CN112074607A - 纤维寡糖的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明主要在纤维寡糖的酶合成中抑制高聚合度的纤维寡糖的生成。提供一种纤维寡糖的制造方法，包含以下工序：使α‑葡萄糖‑1‑磷酸和选自由葡萄糖、纤维二糖和烷基化葡萄糖组成的组中至少一种引物，在含有水和水溶性有机溶剂的混合溶剂中，与纤维糊精磷酸化酶反应。

Description

纤维寡糖的制造方法
技术领域
本发明涉及使用了酶的纤维寡糖的制造方法。
背景技术
作为使用了酶的纤维素低聚物、即纤维寡糖的制造方法，已知利用了过磷酸分解酶即纤维糊精磷酸化酶的逆反应的合成法。
例如，非专利文献1记载了通过使α-葡萄糖-1-磷酸和作为引物的葡萄糖与纤维糊精磷酸化酶反应，从而合成平均聚合度为9的纤维寡糖。
另外，专利文献1记载了使α-葡聚糖磷酸化酶作用于可溶性淀粉而生成葡萄糖-1-磷酸，使得到的葡萄糖-1-磷酸在葡萄糖的存在下与纤维二糖磷酸化酶和纤维糊精磷酸化酶反应，从而合成聚合度为2～6的纤维寡糖。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2001-112496号公报
非专利文献
非专利文献1：Masao Hiraishi、另有5名，“Synthesis of Highly OrderedCellulose II in vitro usingCellodextrin Phosphsrylase”,Carbohydrate Research,Vol.344,(2009)pp.2468-2473。)
发明内容
发明欲解决的技术问题
通常，酶在水溶液中对生物化学反应进行催化，在有机溶剂的存在下容易改性/失活而丧失其催化功能，因此对于使用纤维糊精磷酸化酶的纤维寡糖的酶合成，以往也是使用水作为反应溶剂在缓冲液中进行反应。
但是，在使用水作为反应溶剂的情况下，可知纤维寡糖的聚合度的分布广，生成具有相对于平均聚合度而言相当大的聚合度的纤维寡糖。从提高纤维寡糖的性能的观点出发，有时优选抑制这类高聚合度的纤维寡糖的生成以减小聚合度的分布。
本发明的实施方式是鉴于上述问题而完成，其目的在于提供在纤维寡糖的酶合成中能够抑制高聚合度的纤维寡糖的生成的方法。
用于解决问题的技术手段
本发明的实施方式涉及的纤维寡糖的制造方法包括以下工序：使α-葡萄糖-1-磷酸和选自由葡萄糖、纤维二糖和烷基化葡萄糖组成的组中的至少一种引物，在含有水和水溶性有机溶剂的混合溶剂中，与纤维糊精磷酸化酶反应。
发明效果
如果为本发明的实施方式，则在使用纤维糊精磷酸化酶的纤维寡糖的酶合成中，通过使用添加有水溶性有机溶剂的混合溶剂作为反应溶剂，从而能够抑制高聚合度的纤维寡糖的生成，并且能够合成聚合度的分布小的纤维寡糖。
附图说明
图1是表示向葡萄糖引物合成系统添加有机溶剂的试验中的酶反应后的溶液状态的照片。
图2是表示向纤维二糖引物合成系统添加有机溶剂的试验中的酶反应后的溶液状态的照片。
图3是表示向葡萄糖引物合成系统添加有机溶剂的试验中的沉淀生成物的MS谱的图。
图4是表示向纤维二糖引物合成系统添加有机溶剂的试验中的沉淀生成物的MS谱的图。
图5是表示纤维二糖引物合成系统中的、针对2种清洗溶剂各自的、沉淀生成物和上清液中的生成物的MS谱的图。
图6是表示纤维二糖引物合成系统的、沉淀生成物和上清液中的生成物的MS谱的图。
图7是表示向乙基葡萄糖苷引物合成系统添加有机溶剂的试验中的沉淀生成物的MS谱的图。
图8是表示向辛基葡萄糖苷引物合成系统添加有机溶剂的试验中的沉淀生成物的MS谱的图。
具体实施方式
本实施方式涉及的纤维寡糖的制造方法是：使α-葡萄糖-1-磷酸(以下，有时称为αG1P)和选自由葡萄糖、纤维二糖和烷基化葡萄糖组成在组中的至少一种引物，在含有水和水溶性有机溶剂的混合溶剂中，与纤维糊精磷酸化酶(以下，有时称为CDP)反应。
该反应为利用了CDP的逆反应的合成法，通过将αG1P作为葡萄糖供体，将选自由葡萄糖、纤维二糖和烷基化葡萄糖组成的组中的至少一种作为引物(即，葡萄糖受体)，并使它们与CDP反应，从而相对于引物以αG1P为单体逐次进行聚合。
例如，引物为葡萄糖时的反应如以下所示。
[化1]
Figure BDA0002756797510000041
另外，引物为纤维二糖时的反应如以下所示。
[化2]
Figure BDA0002756797510000042
另外，引物为烷基化葡萄糖时的反应如以下所示。
[化3]
Figure BDA0002756797510000051
上述反应式中，n为整数，表示纤维寡糖的聚合度。另外，R表示烷基。
作为烷基化葡萄糖中的烷基，例如，可举出碳原子数1～12的烷基。因此，上述反应式中的烷基R的碳原子数优选为1～12。具体而言，可举出乙基葡萄糖苷、辛基葡萄糖苷、癸基葡萄糖苷、十二烷基葡萄糖苷等。
关于CDP，已知嗜热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)、纤维菌(Cellulomonas)属等微生物产生，可利用这些微生物通过公知的方法取得。例如，CDP按照M.Krishnareddy等，J.Appl.Glycosci.,2002年,49,1-8记载的方法，可通过大肠杆菌表达系统制备来源于嗜热纤维梭菌YM4的CDP。
