KR20040035683A - 타가토스의 제조 방법 - Google Patents

타가토스의 제조 방법 Download PDF

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KR20040035683A KR10-2004-7000641A KR20047000641A KR20040035683A KR 20040035683 A KR20040035683 A KR 20040035683A KR 20047000641 A KR20047000641 A KR 20047000641A KR 20040035683 A KR20040035683 A KR 20040035683A
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아를라 푸즈 에이엠비에이
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Abstract

락토스를 갈락토스 및 글루코스로 가수분해하고, 갈락토스를 타가토스로 이성질화시키고, 임의의 비전환 화합물을 크로마토그래피에 의해 분리하여 재순환시킴으로써 타가토스를 제조한다. 이에 의해 순수한 타가토스를 고수율로 수득한다.

Description

타가토스의 제조 방법 {Process for Manufacturing of Tagatose}
D-타가토스는 비-식원성 및 전생물적 특성을 갖는 다목적용 저칼로리 벌크 감미제이다. D-타가토스는 식품 및 기능성 식품뿐만 아니라 의약품에서 사용할 수 있다[참조: 미국 특허 제4786722호, 동 제5356879호 및 동 제5447917호].
미국 특허 제5002612호 및 동 제5078796호에 따르면, D-타가토스는 락타제를 사용하여 락토스 또는 락토스 함유 물질을 갈락토스와 글루코스의 혼합물로 가수분해하고, 임의로는 글루코스를 제거하고, 이어서 갈락토스를 타가토스로 화학적 이성질화시켜 제조하였다.
미국 특허 제6057135호에는 치즈 훼이 또는 밀크를 가수분해하여 갈락토스와 글루코스의 혼합물을 제조하여 치즈 훼이 또는 밀크로부터 D-타가토스를 제조하는 것이 기재되어 있다. 글루코스를 글루코스의 발효에 의해 갈락토스로부터 분리하고, L-아라비노스 이소머라제를 사용하는 이성질화에 적용시킨다..
발명의 요약
본 발명의 제1 국면에서는 a) 락토스 또는 락토스 함유 출발 물질을 가수분해하여 갈락토스 및 글루코스를 수득하는 단계, b) 수득된 갈락토스를 L-아라비노스 이소머라제로 이성질화시키는 단계, 및 c) 생성물 및 비전환 화합물을 크로마토그래피에 의해 분리하여 비전환 화합물을 공정으로 재순환시키는 단계를 포함하는, 타가토스의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 제2 국면에서는 단계 a) 및 b)를 단일 반응기 내에서 수행하는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 국면에서는 D-타가토스의 제조법을 제공한다.
본 발명의 추가의 국면에서는 단계 b)에서 사용되는 L-아라비노스 이소머라제가 호열성인 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 국면에서는 단계 a)에서 사용되는 락타제가 호열성인 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 국면에서는 단계(들) a) 및(또는) b)에서 사용되는 온도가 40 내지 90℃인 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 추가의 국면은 첨부된 청구의 범위에 제공한다.
본 발명은 타가토스, 특히 D-타가토스의 효소적 제조 방법에 관한 것이다.
도 1은 실시예 1의 공정을 도식적으로 도시한다.
도 2는 실시예 2의 공정을 도식적으로 도시한다.
도 3은 실시예 3의 공정을 도식적으로 도시한다.
도 4는 실시예 4의 결과를 도시한다.
본 발명에 이르러, 놀랍게도 타가토스의 효소적 제조 방법에 있어서 크로마토그래피적 분리 및 재순환을 이용하는 것이 가능하다는 것을 밝혀내었다. 이에 의해 보다 높은 수율 및 보다 청정한 공정을 달성한다. 총 수율뿐만 아니라 각 사이클에 대한 수율도 보다 높다.
상기 방법은 임의의 비전환 락토스 및 갈락토스를 재순환하여 사용하는 것이 가능하다. 또한, 생성물인 타가토스 및 임의의 부산물, 특히 글루코스를 갈락토스로부터 분리하여 글루코스를 다른 목적을 위해 사용하는 것이 가능하다.
출발 물질은 임의의 락토스 또는 락토스 함유 물질일 수 있다.
