos totales de la cual se incorporan en la presente para referencia. Por ejemplo, se han producido las reductasa HMG-CoA truncadas, en las cuales el dominio regulador se ha removido y el uso de números de copias de gen hasta aproximadamente seis también da actividad incrementada. Id. Ver también. Downing eí ál., Biochem. Biophys. Res. Commun. , 94, 974-78 (1 980) que describe dos mutantes de levadura que tienen niveles incrementados de reductasa HMG-CoA. Dos isozimas de reductasa HMGCoA, codificadas por los genes HMG1 y HMG2, existen en S. cerevisiae. La actividad de estas dos isozimas se regula por varios mecanismos que incluyen la regulación de transcripción, regulación de traslación, y para Hmg2p, la degradación de la enzima en el retículo endoplásmico (Hampton y Riñe, 1 994; Donald, eí al. 1997). En ambos, Hmg l p y Hmg2p, el dominio catalítico reside en la porción terminal de COOH. de la enzima, mientras que ei dominio regulador reside en la región terminal de NH2 que se expande sobre la membrana. Se ha mostrado que la sobreexpresión de solamente el dominio catalítico de Hmg l p en S. cerevisiae incrementa el flujo de carbono a través de la trayectoria de isoprenoide, resultando en la sobreproducción de escualeno (Saunders, eí al. , 1 995; Donald eí al. , 1997). Los presentes inventores han expresado el dominio catalítico de Hmg2p de S. cerevisiae en cepas que tienen una trayectoria de isoprenoide normal (es decir, sin bloquear) y se observó in incremento significativo en la producción de escualeno. Además, la sobreexpresión del dominio catalítico de Hmg2p resultó en la producción de farnesol incrementada en un mutante erg?, e incrementó la producción de farnesol y GG en un mutante erg9 que sobreexpresa la síntasa GGPP, crecida en fermentores. 2.1 .3 Modificaciones de Sintasa GGPP Una modalidad adicional de la presente invención es el uso de un microorganismo que se ha modificado genéticamente para incrementar la acción de sintasa GGPP. Los genes que codifican esta enzima de una variedad de fuentes, ¡ncluyendo bacterias, hongos, plantas, mamíferos y arcabacterias, se han identificado. Ver, Brinkhaus eí al., Arch. Biochem. Biophys, 266, 607-612 (1 988); Carattoli eí al., J. Biol. Chem., 266, 5854-59 (1991 ); Chen eí al., J. Biol. Chem., 268, 1 1 002-1 1007 (1993); Dogbo, eí al., Biochim. Biophys. Acta, 920, 140-148 (1997); Jiang eí al., J. Biol. Chem., 270, 21793-99 (1 995); Kuntz al., Plant J., 2, 25-34 (1992); Laferriere, eí al., Biochim. Biophys. Acta, 1077, 167-72 (1991 ); Math eí al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89, 6761 -64 (1992); Ohnuma eí al., J. Biol. Chem., 269, 14792-97 (1994); Sagami eí al., Arch. Biochem. Byophis., 297, 314-20 (1 992); Sagami eí al., J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 18, 245-51 (1993); Scolnik eí al., Plant Physiol., 104, 1469-70 (1 994); Tachibana eí al., Biosci. Biotech. Biochem., 7, 1 129-33 (1993); Tachibana eí al., J. Biochem., 1 14, 389-92 (1993); Wiedemann eí al., Arch. Biochem. Biophys., 306, 1 52-57 (1 993). Algunos organismos tienen una enzima bisfuncional que también sirve como una sintasa FPP, de manera que se incluye en la conversión total del IPP y DMAPP en FPP a GGPP (ver Figura 1 ). Algunas enzimas, tales como aquellas encontradas en plantas, tienen especificad relajada, convirtiendo IPP y DMAPP en GGPP (ver Figura 1 ). Las modificaciones genéticas de sintasa GGPP, como se utiliza en la presente, comprende someter a estudio una sintasa GGPP monofuncional o una sintasa FPP/GGPP bifuncional para aumentar el componente de actividad de sintasa GGPP de la enzima. Un gen de sintasa GGPP preferido es el gen BST1 de S. cervisiae. El gen BTS1 y su aislamiento se describen en Jiang eí al., J. Biol. Chem., 270, 21 793-99 (1995) y la solicitud copendiente No. de Serie 08/761 ,344, presentada el 6 de Diciembre de 1996, la descripción completa de la cual se incorpora en la presente para referencia. Sin embargo, las sintasas GGPP de otros huéspedes pueden utilizarse, y el uso de sintasas GGPP bifuncionales puede ser particularmente ventajoso en términos de canalización del flujo de carbono a través de FPP a GGPP, evitando así la pérdida de FPP a reacciones de competencia en la célula. En modalidades adicionales de la invención, en adición a las modificaciones de la sintasa GGPP arriba descrita, la sintasa GGPP de tipo silvestre se elimina del organismo de producción. Esto serviría, por ejemplo, para eliminar la competencia entre la sintasa GGPP modificada y la enzima de tipo silvestre para los substratos, FPP e IPP. El borrado del gen tipo silvestre que codifica la sintasa de GGPP podría también mejorar la estabilidad del gen de sintasa GGPP al retirar las regiones de homología de secuencia genética, elevada, evitando así la recombinación genética potencialmente dañina. 2.1 .4 Modificaciones de Sintasa FPP Una modalidad adicional de la presente invención es el uso de un microorganismo que se ha modificado genéticamente para incrementar la acción de sintasa FPP. Los genes que codifican esta enzima de una variedad de fuentes se han identificado. Ver, Anderson eí al., J. Biol. Chem., 264, 19176-1 91 84 (1989); Attucci, eí al., Arch. Biochem. Biophys., 321 , 493-500 (1995); Cañe eí al., J. Am. Chem. Soc, 105, 122-124 (1 983); Chambón eí al., Current Genetics, 18, 41 -46 (1990); Chambón eí al., Lipids, 26, 633-36 (1991 ); Chen al., Protein Science, 3, 600-607 (1994); Davisson, eí al., J. Am. Chem. Soc, 1 1 5, 1 235-45 (1993); Ding eí al., Biochem. J., 275, 61 -65 (1 991 ); Hugueney eí al., FEBS Letters, 273, 235-38 (1990); Joly eí al.,J. Biol. Chem., 268, 26983-89 (1993); Koyama eí al., J. Biochem, 28, 8129-35 (1989); Song eí al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 91 , 3044-48 (1994); Spear ef al., J. Biol. Chem., 267, 14662-69 (1992); Spear ef al. , J. Biol. Chem., 269, 2521 2-18 (1994); Anderson ef al., J, Biol. Chem., 264, 19176-19184 (1989) reportaron una sobreexpresión de 2-3 veces de sintasa de FPP con el gen de S. cerevisiae en un vector de lanzadera de levadura. Como se describe en la sección de Ejemplo, se ha encontrado sorprendentemente que la sobreexpresión de la sintasa FPP no conduce a un incremento en la producción de farnesol, pero inesperadamente conduce a un incremento en la producción de GG en la ausencia de cualquier sobreexpresión de sintasa GGPP. En modalidades adicionales de la invención, además de las modificaciones de sintasa FPP arriba descrita, la sintasa FPP de tipo silvestre se elimina del organismo de producción. Esto serviría, por ejemplo, para eliminar la competencia entre ia sintasa FPP modificada y la enzima de tipo silvestre para los substratos, IPP, DMAPP y GPP. El borrado de la sintasa FPP que codifica el gen de tipo silvestre podría también mejorar la estabilidad del gen de sintasa FPP clonado al retirar las regiones de homología de secuencia genética elevada, evitando así la recombinación genética potencialmente dañina. 2.1 .5 Modificaciones de Fosfatasa Una modalidad adicional de la presente invención es el uso de un microorganismo que se ha modificado genéticamente para incrementar la acción de fosfatasa para incrementar la conversión de FPP en farnesol o GGPP a GG. Por ejemplo, tanto S. cerevisiae como E. coli contienen numerosas actividades de fosfatasa. Al probar varias fosfatasas para la desfoforilación de FPP o GGPP, uno podría seleccionar una fosfatasa apropiada y expresar el gen que codifica esta enzima en un organismo de producción para aumentar la producción de farnesol o GG. Además de (o en lugar de) incrementar la acción de una fosfatasa deseada para aumentar la producción de farnesol o GG, uno podría eliminar, a través de medios genéticos, actividades de fosfatasa no deseables. Por ejemplo, uno podría eliminar a través de ia mutación la actividad de una fosfatasa que actúa específicamente en FPP, de manera que la FPP que se reserva podría estar disponible para ia conversión a GGPP y subsecuentemente GG. 2.1 .6 Modificaciones Genéticas Adicionales Modificaciones de Otras Enzimas de Trayectoria de Isoprenoide Las modificaciones que pueden hacerse para incrementar la acción de reductasa HMGCoA, sintasa GGPP y fosfatasa se describen arriba. La modificación de la acción de enzima de trayectoria de isoprenoide no se limita a aquellos ejemplos específicos, y las estrategias similares pueden aplicarse para modificar la acción de otras enzimas de trayectoria de isoprenoide tales como tiolasa acetoacetilo Co-A, sintasa HMG-CoA, quinasa de mevalonato, quinasa de fosfomevalonato, decarboxilasa de fosfomevalonato, isomerasa IPP, sintasa de pirofosfato de farnesiolo o sintasa de D-1 -deoxixiIulosa 5-fosfato, reductoisomerasa de D-1 -deoxixilulosa 6-fosfato. Sometimiento a Estudio del Metabolismo Central para Incrementar el Suministro de Precursor a la Trayectoria de Isoprenoide. En organismo que tiene la trayectoria de isoprenoide dependiente de mevalonato, la biosíntesis de farnesol o GG comienza con CoA acetilo (referir a la Figura 1 ). Una modalidad de la presente invención es la modificación genética del organismo de producción de tal manera que el nivel intracelular de CoA acetilo se incrementa, mezclando así más CoA acetilo disponible para la dirección a la trayectoria de isoprenoide (y por lo tanto a farnesol y/o GG). Por ejemplo, el suministro a CoA acetilo puede incrementarse al incrementar la acción del complejo de deshidrogenasa de piruvato. El suministro de CoA acetilo puede incrementarse además al incrementar el nivel de piruvato en la célula al incrementar la acción de quinasa de piruvato. En los organismos que tienen la trayectoria de ¡soprenoide independiente de mevalonato, la biosíntesis de isoprenoides comienza con piruvato y gliceraldeh ído 3-fosfato. El suministro de piruvato y gliceraldehído 3-fosfato disponible para la biosíntesis de isoprenoide puede incrementarse al incrementar la acción de quinasa de piruvato e isomerasa de triofosfato, respectivamente. Los ejemplos anteriores se proporcionan solamente para ilustrar el concepto de someter a estudio el metabolismo centra para el propósito de incrementar la producción de compuestos de isoprenoide, y no son una lista exhaustiva de planteamientos que pueden tomarse. Numerosas otras estrategias podrían aplicarse exitosamente para lograr este objetivo. Trayectorias de Bloqueo que Compiten por FPP o GGPP. En levadura, FPP es un compuesto intermedio de punto ramificado que conduce a la biosíntesis de esteróles, heme, dolicol, ubiquinona , GGPP y proteínas farnesiladas. En E. coli, FPP sirve como el substrato para sintasa de pirofosfato de octaprenilo en la trayectoria que condice a ubiquinona. En bacterias que sintetizan los carotenoides, tales como Erwina uredovora, FPP se convierte en GGPP mediante sintaxis GGPP en la primer etapa que condice a los carotenoides. Para incrementar la producción de farnesol o GG, se deseable inactivar ios genes que codifican las enzimas que utilizan FPP o GGPP como substrato, o para reducir la actividad de las enzimas por sí mismas, ya sea a través de mutación o el uso de inhibidores de enzima específicos (como se trata arriba para sintasa de escualeno). En S. cerevisiae, por ejemplo, puede ser ventajoso inactivar la primer etapa en la trayectoria de FPP a heme, en adición a la inactivación de ERG9. Como se trata anteriormente, en E. coli, la inactivación parcial o completa de la sintasa de pirofosfato de octaprenilo podría incrementar la disponibilidad de FPP para la conversión de farnesol. Finalmente, en bacterias que producen carotenoides, tales como Erwina uredovora, la eliminación de sintasa GGPP puede incrementar el nivel de FPP para conversión de farnesol, mientras que la inactivación o reducción de la actividad de sintasa de fitoeno (el producto de gen crtB) puede incrementar el nivel de GGPP disponible para la conversión a GG. Es posible que las trayectorias de bloqueo que conducen lejos de FPP o GGPP podrían tener efectos negativos en el crecimiento y fisiología del organismo de producción. Se contempla además que pueden hacerse modificaciones genéticas adicionales requeridas para desvanecer estas complicaciones. El aislamiento de mutantes de S. cerevisiae, que se bloquean en la trayectoria de isoprenoide y toman esteróles bajo condiciones aeróbicas, como se describe arriba, ilustra que pueden obtenerse las mutaciones de compensación que superan los efectos de las primeras modificaciones genéticas. Aislamiento de Cepas de Producción que son Resistentes a Farnesol o GG. En la sección de Ejemplos, se describe la producción de niveles elevados de farnesol y GG mediante cepas genéticamente modificadas de S. cerevisiae. Se reconoce que como se hacen incrementos adicionales en la producción de farnesol o GG, estos compuestos pueden alcanzar niveles que son tóxicos para el organismo de producción. En realidad, la toxicidad del producto es un problema común encontrado en procesos de producción biológica. Sin embargo, solamente son comunes las modificaciones genéticas hechas por métodos clásicos o tecnología recombinante que supera la toxicidad del producto. La presente invención anticipa encontrar la toxicidad del producto. De esta "manera, una modalidad adicional de esta invención es el aislamiento de mutantes con resistencia incrementada a farnesol y/o GG. Aislamiento de los Organismos de Producción con Propiedades de Crecimiento Mejoradas. Un efecto para bloquear la trayectoria de isoprenoide en S. cerevisiae es que ios organismos mutantes (en la presente invención, mutantes erg9) crecen de manera más lenta que sus cepas de origen (sin bloquear), a pesar de la adición de ergosterol al medio de cultivo. El crecimiento más lento de los mutantes erg9 que se debe al bloque en erg9 se ilustra en el Ejemplo 1 .G, que muestra que la reparación de la mutación de erg9 reestablece ia velocidad de crecimiento de la cepa a aproximadamente aquella del origen de tipo silvestre. Ei crecimiento más lento de los mutantes erg9 podría deberse a las diferencias relacionadas al crecimiento en ergosterol exógenamente suministrado vs. ergosterol sintetizado en la célula, o podría deberse a otros factores fisiológicos. Una modalidad de la presente invención es aislar las variantes de las cepas que producen farnesol o GG con propiedades de crecimiento mejoradas. Esto podría lograrse, por ejemplo, mediante el cultivo continuo, seleccionando las variantes de crecimiento más rápidas. Tales variantes podrían ocurrir espontáneamente o podrían obtenerse mediante planteamientos genéticos moleculares o mutagénesis clásica. 2.2 Incorporación de Prenol e Isoprenol En una modalidad adicional de la presente invención, el farnesol o GG se produce por la introducción de isoprenol y/o prenol en un medio de fermentación. Con referencia a la Figura 9, cada uno de estos compuestos, cuando se toman por un organismo se fosforilan con un grupo pirofosfato para formar respectivamente, pirofosfato de 3-isopentiio y pirofosfato de 3,3-dimetilalilo. Estos dos compuestos se interconvierten mediante la acción de isomerasa de pirofosfato de isopentilo. Estos compuestos se convierten entonces en pirofosfato de farnesilo mediante la acción de sintasa FPP. El farnesol se forma mediante la desfoforilación de pirofosfato de farnesilo. El pirofosfato de farnesilo puede convertirse además en pirofosfato de geranilgeranilo. El geranilgeraniol se forma por desfoforilación de pirofosfato de geranilgeranilo. GG se formaría de FPP mediante la acción combinada de sintasa GGPP y una fosfatasa. Isoprenol y prenol son compuestos comercialmente disponibles y pueden producirse mediante métodos conocidos en la materia. En esta modalidad, el microorganismo utilizando en la fermentación puede ser cualquier microorganismo como se describe en cualquier lugar en la presente. En adición, el microorganismo puede modificarse genéticamente para incrementar la acción de transferasa de dimetilalilo para promover la producción de pirofosfato de geraniio y pirofosfato de farnesol. Los genes que codifican esta enzima de una variedad de fuentes se han identificado [Chen eí al., Protein Sci., 3, 600-607 (1994)]. Además un microorganismo puede modificarse genéticamente para incrementar la acción de quinasa de isoprenol o quinasa de prenol. Aunque estas enzimas no se han descubierto, las enzimas similares que fosforilan el farnesol y geranilgeraniol se han descrito [Bentinger eí al. , Arch, Biochem. Biophys. , 353, 191 -198 (1998); Ohnuma ef al., J. Biochem. 119, 541 -547 (1996)]. 2.3 Condiciones y Medios de Fermentación En el método de producción de farnesol o GG, un microorganismo que tiene una modificación genética, como se trata arriba se cultiva en un medio de fermentación para la producción de farnesol y GG. Un medio de fermentación eficaz, o apropiado se refiere a cualquier medio en el cual un microorganismo genéticamente modificado de la presente invención, cuando se cultiva, es capaz de producir farnesol o GG . Tal medio es típicamente un medio acuoso que comprende fuentes asimilables de carbono, nitrógeno y fosfato. Tal medio puede incluir sales apropiadas, minerales, metales u otros nutrientes. Además, cuando un organismo se bloquea en la trayectoria de ergosteroi y requiere esteróles exógenos, el medio de fermentación debe contener tales esteróles exógenos. Los medios ejemplificativos apropiados se muestran en la discusión de abajo y en la sección de Ejemplos. Sin embargo, debe reconocerse que una variedad de condiciones de fermentación son adecuadas y puede seleccionarse por aquellos expertos en la materia. Las fuentes de carbono asimilable que pueden utilizarse en un medio de fermentación adecuado incluyen, pero no se limitan a, azucares y sus polímeros, incluyendo, dextrina, sucrosa, maltosa, lactosa, glucosa, fructosa, mañosa, sorbosa, arabinosa y xilosa; ácidos grasos; ácidos orgánicos tales como acetato; alcoholes primarios tales como etanol y n-propanol; y polialcoholes tal como glicerina. Las fuentes de carbono preferidas en la presente invención inciuyen monosacáridos, disacáridos y trisacáridos. La fuente de carbono más preferida es glucosa. La concentración de una fuente de carbono, tal como glucosa en el medio de fermentación debe promover el crecimiento celular, pero que no sea tan elevado que reprima el crecimiento del microorganismo utilizado. Típicamente, las fermentaciones se realizan con una fuente de carbono, tal como glucosa, agregándose a niveles para lograr el nivel deseado de crecimiento y biomasa, pero en niveles no detectables (con los límites de detección siendo aproximadamente <0.1 g/l). En otras modalidades, la concentración de una fuente de carbono, tal como glucosa, en el medio de fermentación es mayor que aproximadamente 1 g/L, preferentemente mayor que aproximadamente 2 g/L y más preferentemente mayor que aproximadamente 5 g/L. además, la concentración de una fuente de carbono, tal como glucosa, en el medio de fermentación es típicamente menor a aproximadamente 100 g/L, preferentemente menor a aproximadamente 50 g/L, y más preferentemente menor a aproximadamente 20 g/L. Debe notarse que las referencias a las concentraciones del componente de fermentación pueden referirse tanto a concentraciones del componente inicial como/o en funcionamiento. En algunos casos, puede ser deseable permitir que el medio de fermentación se disminuya de una fuente de carbono durante la fermentación. Fuentes de nitrógeno asimilables que pueden utilizarse en un medio de fermentación adecuado incluyen, pero no se limitan a, fuentes de nitrógeno simples, fuentes de nitrógeno orgánicas y fuentes de nitrógeno complejas. Tales fuentes de nitrógeno incluyen amonio anhidro, sales de amonio y substancias de origen animal, vegetal y/o microbial. Las fuentes de nitrógeno adecuadas incluyen, pero no se limitan a, hidrolisatos de proteína, hidrolisatos de biomasa microbial, peptona, extracto de levadura, sulfato de amonio, urea y aminoácidos. Típicamente, la concentración de las fuentes de nitrógeno, en el medio de fermentación es mayor a aproximadamente 0.1 g/L, preferentemente mayor a aproximadamente 0.25 g/L, y más preferentemente mayor que aproximadamente 1 .0 g/L. Más allá de ciertas concentraciones, sin embargo, la adición de una fuente de nitrógeno al medio de fermentación no es ventajoso para el crecimiento de microorganismos. Como un resultado, la concentración de las fuentes de nitrógeno, en el medio de fermentación es menor a aproximadamente 20 g/L, preferentemente menor a aproximadamente 10 g/L y más preferentemente menor que aproximadamente 5 g/L. Además, en algunos casos puede ser deseable permitir que el medio de fermentación se disminuya de las fuentes de nitrógeno durante la fermentación. El medio de fermentación eficaz puede contener otros compuestos tales como sales inorgánicas, vitaminas, metales traza o promotores del crecimiento. Tales otros compuestos también pueden presentarse en fuentes de carbono, nitrógeno o mineral en el medio eficaz o pueden agregarse específicamente al medio. El medio de fermentación también puede contener una fuente de fosfato adecuada. Tales fuentes de fosfato incluyen tanto fuentes de fosfato inorgánicas como orgánicas. Las fuentes de fosfato preferidas incluyen, pero no se limitan a sales de fosfato tales como sodio mono o dibásico y fosfatos de potasio, fosfato de amonio y mezclas de los mismos. Típicamente, la concentración de fosfato en el medio de fermentación es mayor a aproximadamente 1 .0 g/L, preferentemente mayor a aproximadamente 2.0 g/L y más preferentemente mayor a aproximadamente 5.0 g/L. Más allá de ciertas concentraciones, sin embargo, la adición de fosfato al medio de fermentación no es ventajosa para el crecimiento de los microorganismos. De acuerdo con lo anterior, la concentración de fosfato en el medio de fermentación es típicamente menor a aproximadamente 20 g/L, preferentemente menor a aproximadamente 15 g/L y más preferentemente menor a aproximadamente 10 g/L.

