JP2019193601A - セロオリゴ糖の製造方法 - Google Patents
セロオリゴ糖の製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2019193601A JP2019193601A JP2018088774A JP2018088774A JP2019193601A JP 2019193601 A JP2019193601 A JP 2019193601A JP 2018088774 A JP2018088774 A JP 2018088774A JP 2018088774 A JP2018088774 A JP 2018088774A JP 2019193601 A JP2019193601 A JP 2019193601A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- solution
- polymerization
- cdp
- glucose
- water
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- FYGDTMLNYKFZSV-ZWSAEMDYSA-N cellotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](OC(O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-ZWSAEMDYSA-N 0.000 title claims abstract description 42
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 108010077004 Cellodextrin phosphorylase Proteins 0.000 claims abstract description 57
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims abstract description 37
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 claims abstract description 29
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 29
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 28
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 28
- 239000012046 mixed solvent Substances 0.000 claims abstract description 24
- 150000002303 glucose derivatives Chemical class 0.000 claims abstract description 11
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims abstract description 10
- HXXFSFRBOHSIMQ-VFUOTHLCSA-N alpha-D-glucose 1-phosphate Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O HXXFSFRBOHSIMQ-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 229950010772 glucose-1-phosphate Drugs 0.000 claims abstract description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 52
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 45
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 39
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 abstract description 64
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 39
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 33
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 57
- 239000000047 product Substances 0.000 description 40
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 38
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 38
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 26
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 26
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 23
- 239000007810 chemical reaction solvent Substances 0.000 description 21
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 19
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 19
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 18
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 18
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 18