需要说明的是，CDP的酶量例如可通过以下方式求出，将αG1P和纤维二糖以及CDP孵育，对由CDP生成的磷酸进行定量，将每1分钟使1μmol磷酸游离的酶量作为1U而求出。
本实施方式的特征在于，在使用了上述CDP的纤维寡糖的酶合成中，使用含有水和水溶性有机溶剂的混合溶剂作为反应溶剂。混合溶剂是将水和水溶性有机溶剂混合而成的溶剂，通常可将作为水溶液的缓冲液与水溶性有机溶剂混合而得到。
水溶性有机溶剂为在20℃相对于水100mL的溶解度为5mL以上的有机溶剂，例如，可举出：甲醇、乙醇、1-丙醇、异丙醇、叔丁醇等碳原子数1～4的醇类；丙酮等酮类；四氢呋喃等醚类；N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等酰胺类；乙腈等腈类；二甲基亚砜等亚砜类等。这些有机溶剂可以使用任意一种，也可以将2种以上组合使用。作为水溶性有机溶剂，更优选使用选自由甲醇(MeOH)、乙醇(EtOH)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜(DMSO)组成的组中的至少一种。
作为与水溶性有机溶剂混合的缓冲液，没有特别限定，可举出HEPES缓冲液、tris盐酸缓冲液、MOPS缓冲液、乙酸缓冲液、磷酸缓冲液等，优选使用在反应温度能够将反应溶剂的pH维持在5～9左右的缓冲液。
水和水溶性有机溶剂的使用比例没有特别限定，将混合溶剂设为100体积％，水溶性有机溶剂优选为5～50体积％，更优选为5～40体积％，进一步优选为5～30体积％，可以为10～25体积％，也可以为10～20体积％。
关于反应条件没有特别限定，优选为如以下所示的条件。αG1P的浓度优选为10～1000mM，更优选为100～300mM。引物(葡萄糖、纤维二糖、烷基化葡萄糖)的浓度优选为10～200mM，更优选为30～70mM。CDP的浓度优选为0.01～1.5U/mL，更优选为0.05～0.5U/mL。另外，作为缓冲液的浓度(例如，HEPES缓冲液中的HEPES的浓度)，优选为100～1000mM，更优选为250～750mM。作为反应温度，可以为10～80℃，也可以为20～70℃。另外，作为反应时间，可以为1小时～15天，也可以为1天～10天。
反应结束后，可得到含有纤维寡糖的反应液。由于该反应液含有作为酶的CDP、引物等，因此为了将其除去可以进行清洗。清洗可通过重复以下工序进行：利用离心将沉淀物和上清液分离，使用清洗溶剂使沉淀物再分散。由此可得到纤维寡糖。作为清洗溶剂，可以使用与反应溶剂同样的含有水和水溶性有机溶剂的混合溶剂，或者也可以使用水。纤维寡糖以上述沉淀物(沉淀生成物)的形式得到，但也包含于上清液中，因此，也可通过回收上清液中的生成物来得到纤维寡糖。
得到的纤维寡糖为具有将葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接而成的结构的低聚糖。纤维寡糖的聚合度(即，上述式中的n)例如可以为4以上，可以为5以上，可以为6以上，另外，例如可以为15以下，可以为13以下，可以为11以下。平均聚合度(DP)没有特别限定，例如可以为5.5以上，可以为6.0以上，可以为6.3以上，另外，例如可以为9.0以下，可以为8.5以下，可以为8.3以下。
通过本实施方式得到的纤维寡糖也可以是如使用葡萄糖、纤维二糖作为引物进行合成的情况所示那样未烷基化的纤维寡糖，或者也可以是如使用烷基化葡萄糖作为引物进行合成的情况所示那样已烷基化的纤维寡糖。即，本实施方式涉及的纤维寡糖也包含烷基化纤维寡糖这样的纤维寡糖的衍生物。当然也包含钠离子加成物、钾离子加成物等碱金属离子加成物。需要说明的是，使用烷基化葡萄糖作为引物进行合成后，利用公知的方法将烷基水解，从而可以制造未烷基化的纤维寡糖。
如果为本实施方式，则在使用了CDP的纤维寡糖的酶合成中，通过使用水和水溶性有机溶剂的混合溶剂作为反应溶剂，能够抑制高聚合度的纤维寡糖的生成，可选择性地得到聚合度相对低的纤维寡糖。
作为引物，与葡萄糖相比，使用纤维二糖时，生成物的聚合度选择性更高，能够使聚合度的分布更窄。其理由不是有意限定于此，但认为是因为纤维二糖的情况下，酶之间的到反应开始为止的时间变得更均匀。
本实施方式涉及的纤维寡糖的用途没有特别限定，例如可用于医药品领域等公知的各种用途。
实施例
以下，通过实施例进一步说明，但本发明不限定于这些实施例。
1.实验方法
1-1.试剂
LB-BROTH LENNOX和LB-AGAR LENNOX由Funakoshi购入。甘油、卡那霉素硫酸盐、异丙基-β-D(-)-硫代半乳糖苷(IPTG)、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)、二硫苏糖醇(DTT)、1-丁醇、αG1P二钠·n水合物、40％氘氧化钠重水溶液从和光纯药购入。