락토스는 치즈 제조에서 생성되는 부산물이다. 이러한 공정은 과량으로 생성되는 저가치 생성물인 락토스를 인간에게 유익한 특성을 갖는 고가치 생성물로 전환시키는 기회를 제공한다. 이는 락토스를 이용하기 위한 수단이다. 락토스의 활용에 대한 기회가 장기간 동안 요구되어 왔다.
본 방법은 락토스의 효소적 가수분해, 갈락토스의 타가토스로의 효소적 전환 및 임의로는 비전환 생성물의 재순환과 병행된 크로마토그래피적 분리를 포함한다.
화학물질 등의 소비율은 낮다.
부산물의 생성율은 낮다. 단지 한가지 부산물, 즉 식품용으로 사용할 수 있는 글루코스 시럽/분말로서의 글루코스가 생성된다.
락토스의 가수분해 및 갈락토스의 이성질화용 효소를 함유하는 단일 반응기 내에서 전체 반응을 수행하는 것이 가능하다. 이에 의해 단계 a) 및 단계 b)가 병합된다.
그렇게 하여 완전한 공정이 시간 단위당 수율과 관련하여 개선된다. 갈락토스는 이를 타가토스로 이성질화시키고, 따라서 그렇지 않을 경우에 락타제를 방해하여 락토스의 갈락토스 및 글루코스로의 전환의 억제를 야기할 수 있는 갈락토스의 농도를 감소시킴으로써 반응기로부터 연속적으로 제거한다. 높은 공정 온도로 인해 공정을 고농도 (Brix)에서 수행하는 것이 가능하다. 증발 능력은 유지될 것이며, 이는 또한 투자비 및 작업량과 관련하여 개선된 경제성을 발생시킬 것이다. 증가된 당 농도는 또한 보존제의 사용을 감소시킬 수 있는 효과를 가진다. 또한, 제1의 크로마토그래피적 분리는 불필요하게 될 것이며, 이는 또한 투자비 및 작업량과 관련하여 개선된 경제성을 발생시킨다.
특히 동일한 효소 반응기 내에서의 락토스의 글루코스 및 갈락토스로의 효소적 전환과 병행된 갈락토스의 타가토스로의 후속적인 이성질화가 입증되었다. 초기 시험은 티. 만트라니이 (T. mathranii) 유래의 LacS 락타제 효소 및 L-아라비노스 이소머라제가 동일한 금속 이온, 완충제 및 온도 조건하에 기능할 수 있음을 입증하였다. 다음, 800 mM 락토스 용액 (28%)을 고정화 락타제 및 고정화 이소머라제와 함께 인큐베이션함으로써 원리를 시험하였다. 샘플을 락토스, 글루코스, 갈락토스 및 타가토스의 함량에 대해 HPLC에 의해 분석하였다. 24시간 인큐베이션 동안 글루코스의 농도는 약 800 mM로 증가하였으며, 이는 모든 락토스가 분해되었음을 나타낸다. 갈락토스 및 타가토스 둘 다의 농도는 약 300 mM로 선형적으로 증가되었다. 결과적으로, 전환율은 (300/800) × 100% = 38%이었다.
추가의 효소를 동일한 반응기, 소위 콤비-반응기에 유입할 수 있다.
타가토스는 특히 D-타가토스이며, 이는 식품 업계에서 고도로 요구되고 있다.
모든 락타제를 단계 a)에서 사용할 수 있다. 예로는 바실러스 (Bacillus), 술폴로부스 (Sulfolobus), 써모안아에로박터 (Thermoanaerobacter), 써무스 (Thermus) 및 피로코쿠스 (Pyrococcus)로 이루어진 군으로부터 유래된 효소가 있다.
모든 L-아라비노스 이소머라제를 단계 b)에서 사용할 수 있다. 예로는 바실러스, 술폴로부스, 써모안아에로박터 및 써모토가 (Thermotoga)가 있다.
효소는 임의의 형태로 사용할 수 있다. 예를 들어, 고정화 효소를 사용하는 것이 가능하다.
바이오테크놀러지컬 인스티튜트 (Biotechnological Institute; 덴마크 소재)가 사용하기에 적합한 락타제 및 L-아라비노스-이소머라제를 제공할 수 있다.