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 16
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- HXXFSFRBOHSIMQ-UHFFFAOYSA-N Di-K salt-alpha-D-Pyranose-Galactose 1-dihydrogen phosphate Natural products OCC1OC(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)C1O HXXFSFRBOHSIMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 14
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 14
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 13
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 12
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 12
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 9
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 9
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 9
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- MWEMXEWFLIDTSJ-UHFFFAOYSA-M sodium;3-morpholin-4-ylpropane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 MWEMXEWFLIDTSJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000001254 matrix assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrum Methods 0.000 description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 8
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 7
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 7
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 7
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- WYUFTYLVLQZQNH-JAJWTYFOSA-N Ethyl beta-D-glucopyranoside Chemical compound CCO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O WYUFTYLVLQZQNH-JAJWTYFOSA-N 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- NPYPAHLBTDXSSS-UHFFFAOYSA-N Potassium ion Chemical class [K+] NPYPAHLBTDXSSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N Sodium cation Chemical class [Na+] FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 6
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 6
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N octyl beta-D-glucopyranoside Chemical compound CCCCCCCCO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 5
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 5
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 4
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- WURBVZBTWMNKQT-UHFFFAOYSA-N 1-(4-chlorophenoxy)-3,3-dimethyl-1-(1,2,4-triazol-1-yl)butan-2-one Chemical compound C1=NC=NN1C(C(=O)C(C)(C)C)OC1=CC=C(Cl)C=C1 WURBVZBTWMNKQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GLDQAMYCGOIJDV-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC(O)=C1O GLDQAMYCGOIJDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000193448 Ruminiclostridium thermocellum Species 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 3
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 3