D-(+)-纤维二糖从Nacalai Tesque购入。镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)琼脂糖凝胶从QIAGEN购入。Protein Molecular Weight Marker(Broad)从Takara Bio购入。
丙烯酰胺、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠(SDS)、过硫酸铵(APS)、重水、2,5-二羟基苯甲酸(DHBA)、ProteoMassTM Bradykinin fragment 1-7MALDI-MSStandard(Bradykinin)、ProteoMassTM P14R MALDI-MS Standard(P14R)、ProteoMassTMACTH Fragment 18-39MALDI-MS Standard(ACTH)、三氟乙酸(TFA)、乙腈从Sigma-Aldrich购入。
其它试剂只要没有特别说明，则均从Nacalai Tesque购入，使用特级以上的试剂。
超纯水使用利用Milli-Q System(Milli-Q Advantage A-10,Merck Millipore)精制后的水。纯水使用利用TANK 60Lite PE(Merck Millipore)精制后的水。
1-2.纤维糊精磷酸化酶(CDP)的制备和酶活性评价
CDP通过与M.Krishnareddy等、J.Appl.Glycosci.,2002年,49,1-8记载的方法同样的方法制备。详细内容如以下所示。
1-2-1.试剂的制备
(1)灭菌精制水
采集超纯水500mL至500mL广口试剂瓶进行高压灭菌(121℃、20分钟、BS-245、TOMY)在室温保存。
(2)50mg/mL卡那霉素储备溶液
使卡那霉素硫酸盐1.5g溶解于灭菌精制水，定容为30mL。在超净工作台内利用聚偏二氟乙烯(PVDF)制0.22μm过滤器将制备的溶液过滤灭菌，向每个1.7mL管中分注1mL在-20℃保存。
(3)10mM IPTG储备溶液
使IPTG 71.5mg溶解于灭菌精制水，定容为30mL。在超净工作台内利用PVDF制0.22μm过滤器将制备的溶液过滤灭菌。每个1.7mL管中分注1mL在-20℃保存。
(4)LB-AGAR/卡那霉素板
采集LB-AGAR LENNOX 2.8g至250Ml广口试剂瓶，添加超纯水80mL使其溶解并进行高压灭菌。在室温冷却至60℃以下后，在超净工作台内添加50mg/mL卡那霉素储备溶液80μL并混合。分注于已灭菌的培养皿在室温使其固化后，在4℃保存。制备后在1个月以内使用。
(5)50％甘油溶液
将甘油50mL、超纯水50mL添加至250mL广口试剂瓶并混合后，进行高压灭菌在室温保存。
(6)LB培养基
在500mL广口试剂瓶中使LB-BROTH LENNOX 10g溶解于纯水500mL，进行高压灭菌在室温保存。
(7)MOPS-Na缓冲液(20mM、pH7.5)
使3-吗啉代丙磺酸(MOPS)4.18g溶解于约600mL的超纯水。利用4N氢氧化钠水溶液调整为pH7.5后，定容为1L。利用PVDF制0.10μm过滤器过滤灭菌在4℃保存。
(8)70％乙醇(生物技术级)
采集乙醇(生物技术级)140mL和超纯水60mL至250mL广口试剂瓶并混合后，在室温保存。
(9)清洗缓冲液(20mM MOPS、300mM NaCl、10mM咪唑、pH7.5)
使MOPS 2.09g、氯化钠8.77g、咪唑340mg溶解于约350mL的超纯水。利用4N氢氧化钠水溶液调整为pH7.5后，定容为500mL。利用PVDF制0.10μm过滤器过滤灭菌在4℃保存。
(10)溶出缓冲液(20mM MOPS、300mM NaCl、250mM咪唑、pH7.5)
使MOPS 2.09g、氯化钠8.77g、咪唑8.51g溶解于约350mL的超纯水。利用4N氢氧化钠水溶液调整为pH7.5后，定容为500mL。利用PVDF制0.10μm过滤器过滤灭菌在4℃保存。
(11)5％(w/v)叠氮化钠储备溶液
利用塑料制刮勺称量叠氮化钠500mg，添加MOPS-Na缓冲液(20mM、pH7.5)以总量为10mL的方式使其溶解，在4℃遮光保存。
(12)30％丙烯酰胺/双混合溶液
在约70mL的超纯水中边搅拌边使丙烯酰胺29.2g、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺0.8g溶解。以总量为100mL的方式定容，在4℃遮光保存。
(13)Tris-HCl缓冲液(1.5M、pH8.8)
在约80mL的超纯水中边搅拌边使三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)18.17g溶解。利用6N盐酸调整为pH8.8后，以总量为100mL的方式定容，在4℃保存。
(14)Tris-HCl缓冲液(0.5M、pH6.8)
在约80mL的超纯水中边搅拌边使Tris 6.06g溶解。利用6N盐酸调整为pH6.8后，以总量为100mL的方式定容，在4℃保存。
(15)10％SDS水溶液
在约90mL的超纯水中边搅拌边使十二烷基硫酸钠(SDS)10g溶解。以总量为100mL的方式定容，在室温保存。
