TWI826439B - 纖維寡糖的製造方法 - Google Patents

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Abstract

本發明主要在纖維寡糖的酶合成中抑制高聚合度的纖維寡糖的生成，即提供一種纖維寡糖的製造方法，包含以下工序：使α-葡萄糖-1-磷酸和選自葡萄糖、纖維二糖和烷基化葡萄糖中至少一種引物在含有水和水溶性有機溶劑的混合溶劑中與纖維糊精磷酸化酶反應。

Description

纖維寡糖的製造方法
本發明涉及使用了酶的纖維寡糖的製造方法。
作為使用了酶的纖維素低聚物、即纖維寡糖的製造方法，已知利用過磷酸分解酶即纖維糊精磷酸化酶的逆反應的合成法。
例如，非專利文獻1記載了通過使α-葡萄糖-1-磷酸和作為引物的葡萄糖與纖維糊精磷酸化酶反應，合成平均聚合度為9的纖維寡糖。
另外，專利文獻1記載了使α-葡聚糖磷酸化酶作用於可溶性澱粉而生成葡萄糖-1-磷酸，使得到的葡萄糖-1-磷酸在葡萄糖的存在下與纖維二糖磷酸化酶和纖維糊精磷酸化酶反應，從而合成聚合度為2~6的纖維寡糖。
(註：現有技術文獻：專利文獻1--日本特開2001-112496號公報；非專利文獻1--Masao Hiraishi以外另有5名，”Synthesis of Highly Ordered Cellulose II in vitro using Cellodextrin Phosphsrylase”,Carbohydrate Research,Vol.344,(2009)pp.2468-2473。)
通常，酶在水溶液中催化生物化學反應，在有機溶劑的存在下容易變性.失活而喪失其催化功能，因此對於使用纖維糊精磷酸化酶的纖維寡糖的酶合成，以往也是使用水作為反應溶劑，在緩衝液中進行反應。
但是，在使用水作為反應溶劑的情況下，可知纖維寡糖的聚合度的分佈廣，生成相對於平均聚合度具有相當大的聚合度的纖維寡糖。抑制這類高聚合度的纖維寡糖的生成而減小聚合度的分佈從纖維寡糖的性能提高的觀點出發 有時是優選的。
本發明的實施方式是鑒於以上問題點，其目的在於提供在纖維寡糖的酶合成中可抑制高聚合度的纖維寡糖的生成的方法。
本發明的實施方式涉及的纖維寡糖的製造方法包括以下工序：使α-葡萄糖-1-磷酸和選自葡萄糖、纖維二糖和烷基化葡萄糖中的至少一種引物在含有水和水溶性有機溶劑的混合溶劑中與纖維糊精磷酸化酶反應。
如果為本發明的實施方式，則在使用纖維糊精磷酸化酶的纖維寡糖的酶合成中，通過使用添加有水溶性有機溶劑的混合溶劑作為反應溶劑，可抑制高聚合度的纖維寡糖的生成，且可合成聚合度的分佈小的纖維寡糖。
圖1是表示向葡萄糖引物合成系統添加有機溶劑的試驗中的酶反應後的溶液狀態的照片。
圖2是表示向纖維二糖引物合成系統添加有機溶劑的試驗中的酶反應後的溶液狀態的照片。
圖3是表示向葡萄糖引物合成系統添加有機溶劑的試驗中的沉澱產物的MS譜的圖。
圖4是表示向纖維二糖引物合成系統添加有機溶劑的試驗中的沉澱產物的MS譜的圖。
圖5是表示纖維二糖引物合成系統的、2種清洗溶劑各自的、沉澱產物和上清液中的產物的MS譜的圖。
圖6是表示纖維二糖引物合成系統的、沉澱產物和上清液中的產物的MS譜的圖。
圖7是表示向乙基葡萄糖苷引物合成系統添加有機溶劑的試驗中的沉澱產物的MS譜的圖。
圖8是表示向辛基葡萄糖苷引物合成系統添加有機溶劑的試驗中的沉澱產物的MS譜的圖。
本實施方式涉及的纖維寡糖的製造方法是使α-葡萄糖-1-磷酸(以下，有時稱為αG1P)和選自葡萄糖、纖維二糖和烷基化葡萄糖至少一種引物在含有水和水溶性有機溶劑的混合溶劑中與纖維糊精磷酸化酶(以下，有時稱為CDP)反應。
該反應為利用CDP的逆反應的合成法，將αG1P作為葡萄糖供體，將選自葡萄糖、纖維二糖和烷基化葡萄糖中的至少一種作為引物(即，葡萄糖受體)，通過使它們與CDP反應，從而以αG1P為單體對引物逐次進行聚合。
例如，引物為葡萄糖時的反應如以下所示。
Figure 108114017-A0305-02-0005-1
另外，引物為纖維二糖時的反應如以下所示。
Figure 108114017-A0305-02-0005-2
另外，引物為烷基化葡萄糖時的反應如以下所示。
Figure 108114017-A0305-02-0006-3
上述反應式中，n為整數，表示纖維寡糖的聚合度。另外，R表示烷基。
作為烷基化葡萄糖的烷基，例如，可舉出碳原子數1~12的烷基。因此，上述反應式中的烷基R的碳原子數優選為1~12。具體而言，可舉出乙基葡萄糖苷、辛基葡萄糖苷、癸基葡萄糖苷、十二烷基葡萄糖苷等。
關於CDP，已知嗜熱纖維梭菌(Clostridium thermocellum)、纖維單胞菌(Cellulomonas)屬等微生物產生，可利用這些微生物通過公知的方法取得。例如，CDP按照M.Krishnareddy等，J.Appl.Glycosci.,2002年，49,1-8記載的方法，可通過大腸桿菌表達系統製備來自嗜熱纖維梭菌YM4的CDP。