- 238000001906 matrix-assisted laser desorption--ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 2,5-dihydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(O)=CC=C1O WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical compound [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N Heavy water Chemical compound [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical compound CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CRROPKNGCGVIOG-QCOJBMJGSA-N [des-Phe(8), des-Arg(9)]-bradykinin Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(O)=O)CCC1 CRROPKNGCGVIOG-QCOJBMJGSA-N 0.000 description 2
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010048610 cellobiose phosphorylase Proteins 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- -1 ethyl β-D-glucoside Chemical class 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 238000009499 grossing Methods 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N kanamycin A sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N 0.000 description 2
- 229960002064 kanamycin sulfate Drugs 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 125000004400 (C1-C12) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- FMYBFLOWKQRBST-UHFFFAOYSA-N 2-[bis(carboxymethyl)amino]acetic acid;nickel Chemical compound [Ni].OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O FMYBFLOWKQRBST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108050004944 Alpha-glucan phosphorylases Proteins 0.000 description 1
- 101800004538 Bradykinin Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002299 Cellodextrin Polymers 0.000 description 1
- 241000186321 Cellulomonas Species 0.000 description 1
- JDRSMPFHFNXQRB-CMTNHCDUSA-N Decyl beta-D-threo-hexopyranoside Chemical compound CCCCCCCCCCO[C@@H]1O[C@H](CO)C(O)[C@H](O)C1O JDRSMPFHFNXQRB-CMTNHCDUSA-N 0.000 description 1
- QXZGBUJJYSLZLT-UHFFFAOYSA-N H-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-OH Natural products NC(N)=NCCCC(N)C(=O)N1CCCC1C(=O)N1C(C(=O)NCC(=O)NC(CC=2C=CC=CC=2)C(=O)NC(CO)C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CC=2C=CC=CC=2)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(O)=O)CCC1 QXZGBUJJYSLZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100035792 Kininogen-1 Human genes 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N aldehydo-D-glucose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001413 alkali metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000003287 bathing Methods 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- QXZGBUJJYSLZLT-FDISYFBBSA-N bradykinin Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)CCC1 QXZGBUJJYSLZLT-FDISYFBBSA-N 0.000 description 1