Un medio de fermentación adecuado también puede incluir una fuente de magnesio, preferentemente en la forma de una sal fisiológicamente aceptable, tal como heptahidrato de sulfato de magnesio, aunque otras fuentes de magnesio en concentraciones que contribuyen cantidades similares de magnesio pueden utilizarse. Típicamente, la concentración de magnesio en el medio de fermentación es mayor a aproximadamente mayor a aproximadamente 0.5 g/L, preferentemente mayor a aproximadamente 1 .0 g/L y más preferentemente mayor a aproximadamente 2.0 g/L. Más allá de ciertas concentraciones, sin embargo, la adición de magnesio al medio de fermentación no es ventajosa para el crecimiento de los microorganismos. De acuerdo con lo anterior, la concentración de magnesio en el medio de fermentación es típicamente menor a aproximadamente 10 g/L, preferentemente menor a aproximadamente 5 g/L y más preferentemente menor a aproximadamente 3 g/L. Además, en algunos casos puede ser deseable permitir que el medio de fermentación de disminuya de una fuente de magnesio durante la fermentación. El medio de fermentación también puede incluir un agente quelante biológicamente aceptable, tal como el dihidrato de citrato de trisodio. En tal caso, la concentración de un agente quelante en el medio de fermentación es mayor a aproximadamente 0.2 g/L, preferentemente mayor a aproximadamente 0.5 g/L y más preferentemente mayor a aproximadamente 5.0 g/L. Más allá de ciertas concentraciones, sin embargo, la adición de un agente quelante al medio de fermentación no es ventajosa para el crecimiento de los microorganismos. De acuerdo con lo anterior, la concentración de fosfato en el medio de fermentación es típicamente menor a aproximadamente 10 g/L, preferentemente menor a aproximadamente 5 g/L y más preferentemente menor a , aproximadamente 2 g/L. El medio de fermentación también puede incluir inicialmente una base o ácido biológicamente aceptable para mantener el pH deseado del medio de fermentación. Los ácidos biológicamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, ácido hidroclórico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y mezclas de los mismos. Las bases biológicamente aceptables incluyen, pero no se limitan a hidróxido de amonio, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio y mezclas de los mismos. En una modalidad preferida de la presente invención, la base utilizada es hidróxido de amonio. El medio de fermentación también puede incluir una fuente de calcio biológicamente aceptable, incluyendo pero no limitándose a, cloruro de calcio. Típicamente, la concentración de la fuente de calcio, tal como cloruro de calcio, dihidrato, en el medio de fermentación se encuentra dentro del rango de desde aproximadamente 5 mg/L a aproximadamente 2000 mg/L, preferentemente dentro del rango de desde aproximadamente 20 mg/L a aproximadamente 1 000 mg/L, y más preferentemente en el rango de desde aproximadamente 50 mg/L a aproximadamente 500 mg/L. El medio de fermentación también puede incluir cloruro de sodio. Típicamente, la concentración de cloruro de sodio en el medio de fermentación se encuentra dentro del rango de desde aproximadamente 0.1 g/L a aproximadamente 5 g/L, preferentemente dentro del rango de desde aproximadamente 1 g/L a aproximadamente 4 g/L, y más preferentemente en el rango de desde aproximadamente 2 g/L a aproximadamente 4 g/L. Como se trata previamente, el medio de fermentación también puede incluir metales traza. Tales metales traza pueden agregarse al medio de fermentación como una solución madre que, por conveniencia, puede prepararse de manera separada por el resto del medio de fermentación. Una solución madre de metales traza adecuados para utilizarse en el medio de fermentación se muestra abajo en la Tabla 1 . Típicamente, la cantidad de tal solución de metales traza agregada al medio de fermentación es mayor a aproximadamente 1 mi/L, preferentemente mayor a aproximadamente 5 mL/L, y más preferentemente mayor que aproximadamente 1 0 mL/L. Más allá de ciertas concentraciones, sin embargo, la adición de un metal traza al medio de fermentación no es ventajosa para el crecimiento de los microorganismos. De acuerdo con lo anterior, la cantidad de tal solución de metales trazas agregada al medio de fermentación es típicamente menor a aproximadamente 100 mL/L, preferentemente menor a aproximadamente 50 mL/L, y más preferentemente menor a aproximadamente 30 mL/L. Debe notarse que, además de agregar metales traza en una solución madre, los componentes individuales pueden agregarse por separado, cada uno dentro de rangos que corresponden independientemente a las cantidades de los componentes dictados por los rangos anteriores de la solución de metales traza. Como se muestra abajo en la Tabla 1 , una solución de metales traza adecuada para utilizarse en la presente invención puede incluir, pero no se limita a sulfato ferroso, heptahidrato; sulfato cúprico, pentahidrato; sulfato de zinc, heptahidrato; molibdato de sodio, dihidrato; cloruro cobaltoso; hexahidrato; y sulfato manganoso, monohidrato. El ácido hidroclórico se agrega a una solución madre para mantener las sales de metal traza en solución. TABLA 1 SOLUCIÓN MADRE DE METALES TRAZAS El medio de fermentación también puede incluir vitaminas. Tales vitaminas pueden agregarse al medio de fermentación como una solución madre que, por conveniencia, puede prepararse por separado del resto del medio de fermentación. Una solución madre de vitamina adecuada para utilizarse en el medio de fermentación se muestra abajo en la Tabla 2. Típicamente, la cantidad de tal solución de vitamina agregada al medio de fermentación es mayor a 1 ml/L, preferentemente mayor a 5 ml/L y más preferentemente mayor a 10 ml/L. Más allá de ciertas concentraciones, sin embargo, la adición de vitaminas al medio de fermentación no es ventajosa para el crecimiento de los microorganismos. De acuerdo con lo anterior, la cantidad de tal solución de vitamina agregada al medio de fermentación es típicamente menor a aproximadamente 50 ml/L, preferentemente menor a aproximadamente 30 ml/L y más preferentemente menor a aproximadamente 20 ml/L. Debe observarse que, además de agregar vitaminas en una solución madre, los componentes individuales pueden agregarse por separado cada uno dentro de los rangos que corresponden independientemente a las cantidades de los componentes dictados por los rangos anteriores de la solución madre de vitamina. Como se muestra en la Tabla 2, una solución de vitamina adecuada para utilizarse en la presente invención puede incluir, pero no se limita a, biotina, pantotenato de calcuo, ¡nositol, piridoxina-HCI y tiamina-HCI Tabla 2 Como se establece anteriormente, cuando un organismo se bloquea en la trayectoria de esterol, un esterol exógeno puede agregarse al medio de fermentación. Tales esteróles incluyen, pero no se limitan a, ergosterol o colesterol. Tales esteróles pueden agregarse al medio de fermentación como una solución madre que se prepara por separado del resto del medio de fermentación. Las soluciones madre de esterol pueden prepararse utilizando un detergente para ayudar en la solubilización del esterol. Una solución madre de ergosterol típica se describe en el Ejemplo 1 . D. Típicamente, una cantidad de solución madre de esterol se agrega al medio de fermentación de tal manera que la concentración final del esterol en el medio de fermentación se encuentra dentro del rango desde aproximadamente 1 mg/L a 3000 mg/L, preferentemente dentro del rango desde aproximadamente 2 mg/L a 2000 mg/L, y más preferentemente dentro del rango desde aproximadamente 5 mg/L a 2000 mg/L. Los mecanismos de la presente invención pueden cultivarse en modos de fermentación convencionales, que incluyen , pero no se limitan a, discontinuo, discontinuo por alimentación , reciclaje celular y continuo. Sin embargo, se prefiere que el medio de fermentación se lleve acabo en modo discontinuo por alimentación. Es preferible iniciar la fermentación con concentraciones relativamente elevadas de tales componentes de manera que el crecimiento se soporta por un periodo de tiempo antes de que las adiciones se requieran. Los rangos preferidos de estos componentes se mantienen por toda la fermentación al hacer adiciones a medida que los niveles se disminuyen mediante fermentación. Los niveles de los componentes en el medio de fermentación pueden monitorearse al, por ejemplo, tomar muestras del medio de fermentación periódicamente y analizar las concentraciones. Alternativamente, una vez que el procedimiento de fermentación estándar se desarrolla, las adiciones pueden hacerse en intervalos de tiempo que corresponde a niveles conocidos en tiempo particulares durante toda la fermentación. Como se reconocerá por aquellos expertos en la materia, la velocidad de consumo de nutriente aumenta durante la fermentación a medida que la densidad de la célula del medio aumenta. Además, para evitar la introducción de microorganismo extraños en el medio de fermentación, la adición se lleva a cabo utilizando métodos de adición asépticos, como se sabe en ia materia, además, una cantidad pequeña de agente anti-espumación pueden agregarse durante ia fermentación. La temperatura del medio de fermentación puede ser cualquier temperatura agregada para el crecimiento y producción de farneso o GG. Por ejemplo, antes de la inoculación del medio de fermentación con un inoculo, el medio de fermentación puede traerse y mantenerse a una temperatura en el rango de desde aproximadamente 20°C hasta aproximadamente 45°C, preferentemente a una temperatura en el rango de desde aproximadamente 25°C hasta aproximadamente 40°C, y más preferentemente en el rango de desde aproximadamente 28°C hasta aproximadamente 32°C. El pH del medio de fermentación puede controlarse por la adición de ácido o base al medio de fermentación. En tales casos cuando el amonio se utiliza para controlar pH, también sirve convenientemente como una fuente de nitrógeno en el medio de fermentación. Preferentemente, el pH se mantiene desde aproximadamente 3.0 hasta aproximadamente 8.0, más preferentemente desde aproximadamente 3.5 hasta aproximadamente 7.0, más preferentemente desde aproximadamente 4.0 hasta aproximadamente 6.5. El medio de fermentación también puede mantenerse para tener un contenido de oxígeno disuelto durante el curso de fermentación para mantener crecimientos celulares y para mantener metabolismo celular para la producción de farnesol o GG. La concentración de oxígeno del medio de fermentación puede monitorearse utilizando métodos conocidos, tales como a través del uso de electrodo de oxígeno. El oxígeno puede agregarse al medio de fermentación utilizando métodos conocidos en la materia, por ejemplo, a través de la agitación y aeración del medio mediante agitación, sacudimiento o burbujeo. Preferentemente, la concentración de oxígeno en ei medio de fermentación se encuentra en el rango de desde aproximadamente 20% hasta aproximadamente 1 00% del valor de saturación de oxígeno en el medio en base a la solubilidad de oxígeno en el medio de fermentación a presión atmosférica y a una temperatura en el rango de desde aproximadamente 20°C hasta aproximadamente 40°C. Las caídas periódicas en ia concentración de oxígeno por debajo de este rango pueden ocurrir durante la fermentación, sin embargo, sin afectar adversamente la fermentación. En una modalidad del proceso de fermentación de la presente invención, un medio de fermentación se prepara como se describe arriba en el Ejemplo 1 . H. Este medio de fermentación se inocula con un cultivo que crece activamente de microorganismo de la presente invención en una cantídad suficiente para producir, después de un periodo razonable, una densidad celular elevada. Las densidades celulares de inoculación típica se encuentran dentro del rango de desde aproximadamente 0.01 g/L a aproximadamente 10 g/L, preferentemente desde aproximadamente 0.2 g/L hasta aproximadamente 5 g/L y más preferentemente desde aproximadamente 0.05 g/L a aproximadamente 1 .0 g/L, en base al peso en seco de las células. En la producción de termentadores a escala, sin embargo, las densidades celulares de inoculo mayores se prefieren. Las células se desarrollan a una densidad celular en el rango de desde aproximadamente 10 g/L a aproximadamente 1 00 g/L preferentemente desde aproximadamente 20 g/L hasta aproximadamente 80 g/L, y más preferentemente desde aproximadamente 50 g/L hasta aproximadamente 70 g/L. Los tiempos de residencia para los microorganismos para alcanzar las densidades celulares deseadas durante la fermentación son típicamente menores a aproximadamente 200 horas, preferentemente menores a aproximadamente 120 horas, y más preferentemente menores aproximadamente 96 horas. En un modo de operación de la presente invención, la concentración de fuente de carbono, tal como la concentración de glucosa, del medio de fermentación se monitorea durante la fermentación. La concentración de glucosa del medio de fermentación puede monitorearse utilizando técnicas conocidas, tales como, por ejemplo, el uso de la prueba de enzima de oxidasa de glucosa o cromatografía de líquido de presión elevada, que pueden utilizarse para monitorear la concentración de glucosa en el supenatátil, por ejemplo, un componente libre de célula del medio de fermentación. Como se establece previamente, la concentración de fuente de carbono debe mantenerse por debajo del nivel al cual la inhibición del crecimiento celular ocurre. Aunque tal concentración puede variar de organismo a organismo, para glucosa como una fuente de carbono, la inhibición del crecimiento celular ocurre en concentraciones de glucosa mayores a aproximadamente 60 g/L, y puede determinarse fácilmente mediante prueba. De acuerdo a lo anterior, cuando la glucosa se utiliza al fermentador y se mantiene por debajo de los limites de detección. Alternativamente, la concentración de glucosa en el medio de fermentación se mantiene en el rango de desde aproximadamente 1 g/L a aproximadamente 1 00 g/L, más preferentemente en el rango de desde aproximadamente 2 g/L hasta aproximadamente 50 g/L, y todavía más preferentemente en el rango de desde aproximadamente 5 g/L hasta aproximadamente 20 g/L. Aunque la concentración de la fuente de carbono puede mantenerse " dentro de los niveles deseados por la adición de, por ejemplo, una solución de glucosa substancialmente pura, es aceptable, y puede preferirse, para mantener la concentración de fuente de carbono del medio de fermentación por la adición de alícuotas del medio de fermentación original. El uso de alícuotas del medio de fermentación original puede ser deseable debido a las concentraciones de otros nutrientes en el medio (por ejemplo, las fuentes de nitrógeno y fosfato) pueden mantenerse simultáneamente. Del mismo modo, las concentraciones de metales trazas pueden mantenerse en el medio de fermentación por la adición de alícuotas de la solución de metales trazas. 2.4 Recuperación de Farnesol y GG Una vez que el farnesol o GG se producen por un sistema biológico, se recuperan o aislan de conversión química subsecuente en esteres de a-tocoferilo y a-tocoferol. Los presentes inventores han mostrado que tanto para farnesol como GG, el producto puede estar presente en supernatátiles de cultivo y/o asociarse con las células de levadura. Con respecto a las células, la recuperación de farnesol o GG incluye algún método para permeabilizar o disolver por la acción de lisinas las células. El farnesol o GG en el cultivo puede recuperarse utilizando un proceso de recuperación que incluye, pero no se limita a, cromatografía , extracción , extracción de solvente, separación de membrana, electrodiálisis, osmosis inversa, destilación, derivación química y cristalización. Cuando el producto se encuentra en la forma de fosfato, es decir, fosfato de geranilgeranilo o fosfato de farnesilo, solamente ocurre dentro de las células y por lo tanto, requiere algún método de permeabilización o disolución por la acción de lisinas de las células. 3.0 Síntesis Química de GG y Farnesol 3.1 Síntesis Química de GG Como se observa arriba, en una modalidad de la invención, GG se produce biológicamente, en modalidades alternativas, GG puede producirse por otros métodos. Por ejemplo, GG también puede producirse de farnesol mediante síntesis química. Muchos métodos adecuados se conocen en la materia. En uno de tales métodos, el farnesol se convierte en bromuro de farnesilo (PBr, en éter) y se somete a desplazamiento con acetoacetato de etilo. El éster keto crudo resultante se saponifica, descarboxila, y la acetona resultante se purifica mediante destilación. Siguiendo el procedimiento de Klinge y Demuth (Synlett 1993, 783), la acetona se somete a reacción de Witting-Horner con etilfosfonoacetato de diisopropilo (NaH, glime) para dar una mezcla de aproximadamente 80/20 de geranilgeronoato de t,t,t- y t,t,c-etilo. La reducción de geranilgeranoato de etilo con hidruro de diisobutilaluminio proporciona claramente GG. La mezcla de t,t,t- y t,t-c- puede separarse en el nivel de oxidación de éster (por ejemplo, mediante destilación), o alcohol (por ejemplo, mediante cristalización como se describe en EP 71 1749). La producción de farnesol como un material inicial para la producción química de GG puede llevarse a cabo mediante producción biológica, tal como por el uso de un microorganismo modificado que tíene alguna de las características modificadas arriba descritas. 3.2 Síntesis Química de Farnesol Como se observa arriba, en una modalidad de la ¡nvención, el farnesol se produce biológicamente, y en modalidades alternas, el farnesol puede producirse por otros métodos. Por ejemplo, el farnesol también puede producirse mediante síntesis química. Muchos métodos adecuados se conocen en la materia. 4.0 Producción de Tocoferol de FF mediante Síntesis Química En una modalidad adicional de la presente invención , se proporciona un método para producir vitamina E de geranilgeraniol. El geranilgeraniol contiene cuatro porciones de olefina. Como se utiliza en esta invención, las porciones de olefina de geranilgeraniol se numeran consecutivamente iniciando del termino hidroxi, es decir, la primer porción de olefina se refiere a enlace doble C2-C3, la segunda porción de olefina se refiere a enlace doble C6-C7, la tercer porción de olefina se refiere a enlace doble C10-Cp y la cuarta porción de olefina se refiere a enlace doble C? -C15. El método de la presente invención incluye reducir al menos una porción de olefina de geranilgeraniol para formar un alcohol alílico. Preferentemente, el alcohol alílico es fitol y/o isofitol. La formación del alcohol alílico puede lograrse mediante una reducción selectiva de olefinas que reduce al menos una de las porciones de olefina segunda, tercera o cuarta sin reducir la primer porción de olefina. Preferentemente, la reducción reduce todas las porciones de olefina excepto la primer porción de olefina. La reducción de una porción de olefina puede llevarse a cabo por cualquiera de las condiciones de reducción de alqueno conocidas, incluyendo reducción de diimida; reducción del metal de disolución; reducción de hidruro metálico; e hidrogenación en la presencia de un catalizador metálico tal como paladio, rodio, níquel, platino, rutenio, cobre, cromo o una combinación de los mismos. Alternativamente, una mezcla racémica de alcohol alílico puede producirse y someterse a una separación quiral para proporcionar un isómero estero deseado del alcohol alílico. En una modalidad de la presente invención, un grupo protector se agrega a geranilgeraniol antes de reducir las porciones de olefina segunda, tercera y/o cuarta. Como se utiliza en esta invención, un grupo protector se refiere a cualquier compuesto que puede agregarse a (o combinarse con) geranilgeraniol antes de la reducción de una o más porciones de olefina y removerse después de la reducción para proporcionar un alcohol alílico de geranilgeraniol. Preferentemente, el grupo protector es un grupo protector hidroxi. El grupo protector hidroxi se selecciona de tal manera que la reducción de las porciones de olefina segunda, tercera y cuarta puede lograrse selectivamente sin reducir la primer porción de olefina. Una variedad de grupos protectores hidroxi conocidos en la materia pueden emplearse. Ejemplos de muchos de estos grupos posibles pueden encontrarse en "Protective Groups in Organic Synthesis" por T.W. Green, John Wiley and Sons, 1981 , pp. 1 0-86, que se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. Preferentemente, el grupo protector hidroxi es un éster. Más preferentemente, el éster es un éster estéricamente articulado (es decir, voluminoso) que proporciona una protección suficiente de porción de olefina C2-C3 que se reduce bajo las condiciones de reducir geranilgeraniol a un alcohol alílico protegido. Los grupos éster voluminosos ejemplificativos incluyen isobutirato y pivaloato. La vitamina E se forma del alcohol alílico y una hidroquinona. Preferentemente, la hidroquinona es una hidroquinona de trimetilo, más preferentemente, ia hidroquinona es hidroquinona de 2,3,5-trimetílo. Debe apreciarse que una formación de compuestos relacionados a vitamina E (es decir, a-tocoferol) puede lograrse utilizando una hidroquinona correspondiente para un derivado de tocoferol particular. Por ejemplo, ß-, ?- y d-tocoferol pueden sintetizarse del alcohol alílico y 2,5-dimetil hidroquinona, 2,3-dimetil hidroquinona y 2-metil hidroquinona, respectivamente. Sin limitarse sin ninguna teoría, se cree que el contactar el alcohol alílico con un ácido genera un ion de carbonio que reacciona con la hidroquinona para formar vitamina E. Un ion de carbonio similar puede generarse de un derivado de halógeno de fitol. Por ejemplo, al contactar un titano halogenado tal como bromo-, cloro- o yodofitano con un ácido Lewis tal como haluro de zinc incluyendo bromuro de zinc, cloruro de zinc, y yoduro de zinc; haluro de aluminio incluyendo bromuro de aluminio y cloruro de aluminio; haluro de boro incluyendo cloruro de plata, bromuro de plata y yoduro de plata; haluro de níquel tal como cloruro de níquel y bromuro de níquel; y otros ácidos Lewis de haluro metálico, pueden generarse iones de carbonio que pueden reaccionar con una hidroquinona para formar vitamina E. La Figura 2 ilustra una modalidad particularmente preferida de síntesis de vitamina E de geranilgeraniol. Ei grupo hidroxi de geranilgeraniol 2-1 se protege como éster de isobutirato y otro éster voluminoso utilizando el ácido correspondiente o su derivado tal como anhídrido o cloruro de acilo. Genilgeranilisobutirato 2-2 se hidrogena entonces selectivamente utilizando un catalizador metálico tal como paladio en carbono para producir fitilisobutirato 2-3. La hidrogenación de genilgeranilisobutirato 2-2 reduce las porciones de olefina segunda, tercera y cuarta sin afectar la primer porción de olefina. Se cree que el volumen estérico de isobutirato reduce la velocidad de hidrogenación de la primer porción de olefina en geranilgeraniol protegido, conduciendo así una hidrogenacíón selectiva de residuos de olefina. El grupo protector hidroxi se remueve entonces mediante hidrólisis bajo una condición básica para proporcionar fitol 2-4. La reacción de fitoi 2-4 con 2,3,5-trimetil hidroquinona 2-5 en la presencia de un ácido resulta entonces en una formación de vitamina E 2-6. Alternativamente, el fitiliosbutirato 2-3 puede desprotegerse y reaccionarse con 2,3,5-trimetil hidroquinona 2-5 en una sola etapa mediante un catalizador de ácido para formar la vitamina E 2-6. La vitamina E 2-6 puede transformarse además por una vitamina protegida E tal acetato de vitamina E 2-7 mediante acetilación de la porción de hidroxi libre. Un método alternativo de síntesis química que convierte GG en esteres de a-tocoferilo o a-tocoferol incluye las siguientes etapas: (a) oxidar selectivamente el enlace doble de 2,3-carbono-carbono en geranilgeraniol 7 para producir geranilgeraniol-2,3-epóxido 8; (b) hidrogenar los tres enlaces dobles de carbono-carbono restantes en el epóxido 8 para producir para producir epoxifitol 9; (c) deshidrogenar el epoxifitol 9 para producir una mezcla de fitol 5 e isofitol 6 mediante la reacción con un aceptador de oxígeno; y (d) reaccionar la mezcla de fitol 5 e isofitol 6 con trimetilhidroquinona 4 para producir a/fa-tocoferol 3.

La etapa de oxidar selectivamente el enlace doble de 2,3-carbono-carbono en geranilgeraniol para producir geranilgeraniol-2,3-epóxido se lleva a cabo con cualquier reactivo conocido para epoxidar selectivamente la funcionalidad de olefina de alcoholes alílicos, tales como combinaciones de hidroperóxido de tert-butilo y catalizadores de vanadio o molibdeno como se enseña por el método de Sharpless y Michaelson, J. Am. Chem. Soc. 95, 61 36, (1973). El peróxido de hidrógeno y otro hidroperóxidos de alquilo podría reemplazar el hidroperóxido de tert-butilo, y los solventes inertes tales como hidrocarburos aromáticos, hidrocarburos alifáticos, hidrocarburos cicloalifáticos o esteres alifáticos pueden utilizarse. El término "hidrocarburo alifático" se utiliza para incluir los alcalenos de cadena recta o ramificada que tienen cinco a ocho átomos de carbono. El heptano es el hidrocarburo alifático más preferido. El término "hidrocarburo cicloalifático" se utiliza para incluir cicloaicanos C5-C8 y estos substituidos con uno o más grupos alquilo C?-C4. El término "hidrocarburo aromático" se utiliza para incluir benceno y benceno substituido con uno a tres grupos alquilo C?-C4. El tolueno es el hidrocarburo aromático más preferido. El término "esteres alifáticos" se utiliza para incluir esteres alifáticos que tienen tres a nueve carbonos que tienen la fórmula R!CO2R2 en donde R^ y R2 representan independientemente un grupo alquilo C1-C4 de cadena recta o ramificada, con acetato de etilo siendo el éster alifático preferido. La etapa de hidrogenar los tres enlaces dobles de carbono-carbono restantes en el epóxido 8 para producir epoxifitol 9 puede hacerse con cualquier catalizador homogéneo o heterogéneo convencional bajo una atmósfera de hidrógeno. De esta manera, los catalizadores soportados tales como paladio en carbono, platino en carbono, óxido de platino, níquel Raney, y lo similar pueden utilizarse en un nivel de aproximadamente 0.001 a 0.2 partes en peso con respecto a 8, con o sin solvente inerte tales como esteres alifáticos, alcanoles, hidrocarburos aromáticos, éteres o hidrocarburos alifáticos o cicloalifáticos, bajo una presión de desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 200 atmósferas de presión de hidrógeno a temperaturas desde aproximadamente 0 grados C hasta aproximadamente 150 grados C. El término "alcanol" se utiliza para representar alcoholes de la formula R3-OH y alcoholes substituidos de la fórmula R3OCH2CH2OH, en donde R3 representa un grupo alquilo C1-C de cadena recta o ramificada. El término "éter" se utiliza para representar éteres que tienen ia fórmula R1-O-R2, en donde R? y R2 son como se define arriba y tetrahidrofurano. La etapa de desoxigenar el epoxifitol 9 para producir una mezcla de fitol 5 e isofitol 6 mediante ia reacción con un aceptador de oxígeno puede ser una reacción de transferencia de oxígeno catalizada por renio y puede hacerse transparente o en la presencia de un solvente inerte tal como hidrocarburos aromáticos, hidrocarburos alifáticos, hidrocarburos cicioalifáticos, esteres alifáticos, alcanoles, éteres o agua. La reacción también puede llevarse a cabo en un sistema de solvente orgánico al agua de 2 fases con o sin ia adición de un catalizador de trasferencia de fase. El catalizador puede ser un trióxido de renio substituido o una forma soportada de polímero de tal compuesto de trióxido de renio. El catalizador puede utilizarse en un nivel de desde aproximadamente 0.01 -5.0 por ciento en peso en base a 9. El aceptador de oxígeno debe estar presente en un nivel de 1 .0-3.0 moles por mol de 9 y puede elegirse de triarilfosfinas, tri-Ci-Cß alquilfosfinas, fosfitos de triarilo, tri-Ci-Ciß alquilfosfitos, hipofosfitos de metal álcali o ácido hipofosfórico. Otros compuestos capaces para aceptar irreversiblemente oxígeno de 9 puede utilizarse, tal como sulfuros de di-C?-Cß alquilo y ciertas bases de nitrógeno tales como alquilmorfolinas N-C^Ce. El término "arilo" se utiliza para incluir fenilo y naftiio y estos substituirse con uno a tres grupos alquilo Ci-C6. El término "aralquilo" se utiliza para incluir radicales monovalentes que tienen estructura de arilo (CH2)n-, en donde n = 1 a 4. El término "trióxido de renio substituido" se utiliza para incluir los compuestos de la fórmula R-ReO3, en donde R es un grupo hidrocarbilo seleccionado del grupo que consiste de alquilo C1-C10, arílo Cß-C?o, aralquilo, ciclopentadienilo y ciclopentadienilo substituido con uno a cincos grupos alquilo C1-C . Debe notarse que la etapa de desoxigenar el epoxifitol en la presente invención, tal como por la reacción con trifenilfosfina u otro aceptador de oxígeno adecuado bajo catálisis mediante un compuesto de renio tal como trióxido de metilrenio, es una reacción nueva e inesperada. El uso de trióxido de metilrenio como un catalizador en una variedad de reacciones orgánicas se ha revisado [Schmidt (J. Prakt. ChemJChem.-Ztg. 339, 493-496 (1997)]. Espenson y Zhu f(J. Molecular Catálisis A: Chemical 103. 87-94 (1995)] dio seis muestras del uso de MTO para catalizar la transferencia de oxígeno de epóxidos a trifenilfosfina con la formación de olefinas. Debe notarse que todos los ejemplos de Espenson y Zhu de generación de olefina de epóxidos incluyeron hidrocarburos no funcionales simples tales como ciciohexano, estilbeno, ciclododecano, y así sucesivamente. Estos empleados no demostraron la viabilidad de llevar a cabo tal transformación en una molécula que contiene funcionalidad adicional tal como grupo hidroxilo primario. De hecho, Espenson y Zhu mostró subsecuentemente (J. Org. Chem. 61 , 324-328 (1996) que MTO cataliza la deshidratación de alcoholes primarios con la formación de éteres e hidrocarburos oléfinicos. Por lo tanto es inesperado y sorprendente descubrir que MTO/trifenilfosfina, cuando se aplica a epoxifitol dio una buena producción de productos de alcohol alílico tal como isofitol y fitol. La etapa de reaccionar la mezcla de fitol 5 e isofitol 6 con trimetilhidroquinona 4 para producir a/fa-tocoferol 3 se conduce en la presencia de un catalizador ácido, con frecuencia un ácido Lewis tal como cloruro de zinc, como se hace convenientemente en procesos conocidos. Se ha determinado que una mezcla de fitol 5 e isofitol 6 puede utilizarse para preparar a/fa-tocoferol en la misma producción como cualquier precursor solo. Los compuestos ejemplificativos específicos de términos genéticos utilizados en la presente que son adecuados para utilizarse en la presente invención son como sigue. Los solventes aromáticos típicos incluyen benceno, tolueno y o, m o p-xileno o mezclas de los mismos. El tolueno es el solvente aromático preferido. Los solventes alifáticos típicos incluyen n-pentano, n-hexanol, n-heptano y n-octano e isómeros de los mismos, n-Heptano es el hidrocarburo alifático preferido. Los hidrocarburos cicloalifáticos típicos incluyen ciclopentano, ciciohexano, metilciclohexano y cicioheptano. Los esteres alifáticos típicos incluyen acetato de metilo, acetato de etilo, acetato de n-propilo, acetato de n-butilo, acetato de isopropilo, propíonato de metilo, propionato de etilo, butirato de metilo y butirato de etilo. El acetato de etilo es el éster alifático preferido. Los alcanoles y alcanoles substituidos típicos incluyen metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol, 2-metoxietanol, 2-etoxietanol y 2-isopropoxietanol. Los éteres típicos incluyen éter de dietilo, éter de diisopropilo, éter de dibutilo, éter de metilo n-butilo, éter de metilo t-butilo y tetrahidrofurano. Los ácidos Lewis útiles incluyen cloruro de zinc, cloruro de aluminio, trifluoruro de boro, cloruro férrico y ácido fosfórico. El cloruro de zinc es el ácido Lewis preferido. 5.0 Farnesol para Vitamina E. En todavía otra modalidad de la presente invención, se proporciona un método para producir la vitamina E de farnesol. Este método incluye generalmente convertir farnesoi en un primer compuesto intermedio que comprende un número suficiente de átomos de carbono para formar al menos un grupo substituyente de trímetiltridecilo de vitamina E cuando el compuesto intermedio se reacciona subsecuentemente con una hidroquinona apropiada para formar vitamina E. El método incluye además reaccionar el compuesto intermedio con una hidroquinona para formar vitamina E.

