JPWO2020066987A1 - 好塩菌が産生するｐｈａ共重合体の分子量制御技術 - Google Patents

Abstract

３６１万を超える分子量を有するＰＨＡ、とくにＰＨＢＶ、及び／又はかかるＰＨＡの製造を分子量を制御しつつ行う方法の提供を目的として、重量平均分子量が３６１万より大きい、３−ヒドロキシブタン酸と３−ヒドロキシバレリル酸とがランダムに共重合した共重合体が提供される。

Description

本発明は好塩菌が産生するＰＨＡ共重合体の分子量制御技術に関し、ＰＨＡ共重合体の生産を、好塩菌を用いて分子量をコントロールしながら行う方法に関する。また本発明は分子量をコントロールしながらＰＨＡ共重合体の生産を行う方法、及び新規なＰＨＡにも関する。

２０世紀後半、石油からプラスチックを作る技術が急速に発展し、プラスチックの普及によって人々の生活が一変した。プラスチックに関するノーベル賞の受賞も多数ある（カロザースのナイロン、チーグラーとナッタのポリエチレン、ポリプロピレンなど）。

現在では、プラスチックは日本だけでも年間で１０７５万ｔ生産されている（２０１６年）。一方で、プラスチックのほとんどは石油から作られており、その廃棄時の二酸化炭素の排出による温暖化への影響や石油資源の安定供給性などが問題となっている。さらに、通常のプラスチックは一度環境中に放出されると自然界で分解されないため、プラスチックがそのまま海に漂ってしまうことによる、マイクロプラスチックの問題が深刻化している。
このような問題の解決策としてバイオマスプラスチック、生分解プラスチックが挙げられる。バイオマスプラスチックは、原料が化石燃料ではなくトウモロコシやサトウキビなどの搾りかすや木質などのバイオマスであるプラスチックであり、生分解プラスチックは、使用後に環境中で微生物の力で水と二酸化炭素にまで分解されるプラスチックである。

ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）はある種の微生物に脂質や糖質などのバイオマスを炭素源（栄養）として与えるとエネルギー貯蔵物質として蓄えるプラスチックであり、使用後は環境中で生分解する環境負荷の小さいバイオプラスチックである。
ＰＨＡとして最初に発見されたのはポリ［３−ヒドロキシブタン酸］（「Ｐ（３ＨＢ）」と表記されることがある）であるが、ポリ［３−ヒドロキシブタン酸］は硬くて脆い性質を示す。さらにポリ［３−ヒドロキシブタン酸］は、融点付近で熱分解するため溶融加工温度領域が狭く、実用化は難しいとされてきた。
しかし最近になって、これらの解決策として共重合体化や超高分子量化による物性改善に関する報告が多数されている。物性が改善された共重合体は、モノマー成分として３−ヒドロキシブタン酸（「３ＨＢ」と表記されることがある）以外に第２成分として３−ヒドロキシバレリル酸（「３ＨＶ」と表記されることがある）、３−ヒドロキシヘキサン酸（「３ＨＨ」と表記されることがある）、４−ヒドロキシブタン酸（「４ＨＢ」と表記されることがある）などを取り込んだＰＨＡである。第２成分の導入によりＰＨＡは軟らかくなり、融点が下がることから、第２成分の導入には溶融加工温度領域が広がるというメリットがある。さらに、ＰＨＡ中の第２成分の量によって物性は大きく変わることが知られており、例えば３ＨＶが８．２ｍｏｌ％の場合には融点は１４１℃であり、２５．９％の場合には１０８．４℃（非特許文献６：Biomacromolecules, 2018, 19, 996）であるように、モル分率によって熱物性を制御することができることが知られている。

ところで超高分子量体は、一般的には３０万から１００万程度である重量平均分子量を３００万以上にしたＰＨＡであり、通常の分子量のものと比べて成型加工後に重要な物性（例えば、引張強度など）が向上することが知られている。しかし、一方で分子量が非常に高いことに起因して、超高分子量体は溶融粘度が高く、成型性が悪くなり、コストが上がってしまうという課題がある。このため、求められる物性、コストに応じて、超高分子量体においてその分子量を制御することは非常に重要である。

微生物が産生するＰＨＡやＰＨＡを産生する当該微生物について、例えば特許文献１及び２には、高分子量ＰＨＡ生産微生物として分子量が４００万を超えるＰＨＢＨ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸重合体）を生産する微生物についての報告がある。
特許文献３には側鎖にフェニル構造、チオフェン構造、シクロヘキシル構造を有する残基を含む特殊なＰＨＡの分子量制御方法として特殊なカルボン酸を加えることを特徴とするＰＨＡの分子量制御技術が開示され、特許文献４には高度好塩菌で培養後にＰＨＡを取り出す際に、水で洗うと菌体が溶けてポリエステルのみを回収できるといったことが開示されている。

微生物が産生するＰＨＡや当該微生物について論文も発表されており、例えば非特許文献１には微生物にＰＨＡを産生させるための培養条件及び用いた微生物とともに、炭素源としてのグルコースについて開示されている。
非特許文献２には微生物によりＰＨＡを産生させる際の炭素源としてｗｈｅｙ ｓｕｇａｒｓ（乳清）であることや、生産されたＰＨＡがＰＨＢＶ（（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシバレリル酸重合体）である場合、その重量平均分子量は１０５万であり、３ＨＶ分率は６％であったこと等が開示されている。また非特許文献３には乳清を炭素源として微生物によりＰＨＢＶを生産した場合、得られたＰＨＢＶの分子量が６９．６万、３ＨＶ分率が８〜１０％であったこと等が開示されている。
非特許文献４には窒素固定菌に、酢酸とプロピオン酸を炭素源としてＰＨＡを生産した場合、得られたＰＨＡの分子量は３２７万で、３ＨＶ分率は８．２％であったこと等が開示されている。
非特許文献５にはHaloferax mediterranei ATCC 33500を遺伝子組み換えにより改変した株を用い、炭素源としてグルコースにバレリル酸を加えると、３ＨＶ分率が上がることや、重量平均分子量は９８万から２００万であり、３ＨＶ分率は８．９％から６０．３％までの値をとるといったことが記載されている。
非特許文献６にはHaloferax mediterranei DSM1411を用い、炭素源としてのカルボン酸の炭素数を２〜１１まで変えることにより、得られるPHBVの分子量を４６万から３６１万まで制御できることや、３ＨＶ分率を０〜９９．５％まで制御可能であるといったことが開示されている。
非特許文献７にはＰＨＡを作らせる遺伝子を導入した大腸菌の培養時に、アルコールを添加すると分子量が低下することが開示されている。非特許文献８には、組み換え大腸菌を用いて分子量が1100万を超えるＰ（３ＨＢ）が生産されたことが記載されている。
特許文献５ならびに非特許文献９及び１０にはＰＨＡの強度について記載されている。

ＷＯ２０１２／１０２３７１ ＷＯ２０１４／０６５２５３ 特開２００３−３１９７９２号公報 特開平７−３０３４９０号公報 特許第３７７４７４６号公報

Applied and environmental microbiology, 1990, 56, 8, 2517 Macromolecular Symposia 2007, 253, 33 Macromolecular Bioscience 2007, 7, 218 Applied and environmental microbiology, 2007, 73, 19, 6058 Biomacromolecules, 2015, 16, 578 Biomacromolecules, 2018, 19, 996 Polymer Degradation and stability 2015, 117, 90 Journal of Macromolecular Science, Part A Pure and Applied Chemistry, 1998, 2, 35, 319 Polymer Degradation and Stability 79, 2003, 217-224 Macromol. Symp. 2005, 224, 11-19