應予說明，CDP的酶量，例如可通過以下方式求出，將αG1P和纖維二糖以及CDP孵育，將由CDP生成的磷酸定量，將每1分鐘使1μmol的磷酸游離的酶量作為1U。
本實施方式的特徵在於，在使用上述CDP的纖維寡糖的酶合成中，作為反應溶劑，使用含有水和水溶性有機溶劑的混合溶劑。混合溶劑為將水和水溶性有機溶劑混合而成的溶劑，通常可將作為水溶液的緩衝液與水溶性有機溶劑混合而得到。
水溶性有機溶劑為在20℃相對於水100mL的溶解度為5mL以上的有機溶劑，例如，可舉出甲醇、乙醇、1-丙醇、異丙醇、叔丁醇等碳原子數1~4的醇類；丙酮等酮類；四氫呋喃等醚類；N,N-二甲基甲醯胺、N,N-二甲基乙 醯胺、N-甲基吡咯烷酮等醯胺類；乙腈等腈類；二甲基亞碸等亞碸類等。這些有機溶劑可以使用任意一種，也可以將2種以上組合使用。作為水溶性有機溶劑，更優選使用選自甲醇(MeOH)、乙醇(EtOH)、N,N-二甲基甲醯胺(DMF)和二甲基亞碸(DMSO)中的至少一種。
作為與水溶性有機溶劑混合的緩衝液，沒有特別限定，可舉出HEPES緩衝液、tris鹽酸緩衝液、MOPS緩衝液、乙酸緩衝液、磷酸緩衝液等，優選使用在反應溫度能夠將反應溶劑的pH維持在5~9左右的緩衝液。
水和水溶性有機溶劑的使用比例，沒有特別限定，將混合溶劑設為100體積%，水溶性有機溶劑優選為5~50體積%，更優選為5~40體積%，進一步優選為5~30體積%，可以為10~25體積%，也可以為10~20體積%。
關於反應條件沒有特別限定，優選為如以下所示的條件。αG1P的濃度優選為10~1000mM，更優選為100~300mM。引物(葡萄糖、纖維二糖、烷基化葡萄糖)的濃度優選為10~200mM，更優選為30~70mM。CDP的濃度優選為0.01~1.5U/mL，更優選為0.05~0.5U/mL。另外，作為緩衝液的濃度(例如，HEPES緩衝液中的HEPES的濃度)，優選為100~1000mM，更優選為250~750mM。作为反應溫度，可以为10~80℃，也可以為20~70℃。另外，作為反應時間，可以為1小時~15天，也可以為1天~10天。
反應結束後，可得到含有纖維寡糖的反應液。由於該反應液含有作為酶的CDP、引物等，因此為了將其除去可以進行清洗。清洗可通過重複以下工序進行：利用離心將沉澱物和上清液分離，使用清洗溶劑使沉澱物再分散。由此可得到纖維寡糖。作為清洗溶劑，可以使用與反應溶劑同樣的含有水和水溶性有機溶劑的混合溶劑，或者也可以使用水。纖維寡糖作為上述沉澱物(沉澱產物)的形式得到，但也包含於上清液中，因此，也可通過回收上清液中的產物得到纖維寡糖。
得到的纖維寡糖為具有葡萄糖通過β-1,4糖苷鍵連接而成的結構的低聚糖。纖維寡糖的聚合度(即，上述式中的n)，例如可以為4以上，可以為5以上，可以為6以上，另外，例如可以為15以下，可以為13以下，可以為11 以下。平均聚合度(DP)沒有特別限定，例如可以為5.5以上，可以為6.0以上，可以為6.3以上，另外，例如可以為9.0以下，可以為8.5以下，可以為8.3以下。
通過本實施方式得到的纖維寡糖，如使用葡萄糖、纖維二糖作為引物進行合成的情形所示可以為沒有烷基化的纖維寡糖，或者，如使用烷基化葡萄糖作為引物進行合成的情形所示也可以為烷基化的纖維寡糖。即，本實施方式涉及的纖維寡糖也包含烷基化纖維寡糖這樣的纖維寡糖的衍生物。當然也包含鈉離子附加物、鉀離子附加物等鹼金屬離子附加物。應予說明，使用烷基化葡萄糖作為引物進行合成後，通過利用公知的方法將烷基水解，可以製造沒有烷基化的纖維寡糖。
如果為本實施方式，則在使用CDP的纖維寡糖的酶合成中，通過使用水和水溶性有機溶劑的混合溶劑作為反應溶劑，抑制高聚合度的纖維寡糖的生成，可選擇性地得到聚合度相對低的纖維寡糖。
作為引物，與葡萄糖相比使用纖維二糖時的產物的聚合度選擇性更高，可進一步使聚合度的分佈變得狹窄。其理由不是有意限定於此，但認為是因為纖維二糖的情形下酶之間的到反應開始為止的時間變得更加均勻。
本實施方式涉及的纖維寡糖的用途沒有特別限定，例如可用於醫藥品領域等公知的各種用途。
實施例
以下，通過實施例進一步說明，但本發明不限定於這些實施例。
1.實驗方法
1-1.試劑
LB-BROTH LENNOX和LB-AGAR LENNOX由Funakoshi購入。甘油、卡那黴素硫酸鹽、異丙基-β-D(-)-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)、二硫蘇糖醇(DTT)、1-丁醇、αG1P二鈉．n水合物、40%氘氧化鈉重水溶液從和光純藥購入。
D-(+)-纖維二糖從Nacalai Tesque購入。鎳-次氮基三乙酸(Ni-NTA)琼脂糖凝膠從QIA GEN購入。Protein Molecular Weight Marker(Broad)從Takara Bio購入。