Preferentemente, el compuesto intermedio contiene un número suficiente de átomos de carbono para formar tanto substituyentes como metilo y trimetiltridecilo en ia 2 posición de la porción anular de cromano de vitamina E. Más preferentemente, el compuesto intermedio se selecciona del grupo que consiste de fitol e isofitol. El compuesto intermedio puede prepararse al oxidar farnesol a farnesal. Ejemplos de oxidación de un alcohol a un aldehido pueden encontrarse en "Advanced Organic Chemistry Part B: Reaccionas and Synthesis" 2da Ed. Carey y Sundberg, Plenum Press, 1983, pp. 481 -490, que se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. Por ejemplo, el farnesol puede oxidarse en farnesal utilizando dióxido de magnesio; óxidos de cromo tales como trióxido de cromo y dicromatos; óxido de plata; condiciones de oxidación Swern; y condiciones de oxidación Oppenauer. Además, farnesol puede oxidarse a través de una oxidación de aire catalítico utilizando un catalizador como se describe por Marko ef al. , Science, 1996, 274, 2044. Generalmente, esta oxidación de aire de farnesol en farnesal incluye utilizar cantidades catalíticas de cloruro cuproso, 1 , 10-fenatrolina, di-t-butilhidraxodicarboxilato, y carbonato de potasio en exceso, en un solvente relativamente no polar tal como tolueno o benceno en aproximadamente 80°C. El método para producir vitamina E de farnesol puede incluir además formar una acetona de metilo de farnesal. La acetona de metilo puede formarse mediante una variedad de métodos que incluyen condensación de aldol con una acetona apropiada tal como acetona o sus equivalentes. Por ejemplo, la condensación de aldol de farnesal con acetoacetato seguido por una reacción de decarboxilación proporciona el mismo producto de acetona de metilo como una condensación de aldol de farnesal con acetona. La acetona de metilo puede también formarse utilizando un reactivo Horner-Emmons-Wadsworth o Witting apropiado. El uso de estos reactivos se describe, por ejemplo, en "Advanced Organic Chemistry", 3ra Ed, J. March, John Wiley & Sons, 1985, pp. 845-854, que se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. El método para producir vitamina E de farnesol puede incluir además reducir las porciones de olefina en la acetona de metilo para formar una acetona de metilo de alquilo. Una reducción de porciones de olefina se trata arriba en la sección que considera la producción de vitamina E de GG y se incorpora en la presente para referencia. Preferentemente, la acetona de metilo de alquilo es 6, 10, 14-trimetil pentadecan-2-ona. La acetona de metilo de alquilo se convierte entonces en un alcohol alílico. El alcohol alílico puede producirse al agregar un acetiluro tal como acetiluro de litio, acetiluro de sodio acetiluro de haluro de magnesio y reducir parcialmente el grupo acetileno resultante en un grupo vinilo. Alternativamente, el alcohol alílico puede formarse directamente por otros métodos bien conocidos en la materia, tal como al reaccionar la acetona de metilo alquilo con un anión de vinilo tal como haluro de magnesio de vinilo, litio de vinilo o sodio de vinilo. La formación de vitamina de un alcohol alílico se trata arriba con respecto a la producción de vitamina de geranilgeraniol. Una modalidad particularmente preferida para sintetizar la vitamina E de farnesol se ilustra en la Figura 3. El farnesol 3-8 se oxida en farnesal 3-9 bajo condiciones de oxidación Oppenauer utilizando isopropóxido de aluminio y acetona. Farnesal 3-9 se convierte entonces en acetona dehidrofarnesilo 3-10 mediante una reacción de condensación de aldol con acetona. La reducción de porciones de olefina en acetona de dehidrofarnesilo 3-10 mediante deshidrogenación produce entonces 6, 10, 14-trimetilpentadecan-2-ona 3-11. La adición de acetiluro a la acetona 3-11 genera entonces alcohol propargílico 3-12 que se reduce parcialmente utilizando condición de hidrogenación Lindiar para producir isofitol 3-13. La reacción de isotitol 3-13 con 2,3,5-trimetil hidroquinona 3-5 en la presencia de un catalizador ácido produce entonces vitamina E. 6.0 Producción de Gamma-tocoferol Con referencia a la Figura 1 0, una modalidad adicional de la presente invención es un método para la preparación económica de gamma-focoferol sintético. Este proceso incluye someter un tocotrienol 4-cromanona que tiene la fórmula del compuesto 10 para hidrogenación catalítica para reducir tres enlaces dobles de cadena lateral y el grupo 4-keto para proporcionar gamma-tocoferol 11 . El compuesto inicial 10 se conoce y puede producirse como sigue. La farnesilacetona 1 2 y 2,5-dihidroxi-3,4-dimetilacetofenona 13 se dejan reaccionar en la presencia de un catalizador básico para proporcionar el compuesto de tocotrieno 4-cromanona 10. Esta reacción se conoce en la materia. El método general se describe por Kabbe y Heitzer (Síntesis 1978, 888), y esta reacción exacta se publicó por Pearse eí al., (J. Med. Chem. 37. 526 (1 994). Además, la cromanona 10 se aislo de una fuente natural y se describe por Lañe eí al. , en la Patente de E.U. No. 5,591 , 772 (1 997). En contraste, la etapa de hidrogenar tocotrienol 4-cromanona es tanto novedosa como inesperada. Kabbe y Heitzer (Síntesis 1978, 888), reportó que en las series a/fa-tocoferol, , 4-cromanona se convirtió en alfa-tocoferol a través de una secuencia de tres etapas. Primero, el grupo acetona de 4-cromanona se redujo en un alcohol utilizando borohidruro de sodio y después agua se eliminó para dar un tetraeno. Este compuesto se somete entonces a hidrogenación catalítica para producir alfa-tocoferol. El uso de tal secuencia de múltiples etapas incluye el borhidruro de sodio de reactivo costoso es claramente indeseable, pero necesario. Ahora se ha determinado que 4-cromanona preparada utilizando el procedimiento de Kabbe y Heitzer no se convierte en a/fa-tocoferol mediante hidrogenación catalítica sola. Los intentos para llevar a cabo esta invención conducen en su lugar a la formación de una acetona saturada. De esta manera no fue posible reducir el grupo carbonilo de 4-cromanona mediante hidrogenación catalítica. Es por lo tanto inesperado y sorprendente que la hidrogenación de series gamma homologas de una acetona 10 a tocoferol 1 1 puede llevarse a cabo en producción excelente por medio de una hidrogenación catalítica de una etapa económica, simple sobre catalizadores de cromita de cobre o níquel. Tal método de conversión es más preferible que el proceso de múltiples etapas que incluye un agente reductor de hidruro como se enseña por Kabbe y Heitzer. La hidrogenación catalítica de tocotrieno 4-cromanona 10 en gamma-tocoferol 1 1 puede hacerse utilizando catalizadores heterogéneos tales como cromito de cobre o níquel Raney a temperatura elevada y presión de hidrógeno. Los catalizadores pueden utilizarse en un nivel de aproximadamente 0.001 a 0.3 partes en peso con respecto al tocotrieno 4-cromanona, con o sin un solvente inerte tal como metanol, etanol, isopropanol, esteres afifáticos, éteres, y lo similar. La reacción puede llevarse a cabo a temperaturas en el rango de aproximadamente 50°C a aproximadamente 250°C y más preferentemente, en el rango de aproximadamente 1 35°C a aproximadamente 1 75°C. La reacción puede llevarse a cabo a presiones de hidrógeno que varían desde aproximadamente 100 psi hasta aproximadamente 3000 psi de hidrógeno, y preferentemente variando desde aproximadamente 400 psi hasta aproximadamente 750 psi de hidrógeno. El tiempo de reacción puede variar entre aproximadamente 0.5 a 48 horas. Los catalizadores diferentes a cromito de cobre y níquel Ranye pueden utilizarse en el proceso de esta invención. Tales catalizadores pueden incluir, pero no se limitan a, catalizadores de metales preciosos tales como platino homogéneo o soportado, paladio, rodio, óxido de platino y sus derivados y cobalto Raney. 7.0 Producción biológica de fitol de GGPP a GG.

La presente invención proporciona métodos para la conversión química de GG en fitol o una mezcla de fitol e isofitol. El fitol o una mezcla de fitol más isofitol puede entonces reaccionarse con una hidroquinona en la presencia de un ácido para formar vitamina E, como se describe en cualquier parte en la presente. Recientemente, el gen que codifica la enzima de reductasa de geranilgeranilo se clona de ecotipo Arabidopsis thaliana Columbia [Keller eí al., Eur. J. Biochem. 251 : 413-417 (1998)]. Esta enzima cataliza la reducción gradual de geranilgeranil-clorofilo en fitil-clorofilo así como la reducción de GGPP en d?fosfato de fitilo. Con respecto a la presente invención, una reductasa de geranilgeranilo se utiliza en un sistema biológico para substituir la conversión química de GG en fitol. Por ejemplo, la reductasa de geranilgeranilo se expresa en una cepa mutante erg9 de S. cerevisiae que también expresa una actividad de sintasa GGPP. La reductasa reacciona con GGPP formada in vivo para producir difosfato de fitilo. Una fosfatasa convierte entonces el disfosfato de fitilo en fitol, como ocurre en las cepas que producen farnesol y GG descritas en secciones anteriores. El microorganismo resultante produce fitol directamente de un substrato de crecimiento tal como glucosa en una fermentación única. Alternativamente, para una reductasa de geranilgeranilo capaz de utilizar GG como un substrato, se proporciona un proceso biológico en donde GG se produce por fermentación (como se describe en secciones anteriores) y se purifica al grado necesario para utilizarlo como un almacenamiento de alimentación para un proceso de biotransformación. La biotransformación utiliza reductasa de geranilgeranilo para convertir GG en fitol en una etapa. Esta biotransformación utiliza ya sea reductasa de geranilgeranilo aislada o células completas que contienen actividad de reductasa de geranilgeranilo. La enzima o células se Inmovilizan en un soporte o mediante degradación para aumentar la biotransformación. Se anticipa que la reductasa de geranilgeranilo se modificaría mediante manipulaciones genéticas para aumentar su actividad para la producción de fitol en un proceso biológico industrial. El fitol formado en un proceso biológico utilizando reductasa de geranilgeranilo se recupera y purifica al grado necesario para permitir la reacción con una hidroquinona en la presencia de un ácido para proporcionar vitamina E. Los siguientes Ejemplos se proporcionan para ilustrar las modalidades de la presente invención y no se proponen para limitar el alcance de la invención como se establece en las reivindicaciones. EJEMPLOS Eiemplo 1 Este ejemplo describe la creación de mutantes erg9 mediante mutagénesis química de cepa de S. cerevisiae ATCC 28383 utilizando ácido nitroso. Como se observa arriba, una manera de incrementar las producciones de farnesol o GG es reducir o eliminar la actividad de sintasa de escualeno. En S. cerevisiae, la sintasa de escualeno se codifica por el gen ERG9.

A. Mutagénesis La cepa 28383 se obtuvo de ATCC. Es el origen de la cepa 60431 utilizada abajo para algunos experimentos para propósitos comparativos (también obtenida de ATCC). La cepa 60431 es un mutante erg9-1 que produce farnesol. Una curva de eliminación se llevó a cabo utilizando ácido nitroso con ATCC 28383. Utilizando la formación derivada de la curva de eliminación, una mutagénesis de ATCC 28383 con ácido nitroso se llevó a cabo como sigue. Las células 28383 se incubaron durante la noche a 30°C en medio YPD (1 % de extracto de Bacto-levadura, 2% de Bacto-peptona, y 2% de glucosa) con agitación. Las células se enjuagaron y mutagenizaron . Después de la mutagénesis, las células se dejaron recuperar al cultivarlas en YPDC (YPD más 4 mg/L de colesterol) a 22°C durante la noche. El cultivo se enjuagó entonces y colocó en agrá YPDC (YPDC más 2% de Bacto-agar) que contiene varios niveles de nistatina (20, 30, 40, 50, mg/L). Estos cultivos se incubaron durante dos semanas a 22°C. La nistatina antibiótica de polieno antifúngica inhibe la síntesis de cavidad celular para desarrollar células mediante el enlace de manera específica a ergosterol, que a su vez, resulta en una alteración de permeabilidad selectiva. Algunas cepas que son resistentes a nistatina se han mostrado que tienen producción reducida de colesterol. La nistatina tiene poca, si es que nada, de afinidad para el colesterol que, cuando se suministra de manera exógena, puede utilizarse mediante auxotrofos de esterol tan eficientemente como ergosterol. Aproximadamente 3,000 colonias resistentes a nistatina se obtuvieron. Se seleccionaron por sensibilidad a la temperatura (ts) y auxotropía de esterol. Para determinar la sensibilidad a la temperatura, las células mutagenizadas se desarrollaron en YPDC a una temperatura permisible (22°C) se colocaron réplicas en agar YPD e incubaron a una temperatura restrictiva (37°C). Cualquiera de las células dejan de crecer a la temperatura más elevada podrían incluir aquellas tanto con un defecto condicionalmente letal como un defecto constitutivamente letal en la trayectoria de esterol. Los mutantes sensibles a la temperatura se seleccionaron para auxotrofía de esterol mediante colocar las réplicas en agar YPD (falta de colesterol) e incubación durante la noche a 28°C. De las 3,000 colonias resistentes a nistatina, 170 se salvaron después de la confirmación de ts y auxotrofía de esterol. B. Análisis de Tubo Las 170 cepas se evaluaron inicialmente en análisis de tubo para la producción de farnesol y otros compuestos intermedios de la trayectoria de isprenoide como sigue. Las células se cultivaron en 1 0 ml de YPDC en tubos con tapones de rosca durante 48 horas a 28°C con agitación . Las células se centrifugaron por 5-10 minutos a 2800 rpm, y el supernatátil se transfirió a otro tubo. Las células se enjuagaron una vez con 5 ml de agua destilada y centrifugaron de nuevo por 5-10 minutos a 2800 rpm. La pastilla celular se extrajo al agregar 2.5 ml de 0.2% de pirogalol (en metanol) y 1 .25 ml 60& de KOH (en H2O destilada), ponerlos en vórtice para mezclar, e incubar en un baño de agua a 70-75°C durante 1 .5 horas. Después de esta saponificación, 5 ml de hexano se agregaron, y el tubo se volvió a tapar y se puso en vórtice por 1 5-30 segundos. El tubo se centrifugó a 2800 rpm durante 5 minutos para separar las fases. La capa de hexano se recuperó. Si es necesario, la muestra puede concentrarse al evaporar solvente bajo nitrógeno y agregar de nuevo una cantidad apropiada de hexano para su análisis. Para extraer el supernatátil, 5 ml de hexano se agregaron al supernatátil, y el tubo se volvió a tapar y se puso vórtice por 15-30 segundos. El tubo se centrifugó a 2800 rpm por 25 minutos para separar las fases. La capa de hexano se recuperó, y la muestra se concentró al evaporar bajo nitrógeno y agregar de nuevo una cantidad de hexano para su análisis. Los extractos de hexano de esta primer selección se analizaron por cromatografía de capa delgada (TLC) con confirmación mediante cromatografía de gas (GC)/espectrometría de masa (MS) para la presencia de farnesol u otros compuestos intermedios de la trayectoria de isoprenoide. TLC se llevó a cabo en placas de gel de sílice C1 8 de fase inversa 6:4 (v/v) etilacetato/acetonitrilo (EtOAc/MeCN) como la fase móvil y 2% (p/v) de ácido fosfomolibdíco (PMA) en etanol para detección . GC/MS se llevó a cabo utilizando un detector selectivo de masa de Hewlett Packard series 5890 GC y 5970. La columna utilizada fue una sistema de película de 1 µm (1 5 m de longitud, 0.25 mm ID). Treinta mutantes se identificaron como los productores de farnesol y otros compuestos intermedios. C. Análisis de Matraz Vibrante Estos treinta mutantes se seleccionaron en matraces de agitación, junto con la cepa origen, 28383, y la cepa que produce farnesol, 64031 . Cincuenta ml de medio YPDC en 250 ml de matraces Erlenmeyer desviados se inocularon con cultivos durante la noche en una OD inicial a 600 nm de 0.05 y se incubaron con agitación a 28°C. Los matraces se muestrearon, y OD a 600 nm, peso en seco y contenido de esterol se determinaron. Para medir el peso en seco, 5 mi del cultivo se centrifugaron a 8,000 rpm. Las células se enjuagaron dos veces con H2O destilada, y la pastilla celular se resuspendió en 3-5 ml de H2O destilada y se transfirió a un recipiente de peso en seco pre-pesado. El recipiente se colocó en un horno a 100°C durante 24 horas, después se enfrió en un disecador, se pesó en una báscula analítica, y el peso en seco g/L se determinó de la fórmula: [Peso total (recipiente+células) - peso del recipiente] x 200 = peso en seco en g/L. Para determinación de esterol, 20 ml de cultivo se procesaron , y la pastilla celular y el supernatátil se extrajo, y farnesol y otros esteróles se midieron como se describe arriba. Siete de los 1 3 mutantes parecieron producir compuestos intermedios en la trayectoria de ergosterol y se evaluaron además en otros experimentos de Matraz Vibrante (ver abajo). Todos los 1 3 mutantes se han seleccionado por su resistencia a los niveles más elevados de nistatina. Los cultivos durante la noche se utilizaron para inocular 50 ml de medio YPDC en matraces de agitación triplicada para cada una de las siete cepas mutantes (MBNA1 -1 , MBNA1 -5, MBNA1 -9, MBNA1 -1 0, MBNA1 -1 1 , MBNA1 -1 3, MBNA1 -14), la cepa origen 28383 y la cepa mutante 64031 . Las células y medios se extrajeron por separado en 24, 48 y 72 horas en hexano, como se describe arriba. El análisis de peso en seco (llevado a cabo como se describe arriba) se realizó en cada uno de estos puntos de tiempo para determinar la densidad de la célula. Los extractos de hexano se analizaron por GC/MS para sus niveles de farnesol, escualeno, colesterol y ergosteroí. Los resultados de farnesol se presentan en la Tabla 3 de abajo. Los niveles inferiores de farnesol se encuentran en los supernatátiles de cultivo con niveles muchos más elevados que se acumulan en las células. La cepa MBNA1 -1 produjo 1 % de farnesol y también hizo 0.1 % de ergosterol en 72 horas. La cepa MBNA1 -5 no hizo ningún farnesol, pero produjo 0.3% de escualeno. La cepa MBNA1 -9 produjo 0.64% de farnesol en 48 horas. MBNA1 -1 0, MBNA1 -1 1 , y MBNA1 -14 produjeron niveles muy bajaos de farnesol en las células y parecen hacer ergosterol. MBNA1 -13 mostró la producción de farnesol más elevada (2.5%) en base al peso en seco de la célula (cultivo de 42, 1 87 ng/ml), y no mostró ninguna producción de ergosterol. De esta manera, entre las cepas que producen farnesol (MBNA1 -1 , MBNA1 -9 y MBNA1 -1 3), parece haber diferentes grados de bloqueo en la trayectoria de ergosterol, ya que MBNA1 -1 y MBNA1 -9 produjeron niveles inferiores de farnesol y no requieren ergosterol para crecer, y MBNA1 -1 3 produjo el nivel más elevado de farnesol y tuvo un requerimiento estricto para la suplementación de esterol para crecimiento. La cepa origen 28383 mostró producción de ergosterol hasta 0.4% (sin producción de farnesol), y cepa mutante erg9 64031 mostró acumulación a aproximadamente 0.4%. TABLA 3 Caracterización de Nuevos Mutantes en Experimento de Matraz Vibrante D. Análisis de Enzima Para todos los análisis de enzima, las células crecieron en medio YPDE. (Medio YPD que contiene 5 mg/L de ergosterol). Las células se recolectaron mediante centrifugación . Un gramo de las células (peso húmedo) se suspendió en 4 ml de 0.1 M Tris • HCl, pH 7.0. La suspensión celular se interrumpió entonces por el pasaje a través de una célula de presión Francesa (20,000 psi). La suspensión celular resultantes (disueltas por la acción de lisinas) se centrifugó entonces (1 5,000 x g) y el supernatátil (extracto libre de célula) se utilizó directamente para el análisis de enzima al menos que se note de otra manera. Los mutantes se analizaron para actividad de sintasa de escualeno. Ei análisis de sintasa de escualeno incluyó la incubación de un extracto sin sella con FPP en la presencia de forma reducida de fosfato de dinucleótido adenina de nicotaminda (NADPH), extracción en acetato de etilo, y detección de escualeno por GC. Específicamente, 0.1 M Tris/HCl pH 7 (XµL), 0.1 M DTT (2µL), 0.1 M MgCI2 (1 0 µL), 0.1 M NADPH (4 µL), 1 mg/ml FPP (6 µL), y extracto libre de célula (7000 x g de supernatátil) (YµL), en donde X + Y = 1 78 µL para hacer 200 µL total, se combinaron. Esta mezcla se incubó en tubos de vidrio a 37°C durante 40 minutos. Después, se extrajeron con 0.1 5 mL de acetato de etilo. El extracto se transfirió a frascos de plástico y centrifugó a 1 5,000 x g por 5 min . El extracto de acetato de etilo se analizó utilizando GC/MS .

La Tabla 4 muestra los niveles de sintasa para los mutantes MBNA1 -1 , MBNA1 -9, MBNA1 -1 3, y cepas ATCC 64031 y 28383. La actividad de síntesis de escualeno fue de 0.12 µg de escualeno formado/min x mg de proteína para el organismo 28383 tipo silvestre. Los niveles de actividad para las otras cuatro cepas fueron límites menos detectables de este análisis. Los niveles de sintasa de escualeno reducidos se esperarían para MBNA1 -1 , MBNA1 -9 y 64031 ya que se han caracterizado por ser mutantes parcialmente bloqueados que producen farnesol y cantidades inferiores de ergosterol. MBNA1 -1 3, es un mutante que produce farnesol que no puede crecer sin esterol agregado, así este mutante bloqueado podría esperarse que no tenga ningún nivel detectable de sintasa de escualeno. Los extractos de estas cepas se vuelven a analizar con concentración más elevadas de extracto libre de célula y tiempos de incubación más largos. De nuevo, la sintasa de escualeno no se detectó en ninguno de los mutantes. TABLA 4 ND = No detectado Un análisis de enzima se realizó para las cepas que producen farnesol (MBNA1 -1 , MBNA1 -9 y MBNA1 -1 3) y su cepa origen, 28283. Los niveles de enzima comparados son aquellos de la tiolasa CoA acetoacetilo, sintasa HMG-CoA, reductasa HMG-CoA, sintasa FPP y una fosfatasa. Los extractos libres de célula se preparan como se describe arriba. Para el análisis de sintasa FPP, 0.1 M DTT (2µL), 0.1 M MgCI2 (2µL), 1 mg/mL IPP (6 µL), 1 mg/mL GPP (6 µL), extracto libre de célula (Y), y 0.1 M Tris/HCl (pH 7.0) (X µL), en donde X+Y= 84 µL se combinaron, e incubaron a 37°C durante 1 5 min. Esta mezcla se extrajo entonces dos veces con 0.3 mL de hexano para remover el farnesol pre-existente. Después, 0.1 mL de 2 x regulador de glicina (0.2 M de glicina, 2 mM de MgCI2, 2mM Zn Cl2), pH 10.4, y 33 unidades fosfatasa de alcalina se agregaron, y la mezcla se incubó a 37°C durante una hora. La mezcla se extrajo con 0.1 mL de acetato de etilo y se secó con sulfato de sodio. Farnesol se determinó con GC. Un control sin fosfatasa se incluyó en cada análisis. La reductasa HMG-CoA cataliza la reacción de HMG-CoA con NADPH para formar fosfato de dinucieótido de adenina de n?cotamida (NADP), mevalonato y CoA (ver Figura 1 ). Para estos análisis, los extractos libres de célula se prepararon como se describe arriba excepto que las suspensiones de la célula interrumpidas se centrifugaron a 7,000 c g en ligar de 1 5, 000 x g . La reacción se siguió al monitorear el consumo de HMG-CoA mediante cromatografía de líquido de desempeño elevado (HPLC). Para el análisis, una mezcla de reacción que contiene (en un volumen final de 0.1 ml) 0.1 M Na2H2P2O, pH 6.5, 2 mM DTT, 1 mM NADPH, 0.4 mM HMG-CoA, y extracto libre de célula (el volumen de extracto se varió), con el equilibrio de la reacción de 0.1 ml hecho con 0.1 M Na2H2P2O, pH 6.5) se incubó a 37°C durante 15 minutos. La reacción se monitoreó con HPLC (columna de fase inversa Luna C1 8 (Phenomex) utilizando un gradiente de 0% de Solvente B durante 1 min. , seguido por 0-1 1 % de B durante 42 min. El Solvente A fue 86: 14 (v/v) de fosfato de potasio (pH 6.0)/metanol. El Solvente B fue metanol. La longitud de onda para la detección fue 260 nm): La sintasa HMG-CoA convierte CoA acetoacetilo y CoA acetilo en HMG-CoA y CoA. El análisis monitorea la producción de HMG-CoS mediante HPLC. Para el análisis, 0.1 M Na2H2P2O, pH 6.5, (X µL), 20 mM de CoA de acetoacetilo (4 µL), 20 mM de CoA de acetilo (2 µL), y extracto libre de célula (Y µL), en donde X+Y es 94 µL (volumen total 1 00 µL), se combinaron e incubaron a 37°C durante 5 minutos. Después, la mezcla de reacción se calentó a 60°C durante 5 minutos para inactivar la enzima, seguida por centrifugación en una microfuga a velocidad completa de 5 minutos. El supernatátil se analizó por HPLC. La tiolasa de CoA de acetoactilo cataliza una reacción reversible, mediante la cual, en la dirección hacia delante, dos moléculas de CoA de acetilo se reaccionan para formar CoA y CoA de acetoacetilo. El análisis monitorea la formación de CoA de acetilo (reacción inversa) mediante HPLC. Para el análisis, 0.1 M Na2H2P2O, pH 6.5, (X µL), 20 mM de CoA de acetoacetilo (2 µL), 20 mM de CoA (3 µL), y extracto libre de célula (Y µL), en donde X+Y es 95 µL (volumen total 1 00 µL), se combinaron e incubaron a 37°C durante 5 minutos. Después, la mezcla de reacción se centrifugó en una centrífuga Microcon-10 (Amicon) para separa la enzima del producto. El supernatátil se analizó por HPLC. El análisis de fosfato cuantifica la actividad de fosfatasa al medir la formación de p-nitrofenol (absorbencia incrementada a 400 nm). Para el análisis de fosfatasa, 0.1 M de Tris-HCl, pH 7 (X µL), 1 M MgCI2 (2 ul), 50 mM de p-nitrofeil fosfato (10 ul) y extracto libre de célula (Y ul), en donde X + Y = 1 mL, se combinaron e incubaron a 37°C durante 15 minutos, después de los cuales la absorbencia a 400 nm se midió. La Tabla 5 muestra los niveles para cada uno de ias cinco enzimas en estas cuatro cepas. Los niveles de tiolasa de CoA de acetoacetilo fueron comparables en todas estas cepas. Los niveles de reductasa de HMG-CoA y sintasa HMG-CoA parecieron ser dos a tres veces más elevados en las cepas mutantes. Los niveles de sintasa FPP fueron ios mismos o inferiores en los mutantes que en 28383. Los niveles de fosfatasa parecen elevarse tres a cuatro veces en cepas mutantes en comparación al origen. Ya que todas las cepas se aislaron mediante mutagénesis clásica, es posible que otras mutaciones existan en estas cepas, más allá de la mutación de erg9.