これまでに製造されているＰＨＢＶの重量平均分子量は最大で３６１万であり、３６１万を超える分子量のＰＨＢＶは得られていない。分子量はＰＨＢＶの物性、コストに影響する重要な指標である。
したがって、本発明は３６１万を超える分子量を有するＰＨＢＶを提供すること、及び／又はＰＨＢＶを包含するＰＨＡの製造を、必要に応じて分子量を制御しつつ行う方法を提供することを課題とした。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、炭素源を改変することにより得られるＰＨＡの分子量を制御することができる可能性があることを見出し、さらに研究を進めた結果本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、少なくとも以下の発明に関する：
［１］
重量平均分子量が３６１万より大きい、３−ヒドロキシブタン酸と３−ヒドロキシバレリル酸とがランダムに共重合した共重合体。
[２]
共重合体を構成する３−ヒドロキシブタン酸のモル数と３−ヒドロキシバレリル酸のモル数の総和に対する３−ヒドロキシバレリル酸のモル数の割合（３ＨＶ分率）が５．０％〜４０．０％である上記[１]の共重合体。
[３]
微生物を培養し、培養産物としてポリヒドロキシアルカン酸を得ることを含むポリヒドロキシアルカン酸の製造方法であって、
前記培養における炭素源が糖を含有し、該糖を
（ａ）グルコース及び／又はその誘導体のみ
（ｂ）グルコース及びその誘導体ならびにキシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上、又は
（ｃ）キシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上
にして、
重量平均分子量が１００万以上であるポリヒドロキシアルカン酸を得る、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
[４]
（ｂ）又は（ｃ）におけるキシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上がキシロース及び／又はセロビオースである上記[３]の製造方法。
[５]
微生物が高度好塩菌である上記[３]又は[４]の製造方法。
[６]
高度好塩菌がHaloferax mediterraneiである[５]の製造方法。
[７]
ポリヒドロキシアルカン酸の重量平均分子量が３６１万より大きい、上記[３]〜[６]のいずれかの製造方法。
[８]
得られるポリヒドロキシアルカン酸の重量平均分子量が６００万以下である上記[３]〜[７]のいずれかの製造方法。
[９]
ポリヒドロキシアルカン酸が３−ヒドロキシブタン酸と３−ヒドロキシバレリル酸とがランダムに共重合した共重合体である上記[３]〜[８]のいずれかの製造方法。
[１０] 微生物を培養し、培養産物として得られるポリヒドロキシアルカン酸の分子量を制御する方法であって、
前記培養における炭素源が糖を含有し、該糖を
（ａ）グルコース及び／又はその誘導体のみ
（ｂ）グルコース及びその誘導体ならびにキシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上、又は
（ｃ）キシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上
にして、
製造されるポリヒドロキシアルカン酸の重量平均分子量を１００万から６００万の間で制御する、方法。
[１１] ポリヒドロキシアルカン酸が３−ヒドロキシブタン酸と３−ヒドロキシバレリル酸とがランダムに共重合した共重合体である上記[１０]の方法。
[１２]
微生物を培養し、培養産物としてポリヒドロキシアルカン酸を得ることを含むポリヒドロキシアルカン酸の製造方法であって、
前記培養における炭素源が糖及びフルフラール系化合物を含有し、該糖を
（ａ）グルコース及び／又はその誘導体のみ
（ｂ）グルコース及びその誘導体ならびにキシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上、又は
（ｃ）キシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上
にして、
ポリヒドロキシアルカン酸を得る、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
[１３]
ポリヒドロキシアルカン酸の分子量が２０万から６００万の間である上記[１２]の製造方法。
[１４]
フルフラール系化合物がフルフラール及び/又は５−ヒドロキシメチルフルフラール又はそれらの誘導体である、上記[１２]又は[１３]の製造方法。
[１５]
ポリヒドロキシアルカン酸が３−ヒドロキシブタン酸と３−ヒドロキシバレリル酸とがランダムに共重合した共重合体である上記[１２]〜[１４]のいずれかの製造方法。
[１６]
微生物を培養し、培養産物として得られるポリヒドロキシアルカン酸の分子量を制御する方法であって、
前記培養における炭素源が糖及びフルフラール系化合物を含有し、該糖を
（ａ）グルコース及び／又はその誘導体のみ
（ｂ）グルコース及びその誘導体ならびにキシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上、又は
（ｃ）キシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上
にして、
製造されるポリヒドロキシアルカン酸の重量平均分子量を制御する、方法。
[１７]
ポリヒドロキシアルカン酸の分子量が２０万から６００万の間である、上記[１６]の方法。
[１８]
フルフラール系化合物がフルフラール及び/又は５−ヒドロキシメチルフルフラール又はそれらの誘導体である、上記[１６]又は[１７]の方法。
[１９]
ポリヒドロキシアルカン酸が３−ヒドロキシブタン酸と３−ヒドロキシバレリル酸とがランダムに共重合した共重合体である上記[１６]〜[１８]のいずれかの方法。
[２０]
３−ヒドロキシブタン酸と３−ヒドロキシバレリル酸とがランダムに共重合した、重量平均分子量が３６１万より大きい共重合体を冷延伸したフィルム。
[２１]
冷延伸が以下の工程を含む、上記[２０]のフィルム：
（１）３−ヒドロキシブタン酸と３−ヒドロキシバレリル酸とがランダムに共重合した共重合体を溶融させて溶融フィルムを得る
（２）（１）で得られた溶融フィルムを氷水中で急冷し、非晶フィルムを作製する
（３）（２）で得られた非晶フィルムをそのまま氷水中で１０倍の長さまで延伸し非晶フィルムを配向させる
（４）（３）で得られた配向後のフィルムに緊張熱処理を行い結晶化させ、冷延伸したフィルムを得る。
[２２]
３−ヒドロキシブタン酸と３−ヒドロキシバレリル酸とがランダムに共重合した共重合体における３ＨＶ分率が５％〜１５％である、上記[２０]又は[２１]のフィルム。

本発明者らは、炭素源として特定の糖質（「糖」、「糖分」又は「糖類」等の語が、同義を表すために用いられることがある）を利用し、さらに求められる物性によって糖質の種類を好適に選択することにより上記の課題が解決されることを見出した。
本発明によれば、特定の糖質を炭素源として含有させることにより重量平均分子量が３６１万を超え、５００万を超えることも可能な超高分子量共重合体としてのＰＨＢＶが提供される。かかるＰＨＡは補強材、超高強度繊維など従来の分子量では適用できなかった用途への応用が可能である。
ＰＨＡとして分子量が４００万を超えるＰＨＢＨや（特許文献１）分子量が１０００万を超えるＰ（３ＨＢ）（非特許文献８）については知られている。しかしながら公知のＰＨＢＶの分子量はせいぜい３６１万である。すなわちこれまでに分子量が３６１万を超えるＰＨＢＶは知られていなかった。
これに対して本願発明によれば、３６１万より大きい分子量を有するＰＨＢＶが与えられる。

本発明の製造方法によれば、ＰＨＡについて求められる物性又はコストに応じて、例えば１００万から６００万の適切な分子量にＰＨＡの分子量を制御することができる。
本発明の製造方法のうち、炭素源としてのフルフラール系化合物を添加することをさらに含む製造方法によれば、さらに広範囲な分子量にＰＨＡの分子量を制御することができる。フルフラール系化合物を添加することをさらに含む本発明の製造方法によれば、得られるＰＨＡの分子量制御をさらに容易にして、所望の量のＰＨＡを得ることができる。すなわち、フルフラール系化合物を添加することをさらに含む本発明の製造方法においては、該添加により生じるＰＨＡの生産量の変化は小さい。
本発明の製造方法によれば、原料及び炭素源となる糖質の種類を適宜選択することにより、ＰＨＡの分子量のみならず第２成分のモル分率も制御できる。
また本発明の製造方法によれば、分子量制御のための炭素源として中性であり水溶解度が高い糖質が用いられるため、培養液を中和する必要がなく、また高密度培養も可能になる。カルボン酸で微生物を培養した場合、高濃度で培養すると培養液が酸性となり、プラントを腐食してしまうおそれがある上に、酸性下では微生物が生育できないという問題がある。かかる問題を解決するためには培養液を中和する必要があるが、そのための操作には手間がかかるうえに水酸化ナトリウムなどの塩基を大量に用いることになるため、工業的には採用しがたい手法である。本発明の製造方法によれば、このようなカルボン酸を用いることに伴う問題を生じさせることなくＰＨＡの製造を行うことができるといった効果も奏される。