(16)10％APS水溶液
使过硫酸铵(APS)0.1g溶解于约1mL的超纯水，在4℃保存。
(17)饱和1-丁醇
使1-丁醇和超纯水以2:1的比例混合，在室温保存。
(18)5×电泳缓冲液(125mM Tris、960mM甘氨酸、0.5％SDS)
以总量为1L的方式使Tris 15.1g、甘氨酸72.1g、SDS 5.0g溶解于超纯水，在4℃保存。使用时利用超纯水稀释至5倍。回收一次使用后的电泳缓冲液再次使用，使用次数最大为2次。
(19)5×Loading缓冲液(200mM Tris、0.05％溴酚蓝、10％SDS、50％甘油)
向Tris 2.42g、SDS 10.0g、溴酚蓝50mg添加50mL的甘油和约40mL的超纯水使其溶解。使用6N盐酸调整为pH6.8后，定容为100mL。每个1.7mL管中分注1mL在4℃保存。
(20)1M DTT溶液
以成为1M的方式向二硫苏糖醇(DTT)约150mg添加约1mL的超纯水使其溶解，在-20℃保存。
(21)固定液
将乙酸50mL、乙醇200mL混合后，利用超纯水定容为500mL，在室温保存。
(22)脱色液
将乙酸40mL、乙醇125mL混合后，利用超纯水定容为500mL，在室温保存。
(23)染色液
将考马斯亮蓝R-250 0.25g添加至脱色液100mL，搅拌使其溶解，在室温遮光保存。
1-2-2.大肠杆菌的培养和CDP的表达
(1)E.coli BL21-CDP甘油储备的制备
使用以气体燃烧器加热灭菌并放冷的铂接种环，从具有含来源于嗜热纤维梭菌YM4的CDP基因的质粒的Escherichia coli BL21-Gold(DE3)株(E.coli BL21-CDP)的甘油储备，植菌于LB-AGAR/卡那霉素板，在37℃培养8～12小时。向预先干热灭菌的试管中添加50mg/mL卡那霉素储备溶液5μL和LB培养基5mL的混合溶液后，使用加热的铂接种环由单菌落进行植菌。使用振荡培养机(BR-23FP、TAITEC)在37℃进行振荡培养(往复，200rpm)直至OD660达到0.6～0.8。然后，将培养液800μL采集到1.7mL管中，添加50％甘油溶液100μL并混合。利用液氮冷冻在-80℃保存。
(2)E.coli BL21-CDP母板的制备
使用以气体燃烧器进行加热灭菌并放冷的铂接种环，由E.coli BL21-CDP的甘油储备或者制作后1个月以内的母板对LB-AGAR/卡那霉素板进行植菌，在37℃培养8～12小时。由母板进行植菌时，直接在4℃保存。由甘油储备进行植菌时，进一步对LB-AGAR/卡那霉素板进行植菌在37℃培养8～12小时在4℃保存。
(3)E.coli BL21-CDP前培养液的制备
采集LB培养基3mL至已干热灭菌的试管中，添加50mg/mL卡那霉素储备溶液3μL。加热灭菌，使用放冷的铂接种环，由E.coli BL21-CDP母板的单菌落进行植菌。使用振荡培养机在37℃振荡培养(往复，200rpm)10～12小时。
(4)E.coli BL21-CDP的培养和CDP的表达
向2个1L带有折流管的烧瓶分别称量LB-BROTH LENNOX 6g后，添加纯水300mL进行高压灭菌并放冷。分别添加50mg/mL卡那霉素储备溶液300μL并混合后，添加E.coli BL21-CDP前培养液300μL。使用振荡培养机在30℃进行振荡培养(旋转，600rpm)确认OD660达到0.55～0.60后，分别添加10mM IPTG储备溶液3mL在25℃振荡培养(旋转，200rpm)20小时使CDP表达。
1-2-3.His Tag精制和缓冲液置换
(1)基于E.coli BL21-CDP的破碎提取CDP
将1-2-2项(4)制备的表达CDP而成的E.coli BL21-CDP混悬液均等地分注于12根50mL管，每根约50mL，使用离心机(离心机：EX-126、TOMY、转子：3850-04P，TOMY)进行离心(3500rpm，20分钟，4℃)。通过倾析除去上清液，向沉淀的E.coli BL21-CDP颗粒添加MOPS-Na缓冲液(20mM，pH7.5)分别定容为约15mL，用手激烈地振荡使其混悬。将E.coli BL21-CDP混悬液分注于4根100mL自立式管，每根约45mL，边进行冰浴边使用探针式超声波照射器(Sonifier 250、BRANSON)进行超声波照射将E.coli BL21-CDP破碎。超声波照射在power：200W(刻度盘10)、duty cycle：30％的条件下进行2个循环(将重复4次5秒钟超声波照射和25秒钟间隔作为1个循环)。为了防止E.coli BL21-CDP破碎液中的蛋白酶等引起的CDP分解，在以下E.coli破碎液通常进行冰浴。将4根100mL管中的E.coli BL21-CDP破碎液分别转移至50mL管进行离心(3500rpm，＞20分钟，4℃)。然后，通过倾析将上清液回收至50mL管。
(2)基于Ni-NTA亲和柱的CDP精制