Tabla 5 E. Análisis Genético ERG9 ADN cromosómico se preparó de cepas ATCC 28383, MBNA1 -1 , MBNA1 -9 y MBNA1 -1 3 de acuerdo al método descrito en Sherman eí al. (Sherman, F. , G.R. Fink, y J. B. Hicks, 1 989, Methods ¡n Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY). El ADN genómico se digirió con las enzimas de restricción Apal y Nsil y se sometió a análisis blot Southern utilizando un fragmento de ADN de ERG9 biotilinado como una prueba. La prueba de ERG9 consistió de un fragmento de ADN de ERG9 de 2044 bp aislado de un gel de agarosa después de la digestión del plásmido pTWM1 03 con Apal y ?/s/l. pTWM1 03 consiste del gen ERG9 y las secuencias de flanqueo que se extienden desde la posición #10916 a #1 3868 de la secuencia de Acceso del Banco de Genes #U00030. Este plásmido se construyó mediante amplificación por reacción en cadena de polimerasa (PCR) del gen ERG9 y las regiones de flanqueo utilizando los siguientes dos oligonucleótidos: 5'-oligo = VE107-5 CTC AGT ACG CTG GTA CCC GTC AC (denotada en la presente como SEQ ID NO: 1 ) 3'-oligo = VE1 05-3 gat gga TCC CAÁ TAT GTG TAG CTC AGGA (denotada en la presente como SEQ ID NO:2) Las letras capitales designas secuencias de ADN de la región de flanqueo de ERG9, mientras que las minúsculas designan bases agregadas para crear los sitios de restricción. VE1 07-5 contiene secuencias desde la posición #1 0905 a la posición #1 0928 de la secuencia de Acceso al Banco de Genes #U00030. VE 1 05-3 contiene el complemento inverso de las secuencias de la posición #1 3868 a la posición #1 3847. Las condiciones de amplificación fueron como sigue: El ADN templado fue ADN genómico aislado de la cepa S288C (Centro de Almacenamiento Genético de Levaduras, Berkeley, CA). 2 min. 94°C/1 ciclo 1 min. 94°C, 1 min, 52°C, 1 .5 min, 74°C/30 ciclos 5 min. A 74°C/1 ciclo. El ADN de ERG9 de 2969 bp generado de esta reacción PCR se digirió con Kpnl y SamHI, después se ligó a Kpnl, SamHI se digirió YEp352 para generar el plásmido pTWM 103. YEp352 es un vector de lanzadera de levadura/E. coli (Hill, J: E. , Myers, A:M: , Koerner, T:J. y Tzagaloff, A. , 1986, Yeast/E. coli Shuttle Vectors with Múltiple Unique Restriction Sites, Yeast 2: 163-1 67). ADN para la prueba de ERG9 descrita arriba se obtuvo al digerir TWM103 con Apal y Nsil, y purificar el fragmento de 2044 bp que contiene el gen ERG9 y las secuencias de flanqueo. El ADN de ERG9 se biotiniló entonces utilizando extensión de primario aletorio (Equipo de NEBIot Phototope, Nueva Inglaterra, BioLabs, Beverly, MA). Aproximadamente 1 µg de prueba de ERG9 biotinilada se hibridizó en la Southern blot de Apal y Nsil digeridos con ADN genómico de las cepas ATCC 28383, MBNA1 -1 , MBNA1 -9 Y MBNA1 -12. La prueba reveló que todas las cuatro cepas contuvieron una secuencia de hibridización única ubicada en un fragmento de 2044 bp. Para clonar los genes ERG9 de estas cuatro cepas, el ADN genómico de cada una se digirió de nuevo con Apal y Nsil. El vector de lanzadera de levadura/E. coli pRS31 5 (Sikorski, R.S. , y P. Hieter, 1989, A System of Shuttle Vectors and Yeast Host Strains Designed for Efficient Manipulaton of DNA in Saccharomyces cerevisiae, Genetics, 1 22; 1 9-27) se digirió con Apal y Psfl (Nsil y Psíl tienen extremos cohesivos compatibles. Los ADNs digeridos se separan en un gel de agarosa, y los fragmentos de ADN cromosómico en el rango de tamaño desde aproximadamente 1 .6 kb a aproximadamente 3 kb, así como la banda de 3895 bp que corresponde a pRS316 digerido se cortaron del gel y purificaron utilizando GeneClean (BIO 101 , Inc. , Visa, CA). Los fragmentos de ADN genómico purificados de cada una de las cuatro cepas se ligaron a pRS316, y transformaron en E. coli. Los transformadores que contiene los clones pRS316/ERG9 de cada cepa se secuenciaron por ACGT, Inc. , Northbrook , IL utilizando un secuencias de ADN automático de Applied Biosystems Inc.. Modelo ABI 100. La secuencia del gen ERG9 de ATCC 28383 fue idéntica a la secuencia colocada en el Banco de Genes (Acceso #U00030). Los genes erg9 de MÉ5NA1 -2 y MBNA1 -9 se encontraron que tienen la misma mutación, principalmente, un cambio de G a A en la posición #12386 del Acceso al Banco de Genes #U00030, que cambia un codón TGGG a un codón de detención TGA. Esto causa la terminación de la proteína ERG9 en 237 aminoácidos en lugar de los 444 aminoácidos normales encontrados en la proteína ERG9 tipo silvestre. El gen erg9 de MBNA1 -1 3 se encontró que contiene un borrado de una C en la posición #1 2017 del Acceso al Banco de Genes #U00030, que causa una terminación temprana y de cambio de estructura de la proteína ERG9 en 1 16 aminoácidos, con al menos dos aminoácidos siendo diferentes de la proteína ER9 tipo silvestre (debido al cambio de estructura). Los alelos erg9 de MBNAN1 -1 y MBNA1 -9 mantienen los niveles bajos de actividad. Esto se determinó al transformar un mutante de borrado de erg9 que requiere ergosterol con plásmidos que portan los genes erg9 mutantes de MBNA1 -1 y MBNA1 -9. La presencia de los genes clonados en las cepas de borrado erg9 permitió que estos transformadores crezcan, aunque lentamente, en medio que carece de ergosterol. El alelo erg9 de MBNA1 -13 no muestra ninguna actividad residual cuando se prueba de esta manera. La cepa de borrado erg9 creció en niveles de tipo silvestre cuando se transforma con el alelo ERG9 de ATCC 28383. F. Descripción de las Mutaciones Secundarias Saccharomyces cerevisiae no importan normalmente ergosterol de su ambiente bajo condiciones aeróbicas normales. Sin embargo, los mutantes de erg? aislados fueron capaces de crecer aeróbicamente cuando sé complementan con ergosterol o colesterol, y por lo tanto, deben contener mutaciones secundarias que permite que ocurra la toma de esterol aeróbica. Los métodos utilizados para aislar los mutantes de trayectoria de ergosterol, tal como MBNA1 -1 3 de mutante de erg9, no solamente incluyeron una selección de mutantes de trayectoria de ergosterol, sino que también una selección de células que importan esteróles bajo condiciones aeróbica también, ya que solamente los mutantes con mutaciones tanto en el gen de trayectoria de esterol como el gen de toma de esterol han sobrevivido. En el " Ejemplo 3 de abajo, se describe la dificultad encontrada cuando se intenta obtener las mutaciones eliminadas de erg9 mediante métodos moleculares, aún en una cepa que lleva la mutación upc2, que se reporta para permitir la toma de esteróles bajo condiciones aerób?cas (Lewis, T. L. , G.A. Keesler, G.P. Fenner y L.W. Parks, 1988, Pleiotropic mutations in Saccaromyces cerevisiae affecting sterol uptake and metabolism, Yeast 4: 93-1 06). Parece que la mutación upc2 no confiere toma de esterol aeróbica eficiente en un mutante de erg9, y que las cepas descritas en el Ejemplo 3 adquirieron mutaciones espontáneas (en una velocidad de frecuencia baja) que mejora su disponibilidad para tomar los esteróles de manera aeróbica. Teniendo las mutaciones apropiadas que mejoran la toma aeróbica de ergosterol y colesterol en una cepa de otra manera de tipo silvestre permite a uno aislar las mutaciones de erg9 en esa cepa en una frecuencia mucho más elevada que lo que se obtendría con una cepa mutante de toma sin esterol. Con objeto de demostrar que la cepa MBNA1 -1 3 mutante de erg9 (y derivados de esta cepa) ha adquirido una(s) mutación(es)que aumenta la toma de esteróles bajo condiciones aeróbicas (referidas como una mejora de toma de esterol o mutaciones sue), se comparó la frecuencia para crear una eliminación de erg9 en el MBNA1 -1 3 antecedente, que contiene la mutación de toma de esterol, con la frecuencia de obtener la mutación de eliminación de erg9 en el antecedente de origen ATCC 28383, que presumiblemente carece de mutación de toma de esterol. Esto se hizo con las siguientes dos cepas que representan cada cepa antecedente. SWE23-?HE9 (ura3, his3, sue) se deriva de MBNA1 -1 3 y contiene un gen ER9 reparado. SWY5-?H 1 (ura3, his3) es un mutante auxotrófico derivado de la cepa ATCC 28383. La construcción de SWE23-?HE9 y SWY5-?H 1 se describe en detalle en la Sección G de abajo. Ya que SWE23-?HE9 se deriva de MBNA1 -1 3, • 5 esta cepa sirvió como el huésped que lleva la mutación sue, mientras que SWY5-?H, que se deriva de ATCC 28383, sirvió como el huésped sin la mutación sue. Ambas cepas se transforman con cantidades iguales (aproximadamente 1 µg) del fragmento de ADN erg9?::HIS3 obtenido al digerir pKML19-41 (construcción de plásmido descrita en 10 el Ejemplo 3), con BamHl y Xmal, y la purificación del fragmento de 2.1 kb resultante. Las células se transformaron con este fragmento # de 2.1 kb utilizando el procedimiento de transformación LiAc (Gietz, R.D. , R.H. Schiestl, A. R. Willems y R.A. Woods, 1 995, Studies on the transformation of intact yeast celias by the LiAc/SS-DNA/PEG 15 procedure, Yeast VX. 355-360), y los transformadores se seleccionaron del medio SCE-ura. El medio SCE contiene 0.67% de base de nitrógeno de levadura Bacto (sin aminoácidos), 2% de dextrosa, 20 mg/L de sulfato de adenina, 20 mg/L de uracilo, 20 mg/L de L-triptofano, 20 mg/L de L-histidina, 20 mg/L de L-arginina, 20 20 mg/L de L-metionina, 30 mg/L de L-tirosina, 30 mg/L de L-leucina, 30 mg/L de L-isoleucina, 30 mg/L de L-lisina, 50 mg/L de L-fenilalanina, 100 mg/L de ácido glutámico, 1 00 mg/L de ácido L-aspártico, 150 mg/L de L-valina, 200 mg/L de L-treonina, 400 mg/L de L-serina y 5 mg/L de ergosterol. Para placas agar, 2% de Bacto agar se agregan 25 al medio SCE. El medio SCE-ura es SCE que carece de uracilo.

Un total de 24 HIS+ colonias se originaron de la transformación de SWY5-?H1 , mientras que 401 HIS+ colonias se obtuvieron de SWE23-?H9. Ya que es posible para el gen erg9?::HIS3 integrar en los lugares otros diferentes a los lugares ERG9 (y por lo tanto permitiendo a las células permanecer prototróficas para ergosterol), veinte de cada tipo de transformante se probaron para un requerimiento de ergosteroi mediante la colocación en medio YPD (falta de ergosterol). Todos los 20 de las HIS+ colonias derivadas de SWY5-?H fueron capaces de crecer en YPD que indica que aún contienen un gen ERG9 funcional, y sugiere que el gen erg9?::HIS3 no se integró en el lugar ERG9. Por el otro lado, ninguna de las 20 HIS+ colonias derivadas de SWE23-?H9 fue capaz de crecer en YPD hincando que el ADN de erg9?::HIS3 ha reemplazado el gen ERG9 de tipo silvestre en esta cepa antecedente en una frecuencia relativamente elevada. Para verificar esto, nueve HIS+ colonias de cada cepa se analizaron por PCR para determinar los tipos de alelos ERG9 presentes en sus genomas. El ADN genómico se preparó como se describe en Sherman ef al, (1989). Los oligonucleótidos utilizados para el análisis de se dan abajo. 5' oligo = 250 UpBam gcgcatCCACGGGCTATATAAA (SEQ ID NO:3) 3' oligo = 1764 LoBam gcggatCCTATTATGTAAGTACTTAG (SEQ ID NO:4) Las condiciones de PCR fueron como sigue: 94°C, 3 min. 94°C, 30 seg; 50°C, 30 seg; 72°C, 3 min; 30 ciclos 72°C, 7 min. Los oligonucleótidos 250 UpBam contienen secuencias que corresponden a la posición #1 1 555 a #1 1 570 de la secuencia del Acceso al Banco de Genes #J05091 . El oligo 1764LoBam contiene el complemento inverso de las secuencias de la posición #13049 a #1 3068 del mismo archivo de secuencia del Banco de Genes. En todos los 9 de los transformante HIS+ de SWE23-?H9, el producto PCR fue 2.1 kbp indicando que el gen ERG9 se ha reemplazado por el gen erg9?::HIS3. En 8 de los 9 transformadores HlS+ de SWY5-?H1 , los productos PCR fueron 2.1 kbp y 1 .5 kbp, indicando que el gen ERG9 de tipo silvestre permaneció intacto y que el ADN de erg9?::HIS3 se ha integrado en cualquier lugar en el genoma. Los nueve transformadores HIS+ mostraron solamente el producto PCR de 1 .4 kbp, también indicando que el gen ERG9 estuvo intacto en esta cepa. En este caso, el gen HIS3 se cree que se ha integrado en el genoma sin llevar todas las secuencias erg9 con el. Estos resultados muestran que durante el curso de aislar la cepa MBNA1 -1 3, una mutación adicional, referida en la presente como sue, se originó en la cepa. En base a los resultados descritos en el Ejemplo 3 de abajo, la mutación sue parece ser diferente de la mutación upc2 reportada previamente y confiere más toma eficiente de esteróles. G. Derivación de Nuevas Cepas de MBAN 1 -13 Con objeto de utilizar la cepa MBNAN 1 -1 3 del mutante erg9 para las manipulaciones genéticas, la cepa se desarrolla además de manera que pueda llevar marcadores auxotróficos adecuados para este propósito. MBAN 1 -13 se mutagenizó utilizando sulfonato de metano metilo utilizando procedimientos estándar y mutantes resistentes a ácido 5-fluoroorótico (5-FOA) se obtuvieron al colocar las células mutagenizadas en medio que contiene 5-FOA. El uso de selección de 5-FOA se describe en Sikorski y Boeke, 1991 (Sikorski, R.S. y Boeke, J.D. 1991 , In Vitro Mutagenesis and Plasmids Shuffling: From Cloned Gene to Mutant Yeast, Methods in Enzimology 194: 302-318). Este método de selección permitió el aislamiento de cepas que contienen mutaciones en el gen URA3, codificando la decarboxilasa de orotidina-5'-fosfato. Varias cepas resistentes se aislaron que muestra resistencia a 5-FOA (es decir, un fenotipo ura"). Para determinar cuales de estas cepas contuvieron una mutación específicamente en el gen URA3, las cepas ura" se transformaron con pRS316 (Sikorski y Hieter, 1989), que contiene el gen URA3 intacto, utilizando el procedimiento de transformación LiOAc (Gietz ef al. , 1995). Varias cepas se identificaron cuya falta de crecimiento en el medio que carece de uracilo se restableció por pRS316, indicando que aquellas cepas llevan la mutación ura3. Una de estas cepas, EMS9-23 (ura3, erg9) se eligió para modificación adicional. La cepa EMS9-23 se alteró genéticamente para contener los borrados en los genes /eu2, trp l o /7/s3 utilizando los plásmidos de transplante de gen descritos en Sikorski y Hieter (1989); y el procedimiento de reemplazo de gen dentro/fuera descrito en Rothstein (1991 ) (Rothstein , R. , 1991 , Targeting , Disruption , Remplacement y Allele Rescue: Integrative DNA Transformation in Yeast, Methods in Enzymology 194:281 -301 ). Los mutantes Ieu2, trp l o his3 derivados de MBNA 1 -13 se nombraron SWE23-?L1 , SWE23-?T1 y SWE23-?H1 , respectivamente. La cepa SWE23-?H1 , se manipuló además para intercambiar la mutación de la estructura de cambio de erg9 original (ver Sección E) con el alelo erg9?::HIS3. Esto se hace al transformar SWE23-?H 1 (utilizando el procedimiento LiOAc) con aproximadamente 5 µg de un fragmento de ÁDN lineal que contiene el cassette de erg9?::HIS3 (la construcción del cassette erg9?::HIS3 se describe en detalle en el Ejemplo 3). El cassette erg9?::HIS3 se obtuvo al digerir pKLM19-40 con ßamHl y Xmal, y purificar el fragmento de ADN de 2.1 kbp que contiene ei fragmento erg9?::HIS3. Los transformadores de SWE23-?H 1 el cual el alelo de estructura de cambio erg9 se ha reemplazado por el alelo erg9?::HlS3 se seleccionaron al colocarlos transformadores en medio SCE que carece de histidina. Una de las cepas resultantes se refiere como SWE23-?E91 . La cepa SWE23-DH 1 , se modificó además para contener mutaciones en los genes Ieu2 y trp l. Estas mutaciones se introdujeron utilizando los plásmidos de transpiante de gen (Sikorski y Hieter, 1981 ); y el procedimiento de reemplazo de gen dentro/fuera ( Rothstein 1991 ) arriba descrito. Una de las cepas resultantes se refiere como SWE23-DH1 #42, y contiene las mutaciones erg9, ura3, his3, Ieu2, trp l y sue. La cepa SWE23-DH 1 #42 se modifica además para intercambiar la mutación de cambio de estructura de erg9 original con el alelo erg9?::HIS3. Esto se hizo al transformar SWE23- DH 1 #42 (utilizando el procedimiento LiOAc) con aproximadamente 5 mg de un fragmento de ADN lineal que contiene el cassette erg9?::HIS3 como se describe arriba. Los transformadores HIS+ en los cuales la mutación del cambio de estructura de erg9 se ha reemplazado por el alelo erg9?::HIS3, se seleccionaron en el medio SCE-his. Una délas cepas resultantes se refiere como SW23B, y porta mutaciones en los genes: ura3, Ieu2, trp l, his3, erg9::HIS3, sue. Un resumen de las cepas derivadas de MBNA-13 y sus producción de farnesol respectiva en los cultivos en matraz vibrante se da en la Tabla 6. Las cepas se desarrollaron durante la noche en medio YPDE (30°C con agitación a 180 rpm). Estos cultivos se utilizaron para inocular 25 mi de medio YPDE en un matraza de 20 ml de tal manera que el OD6oo inicial fue 0.05. Las células crecieron durante 72 horas a 30°C (con agitación a 180 rpm). Las muestras del caldo total (es decir, las células más el medo de cultivo) se analizar para peso de la célula en seco y farnesol como se describe en la Sección de arriba. Tabla 6 Crecimiento y Producción de Farnesol en Cepas Derivadas de MBNA1 -13 Las cepas MBNA1 -13, EMS9-23 y SWE23-?E91 se evaluaron además para el crecimiento y producción de farnesol en termentadores de 1 L utilizando el método descrito en la Sección H de abajo. EMS9-23 y SWE23-?E91 se transformaron cada uno con plásmido YEp352, que contiene el gen URA3 clonado. Esto obvia la necesidad de agregar uracilo al medio de fermentación para estas dos cepas. La Figura y la Tabla 7 resumen los resultados de estas fermentaciones. MBNA1 -13 y EMS9-23/YEp352 se ejecutaron de manera similar. Aunque el crecimiento de SWE23-?E91 /YEp352 se deja atrás de las otras dos cepas, alcanzó una densidad de la célula y nivel de producción de farnesol comparable con las otras cepas. Tabla 7 Comparación de MBNA1 -13 y Cepas Derivadas de ella en Fermentadores de 1 L Las cepas EMS9-23 y SWE23-?H 1 se manipularon además al reparar sus mutaciones erg9 de nuevo a la función de tipo silvestre. Esto se hizo al transformar las dos cepas (utilizando el procedimiento de transformación de LiOAc) con aproximadamente 5 µg de un fragmento de ADN que contiene el gen ERG9 intacto. El fragmento de ADN de gen erg9 se obtuvo al digerir pTWM103 (ver Sección E de arriba) con Sacl y BamHl, y purificar el fragmento de ADN de 2.5 kb que contiene el gen ERGT. Los transformadores de EMS9-23 y SWE23-?H 1 en los cuales la mutación de cambio de estructura erg? se ha reemplazado por el gen ERGT de tipo silvestre obtenido de cada cepa al seleccionar para las células que podrían crecer en medio YPD que carece de ergosterol. En cepa reparada de erg? derivada de EMS9-23, designada SWE23-E9, se eligió para estudio adicional. En experimentos separados, las mutaciones auxotróficas se introdujeron en la cepa origen ATCC 28383. Un mutante ura3 espontáneo de ATCC 28383 se obtuvo después de que se colocan las células en medio que contiene 5-FOAcomo se describe arriba. Los mutantes resistentes a 5-FOA se transformaron con pRS316 (arriba descrito) para identificar aquellos que han adquirido espontáneamente una mutación específicamente en su gen URA3. Una cepa, SWY5, muestra un fenotipo ura" estable (frecuencia de baja reversión), y se eligió para estudio adicional. SWY5 se manipuló además para llevar la mutación his3 al utilizar el plásmido de transpiante de gen YRp1 Alh ¡S3-?200 descrito por Sikorski y Hieter (Sikorski y Hieter, 1 989) y el procedimiento de reemplazo del gen dentro/fuera descrito por Rothstein (Rothstein, 1991 ). Un mutante his3 derivado de SWYE, designado SWY5-?H, se eligió para estudio adicional. La Tabla 8 enlista las cepas auxotróficas y reparadas descritas y sus genotipos.

Tabla 8 Cepas Auxotríficas y Reparadas Relacionadas con ATCC 28383 y MBNA1 -13 Para probar si el MBNA1 -1 3 mutante de erg? ha adquirido cualquier requerimiento nutricional adicional durante el curso de su aislamiento, un experimento de crecimiento se condujo en matraces vibrantes para comparar la cepa origen ATCC 28383, la cepa EMS-23 mutante de erg? y la cepa SWE23-E9 reparada de erg?. Los cultivos crecieron en medio YPD a 30°C con agitación a 1 80 rpm. El cultivo de EMS9-23 también se complementó con 5 mg/L de ergosterol. El crecimiento se monitoreó por OD6oo- Los resultados de este experimento, presentados en la Figura 5, muestran que el crecimiento del mutante de erg9 se reduce, pero que el crecimiento de la cepa origen de tipo silvestre 28383 y la cepa reparada de erg? SWE23-E9 crecieron similarmente. El OD60o final ligeramente inferior en el cultivo de SWE23-E9 fue probable debido al hecho de que esta cepa es un auxotrofo de uracilo, y la concentración de uracilo en el medio YPD no fue óptima. Estos resultados indican que la causa principal del defecto de crecimiento en los mutantes de erg? es la mutación de erg? por sí misma. Otras mutaciones en los mutantes de erg?, tal como las mutaciones sue, no tienen un efecto significativo en crecimiento. H. Fermentación de Un Litro Las cepas MBNA1 -13, EMS9-23/YEp352 y SWE23-?E91 /YEp352 se desarrollaron en termentadores de un litro bajo condiciones de alimentación discontinuas como se describe abajo. Bajo estas condiciones, la producción de farnesol para estas cepas varió de 5.5-6.0% de peso de la célula en seco (datos mostrados en la Sección G de arriba) en 191 -239 horas Materiales y Condiciones de Fermentación La fermentación de un litro se llevo a cabo al esterilizar en autoclave primero durante 45 minutos a 1 21 °C, en el fermentador, la siguiente solución: (NH4)2SO4 10.0 g/L KH2PO4 1 0.0 g/L CaCI2-2H2O 0.5 g/L NaCI 0.5 g/L MgSO4-7H2O 3.0 g/L extracto de levadura 2.0 g/L solución de sal 20.0 mL desespumador (Dow 1520) 4.0 gotas agua desionizada 500 mL.

Después de esterilizar por autoclave, las siguientes soluciones estériles se agregaron: solución de glucosa (50%) p/v) 5.0 mL solución de vitamina 15.0 mL solución de ergosterol 0.2 mL Las soluciones de vitamina y glucosa se esterilizaron por el paso a través de un filtro de 0.45 micrones. La solución de ergosterol se considera estéril (ver abajo), La solución de alimentación de glucosa (hecha en agua desionizada) solución de glucosa (60%) p/v) 360 mL solución de extracto de levadura (12.5% p/v) 80 mL solución de ergosterol 5.8 mL El extracto de levadura, glucosa esterilizado por autoclave; ergosterol considerado estéril. Inoculo 1 mL suspensión congelada en 1 00% de glicerol inoculado en 250 ml de medio YPDE en 1000 mL de matraz desviado, incubado a 48 horas a 29°C y 150 rpm, utilizada en 30 mL de inoculo por fermentador. Condiciones de fermentación 28°C pH 4.5 Agitación 300-1 000 rpm, aeración 50-200 mL/min como se requiera para mantener el oxígeno disuelto en 10-60% de saturación de aire. La solución alimentada de glucosa agregada después de que la glucosa adicional se disminuye. La velocidad de adición para lograr una velocidad de crecimiento de 0.04 hr"1 que considera que el producto celular en glucosa es 0.25. La velocidad de alimentación = 3.5 ml/hr. Solución de sal (dada por litro en agua desionizada) FeSO4-7H2O 0.28 g ZnSO4-7H2O 0.29 g CuSO4-5H2O 0.08 g Na2MoO4-2H2O 0.24 g CoCI2-6H2O 0.24 g MnSO4-H2O 0.17 g HCl 0.10 mL La solución de vitamina (dada por litro en agua desionazada) biotina 10 mg ca-pantotenato 120 mg inositol 600 mg piridoxina-HCI 120 mg tiamina-HCI 120 mg La solución de ergosterol Etanol 20 mL IGEPAL 20 mL ergosterol 0.4 g Calentar a 50°C con mezclado hasta que se disuelva, almacenar en -20°C. IGEPAL es 1 ,3,3 tetrametil butil fenoxi (etoxi)8etanol (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, Producto IGEAPL CA-630, Cat. #1 3021 ). Eiemplo 2 Este ejemplo describe la producción de mutantes de erg? mediante mutagénesis química de la cepa 64031 de S. cerevisiae utilizando sulfonato de etllmetano (EMS). La cepa 64031 (obtenida de ATCC) es un mutante de erg?-1 que produce niveles bajos de farnesol (ver Ejemplo 1 ) mutagénesis adicional produjo mutantes que muestran producciones mejoradas de farnesol. Una curva de eliminación se llevo a cabo utilizando EMS, y una mutagénesis de 64031 también se llevo a cabo como se describe en el Ejemplo 1 . La selección también se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 1 . Un total de 163 cepas se encontraron que son resistentes a nistatina, ts, auxotrofos de esterol. Se cultivaron en tubos y matraces vibrantes y ia producción de farnesol se determinó como se describe en el Ejemplo 1 . Las cantidades de farnesol producidas en los cultivos de matraz vibrante se presentan en la Tabla 9.