本発明の製造方法のうち、高度好塩菌（「ハロアーキア」（Haloarchaea）と称されることもある）を用いるものによれば、ＰＨＡの製造・回収を低コストで行うことができる。
高濃度塩化ナトリウム水溶液中でのみ生きる高度好塩菌と呼ばれるタイプの中にもＰＨＡを生産する微生物がいることが知られている。高濃度塩化ナトリウム水溶液中でＰＨＡを生産する菌体は、生産後低濃度塩化ナトリウム水溶液中又は水中で溶菌し、中に蓄えているＰＨＡを取り出せることが知られている（特許文献４）。通常、ＰＨＡは菌体から回収する際に有機溶媒や界面活性剤などを大量に使用するが、高度好塩菌の場合は水のみで回収できるため、コスト面でのメリットが大きい。
高度好塩菌でのＰＨＡ生産において分子量を制御する先行技術としては、例えば、Anna Ferre-Guellらはカルボン酸を炭素源としたHaloferax mediterraneiでの超高分子量体の製造方法を提供し、さらに４６万〜３６１万までの間で幅広い分子量をもつPHBVの生産方法を発表した(非特許文献６)。この方法では、分子量を制御するときに炭素源として、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸が用いられている。

非特許文献１には炭素源としてグルコースが用いられ、Haloferax mediterraneiによりＰＨＡの製造が行われたことが報告されている。しかしながら同文献にはＰＨＡとしてＰＨＢＶについての開示はないし、ＰＨＡの分子量についての記載もなされていない。
特許文献１には特定の微生物を用いることにより分子量が４００万を超えるＰＨＢＨが生産された旨記載されている。しかしながら同文献に記載されているのは高分子量のＰＨＡを合成する方法に留まり、同文献には高分子量のＰＨＡを、分子量を制御しつつ得ることやそのための手法については記載されていない。
本発明の製造方法においては、ＰＨＡの分子量を広範囲に制御しつつ該ＰＨＡを得ることができることは、従来技術からは予測不能な優れた効果である。

実施例２６〜２８について、生産されたＰＨＢＶの生産量、３ＨＶ分率、及び重量平均分子量を示す図である。左の図中の縦軸に示された「DCW」の表記は乾燥菌体濃度を示す。 実施例２９〜３５及び試験例として、10倍に１軸冷延伸したフィルムの製造及び該フィルムの物性評価の結果を示すグラフである。非特許文献９に開示されている対応する数値を併せてプロットした（▲）。本実施例において示されている分子量は絶対分子量である。

以下に本発明について、より詳細に説明する。なお本明細書におけるＰＨＡの分子量は、他の記載がない限りポリスチレン標準を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより測定された数値である。
本発明により新規なＰＨＡ共重合体である重量平均分子量が３６１万を超える、３−ヒドロキシブタン酸と３−ヒドロキシバレリル酸とがランダムに共重合した共重合体が提供され、さらに該共重合体を包含するＰＨＡの製造方法が提供される。
ＰＨＡを製造するための本発明の製造方法は、製造されるＰＨＡの分子量を制御し、また第２成分のモル分率も制御できる。本発明の製造方法においてこのような制御が可能であるのは、炭素源として用いられる糖類、すなわちグルコース又はその誘導体ならびにキシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体のうち、微生物（とくに高度好塩菌）における消費スピードはグルコース又はその誘導体の消費スピードが最も大きく、キシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース又はスクロース又はその誘導体についての消費スピードはグルコース又はその誘導体の消費スピードより小さいため、これらの各糖類についての消費スピードの相違を利用し、供給する炭素源全体の消費スピードを調節することに基礎を置くものであると考えることが可能である。本発明の原理は、かかる理論に束縛されるものではない。

本明細書において「〜」の記号は、該記号により結ばれた２つの数値の間の範囲により特定される数値範囲（前記２つの数値を包含する）を表す。例えば「２０万〜６００万」の記載は２０万及び６００万を含む、２０万から６００万の間に存在するすべての数値により構成される範囲を意味する。同じ意味を表すために、「２０万以上６００万以下」の表記が用いられることがある。
本明細書においてポリマーの分子量を数値により表す場合、本技術分野における当業者により理解される数値の幅を含むことにより特定される数値が意図される。

１．ＰＨＡを製造する方法
ＰＨＡを製造するための本発明の製造方法（以下において「本発明の製造方法」ということがある）の一つは、重量平均分子量が３６１万を超えるＰＨＡを製造することを可能にする、下記のものである：
微生物を培養し、培養産物としてポリヒドロキシアルカン酸を得ることを含むポリヒドロキシアルカン酸を製造する方法であって、
前記培養における炭素源が糖を含有し、該糖を
（ａ）グルコース及び／又はその誘導体のみ
（ｂ）グルコース及びその誘導体ならびにキシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上、又は
（ｃ）キシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上
にして、
重量平均分子量が１００万以上であるポリヒドロキシアルカン酸を得る、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
上記糖には、例えば酵母エキスのような他の栄養源に含有される糖は包含されない。上記糖は、酵母エキスのような他の栄養源とは別に供給される糖を指す。
本発明の製造方法において用いられる糖には、上記各糖の誘導体も包含される。糖の誘導体としては、上記糖がエーテル化、エステル化されたものが想定され、とくにエーテル化されたものとしてはメトキシ化されてなる誘導体が、エステル化されたものとしてはアセチル化されてなる誘導体が、それぞれ例示される。

本発明の製造方法において、炭素源は上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載される糖を含むものであれば限定されず、上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載される糖を含むものであれば他の炭素源を含んでもよい。例えば天然物由来の糖が用いられる場合に、上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載される糖とともに、上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載される糖以外の炭素源が存在してよい。微生物を培養する際の炭素源として、上記（ａ）〜（ｃ）に規定されるいずれかの糖類のみが用いられる本発明の製造方法は好ましい。
本発明の製造方法は、上述のとおり、製造されるＰＨＡの分子量を制御し、また第２成分のモル分率も制御できる。本発明の製造方法においてこのような制御が可能である原理として考えられる原理についても上述のとおり（炭素源として微生物に用いられる各糖類についての消費スピードの相違を利用し、供給する炭素源全体の消費スピードを調節することに基礎を置く）である。
なお、本発明の製造方法においては、例えば１００万〜６００万の重量平均分子量に、ＰＨＡの分子量を制御してＰＨＡを製造することができるところ、炭素源としてのフルフラール系化合物をさらに添加することによりＰＨＡとしてより低分子量のものが得られ、さらに広範囲な分子量を有するＰＨＡを製造することができる。炭素源としてのフルフラール系化合物をさらに添加する本発明の製造方法においては、製造されるＰＨＡの分子量は限定されないところ、例えば２０万〜６００万の重量平均分子量に、ＰＨＡの分子量を制御してＰＨＡを製造することができる。フルフラール系化合物が用いられる本発明の方法については、さらに後述する。
本発明の製造方法として、ＰＨＡの分子量を１００万〜５７５万の重量平均分子量に制御してＰＨＡ製造する方法は好ましい。

＜炭素源＞
本発明の製造方法における上記炭素源として
（ａ）グルコース及び／又はその誘導体のみ
を用いると、生成されるＰＨＡの分子量は大きくなる傾向にあり、
上記炭素源として
（ｂ）グルコース及びその誘導体ならびにキシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上、
を用いると、生成されるＰＨＡの分子量は上記（ａ）の場合より小さくなる傾向にあり、
上記炭素源として
（ｃ）キシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上を用いグルコース及び／又はその誘導体を用いないことにより、生成されるＰＨＡの分子量は上記（ｂ）の場合よりさらに小さくなる傾向にある。
このような炭素源としての糖を選択することにより、ＰＨＡの分子量を制御する方法も本発明により提供される。本発明によるＰＨＡの分子量を制御する方法は、培養における炭素源が糖を含有し、該糖を
（ａ）グルコース及び／又はその誘導体のみ
（ｂ）グルコース及びその誘導体ならびにキシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上、又は
（ｃ）キシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上
にして、
製造されるポリヒドロキシアルカン酸の重量平均分子量を１００万から６００万の間で制御する、方法である。
本発明の制御する方法として、ＰＨＡの分子量を１００万〜５７５万の重量平均分子量に制御する方法は好ましい。

本発明の製造方法に用いられる糖の量（培養の初期濃度）は限定されないところ、約5g/L〜910g/Lが例示される。糖の量として約5g/L〜約500g/Lは好ましく、約10g/L〜50g/Lはより好ましい。
本発明の製造方法において、用いられる糖は複数回に分けて投入されてよい。投入される回数及びタイミングは限定されず、回数としては２回、３回、４回、５回、又は６回以上であってよい。
投入されるタイミングは、培養開始後約２０時間〜約３０時間後、約３０時間〜約４０時間後、約４０時間〜約５０時間後、約５０時間〜約６０時間後、約６０時間〜約７０時間後、約７０時間〜約８０時間後、又は約８０時間後以降から選択してよく、選択されたタイミングでの糖の投入を組み合わせて実施してよい。