向预先利用70％乙醇灭菌、利用超纯水置换后的直径1.8cm、长度10cm的塑料制柱填充Ni-NTA琼脂糖凝胶(GE Healthcare)分散液9.8mL。通过利用70％乙醇充满柱内并使其流动将NI-NTA琼脂糖凝胶杀菌并清洗。重复2次该操作。供给MOPS-Na缓冲液(20mM，pH7.5)3mL使其流动，进一步供给3mL。利用刮勺搅拌使Ni-NTA琼脂糖凝胶再分散将气泡除去。然后，利用MOPS-Na缓冲液(20mM，pH7.5)5mL置换4次。
将E.coli BL21-CDP破碎液的上清液供给至柱，回收由柱流出的溶液作为流通溶液。供给清洗缓冲液3～5mL进行置换，进一步供给3～5mL。通过移液使Ni-NTA琼脂糖凝胶再分散而使凝胶层的表面变得均匀后，使供给的清洗缓冲液流动。进一步重复供给清洗缓冲液5mL而进行置换的操作，合计供给30mL以上。供给清洗缓冲液时通过的溶液全部回收，作为清洗液。然后，供给溶出缓冲液3～5mL，每个1.7mL管分别回收1mL馏分，作为溶出液。重复该操作，合计供给溶出缓冲液25mL。利用微量紫外可见分光光度计(NanoDrop 2000c、Thermo Scientific)测定各个馏分的吸光度，以280nm的吸光度为指标确认蛋白质的溶出。此时，背景测定使用超纯水。蛋白质的溶出没有完成时，向柱供给溶出缓冲液直至280nm的吸收消失。回收的溶出液中，将吸光度高的馏分回收，作为CDP溶液。
(3)CDP溶液的缓冲液置换
CDP溶液的缓冲液置换使用PD10柱(Sephadex G-25、GE Healthcare)，按照附带的说明书进行。根据CDP溶液的容量，使用必要数量的PD10柱。使用附带的连接器将PD10柱固定于50mL管。利用70％乙醇充满，使用离心机(MX-305、TOMY)进行离心(1000g，2分钟，4℃)。通过重复2次该操作而对柱进行杀菌和清洗。利用MOPS-Na缓冲液(20mM，pH7.5)将5％(w/v)叠氮化钠储备溶液稀释250倍，利用由此制备的0.02％叠氮化钠/20mM MOPS-Na缓冲液充满，通过重复4次静置使溶液流动的操作，从而利用缓冲液将PD10柱置换。进一步添加0.02％叠氮化钠/20mM MOPS-Na缓冲液，进行离心。
将PD10柱转移至新的50mL管，以不破坏通过离心而成的Sephadex的斜面的方式向每一根PD10柱供给1.75～2.5mL CDP溶液。以与上述离心时相同的角度固定于离心机，进行离心。回收溶出的溶液作为CDP储备溶液，利用NanoDrop 2000c测定CDP储备溶液的280nm的吸光度，每个1.7mL管分注1mL在4℃保存。
每根柱添加30mL的MOPS-Na缓冲液(20mM、pH7.5)静置将柱清洗。接着重复2次利用超纯水充满、进行离心的操作。同样利用50体积％乙醇水溶液清洗2次。利用50体积％乙醇水溶液充满PD-10柱在4℃保存。
1-2-4.利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)确认CDP的精制
(1)10％丙烯酰胺凝胶的制备
将30％丙烯酰胺/双混合溶液3.33mL、Tris-HCl缓冲液(1.5M、pH8.8)2.5mL、超纯水4.01mL添加至50mL管，边进行超声波照射边利用吸气器抽吸脱气。添加10％SDS水溶液100μL、10％APS水溶液50μL、TEMED 10μL，以不起泡的方式进行移液并混合。将混合的溶液3.5mL添加至2枚玻璃板的间隙(0.75mm)，安静地重叠饱和1-丁醇900μL，在室温静置1小时而聚合。使用微量吸管将饱和1-丁醇除去，接着利用超纯水清洗，作为分离凝胶。
将30％丙烯酰胺/双混合溶液0.44mL、Tris-HCl缓冲液(0.5M、pH6.8)0.44mL、超纯水2.03mL添加至50mL管，边进行超声波照射边利用吸气器抽吸脱气。添加10％SDS水溶液33μL、10％APS水溶液16.7μL、TEMED 1.65μL，以不起泡的方式进行移液并混合。将溶液充分添加至分离凝胶上，边注意不要让空气进入10孔梳中边组装，在室温静置1小时进行聚合。生成后的凝胶每个玻璃板利用充分湿润的无尘纸(Kimwipes)夹持，进一步利用棉卷(ラップ)包住在4℃保存。
(2)基于电泳的评价
在1.7mL管中添加Protein Molecular Weight Marker(Broad)5μL、1M DTT溶液2μL、5×Loading缓冲液20μL、灭菌精制水173μL并混合，将其作为标记物，在-20℃保存。将CDP储备溶液和CDP的精制中回收的流通液、清洗液各自1μL与5×Loading缓冲液2μL、1M DTT1μL、超纯水6μL混合。将它们和在室温解冻的标记物10μL在105℃进行热处理，利用台式小型离心机(R5-AQBD02、Recenttec)进行快速离心。将本项(1)制备的聚丙烯酰胺凝胶安装于电泳用容器(Mini-PROTEAN Tetra Cell、BIO RAD)，注入利用超纯水稀释5倍的5×电泳缓冲液500mL，取下梳子。向每个孔装入电泳样品，使用电泳装置(Mini-PROTEAN Tetra System、BIO RAD)在电压150V进行电泳约40分钟。在条带到达距凝胶的下端约1cm的上方时停止电泳，将凝胶由玻璃板取出，浸渍于固定液，遮光利用振动器(Wave-PR、TAITECH)振荡30分钟。除去固定液，添加染色液浸渍凝胶，遮光振荡60分钟。回收染色液，添加脱色液浸渍凝胶，遮光振荡30分钟。重复除去脱色液重新添加脱色液进行振荡的操作，直至可确切地看见标记物所含有的蛋白质的条带。利用超纯水清洗凝胶，通过Gel Doc EZ Imager(BIO RAD)拍照并利用附带的软件进行解析。