丙烯醯胺、N,N’-亞甲基雙丙烯醯胺、十二烷基硫酸鈉(SDS)、過硫酸銨(APS)、重水、2,5-二烴基苯甲酸(DHBA)、ProteoMassTM Bradykinin fragment 1-7 MALDI-MS Standard(Bradykinin)、ProteoMassTM P14R MALDI-MS Standard(P14R)、ProteoMassTM ACTH Fragment 18-39 MALDI-MS Standard(ACTH)、三氟乙酸(TFA)、乙腈從Sigma-Aldrich購入。
其它試劑只要沒有特別說明均從Nacalai Tesque購入，使用特級以上的試劑。
超純水使用利用Milli-Q System(Milli-Q Advantage A-10,Merck Millipore)精製烴的水。純水使用利用TANK 60 Lite PE(Merck Millipore)精製的水。
1-2.纖維糊精磷酸化酶(CDP)的製備和酶活性評價
CDP通過與M.Krishnareddy等，J.Appl.Glycosci.,2002年，49,1-8紀載的方法同樣的方法製備。詳細內容如以下所示。
1-2-1.試劑的製備
(1)滅菌精製水
採取超純水500mL至500mL廣口試劑瓶進行高壓滅菌(121℃、20分鐘、BS-245、TOMY)在室溫保存。
(2)50mg/mL卡那黴素儲備溶液
使卡那黴素硫酸鹽1.5g溶解於滅菌精製水，定容為30mL。在超淨工作臺內利用聚偏二氟乙烯(PVDF)製0.22μm篩檢程式將製備的溶液過濾滅菌，每個1.7mL管中分注1mL在-20℃保存。
(3)10mM IPTG儲備溶液
使IPTG71.5mg溶解於滅菌精製水，定容為30mL。在超淨工作臺 內利用PVDF製0.22μm篩檢程式將製備的溶液過濾滅菌。每個1.7mL管中分注1mL在-20℃保存。
(4)LB-AGAR/卡那黴素板
採取LB-AGAR LENNOX2.8g至250Ml廣口試劑瓶，添加超純水80mL使其溶解並進行高壓滅菌。在室溫冷卻至60℃以下後，在超淨工作臺內添加50mg/mL卡那黴素儲備溶液80μL並混合。分注於已滅菌的培養皿在室溫使其固化後，在4℃保存。製備後在1個月以內使用。
(5)50%甘油溶液
將甘油50mL、超純水50mL添加至250mL廣口試劑瓶並混合後，進行高壓滅菌在室溫保存。
(6)LB培養基
在500mL廣口試劑瓶中使LB-BROTH LENNOX10g溶解於純水500mL，進行高壓滅菌在室溫保存。
(7)MOPS-Na緩衝液(20mM、pH7.5)
使3-嗎啉代丙磺酸(MOPS)4.18g溶解於約600mL的超純水。利用4N氫氧化鈉水溶液調整為pH7.5後，定容為1L。利用PVDF製0.10μm篩檢程式過濾滅菌在4℃保存。
(8)70%乙醇(生物技術級)
採取乙醇(生物技術級)140mL和超純水60mL至250mL廣口試劑瓶並混合後，在室溫保存。
(9)清洗緩衝液(20mM MOPS、300mM NaCl、10mM咪唑、pH7.5)
使MOPS2.09g、氯化钠8.77g、咪唑340mg溶解於約350mL的超純水。利用4N氫氧化鈉水溶液調整為pH7.5後，定容為500mL。利用PVDF製0.10μm篩檢程式過濾滅菌在4℃保存。
(10)洗脫緩衝液(20mM MOPS、300mM NaCl、250mM咪唑、pH7.5)
使MOPS2.09g、氯化钠8.77g、咪唑8.51g溶解於約350mL的超純水。利用4N氫氧化鈉水溶液調整為pH7.5後，定容為500mL。利用PVDF製0.10μm篩檢程式過濾滅菌在4℃保存。
(11)5%(w/v)疊氮化鈉儲備溶液
利用塑膠製刮勺稱量疊氮化鈉500mg，添加MOPS-Na緩衝液(20mM、pH7.5)以總量成為10mL的方式使其溶解，在4℃遮光保存。
(12)30%丙烯醯胺/雙混合溶液
在約70mL的超純水中邊攪拌邊使丙烯醯胺29.2g、N,N’-亞甲基雙丙烯醯胺0.8g溶解。以總量成為100mL的方式定容，在4℃遮光保存。
(13)Tris-HCl緩衝液(1.5M、pH8.8)
在約80mL的超純水中邊攪拌邊使三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)18.17g溶解。利用6N鹽酸調整為pH8.8後，以總量成為100mL的方式定容，在4℃保存。
(14)Tris-HCl緩衝液(0.5M、pH6.8)
在約80mL的超純水中邊攪拌邊使Tris6.06g溶解。利用6N鹽酸調整為pH6.8後，以總量成為100mL的方式定容，在4℃保存。
(15)10%SDS水溶液
在約90mL的超純水中邊攪拌邊使十二烷基硫酸鈉(SDS)10g溶解。以總量成為100mL的方式定容，在室溫保存。
(16)10%APS水溶液
使過硫酸銨(APS)0.1g溶解於約1mL的超純水，在4℃保存。
(17)飽和1-丁醇
使1-丁醇和超純水以2：1的比例混合，在室溫保存。
(18)5×電泳緩衝液(125mM Tris、960mM甘氨酸、0.5%SDS)
以總量成為1L的方式使Tris15.1g、甘氨酸72.1g、SDS5.0g溶解於超純水，在4℃保存。使用時利用超純水稀釋至5倍。回收一次使用的電泳緩衝液再次使用，使用次數最大為2次。