TABLA 6 Eiemplo 3 En el Ejemplo 1 .G anterior, la creación de un mutante erg??::HIS3 de MBAN 1 -1 3 se describe. En este ejemplo, la construcción de otras cepas de S. cerevisiae lapoíde (sin derivarse de MBNA1 -13) que contiene una inserción de eliminación de erg9::inserción de HIS3. El gen ERGT se amplificó por PCR utilizando ADN genómico asilado de la cepa S288C (de acuerdo al método de Sherman ef al) como templado y los siguientes dos primarios: 5' oligoo = gag cat CCA CGG GCT ATA TAAA (SEQ ID NO:5); 250 SamUp 3' oliho = tcc ecc cg GGC GCA GAC TTC ACG CTC (SEQ ID NO: 6); 1712 XmaLo. El ADN de ERGT amplificado por PCR se digirió con BamHI y Xmal, después se ligó a BamHI, Xmal digerido pRS31 6 (vector de lanzadera de Levadura/E. coli, Sikorski y Hieter, 1 989). Las condiciones de PCR fueron: 94°C por 1 min.- 1 ciclo 30 ciclos 72°C por 2 min.- 1 ciclo El gen ERGT clonado de esta manera se extiende desde la posición #1 1 555 ha'sta la posición #1 3047 del Acceso al Banco de Genes #U00030, y el clon resultante se nombró pJMB98-1 2. La construcción del borrado en ERGT y la inserción de ADN HIS3 se hizo como sigue: El gen HIS3 se obtuvo al digerir el HIS3 que contienen plásmido pRS403 (Stratagene, La Joya, CA9 con Eco47III y Sspl , y purificar el fragmento de 1 226 bp que contiene el gen HIS3. El plásmido pJMB98-12 se digirió con Va/791 1, después se trató con polimerasa de ADN T4 para hacer hacerlo de extremos redondeados. El plásmido se digirió además con Hpal de manera que un fragmento de 589 bp internacional dentro de ERGT se borra. En este sitio se ligó el £co47lll de 1226 bp, fragmento Sspl que contiene el gen HIS3. El plásmido resultante, pKML1 9-41 , tiene el gen HIS3 clonado dentro del gen ERGT borrado, con la secuencia de codificación HIS3 en la misma orientación que la secuencia de codificación ERGT. Para transformar la levadura con este ADN de erg??::HIS3, el plásmido pKLM19-41 se digirió con Smal y Xbal, y el fragmento de 2141 bp que contiene el gen erg??::HIS3 se aisló. ADN se purificó de placas de gel de agarosa al utilizar GeneClean. Aproximadamente 5 µg de ADN erg??::HIS3 purificado se utilizó para transformar la cadena diplóide CJ3A X CJ3B (af ,ura3/ura3, his3/his3, Ieu2/leu2, trp 1/trp 1, upc2/upc2, obtenida de Dr. L. Parks. Universidad del Estado de N.C. , Raleigh, NC) utilizando el procedimiento de transformación de acetato de litio descrito en Gietz, ef al (1995). CJ3A X CJ3B es homocigoso para la mutación upc2. Esta mutación permite la toma de esterol bajo condiciones aeróbicas (Lewis, ef al. , 1 988). Se cree que la mutación de upc2 podría permitir la fácil producción de una cepa de haploide que porta una mutación en el gen erg?. La auxotropía de histidina fue necesaria para seleccionar las cepas que portan los plásmidos que contienen el gen HIS3 funcional. Las células transformadas se colocaron en medio SCE (descrito en el Ejemplo 1 .F) que carece de histidina (SC-His) para seleccionar transformantes HlS+. Cientos de transformadores se obtuvieron. Estas células HIS* se parcharon entonces sobre SC-His y se dejaron crecer por dos días más. Los transformadores se parcharon entonces sobre medio de esporulación (Sherman, ef al. 1986). El medio de esporulación contiene (por litro de agua destilada): 1 % de acetato de potasio; 0.1 % de extracto de levadura Bacto, 0.05% de dextrosa y 2% de Bacto agar. Los parches se dejaron entonces crecer y esporular durante 3-5 días. Una porción de las células se removió y colocó en una solución de liticaza para digerir la pared celular de asea. Las células se difunden entonces en una línea delgada sobre una placa de YPD + 2 mg/L de ergosterol (YPDE). Las células diploides esporuladas forman cuatro tetradas que contiene cuatro esporas, y las esporas individuales se separaron utilizando un micromanipulador. Estas esporas hapioides individuales germinarán con cada una que contienen una sola copia de ios cromosomas. Una segregación 2:2 se espera para eliminación de erg??::HIS3 en esta cepa. Dos esporas deben ser viables en YPD ya que podrían contener la copia del cromosoma que no se interrumpió (significando que no necesitarían ergosterol ya que tienen un gen ERGT de función y podrían ser capaces de crecer en YPD debido a que la histídina se encuentra presente en el medio). Las otras dos esperas deberán crecer en SC-His + 2 mg/L de ergosterol) (SCE-His) ya que, si el ADN de erg??::HIS3 se integra en el sito ERGT, las células requerirían ergosterol, pero crecerían sin histidina. Las tetradas de algunos de los transformadores pKLM1 9-41 se analizaron para determinación fenotípica de la eliminación de erg?. Los resultados mostraron que solamente dos de las cuatro esporas son viables cuando crecen aeróbicamente,. Cuando estas se replican en YPD estas dos esporas sobrevivieron, pero no sobrevivieron en SC-His o SCE-His. Esto indica una segregación de 2:2 y que las dos esporas sobrevivientes fueron del tipo origen o auxotrófico para histidina. Esto indicó que las dos que no sobrevivieron aeróbicamente probablemente contuvieron la eliminación de erg??::HlS3. El análisis PCR confirmó los resultados de una eliminación de erg??::HIS3 en varias de las cepas. El ADN total se aisló utilizando un método rápido de aislamiento de ADN de varios de los transformadores diploides que mostraron la segregación 2:2. El ADN total se utilizó entonces como el templado para la amplificación de PCR con primarios que complementan la secuencia 5' y 3' al gen ERGT en el cromosoma. Los oligonucleótidos utilizados para este análisis son como sigue: 5'-oligo = 250 Bam Up (arriba descrito) 3'- oiigo = 3ERGT-1 = gat ceg cg GCT CAÁ GCT AGC GGT ATT ATG CC (SEQ ID NO: 7). 3ERGT^ contiene las secuencias que corresponde al complemento inverso de secuencias de la posición #14812 a la posición #14790 de la secuencia de Acceso al Banco de Genes #U00030. El oligonucleótido 250 Bam Up yace dentro de la secuencia del clon ERGT utilizado para construir el alelo erg??::HIS3, mientras que el oligonucleótido SERG -'l yace aguas abajo del límite del ADN de ERGT clonado. Las secuencias de ERGT amplificada de ADN genómico por estos dos primarios deben representar los genes ERGT ubicados en el lugar ERGT cromosómico actual, y no amplificará las secuencias de erg??::HIS3 que se integran en otras ubicaciones cromosómicas. Los resultaos mostraron dos bandas en 3.271 y 3.908 kb, que indican la presencia en las cepas diploides de una copia funcional del gen ERGT y una copia interrumpida que es 637 bp kb más larga debido a la Inserción del gen HIS3. El análisis Southern blot también se llevó a cabo para verificar la interrupción de erg??::HIS3 en los diploides. El ADN genómico de una cepa diploide origen que porta dos copias normales del gen ERGT se comparó con tres transformadores diferentes que se cree que portan un gen ERGT normal y un gen ERGT interrumpido. El ADN se digirió con ya sea Acc I o Xba 1, separado por electrofóresis de gel, transferido a una membrana lmmobiion S, y probado con pruebas específicas para examinar los genes ERGT presentes. La prueba en este caso fue un fragmento de 1 .4 kb que contiene una porción del gen ERGT.

La prueba utilizada para el análisis Southern blot de ADN genómico se preparó de gen ERGT amplificado por PCR utilizando oligonucleótidos 250 Bam Up y 1712 Xma Lo (descritos arriba). El plásmido pJMB98-12 se utilizó como templado. Las condiciones de PCR fueron: 94°C por 1 min.- 1 ciclo 94°C por 30seg. 58°C por 1 min 30 ciclos 72°C por 1 min 72°C por 2 min.- 1 ciclo El ADN ERGT amplificado se purificó y biosintetizó, como se describe arriba. Aproximadamente 1 µg de la prueba biotinilada se utilizó para hibridizar a la blot. La hibridización de la prueba a las bandas de ADN específicas bajo condiciones exigentes identificaron secuencia complementaria que se encuentra presente. Para el diploide origen, CJ3AxCJ3B, una sola banda se observó en 2. 1 kb para la digestión de Acc I y una sola banda a 2.8 kb se observó con al digestión de Xba I. Las eliminación putativas de erg??::HIS3 contuvo cada una bandas: bandas en 2.1 kb y 1 .3 kb para la digestión de Acc I y bandas a 2.8 kb y 3.4 kb para la digestión de Xba I. Estos resultados indicaron la presencia de una copia del gen ERGT tipo silvestre junto con una interrupción de erg??::HIS3 en los diploides transformados. Los intentos se hicieron para crecer las células hapioides anaeróbicamente en agar YPDE. Las cepas que se bloquean en ia trayectoria de ergosterol pueden tomar esteróles bajo condiciones anaeróbicas. Dos de las esporas crecieron rápidamente bajo condiciones anaeróbicas (ERGT, his-) y dos crecieron muy lentamente (erg??::HIS3). Las esporas de tres de las cepas erg??::HIS3 (KML505, KML510 y KML521 ) que crecieron anaeróbicamente en placas se desarrollaron en medio líquido bajo condiciones anaeróbicas y mostraron producción de farnesol. En la incubación aeróbicamente adicional de las placas YPDE originales, parece que pocas de las cepas hapioides que se probaron positivas para la producción de farnesol bajo crecimiento anaeróbico se desarrollaron. Tales tres esporas viables (derivadas de KML505) se originaron después de incubación aeróbica prolongada. Estas tres cepas que crecen aeróbicamente, designadas como BKY1 -2D, BKY1 -7C y BKY1 -8D todas produjeron farnesol bajo condiciones aeróbicas. La cepa origen KML510 (al ,ura3/ura3, his3/his3, trp 1/trp 1, Ieu2/leu2, upc2/upc2, ERGT/erg??::HIS3) que contienen ya sea pJMB98-12 o PRS316 se esporularon y las tetradas se disecaron en placas YPDE. Las placas se incubaron bajo condiciones aeróbicas y los siguientes patrones de crecimiento de esporas se observaron. El análisis de tetrada de KML51 0/pJMB98-12 se hizo con 20 tetradas. 16 tetradas dieron origen a dos esporas de rápido crecimiento, viables y dos esporas no viables. Todas las esporas viables fueron his", erg+. Tres tetradas dieron origen a dos esporas de rápido crecimiento, viables, una espora de lento crecimiento, viable y una espora no viable. Todas las de rápido crecimiento, viables fueron his", erg*. Las esporas de lento crecimiento, viables fueron todas his\ erg". Una tetrada no dio origen a ninguna espora viable. Todas las esporas his+, erg" fueron también ura", indicando que pJMB98-12 no segrega en estas esporas durante la meiosis. Una de las esporas his+, erg" se utilizó para estudios adicionales, y se nombró BTY19-9C. El análisis de tetrada de KML510/pRS316 se hizo con 20 tetradas. 1 8 tetradas dieron origen a dos esporas de rápido crecimiento, viables y dos esporas no viables. Dos tetradas dieron origen a dos esporas de rápido crecimiento, viables, una espora de lento crecimiento, viable y una espora no viable. Todas las esporas de rápido crecimiento, viables fueron his", erg+. Todas las esporas de lento crecimiento fueron his+, erg". Todas las esporas his+, erg" fueron también ura', indicando que pRS316 no segrega en estas esporas durante la meiosis. Una de las esporas his+, erg" se utilizó para estudios adicionales, y se nombró BTY20-2A. Para confirmar que BTY19-9C y BTY20-2A no portan el gen ERGT de tipo silvestre, un experimento PCR se condujo utilizando ADN genómico aislado de las dos cepas, y los oligonucleótidos VE 1 04-5 y VE 1 05-3. 5' oligo = VE104-5 = gac tet AGA AGC GGA AAA CGT ATA CAC 3'oligo = VE 105-3 = arriba descrita VE104-5 contiene secuencias que corresponden a la posición #1 1 631 a 1 16541 de la secuencia de Acceso al Banco de Genes #U00030. El tamaño de producto PCR predicado para un gen ERGT funcional fue 2.23 kb, y para la interrupción de erg??::HIS3, 2.87 kb. Las cepas BTY19-9C y BTY20-2A tuvieron un producto de PCR de aproximadamente 2.87 kb, que indicó la presencia de la interrupción de erg??::HIS3. Cinco cepas (BKY1 -2D, BKY1 -7C, BKY1 -8D, BTY19-9C y BTY20-2A) se evaluaron para la producción de farnesol en matraces vibrantes. Las cepas BKY1 -7C y BTY20-2A dieron la mejor producción de farnesol de las cinco cepas, pero BKY1 -7C creció lentamente. Los transformadores KML505, KML510 y KML521 se transfirieron a medio de esporulación. Las tetradas se disecaron sobre YPDE y dejaron crecer por periodos extendidos de tiempo bajo condiciones aeróbicas para bloquear el crecimiento de esporas adicionales más allá de la segregación 2:2 anticipada (viable:no viable). Las dos esporas adicionales fueron viables después de incubación adicional bajo condiciones aeróbicas. Estas dos cepas, BJY7-5D y BJY8-1 A, produjeron farnesol en una pantalla tubular. Las cepas BJY7-5D y BJY8-1 A se evaluaron en matraces vibrantes. BJY8-1A dio la mejor producción de farnesol (0.29 mg/ml), 4.7% en base al peso en seco de la célula) después de 72 horas de incubación . BJY7-5D dio 0.1 8 mg de farnesol/ml, (3.5% en base al peso en seco de la célula). Eiemplo 4 Este ejemplo muestra la sobreexpres?ón de reductasa HMG CoA en cepas con o sin gen ERGT funcional .

La reductasa HMG CoA se ha propuesto que es la enzima clave que regula el flujo de carbono a través de la trayectoria de isporenoide. En S. cerevisiae, los dos genes, HMG1 y HMG2, codifican las dos isozimas de reductasa HMG CoA, designadas HMG 1 p y HMG2p. La regulación de reductasa HMG CoA se logra a través de una combinación de regulación transcripcional y traslacional así como la degradación de proteína. Los segmentos de los genes HMG 1 y HMG2 que codifican los dominios catalíticos de las isozimas HMG1 p Y HMG2p se han clonado bajo control transcripcional del promotor fuerte del gen GPD (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa). Los plásmidos que contienen estas construcciones (pHR1 27-3 y pRH 124-31 , que contienen los dominios catalíticos de HMG1 P y HMG2p, respectivamente) se obtuvieron de R. Hampton, U.C. San Diego. Las cepas de S. cerevisiae que sobreexpresan el dominio catalítico de HMG1 p se reportaron que tienen un flujo elevado de carbono a través de la trayectoria de isoprenoide. Este flujo de carbono incrementado se manifestó como sobreproducción de escualeno y ergosterol (Donald, K.A.G. , Hampton, R.Y., y Fritz, I.B. , 1997, Effects of Overproduction of the Catalytic Domain of 3-Hydroxy-3Methylglutaryl Coenzyme A Reductase on Squalene Síntesis in Saccharomyces cerevesiae. Applied and Environmental Micorbiology 63:3341 -3344). A, . Sobreexpresión de Reductasa HMG CoA en Cepas con un Gen ERGT Funcional Con objeto de confirmar que la sopreexpresión de reductasa HMG CoA resultaría en flujo de carbono incrementado a través de la trayectoria de isoprenoide en las cepas derivas de ATCC 28383, similar a otras cepas de S. cerevisiae (Donald, eí al., 1997), la cepa SWY5, un mutante ura3 de la cepa origen ATCC 28383, y SWE-23-E9, la versión reparada de erg? de EMS9-23 (cepas descritas en el Ejemplo 1 .G, arriba), se transformaron con plásmidos pRH127-3 y pRH 1 24-31 . Las transformaciones se llevaron a cabo utilizando el procedimiento LiOAc (Gietz, ef al. , 1995). Las cepas de control que llevan el vector vacío YEp352 también se construyeron. Los transformantes representativos se probaron para producción de escualeno y ergosterol en un experimento de matraz vibrante. Las células se desarrolaron en 50 ml de medio SCE-ura a 30°C, con agitación a 180 rpm durante 48 horas. En 24 horas, 10 ml del cultivo se extrajeron, y las células se cultivaron para análisis de reductasa HMGCoA como se describe en ei Ejemplo I. D- Al final del periodo de crecimiento de 48 horas, un alícuota de los cultivos se utilizó para inocular matraces que contienen 50 ml de medio YPD de tal manera que el OD6oo inicial de los cultivos fue 0.1 . Los cultivos en medio YPD se desarrollaron durante 72 horas a 30°C, con agitación a 180 rpm, y después se analizaron para peso de célula en seco, acumulación de ergosterol y escualeno. El método de extracción utilizado para este análisis fue como sigue. Diez ml del cultivo se nodulizaron mediante centrifugación a 1 ,500 x g durante 1 0 minutos. La pastilla celular se volvió a suspender en 1 ml de agua desionizada, y las células se volvieron a nodulizar. Las pastillas celulares se volvieron a suspender en 1 ml de agua desionizada e interrumpieron mediante agitación con perlas de silicato de zirconio (0.5 mm de diámetro). La suspensión celular interrumpida se saponificó con 2.5 ml de una solución al 0.2% de pirogalol (en metanol) y 1 .25 ml de solución de hidróxido de potasio al 60% a 75 grados C durante 1 .5 horas. Las muestras se extrajeron entonces con 5 ml de hexano, pusieron en vórtice durante 3 minutos y centrifugaron a 1 ,000 x g durante 20 minutos para separar estas fases. La capa de hexano se analizó entonces mediante GC-MS como se describe en el Ejemplo 1 .B. Los datos de este experimento se muestran en la Tabla 10. En comparación a las cepas de control que portan solamente el vector Yep352, las cepas que sobreexpresan los dominios catalíticos de ya sea HMG 1 p o HMG2p contuvieron niveles elevados de actividad de reductasa HMGCoA y niveles elevados de escualeno. Sin embargo, ninguna de las cepas que sobreexpresan HMG 1 p o HMG2p contuvieron niveles significativamente incrementados de ergosterol. Sin embargo, estos datos muestra que el incremento de la actividad de reductasa HMG CoA en el linaje de la cepa MBNA1 -1 3 incrementa el flujo de carbono a través de la trayectoria de isoprenoide.

Tabla 10. Efecto de Actividad de Reductasa HMG CoA en Producción de Escualeno y Ergosterol en Cepas que Tienen una Trayectoria de Isoprenoide Normal B. Sobreexpresión de Reductasa HMG CoA en un Mutante erg? Habiendo mostrado que la amplificación de HMG1 p o HMG2p incremento el flujo de carbono a escualeno, se prueba si la sobreexpresión de HMG1 o HMG2 incrementaría la producción de farnesol en una cepa que porta la mutación erg?. La cepa SWE23- ?E91 (descrita en el Ejemplo 1 .G.) se transformó con los plásmidos pRH 127-3 o pRH124-31 . La transformación de SWE23-?E91 se llevó a cabo utilizando el procedimiento de transformación de LiOAc (Gietz eí al, 1 996). Aproximadamente 2.5 µg de ADN de pRH 1 27-3 o pRH 1 24-31 se utilizaron en cada transformación. Los transformantes se seleccionaron de placas SCE-ura, y varias se eligieron y volvieron a mover a para su purificación en placas SCE-ura. Para probar el efecto de reductasa HMG CoA amplificada en producción de farnesol, los transformantes representativos se desarrollaron por 48 horas en medio SCE-ura líquido. Una cepa de control, SWE23-?E91 /YEp352, también se incluyó en el experimento. Al final del periodo de crecimiento de 48 horas, las alícuotas de los cultivos se utilizaron para inocular los matraces que contienen 50 ml de medio YPDE de tal manera que el ODß00 inicial fue 0.5. Estos cultivos se desarrollaron durante 72 horas a 30°C, con agitación a 180 rpm. Al final del periodo de incubación, las muestras se analizaron para peso de célula en seco y concentración de farnesol. Para confirmar que los genes de reductasa HMG CoA se sobreexpresan en los transformantes, 20 ml de los cultivos crecieron en SCE-ura se recolectaron mediante centrifugación a 1500 x g durante 10 minutos, y la actividad de reductasa HMG CoA se midió utilizando el método de célula permeabilizado descrito en el Ejemplo I . D. Los datos de este experimento se muestran en la Tabla 1 1 .

Tabla 11. Efecto de Actividad de Reductasa HMG CoA Elevada en Producción de Farnesol en un Mutante erg9:-HIS3 en Cultivos de Matraz Vibrante Tanto en SWE23-?E91 /pRH 127-3 como SWE23- ?E91 /pRH 124-31 , los niveles de actividad de reductasa HMG CoA se elevaron. Sin embargo, la producción de farnesol en estas cepas fue inferior a la cepa de control SWE23-?E91 /YEp352. Este resultado inesperado se observó varias veces en experimentos independientes. A pesar de la falla de actividad de reductasa HMG CoA amplificada para incrementar la producción de farnesol en una cepa erg9?::HIS3 desarrollada en cultivos de matraz vibrante, las cepas listadas en la Tabla 12 se probaron para la producción de farnesoi en termentadores 1 -L utilizando el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 .H. Bao estas condiciones, el resultado esperado se observó; las cepas que sobreexpresan reductasa HMG CoA produjeron significativamente más farnesol que la cepa de control. Los datos se resumen en la Figura 6 y Tabla 1 2. La elevación de la actividad de reductasa HMG CoA en las cepas SWE23-?E91 /pRH127-3 y SWE23- ?E91 /pRH 1 24-31 se confirmó por el análisis de enzima directo utilizando el método de célula permeabilizado. Esto se ilustra por las actividades de reductasa en puntos del tiempo específicos durante la fermentación (mostradas en la Tabla 2). Tabla 12. Efecto de Actividad de Reductasa HMG CoA Elevada en Producción de Farnesol en un Mutante erg9?: :HIS3 en Desarrollado en Fermentadores 1 -L Eiemplo 5 Este ejemplo describe la sobreexpresión de varias sintasas GGPP en mutantes erg?. Con objeto de convertir FPP producido en cepas de mutante erg? en GGPP (el precursor de producto deseado, GG), los genes que codifican las diversas sintasas GGPP en mutantes erg? se sobreexpresaron . Los genes clonados para este propósito fueron el gen BTS1 de Saccharomyces cerevisiae, el gen crtE de Erwinia uredovora, el gen a 1-3 de Neurospora crassa, y el gen ggs de Gibberella fujikuroi. Los plásmidos que llevan estos genes se construyeron como sigue. Para clonar el gen BSTI1 , el ADN genómico se preparó de la cepa S288C de S. cerevisiae de acuerdo al método descrito en Sherman, ef al., (1986). El gen se amplificó mediante PCR utilizando los siguientes dos nucleótidos. 5'oligo = VE100-5 gactctAGAGTTTACGAGTCTGGAAAATC (SEQ ID NO: 8) 3'oligo = VE101 -3 gtaggATCCATGGAATTGAGCAATAGAG (SEQ ID NO: 9) Las condiciones de PCR fueron: 94°C, 3 minutos; 94°C, 1 minuto; 52°C, 1 minuto; 74°C, 1 .5 minutos, 30 ciclos; después 74°C, 7 minutos (1 ciclo). El producto PCR se digirió con Xbal y SamHI y ligo en pPGK31 5 digerido con Xbal , BamHI para generar pTWM1 01 . El plásmido pPGK31 5 contiene el promotor PGK de S. cerevisiae y terminador separador por un sitio de clonación múltiple. La clonación del gen BST1 en pPGK315 como se describe arriba colocó el gen BST1 bajo control del promotor PGK resistente. El plásmido pPGK315 se construyó al digerir el plásmido pRS31 5 con Sacl l y Smal , después tratar con polimerasa de ADN T4 para crear extremos redondeados. El plásmido se volvió a ligar para generar pRS31 5-DSS . El plásmido pRS31 5DSS se digirió entonces con Xhol y se ligó con un fragmento Xhol , Salí de 994 bp obtenido del plásmido pPGKMCS que contuvo el promotor PGK y terminador separado por un sitio de clonación múltiple. El plásmido pPGKMCS se construyó al digerir pPGK (Kang et al. , 1990. Mol. Cell. Biol. , 1 0:2582) con EcoRI y BamHI, después ligar con los siguientes dos nucleótidos anulares. 5'oligo = AATTCCAAGCTTGCGGCCGCTCTAGAACGCGTG (SEQ ID NO: 1 0) 3'oligo = GATCCACGCGTTCTAGAGCGGCCGCAAGCTTG (SEQ ID NO: 1 1 ) El plásmido pTWM1 1 0-1 1 se construyó al ligar un fragmento Kpnl-Sa 1 l de 2397 bp que contiene el promotor PGK/ß rs-//terminador PGK (obtenido mediante digestión de PTWM1 10 con Kpnl y Sa 1 l) en YEp352 digerido con Kpnl-Sa 1 l. Para clonar el gen crtE, el ADN genómico se aisló de la cepa 2OD3 E. uredovora utilizando el Equipo de Aislamiento de ADN genómico PureGene (Gentra Systems, Inc. , Minneapolis, MN). El gen crtE se amplificó utilizando el ADN genómico y los siguientes dos oligonucleótidos. 5'oiigo = 20D3Up gaattcGTTTATAAGGACAGCCCGA (SEQ ID NO: 12) 3'oligo = 20D3LO ctgcagTCCTTAACTGACGGCAGCGA (SEQ ID NO: 1 3). Oligo 20D3Up contiene las secuencias que corresponden a la posición #206 a #224 de la secuencia de Acceso al Banco de Genes #D90087. Oligo 20D3Lo contiene el complemento inverso de las secuencias de la posición #1 1 1 7 a #1 1 36 del mismo archivo de la secuencia dei Banco de Genes. El ADN amplificado se ligó en el sitio Srfl de pCR-Script SK (+) (Stratagene, La Joya, CA) para generar el plásmido pSW1 -B. Este plásmido se digirió entonces con EcoRI y Sacl, y el fragmento de 973 bp que contiene el gen crtE se purificó y ligó en pAD314-956 digerido con EcoRI-Sacl para generar el plásmido pSW2B. El plásmido pSW2-B se digirió con BamHI para generar un fragmento de 2199 bp que contiene el promotor ADH1 , secuencia de codificación crtE, y terminador ADH1, y este fragmento se ligó en YEp352 digerido con SamHI para generar pSW4, que se colocó en el gen crtE en la orientación opuesta a aquella del gen URA3 en el plásmido, y pSW4B, que colocó el gen crtE en la misma orientación que el gen URA3. El plásmido pADH31 3-956 se generó de la siguiente manera. El plásmido pRS31 3 (Sikorski y Hieter, 1 989) se digirió con Sacl y Xbal, trató con polimerasa de ADN T4 para crear extremos redondeados, después se relegó para generar el plásmido pDSX31 3. Este plásmido se digirió con Smal y Apal, trató con polimerasa de ADN T4 para crear extremos redondeados, y después se relegó para generar pDSXSA313. El plásmido pAAHd (Ammerer, G. , 1983, Meth. Enzymol. 1 01 : 1 92-201 ), que porta el promotor ADH1 y terminador separado por un sitio Hindlll , se digirió con Hindlll , después se ligó a ios siguientes dos oligonucleótidos anulares para introducir un sitio de clonación múltiple y crear pAAH5-MCS. 5'oligo = MCS1 AGCTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGCTCTAGAGTC GACCTGCAGGCATGCA (SEQ ID NO:14) 3'oligo = MCS2 AGCTTGCATGCCTCCAGGTCGACTCTAGAGCCCG GG TACCGAGCTCGAATTC (SEQ ID NO: 1 5) Una reacción de PCR que contiene pADH31 3-MCS como templado y los siguientes dos ollgonucleótidos se llevó a cabo, y un producto PCR de 1 232 bp que contiene el promotor ADH1 , sitio de clonación múltiple, y terminador ADH1 se obtuvo. 5'oligo = ADH1 A gacggatCCGTGGAATATTTCGGATATCC (SEQ ID NO: 16) 3'oligo = ADH1 B ctcggatccGGACGGATTACAACAGGTATTGTCC (SEQ ID NO: 1 7) Oligo ADH1 A contiene las secuencias que corresponden a la posición #16 a #37 de la secuencia de Acceso al Banco de Genes #V01292. Oligo ADH1 B contiene ei complemento inverso de las secuencias de la posición #2092 a #21 16 del mismo archivo de secuencia del Banco de Genes. El producto PCR de 1232 bp se digirió con BamHl y ligó en pDSXSA313 digerido con BamHI para generar el plásmido pADH313-956. Para clonar el gen a 1-3 de N. crassa, el ADN genómico se aisló de ATCC 14692 cepa N. crassa utilizando el método descrito por Borges ef al. , en la sección de métodos del web site de Fungal Genetics Stock , Center's ( ). El gen se amplificó mediante PCR utilizando los siguientes dos oligonucleótidos. 5'oligo = VE 1 1 8-5 cagaatTCACCATGGCCGTGACTTCCTCCTC (SEQ ID NO: 1 8) 3' oligo = VE 1 1 9-3 caagatctCATACATTCAATCCTCATGGACAC (SEQ ID NO: 19). Oligo VE1 18-5 contiene las secuencias que corresponden a la posición #1216 a #1240 de la secuencia de Acceso al Banco de Genes #U20940. Oligo VE1 1 9-3 contiene el complemento inverso de las secuencias de la posición #2576 a #2599 del mismo archivo de secuencia del Banco de Genes. EL ADN amplificado se ligó en el sitio Srfl de pCR-Script SK (+) (Stratagene, La Joya, CA) para generar pSW7-1 y pSW7-2, dos clones PCR independientes del gen a 1-3. Estos dos plásmidos se digirieron con EcoRI y Bgl ll, y el fragmento de 1393 bp que contiene el gen a 1-3 se purificó y ligó en EcoRI, pPGK digerido con SamHI (Kang et al. , 1990) para generar pSW9-1 y pSW9-2, con la secuencia a1 -3 en cada derivado de pSW7-1 y pSW7-2, respectivamente. Para clonar el gen ggs, el ADN genómico se preparó de ATCC 1261 7 cepa Gibberella fujikuoi, utilizando el mismo procedimiento descrito arriba para Neurospora. El gen ggs se amplificó por PCR utilizando los siguientes dos oligonucleótidos. 5' oligo = VE 1 20-5 gagaattCTTAACACGCATGATCCCCACGGC (SEQ ID NO:20) 3' oligo = VE 1 21 -3 ctggatcCGTCAAATCCGTGAATCGTAACGAG (SEQ ID NO:21 ). Oligo VE120-5 contiene las secuencias que corresponden a la posición #607 a #630 de la secuencia de Acceso al Banco de Genes #X96943. Oligo VE121 -3 contiene el complemento inverso de ias secuencias de la posición #1 908 a #1 932 del mismo archivo de secuencia del Banco de Genes. EL ADN amplificado se ligó en el sitio Srfl de pCR-Script SK (+) (Stratagene, La Joya, CA) para generar pSW8-1 y pSW8-2, dos clones PCR independientes del gen ggs. Estos dos plásmidos se digirieron con EcoRI y SamHI, y el fragmento de 1335 bp que contiene el gen ggs se purificó y ligó en EcoRI, pPGK digerido con SamHl para generar pSW10-1 y pSW10-2, con la secuencia a 1 -3 en cada derivado de pSW8-1 y pSW8-2, respectivamente. La cepa EMS9-23 (ura3, erg?, descrita en el Ejemplo 1 .G) se transformó con los plásmidos descritos arriba utilizando el método LiOAc, y los transformantes se seleccionaron de las placas SCE-ura. Los transformantes se eligieron y movieron en placas SCE-ura para su purificación. Los transformantes representativos se probaron para producción de GG. Las cepas se desarrollaron a 30°C durante 48 horas en medio SEC-ura líquido, después se utilizaron para inocular matraces que contienen el medio YPDE, de tal manera que el OD6oo inicial fue 0.5. Estos cultivos se incubaron a 30°C con agitación durante 72 horas y analizaron para el peso de la célula en seco, farnesol y niveles GG. Un segundo conjunto de matraces que contienen 20 ml de medio SEC-URE también se inoculó de los mismos cultivos iniciales y se desarrollaron durante 48 horas. La células de esos matraces se cosecharon, enjuagaron con 10 ml de 50 L de regulador de Bis-Tris-fosfato, pH 7.0 y renodulizado. Las pastillas de la célula se utilizaron entonces para preparar suspensiones de célula permeabilizada para los análisis de síntesis GGPP. Las células se permabilizaron al volver a suspender en 1 ml de 50 mM de regulador Bis-Tris-Propane, pH 7.0, que contiene 0.1 % de Tritón X100, y congela a 80°C hasta que sea necesario. Después de derretir, la células permeabilizadas se utilizaron para los análisis de síntesis de GGPP. La mezcla del análisis de sintasa GGPP contuvo 0.05 M de regulador Bis-Tris-propane, pH 7.0 (Cµ1 ), 0.1 ;M de ditiotreitol (1 µL); 1 mg/ml FPP (5 µl), 1 mg(ml de IPP (5 µl) y células permeabilizadas (1 µL), en donde X+Y = 87 µL. Un acceso de control se incluyó, en donde el FPP e IPP no pueden incluir. Las mezclas de análisis se incubaron a 37°C durante 20 minutos. 0.1 ml de regulador de glicerina 2X (0.2 M de glicina, 2 mM de MgCI2, 2 mM de ZnCI2, pH 1 0.4) y 63 unidades fosfatasa de alquileno (Sigma Chemical Co. , St. Louis, MO), se agregaron, y ias mezclas se incubaron durante 2 minutos a 37°C. Las mezclas se extrajeron entonces con 0.2 ml 1 : 1 de hexano: acetato de etilo, y analizaron por GG por GC/MS. La actividad de sintasa se expresa en nmol GGPP formado/min/mg/ proteína. Los pesos de célula en seco, producción de farnesol, producción de GG y actividades de sintasa GGPP para las cepas se resumen en la Tabla 1 3. La cepa de control, EMS923/Yep352, que carece de sintasa GGPP clonada, hizo 8.7% de farnesol (en base a peso de célula en seco) y esencialmente no GG. La cuatro otras cepas, cada una de las cuales sobreexpresó una sintasa GGPP clonada diferente, producida aproximadamente la misma cantidad de farnesol como el control /8.0 - 9.74%) y niveles producidos de GG variando de 0.62-1 .73%: Tabla 13. Producción de GG en Cultivos de Matraz Vibrante de Cepas que Sobreexpresan Cuatro Genes de Sintasa GGPP Clonados, Diferentes.