1-2-5.CDP的酶活性测定
使用超纯水以成为300mM的方式使D-(+)-纤维二糖溶解，作为纤维二糖储备溶液。CDP的活性按照以下方式测定。将含有αG1P50mM、D-(+)-纤维二糖50mM、和稀释规定倍率的CDP的3-吗啉代丙磺酸缓冲液(50mM、pH7.5)在37℃孵育。对由CDP生成的磷酸进行定量，求出在将每1分钟使1μmol磷酸游离的酶量定义为1U时的U/mL，作为酶活性。CDP的稀释率，以反应时间为100分钟时的αG1P的转化率为10％以下的方式确定。
1-3.纤维寡糖的酶合成
1-3-1.利用CDP的纤维寡糖的酶合成(引物：葡萄糖)
使2-[4-(2-羟乙基)-1-呱嗪基]乙磺酸(HEPES)23.8g溶解于约60mL的超纯水。利用4N氢氧化钠水溶液调整为pH7.5后，定容为100mL，利用PVDF制0.22μm过滤器过滤灭菌。将其作为HEPES缓冲液(1M、pH7.5)，在4℃保存。
称量规定量的D-(+)-葡萄糖和αG1P二钠·n水合物，分别以成为1M的方式溶解于超纯水，得到1M葡萄糖储备溶液和1MαG1P水溶液。
将HEPES缓冲液、1MαG1P水溶液、1M葡萄糖储备溶液以反应时的浓度分别变为500mM、200mM、50mM的方式添加至4mL管，添加规定量的甲醇(MeOH)、乙醇(EtOH)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)作为水溶性有机溶剂，考虑到使用的CDP储备溶液的量，利用超纯水定容。边进行超声波照射边利用吸气器抽吸脱气。以终浓度变为0.2U/mL的方式适量添加CDP储备溶液，以不产生气泡的方式通过移液进行混合。分取规定量至1.7mL管或者1mL MIGHTY VIALS中，在60℃孵育3天。
关于作为反应溶剂的混合溶剂，将含有10体积％的MeOH的HEPES缓冲液(500mM、pH7.5)记为10％MeOH(即，混合溶剂中含有10体积％的MeOH)。关于其他混合溶剂，也同样进行表述。需要说明的是，作为对照，不添加水溶性有机溶剂，除此之外同样进行将孵育得到的生成物记为“(-)”。
1-3-2.利用CDP的纤维寡糖的酶合成(引物：纤维二糖)
代替1M葡萄糖储备溶液而使用了300mM纤维二糖储备溶液，除此之外，与1-3-1项同样进行纤维寡糖的酶合成反应。
1-3-3.利用CDP的纤维寡糖的酶合成(引物：烷基化葡萄糖)
代替1M葡萄糖储备溶液，使用300mM乙基葡萄糖苷储备溶液或300mM辛基葡萄糖苷储备溶液，除此之外，与1-3-1项同样进行纤维寡糖的酶合成反应。300mM乙基葡萄糖苷储备溶液和300mM辛基葡萄糖苷储备溶液通过以下方式制备，即，称量规定量的乙基β-D-葡萄糖苷(Carbosynth Limited)和正辛基β-葡萄糖苷(Dojindo Laboratories)，以分别成为300mM的方式溶解于超纯水。
1-3-4.酶合成后的纤维寡糖的精制
为了将1-3-1～3项中制备的生成物用于各种分析，使用超纯水或超纯水和有机溶剂的混合溶剂作为清洗溶剂进行精制。详细而言，添加清洗溶剂通过基于移液的水流将生成物进行机械破坏使其分散，进行离心(15000rpm、10分钟以上、4℃)，除去上清液。重复5次添加清洗溶剂稀释10倍并使沉淀物再分散而进行离心的操作，精制直至溶液的置换率为99.999％以上。利用100℃的加热块将精制的分散液加热10分钟，使残存的CDP失活。需要说明的是，关于对照(-)，使用超纯水作为清洗溶剂进行精制。
生成物的产量通过将精制后的水分散液绝对干燥而算出。预先在105℃干燥24小时，在干燥器内称量放冷后的样品管，添加精制后的水分散液在105℃干燥24小时，然后在干燥器内放冷称量。由干燥前后的重量差算出生成物的浓度。该操作同时进行3次，通过它们的平均值算出生成物的产量。
使用基于基质辅助激光解吸电离飞行时间型质量分析(MALDI-TOF-MS)法的测定时，利用超纯水将精制后的分散液稀释来使用。
1-4.酶合成后的纤维寡糖的特性评价
1-4-1.生成物的翻转倒置试验
对于使用1mL MIGHTY VIALS制备的样品，通过翻转倒置试验来评价凝胶化。将小瓶上下翻转静置，在生成物不流动的情况下判断为已形成凝胶状的结构体。
1-4-2.生成物的化学结构的评价
(1)生成物的产量测定
利用1-3-4项所示的方法，通过绝对干燥算出产量。
(2)生成物的MALDI-TOF-MS测定
在质荷比的校正中使用的标准样品按照以下方式制备，即：将Bradykin fragment1-7水溶液(10nmol/mL Bradykinin fragment1-7、0.05质量％三氟乙酸(TFA)、50质量％乙腈)、P14R水溶液(10nmol/mL P14R、0.1质量％TFA)、ACTH fragment18-39水溶液(10nmol/mLACTH fragment18-39、0.1质量％TFA)各自5μL、10mg/mL DHBA水溶液5μL、1.0质量％TFA水溶液1μL、乙腈4μL在1.7mL管中混合。