本発明の製造方法においては、上述のとおり、炭素源としてのフルフラール系化合物をさらに添加することにより、さらに広範囲な分子量、例えば２０万〜６００万の重量平均分子量に、ＰＨＡの分子量を制御してＰＨＡを製造することができる。すなわち本発明は、以下の各発明にも関する：
●微生物を培養し、培養産物としてポリヒドロキシアルカン酸を得ることを含むポリヒドロキシアルカン酸の製造方法であって、
前記培養における炭素源が糖及びフルフラール系化合物を含有し、該糖を
（ａ）グルコース及び／又はその誘導体のみ
（ｂ）グルコース及びその誘導体ならびにキシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上、又は
（ｃ）キシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上
にして、
ポリヒドロキシアルカン酸を得る、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。

●微生物を培養し、培養産物として得られるポリヒドロキシアルカン酸の分子量を制御する方法であって、
前記培養における炭素源が糖及びフルフラール系化合物を含有し、該糖を
（ａ）グルコース及び／又はその誘導体のみ
（ｂ）グルコース及びその誘導体ならびにキシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上、又は
（ｃ）キシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上
にして、
製造されるポリヒドロキシアルカン酸の重量平均分子量を制御する、方法。

フルフラール系化合物は糖質を原料に生産されるアルデヒドの一種であり、糖質を酸性下で加熱することなどにより６単糖からは５-ヒドロキシメチルフルフラール（HMF）が、５単糖からはフルフラールが生成することが知られている。フルフラール系化合物のうち、「フルフラール」は２−フリルアルデヒドの通称である。
本発明における「フルフラール系化合物」とは、フルフラール及び５−ヒドロキシメチルフルフラール、ならびにそれらの誘導体を意味する。
本発明においては、上記糖類、とくにグルコース及び／又はその誘導体、なかんずくグルコースのみを炭素源として、フルフラール系化合物をさらに用いることにより、得られるＰＨＡの分子量をさらに低下させ制御することができる。例えばフルフラール系化合物をさらに用いることにより、得られるＰＨＡの分子量を２０万〜５５０万に制御することができ、また２０万〜４００万、あるいは２０万〜３６１万に制御することができる。
理論に束縛されるものではないが、フルフラール系化合物によりさらに広範囲な分子量にＰＨＡの分子量を制御してＰＨＡを製造することができる理由は、フルフラール系化合物が、重合により生成されたポリマー鎖の移動反応を起こしやすくすることによるものである可能性がある。重合によりポリマーが生成するときに、フルフラール系化合物により比較的低い分子量のポリマー鎖の成長末端が移動を促進されることにより該ポリマー鎖の伸長は停止され、該ポリマーとは別異の次のポリマー鎖の伸長が開始されることとなるため、得られるＰＨＡの分子量はフルフラール系化合物を用いない場合より小さくなると考えることができる。

フルフラール系化合物が用いられる本発明の製造方法又は制御方法において用いられるフルフラール系化合物の種類は限定されず、フルフラール及び５−ヒドロキシメチルフルフラール、ならびにそれらの誘導体が例示される。かかる誘導体として、５−ヒドロキシメチルフランカルボン酸、５−ヒドロキシフルフリルアルコール、フラン−２，５−ビスメタノールとそれらをエーテル化又はエステル化されてなるものが挙げられる。エーテル化としてはメトキシ化が、エステル化としてはアセチル化及びメチルエステル化が、それぞれ例示される。
糖がグルコース及びその誘導体、ならびにキシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上であり、フルフラール系化合物がフルフラール及び/又は５−ヒドロキシメチルフルフラール又はそれらの誘導体である本発明の製造方法又は本発明の制御方法は、好ましい。

本発明の製造方法において用いられるフルフラール系化合物の量は限定されず、培養の初期濃度として約０．０１〜約３．０g/Lが例示される。フルフラール系化合物の初期濃度として、０．０１ｇ/Ｌ〜１ｇ/Ｌは好ましい。
用いられるフルフラール系化合物の量の糖の量に対する割合は限定されず、約０．００２５〜約０．６が例示される。用いられるフルフラール系化合物の量の糖の量に対する割合が、０．０１〜０．２である本発明の製造方法又は本発明の制御方法は好ましい。

＜微生物＞
本発明の製造方法においては、微生物を公知の方法により培養することにより、ＰＨＡを製造できる。
本発明の製造方法において用いられる微生物は限定されないところ、該微生物として高度好塩菌は好適である。ＰＨＡの生産能が高いばかりでなく、生産されたＰＨＡの回収が容易だからである。
高度好塩菌のうちHaloferax属、Halalkalicoccus属、Haloarchaeobius属、Haloarcula属、Halobacterium属、Halobaculum属、Halococcus属、Halogranum属、Halomarina属、Halorubrum属、Haloterrigena属、Natrialba属、Natronobacterium属は好ましく、Haloferax mediterraneiはとくに好ましい。
本発明の制御方法においても、本発明の製造方法に用いられる微生物を用いることができる。

＜その他の培養条件＞
本発明のＰＨＡの製造方法における微生物の培養に関し、上記炭素源及び微生物以外の条件については限定されず、本技術分野において通常用いられる条件や公知の条件を用いてよい。
また本発明の製造方法における培養に用いられる培地としては、固体であっても液体であってもゲル状であっても構わないが、生産スピードの観点から液体培地であることは好ましい。
また本発明の製造方法における培養において、総塩濃度としては例えば100g/L〜300g/Lが挙げられる。総塩濃度が150g/L〜250g/Lであることは好ましい。
用いられる培地としては、例えばNH₄Cl、KH₂PO₄、FeCl₃、NaCl、MgCl₂、MgSO₄、CaCl₂、KCl、NaHCO₃及びNaBr等の無機塩類を含有するものが挙げられる。これらの無機塩類の種類と量は限定されず、例えばNH₄Cl、KH₂PO₄、FeCl₃、KCl、NaHCO₃、NaBr及びNaClについては、それぞれ以下の量(g/L)が例示される：
NH₄Cl：１．５〜２．５、KH₂PO₄：０．００５〜０．３５、FeCl₃ ：０．００１〜０．０１、KCl：３〜７、NaHCO₃ ：０．１〜１、NaBr：０．３〜０．７、 NaCl： １００〜３００。
本発明のＰＨＡの製造方法において用いられる培地として、ＮＢＲＣ（独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター）がウェブサイトにおいて公開している培地一覧（https://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/cultures/culture-list.html）におけるNo.1380の培地は好ましい。当該No.1380の培地組成を上記培地一覧から引用して示す：

本発明の製造方法における微生物の培養に用いられる培地に含有される栄養源についてさらに説明するに、炭素源としては、上記（ａ）〜（ｃ）に規定されるいずれかの糖が少なくとも用いられることは上述のとおりであるところ、微生物を培養する際の上記糖とは別の炭素源として、アミノ酸類、アルコール類、油脂類、及び／又は脂肪酸類等の通常微生物培養に用いられる炭素源を用いてよい。具体的には以下のものが例示される：
アミノ酸類として、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、リシン、ロイシン；
アルコール類として、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、グリセロール；
油脂類として、パーム油、パーム核油、コーン油、やし油、オリーブ油、大豆油、及び菜種油；
脂肪酸類として、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、及びクロトン酸とそのナトリウム塩やアンモニウム塩などの脂肪酸塩。脂肪酸類が用いられる場合、該脂肪酸類の量は少量であることが好ましい。

本発明の製造方法における微生物の培養に用いられる培地には、窒素源や無機塩類等を含んでよい。
窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩のほか、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。
無機塩類としては、例えばリン酸２水素カリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。

本発明の製造方法において微生物を培養する際の培養の温度は、該微生物が生育可能な温度であれば限定されないところ、例えば約１０℃〜約６５℃が挙げられ、２０℃〜５０℃は好ましく、３５℃〜４５℃はより好ましい。
本発明の製造方法において、炭素源、無機塩類、有機栄養源を添加するタイミングに関しては限定されないところ、一般的に用いられている回分培養、流加培養、連続培養等の方法を目的に応じて適宜選択して用いることができる。
本発明の製造方法における微生物の培養時間としては、回分培養では２４時間〜１６８時間、流加培養では７２時間〜１４日間、連続培養では１４日間を超える長期間が例示されるが、これらの時間に限定されない。