El efecto de amplificación de actividad de sintasa GGPP en la producción de GG se evaluó además en termentadores l-L. La cepa EMS29-23 se transformó con plásmido pTWM1 1 0-1 1 , que porta el gen BST1 de S. cerevisiae. La cepa SWE23-?E91 (descrito en ei Ejemplo 1 .G de arriba), se transformó con ya sea Yep352 (vector de control) o pSW4A-3 (un individual para aislar el plásmido pSW4A, que porta ef gen crtE clonado. Las cepas SWE23-?E91 /YEp352, EMS29- 23/pTWM 1 1 0-1 1 , y SWE23-?E91 /pSW4A-3 se desarrollaron en termentadores de 1 L utilizando el método descrito en el Ejemplo 1 .H y el crecimiento, producción de farnesol y producción de GG se compararon. Los resultados se muestran en la Figura 7 y Tabla 14. El crecimiento de las tres cepas fue similar. La cepa SWE23-?E91 /YEp352 produjo 2.32 g/L de farnesol en 236 horas, y no produce ningún GG detectable. EMS9-23/pTWM1 10-1 1 produjo 2.1 g/L de farnesol en 239 horas y también produjo 0.42 g/L de GG en el mismo periodo de tiempo. La cepa SWE23-?E91 /pSW4A-3 produjo 2.47 g/L de famesol en 236 horas y también produjo 0.59 g/L de GG en el mismo periodo. La actividad de sintasa GGPP en la cepa de control fue por debajo de limites detectables. La producción de GG mediante las cepas EMS29-23/pTWM1 10-1 1 y SWE23-?E91 /pSW4A-3 se correlacionaron a actividad de sintasa GGPP incrementada. Tabla 14. Crecimiento, Producción de GG y Farnesol en Cepas que Sobreexpresan Sintasas GGPP y Desarrolladas en Fermentadores de 1 L.

Eiemplo 6 Este ejemplo ilustra el efecto de sobreexpresar el gen ERGT que codificada sintasa FPP. Para determinar los efectos de elevar los niveles de sintasa FPP en mutantes erg9, el gen ERGT que codifica la sintasa FPP de Saccharomyces cerevisiae se clonó para sobreexpresión. El gen ERGT se amplificó por PCR utilizando ADN genómico de la cepa S288C de S. cerevisiae (preparada de acuerdo al método descrito en Sherman ef al. , 1986) y los siguientes dos oligonucleótidos. 5' oligo = BamFPPUp ggccggatccATATTACGTAGAAATGGCTTCAG (SEQ ID NO:22) 3' oligo = XhoFPPLo gccgctcgagGGTCCTTAT CTAGTTTG (SEQ ID NO:23). Oligo BamFPPUp contiene secuencias que corresponden a la posición #790 a #810 de la secuencia de Acceso al Banco de Genes #J05091 . Oligo XhoFPPLo contiene el complemento inverso de las secuencias de la posición #1 891 a #1 907 del mismo archivo de secuencia del Banco de Genes. El producto PCR se digirió con Ba HI y X?ol, y ligó en un vector que contiene el promotor GPD de S. cerevisiae (gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa) y terminador PGK. El vector promotor/terminador se obtuvo al digerir un plásmido que contiene el dominio catalítico del gel HMG2 S. cerevisiae clonado entre el promotor GPD y terminador PGK, principalmente pRH 1 24-31 (descrito en el Ejemplo 4), con Sa HI y Sa 1 l para remover el ADN HMG2. La banda de 6.3 kb que corresponde al vector promotor/terminador se purificó y ligó al fragmento de 1 1 29 bp que contiene ERG20 para generar pJMB1931 y pJMB19-32. Los plásmidos pJMB1931 y pJMB19-32 se utilizaron para transformar la cepa SWE23-?E91 (ura3, his3, erg9?::HIS3) utilizando el método LiOAc, y los transformantes se seleccionaron en placas SCE-ura. Los transformantes se recolectaron y volvieron a mover en placas SCE-ura para su purificación. Para determinar los efectos de sobreexpresión de sintasa FPP en cepas de mutante erg?, los transformantes representativos construidos como se describe arriba se desarrollaron en cultivos de matraz vibrante y se compararon para crecimiento, producción de farnesol, producción de GG y actividades de sintasa FPP y sintasa GGPP. Las cepas se desarrollaron con agitación a 30°C durante 48 horas en medio SCE-ura líquido, después se utilizó para inocular matraces que contienen medio YPDE, de tal manera que el OD60o inicial fue 0.5. Estos cultivos se incubaron a 30°C con agitación por un adicional de 72 horas y analizó por peso de célula en seco, niveles de farnesol y GG. Un segundo conjunto de matraces que contienen 20 ml de medio SCE-ura también se inoculó de los mismos cultivos iniciales y se desarrolló durante 48 horas. Las células de estos matraces se recolectaron, enjuagaron con 10 ml de 50 mM de regulador BisTris-Propane, pH 7.0, y se volvieron a nodulizar. Las pastillas celulares se utilizaron entonces para preparar suspensiones celulares permeabilizadas para análisis de sintasa FPP y GGPP. Las células se permeabilizaron al volver a suspender en 1 ml de 50 mM de regulador Bis-Tris-Propane, pH 7.0, que contiene 0.1 % de Tritón X100, y congeló a 80°C hasta que se necesite. Después de derretir, las células permeabilizadas se utilizaron para análisis. La mezcla del análisis de sintasa GGPP fue la misma como se describe en el Ejemplo 5. La mezcla del análisis de sintasa FPP contuvo 0.05 M de regulador Bis-Tris propano, pH 7.0 (X µ1 ), 0.1 M de ditiotreitol (1 µl), 0.5 M de MgCI2 (2 µl), 1 mg/ml IPP (6 µl), 1 mg/ml geranildifosfato (GPP) (6 µl), y células permeabilizadas (Y µl), en donde X+Y = 85 µl. Una reacción de control se incluyó, en la cual IPP y GPP se omitieron. Las mezclas de análisis se incubaron a 37°C durante 15 minutos, 0.1 ml de regulador de glicina 2x (0.2 M de glicina, 2 mM de MgCI2, 2 mM de ZnCI2, pH 1 0.4) y 63 unidades de fosfatasa alcalina (Sigma Chemical Co. , St. Louis, MO) se agregaron, y las mezclas se incubaron durante 60 minutos a 37°C. Las mezclas se extrajeron entonces con 0.2 ml 1 : 1 hexano: acetato de etilo, y analizaron por Farnesol por GC/MS. La actividad de sintasa FPP se expresa como proteína FPP formada/min/mg en nmol. Los datos presentados en la Tabla 1 5 muestran que la sobreexpresión de la sintasa FPP no incrementa la producción, pero, incrementa de manera inesperada, la producción de GG en estos cultivos de matraz vibrante. El nivel de GG producido por SWE23-?E91 /pJMB 1 3-31 o SWE23-?E91 /pJMB 19-32 fue aún más elevado que aquel observado para la cepa EMS923/pTWM 1 1 0-1 1 ) que sobreexpresa el gen B TS 1 de S. cerevisiae (sintasa GGPP).

Tabla 15 Producción de GG en mutantes erg9 que sobreexpresan la sintasa FPP y sintasa GGPP El efecto de amplificación de la actividad de sintasa FPP en la producción de GG se evaluó además en fermentadores de 1 L. Las cepas SWE23-?E91 /YEp352 (control), EMS9-23/pSW4A3 (crtE, Q sintasa GGPP) y SWE23-?E91 /pJMBl 9-32 (ERG20, sintasa FPP) también crecieron en fermentadores de 1 litro utilizando el método descrito en el Ejemplo 1 .H, y el crecimiento, producción de farnesol, producción de GG y actividad de sintasa GGPP se compararon (Figura 8 Tabla 16). El crecimiento de las tres fue similar, aunque SWE23- 5 ?E91 /pJMB 1 9-32 se atrasa antes de crecer a una velocidad similar a las otras cepas. La cepa SWE23-?E91 /YEp352 produjo 2.31 g/L de farnesol en 258 horas y no produjo ningún GG detectable. EMS9-23/pSW4A3 produjo 2.52 g/L de farnesol y 0.57 g/L de GG en 258 horas. La cepa SWE23-?E91 /pJMB19-32 produjo 1 .95 g/L de farnesol en 258 horas y también produjo 0.59 g/L de GG en el mismo periodo. La producción de GG inesperada por SWE23-?E91 /pJMB19-32 se correlacionó a actividad de sintasa GGPP incrementada en esta cepa (ver abajo). Ninguna actividad de sintasa GGPP se detectó en la cepa de control SWE23-?E91 /YEp352. La cepa EMS9-23/pSW4A3, que expresa el gen crtE (sintasa GGPP) de E. uredovora mostró actividad de sintasa GGPP relativamente elevada (1 .7 nmol/min/mg en células del punto de tiempo de 258 horas). Como se espera, la cepa SWE23-?E91 /YEp352, que sobreexpresa la sintasa FPP de S. cerevisiae, contuvo actividad de sintasa FPP, que se elevó > 10 veces en todos los puntos de tiempo a través de la fermentación en comparación a un control que tienen solamente niveles normales de sintasa FPP (datos no mostrados). Sin embargo, de manera sorprendente, la cepa SWE23-?E91 /pJMB19-32 también tuvo actividad de sintasa GGPP elevada (Tabla 16). Esta actividad considera sin duda la producción de GG inesperada por esta cepa. La actividad de sintasa GGPP elevada detectada en la cepa SWE23-?E91 /pJMB 1 9-32 podría se r un resultado de la sobreexpresión de sintasa FPP que induce l a actividad de la sintasa GGPP (el producto de gen B TS1). Sin em bargo, es posible que la sintasa FPP tenga algún nivel bajo de actividad de sintasa GGPP que se revela en esta cepa debido a alto grado de sobreproducción de la sintasa FPP. Tabla 16. Efecto de Sintasa FPP Amplificada en Crecimiento, Producción de GG y Farnesol de Cepas Desarrolladas en Fermentadores de 1 L.

Eiemplo 7 Este ejemplo evalúa varios procedimientos de extracción de farnesol. En el primer experimento, se hizo una comparación entre la extracción del caldo completo (células más medio) y las extracciones separadas de la pastilla celular y medio bajo varias condiciones para MBNA1 -1 3 (productor de farnesol) y ATCC 28383 (producto de ergosterol) (ver Ejemplo 1 ). Una muestra de 1 0 ml de cultivo se extrajo generalmente como se describe en el Ejemplo 1 , pero con los cambios indicados en ia Tabla 1 7 de abajo. El método 1 en la Tabla 1 7 es el mismo que ei método descrito en el Ejemplo 1 . Se encontró que, para extracción de farnesol, una extracción de caldo completo fu justamente tan eficiente como una extracción de medio y célula separadas para los métodos 1 , 2, 3, 5 y 7. Se extrajo más farnesol por el método 5, que es justamente un adición de 2 ml de 0.2% de pirogaloi en metanol antes de extraer el caldo completo en hexano. La segunda extracción más elevada fue el método 1 . TABLA 17 Después, los experimentos se condujeron para determinar los efectos del tipo de solvente de extracción (método 1 , caldo completo), tiempos utilizados para la extracción (método 1 , extracción de hexano, caldo completo) y la cantidad de metanol agregada antes de la extracción (método 1 , extracción de hexano, caldo completo). Los resultados se presentan en las Tablas 17-19 de abajo.

Tabla 17 * valor máximo de solvente coeluido con farnesol, haciendo la cuantificación de farnesol imposible utilizando este método. Tabla 18 Tabla 19 Se hizo trabajo adicional para perfeccionar y simplificar el procedimiento de extracción para farnesol, y para adaptar el procedimiento de extracción de GG de caldos de fermentación . Este trabajo resultó en el procedimiento de extracción final descrito abajo. 1 . El caldo de fermentación completo se utiliza sin diluir o diluido apropiadamente con agua en un volumen final de 2.0 ml en un tubo de prueba vitreo 5 cubierto de teflón. 2. Se agregan 2.0 ml de hexano 3. Se agregan 2.0 ml de metanol. 4. El tubo se pone en vórtice en velocidad elevada de 3.5 minutos. 0 5. La muestra se centrífuga a 2,800 rpm en una centrífuga superior de tabla durante 25-30 minutos para separar las fases 6. El supernatátil (fase orgánica) se retira y se coloca en un frasco GC/MS vitreo cubierto de teflón de 20 5 ml para la determinación de farnesol y GG mediante GC/MS. Eiemplo 8 Este ejemplo ilustra la producción de geranilgeraniol-2,3- epóxido en donde la epoxidación se conduce en tolueno utilizando 0 íerf-butilhidroperóxido en la presencia de vanadio. Una solución de 5.0 gramos de geranilgeraniol (0.0172 mole) en 25 ml de tolueno se trató con 50 mg de tris(acetilacetona) vanadio (0.8 mol %) y agitó a reflujo bajo nitrógeno. 5.76 ml de tert- butilhidroperóxido 3.3 molar en tolueno (0.01 9 mole) se agregaron 5 gota a gota. Al final de la adición, el calentamiento se discontinuó y la mezcla se dejó enfriar a temperatura ambiente. En análisis por cromatografía de capa delgada describió la conversión completa del material inicial a un producto único. La mezcla de reacción se trató con aproximadamente 50 ml de aproximadamente 5% de solución de sulfito de sodio acuosa, agitó 10 minutos y decantó. La fase orgánica se enjuagó con agua, 5% de NaHCO3, salmuera, y se secó sobre MgSO . El retiro del solvente bajo presión reducida proporcionó 5.28 g (98%) de producto aceitoso amarillo pálido. El análisis NMR soportó la estructura deseada de geranilgeraniol-2,3-epóxido. Eiemplo 9 Este ejemplo ilustra la producción de epoxifitol mediante la hidrogenación de geranilgeraniol-2,3-epóxido. El producto total del Ejemplo 6 se disolvió en 50 ml de etanol, trató con 0.2 gramos de 5% de paladio en catalizador de carbono, e hidrogenó a 1 atm de H2 durante 72 horas (tratamiento por aproximadamente 4 hrs a 40 psi H2, 40 deg C es más conveniente). La mezcla se filtró (celita) y se despojó de solvente para dar 5.03 gramos (95%) de producto como un aceite sin color, idéntico por cromatografía y espectroscopia NMR con una muestra auténtica de epoxifitol preparada por la epoxidación de fitol. Eiemplo 1 0 Este ejemplo ilustra la preparación de una mezcla de • fitol/isofitol de epoxifitol. Una solución de 5.0 gramos de epoxifitol (0.016 mol) del Ejemplo 7 y 4.72 gramos de trifenilfosfina (0.01 8 mol) en 50 ml de tolueno se trataron con 80 mg de trióxido de metilrenio y se agitaron bajo reflujo durante dos horas. El análisis de cromatografía de capa delgada indicó la ausencia de material inicial y la presencia de isofitol, fitol y una señal de olefinas de paso frontal. La mezcla se enfrió, filtró a través de un cojinete pequeño de gel de sílice para remover el catalizador, y se despojó de solvente para dar 5.0 gramos de producto crudo. La cromatografía de gel de sílice proporcionó 0.4 gramos de fitadienos (7.4%) y 3.9 gramos (83%) de una mezcla 3: 1 de ísofitol y fitol. Los pasos subsecuentes de este experimento se condujeron utilizando menos catalizador (20-40 mg) y retiro de catalizador al enjuagar con solución de carbonato de sodio acuosa (el producto de hidrólisis amarillo ReO " va en la capa de agua inmediatamente). Los productos crudos de este procedimiento fueron esencialmente libres de fitadienos (nmr, vpc). La destilación dio la mezcla de fitol/isofitol en más del 90% de producto. Eiemplo 1 1 Este ej'emplo ilustra la producción de gamma-tocoferol. Una solución de 18.9 gramos (0.0446 mol) de 4-cromanona tocotrienol 10 en 20 ml de alcohol de etilo se trató con 2 gramos (peso húmedo de etanol) de catalizador de níquel Raney y se hidrogenó con agitación a 500 psi de hidrógeno y 1 50 grados C durante 7 horas. La reacción se enfrió, ventiló, el catalizador se filtró y el filtrado se despojó de solvente al vacío para dejar 1 8.9 gramos de un producto aceitoso amarillo claro. El análisis del producto por NMR de protón, espectroscopia de masa, y espectroscopia IR estableció que fue gamma-tocoferol; el análisis mediante cromatografía de gas cuantitativo describió una composición de 97.07% en peso de gamma-tocoferol, el resto siendo etanol. El producto fue 98.9% de teoría. Eiemplo 12 Este ejemplo es un ejemplo comparativo para ilustrar que el procedimiento para la preparación de gamma-tocoferol del Ejemplo 9 no funciona para la preparación de alfa-tocoferol. Una solución de 6.2 gramos de 4-cromanona 14 en 200 ml de etanol se trató con 2 gramos (peso húmedo) de catalizador de níquel Raney y se hidrogenó a 1 50°C, 500 psi de hidrógeno, con agitación durante 7 horas. El funcionamiento como se describe en el Ejemplo 9 dio 6.1 gramos de un jarabe amarillo que fue mostrado por en análisis NMR de protón por tener una estructura de una ketona saturada (sin protones olefínicos observados; protones en posición 3, alfa a carbonilo, cuarteto, j=1 2 hz, 2.66 ppm); el análisis IR mostró la presencia del grupo carbonilo (1663 cm"1) y el espectro de masa mostró m/e 444 (cale, para 11 , 444). El análisis cromatográfico de gas no detecta la presencia de ningún a/fa-tocoferol en el producto crudo. Eiemplo 1 3 El siguiente ejemplo demuestra el efecto de amplificación de reductasa HMG CoA en producción de GG mediante una cepa que sobreexpresa la cinta GGPP. En este experimento, se construyó una cepa que tiene una sola copia de un plásmido integrado en su genoma que permite a ias células sobreexpresar la sintasa GGPP. El piásmido de integración se conoce como pSW35-42, y se construyó como sigue. El plásmido pSW4A (ver Ejemplo 5) se digirió con BamHl para generar un fragmento de 21 99 bp que contiene una fusión del promotor ADH1 , secuencia de codificación crtE y terminador ADH1. Este fragmento se ligó entonces en Ylp351 digerido por BamH l (Hill eí al. , 1986, Yeast/E. coli Shuttle Vectors with Múltiple Unique Restriction Sites, YEAST 2: 163-167) para generar pSW35-42. Para construir una cepa que contiene pSW35-42, este plásmido se digirió con la endonucleasa de restricción BstEII para introducir un solo corte dentro del gen LEU2. El plásmido linearizado se purificó y utilizó para transformar la cepa SWE23-DL1 utilizando el método LiOAc. Los transformantes en los cuales se ha integrado pSW35-42 en el lugar LEU2 se selecciona en medio que carece de leucina. Una de las cepas transformadas resultantes se refiere como SWE23-DL1 : : pSW35-42. Esta cepa se transformó entonces con ya sea YEp352 (un control de vector vacío, Hill eí al., 1986, LEVADURA 2: 163-1 67) o con pRH 1 24-31 (contiene el dominio catalítico del gen HMG2, ver Ejemplo 4) , que resultó en cepas SWE23-DL1 : :pSW35-42/?Ep352 y SWE23-DL1 : : pSW35-42/pRH 1 24, respectivamente. La cepa SWE23-DL1 : : pSW35-42/YEp352 sobreexpresa la sintasa GGPP mientras que SWE23-DL1 : : pSW35-42/pRH 1 24 sobreexpresa la sintasa GGPP y reductasa HMG CoA. Los experimentos de fermentación de las cepas SWE23- DL1 : :pSW35-42/pRH 124 y SWE23-DL1 ::pSW35-42/YEp352 se condujeron para comparar la producción de GG por estas dos cepas. Las cepas se probaron para la producción de GG en fermentadores de 1 L utilizando el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 .H. Los datos de fermentación se presentan en la Tabla 20. Este experimento muestra que la fermentación de SWE23-DL1 ::pSW35-42/pRH 1 24 acumuló más GG que la fermentación de SWE23-DL1 : : pSW35-42/YEp352, y demuestra que la elevación de la actividad de reductasa HMG CoA en una cepa diseñada para producir GG resultó en una elevación adicional de niveles GG en comparación a una cepa similar con una reductasa HMG CoA no amplificada. Tabla 20 Un segundo planteamiento para lograr la sobreexpresión de reductasa HMG CoA y sintasa GGPP en la misma cepa se llevó a cabo al clonar ambos genes en un vector de levadura de número de copia elevado, y transformar este plásmido en una cepa mutante erg?. El plásmido utilizado para este propósito se refiere como pSW46-1 , y este se construyó sigue. El plásmido pSW4A (ver Ejemplo 5) se digirió con EcoRI y Sacl y el fragmento de 0.9 kb que contiene el gen crtE se purificó y ligó en EcoRI, Sacl digirió pADH31 3-956 para generar pSW38-1 0. Dos regiones de este plásmido se borraron mediante la digestión con enzimas de restricción, llenando los extremos del ADN utilizando polimerasa Pfu, y ligar para reformar el plásmido circular. Las regiones borradas de esta manera se encuentran entre los sitios Ndel y Spel, y entre ios sitios Hindlll y Pstl. El plásmido resultante se refiere como pSW43-5. El plásmido pSW43-5 se digirió con BamHl, y el fragmento de 2199 bp resultante que contiene el promotor ADH1 , gen crtE, y terminador ADH1 (referido como el fragmento ADHp/ crtElADHt) se purificó y ligó en el sitio BamHl de YEp352. El píásmido resultante se refiere como pSW44-17, y difiere de pSW4A en que contiene uno en lugar de dos sitios Pstl. El plásmido pRH 1 24-31 se digirió con Xbal y Psfl y el fragmento de 3.2 kB que contiene el promotor GPD, el gen de dominio catalítico HMG2, y el terminador PGK (referido como el fragmento GPDp/HMG2cat/PGKt) se clonó en Xbal, Pstl digirió pSWA44-17 para generar pSW46-1 . Este plásmido se replica a un número de copias elevado en levadura que contiene ambos genes HMG2 y crtE, proporcionándose para la sobreexpresión de reductasa HMG CoA y sintasa GGPP. El plásmido pSW46-1 se transformó en la cepa de mutante erg? SWE-DE91 , y los transformantes URA+ se aislaron . Varios de estos transformantes resultantes se probaron en un experimento de matraz vibrante y se compararon con una cepa que sobreexpresa solamente sintasa GGPP (EMS9-23/pSW4A). Los resultados de ese experimento se presentan en la Tabla 21 , y demuestran que los niveles más elevados de GG se acumulan en cepas que sobreexpresan tanto la reductasa HMG CoA como sintasa GGPP cuando se compara con una cepa que sobreexpresa solamente sintasa GGPP. Tabla 21 Estos datos soportan la idea de que la sobreexpresión de reductasa HMG CoA en una cepa que es capaz de producir niveles elevadas de GG conduce a un incremento adicional en la cantidad de GG producido. Eiemplo 14 El siguiente ejemplo describe la producción de cepas más estables que sobreexpresan reductasa HMG CoA. Como se describe en el Ejemplo 4, se construyeron las cepas que sobreexpresan reductasa HMG CoA debido a la presencia de plásmidos de replicación de número de copia elevado que contienen genes HMG Icat o HMG3cat. Ya que los plásmidos de replicación puede perderse frecuentemente durante ia división celular, esta inestabilidad mitótica de los plásmidos de replicación puede conducir eventualmente a cultivos con una proporción elevada de células que contienen solamente niveles de reductasa HMG CoA normales. Con objeto de obtener cepas más estables que la reductasa HMG CoA, las copias del gen que codifica el dominio catalítico de HMG2p se integró en el genoma de la cepa SW23B. Esto se llevó a cabo al construir primero un plásmido que permite las múltiples integraciones del gen HMG1 en la región espaciadora del gen rARN. Este planteamiento se modela después del método de integración de rADN descrito por Lopes ef al, 1 989 (Lopes, T.S. , Klootwijk, J. , Veenstra, A. E. van der Aar, P.C. , van Heerikhuizen, H.M Raue, H.A., y Planta, R.J. 1 989. La integración del número de copia elevado en el ADÑ ribosómico de Saccharomyces cerevisiae: un nuevo vector para expresión de nivel elevado. Gene 79: 199-206). PCR se utilizó para amplificar dos regiones del lugar rAR que yacen en la región intergénica entre el gen que codifica el rARN 35S y el gen que codifica el rADN 5S, referida en la presente como región espaciadora rADN . Los oligonucleótidos utilizados para amplificar el primero de los dos fragmentos de la región espaciadora rADN contuvieron secuencias que corresponden a las bases #1 1 161 a #1 1 1 30 y ei complemento inverso de #1 031 1 a #1 0330 del Acceso al Banco de Genes #Z73326. Las secuencias de oligonucleótidos se listan abajo. Las letras minúsculas del caso se utilizan para indicar las bases que se alteran o agregan para crear sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción, que se indican en paréntesis siguiendo la secuencia de oligonucleótido. SEQ ID NO:24: RßXbal Lo 5'-tctagaGGCACCTGTCACTTTGGAAAAAAAATATACGC-3' (Xbal) SEQ ID NO: 25: R7Sacll Up 5'-ccgcggGCCGGAAATGCTCTCTCTGTTC-3' (Sacll) El fragmento de ADN generado de amplificación PCR utilizando estos dos oligonucleótidos se refiere en la presente como el fragmento R6/R7. El fragmento R6/7 generado por PCR se clonó inicialmente en el plásmido pCR-Script para generar pSW48-1 , después cortar de este plásmido por digestión con XbAl y Sacll. El fragmento 759 bp resultante se clonó entonces en Xbal, Sacll digirió pBluescript SK- (Sratagene) para generar pSW49-1 . Los oligonucleótidos utilizados para amplificar el segundo fragmento de ia reglón espaciadora rADN contuvieron secuencias que corresponden a las bases #1 1 247 a #1 1272 y el complemento inverso de #12054 a #1 2072 del Acceso al Banco de Genes #Z73326. Las secuencias de estos oligonucleótidos se listan abajo. SEQ ID NO:26: R5Sa 1 UpB 5'-CACgtCgACCATTCAAACTTTACTAC-3' (Sa 1l) SEQ ID NO: 27: R4Apal Lob 5'-GAGGGCccGGTCCAGACAT-3' (Apal) El fragmento de ADN generado de amplificación PCR utilizando estos dos oligonucleótidos arriba listados se refiere en la presente como el fragmento R4/R5. El fragmento R4/R5 generado por PCR digirió con Apal y Sa 1 l, y ligó en Apal, Sa 1 l digirió pSW49-1 para genera pSW52-1 1 . PCR se utilizó para amplificar el gen TRP1 de tal manera que el gen portó un promotor incompleto. El promotor incompleto se propuso para reducir la expresión del gen TRP1 , y proporcionar así un medio de selección para integración del número de copia elevado del cassette de expresión final. Los oligonucleótidos utilizados para el gen TRP1 contuvieron secuencias que corresponden a las bases #53 a #73 y el complemento inverso de #804 a #823 del Acceso al Banco de Genes #J01 374. Las secuencias de estos oligonucleótidos se listan abajo. SEQ D NO:28: TRP 1 SmaUp 5'-cccgggTATTGAGCACGTGAGTATACG-3' (Smal) SEQ ID NO:29: TRP1 BamLo 5'-ggatccGGCAAGTGCACAAACAATAC-3' (BamHl) En la siguiente etapa, pSW50-1 se digirió con BamHl y Smal, y el fragmento TRP1 de 779 bp resultante se purificó. El plásmido pRH 1 24-31 se digirió con Pstl y Smal para generar un fragmento de 3261 bp que contiene el promotor GPD, gen HMG2 cat, y el terminador PGK (referido como el fragmento GPDp/HMG2cat/PGKt), y este fragmento se purificó. El fragmento TRP1 y el fragmento GPDp/HMG2cat/PGKt se ligaron en Pstl, BamHl digirió pSW52-1 1 en una ligación de tres fragmentos para generar pSW58-77 y pSW58-45. El fragmento de ADN que contiene las fusiones del gen R6/R7-TRP1-GPDplHMG2catfPGK t-R4/R5 se cortó de pSW58-77 mediante la digestión con las endonucleasas de reacción Sacl y Kpnl. El fragmento de 5671 bp que corresponde a la construcción de integración se purificó y utilizó para transformar la cepa SW23B. Los transformantes se seleccionaron en medio SCE-trp. Las cepas aisladas de esta manera se seleccionaron para la elevación de la actividad de reductasa HMG CoA y mediante análisis de Southern blot para la elevación del número de copias del gen HMG2. Las cepas se identificaron portando una copia de la construcción integrante, dos copias de la construcción integrante, tres copias de la construcción integrante, y ocho copias de la construcción integrantes y se refieren como SW23B#1 9, SW23B#31 , SW23B#40, y SW23B#74, respectivamente. La Tabla 22 da la actividad específica de la reductasa HMG CoA como se determina en análisis de enzima in vitro y el número de copias del gen HMG cat como se determina por Southern blotting. El análisis de reductasa HMG CoA se describe previamente (Quain, D. E. y Haslam, J. M. 1979. The Effects of Catabolite Derepression on the Accumulation of Steryl Esters and the Activity of ß-Hydroxymethylglutaryl-CoA Reductase in Saccharomyces cerevisiae, J. Gen. Microbiol. 1 1 1 : 343-351 ).