生成物的测定样品按照以下方式制备，即：将0.1％(w/v)的生成物的水分散液1μL、10mg/mL DHBA水溶液1μL、三氟乙酸(0.2体积％)的乙腈溶液3μL在利用氢氧化钾(3.3质量％)的甲醇溶液清洗后的MIGHTY VIALS中混合。
标准样品和生成物的测定样品各自1μL装配于样品板，重复5次使其风干的操作。真空干燥1小时以上，利用MALDI-TOF-MS(AXIMA-performance、岛津制作所)测定。测定条件为Mode：Liner(positive)、Mass Range：1.0-3000.0、Max Leaser Rap Rate：10、power：100、profiles：100、shots：2、Ion Gate(Da)：Blank500、Pulsed Extraction optimized at(Da)：1000.0。
由测定得到的MS谱在Smoothing method：Gaussian、Smoothing filter width：19、Baseline filter width：1000的条件下进行处理。
将钠离子加成物和钾离子加成物的峰面积进行合计，算出各聚合度的峰面积。由算出的各聚合度的峰面积的比例算出聚合度的平均值，作为平均聚合度。聚合度的分布通过按照以下式子对MALDI-TOF-MS谱进行分析，利用根据平均聚合度的标准差进行评价。
[数1]
Figure BDA0002756797510000201
2.结果和讨论
2-1.酶反应后的溶液状态
将葡萄糖或者纤维二糖应用于利用CDP的酶合成系统。使用αG1P作为单体，使用葡萄糖或者纤维二糖作为引物，在含有规定浓度的水溶性有机溶剂的HEPES缓冲液(500mM、pH7.5)中，在60℃孵育3天。其结果，使用任意的水溶性有机溶剂的情况下反应后的溶液整体均白浊，因此提示了在相同条件下引物被CDP识别，纤维寡糖被酶合成(参照图1(葡萄糖引物合成系统)和图2(纤维二糖引物合成系统))。此外，葡萄糖引物中使用10％EtOH、20％DMSO作为反应溶剂的情况、以及纤维二糖引物中任意的反应溶剂的情况下，即使反转容器溶液也不会流落，生成凝胶状的结构物。
2-2.酶合成后的纤维寡糖的聚合度及其分布的评价
2-2-1.对于葡萄糖引物合成系统的有机溶剂的添加效果
对于使用葡萄糖引物在各种混合溶剂中进行酶合成而成的生成物，分别使用含有与反应溶剂相同比例的有机溶剂的水作为清洗溶剂进行精制后，利用MALDI-TOF-MS谱测定沉淀生成物。得到的MS谱如图3所示，均显示m/z的间隔与葡糖基单元(162Da)对应的多个峰，此外检测到的峰分别与聚合度为6～16聚体左右的纤维素低聚物的钠离子加成物或者钾离子加成物一致。因此，表明具有规定聚合度分布的纤维寡糖被酶合成。使用含有水溶性有机溶剂的混合溶剂的情况下，与在不含有水溶性有机溶剂的HEPES缓冲液中进行酶合成后的对照(-)相比，平均聚合度DP为同等或略低。另外，标准偏差小，聚合度的分布窄。另外，由图3可知，使用混合溶剂的情况下，能够抑制生成聚合度n为14～16的高聚合度的低聚物。
下述表1示出由图3的MS谱数据算出10％MeOH、20％DMSO和对照(-)的各聚合度的比例的结果。由表1可知，使用混合溶剂的情况下，与对照(-)相比，能够抑制生成聚合度高的低聚物。需要说明的是，表1中没有示出聚合度15和16的比例，这是因为它们的比例不足1％。另外，表1中的“0％”是指检测限以下。
[表1]
Figure BDA0002756797510000211
2-2-2.对于纤维二糖引物合成系统的有机溶剂的添加效果
对于使用纤维二糖引物在各种混合溶剂中进行酶合成而得到的生成物，分别使用含有与反应溶剂相同比例的有机溶剂的水作为清洗溶剂进行精制后，利用MALDI-TOF-MS谱测定沉淀生成物。得到的MS谱如图4所示，均显示m/z的间隔与葡糖基单元对应的多个峰，此外检测到的峰分别与聚合度为4～10聚体左右的纤维素低聚物的钠离子加成物或者钾离子加成物一致。因此，表明具有规定聚合度分布的纤维寡糖被酶合成。另外，由与2-2-1项中的结果的对比可知，使用纤维二糖作为引物的情况下，与使用葡萄糖作为引物的情况相比，聚合度低，其分布也窄，聚合度选择性更高。
使用含有水溶性有机溶剂的混合溶剂的情况下，与在不含有水溶性有机溶剂的HEPES缓冲液中进行酶合成的对照(-)相比，平均聚合度DP略低。另一方面，关于标准差，即使在对照(-)中也为很小的值，因此没有发现显著的不同。但是，由图4的MS谱可知，使用混合溶剂的情况下，聚合度n为8～10的高聚合度的低聚物的生成相对于对照(-)被抑制。
下述表2示出由图4的MS谱数据算出10％MeOH、15％DMF、20％DMSO和对照(-)的各聚合度的比例的结果。由表2可知，使用混合溶剂的情况下，与对照(-)相比，聚合度高的(聚合度＝8～9)低聚物的生成被抑制，特别是15％DMF和20％DMSO时，其效果高。需要说明的是，表2中的“0％”是指检测限以下。