바이오테크놀러지컬 인스티튜트 (덴마크 소재)는 써모안아에로박터 만트라니이 (Thermoanaerobacter mathranii), 써모안아에로박터 만트라니이 DSM 11426로부터 유래된 효소를 발견하여 시험하였다. 이들은 그들의 발명을 포함하는 미국 특허원 제09/905,108호를 출원하였다.
D-갈락토스 상에서의 티. 만트라니이 효소에 대한 Km값은 통상의 L-아라비노스 이소머라제 생산 유기체, 예를 들어, 아에로박터 아에로게네스 (Aerobacter aerogenes), 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 아르트로박터 (Arthrobacter) 종 및 락토바실러스 펜토수스 (Lactobacillus pentosus)유래의 효소에 대한 값보다 낮다. 따라서, 티. 만트라니이는 보다 우수한 친화성을 보유한다.
상기한 이들 효소는 호열성이다.
호열성 효소를 사용하는 추가의 이익은 락토스 및 글루코스의 용해도가 보다 높은 경우에 높은 공정 온도를 사용하는 가능성이다. 이는 보다 농축된 생성물을 본 발명의 효소적 방법에 사용할 수 있음을 의미한다. 이는 또한 보다 적은 물 소비량 및 보다 적은 물 증발량을 의미한다. 이는 기술적 이점 및 특히 가열 및 냉각 공정 스트림에 대한 물 및 에너지의 보다 적은 요구량을 제공할 것이다.
효열성 효소의 사용은 또한 보다 높은 온도에서 작업하는 것을 가능하게 한다. 이는 손상 미생물로의 오염에 대한 감소된 위험율로 인해 보다 우수한 위생 상태를 야기한다. 또한, 갈락토스의 타가토스로의 증가된 전환은 아라비노스의 리불로스로의 전환과 비교하여 보다 높은 온도에서 달성된다. 이에 더하여 또한 보다 용이한 유출 및 보다 신속한 여과와 같은 기술적 이점이 존재할 수 있다.
따라서, 단계 a) 및(또는) 단계 b)에 있어서 고온에서 최적의 수율을 보유하는 효소를 사용하는 것이 바람직하다. 이는 통상적으로 보다 신속한 반응을 제공할 것이다. 또한, 효소가 호열성이거나 심지어 호극성인 경우에 고온, 예를 들어, 낙농 업계에서 통상적으로 사용되는 저온살균 온도 또는 100℃를 초과하는 온도를 사용하여 시스템을 세정하는 것이 가능하다. 단계 a) 및 b)에 있어서 온도 사이에 온도 차이가 없거나 단지 경미한 차이가 존재하는 경우에, 냉각 및 가열을 위한 에너지가 감소된다. 따라서, 생산 공정은 60℃를 초과하는 온도에서 작업할 수 있다. 이는 미생물학 및 가온 및 냉각용 스트림 및 염수의 소비율과 광범위한 관련을 갖는다.
단계(들) a) 및(또는) b)에서 사용되는 온도는 40 내지 90℃이다. 통상적으로, 이는 60 내지 90℃이다. 바람직하게는, 온도는 60 내지 80℃, 보다 바람직하게는 65 내지 70℃이고, 가장 바람직한 온도는 65℃이다. 그러나, 온도는 선택된 효소에 따라 달라질 것이고, 이는 단계 a) 및 b)에서 상이할 수 있다. 상기한 바와 같이, 일부 이점은 단일 반응기 내에서 동시에 두 단계를 수행하는 것을 비롯하여 두 단계에서 동일한 온도를 사용함으로써 달성된다.
갈락토스의 타가토스로의 화학적 전환과 대조적으로, 공정은 당에 최적인 pH 값에서 작업할 수 있다. 이는 당 분해 생성물의 생성을 상당히 감소시킨다. 결과로서, 회수율 및 경제성이 개선된다. 전형적인 pH 값은 약 7.0이다. 사용하기에 적합한 pH 값 및 다른 반응 파라미터는 특히 미국 특허 제6057135호에서 찾아볼 수 있다. 문헌 [Yamanaka, K and Wood, W. A. (1966) Methods in Enzymology 9: 596-602]에는 특히 D-갈락토스로부터 케토스를 생산할 수 있는 L-아라비노스 이소머라제 효소를 제공하는 다수의 유산균이 기재되어 있다.