Tabla 22 Estas cepas requieren uracilo y leucina exogenósamente suministradas para el crecimiento debido a las mutaciones leul y ura3 en estas cepas. Para eliminar la necesidad de suministrar estos nutrientes durante los experimentos de fermentación, las cepas se transformaron con un plásmido, pTWM1 38, que contiene las copias funcionales de URA3, LEU2 y TRP1. La presencia de este plásmido en estas cepas permitió que las cepas crecieran sin complementación de leucina y uracilo. Los experimentos de fermentación se llevaron a cabo para comparar la producción de farnesol mediante estas cepas. También incluida en este experimento se encuentra la cepa SWE23- DE91 /pRH 1 24-31 que contiene la fusión del gen GPDp/HMG2cat/PGKt en un plásmido de número de copias elevado (ver Ejemplo 4.B). Las cepas se probaron para producción de farnesol en fermentadores de 1 L utilizando el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 . H, y los datos de este experimento se presentan en la Tabla 23.

TABLA 23 Estos datos soportan la idea de que las cepas con niveles elevados de reductasa HMG CoA producen más farnesol que una cepa con niveles normales de reductasa HMG CoA. Los datos también indican que una cepa que contiene ocho copias integradas del gen HMG2cat producen esencialmente tanto farnesol como una cepa que lleva más de 20 copias extracromosómicas del gen HMG2cat como es el caso con la cepa SW23B/pRH 124-31 . Una cepa que contiene una sola copia integrada del gen HMG2 cat produjo más farnesol que la cepa de control, pero ligeramente menos que las cepas con más copias del gen HMGcat. Además, las cepas que contienen niveles de reductasa HMG CoA elevados acumularon mevalonato en el cultivo mientras que las cepas con niveles normales de reductasa HMG CoA no. Esto sugiere que una etapa aguas abajo de reductasa HMG CoA limita el flujo de carbono en la trayectoria una vez que la actividad de la enzima de reductasa HMG CoA se ha elevado (ver Ejemplo 1 5). El flujo de carbono a través de la trayectoria se limita por la actividad de una de las enzimas aguas abajo de reductasa HMG CoA que resultan en acumulación de mevalonato en el medio. Eiemplo 1 5 Este ejemplo muestra los efectos de la sobreexpresión de los múltiples genes de trayectoria de isoprenoide en una cepa que tienen una mutación erg? y niveles elevados de reductasa HMG CoA. Como se muestra en los Ejemplos 4 y 14, la elevación de los niveles de reductasa HMG CoA conducen a flujo de carbono más elevado a través de la trayectoria de isoprenoide/esterol. La sobreexpresión de otros genes de trayectoria de isoprenoide en cepas que contienen reductasa HMG CoA amplificada puede incrementar además el flujo de carbono a través de esta trayectoria. La amplificación de los genes de trayectoria de isoprenoide en cepas que tienen niveles elevados de reductasa HMG CoA así como un gen erg? defectivo puede resultar en elevación adicional de niveles de farnesol. También, la amplificación de los genes de trayectoria de isoprenoide pueden resultar el elevación adicional de los niveles de GG en cepas que tienen un gen erg? defectivo y tienen niveles elevados de reductasa HMG CoA y sintasa GGPP. Para probar estas ideas, los plásmidos que se construyeron permitieron la sobreexpresión de múltiples genes de trayectoria de isoprenoide. Uno de los plásmidos proporcionados para la sobreexpresióñ de kinasa de mevalonato, kinasa de fosfomevalonto y decarboxilasa de difosfomevalonato, se codificó por los genes ERG12, ERG8 y ERG1 T, respectivamente. Este plásmido se refiere como pSW77-69 y se construyó de fragmentos de ADN obtenidos de un número de plásmidos que contiene genes de trayectoria de isoprenoide únicos. La construcción de aquellos plásmidos se describe primero. PCR se utilizó para amplificar el gen ERG12 para clonar. Los oligonucleótidos utilizados para amplificar el gen ERG 12 contuvieron las secuencias que corresponden a las bases #2827 a #2846 y el complemento inverso de #5247 a #5229 del Acceso al Banco de Genes #Z49809. Las secuencias de los dos oligonucleótidos se dan abajo. Las letras minúsculas del caso se utilizan paras las bases alteradas o agregadas para crear sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción, que se indican en paréntesis siguiendo la secuencia de oligonucléótido. SEQ ID NO: 30 E12.4SN 5'-CCAAATATAACtCGAGCTTTG-3 (Xhol) SEQ ID NO: 31 : E12.SALI3 5'-GCAAAGTcCaCCACCGCAG-3 (Sa1 l) El gen ERG 12 se amplificó utilizando los dos oligonucleótidos E12.4SN y E12.SAL13 y ADN genómico de la cepa ATCC 28383. EL ADN resultante se clonó el pCR-Script en el sitio Sfrl para generar pSW68. Los oligonucleótidos utilizados para amplificar el gen ERG 1 T contuvieron las secuencias que corresponden a las bases #91 1 a #937 del Acceso al Banco de Genes #Z71656 y el complemento inverso de #1 930 a #1962 del Acceso al Banco de Genes #Z71658. Las secuencias de los dos oligonucleótidos se dan abajo. SEQ ID NO: 32: E19 SMAI 5'-GCCACGTGCCCcCGGGTTTCTCTÁGCC-3' (Smal) SEQ ID NO:33: E1 9 SAC1 3 5'-GGAAAAGagCtCGATAATTATTGATGATAGATC-3' (Sacl) El gen ERG 1T se amplificó utilizando los dos oligonucleótidos E19 SMAI, E 1 9.SAC1 3 y ADN genómico de la cepa ATCC 28383. EL ADN resultante se clonó el pCR-Script en el sitio Sfrl para generar pSW69. Los oligonucleótidos utilizados para amplificar el gen ERG 1 ? contuvieron las secuencias que corresponden a las bases #2729 a #2749 y el complemento inverso de #51 77 a #51 96 del Acceso al Banco de Genes #Z49939. Las secuencias de los dos oligonucieótidos se dan abajo. SEQ ID NO:34: E8.21 35N 5'-CCGTTTTGGATccTAGATCAG-3' (BamHl) SEQ ID NO:35: E8SMAI3 5'-gttcccGGGTTATTGTCCTGCATTTG-3? (Smal) . El gen ERG8 se amplificó utilizando los dos oligonucleótidos E8.21 35N , E8SMAI3 y ADN genómico de la cepa ATCC 28383. EL ADN resultante se clonó el pCR-Script en el sitio Sfrl para generar pSW71 . El plásmido pSW71 se digirió con BamHl y Smal, y el fragmento de 2459 bp resultante que contiene el gen ERG8 se purificó. El plásmido pSW69-3 se digirió con Smal y Sacl, y el fragmento de 2239 bp que contiene el gen ERG1 T se purificó. El vector de levadura de número de copias más elevado YEp352 (que contiene un marcador de selección URA3) se digirió con BamHl y Sacl y se purificó. Los tres fragmentos de ADN purificados se ligaron juntos para generar pSW76-1 1 . Después, pSW68 se digirió con Salí t Xhol y la bada de 2400 bp resultante que contiene el gen ERG12 se purificó y ligó en pSW76-1 1 digerido por Salí para generar pSW77-69. Este plásmido contiene ERG12, ERG8, y ERG1T y proporciona la sobreexpresión de kinasa de mevalonato, kinasa de fosfomevalonato, y decarboxilasa de difosfomevalonato. Otro plásmido proporcionada para la sobreexpresión de kinasa de mevalonato, kinasa de fosfo-mevalonato, decarboxilasa de difosfofomevalonato, e isomerasa de IPP, se codificó por los genes ERG12, ERG8, ERG 19 y IDI1 , respectivamente. Este plásmido se refiere como pSW78-68, y se construyó como sigue. El gen IDI1 se amplificó por PCR para su clonación. Los oligonucleótidos utilizados para amplificar el gen IDI1 contuvieron las secuencias que corresponden a las bases #19577 a #1 9604 y el complemento inverso de #1 7477 a #1 7502 del Acceso al Banco de Genes #U43503. Las secuencias de los dos oligonucleótidos se dan abajo.

SEQ ID NO:36: ISO SAC1 5 5'-AAGAGctcATCTGATAATAGATCAAGCG-3' (Sacl) SEQ ID NO:37: ISO SAC13 5'-AGGAGCTCAACGACAATAAATGGCTG-3' (Sacl) El gen IDI1 se amplificó utilizando los dos oligonucleótidos ISO SAC1 5, ISOSACI3, y ADN genómico de la cepa ATCC 28383. El ADN resultante se clonó en pCR-Script en el sito Sfrl para generar pSW73. El plásmido pSW73 se digirió con Sacl y el fragmento de 21 17 bp resultante que contiene el gen IDI1 se ligó con pSW77-69 digerido por Sacl para generar pSW78-68. Este plásmido contiene ERG12, ERG8, ERG1 T y IDI1 y proporciona la sobreexpresión de kinasa de mevalonato, kinasa de fosfomevalonato, decarboxilasa de difosfomevalonato e isomerasa IPP. Otro plásmido proporcionado para la sobreexpresión de tiolasa CoA de acetoacetilo y sintasa HMG CoA, se codificó por los genes ERG10 y ERG13, respectivamente. Este plásmido se refiere como pSW49-29, y se construye como sigue: PCR se utilizó para amplificar los genes ERG13 y ERG10 para su clonación. Los oligonucleótidos utilizados para amplificar el gen ERG 13 contuvieron al complemento inverso de bases #21 1 04 a #21 127 y las bases #1 8270 a #18292 del Acceso al Banco de Genes #Z50178. Las secuencias de los dos oligonucleótidos se dan abajo. SEQ ID NO.38: E1 3 XBAI5 5'-GTCCTctAGATCTTGAATGAAATC-3' {Xbal) SEQ D NO:39: E13 SAC13 5'-CTTTGAGCtcGTACAAGAAGCAG-3' (Sacl) El gen ERG13 se amplificó utilizando los dos oligonucleótidos E13 XBAI5.E13 SACI13, y ADN genómico de la cepa ATCC 28383. El ADN resultante se clonó en pCR-Script en el sito Sfrl para generar pSW72. Los oligonucleótidos utilizados para amplificar el gen ergio contuvieron las secuencias que corresponden a las bases #4073 a #4093 y el complemento inverso de #6542 a #6565 del Acceso al Banco de Genes #U36624. Las secuencias de los dos oligonucleótidos se dan abajo. SEQ ID NO: 40: E10 HIND5 5'-CTAACTttTGCGCCCGTGAAG-3' (Hindlll) SEQ ID NO:41 : E10 XBAI13-2 5'-GTTCTAGAAGTTTTCAAAGCAGAG-3' (Xbal). El gen ERG10 se amplificó utilizando los dos oligonucleótidos E 10 HIND5, E1 0 XBAI3-2, y ADN genómico de la cepa ATCC 28383. El ADN resultante se clonó en pCR-Script en el sito Sfrl para generar pSW70. El plásmido pSW70 se digirió con Xbal y Hindlll y el fragmento de 2482 bp que contiene el gen ERG 10 se purificó. El plásmido pSW72-4 se digirió con Xbal y Sacl, y el fragmento de 2850 resultante que contiene el gen ERG13 se purificó. Los dos fragmentos de ADN purificados se ligaron entonces junto con Sacl, Hindlll digirió YEp351 (marcador seleccíonable LEU2) para generar pSW79-30. Este plásmido contiene los genes ERG13 y ERG10 y permite la sobreexpresión de tiolasa de CoA acetoacetilo y sintasa HMG CoA. La cepa SW23B#74 (contiene ocho copias integradas del gen HMG2 cat, ver Ejemplo 14) se transformó con pSW77-69 y pSW78-69. y los transformantes se seleccionaron en medio SCE-ura. Las cepas resultantes se refieren como SW23B#74/pSW77-69 y SW23B#74/pSW78-68, respectivamente. Estas cepas requieren leucina agregada para crecimiento debido a la mutación de Ieu2. Para eliminar la necesidad de complementar estas cepas con leucina durante los experimentos de fermentación, se transforman con un fragmento lineal de ADN que contiene el gen LEU2 funcional, y los transformantes LEU+ se aislaron. Estas cepas se refieren como SW23B#74L/pSW77-69 y SW23B#74L/pSW78-68, respectivamente. SW23B#74 también se transformó con pSW79-30, y los transformantes se seleccionaron en medio SCE-leu. SW23B#74/pSW79-30 requiere uracilo ya que contiene una mutación en el gen ura3. Para eliminar la necesidad de complementar estas cepas con uracilo durante los experimentos de fermentación, esta cepa se transforma con un fragmento lineal de ADN que contiene un gen URA3 funcional, y los transformantes URA+ se aislaron. Esta cepa se refiere como SW23B#74U/pSW79-30. SW23B#74 también se transformó tanto con pSW78-68 y pSW79-30, y se aislaron los transformantes que son capaces de crecer en medio SCE-ura, -leu indicando que los transformantes contuvieron ambos plásmidos. La cepa resultante se refiere como SW23B#74/pSW78-68/pSW79-30. Los experimentos de fermentación se llevaron a cabo con las cepas descritas arriba para examinar el efecto de estas amplificaciones de genes en producción de farnesol. Las cepas se probaron en fermentadores de 1 -L utilizando el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 .H, y datos de estos experimentos se presentan en la Tabla 24. TABLA 24 Estos datos muestra que una cepa que sobreexpresa reductasa HMG CoA acumula el mevalonato intermedio de trayectoria de isoprenoide en el medio de cultivo. Ya que la acumulación de mevalonato no se observa en las cepas con niveles normales de reductasa HMG CoA, esto demuestra que el flujo de carbono a través de la trayectoria de isoprenoide se ha incrementado por la amplificación de reductasa HMG CoA al punto en donde la etapa subsecuente a la reductasa HMG CoA limita la conversión de los compuestos intermedios de trayectoria. Además, la sobreexpresión de las primeras tres enzimas en la trayectoria de isoprenoide, principalmente tiolasa CoA de acetoacetilo, la sintasa HMG CoA, y reductasa HMG CoA (codificada por ERG13, ERG10 y HMG2cat, respectivamente) condujeron a acumulación aún más elevada de mevalonato en el medio. Esto demuestra que el flujo de carbono en la trayectoria de isoprenoide se ha incrementado además por la amplificación de las primeras tres etapas y enfatiza que una de las enzimas aguas abajo de reductasa HMG CoA limita la conversión de los compuestos intermedios de trayectoria de isoprenoide. Ya que el mevanolato sirve como un precursor para farnesoi y FF, las modificaciones descritas arriba pueden utilizarse para incrementar el flujo de carbono en la trayectoria de isoprenoide, y, si ei mevalonato puede metabolizarse de manera más eficiente, puede conducir a acumulación de GG y farnesol incrementada. Con respecto a este último punto, las enzimas aguas abajo de reductasa HMG CoA se amplificaron en una cepa que sobreexpresa la reductasa HMG CoA. Las enzimas amplificadas fueron reductasa HMG CoA, kinasa de mevalonato, kinasa de fosfomevalonato, decarboxilasa de difosfomevalonato, e isomerasa IPP (codificada pro HMGcat, ERG12, ERG8, ERG 1 T e IDI1 , respectivamente). Estas cepas acumularon menos mevalonato cuando se comparan con las cepas que sobreexpresan solamente reductasa HMG CoA, indicando que el flujo Incrementado a través de la trayectoria de isoprenoide que resulta de la sobreexpresión de reductasa HMG CoA se acumuló por niveles elevados de ias enzimas aguas abajo. Aunque los niveles de farnesol no se observaron en el experimento descrito arriba, puede ser debido al nivel bajo de mevalonato disponible para su conversión. Sin embargo, estos datos sugieren que la amplificación de una o más de las enzimas aguas abajo de reductasa HMG CoA en una cepa con niveles amplificados de las primeras tres enzimas de trayectoria puede conducirse a acumulación incrementada de farnesol y GG ya que el flujo para mevalonato se incrementa más en estas cepas. Es probable que la sobreexpresión de uno o más genes aguas abajo de reductasa HMG CoA en una cepa que sobreexpresa tiolasa CoA de acetoacetilo, sintasa HMG CoA, y reductasa HMG CoA conducirá a incrementos significativos en farnesol y acumulación de GG. Eiemplo 16 Este ejemplo describe un experimento en el cual la sintasa de escualeno se bloquea por ácido zaragózico en una cepa con una trayectoria de esterol funcional e intacta, que incluye un gen ERGT funcional, y el efecto de este inhibidor de sintasa de escualeno en farnesol y acumulación de GG se observa .

Los ácidos zaragózicos son una familia de compuestos que actúan como inhibidores potentes de sintasa de escualeno (Bergstrom, J . D. , Dufresne, C , Bills, G.F. , Nailin-Omstead, M. , y Byrne, K. 1 995. Discovery, Biosynthesis, and Mechanism of Actino ot the Acids Zaragozic; Potent Inhibitors of Squalene Synthasa. Ann. Rev. Microbiol. 49:607-639). Son capaces de inhibir la biosíntesis de colesterol en mamíferos y biosíntesis de ergosterol en hongos. Ya que el ergosterol es necesario para crecimiento celular fúngico, los ácidos zaragózicos son compuestos funguicidas potentes. La cepa SWE23-E9 (ura3, sue; ver EJEMPLO 1 .G) se utilizó en este experimento debido a que contiene la mutación sue que proporciona la toma de esteróles bajo condiciones aeróbicas. Esto permitió que la levadura crezca en medio complementado con ergosteroi cuando la sintasa de escualeno se bloqueó por ácido zaragózico. Una cepa sin la mutación sue no sería capaz de tomar esteróles, incluyendo ergosterol, del medio, y por lo tanto no crecería en la presencia de ácido zaragózico. SW29-E9 que contiene ya sea un vector vacío (Yep352) o plásmidos que permiten la sobreexpresión de reductasa HMG CoA (pRH 1 24-31 ), sintasa GGPP (pSW4A) o tanto reductasa HMG CoA como sintasa GGPP (pSW46-1 ) se probaron en matraces vibrantes al crecer primero las cepas en medio SCE-ura durante 48 horas para seleccionar los plásmidos. Las muestras de estos cultivos se inocularon entonces en medio YPDE o medio YPDE que contiene ácido zaragózico en 100 µg/ml. Los cultivos YPDE (+/- ácido zaragózico) se incubaron a 30°C durante 48 horas, después se analizaron para peso de célula en seco y acumulación de farnesol. Los datos de este experimento se muestran en la Tabla 25. Todos los cultivos tratados con ácido zaragózico muestran acumulación elevada de farnesol relativa a los cultivos no tratados. La acumulación de GG no se midió en este experimento. TABLA 25 En un experimento separado, SWE23-E9 que contiene ya sea un vector vacío (Yep352) o un plásmido que permite la sobreexpresión tanto de reductasa HMG CoA y sintasa GGPP (pSW46-1 ) se probaron en matraces vibrantes al desarrollar primero las cepas en medio SCE-ura durante 48 horas para seleccionar los plásmidos. Las muestras de estos cultivos se inocularon entonces en medio YPDE o medio YPDE . que contiene ácido zaragózico en 1 00 g/ml. Los cultivos de YPDE (+/- ácido zaragózico) se incubaron a 30°C durante 72 hr, después analizaron por peso de célula en seco y GG. Los datos se presentan en la Tabla 26. El cultivo de SWE23-E9/pSW46-1 se tratado con ácido zaragózico mostró un nivel más elevado de GG en comparación a la misma cepa desarrollada en la ausencia de ácido zaragózico. Estos experimentos demuestran que las cepas sin mutaciones en la trayectoria biosintética de esterol puede inducirse para acumular farnesol al bloquear la trayectoria utilizando un inhibidor de sintasa de escualeno. La cantidad de farnesol o GG acumulado por los cultivos de ácido zaragózico fue mucho menor que la cantidad acumulada por las cepas con genes ergl? completamente defectivos que indican que un bloque genético de sintasa de escualeno es más eficaz que un bloque inducido por un inhibidor de sintasa de escualeno. TABLA 26 Eiemplo 17 Una trayectoria alternativa que conduce a FPP se ha descrito en un número de bacterias y plantas, y se refiere como la trayectoria Rohmer o sin mevalonato (Eisenreich , W. , Schawrz, M. , Carayrade, A., Arigoni, D. , Zenk, M. H. y Bacher, A. , 1998. The Deoxixylulose Phosphate Pathway of Terpenoíd Biosíntesis in Plants and Microorganism. Chem. Biol. 5: R221 -233. Paseshnichenko, V.A. , 19978, A New Alternative Non-Mevalonate Pathway for isoprenoid Biosynthesis in Eubacteria and Plants. Biochemistry (Mosc) 63: 139-148). Algunas de las enzimas de la trayectoria no monovalente y sus genes se han identificado y estudiado en E. coli, y estas incluyen la sintasa deoxixiluIosa-5-fosfato, reductasa deoxixilulosa-5-fosfato. reductasa de fosfato, isomerasa de IPP, y sintasa de FPP, codificadas por los genes dxr, dxs, idi, y ispA, respectivamente. A fin de construir cepas de E. coli que acumulen niveles altos de farnesol, los plásmidos se construyeron para la sobreexpresión en E. coli de los genes listados arriba. En algunos casos, ios genes adicionales adyacentes al gen de trayectoria de isoprenoide conocido, se incluyeron en el ADN clonado. El gen idi que se codifica para la isomerasa de IPP fue amplificado por PCR utilizando los dos oligonucleótidos listados abajo y el ADN genómico aislado de la cepa de E. coli W31 10. Los oligonucleótidos utilizados para amplificar el gen idi contuvieron secuencias que corresponden a las bases #42309 a #442335 y el complemento inverso de #43699 a #437236 dé la Acceso al Banco de Genes #U28375. Las letras minúsculas dei caso se utilizan para las bases que se alteraron para crear la restricción de los sitios de reconocimiento de endonucleasa , los cuales se indican en paréntesis que siguen la secuencia de oligonucleótido. Un sitio de EcoRI natural se utilizó en VE145-5. SEQ ID NO: 42: Ve145-5 5'-GGGATTCGAATTCTGTCGCGCTGTAAC-3' (EcoRI) SEQ ID NO: 43: Ve146-3 5'-TGggATCcGTAACGGCTTTAGCGAGCTG-3' (BamHl) El producto de PCR idi se digirió con EcoRl y BamHl, y se ligó en EcoRI, p'UC19 digerido por BamHl. El clon resultante se refiere como pHS-01 82. El gen dxr se amplificó por PCR utilizando los dos oligonucleótidos listados abajo y el ADN genómico aislado de la cepa E. coli W31 1 0. Los oligonucleótidos utilizados para amplificar una región de ADN que incluye los genes frr, dxr, y yaeS contuvieron secuencias que corresponden a las bases #21 31 a #2150 y el complemento inverso a #5297 a #531 5 del Acceso al Banco de Genes #D83536. SEQ ID NO: 44: DXR1 7.SN GATTCCGCGTAAGgATCcCG (BamHl) DXR3179.ASN CCAGCATctAGACCACCAG (Xbal) El producto PCR resultante se digirió con BamHl y Xbal digerido pHS-0182 para generar pHS-0182R. Los genes ispA y dxs parecen formar parte de un operón que posiblemente incluye otros dos genes referidos como xseB y a/0. El PCR se utilizó para amplificar una región de ADN que incluye xseB, ispA, dxs, y yay'O utilizando los oligonucleótidos listados abajo y el ADN genómico aislado de la cepa E. coli W31 10. Los oligonucleótidos contuvieron secuencias que corresponden a las bases #41 57 a #4183 y el complemento inverso de #8938 a #48956 de la Acceso al Banco de Genes #AE000148. SEQ ID NO: 46: DXS.561 P 5'-gactgcagCTGGCCGCTGGGTATTCTGTCGTAGTT-3' (Pstl) SEQ ID NO: 47: DXS.820X 5,-gatctagaTCACGCGTACGCAGAAGGTTTTGC-3, (Xbal) El producto de PCR resultante se digirió con Xbal y Pstl, y se ligó a Xbal, Pstl digirió pUC1 9 para generar pHS-dxs. El fragmento de ADN que contiene el gen dxs se cortará de pHS-dxs utilizando Xbal, y Pstl digerido pHS-01 82R para generar un plásmido que contiene dxs, dxr, ispA, e idi. El plásmido resultante se transformará en E. coli, y una cepa transformada que contiene el plásmido se probará para producción de farnesol en experimentos de matraz vibrante y fermentación. A fin de construir cepas de E. coli que acumulen niveles elevados de GG, se construirá un plásmido para la sobreexpresión en E. coli de sintasa GGPP de Erwinia herbicola. El gen crtE que se codifica para sintasa GGPP se amplificó al utilizar PCR y ADN genómico aislado de la cepa de Erwinia herbicola Eho10 y los siguientes dos oligonucleótidos. Los oligonucleótidos contuvieron secuencias que corresponden a las bases #351 3 a #3531 y el complemento inverso de las bases #4459 a #4481 del Acceso al Banco de Genes #M87280. SEQ ID NO: 48: Ehol OE Up 5'-gaattcCAATTCAGCGGGTAACCTT-3' (EcoRI) SEQ ID NO: 49: Ehol OE Lo 5'-aagcttTGCTTGAACCCAAAAGGGCGGTA-3' (Hindlll) El producto de PCR resultante se digirió con EcoRI y Hindlll, y se ligó en pET24d(+) (Novagen) de tal forma que la expresión del gen ctrE se controló por el promotor T7. El plásmido resultante se refiere como pKL19-63. Este plásmido puede transformarse en cepas de E. coli tales como BL21 (DE3) (disponible de Novagen) que contienen un gen inductible IPTG que se codifica para pollmerasa de T7. Esto permite la inducción de IPTG del gen crtE en esta cepa. El promotor T7/fusión de gen crtE puede cortarse de pKL1 9-63 utilizando Bglll y Hindlll, y se ligó en BamHl, Hindlll digirió pACYC1 84 (Acceso #X06403) para construir un plásmido que se reemplace en la resistencia de cloramfenicol para selección. Este plásmido contiene el origen p1 5A de la replicación y podría ser compatible con plásmidos que contienen ei origen ColEl de la replicación tal como los clones que llevan los genes de trayectoria de ísoprenoide de E. coli descritos arriba. Estos últimos plásmidos confieren resistencia de ampicilina, y pueden obtenerse tales transformantes de E. coli que llevan tanto el plásmido crtE como ei plásmido que contienen los genes de dxs, dxr, idi, y ispA al transfomar E. coli con ambos plásmidos y seleccionar para la resistencia al cioroamfenicol y la ampicilina. Por consiguiente, se obtendrán las cepas de E. coli BL21 (DE3) que contienen plásmidos para sobreexpresión de sintasa de deoxixilulosa-5-fosfato, reductoisomerasa de deoxixilulosa-5-fosfato, isomerasa de IPP, sintasa FPP, y sintasa GGPP. Estas cepas se probarán para producción de GG en experimentos de matraz de agitación y fermentación. Eiemplo 18 El siguiente ejemplo describe la construcción de cepas de Saccharomyces cerevisiae que se construyen para producir niveles elevados de farnesol y GG al expresar enzimas que corresponden a las enzimas de trayectoria de no mevalonato. La biosíntesis de IPP ocurre en cualquier bacteria y plantas que comienza de piruvato y gliceraldehido-3-y procede a través de unas series de etapas enzimáticas conocidos como la trayectoria no-mevalonato, e incluye las enzimas de sintasa de deoxixilulosa-5-fosfato y reductoisomerasa de deoxixiluiosa-5-fosfato. El compuesto resultando de estas dos etapas enzimáticas es, 2-C- metil-D-eritritol 4-fosfato (también conocido como MEP), que además se metaboliza por enzimas desconocidas para admitir IPP. Se construyen plásmidos que expresan los genes de E. coli dxs y dxr en levadura al fusionar las regiones de codificación de aquellos genes a elementos promotores que se permiten para expresión en levadura.