本発明の製造方法において、培地における溶存酸素量を大きくすることは好ましく、培地における溶存酸素量を飽和量に保つことはより好ましい。
本発明の製造方法において培地のｐＨは限定されないところ、培地の初期のｐＨを約６．５〜約７．５とすることは好ましい。培地の初期のｐＨを約６．５〜約７．５とし、培養中の培地のｐＨを約６．５〜約７．５に維持することはより好ましい。これらのｐＨを約７．０〜約７．４にすることはさらに好ましい。

本発明の制御方法においても、本発明の製造方法に用いられるその他の培養条件を用いることができる。

＜本発明の製造方法により製造されるＰＨＡ＞
本発明の製造方法における生成物であるＰＨＡの種類は限定されないところ、ＰＨＢＶ及び／又はＰ（３ＨＢ）（３−ヒドロキシブタン酸重合体）が好適な生成物である。

本発明の製造方法により製造されたＰＨＡは、有機溶媒や界面活性剤、低濃度塩化ナトリウム水溶液又は水を用いる遠心分離や濾過・沈殿による公知の方法により菌体から回収することができる。
本発明の製造方法において微生物が産生するＰＨＡの生産量と３HV分率は、ＧＣ−ＭＳ法等の公知の方法を用いて測定してよい。本発明の製造方法により得られるＰＨＡがＰＨＢＶである場合、３ＨＶ分率もＧＣ−ＭＳ法等の公知の方法を用いて決定してよい。
グルコース又はその誘導体やその他の糖質、フルフラール系化合物の濃度の測定には、市販の濃度測定キットによる測定や、ＨＰＬＣ法などの公知の方法を用いてよい。
本発明の製造方法において微生物が培養された際の微生物菌体の生産量を特定することが必要な場合には、微生物菌体の生産量は吸光度法や乾燥菌体重量測定法などの公知の方法で測定してよい。

また本発明の製造方法により得られるＰＨＡの分子量の測定も公知の方法により行ってよく、例えばポリスチレン標準を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより行うことができる。本明細書におけるＰＨＡの分子量には、他の記載がない限りポリスチレン標準を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより測定された数値を用いたことは前述のとおりである。
本発明の方法で製造されるＰＨＡの重量平均分子量は、フルフラール系化合物を用いない場合には約１００万から約６００万であり、フルフラール系化合物を用いる場合には約２０万から約６００万である。それぞれの範囲において得られるＰＨＡの分子量を、本発明の製造方法においては制御又は調節することができる。

２．ＰＨＢＶ
本発明により３−ヒドロキシブタン酸（３ＨＢ）と３−ヒドロキシバレリル酸（３ＨＶ）とがランダムに共重合した共重合体（以下「ＰＨＢＶ」ということがある）も提供され、かかるＰＨＢＶは重量平均分子量が３６１万を超えるものであり、好ましくは分子量が４００万を超えるものである。本発明のＰＨＢＶとして分子量が５００万を超えるものはより好ましく、分子量が５７０万を超えるものは一層好ましい。
本発明のＰＨＢＶは、以下で示される構造単位を、ＰＨＢＶ全体の分子量が３６１万を超える任意の組み合わせとして含む（下式においてｍ及びｎは整数を表す）：


本発明のＰＨＢＶの構造、モノマーの組成及び分子量は限定されず、分子量が３６１万を超えるものであればよい。本発明のＰＨＢＶは線状であり、少なくとも実質的に直鎖状である本発明のＰＨＢＶは好ましい。
本発明のＰＨＢＶは上記のとおり３ＨＢと３ＨＶとがランダムに共重合した共重合体であるところ、３ＨＢと３ＨＶとの交互共重合又はブロック共重合により生成される共重合体も包含される。

本発明のＰＨＢＶにおいて、ＰＨＢＶを構成する３−ヒドロキシブタン酸と３−ヒドロキシバレリル酸とのモル比は限定されない。３ＨＶ分率（共重合体を構成する３−ヒドロキシブタン酸のモル数と３−ヒドロキシバレリル酸のモル数の総和に対する３−ヒドロキシバレリル酸のモル数の割合）が、約５．０％〜約４０．０％である本発明のＰＨＢＶは好ましく、約５．０％〜約２８．０％である本発明のＰＨＢＶはより好ましく、約７．０％〜１８．０％である本発明のＰＨＢＶは一層より好ましく、約９．０％〜約１５．０％である本発明のＰＨＢＶは一層さらにより好ましい。

本発明のＰＨＢＶのうち、従来のＰＨＢＶを上回る特性、とくに従来のＰＨＢＶより柔軟である、及び／又はより強度に優れるといった特性を有するものは好ましい。本発明のＰＨＢＶのうち、引張強度に優れるものは好ましい。
本発明のＰＨＢＶのうち、冷延伸により引張強度が一層優れたものになるものも好ましい。冷延伸後の引張強度が２４０ＭＰａ以上であるものは好ましく、該引張強度が２５０ＭＰａ以上であるものはより好ましく、該引張強度が２５５ＭＰａ以上であるものは一層より好ましい。
本発明により、３−ヒドロキシブタン酸と３−ヒドロキシバレリル酸とがランダムに共重合した、重量平均分子量が３６１万より大きい共重合体を冷延伸したフィルムも提供される。かかるフィルムは重量平均分子量が100万の通常分子量PHBVと比べ引張強度に優れるといった特徴がある。
本発明の上記フィルムのうち、引張強度が２４０ＭＰａ以上であるものは好ましく、該引張強度が２５０ＭＰａ以上であるものはより好ましく、該引張強度が２５５ＭＰａ以上であるものは一層より好ましい。
また、冷延伸が以下の工程を含む上記フィルムは、引張強度に優れるフィルムがより確実に得られるため好ましい：
（１）３−ヒドロキシブタン酸と３−ヒドロキシバレリル酸とがランダムに共重合した共重合体を溶融させて溶融フィルムを得る
（２）（１）で得られた溶融フィルムを氷水中で急冷し、非晶フィルムを作製する
（３）（２）で得られた非晶フィルムをそのまま氷水中で１０倍の長さまで延伸し非晶フィルムを配向させる
（４）（３）で得られた配向後のフィルムに緊張熱処理を行い結晶化させ、冷延伸したフィルムを得る。
冷延伸による引張強度の向上を考慮すると、３HV分率が５％以上であるものは冷延伸による引張強度の向上が顕著であるため好ましい。これは、3HV成分を５％以上の割合で含んだ結晶がPHBと同等の強度を発揮する上に、170℃での融解が可能になるからであると推定されるが、本発明が効果を発揮するメカニズムについてはかかる理論に拘束されるものではない。３HV分率が５％〜１５％である本発明のＰＨＢＶは、より好ましい。

本発明のＰＨＢＶを製造するための方法は限定されず、重量平均分子量が３６１万を超えるＰＨＢＶを製造することができるいかなる方法であってよい。
かかる方法として、微生物を培養し、培養産物として本発明のＰＨＢＶを得る方法が例示されるところ、前記培養における微生物として高度好塩菌を用い、炭素源としてグルコース及び／又はその誘導体を用いる方法は好ましく、グルコースを用いる方法はとくに好ましい。これらの方法によれば、重量平均分子量が３６１万を超えるＰＨＢＶを効率的に製造することができ、また製造されたＰＨＢＶを簡便に回収することができるからである。

本発明のＰＨＢＶの製造方法は限定されないところ、例えば本発明の上記ＰＨＡの製造方法により製造することができる。本発明の上記ＰＨＡの製造方法を用いて本発明のＰＨＢＶを製造する場合、炭素源としての糖類は
（ａ）グルコース及び／又はその誘導体のみ、又は
（ｂ）グルコース及びその誘導体ならびにキシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上、
であってよい。
本発明のＰＨＢＶは、酵母エキスを用い、酵母エキスに含有されるアミノ酸などの炭素源以外の炭素源を添加しなくても製造される。酵母エキスに含有されるアミノ酸などの炭素源以外の炭素源を用いることにより、より小さいコストで本発明のＰＨＢＶを製造することができる。