시럽 형태의 본 발명의 생성물은 매우 순수하여, 타가토스 시럽을 직접 사용하는 것이 가능하다. 지금까지, 생성물을 정제하는 것, 예를 들어, 불순한 시럽을 결정화시켜 이를 다시 용해시키거나 가용화시키는 것이 필요하였다.
상기한 바와 같이, D-타가토스는 락토스-함유 공급원 (예를 들어, 치즈 훼이, 카제인 훼이 또는 밀크)으로부터 제조할 수 있다. 락토스는 고정화 락타제일수 있는 락타제에 의해 동일량의 갈락토스 및 글루코스로 가수분해된다.
갈락토스는 바람직하게는 크로마토그래피에 의해 글루코스로부터 분리한다. 비가수분해된 락토스는 분리하여 효소 칼럼으로 재순환시킬 수 있다. 갈락토스는 임의로는 고정화된 L-아라비노스 이소머라제에 의해 타가토스로 이성질화시킨다. 비이성질화된 갈락토스는 크로마토그래피에 의해 분리하여 재순환시킬 수 있다. D-타가토스 함유 분획을 결정화시킨다. 결정을 모액으로부터 분리하여 건조시킨다. 타가토스가 다량인 모액을 재순환/재결정화시킬 수 있다. 또한, 인간용 또는 기타 목적용 식품에서 시럽으로서 생성된 타가토스를 직접 사용하는 것이 가능하다.
따라서, 본 발명에 이르러, 타가토스를 1개 또는 2개의 반응기 내에서 고수율 및 매우 순수한 형태로 제조하기 위해 크로마토그래피와 병행된 효과적인 효소적 방법을 발견하였다. 당해 방법은 호열성/호극성 효소를 사용하여 수행할 경우에 특별한 이점을 갖는다.
타가토스를 제조하는 신규한 방법은 비전환 생성물의 재순환과 병행된 특정한 효소적 전환으로 인해 고도로 효과적이며 순수하다. 당해 방법은 극도로 효과적이고 환경 친화적이다.
실시예 1
재순환과 병행된 락토스의 가수분해
재순환과 병행된 갈락토스의 이성질화
1. 락토스를 한외여과, 이어서 결정화에 의해 훼이로부터 제조하였다.
2. 락토스 수용액 (8-40% DS)을 고온 또는 저온에서 고정화 락타제에 의해 (아스퍼질러스 오리재 (Aspergillus oryzae) 또는 호열성 유기체 유래의 효소에 의해) 가수분해하였다.
3. 글루코스 및 갈락토스를 크로마토그래피에 의해 분리하였다. 공급물 농도에 따라, 예를 들어 증발에 의한 농축이 필요할 수 있다.
4. 락토스 및 가능한 갈락토올리고당을 고정화 효소를 함유하는 칼럼으로 재순환시켰다.
5. 재순환 루프에서 올리고당의 농도가 너무 높은 경우에 (가수분해가 바람직하지 않게 영향을 미침), 시스템을 플러싱시켰다.
6. 글루코스 및 갈락토스 함유 분획을 고정화 갈락토스 이소머라제 (호열성 유기체 유래)에 의해 이성질화시켰다.
7. 혼합물을, 예를 들어, 증발에 의해 농축시켰다.
8. 타가토스를 크로마토그래피에 의해 분리하였다.
9. 타가토스 분획을 농축시키고, 가능하게는 결정화시켰다.
10. 글루코스 분획을 시럽으로서 판매하기 위해 농축시킬 수 있거나, 이를 추가로 가공처리할 수 있다.
11. 갈락토스 분획을 이소머라제 칼럼으로 재순환시켰다.
실시예 2
재순환시키지 않으면서 락토스의 가수분해 및 후속적인 이성질화
1. 락토스를 한외여과 및 후속적인 결정화에 의해 훼이로부터 제조하였다.
2. 락토스 수용액 (8-40% DS)을 고정화 락타제 (당해 효소는 아스퍼질러스 오리재로부터 유래함)에 의해 가수분해하였다.
3. 글루코스 약 46% 및 갈락토스 46%를 함유하는 혼합물을 고정화 갈락토스 이소머라제 (호열성 유기체 유래)를 함유하는 칼럼으로 통과시켰다. 갈락토스의 약 30%가 타가토스로 전환되었다.