Los genes de dxs y dxr se amplifican por PCR con oligonucleótidos que incluyen sitios de restricción para permitir la clonación en vectores de expresión de levadura que contiene promotores tales como el promotor ADH1 , promotor PGK, o promotor GPD. Las dos fusiones de gen se combinan así en un plásmido único ai subclonar una fusión de gen en el otro plásmido. El plásmido resultante que contienen ambos genes, se transforma así en un mutante erg? de levadura. La cepa resultante es capaz de sintetizar MEP, que puede además metaboiizar a IPP por enzimas endógenas capaces de llevar las reacciones deseadas a IPP. Esta capacidad puede conducir a la acumulación aumentada de IPP, que puede originar las células para acumular niveles elevados de farnesol a través de la acción de las enzimas de isomerasa de IPP y sintasa FPP endógenas. Si esto se hace en una cepa que también sobre exprese sintasa GPP, entonces pueden acumularse niveles elevados de GG en estas cepas. Eiemplo 1 9 Este ejemplo describe la construcción de una cepa de Saccharomyces cerevisiae que sobre expresa una codificación de gen EGR20 mutado para una enzima de sintasa FPP que exhibe especifidad de producto alterado. Las cepas diferentes que sobreexpresan sintasa FPP tipo silvestre, cepas que expresan la sfntasa FPP mutada, acumularon más GG que farnesol. La comparación de las secuencias de aminoácido de sintasas FPP de una variedad de organismos reveló varios dominios altamente conservados que incluyen dos dominios de aspartato abundante, que son esenciales para la actividad catalítica. Los investigadores han reportado que las mutaciones que efectúan el aminoácido localizado en la posición quinta antes del primer dominio de aspartato abundante pueden alterar la especifidad del producto de la enzima de tal forma que la enzima fácilmente cataliza la formación de GGPP así como también FPP. Esto se ha mostrado para tanto enzimas aviar como sintasas FPP de Bacillus stearothermophilus (Tarshis, L.C. , Proteau, P. J. , Kellogg, B. A. , Sacchettini, J . C , Poulter, C. D. 1996. Regulation of Product Chain Length by Isoprenyl Diphosphate Synthases. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:15018-15023; Ohnuma, S. , Narita, K. , Nakazawa, T. , Ishida, C, Takeuchi, Y. , Ohto, C , y Nichino, T. 1 996. A Role of the Amino Acid Residue Located on the Fifth Position Before the First Aspartate-rich Motif of Farnesyl Diphosphate Synthase on Determination of the Final Product. J. Biol. Chem. 271 :30748-30754; Patente E. U. 5,766,91 1 ). En el caso de la enzima Bacillus, el aminoácido en el quinta posición antes del primer dominio de aspartato abundante se cambió de tirosina a serina. La enzima aviar contiene una fenilalanina en esta posición. Se piensa que los aminoácidos aromáticos en aquella" posición bloquean la extensión de la cadena de isoprenilo superior a los quince carbonos, y que la restricción pueda mitigarse al dependen de la fenilalanina con una aminoácido menos voluminoso tal como la serina. Como en las sintasa FPP de Bacillus mencionadas arriba, la sintasa FPP de Saccharomyces cerevisiae tiene una tirosina en la quinta posición antes del primer dominio de aspartato abundante. El sitio dirigido a mutagénesis se utilizó para alterar la secuencia del gene ERG20 para codificarse por una serina en lugar de una tirosina en aquella posición. El método utilizado para introducir la mutación que depende en la amplificación de PCR del plásmido entero pJMB1 9-31 utilizando oligonucleótidos mutagénicos que introducen la mutación deseada, y se perfila en el folleto de instrucción para los Efectos de Mutagénesis de Cambio Rápido de Sitio Dirigido (Stratagen). Los oligonucleótidos contuvieron secuencias que corresponden a las bases #1063 a #1097 y el complemento inverso de bases #1063 a #1097 del Acceso al Banco de Genes #J05091 . Las secuencias de los oligonucleótidos se dan abajo, con los cambios indicados por letras de caso pequeño. Una alteración de A a T se hizo en la posición #1084 para cambiar el aminoácido codificado de tirosina a serina. También, una alteración de T a C se hizo en la posición #1074 para crear un nuevo sitio Pstl, que se permite para identificación rápida del gen mutante. Esta última mutación fue silenciosa en aquella que no cambió ei aminoácido codificado. SEQ ID NO: 50: Y95S-SN 5'-GCATTGAGTTGcTGCAGGCTTcCTTCTTGGTCGCC-3' SEQ ID NO: 51 : Y95S-ASN 5'-GGCGACCAAGAAGgAAGCCTGCAgCAACTCAATGC-3' Los dos oligonucleótidos se utilizaron para amplificar pJMB 19-31 , y el producto de PCR resultante sé ligó a sí mismo para reformar el plásmido circular, excepto que el gen ERG20 ahora contuvo la mutación deseada. El plásmido resultante se refiere como pHS31 -Y95S, y este plásmido se transformó en la cepa mutante erg? SWE23-DE91 para formar SWE23-DE91 /pHS31 .Y95S. Los experimentos de matraz vibrante se llevaron a cabo para comparar el farnesol. y producción de GG por cepas que sobreexpresan el gen ERG20 de tipo silvestre y el gen ERG20 mutado. Las cepas crecieron durante la noche en SCE-ura, y esto se utilizó para inocular matraces que contienen medio YPDE. Estos cultivos crecieron a 30°C por 72 hr, después se cosecharon para peso en célula en seco y análisis de isoprenoide. Los datos de este experimento se presentan en la Tabla 27. Tabla 27 Estos datos muestran que la proporción de farnesoLGG se altera dramáticamente por la sobreexpresión de mutante de tir a ser del gen ERG20 en una cepa mutante egr?. La cepa que sobre expresa el gen ERG20 mostró proporcionalmente más GG que la cepa que sobre expresa el gen ERG20 de tipo silvestre. En adición, la cantidad total de GG producido por la cepa que sobre expresa el mutante ERG20 fue mayor mientras que la cantidad total de farnesol fue más bajo como se comparó con la cepa que sobreexpresa el gen ERG20 de tipo silvestre. La reducción en nivel de farnesol no se reflejó completamente en el grupo GG, sugiriendo que algunos de los FPP pueden convertirse a otros compuestos además de GG. Alternativamente, es posible que la inhibición de retroalimentación juegue un papel en regular la cantidad de GG acumulado por estas cepas. La descripción anterior de la invención se ha presentado para propósitos de ilustración y descripción. Además, la descripción no se propone para limitar la invención a la forma descrita en la presente. Consecuentemente, las variaciones y modificaciones en proporción a las enseñanzas de arriba, y la experiencia o conocimiento de la técnica relevante, se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Las modalidades descritas más arriba se proponen además para explicar las mejores formas conocidas de practicar la invención y para permitir que otros expertos en la materia utilicen la invención en tales, u otras, modalidades y con las diversas modificaciones requeridas por las aplicaciones o usos particulares de la invención. Se propone que las reivindicaciones anexas se interpretan para incluir modalidades alternas al grado permitido por la técnica anterior.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Millis, James R. Sauc , Gabriel G. Maurina-Brunker, Julie McMullin, Thomas W. Hyatt, John A. <120> Método para producir vitamina <130> 3161-17-PCT <140> aun no asignado <141> 1999-07-06 <1S0> 60/091,868 <151> 1998-07-06 <160> 51 <170> Patentln Ver. 2 . 0 <210> 1 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <221> mise característica <222> (1) . . (23 ) <223> PRIMARIO <220> <223 > Descripción de Secuencia Artif¡cial:PRIMARIO <400> 1 ctcagtacgc tggtacccgt cae 23 <210> 2 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <221> misc_caracterfetica <222> (1) . . (27) <223> PRIMARIO <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial:PRIMARIO <400> 2 gatggatccc aatatgtgta gctcagg 27 <210> 3 <211> 22 <212> ADN "<213 > Secuencia Artificial <220> <221> misc_característica <222> (1) . . 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(35) <223> PRIMARIO <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial.PRIMARIO <400> 51 ggcgaccaag aaggaagcct gcagcaactc aatgc 35

Claims

REIVINDICACIONES 1 . Un método para producir esteres de a-tocoferiio o a-tocoferol que comprende: (a) producir biológicamente geranilgeraniol; y (b) convertir químicamente dicho geranilgeraniol en un éster de a-tocoferilo o a-tocoferol por un proceso que comprende: (i) oxidar selectivamente el enlace doble de 2,3- carbono-carbono en geranilgeraniol para producir geranilgeraniol-2,3-epóxido; (ii) hidrogenar los tres enlaces dobles de carbono- carbono restantes en dicho epóxido para producir epoxifitol; (iii) deoxigenar dicho epoxifitol para producir una mezcla de fitol e isofitol por la reacción con un aceptador de oxígeno; y (iv) reaccionar dicha mezcla de isofitol y fitol con trimetilhilhidroquinona para producir a-tocoferol. 2. Un método según la reivindicación 1 , caracterizado porque dicha etapa de oxidar selectivamente se lleva a cabo en un solvente inerte utilizando hidroperóxido t-butilo en la presencia de vanadio o molibdeno como el oxidante. 3. Un método según la reivindicación 2, caracterizado porque dicho solvente inerte se selecciona del grupo que consiste de hidrocarburos aromáticos, hidrocarburos aiifáticos, hidrocarburos cicioalifáticos y esteres alifáticos o mezclas de los mismos. 4. Un método según la reivindicación 1 , caracterizado porque dicha etapa de deshidrogenación se conduce en un solvente inerte en la presencia de un catalizador seleccionado del grupo que consiste de níquel Raney, paladio en carbono y platino en carbono. 5. Un método según la reivindicación 4, caracterizado porque dicho solvente inerte se selecciona del grupo que consiste de esteres alifáticos, alcanoles, hidrocarburos aromáticos, hidrocarburos alifáticos y esteres, o mezclas, y en donde dicha etapa de hidrogenación se conduce bajo una presión de desde aproximadamente 1 atmósfera hasta aproximadamente 200 atmósferas a temperaturas entre aproximadamente 0°C y aproximadamente 150°C. 6. Un método según la reivindicación 4, caracterizado porque dicho catalizador se encuentra presente en un nivel de aproximadamente 0.001 hasta aproximadamente 0.5 por ciento en peso en base al peso inicial de geranilgeraniol-2,3-epóxido. 7. Un método según ia reivindicación 1 , caracterizado porque dicha etapa de desoxigenación se conduce en la presencia de un catalizador de trióxido de renio substituido. 8. Un método según la reivindicación 1 , caracterizado porque dicha etapa de desoxigenación se conduce en un solvente inerte utilizando un aceptador de oxígeno seleccionado del grupo que consiste de triarilfosfinas, tri-d-Ce alquilfosfinas, fosfitos de triarilo, tri-d-ds alquilfosfitos, hipofosfitos de metal álcali, ácido hipofosfórico, sulfuros de C?-C6 alquilo y aiquilmorfolinas d-C6 y en la presencia de un catalizador de óxido de renio substituido. 9. Un método según la reivindicación 8, caracterizado porque dicho solvente inerte se selecciona del grupo que consiste de hidrocarburos aromáticos, hidrocarburos alifáticos, hidrocarburos cicloalifáticos, esteres alifáticos, alcoholes y agua, o mezclas de los mismos; en donde el aceptador de oxígeno es una triarilfosfina; y en donde el catalizador es trióxido de alquilrenio d-C-io. 10. Un método según la reivindicación 8, caracterizado porque la trifenilfosfina es el aceptador de oxígeno y se presenta en niveles de desde aproximadamente 1 .0 hasta aproximadamente 3.0 moles por mol del epoxifitol inicial y en donde el trióxido de metiirenio es el catalizador y se presenta en niveles de desde aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 5.0 por ciento en peso en base al epoxitol inicial. 1 1 . Un método según la reivindicación 1 , caracterizado porque dicha etapa de reacción se conduce en la presencia de un catalizador de ácido Lewis. 12. Un método según la reivindicación 1 1 , caracterizado porque dicho catalizador de ácido Lewis es cloruro de zinc. 1 3. Un método para producir a/fa-tocoferol de geranilgeraniol, que comprende: (a) oxidar selectivamente el enlace doble de 2,3-carbono- carbono en geranilgeraniol para producir gerani!geraniol-2,3-epóxido; (b) hidrogenar los tres enlaces dobles de carbono- carbono restantes en dicho epóxido para producir epoxifitol; (c) desoxigenar dicho epoxifitol para producir una mezcla de fitol e isotitol por la reacción con un aceptador de oxígeno; y (d) reaccionar dicha mezcla de fitoi e ¡sofitol con trimetilhidroquinona para producir a/fa-tocoferol. 14. Un método según la reivindicación 13, caracterizado porque dicha etapa de oxidación de manera selectiva se lleva a cabo en un solvente inerte utilizando hidroperóxido t-butilo en la presencia de vanadio o molibdeno como el oxidante. 15. Un método según la reivindicación 13, caracterizado porque dicho solvente inerte se selecciona del grupo que consiste de hidrocarburos aromáticos, hidrocarburos alifáticos, hidrocarburos cicloalifáticos y esteres alifáticos o mezclas de los mismos. 16. , Un método según la reivindicación 1 3, caracterizado porque dicha etapa de deshidrogenación se conduce en un solvente inerte en la presencia de un catalizador seleccionado del grupo que consiste de níquel Raney, paladio en carbono y platino en carbono. 17. Un método según la reivindicación 16, caracterizado porque dicho solvente inerte se selecciona del grupo que consiste de esteres alifáticos, alcanoles, hidrocarburos aromáticos, hidrocarburos alifáticos y esteres, o mezclas, y en donde dicha etapa de hidrogenación se conduce bajo una presión de desde aproximadamente 1 atmósfera hasta aproximadamente 200 atmósferas a temperaturas entre aproximadamente 0°C y aproximadamente 150°C. 1 8. Un método según la reivindicación 16, caracterizado porque dicho catalizador se encuentra presente en un nivel de aproximadamente 0.001 hasta aproximadamente 0.5 por ciento en peso en base al peso inicial de geranilgeraniol-2,3-epóxido. 19. Un método según la reivindicación 13, caracterizado porque dicha etapa de desoxigenación se conduce en la presencia de un catalizador de trióxido de renio substituido. 20. Un método según la reivindicación 13, caracterizado porque dicha etapa de desoxigenación se conduce en un solvente inerte utilizando un aceptador de oxígeno seleccionado del grupo que consiste de triarilfosfinas, tri-C?-C6 alquilfosfinas, fosfitos de triarilo, tri-Ci-Ciß alquilfosfitos, hipofosfitos de metal álcali, ácido hipofosfórico, sulfuros de d-C6 alquilo y alquilmorfolinas d-C6 y en la presencia de un catalizador de óxido de renio substituido. 21 . Un método según la reivindicación 20, caracterizado porque dicho solvente inerte se selecciona dei grupo que consiste de hidrocarburos aromáticos, hidrocarburos alifáticos, hidrocarburos cicloalifáticos, esteres alifáticos, alcoholes y agua, o mezclas de los mismos; en donde el aceptador de oxígeno es una triarilfosfina; y en donde el catalizador es trióxido de alquilrenio d-C10- 22. Un método según la reivindicación 20, caracterizado porque la trifenilfosfina es el aceptador de oxígeno y se presenta en niveles de desde aproximadamente 1 .0 hasta aproximadamente 3.0 moles por mol del epoxifitol inicial y en donde el trióxido de metilrenio es el catalizador y se presenta en niveles de desde aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 5.0 por ciento en peso en base al epoxitol inicial. 23. Un método según la reivindicación 13, caracterizado porque dicha etapa de reacción se conduce en la presencia de un catalizador de ácido Lewis. 24. Un método según la reivindicación 23, caracterizado porque dicho catalizador de ácido Lewis es cloruro de zinc. 25. Él método según la reivindicación 1 , caracterizado porque dicha etapa de producción de manera biológica comprende: (a) cultivar un microorganismo en un medio de fermentación, en donde la acción de sintasa de escualeno de dicho microorganismo se reduce, y en donde dicha etapa de cultivación produce un producto seleccionado del grupo que consiste de fosfato de geraniigeranilo y geranilgeraniol; y (b) recuperar dicho producto. 26. Él método según la reivindicación 25, caracterizado porque dicho medio de fermentación comprende un inhibidor de sintasa de escualeno. 27. Él método según la reivindicación 25, caracterizado porque dicho microorganismo se modifica genéticamente para reducir la acción de sintasa de escualeno. 28. Él método según la reivindicación 27, caracterizado porque dicho microorganismo se modifica genéticamente además para incrementar la acción de reductasa HMG-CoA. 29. Él método según la reivindicación 28, caracterizado porque la acción de reductasa HMG-CoA se incrementa por la sobreexpresión de reductasa HMG-CoA o el dominio catalítico de la misma én el microorganismo. 30. Él método según la reivindicación 29, caracterizado porque dicho microorganismo se modifica genéticamente además para incrementar la acción de una proteína seleccionada del grupo que consiste de acetoacetil Co-A tiolosa, sintasa HMG-CoA, decarboxilasa de fosfomevalonato, isomerasa de pirofosfato de isopentenilo, sintasa de pirofosfato de farnesilo, sintasa de D-1 -deoxixiluolosa 5-fosfato y reducto?somerasa de 1 -deoxi-D-xilulosa 5-fosfato. 31 . Él método según la reivindicación 30, caracterizado porque el microorganismo se ha modificado genéticamente para incrementar la acción de sintasa de pirofosfato de farnesilo. 32. Él método según la reivindicación 31 , caracterizado porque el microorganismo se ha modificado genéticamente para sobreexpresar la sintasa de pirofosfato de farnesilo. 33. Él método según la reivindicación 30, caracterizado porque el microorganismo se ha modificado genéticamente para incrementar la acción de sintasa de pirofosfato de geranilgeranilo. 34. Él método según la reivindicación 33, caracterizado porque el microorganismo se ha modificado genéticamente para sobreexpresar la sintasa de pirofosfato de geranilgeranilo. 35. Él método según la reivindicación 25, caracterizado porque dicho microorganismo es mutante erg?. 36. Él método según la reivindicación 35, caracterizado porque dicho microorganismo comprende un alelo de borrado/inserción erg??::HIS3. 37. Él método según la reivindicación 25, caracterizado porque dicha etapa de recuperación comprende recuperar dicho producto de dicho microorganismo. 38. Él método según la reivindicación 25, caracterizado porque dicho producto se segrega en dicho medio de fermentación mediante dicho organismo y en donde dicha etapa de recuperación comprende la purificación de dicho producto de dicho medio de fermentación. 39. Él método según la reivindicación 25, caracterizado porque dicho producto es fosfato de geranilgeranilo intracelular y geranilgeraniol y dicha etapa de recuperación comprende aislar dicho fosfato de geranilgeranilo y geranilgeraniol de dicho microorganismo. 40. Él método según la reivindicación 25, caracterizado porque dicho producto es fosfato de geranilgeranilo intracelular y dicha etapa de recuperación comprende además defosforilar dicho fosfato de geranilgeranilo para producir geranilgeraniol. 41 . Él método según la reivindicación 25, caracterizado porque dicho microorganismo se selecciona del grupo que consiste de «•» hongos, bacterias y microalgas. 42. Él método según la reivindicación 25, caracterizado porque dicho microorganismo es levadura. 43. Él método según la reivindicación 42, caracterizado porque dicha levadura se bloquea en la trayectoria de ergosterol y se modifica genéticamente para tomar esteróles exógenos bajo condiciones aeróbicas. 44. Él método según la reivindicación 25, caracterizado porque dicho microorganismo se ha modificado genéticamente para 10 incrementar la acción de fosfatasa. 45. Un método para producir una mezcla de fitol e isofitol, que comprende reaccionar epoxifitol con un aceptador de oxígeno en la presencia de un catalizador de trióxido de renio substituido. 15 46. Un método según la reivindicación 45, caracterizado porque dicha etapa de reaccionar se lleva a cabo en un solvente inerte utilizando un aceptador de oxígeno seleccionado del grupo que consiste de triarilfosfinas, tri-d-C6 alquilfosfinas, fosfitos de triarilo, tri-d-ds aiquilfosfitos, hipofosfitos de metal álcali, ácido 20 hipofosfórico, sulfuros de C?-C6 alquilo y alquiimorfolinas d-C6 y en la presencia de un catalizador de óxido de renio substituido. 47. Un método según la reivindicación 46, caracterizado porque dicho solvente inerte se selecciona del grupo que consiste de hidrocarburos aromáticos, hidrocarburos alifáticos, hidrocarburos 25 cicloalifáticos, esteres alifáticos, alcoholes y acjua, o mezclas de los -? mismos; en donde el aceptador de oxígeno es una triarilfosfina; y en donde el catalizador es trióxido de alquilrenio d-C?0. 48. Un método según la reivindicación 47, caracterizado porque el aceptador de oxígeno es trifenilfosfina y el catalizador de trióxido de alquilrenio d-Cio es trióxido de metilrenio. 49. Un método según la reivindicación 47, caracterizado porque el aceptador de oxígeno se utiliza en niveles de desde aproximadamente 1 .0 a aproximadamente 3.0 moles por mol de epoxifitol inicial y el catalizador se encuentra presente en niveles de 10 desde aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 5.0 por ciento en peso en base al epoxifitol inicial. 50. Un método para preparar gamma-tocoferol que comprende hidrogenación catalítica de 4-cromanona tocotrienol. 51 . Un método según la reivindicación 50, caracterizado 15 porque dicha hidrogenación se conduce en la presencia de un catalizador seleccionado del grupo que consiste de níquel Raney, cobalto Raney, cromito de cobre, y un catalizador homogéneo o heterogéneo de metal precioso. 52. Un método según la reivindicación 50, caracterizado 20 porque dicha hidrogenación se conduce en la presencia de un catalizador seleccionad del grupo que consiste de níquel Raney, cromito de cobre y mezclas de los mismos. 53. Un método según la reivindicación 50, caracterizado porque dicha hidrogenación se conduce en la presencia de un 25 catalizador de níquel Raney. — * y? - 185 - 54. Un método según la reivindicación 50, caracterizado dicha hidrogenación se conduce en un solvente seleccionado del grupo que consiste de metano!, etanol, isopropanol y acetato de etilo. 55. Un método según la reivindicación 50, caracterizado porque dicha hidrogenación se conduce en un solvente de etanol. 56. Un método según la reivindicación 55, caracterizado porque dicha hidrogenación se conduce en una presión de hidrógeno de desde aproximadamente 100 psi de hidrógeno a aproximadamente 10 3000 psi de hidrógeno. 57. Un método según ia reivindicación 55, caracterizado porque dicha hidrogenación se conduce en una presión de hidrógeno de desde aproximadamente 400 psi de hidrógeno a aproximadamente 750 psi de hidrógeno. 15 58. Un método según la reivindicación 57, caracterizado porque dicha hidrogenación se conduce a una temperatura de aproximadamente 50°C a aproximadamente 250°C. 59. Un método según la reivindicación 50, caracterizado porque dicha hidrogenación se conduce a una temperatura de 20 aproximadamente 1 35°C a aproximadamente 175°C.