- MZNDIOURMFYZLE-UHFFFAOYSA-N butan-1-ol Chemical class CCCCO.CCCCO MZNDIOURMFYZLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YYRMJZQKEFZXMX-UHFFFAOYSA-N calcium;phosphoric acid Chemical compound [Ca+2].OP(O)(O)=O.OP(O)(O)=O YYRMJZQKEFZXMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001547 cellobiose group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940073499 decyl glucoside Drugs 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- PYIDGJJWBIBVIA-UYTYNIKBSA-N lauryl glucoside Chemical compound CCCCCCCCCCCCO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O PYIDGJJWBIBVIA-UYTYNIKBSA-N 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- CHWRSCGUEQEHOH-UHFFFAOYSA-N potassium oxide Chemical compound [O-2].[K+].[K+] CHWRSCGUEQEHOH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001950 potassium oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 150000003462 sulfoxides Chemical class 0.000 description 1
- 239000002426 superphosphate Substances 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
- C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
- C12Y204/01049—Cellodextrin phosphorylase (2.4.1.49)
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
1−1.試薬
LB−BROTH LENNOX及びLB−AGAR LENNOXはフナコシより購入した。グリセロール、カナマイシン硫酸塩、イソプロピル−β−D(−)−チオガラクトピラノシド(IPTG)、N,N,N’,N’−テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)、ジチオトレイトール(DTT)、1−ブタノール、αG1P二ナトリウム・n水和物、40%重水酸化ナトリウム重水溶液は和光純薬より購入した。
CDPは、M.Krishnareddyら、J.Appl.Glycosci.,2002年,49,1−8に記載の方法と同様の方法により調製した。詳細は以下の通り。
(1)滅菌精製水
500mL広口メディウム瓶に超純水500mLを採取してオートクレーブ(121℃、20分間、BS−245、TOMY)して室温で保存した。
カナマイシン硫酸塩1.5gを滅菌精製水に溶解させ、30mLにメスアップした。調製した溶液をクリーンベンチ内でポリフッ化ビニリデン(PVDF)製0.22μmフィルターで濾過滅菌し、1.7mLチューブに1mLずつ分注して−20℃で保存した。
IPTG71.5mgを滅菌精製水に溶解させ、30mLにメスアップした。調製した溶液をクリーンベンチ内においてPVDF製0.22μmフィルターで濾過滅菌した。1.7mLチューブに1mLずつ分注して−20℃で保存した。
250mL広口メディウム瓶にLB−AGAR LENNOX2.8gを採取し、超純水80mLを添加して溶解させてオートクレーブした。60℃以下まで室温で冷却した後、クリーンベンチ内で50mg/mLカナマイシンストック溶液80μLを加えて混合した。滅菌済みシャーレに分注して室温で固化させた後、4℃で保存した。調製後1ヶ月以内に使用した。
250mL広口メディウム瓶にグリセロール50mL、超純水50mLを加えて混合した後、オートクレーブして室温で保存した。
500mL広口メディウム瓶にLB−BROTH LENNOX10gを純水500mLに溶解させ、オートクレーブして室温で保存した。
3−モルホリノプロパンスルホン酸(MOPS)4.18gを約600mLの超純水に溶解させた。4N水酸化ナトリウム水溶液によりpH7.5に調整後、1Lにメスアップした。PVDF製0.10μmフィルターで濾過滅菌して4℃で保存した。
エタノール(バイオテクノロジーグレード)140mL及び超純水60mLを250mL広口メディウム瓶に採取して混合した後、室温で保存した。
MOPS2.09g、塩化ナトリウム8.77g、イミダゾール340mgを約350mLの超純水に溶解させた。4N水酸化ナトリウム水溶液によりpH7.5に調整後、500mLにメスアップした。PVDF製0.10μmフィルターで濾過滅菌して4℃で保存した。
MOPS2.09g、塩化ナトリウム8.77g、イミダゾール8.51gを約350mLの超純水に溶解させた。4N水酸化ナトリウム水溶液によりpH7.5に調整後、500mLにメスアップした。PVDF製0.10μmフィルターで濾過滅菌して4℃で保存した。
アジ化ナトリウム500mgをプラスチック製スパチュラにより秤量してMOPS−Na緩衝液(20mM、pH7.5)を添加して全量が10mLとなるよう溶解させて4℃で遮光保存した。
アクリルアミド29.2g、N,N’−メチレンビスアクリルアミド0.8gを約70mLの超純水に撹拌しながら溶解させた。全量が100mLになるようにメスアップして4℃で遮光保存した。
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Tris)18.17gを約80mLの超純水に撹拌しながら溶解させた。6N塩酸によりpH8.8に調整後、全量が100mLになるようにメスアップして4℃で保存した。
Tris6.06gを約80mLの超純水に撹拌しながら溶解させた。6N塩酸によりpH6.8に調整後、全量が100mLになるようにメスアップして4℃で保存した。