本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。本発明は、いかなる意味においてもかかる実施例に限定されるものではない。
すべての実施例において他に記載がない限りNBRCより提供の菌株 Haloferax mediterranei NBRC 14739を用いて実験を行った。
すべての実施例において他に記載がない限り、上記菌を各例の項において示される方法・条件にて培養後、培養により得られたＰＨＡ（ＰＨＢＶ）の分子量をポリスチレン標準を用いたGPC(ゲルろ過クロマトグラフィー)により測定し、分子量として示した。
GPC測定には、東ソー株式会社製EcoSEC HLC-8320GPCを使用した。ガードカラムはTSKgel guardcolumn SuperHZ-Hを、カラムはTSKgel Super HZM-H２本を直列につないで用いた。移動相にはクロロホルム（０．６mL/min）を用い、カラム温度は４０℃とした。サンプル濃度は約0.5 mg/mLとし、サンプル注入量は10μLとした。検量線の作成には、ポリスチレン標準を用いた。
共重合体の3-ヒドロキシバレリル酸(３ＨＶ)分率とPHBV生産量の測定はガスクロマトグラフィー-質量分析(GC-MS法)を用いて以下のように行った（機器名：Agilent 6890 / 5973 GCMS System ）。すなわち、乾燥菌体の約2mg〜25mgに2mlの硫酸−メタノール混液(15:85)と2mlのクロロホルムを添加して密栓し、100℃で140分間加熱することでポリエステル分解物のメチルエステルを得て、これに水１mLを加えて攪拌後、クロロホルム層をGC-MS法により分析して行った。
これらのＰＨＡの生産量、分子量、３HV分率の測定方法は、ＰＨＡの生産量、分子量、３HV分率を特定するための手法として本技術分野において通常用いられるものである。また、これらの方法により特定されたＰＨＡの生産量、分子量及び３HV分率の数値は公知文献に記載されているＰＨＡの生産量、分子量及び３HV分率の数値と、その大小をそれぞれ正確に比較することができるものである。
乾燥菌体重量は、凍結乾燥法などの公知の方法により測定することができる。乾燥菌体に含まれる無機塩を定量したいときは、高温で無機塩以外の有機物をすべて熱分解する方法を用いてもよい。

Ａ．実施例１〜１１ Haloferax mediterranei NBRC14739のフラスコ培養
●（材料と方法）300 mL三角フラスコに、培養液総量を50 mLにして以下の各成分を加えて72 h、37 ℃、200 rpmで振とう培養を行った。初期pHは 7.2に合わせた。
培地中の成分(g/L)：NH₄Cl 2、KH₂PO₄ 0.0375、FeCl₃ 0.005、NaCl 194、
MgCl₂ 16、MgSO₄ 24、CaCl₂ 1、KCl 5、NaHCO₃ 0.2、
NaBr 0.5、酵母エキス 5
上記成分からなる培地(BSM培地)に、炭素源として、下表に示す糖を所定量入れて、72 hの培養を行った。
●（結果）各条件で生産されたＰＨＢＶの３ＨＶ分率と重量平均分子量、多分散度、乾燥菌体重量、ＰＨＢＶ生産量を下表に示す。

上表に示すとおり、糖質の種類を変えることにより、ＰＨＢＶの分子量を４３９万から１２４万まで、３ＨＶ分率を１２．０％から２５．２％まで制御できることが明らかになった。

Ｂ．実施例１２−１（規模拡大試験−１）
●（材料と方法）5 L容ジャーファーメンターを用いて、以下の各成分を加えて146 h、2 L、37 ℃、初期グルコース濃度20 g/Lで培養を行った。培養中、12 ％アンモニア水を用いてpHを7.2に保ち、グルコースをすべて消費させるまで培養を行った。
培地中の成分(g/L)：NH₄Cl 2、KH₂PO₄ 0.0375、FeCl₃ 0.005、NaCl 194、
MgCl₂ 16、MgSO₄ 24、CaCl₂ 1、KCl 5、NaHCO₃ 0.2、
NaBr 0.5、酵母エキス5

●（結果・考察）時間ごとのＰＨＢＶの３ＨＶ分率と重量平均分子量、多分散度、乾燥菌体重量、ＰＨＢＶ生産量を下表に示す。


上表に示すとおり、培養容器の規模が拡大されたこと、培養中にpHの制御を行ったことによりＰＨＢＶの生産量は増大し、生産効率は向上した。

Ｃ．実施例１２−２（規模拡大試験−２：成分の追加についての検討）
●（材料と方法）5 L容ジャーファーメンターを用いて、以下の各成分を加えて288 h、37 ℃、2 L、初期グルコース濃度20 g/Lで培養を行った。培養中、12 ％アンモニア水を用いてpHを7.2に保ち、培養開始96 hにグルコース40 gを、168 hにKH₂PO₄0.075 gを追加して加えた。
培地中の成分(g/L)：NH₄Cl 2、KH₂PO₄ 0.0375、FeCl₃ 0.005、NaCl 194、
MgCl₂ 16、MgSO₄ 24、CaCl₂ 1、KCl 5、NaHCO₃ 0.2、
NaBr 0.5、酵母エキス5

●（結果）時間ごとのＰＨＢＶの３ＨＶ分率と重量平均分子量、多分散度、乾燥菌体重量、ＰＨＢＶ生産量を下表に示す。


実施例１２−１と比較してＰＨＢＶの分子量は増大した。また、グルコースの追加を行ったことによりPHBVの生産量はさらに増大し、培養開始１７５時間後〜１７６時間後に最大値に達した。

Ｄ．実施例１２−３（規模拡大試験−３：糖の量についての検討（１））
●（材料と方法）5 L容ジャーファーメンターを用いて、以下の各成分を加えて168 h、2 L、37 ℃、初期グルコース濃度40 g/Lで培養を行った。培養中、12 ％アンモニア水を用いてpHを7.2に保った。
培地中の成分(g/L)：NH₄Cl 2、KH₂PO₄ 0.0375、FeCl₃ 0.005、NaCl 194、
MgCl₂ 16、MgSO₄ 24、CaCl₂ 1、KCl 5、NaHCO₃ 0.2、
NaBr 0.5、酵母エキス 5
●（結果）時間ごとのＰＨＢＶの３ＨＶ分率と重量平均分子量、多分散度、乾燥菌体重量、ＰＨＢＶ生産量を下表に示す。


上表に示すとおり、実施例１２−２と比較してＰＨＢＶの生産効率は向上した。培養開始時の糖の量を増大させたためであると考えられた。

Ｅ．実施例１２−４（規模拡大試験−４：糖の量についての検討（２））
●（材料と方法）5 L容ジャーファーメンターを用いて、以下の各成分を加えて288 h、2 L、37 ℃、初期グルコース濃度80 g/Lで培養を行った。培養中、12 ％アンモニア水を用いてpHを7.2に保った。
培地中の成分(g/L)：NH₄Cl 2、KH₂PO₄ 0.0375、FeCl₃ 0.005、NaCl 194、
MgCl₂ 16、MgSO₄ 24、CaCl₂ 1、KCl 5、NaHCO₃ 0.2、
NaBr 0.5、酵母エキス 5

●（結果・考察）時間ごとのＰＨＢＶの３ＨＶ分率と重量平均分子量、多分散度、乾燥菌体重量、ＰＨＢＶ生産量を下表に示す。


上表に示すとおり、実施例１２−３と比較してＰＨＢＶの生産効率の向上はなかった。

Ｆ．実施例１２−５（規模拡大試験−５：培地の検討）
実施例A
（材料と方法）5L容ジャーファーメンターを用いて、以下の各成分を加えて144h、2L、37℃、初期グルコース濃度10 g/Lで培養を行った。培養中、12％アンモニア水を用いてpHを7.2に保ち、途中栄養源や無機塩類を適宜添加した。
培養開始時の培地中の成分(g/L)：グルコース 10、酵母エキス0.1、
カザミノ酸 0.1、
グルタミン酸ナトリウム1水和物 1、
クエン酸ナトリウム2水和物 1、
KCl 2、K₂HPO₄0.3、
CaCl₂・2H₂O 0.15、NH₄Cl 1、
MgSO₄・7H₂O 50、NaCl 200、
その他微量金属元素
その他微量金属元素としては、NBRC公開の指定培地No.1380に含有されるものを用いた。すなわち、ニトリロ三酢酸 12.8 g、塩化鉄(III)6水和物 1.35 g 、塩化マンガン4水和物 0.1 g、塩化コバルト6水和物 0.024 g、塩化カルシウム 2水和物 0.1 g、塩化亜鉛 0.1 g、塩化銅(II)2水和物 0.025 g、ホウ酸 0.01g、モリブデン酸ナトリウム2水和物 0.024g、塩化ナトリウム1g、塩化ニッケル6水和物 0.12 g、水 1 LをｐHを7.0になるように溶解したものを2 mL/L(培養液)の濃度で加えた。
添加された成分(g/L)は、
培養開始 30 h後；グルコース 10
48 h後；グルコース 10
56 h後；グルコース 10
74 h後；グルコース 10、酵母エキス0.1、
カザミノ酸 0.1、
グルタミン酸ナトリウム1水和物 1、
クエン酸ナトリウム2水和物 1、KCl 2、
CaCl₂・2H₂O 0.15
80 h後；グルコース 10
であった。