4. 생성물을 농축 및 크로마토그래피적 분리에 의해 3개의 분획으로 분리하였다:
· 분획 1은 주로 비전환 갈락토스를 함유하였다. 이들 분획은 갈락토스 이소머라제 칼럼으로 재순환시켰다.
· 분획 2는 주로 타가토스를 함유하였다. 이들 분획은 결정화를 위해 농축시키거나, 시럽으로서 판매하였다.
· 분획 3은 주로 글루코스를 함유하지만, 또한 락타제 효소에 의해 생성되는 갈락토올리고당뿐만 아니라 비전환 락토스도 함유하였다. 이들 분획은 시럽으로서 판매하기 위해 또는 추가의 가공처리, 예를 들어, 결정화 또는 건조를 위해 농축시켰다.
실시예 3
단일 반응기 내에서의 가수분해 및 이성질화
1. 락토스를 한외여과 및 후속적인 결정화에 의해 훼이로부터 제조하였다.
2. 락토스 수용액을 고정화 락타제 및 L-아라비노스 이소머라제 (두 효소는호열성 유기체로부터 유래함)를 함유하는 칼럼으로 통과시켰다.
3. 생성물을 농축 및 크로마토그래피적 분리에 의해 3개의 분획으로 분리하였다:
· 분획 1은 주로 비전환 갈락토스를 함유하였다. 이들 분획은 효소적 전환용 칼럼으로 재순환시켰다.
· 분획 2는 주로 타가토스를 함유하였다. 이들 분획은 결정화를 위해 농축시키거나, 시럽으로서 판매하였다.
· 분획 3은 주로 글루코스를 함유하지만, 또한 락타제 효소에 의해 생성되는 갈락토올리고당뿐만 아니라 비전환 락토스도 함유하였다. 이들 분획은 시럽으로서 판매하기 위해 또는 추가의 가공처리, 예를 들어, 결정화 또는 건조를 위해 농축시켰다.
실시예 4
고정화 락타제 및 고정화 이소머라제를 사용한 락토스의 타가토스로의 단일 반응기 전환
술폴로부스 솔파타리쿠스 (Sulfolobus solfataricus) 유래의 β-글리코시다제 코딩 유전자 [Moracci M, Ciaramella M, and Rossi M. [2001] Methods in Enzymology vol. 330, p. 201-15]를 대장균 내에서 클로닝시키고 발현시켰다. 당해 유전자를 술폴로부스, 솔파타리쿠스 균주 P2 유래의 정제된 염색체 DNA를 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 단리하였다. 후속적으로 표준 발현 플라스미드 pET3a (Novagen)으로 클로닝되는 단편 상에서 완전 코딩 서열을 수득하도록NdeI 및 BamHI에 대한 추가의 제한 부위를 함유하는 프라이머를 고안하였다.
미국 특허 제4,354,105호에 기술된 바와 같이 효소를 발현시키는 대장균 세포를 배양하고, 원심분리에 의해 수집하고, 프렌치 프레셔 셀 (French pressure cell)로 용해시키고, 글루타르알데히드 및 폴리에틸렌이민과 가교결합시켰다. 고정화 효소를 펠릿의 원심분리 및 동결건조에 의해 회수하였다. 고정화 락타제의 활성은 1500 단위/g 건조 중량이었다. 1 단위는 락토스의 30-% (w/v) 용액 중 65℃, pH 7에서 분당 글루코스 1 마이크로몰을 유리시키는 효소의 양으로서 정의하였다.
써모안아에로박터 만트라니이 유래의 L-아라비노스 이소머라제 유전자를 미국 특허원 제09/905,108호 (바이오테크놀러지컬, 덴마크 소재)에 기술된 바와 같이 대장균 내에서 클로닝시키고 발현시켰다.
미국 특허 제4,354,105호에 기술된 바와 같이 효소를 발현시키는 대장균 세포를 배양하고, 원심분리에 의해 수집하고, 프렌치 프레셔 셀로 용해시키고, 글루타르알데히드 및 폴리에틸렌이민과 가교결합시켰다. 고정화 효소를 펠릿의 원심분리 및 동결건조에 의해 회수하였다. 고정화 L-아라비노스 이소머라제의 활성은 50 단위/g 건조 중량이었다. 1 단위는 D-갈락토스의 30-% (w/v) 용액 중 65℃, pH 7에서 분당 D-타가토스 1 마이크로몰을 유리시키는 효소의 양으로서 정의하였다.