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)10gを約90mLの超純水に撹拌しながら溶解させた。全量が100mLになるようにメスアップして室温で保存した。
過硫酸アンモニウム(APS)0.1gを約1mLの超純水に溶解させて4℃で保存した。
1−ブタノールと超純水を2:1の割合で混合して室温で保存した。
Tris15.1g、グリシン72.1g、SDS5.0gを全量が1Lとなるように超純水に溶解させて4℃で保存した。使用の際は超純水で5倍に希釈した。一度使用した泳動バッファーは回収して再度使用し、使用回数は最大で2回とした。
Tris2.42g、SDS10.0g、ブロモフェノールブルー50mgを50mLのグリセロールと約40mLの超純水を添加して溶解させた。6N塩酸を用いてpH6.8に調整後、100mLにメスアップした。1.7mLチューブに1mLずつ分注して4℃で保存した。
ジチオトレイトール(DTT)約150mgを1Mとなるように約1mLの超純水を添加して溶解させ、−20℃で保存した。
酢酸50mL、エタノール200mLを混合した後、超純水で500mLにメスアップして室温で保存した。
酢酸40mL、エタノール125mLを混合した後、超純水で500mLにメスアップして室温で保存した。
クマシーブリリアントブルーR−250 0.25gを脱色液100mLに加え、撹拌して溶解させて室温で遮光保存した。
(1)E.coli BL21−CDPグリセロールストックの調製
ガスバーナーで加熱滅菌し、放冷した白金耳を用いて、Clostridiumthermocellum YM4由来CDPの遺伝子を含むプラスミドをもつEscherichia coli BL21−Gold(DE3)株(E.coli BL21−CDP)のグリセロールストックからLB−AGAR/カナマイシンプレートに植菌し、37℃で8〜12時間培養した。予め乾熱滅菌した試験管に50mg/mLカナマイシンストック溶液5μLとLB培地5mLの混合溶液を加えた後、加熱した白金耳を用いてシングルコロニーから植菌した。OD660が0.6〜0.8に達するまで振盪培養機(BR−23FP、TAITEC)を用いて37℃で振盪培養(往復、200rpm)した。その後、培養液800μLを1.7mLチューブに採取し、50%グリセロール溶液100μLを添加して混合した。液体窒素で凍結して−80℃で保存した。
ガスバーナーで加熱滅菌し、放冷した白金耳を用いて、E.coli BL21−CDPのグリセロールストックもしくは作製後1ヶ月以内のマスタープレートからLB−AGAR/カナマイシンプレートに植菌して37℃で8〜12時間培養した。マスタープレートから植菌した場合はそのまま4℃で保存した。グリセロールストックから植菌した場合は、さらにLB−AGAR/カナマイシンプレートに植菌して37℃で8〜12時間培養して4℃で保存した。
乾熱滅菌した試験管にLB培地3mLを採取して50mg/mLカナマイシンストック溶液3μLを加えた。加熱滅菌し、放冷した白金耳を用いて、E.coli BL21−CDPマスタープレートのシングルコロニーから植菌した。振盪培養機を用いて37℃で10〜12時間振盪培養(往復、200rpm)した。
2本の1Lバッフル付きフラスコにLB−BROTH LENNOX6gをそれぞれ秤量した後、純水300mLを加えてオートクレーブして放冷した。50mg/mLカナマイシンストック溶液300μLをそれぞれに添加して混合した後、E.coli BL21−CDP前培養液300μLを加えた。振盪培養機を用いて30℃で振盪培養(回転、600rpm)してOD660が0.55〜0.60に達したことを確認後、10mM IPTGストック溶液3mLをそれぞれ加えて25℃で20時間振盪培養(回転、200rpm)してCDPを発現させた。
(1)E.coli BL21−CDPの破砕によるCDPの抽出
1−2−2項(4)で調製したCDPを発現させたE.coli BL21−CDP懸濁液を50mLチューブ12本に約50mLずつ均等に分注し、遠心機(遠心機:EX−126、TOMY、ローター:3850−04P、TOMY)を用いて遠心(3500rpm、20分間、4℃)した。上清をデカンテーションにより除去し、沈澱したE.coli BL21−CDPペレットにMOPS−Na緩衝液(20mM、pH7.5)を加えてそれぞれ約15mLにメスアップし、手で激しく振盪して懸濁させた。E.coli BL21−CDP懸濁液を4本の100mL自立式チューブに約45mLずつ分注し、氷浴しながらプローブ式超音波照射器(Sonifier 250、BRANSON)を用いて超音波照射してE.coli BL21−CDPを破砕した。超音波照射は、power:200W(ダイヤル10)、duty cycle:30%の条件で2サイクル(5秒間超音波照射と25秒間インターバルの4回繰り返しを1サイクル)行った。E.coli BL21−CDP破砕液中のプロテアーゼ等によるCDPの分解を防ぐために、以降はE.coli破砕液は常に氷浴した。4本の100mLチューブ中のE.coli BL21−CDP破砕液をそれぞれ50mLチューブに移して遠心(3500rpm、>20分間、4℃)した。その後、デカンテーションにより上清を50mLチューブに回収した。
予め70%エタノールで滅菌し、超純水で置換した直径1.8cm、長さ10cmのプラスチック製カラムに、Ni−NTAアガロースゲル(GE Healthcare)分散液9.8mLを充填した。カラム内を70%エタノールで満たして流すことでNI−NTAアガロースゲルを殺菌・洗浄した。この操作を2回繰り返した。MOPS−Na緩衝液(20mM、pH7.5)3mLをアプライして流し、さらに3mLアプライした。スパチュラで撹拌してNi−NTAアガロースゲルを再分散させて気泡を取り除いた。その後、MOPS−Na緩衝液(20mM、pH7.5)5mLで4回置換した。
CDP溶液の緩衝液置換はPD10カラム(Sephadex G−25、GE Healthcare)を用いて、付属の説明書にしたがって行った。CDP溶液の容量に応じて、必要な数のPD10カラムを用いた。付属のアダプターを用いてPD10カラムを50mLチューブに固定した。70%エタノールで満たし、遠心機(MX−305、TOMY)を用いて遠心(1000g、2分間、4℃)した。この操作を2回繰り返すことでカラムを殺菌及び洗浄した。5%(w/v)アジ化ナトリウムストック溶液をMOPS−Na緩衝液(20mM、pH7.5)で250倍希釈して調製した0.02%アジ化ナトリウム/20mM MOPS−Na緩衝液で満たし、静置して溶液を流す操作を4回繰り返すことでPD10カラムを緩衝液で置換した。さらに0.02%アジ化ナトリウム/20mM MOPS−Na緩衝液を加え、遠心した。