●(結果)下表に示すとおりであった。
かかる結果から、重量平均分子量は最高で572万、11.58 g/LのPHBVを生産することが明らかになった。

Ｇ．実施例１２−６（規模拡大試験−６：糖の与え方についての検討）
実施例B
（材料と方法）5L容ジャーファーメンターを用いて、以下の各成分を加えて144h、2L、37℃、初期グルコース濃度10 g/Lで培養を行った。培養中、12％アンモニア水を用いてpHを7.2に保ち、途中栄養源や無機塩類を適宜添加した。
培養開始時の培地中の成分(g/L)：グルコース10、酵母エキス0.1、
カザミノ酸 0.1、
グルタミン酸ナトリウム1水和物 1、
クエン酸ナトリウム2水和物 1、
KCl 2、K₂HPO₄0.3、
CaCl₂・2H₂O 0.15、NH₄Cl 1、
MgSO₄・7H₂O 50、NaCl 200、
その他微量金属元素
その他微量金属元素としては、NBRC公開の指定培地No.1380に含有される上記のとおりのものを用いた。
添加(g/L)は、培養開始30 h後；グルコース20
54 h後；グルコース20、酵母エキス0.1、
カザミノ酸 0.1、
グルタミン酸ナトリウム1水和物 1、
クエン酸ナトリウム2水和物 1、
KCl 2、CaCl₂・2H₂O 0.15
79 h後；グルコース 30。

●(結果)下表に示すとおりであった。
かかる結果から、重量平均分子量は最高で541万、12.3g/LのPHBVを少なくとも生産できることが明らかになった。

Ｈ．実施例１２−７（規模拡大試験−７：製造条件の検討）
（材料と方法）5L容ジャーファーメンターを用いて、以下の各成分を加えて72h、2L、37℃、初期グルコース濃度6.8g/Lで培養を行った。初期pHを7.2に保ち、培養中にpHコントロールと栄養源や無機塩類の添加は行わなかった。
培養開始時の培地中の成分(g/L)：グルコース 6.8、酵母エキス0.1、
カザミノ酸 0.1、
グルタミン酸ナトリウム1水和物 1、
クエン酸ナトリウム2水和物 1、
KCl 2、CaCl₂・2H₂O 0.15、NH₄Cl 1、
MgSO₄・7H₂O 50、NaCl 200、
その他微量金属元素
その他微量金属元素としては、NBRC公開の指定培地No.1380に記載の上記のとおりのものを用いた。

●(結果)下表に示すとおりであった。
かかる結果から、pHコントロールを行わないことにより、3HV分率の高いPHBVが生産されることが明らかになった。

Ｉ．実施例１３〜１４ Haloferax mediterranei NBRC14739のフラスコ培養（酵母エキスについての検討）
●（材料と方法）300 mL三角フラスコに、培養液総量を50 mLにして以下の各成分を加えて72 h、37 ℃、200 rpmで振とう培養を行った。初期 pHは 7.2に合わせた。
培地中の成分(g/L)：NH₄Cl 2、KH₂PO₄ 0.0375、FeCl₃ 0.005、NaCl 194、
MgCl₂ 16、 MgSO₄ 24、CaCl₂ 1、KCl 5、NaHCO₃ 0.2、
NaBr 0.5
上記成分からなる培地に、酵母エキスと糖を所定量加えて、72 hの培養を行った。

●（結果・考察）各条件で生産したＰＨＢＶの３ＨＶ分率と重量平均分子量、多分散度、乾燥菌体重量、ＰＨＢＶ生産量を同表に示す。


酵母エキスのみを用い糖を添加しない場合であっても本発明のＰＨＢＶは製造された。

Ｊ．実施例１５＜培地の評価＞
●（材料と方法） Haloferax mediterraneiについて、表１０に示す高度好塩菌用のＮＢＲＣ指定培地+5g/Lのグルコースを用いて、300 mL三角フラスコに、培養液総量を50 mLにして培養を行った。指定培地中にグルコースが含まれている場合には、もともと含まれているグルコース以外にさらに5 g/Lのグルコースを追加した。
各指定培地の成分は、ＮＢＲＣがウェブサイトにおいて公開している培地一覧（https://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/cultures/culture-list.html）を引用して以下に示す。










●(結果)下表に示すとおりであった。
培地を変更することにより、重量平均分子量の範囲が１３０万〜５４０万であるＰＨＡを生産することが可能であった。
またＮＢＲＣNo.1380の培地では、PHA生産量が高いうえに、3HV分率、分子量が高くこれまでにないタイプのPHAを生産可能であることが明らかになった。

Ｋ．実施例１６〜２５ ＜フルフラール系化合物の評価＞
フルフラール系化合物をさらに用いた以外は実施例１〜１１と同様の方法で、初期グルコース濃度を10 g/L、フルフラール濃度、HMF（５-ヒドロキシメチルフルフラール）濃度をそれぞれ0.06g/Lから1.6g/Lまで変化させ、Haloferax mediterranei NBRC14739のフラスコ培養を行った。より具体的には以下のとおりである。
●（材料と方法）300 mL三角フラスコに、培養液総量を50 mLにして以下の各成分を加えて72 h、37 ℃、200 rpmで振とう培養を行った。初期pHは 7.2に合わせた。
培地中の成分(g/L)：NH₄Cl 2、KH₂PO₄ 0.0375、FeCl₃ 0.005、NaCl 194、
MgCl₂ 16、MgSO₄ 24、CaCl₂ 1、KCl 5、NaHCO₃ 0.2、
NaBr 0.5、酵母エキス 5
上記成分からなる培地に、炭素源として、下表に示す糖質とフルフラール系化合物を所定量入れて、72 hの培養を行った。
●（結果）各条件で生産されたＰＨＢＶの３ＨＶ分率と重量平均分子量、多分散度、乾燥菌体重量、ＰＨＢＶ生産量を下表に示す。

フルフラールの濃度及びHMF濃度を変化させることで、様々な分子量のＰＨＢＶを製造し、分子量を制御できること明らかになった。フルフラール又はHMFといったフルフラール系化合物による製造されるＰＨＢＶの分子量の制御は、グルコース以外の糖が用いられた場合においてもなされると考えられる。

Ｌ．実施例２６〜２８ ＜予備試験 ＞
●（材料と方法）300 mL三角フラスコに、培養液総量を50 mLにして以下の各成分を加えて72 h、37 ℃、200 rpmで振とう培養を行った。初期 pHは 7.2に合わせた。
培地中の成分(g/L)：NH₄Cl 2、KH₂PO₄ 0.0375、FeCl₃ 0.005、NaCl 194、
MgCl₂ 16、 MgSO₄ 24、CaCl₂ 1、KCl 5、NaHCO₃ 0.2、
NaBr 0.5、
上記成分からなる培地に、酵母エキス(g/L)と糖（グルコース 5 g/L（「Ｇ」：実施例２６）、キシロース 5 g/L（「Ｘ」：実施例２７）又はセロビオース 5 g/L（「Ｃ」：実施例２８）を加えて、72 hの培養を行った。微生物としてHaloferax mediterranei NBRC14739を用いた。

●（結果）各条件で生産されたＰＨＢＶ生産量、ＰＨＢＶの３ＨＶ分率と重量平均分子量を図１に示す。同図に示されるように、グルコース（「Ｇ」：実施例２６）、キシロース（「Ｘ」：実施例２７）又はセロビオース（「Ｃ」：実施例２８）のみを用いることにより、得られるＰＨＢＶの分子量を、少なくとも約４５０万（グルコースのみを用いた場合）〜約１１０万（キシロースのみ）の間に調節できることが明らかになった。また3ＨＶ分率も用いる糖の種類により異なり、グルコースのみを用いた場合には１２ｍｏｌ％、キシロースのみを用いた場合には２５ｍｏｌ％、セロビオースのみを用いた場合には１７ｍｏｌ％であった。