使用通过绝对干燥而算出的沉淀生成物的产量和由MALDI-TOF-MS谱测定算出的平均聚合度DP，算出单体即αG1P的转化率。结果如表2所示，10％MeOH、15％DMF、20％DMSO和对照(-)的αG1P转化率分别约为65％、50％、60％、55％。
[表2]
Figure BDA0002756797510000231
2-2-3.清洗溶剂的影响和沉淀生成物与上清液中的生成物的不同的确认
对于与2-2-2项同样地使用纤维二糖引物在20％DMSO中进行酶合成而得到的生成物，使用水或者20％DMSO作为清洗溶剂重复5次离心和再分散，进行精制。将混合了该精制时的3～5次离心后的上清液而得到的上清液中的生成物和5次离心后的沉淀生成物分别进行MALDI-TOF-MS谱测定。
结果如图5所示，对于MS谱、平均聚合度DP和标准差基本没有发现清洗溶剂引起的不同。因此，可知2-2-2项的MS谱等的不同不是清洗溶剂引起的，而是反应溶剂的不同引起的。
2-2-4.上清液中的生成物的确认
对于与2-2-2项同样地使用纤维二糖引物在20％DMSO或30％DMSO中进行酶合成而得到的生成物，分别使用含有与反应溶剂相同比例的DMSO的水作为清洗溶剂重复5次离心和再分散，进行精制。对在20％DMSO的反应中混合了该精制时的3～5次离心后的上清液而得到的上清液中的生成物和5次离心后的沉淀生成物、以及在30％DMSO的反应中混合了该精制时的1次离心后上清液并通过Millipore公司生产ZipTip进行脱盐而得到的上清液中的生成物和5次离心后的沉淀生成物，分别进行MALDI-TOF-MS谱测定。
结果如图6所示，在将30％DMSO作为反应溶剂的情况下，与20％DMSO的情况同样地，能够抑制生成聚合度n为8～10的高聚合度的低聚物。需要说明的是，认为图6中的符号Z所表示的峰为来自ZipTip的杂质。
2-2-5.对于乙基葡萄糖苷引物合成系统的有机溶剂的添加效果
对于使用乙基葡萄糖苷引物、使用20％DMSO作为反应溶剂进行酶合成而得到的沉淀生成物，通过使用含有与反应溶剂相同比例的DMSO的水作为清洗溶剂重复5次离心和再分散操作从而进行精制后，对沉淀生成物进行MALDI-TOF-MS谱测定。得到的MS谱如图7所示，显示m/z的间隔与葡糖基单元对应的多个峰，此外检测到的峰与聚合度为6～9聚体左右的乙基化纤维素低聚物的钠离子加成物或者钾离子加成物一致。因此，可知具有规定聚合度分布的纤维寡糖被酶合成。另外，使用20％DMSO作为反应溶剂的情况，与HEPES缓冲液中进行酶合成的对照(-)相比，平均聚合度DP低，聚合度的分布也窄，能够抑制生成聚合度n为9～11的高聚合度的低聚物。
下述表3示出由图7的MS谱数据算出各聚合度的比例的结果。由表3可知，使用混合溶剂的情况下，与对照(-)相比，能够抑制生成聚合度高的低聚物。需要说明的是，表3中的“0％”是指检测限以下。
[表3]
Figure BDA0002756797510000241
2-2-6.对于辛基葡萄糖苷引物合成系统的有机溶剂的添加效果
对于使用辛基葡萄糖苷引物、使用20％DMSO作为反应溶剂进行酶合成而得到的沉淀生成物，通过使用含有与反应溶剂相同比例的DMSO的水作为清洗溶剂重复5次离心和再分散操作从而进行精制后，对沉淀生成物进行MALDI-TOF-MS谱测定。得到的MS谱如图8所示，显示m/z的间隔与葡糖基单元对应的多个峰，此外检测到的峰与聚合度为5～7聚体左右的辛基化纤维素低聚物的钠离子加成物或者钾离子加成物一致。因此，可知具有规定聚合度分布的纤维寡糖被酶合成。另外，使用20％DMSO作为反应溶剂的情况下，与HEPES缓冲液中进行了酶合成的对照(-)相比，平均聚合度DP低，聚合度的分布也窄，能够抑制生成聚合度n为7～9的高聚合度的低聚物。
下述表4示出由图8的MS谱数据算出各聚合度的比例的结果。由表4可知，使用混合溶剂的情况下，与对照(-)相比，能够抑制生成聚合度高的低聚物。需要说明的是，表4中的“0％”是指检测限以下。
[表4]
Figure BDA0002756797510000251
以上，说明了本发明的几个实施方式，但是这些实施方式是作为例子而提出的，并非有意限定发明的范围。这些实施方式能够以其他各种形态实施，在不脱离发明的主旨的范围内，可进行各种省略、置换、变更。这些实施方式、其省略、置换、变更等包含于发明的范围、主旨，同样地，包含于权利要求所记载的发明及其等同的范围。

Claims (2)

1.一种纤维寡糖的制造方法，包括以下工序：
使α-葡萄糖-1-磷酸和选自由葡萄糖、纤维二糖和烷基化葡萄糖组成的组中的至少一种引物，在含有水和水溶性有机溶剂的混合溶剂中，与纤维糊精磷酸化酶反应。
2.如权利要求1所述的纤维寡糖的制造方法，其中，
所述水溶性有机溶剂为选自由甲醇、乙醇、N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜组成的组中的至少一种。
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