(1)10%アクリルアミドゲルの調製
50mLチューブに30%アクリルアミド/ビス混合溶液3.33mL、Tris−HCl緩衝液(1.5M、pH8.8)2.5mL、超純水4.01mLを加え、超音波照射しながらアスピレーターで吸引して脱気した。10%SDS水溶液100μL、10%APS水溶液50μL、TEMED10μLを加え、泡立たないようピペッティングして混合した。混合した溶液3.5mLを2枚のガラスプレートの間隙(0.75mm)に加え、飽和1−ブタノール900μLを静かに重層し、室温で1時間静置して重合した。マイクロピペットを用いて飽和1−ブタノールを除去し、次いで超純水で洗浄し、分離ゲルとした。
1.7mLチューブにProtein Molecular Weight Marker(Broad)5μL、1M DTT溶液2μL、5×Loadingバッファー20μL、滅菌精製水173μLを加えて混合し、これをマーカーとし、−20℃で保存した。CDPストック溶液及びCDPの精製において回収したフロースルー液、洗浄液それぞれ1μLを5×Loadingバッファー2μL、1M DTT1μL、超純水6μLと混合した。これらと室温で解凍したマーカー10μLを105℃で熱処理し、卓上小型遠心機(R5−AQBD02、Recenttec)によりスピンダウンした。本項(1)で調製したポリアクリルアミドゲルを電気泳動用容器(ミニプロティアンTetraセル、BIO RAD)にセットし、超純水で5倍希釈した5×泳動バッファーを500mL注ぎ、コームを外した。1ウェルずつに電気泳動サンプルをロードし、電気泳動装置(ミニプロティアンTetraシステム、BIO RAD)を用いて電圧150Vで約40分間泳動した。バンドがゲルの下端より約1cm上に達したところで泳動を止め、ゲルをガラスプレートから取り出して固定液に浸漬させ、遮光してシェイカー(Wave−PR、TAITECH)で30分間振盪した。固定液を除去し、染色液を加えてゲルを浸漬させ、遮光して60分間振盪した。染色液を回収し、脱色液を加えてゲルを浸漬させ、遮光して30分間振盪した。脱色液を除去して新たに脱色液を加えて振盪する操作を、マーカーに含まれるタンパク質のバンドが明確に見えるまで繰り返した。超純水でゲルを洗浄し、Gel Doc EZ Imager(BIO RAD)により撮影して付属のソフトウェアで解析した。
D−(+)−セロビオースを300mMとなるように超純水を用いて溶解させ、セロビオースストック溶液とした。CDPの活性は以下のように測定した。αG1P50mMとD−(+)−セロビオース50mM、及び所定倍率希釈されたCDPを含む3−モルホリノプロパンスルホン酸緩衝液(50mM、pH7.5)を37℃でインキュベーションした。CDPにより生成されるリン酸を定量し、1分間あたり1μmolのリン酸を遊離する酵素量を1Uと定義した際のU/mLを求め、酵素活性とした。CDPの希釈率は、反応時間が100分の際におけるαG1Pの転化率が10%以下になるように決定した。
1−3−1.CDPによるセロオリゴ糖の酵素合成(プライマー:グルコース)
2−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]エタンスルホン酸(HEPES)23.8gを約60mLの超純水に溶解させた。4N水酸化ナトリウム水溶液によりpH7.5に調整後、100mLにメスアップしてPVDF製0.22μmフィルターで濾過滅菌した。これをHEPES緩衝液(1M、pH7.5)とし、4℃で保存した。
1Mグルコースストック溶液の代わりに300mMセロビオースストック溶液を用い、その他は1−3−1項と同様にしてセロオリゴ糖の酵素合成反応を行った。
1Mグルコースストック溶液の代わりに、300mMエチルグルコシドストック溶液又は300mMオクチルグルコシドストック溶液を用い、その他は1−3−1項と同様にしてセロオリゴ糖の酵素合成反応を行った。300mMエチルグルコシドストック溶液及び300mMオクチルグルコシドストック溶液は、エチルβ−D−グルコシド(Carbosynth Limited)及びn−オクチルβ−グルコシド(Dojindo Laboratories)を所定量秤量し、それぞれ300mMとなるよう超純水に溶解させて調製したものである。
1−3−1〜3項において調製された生成物を各種分析に用いるために、超純水又は超純水と有機溶媒の混合溶媒を洗浄溶媒として用いて精製した。詳細には、洗浄溶媒を加えてピペッティングによる水流により生成物を機械的に破壊して分散させ、遠心(15000rpm、10分間以上、4℃)し、上清を除去した。洗浄溶媒を加えて10倍希釈し沈澱物を再分散させ、遠心する操作を5回繰り返し、溶液の置換率が99.999%以上となるまで精製した。精製した分散液を100℃のヒートブロックにより10分間加熱することで、残存するCDPを失活させた。なお、コントロール(−)については、洗浄溶媒として超純水を用いて精製した。
1−4−1.生成物の反転倒立試験
1mLマイティーバイアルを用いて調製したサンプルについて、反転倒立試験によりゲル化を評価した。バイアルを上下反転して静置し、生成物が流動しなかった場合にゲル状の構造体を形成したと判断した。
(1)生成物の収量測定
1−3−4項で示した手法で、絶乾により収量を算出した。
質量電荷比の校正に用いる標準サンプルはBradykin fragment 1−7水溶液(10nmol/mL Bradykinin fragment1−7、0.05質量%トリフルオロ酢酸(TFA)、50質量%アセトニトリル)、P14R水溶液(10nmol/mL P14R、0.1質量%TFA)、ACTH fragment18−39水溶液(10nmol/mL ACTH fragment18−39、0.1質量%TFA)それぞれ5μL、10mg/mL DHBA水溶液5μL、1.0質量%TFA水溶液1μL、アセトニトリル4μLを1.7mLチューブ中で混合して調製した。
2−1.酵素反応後の溶液状態