(19)5×Loading緩衝液(200mM Tris、0.05%溴酚藍、10%SDS、50%甘油)
向Tris2.42g、SDS10.0g、溴酚藍50mg添加50mL的甘油和約40mL的超純水使其溶解。使用6N鹽酸調整為pH6.8後，定容為100mL。每個1.7mL管中分注1mL在4℃保存。
(20)1M DTT溶液
以成為1M的方式向二硫蘇糖醇(DTT)約150mg添加約1mL的超純水使其溶解，在-20℃保存。
(21)固定液
將乙酸50mL、乙醇200mL混合後，利用超純水定容為500mL，在室溫保存。
(22)脫色液
將乙酸40mL、乙醇125mL混合後，利用超純水定容為500mL，在室溫保存。
(23)染色液
將考馬斯亮藍R-250 0.25g添加至脫色液100mL，攪拌使其溶解，在室溫遮光保存。
1-2-2.大腸桿菌的培養和CDP的表達
(1)E.coli BL21-CDP甘油儲備的製備
使用以氣體燃燒器加熱滅菌並放冷的鉑接種環，從具有包含來自嗜熱纖維梭菌YM4的CDP基因的質粒的Escherichia coli BL21-Gold(DE3)株 (E.coli BL21-CDP)的甘油儲備植菌於LB-AGAR/卡那黴素板，在37℃培養8~12小時。向預先乾熱滅菌的試管中添加50mg/mL卡那黴素儲備溶液5μL和LB培養基5mL的混合溶液後，使用加熱的鉑接種環由單菌落進行植菌。使用振盪培養機(BR-23FP、TAITEC)在37℃進行振盪培養(往復，200rpm)直至OD660達到0.6~0.8。然後，採取培養液800μL至1.7mL管，添加50%甘油溶液100μL並混合。利用液氮冷凍在-80℃保存。
(2)E.coli BL21-CDP主機板的製備
使用以氣體燃燒器進行加熱滅菌並放冷的鉑接種環，由E.coli BL21-CDP的甘油儲備或者製作後1個月以內的主機板對LB-AGAR/卡那黴素板進行植菌，在37℃培養8~12小時。由主機板進行植菌時，直接在4℃保存。由甘油儲備進行植菌時，進一步對LB-AGAR/卡那黴素板進行植菌在37℃培養8~12小時在4℃保存。
(3)E.coli BL21-CDP前培養液的製備
採取LB培養基3mL至乾熱滅菌的試管，添加50mg/mL卡那黴素儲備溶液3μL。加熱滅菌，使用放冷的鉑接種環，由E.coli BL21-CDP主機板的單菌落進行植菌。使用振盪培養機在37℃振盪培養(轉數，200rpm)10~12小時。
(4)E.coli BL21-CDP的培養和CDP的表達
向2个1L帶有折流管的燒瓶分别稱量LB-BROTH LENNOX6g後，添加純水300mL進行高壓滅菌並放冷。分別添加50mg/mL卡那黴素儲備溶液300μL並混合後，添加E.coli BL21-CDP前培養液300μL。使用振盪培養機在30℃進行振盪培養(轉數，600rpm)確認OD660達到0.55~0.60後，分別添加10mM IPTG儲備溶液3mL在25℃振盪培養(轉數，200rpm)20小時使CDP表達。
1-2-3.His Tag精製和緩衝液置換
(1)通過E.coli BL21-CDP的破碎提取CDP
將1-2-2項(4)製備的表達CDP的E.coli BL21-CDP混懸液均等地分注於12根50mL管，每根約50mL，使用離心機(離心機：EX-126、TOMY、轉子：3850-04P，TOMY)進行離心(3500rpm，20分鐘，4℃)。通過傾析除去上清液，向沉澱的E.coli BL21-CDP顆粒添加MOPS-Na緩衝液(20mM，pH7.5)分別定容為約15mL，利用手激烈地振盪使其混懸。將E.coli BL21-CDP混懸液分注於4根100mL自立式管，每根約45mL，邊進行冰浴邊使用探針式超聲波照射器(Sonifier 250、BRANSON)進行超聲波照射將E.coli BL21-CDP破碎。超聲波照射在power：200W(刻度盤10)、duty cycle：30%的條件下進行2個迴圈(將重複4次5秒鐘超聲波照射和25秒鐘間隔作為1個迴圈)。為了防止E.coli BL21-CDP破碎液中的蛋白酶等引起的CDP分解，在以下E.coli破碎液常常進行冰浴。將4根100mL管中的E.coli BL21-CDP破碎液分別轉移至50mL管進行離心(3500rpm，>20分鐘，4℃)。然後，通過傾析將上清液回收至50mL管。
(2)利用Ni-NTA親和柱精製CDP
向預先利用70%乙醇滅菌、利用超純水置換的直徑1.8cm、長度10cm的塑料製柱填充Ni-NTA琼脂糖凝膠(GE Healthcare)分散液9.8mL。通過利用70%乙醇充滿柱內並使其流動將NI-NTA瓊脂糖凝膠殺菌．清洗。重複2次該操作。供給MOPS-Na緩衝液(20mM，pH7.5)3mL使其流動，進一步供給3mL。利用刮勺攪拌使Ni-NTA瓊脂糖凝膠再分散將氣泡除去。然後，利用MOPS-Na緩衝液(20mM，pH7.5)5mL置換4次。