Ｍ．実施例２９〜３５及び試験例（冷延伸したフィルムの製造及び該フィルムの物性評価）
分子鎖を同じ方向に配向させると、配向方向に対して引張強度が向上することが知られている。そこで冷延伸と称される方法（例えば特許文献５に記載されている方法）で本発明のPHAの分子鎖の配向を行い本発明のPHAの引張強度の向上の度合いを調べ、従来技術との対比を行った。
各サンプルは、超高分子量PHBV( Mw= 3.07×10⁶, Mw/Mn=1.87, 3HV分率8.4 %)のキャストフィルムを、カッターで10 mm×30 mmに切り出して作製した。同サンプルについて、10倍に冷延伸したフィルムを異なる温度で熱処理(結晶化)させて３日以上放置した後のフィルムの引張強度を測定した。具体的な方法は以下のとおりであった：
（１）各サンプルについて、１７０℃又は２００℃（非特許文献９に示されている、より高融点であるＰＨＢについての結果との対比のため）の温度で３０秒間、３ＭＰａの熱プレスを行い完全に溶融させる
（２）（１）で得た溶融フィルムを氷水中で急冷し、非晶フィルムを作製
（３）そのまま氷水中で１０倍の長さまで延伸し非晶フィルムを配向させる
（４）２５℃、６０℃、８０℃、１００℃又は１２０℃の温度で２時間緊張熱処理を行い結晶化
（５）３日間以上室温で保管し、引張強度測定用の冷延伸フィルムとした。
引張強度の測定にはEZ Test EZ-LXを用いた。測定は、初期長さ30mm、引張速度は20mm/minとし、1条件につき3回の測定を実施した。なお、冷延伸前の引張強度は29.9ＭＰａであった。
なお、物性解析を行う際には、分子量表記に絶対分子量を用いることがある。例えば特許文献５及び非特許文献９においても分子量表記に絶対分子量を用いていることから、本実施例でも絶対分子量表記を用いた。
ＰＨＡの絶対分子量は、
(絶対分子量)＝(PS換算のGPC分子量)×0.7
で算出可能であることが知られているため、本実施例でもこの計算式を用いて算出した絶対分子量の値を、分子量の値として用いた。
結果は下表及び図２に示すとおりであった。

10倍に冷延伸したときの引張強度は最高で、258.7MPaに達した（実施例３２）。この引張強度は、非特許文献９に示されている公知の超高分子量ＰＨＢを10倍冷延伸した引張強度を、熱処理温度が少なくとも５０℃〜１００℃の場合において上回り（図２）、同文献及び特許文献５（非特許文献９と記載が一部共通する）に示されている超高分子量PHBから10倍冷延伸により得たフィルムの破壊強度(237MPa)(特許文献５中における実施例８)の最大値も約10%上回った。
さらに、非特許文献１０において通常分子量PHBV(Mw=1.0×10⁶)において同様の処理(10倍冷延伸)を行った場合のデータが開示されているところ、10倍延伸して75℃で2h熱処理した場合の引張強度は117MPaである。これに対し本試験においては、非特許文献１０に示されている熱処理温度である75℃近傍の温度（60℃及び80℃）で2h熱処理した場合において、253.7MPa及び245.9MPaであった。すなわち本発明のＰＨＢＶは、超高分子量であることにより、従来技術の引張強度を１００％を超える割合で増大させた。
これらの結果及び知見から、本発明の３−ヒドロキシブタン酸と３−ヒドロキシバレリル酸とがランダムに共重合した共重合体を冷延伸したフィルムは、引張強度に優れることが明らかになった。また、本願発明のＰＨＡにおいては、超高分子量であることが引張強度を向上させる効果を奏することも明らかになった。

本発明によればＰＨＡを、重量平均分子量を例えば２０万から６００万の間で制御しつつ製造することができる。したがって本発明はＰＨＡ製造業及びその関連産業の発展に寄与するところ大である。

Claims (16)

1. 重量平均分子量が３６１万より大きい、３−ヒドロキシブタン酸と３−ヒドロキシバレリル酸とがランダムに共重合した共重合体。
2. 共重合体を構成する３−ヒドロキシブタン酸のモル数と３−ヒドロキシバレリル酸のモル数の総和に対する３−ヒドロキシバレリル酸のモル数の割合（３ＨＶ分率）が５．０％〜４０．０％である請求項１に記載の共重合体。
3. 微生物を培養し、培養産物としてポリヒドロキシアルカン酸を得ることを含むポリヒドロキシアルカン酸の製造方法であって、
   前記培養における炭素源が糖を含有し、該糖を
   （ａ）グルコース及び／又はその誘導体のみ
   （ｂ）グルコース及びその誘導体ならびにキシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上、又は
   （ｃ）キシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上
   にして、
   重量平均分子量が１００万以上であるポリヒドロキシアルカン酸を得る、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
4. （ｂ）又は（ｃ）におけるキシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上がキシロース及び／又はセロビオースである請求項３に記載の製造方法。
5. 微生物が高度好塩菌である請求項３又は４に記載の製造方法。
6. 高度好塩菌がHaloferax mediterraneiである請求項５に記載の製造方法。
7. ポリヒドロキシアルカン酸の重量平均分子量が３６１万より大きい、請求項３〜６のいずれかに記載の製造方法。
8. 得られるポリヒドロキシアルカン酸の重量平均分子量が６００万以下である請求項３〜７のいずれかに記載の製造方法。
9. ポリヒドロキシアルカン酸が３−ヒドロキシブタン酸と３−ヒドロキシバレリル酸とがランダムに共重合した共重合体である請求項３〜８のいずれかに記載の製造方法。
10. 微生物を培養し、培養産物として得られるポリヒドロキシアルカン酸の分子量を制御する方法であって、
    前記培養における炭素源が糖を含有し、該糖を
    （ａ）グルコース及び／又はその誘導体のみ
    （ｂ）グルコース及びその誘導体ならびにキシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上、又は
    （ｃ）キシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上
    にして、
    製造されるポリヒドロキシアルカン酸の重量平均分子量を１００万から６００万の間で制御する、方法。
11. ポリヒドロキシアルカン酸が３−ヒドロキシブタン酸と３−ヒドロキシバレリル酸とがランダムに共重合した共重合体である請求項１０に記載の方法。
12. 微生物を培養し、培養産物としてポリヒドロキシアルカン酸を得ることを含むポリヒドロキシアルカン酸の製造方法であって、
    前記培養における炭素源が糖及びフルフラール系化合物を含有し、該糖を
    （ａ）グルコース及び／又はその誘導体のみ
    （ｂ）グルコース及びその誘導体ならびにキシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上、又は
    （ｃ）キシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上
    にして、
    ポリヒドロキシアルカン酸を得る、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
13. 微生物を培養し、培養産物として得られるポリヒドロキシアルカン酸の分子量を制御する方法であって、
    前記培養における炭素源が糖及びフルフラール系化合物を含有し、該糖を
    （ａ）グルコース及び／又はその誘導体のみ
    （ｂ）グルコース及びその誘導体ならびにキシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上、又は
    （ｃ）キシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上
    にして、
    製造されるポリヒドロキシアルカン酸の重量平均分子量を制御する、方法。
14. ３−ヒドロキシブタン酸と３−ヒドロキシバレリル酸とがランダムに共重合した、重量平均分子量が３６１万より大きい共重合体を冷延伸したフィルム。
15. 冷延伸が以下の工程を含む、請求項１４に記載のフィルム：
    （１）３−ヒドロキシブタン酸と３−ヒドロキシバレリル酸とがランダムに共重合した共重合体を溶融させて溶融フィルムを得る
    （２）（１）で得られた溶融フィルムを氷水中で急冷し、非晶フィルムを作製する
    （３）（２）で得られた非晶フィルムをそのまま氷水中で１０倍の長さまで延伸し非晶フィルムを配向させる
    （４）（３）で得られた配向後のフィルムに緊張熱処理を行い結晶化させ、冷延伸したフィルムを得る。
16. ３−ヒドロキシブタン酸と３−ヒドロキシバレリル酸とがランダムに共重合した共重合体における３ＨＶ分率が５％〜１５％である、請求項１４又は１５に記載のフィルム。