고정화 락타제 20 mg, 고정화 이소머라제 80 mg, 락토스 (30%, 875 mM) 0.30 g, 25 mM K-말레에이트 완충제, pH 6.9, 및 5 mM MnCl2를 함유하는 1밀리리터 분석혼합물을 65℃에서 인큐베이션하였다. 효소의 부재하에 대조 샘플을 유사하게 처리하였다. 주기적으로, 샘플을 취하여, Aminex HPX-87C 칼럼 (Bio-Rad) 및 굴절률 검출기 (Waters 410)를 사용하는 고압 액체 크로마토그래피에 의해 글루코스, 갈락토스 및 타가토스의 농도를 측정하였다. 이동상은 탈이온화 탈기수이며, 칼럼 온도는 85℃이고, 유속은 0.6 ml/분이었다.
도 4에 도시된 바와 같이, 글루코스 농도는 24시간에 걸쳐 약 800 mM로 증가하였으며, 이는 거의 모든 락토스가 갈락토스 및 글루코스로 가수분해되었음을 나타낸다. 타가토스의 농도는 24시간에 걸쳐 약 300 mM로 선형적으로 증가하였으며, 이는 생물전환율이 300 mM/800 mM = 38%임을 나타낸다.
에스. 솔파타리쿠스 유래의 고정화 lacS 락타제 및 티. 만트라니이 유래의 araA 이소머라제를 사용한 락토스의 타가토스로의 전환
인큐베이션시간(시간) 락토스(mM) 글루코스 (mM) 갈락토스 (mM) 타가토스(mM)
0 816 0 0 0
2 176 57 30
4 281 87 48
6 366 116 72
8 430 139 98
24 811 316 295

Claims (18)

  1. a) 락토스 또는 락토스 함유 출발 물질을 가수분해하여 갈락토스 및 글루코스를 수득하는 단계,
    b) 수득된 갈락토스를 L-아라비노스 이소머라제로 이성질화시키는 단계, 및
    c) 생성물 및 비전환 화합물을 크로마토그래피에 의해 분리하여 비전환 화합물을 공정으로 재순환시키는 단계를 포함하는,
    타가토스의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 비전환 락토스를 크로마토그래피에 의해 분리하여 가수분해를 위한 단계 a)로 재순환시키는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 비전환 갈락토스를 크로마토그래피에 의해 분리하여 이성질화를 위한 단계 b)로 재순환시키는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 a) 및 단계 b)를 단일 반응기 내에서 수행하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 갈락토스가 D-갈락토스이고, 타가토스가 D-타가토스인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 b)에서 사용되는 L-아라비노스 이소머라제가 호열성인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 a)에서 사용되는 락타제가 호열성인 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 b)에서 사용되는 L-아라비노스 이소머라제가 비제한적으로 바실러스 (Bacillus), 술폴로부스 (Sulfolobus), 써모안아에로박터 (Thermoanaerobacter) 및 써모토가 (Thermotoga)로 이루어진 군으로부터 유래된 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, L-아라비노스 이소머라제가 써모안아에로박터 만트라니이 (Thermoanaerobacter mathranii)로부터 유래된 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, L-아라비노스 이소머라제가 써모안아에로박터 만트라니이 DSM 11426으로부터 유래된 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 a)에서 사용되는 락타제가 비제한적으로 바실러스, 술폴로부스, 써모안아에로박터, 써무스 (Thermus) 및피로코쿠스 (Pyrococcus)로 이루어진 군으로부터 유래된 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 1종 이상의 사용되는 효소가 고정화된 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계(들) a) 및(또는) b)에서 사용되는 온도가 40 내지 90℃인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 온도가 60 내지 90℃인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 온도가 60 내지 80℃인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 온도가 65 내지 70℃인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 온도가 65℃인 방법.
  18. 제4항에 있어서, 사용되는 L-아라비노스 이소머라제가 써모안아에로박터 만트라니이로부터 유래되고, 사용되는 락타제가 술폴로부스 솔파타리쿠스 (Sulfolobus solfataricus)로부터 유래된 것인 방법.
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