將E.coli BL21-CDP破碎液的上清液供給至柱，回收由柱流出的溶液作為流通溶液。供給清洗緩衝液3~5mL進行置換，進一步供給3~5mL。通過移液使Ni-NTA瓊脂糖凝膠再分散而使凝膠層的表面變得均勻後，使供給的清洗緩衝液流動。進一步重複供給清洗緩衝液5mL而進行置換的操作，合計供給30mL以上。供給清洗緩衝液時通過的溶液全部回收，作為清洗液。然後，供給洗脫緩衝液3~5mL，每個1.7mL管分別回收1mL餾分，作為洗脫液。重複該操作，合計供給洗脫緩衝液25mL。利用微量紫外可見分光光度計(NanoDrop 2000c、Thermo Scientific)測定各個餾分的吸光度，以280nm的吸光度為指標確認蛋白質的洗脫。此時，背景測定使用超純水。蛋白質的洗脫沒有完成時，向柱 供給洗脫緩衝液直至280nm的吸收消失。回收的洗脫液中，回收吸光度高的餾分，作為CDP溶液。
(3)CDP溶液的緩衝液置換
CDP溶液的緩衝液置換使用PD10柱(Sephadex G-25、GE Healthcare)，按照附帶的說明書進行。根據CDP溶液的容量，使用必要數量的PD10柱。使用附帶的連接器將PD10柱固定於50mL管。利用70%乙醇充滿，使用離心機(MX-305、TOMY)進行離心(1000g，2分鐘，4℃)。通過重複2次該操作將柱進行殺菌和清洗。利用MOPS-Na緩衝液(20mM，pH7.5)將5%(w/v)疊氮化鈉儲備溶液稀釋250倍，利用由此製備的0.02%疊氮化鈉/20mM MOPS-Na緩衝液充滿，通過重複4次靜置使溶液流動的操作從而利用緩衝液將PD10柱置換。進一步添加0.02%疊氮化鈉/20mM MOPS-Na緩衝液，進行離心。
將PD10柱轉移至新的50mL管，以不破壞離心所致的Sephadex的斜面的方式向每一根PD10柱供给1.75~2.5mL CDP溶液。以與上述離心時相同的角度固定於離心機，進行離心。回收洗脫的溶液作為CDP儲備溶液，利用NanoDrop 2000c測定CDP儲備溶液的280nm的吸光度，每個1.7mL管分注1mL在4℃保存。
每根柱添加30mL的MOPS-Na緩衝液(20mM、pH7.5)靜置將柱清洗。接著重複2次利用超純水充滿、進行離心的操作。同樣利用50體積%乙醇水溶液清洗2次。利用50體積%乙醇水溶液充满PD-10柱在4℃保存。
1-2-4.利用聚丙烯醯胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)確認CDP的精製
(1)10%丙烯醯胺凝膠的製備
將30%丙烯醯胺/雙混合溶液3.33mL、Tris-HCl緩衝液(1.5M、pH8.8)2.5mL、超純水4.01mL添加至50mL管，邊進行超聲波照射邊利用吸氣器抽吸脫氣。添加10%SDS水溶液100μL、10%APS水溶液50μL、TEMED10μL，以不起泡的方式進行移液並混合。將混合的溶液3.5mL添加至2枚玻璃板的間隙(0.75mm)，安靜地重疊飽和1-丁醇900μL，在室溫靜置1小時而聚合。使用 微量吸管將飽和1-丁醇除去，接著利用超純水清洗，作為分離凝膠。
將30%丙烯醯胺/雙混合溶液0.44mL、Tris-HCl緩衝液(0.5M、pH6.8)0.44mL、超純水2.03mL添加至50mL管，邊進行超聲波照射邊利用吸氣器抽吸脫氣。添加10%SDS水溶液33μL、10%APS水溶液16.7μL、TEMED1.65μL，以不起泡的方式進行移液並混合。將溶液充分添加至分離凝膠上，以空氣不進入10孔梳的方式邊注意邊設定，在室溫靜置1小時進行聚合。生成的凝膠每個玻璃板利用充分濕潤的無塵紙(Kimwipes)夾持，進一步利用棉卷包住在4℃保存。
(2)基於電泳的評價
在1.7mL管中添加Protein Molecular Weight Marker(Broad)5μL、1M DTT溶液2μL、5×Loading緩衝液20μL、滅菌精製水173μL並混合，將其作為標記物，在-20℃保存。將CDP儲備溶液和CDP的精製中回收的流通液、清洗液各自1μL與5×Loading緩衝液2μL、1M DTT1μL、超純水6μL混合。將它們和在室溫解凍的標記物10μL在105℃進行熱處理，利用桌式小型離心機(R5-AQBD02、Recenttec)進行快速離心。將本項(1)製備的聚丙烯醯胺凝膠安裝於電泳用容器(Mini-PROTEAN Tetra Cell、BIO RAD)，注入利用超純水稀釋5倍的5×電泳緩衝液500mL，除去梳子。向每個孔裝入電泳樣品，使用電泳裝置(Mini-PROTEAN Tetra System、BIO RAD)在電壓150V進行電泳約40分鐘。在條帶到達距凝膠的下端約1cm的上方時停止電泳，將凝膠由玻璃板取出，浸漬於固定液，遮光利用振動器(Wave-PR、TAITECH)振盪30分鐘。除去固定液。添加染色液浸漬凝膠，遮光振盪60分鐘。回收染色液，添加脫色液浸漬凝膠，遮光振盪30分鐘。重複除去脫色液重新添加脫色液進行振盪的操作直至可確切地看見標記物所含有的蛋白質的條帶。利用超純水清洗凝膠，通過Gel Doc EZ Imager(BIO RAD)拍照並利用附帶的軟體進行解析。
1-2-5.CDP的酶活性測定
使用超純水以成為300mM的方式使D-(+)-纖維二糖溶解，作為纖維二糖儲備溶液。CDP的活性按照以下方式測定。將含有αG1P50mM、 D-(+)-纖維二糖50mM、和稀釋規定倍率的CDP的3-嗎啉代丙磺酸緩衝液(50mM、pH7.5)在37℃孵育。將由CDP生成的磷酸定量，求出每1分鐘使1μmol的磷酸游離的酶量定義為1U時的U/mL，作為酶活性。CDP的稀釋率，以反應時間為100分鐘時的αG1P的轉化率為10%以下的方式確定。
1-3.纖維寡糖的酶合成
1-3-1.利用CDP的纖維寡糖的酶合成(引物：葡萄糖)
使2-〔4-(2-羥乙基)-1-呱嗪基〕乙磺酸(HEPES)23.8g溶解於約60mL的超純水。利用4N氫氧化鈉水溶液調整為pH7.5後，定容為100mL，利用PVDF製0.22μm篩檢程式過濾滅菌。將其作為HEPES緩衝液(1M、pH7.5)，在4℃保存。
稱量規定量的D-(+)-葡萄糖和αG1P二鈉．n水合物，分別以成為1M的方式溶解於超純水，得到1M葡萄糖儲備溶液和1MαG1P水溶液。
將HEPES緩衝液、1MαG1P水溶液、1M葡萄糖儲備溶液以反應時的濃度分別變為500mM、200mM、50mM的方式添加至4mL管，添加規定量的甲醇(MeOH)、乙醇(EtOH)、N,N-二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基亞碸(DMSO)作為水溶性有機溶劑，考慮到使用的CDP儲備溶液的量，利用超純水定容。邊進行超聲波照射邊利用吸氣器抽吸脫氣。以終濃度變為0.2U/mL的方式適量添加CDP儲備溶液，以不產生氣泡的方式通過移液進行混合。分取規定量至1.7mL管或者1mL MIGHTY VIALS，在60℃孵育3天。
關於作為反應溶劑的混合溶劑，將含有10體積%的MeOH的HEPES緩衝液(500mM、pH7.5)記為10%MeOH(即，混合溶劑中含有10體積%的MeOH)。關於其他混合溶劑也同樣進行表述。應予說明，作為對照，不添加水溶性有機溶劑，除此之外同樣進行將孵育得到的產物記為“(-)”。
1-3-2.利用CDP的纖維寡糖的酶合成(引物：纖維二糖)
代替1M葡萄糖儲備溶液使用300mM纖維二糖儲備溶液，除此之外與1-3-1項同樣進行纖維寡糖的酶合成反應。
1-3-3.利用CDP的纖維寡糖的酶合成(引物：烷基化葡萄糖)
代替1M葡萄糖儲備溶液，使用300mM乙基葡萄糖苷儲備溶液或300mM辛基葡萄糖苷儲備溶液，除此之外與1-3-1項同樣進行纖維寡糖的酶合成反應。300mM乙基葡萄糖苷儲備溶液和300mM辛基葡萄糖苷儲備溶液通過以下方式製備，即，稱量規定量的乙基β-D-葡萄糖苷(Carbosynth Limited)和正辛基β-葡萄糖苷(Dojindo Laboratories)，以分別成為300mM的方式溶解於超純水。
1-3-4.酶合成的纖維寡糖的精製
為了將1-3-1~3項中製備的產物用於各種分析，使用超純水或超純水和有機溶劑的混合溶劑作為清洗溶劑進行精製。詳細而言，添加清洗溶劑通過基於移液的水流將產物進行機械破壞使其分散，進行離心(15000rpm、10分鐘以上、4℃)，除去上清液。重複5次添加清洗溶劑稀釋10倍使沉澱物再分散、進行離心的操作，精製直至溶液的置換率為99.999%以上。利用100℃的加熱塊將精製的分散液加熱10分鐘，使殘存的CDP失活。應予說明，關於對照(-)，使用超純水作為清洗溶劑進行精製。
產物的收量通過將精製後的水分散液絕乾而算出。預先在105℃乾燥24小時，在乾燥器內稱量放冷的樣品管，添加精製後的水分散液在105℃乾燥24小時，然後在乾燥器內放冷稱量。由乾燥前後的重量的差算出產物的濃度。該操作同時進行3次，通過它們的平均值算出產物的收量。
使用基於基質輔助鐳射解吸電離飛行時間型品質分析(MALDI-TOF-MS)法的測定時，利用超純水將精製後的分散液稀釋來使用。
1-4.酶合成的纖維寡糖的特性評價
1-4-1.產物的翻轉倒置試驗
對於使用1mL MIGHTY VIALS製備的樣品，通過翻轉倒置試驗評價凝膠化。將小瓶上下翻轉靜置，在產物不流動的情況下判斷形成凝膠狀的結構體。
1-4-2.產物的化學結構的評價
(1)產物的收量測定
利用1-3-4項所示的方法，通過絕乾算出收量。
(2)產物的MALDI-TOF-MS測定
用於質荷比的校正的標準樣品按照以下方式製備，即，將Bradykin fragment 1-7水溶液(10nmol/mL Bradykinin fragment1-7、0.05質量%三氟乙酸(TFA)、50質量%乙腈)、P14R水溶液(10nmol/mL P14R、0.1質量%TFA)、ACTH fragment18-39水溶液(10nmol/mLACTH fragment18-39、0.1質量%TFA)各自5μL、10mg/mL DHBA水溶液5μL、1.0質量%TFA水溶液1μL、乙腈4μL在1.7mL管中混合。
產物的測定樣品按照以下方式製備，即，將0.1%(w/v)的產物的水分散液1μL、10mg/mL DHBA水溶液1μL、三氟乙酸(0.2體積%)的乙腈溶液3μL在利用氫氧化鉀(3.3品質%)的甲醇溶液清洗的MIGHTY VIALS中混合。
將標準樣品和產物的測定樣品各自1μL裝配於樣品板，重複5次風乾的操作。真空乾燥1小時以上，利用MALDI-TOF-MS(AXIMA-performance、島津製作所)測定。測定條件為Mode：Liner(positive)、Mass Range：1.0-3000.0、Max Leaser Rap Rate：10、power：100、profiles：100、shots：2、Ion Gate(Da)：Blank500、Pulsed Extraction optimized at(Da)：1000.0。
由測定得到的MS譜在Smoothing method：Gaussian、Smoothing filter width：19、Baseline filter width：1000的條件下進行處理。
將鈉離子附加物和鉀離子附加物的峰面積進行合計，算出各聚合度的峰面積。由算出的各聚合度的峰面積的比例算出聚合度的平均值，作為平均聚合度。聚合度的分佈，通過按照以下數學式解析MALDI-TOF-MS譜，利用基於平均聚合度的標準差進行評價。
Figure 108114017-A0305-02-0019-4
2.結果和討論
2-1.酶反應後的溶液狀態
將葡萄糖或者纖維二糖應用於利用CDP的酶合成系統。使用αG1P作為單體，使用葡萄糖或者纖維二糖作為引物，在含有規定濃度的水溶性有機溶劑的HEPES緩衝液(500mM、pH7.5)中，在60℃孵育3天。其結果，使用任意的水溶性有機溶劑的情形下反應後的溶液整體均白濁，因此提示在相同條件下引物被CDP識別，進行酶合成得到纖維寡糖(參照圖1(葡萄糖引物合成系統)和圖2(纖維二糖引物合成系統))。此外，葡萄糖引物中使用10%EtOH、20%DMSO作為反應溶劑的情形、以及、纖維二糖引物中任意的反應溶劑的情形，即使反轉容器溶液也不會流落，生成凝膠狀的結構物。
2-2.酶合成的纖維寡糖的聚合度及其分佈的評價
2-2-1.對於葡萄糖引物合成系統的有機溶劑的添加效果
對於使用葡萄糖引物在各種混合溶劑中進行酶合成而得到的產物，分別使用含有與反應溶劑相同比例的有機溶劑的水作為清洗溶劑進行精製後，利用MALDI-TOF-MS譜測定沉澱產物。得到的MS譜如圖3所示，均顯示m/z的間隔與葡萄糖單元(162Da)對應的多個峰，此外檢測的峰分別與聚合度為6~16聚體左右的纖維素低聚物的鈉離子附加物或者鉀離子附加物一致。因此，表明可以酶合成具有規定聚合度分佈的纖維寡糖。使用含有水溶性有機溶劑的混合溶劑的的情況下，與在不含有水溶性有機溶劑的HEPES緩衝液中進行酶合成的對照(-)相比，平均聚合度DP為同等或略低。另外，標準偏差小，聚合度的分布狭窄。另外，由圖3可知，使用混合溶劑的情況下，可抑制聚合度n為14~16的高聚合度的低聚物的生成。
下述表1示出由圖3的MS譜數據算出10%MeOH、20%DMSO和對照(-)的各聚合度的比例的結果。由表1可知，使用混合溶劑的情況下，與對照(-)相比，可抑制聚合度高的低聚物的生成。應予說明，表1中沒有示出聚合度15和16的比例，這是因為它們的比例不足1%。另外，表1中的“0%”是指檢測限以下。
Figure 108114017-A0305-02-0021-5
2-2-2.對於纖維二糖引物合成系統的有機溶劑的添加效果
對於使用纖維二糖引物在各種混合溶劑中進行酶合成而得到的產物，分別使用含有與反應溶劑相同比例的有機溶劑的水作為清洗溶劑進行精製後，利用MALDI-TOF-MS譜測定沉澱產物。得到的MS譜如圖4所示，均顯示m/z的間隔與葡萄糖單元對應的多個峰，此外檢測的峰分別與聚合度為4~10聚體左右的纖維素低聚物的鈉離子附加物或者鉀離子附加物一致。因此，表明可以酶合成具有規定聚合度分佈的纖維寡糖。另外，由與2-2-1項中的結果的對比可知，使用纖維二糖作為引物的情形，與使用葡萄糖作為引物的情形相比，聚合度低，其分佈也狹窄，聚合度選擇性更高。
使用含有水溶性有機溶劑的混合溶劑的情形，與在不含有水溶性有機溶劑的HEPES緩衝液中進行酶合成的對照(-)相比，平均聚合度DP略低。另一方面，關於標準差，即使在對照(-)中也為很小的值，因此沒有發現顯著的不同。但是，由圖4的MS譜可知，使用混合溶劑的情形下，聚合度n為8~10的高聚合度的低聚物的生成相對於對照(-)被抑制。
下述表2示出由圖4的MS譜數據算出10%MeOH、15%DMF、20%DMSO和對照(-)的各聚合度的比例的結果。由表2可知，使用混合溶劑的情形，與對照(-)相比，聚合度高的(聚合度=8~9)低聚物的生成被抑制，特別是15%DMF和20%DMSO中其效果高。應予說明，表2中的“0%”是指檢測限以下。
使用通過絕乾算出的沉澱產物的收量和由MALDI-TOF-MS譜測定算出的平均聚合度DP，算出單體即αG1P的轉化率。結果如表2所示， 10%MeOH、15%DMF、20%DMSO、和對照(-)的αG1P轉化率分別約為65%、50%、60%、55%。
Figure 108114017-A0305-02-0022-6
2-2-3.清洗溶劑的影響和沉澱產物與上清液中的產物的不同的確認
對於與2-2-2項同樣地使用纖維二糖引物在20%DMSO中進行酶合成而得到的產物，使用水或者20%DMSO作為清洗溶劑重複5次離心．再分散，進行精製。分別利用MALDI-TOF-MS譜測定混合了該精製時的3~5次離心後的上清液的上清液中的產物和5次離心後的沉澱產物。
結果如圖5所示，對於MS譜、平均聚合度DP和標準差基本沒有發現清洗溶劑引起的不同。因此，可知2-2-2項的MS譜等的不同不是清洗溶劑引起的，而是反應溶劑的不同引起的。
2-2-4.上清液中的產物的確認
對於與2-2-2項同樣地使用纖維二糖引物在20%DMSO或30%DMSO中進行酶合成而得到的產物，分別使用含有與反應溶劑相同比例的DMSO的水作為清洗溶劑重複5次離心．再分散，進行精製。分別利用MALDI-TOF-MS譜測定20%DMSO的反應中混合了該精製時的3~5次離心後的上清液的上清液中的產物以及5次離心後的沉澱產物，30%DMSO的反應中混合該精製時的1次離心後上清液並通過Millipore公司生產ZipTip進行脫鹽所得到的上清液中的產物以及5次離心後的沉澱產物。
結果如圖6所示，將30%DMSO作為反應溶劑的情形，與20%DMSO的情形同樣，可抑制聚合度n為8~10的高聚合度的低聚物的生成。應予說明，認為圖6的符號Z表示的峰為來自ZipTip的雜質。
2-2-5.對於乙基葡萄糖苷引物合成系統的有機溶劑的添加效果
對於使用乙基葡萄糖苷引物、使用20%DMSO作為反應溶劑進行酶合成而得到的沉澱產物，通過使用含有與反應溶劑相同比例的DMSO的水作為清洗溶劑重複5次離心．再分散操作從而進行精製後，利用MALDI-TOF-MS譜測定沉澱產物。得到的MS譜如圖7所示，顯示m/z的間隔與葡萄糖單元對應的多個峰，此外檢測的峰與聚合度為6~9聚體左右的乙基化纖維素低聚物的鈉離子附加物或者鉀離子附加物一致。因此，可知可酶合成具有規定聚合度分佈的纖維寡糖。另外，使用20%DMSO作為反應溶劑的情形，與HEPES緩衝液中進行酶合成的對照(-)相比，平均聚合度DP低，聚合度的分佈也狹窄，可抑制聚合度n為9~11的高聚合度的低聚物的生成。
下述表3示出由圖7的MS譜資料算出各聚合度的比例的結果。由表3可知，使用混合溶劑的情形，與對照(-)相比，可抑制聚合度高的低聚物的生成。應予說明，表3中的“0%”是指檢測限以下。
Figure 108114017-A0305-02-0023-8
2-2-6.對於辛基葡萄糖苷引物合成系統的有機溶劑的添加效果
對於使用辛基葡萄糖苷引物、使用20%DMSO作為反應溶劑進行酶合成而得到的沉澱產物，通過使用含有與反應溶劑相同比例的DMSO的水作為清洗溶劑重複5次離心．再分散操作從而進行精製後，利用MALDI-TOF-MS譜測定沉澱產物。得到的MS譜如圖8所示，顯示m/z的間隔與葡萄糖單元對 應的多個峰，此外檢測的峰與聚合度為5~7聚體左右的辛基化纖維素低聚物的鈉離子附加物或者鉀離子附加物一致。因此，可知可酶合成具有規定聚合度分佈的纖維寡糖。另外，使用20%DMSO作為反應溶劑的情形，與HEPES緩衝液中進行酶合成的對照(-)相比，平均聚合度DP低，聚合度的分佈也狹窄，可抑制聚合度n為7~9的高聚合度的低聚物的生成。
下述表4示出由圖8的MS譜資料算出各聚合度的比例的結果。由表4可知，使用混合溶劑的情形，與對照(-)相比，可抑制聚合度高的低聚物的生成。應予說明，表4中的“0%”是指檢測限以下。
Figure 108114017-A0305-02-0024-9
以上，說明了本發明的幾個實施方式，但是這些實施方式是作為例子而提出的，並非有意限定發明的範圍。這些實施方式能夠以其他各種形態實施，在不脫離發明的主旨的範圍內，可進行各種省略、置換、變更。這些實施方式、其省略、置換、變更等包含於發明的範圍、主旨，同樣地，包含於專利請求的範圍所記載的發明及其等同的範圍。

Claims (2)

  1. 一種纖維寡糖的製造方法，包括以下工序：使α-葡萄糖-1-磷酸和選自葡萄糖(glucose)、纖維二糖(cellobiose)和烷基化葡萄糖(alkylated glucose)中的至少一種引物(primer)在含有水和水溶性有機溶劑的混合溶劑中與纖維糊精磷酸化酶反應，所述水溶性有機溶劑為在20℃相對於水100mL的溶解度為5mL以上的有機溶劑。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的纖維寡糖的製造方法，其中，所述水溶性有機溶劑為選自甲醇、乙醇、N,N-二甲基甲醯胺和二甲基亞碸中的至少一種。
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