グルコースもしくはセロビオースをCDPによる酵素合成系に適用した。モノマーとしてαG1P、プライマーとしてグルコースもしくはセロビオースを用い、所定濃度の水溶性有機溶媒を含むHEPES緩衝液(500mM、pH7.5)中、60℃で3日間インキュベーションした。その結果、いずれの水溶性有機溶媒を用いた場合も反応後の溶液全体が白濁したことから、同条件下でプライマーがCDPにより認識され、セロオリゴ糖が酵素合成されていることが示唆された(図1(グルコースプライマー合成系)および図2(セロビオースプライマー合成系)参照)。さらに、グルコースプライマーでは反応溶媒として10%EtOH、20%DMSOを用いた場合、及び、セロビオースプライマーではいずれの反応溶媒の場合も、容器を反転させても溶液が流れ落ちず、ゲル状の構造体が生成された。
2−2−1.グルコースプライマー合成系への有機溶媒の添加効果
グルコースプライマーを用いて各種の混合溶媒中で酵素合成した生成物について、それぞれ反応溶媒と同割合の有機溶媒を含む水を洗浄溶媒として用いて精製した後、沈殿生成物をMALDI−TOF−MSスペクトル測定した。得られたMSスペクトルは、図3に示す通りであり、いずれもm/zの間隔がグルコシルユニット(162Da)に対応する複数のピークを示し、さらに検出されたピークは重合度が6〜16量体程度のセルロースオリゴマーのナトリウムイオン付加体もしくはカリウムイオン付加体にそれぞれ一致した。したがって、所定の重合度分布を有するセロオリゴ糖が酵素合成されていることが明らかになった。水溶性有機溶媒を含む混合溶媒を用いた場合、水溶性有機溶媒を含まないHEPES緩衝液中で酵素合成したコントロール(−)と比較して、平均重合度DPが同等又はやや低くなった。また、標準偏差が小さく、重合度の分布が狭いものであった。また、図3から明らかなように、混合溶媒を用いた場合、重合度nが14〜16である高重合度のオリゴマーの生成が抑えられていた。
セロビオースプライマーを用いて各種の混合溶媒中で酵素合成した生成物について、それぞれ反応溶媒と同割合の有機溶媒を含む水を洗浄溶媒として用いて精製した後、沈殿生成物をMALDI−TOF−MSスペクトル測定した。得られたMSスペクトルは、図4に示す通りであり、いずれもm/zの間隔がグルコシルユニットに対応する複数のピークを示し、さらに検出されたピークは重合度が4〜10量体程度のセルロースオリゴマーのナトリウムイオン付加体もしくはカリウムイオン付加体にそれぞれ一致した。したがって、所定の重合度分布を有するセロオリゴ糖が酵素合成されていることが明らかになった。また、2−2−1項での結果との対比から明らかなように、セロビオースをプライマーとして用いた場合、グルコースをプライマーとして用いた場合よりも、重合度が低く、その分布も狭いものであり、重合度選択性がより高いことがわかった。
2−2−2項と同様にセロビオースプライマーを用いて20%DMSO中で酵素合成した生成物について、洗浄溶媒として水もしくは20%DMSOを用いて遠心・再分散を5回繰り返し精製した。該精製時における3〜5回遠心後の上清を混合した上清中の生成物と、5回遠心後の沈殿生成物を、それぞれMALDI−TOF−MSスペクトル測定した。
2−2−2項と同様にセロビオースプライマーを用いて20%DMSO又は30%DMSO中で酵素合成した生成物について、それぞれ反応溶媒と同割合のDMSOを含む水を洗浄溶媒として用いて遠心・再分散を5回繰り返し精製した。20%DMSOの反応では該精製時における3〜5回遠心後の上清を混合した上清中の生成物と、5回遠心後の沈殿生成物を、30%DMSOの反応では該精製時における1回遠心後の上清を混合しミリポア社製ZipTipにより脱塩して得られた上清中の生成物と、5回遠心後の沈殿生成物を、それぞれMALDI−TOF−MSスペクトル測定した。
エチルグルコシドプライマーを用い、反応溶媒として20%DMSOを用いて酵素合成した沈殿生成物について、反応溶媒と同割合のDMSOを含む水を洗浄溶媒として用いて遠心・再分散操作を5回繰り返すことにより精製した後、沈殿生成物をMALDI−TOF−MSスペクトル測定した。得られたMSスペクトルは、図7に示す通りであり、m/zの間隔がグルコシルユニットに対応する複数のピークを示し、さらに検出されたピークは重合度が6〜9量体程度のエチル化セルロースオリゴマーのナトリウムイオン付加体もしくはカリウムイオン付加体に一致した。したがって、所定の重合度分布を有するセロオリゴ糖が酵素合成されていることが明らかになった。また、反応溶媒として20%DMSOを用いた場合、HEPES緩衝液中で酵素合成したコントロール(−)と比較して、平均重合度DPが低く、重合度の分布も狭くなっており、重合度nが9〜11である高重合度のオリゴマーの生成が抑えられていた。
オクチルグルコシドプライマーを用い、反応溶媒として20%DMSOを用いて酵素合成した沈殿生成物について、反応溶媒と同割合のDMSOを含む水を洗浄溶媒として用いて遠心・再分散操作を5回繰り返すことにより精製した後、沈殿生成物をMALDI−TOF−MSスペクトル測定した。得られたMSスペクトルは、図8に示す通りであり、m/zの間隔がグルコシルユニットに対応する複数のピークを示し、さらに検出されたピークは重合度が5〜7量体程度のオクチル化セルロースオリゴマーのナトリウムイオン付加体もしくはカリウムイオン付加体に一致した。したがって、所定の重合度分布を有するセロオリゴ糖が酵素合成されていることが明らかになった。また、反応溶媒として20%DMSOを用いた場合、HEPES緩衝液中で酵素合成したコントロール(−)と比較して、平均重合度DPが低く、重合度の分布も狭くなっており、重合度nが7〜9である高重合度のオリゴマーの生成が抑えられていた。
Claims (2)
- α−グルコース−1−リン酸と、グルコース、セロビオース及びアルキル化グルコースからなる群から選択される少なくとも一種のプライマーとを、水と水溶性有機溶媒を含む混合溶媒中で、セロデキストリンホスホリラーゼと反応させる工程を含む、セロオリゴ糖の製造方法。
- 前記水溶性有機溶媒が、メタノール、エタノール、N,N−ジメチルホルムアミド及びジメチルスルホキシドからなる群から選択される少なくとも一種である、請求項1に記載のセロオリゴ糖の製造方法。
Priority Applications (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2018088774A JP7076098B2 (ja) | 2018-05-02 | 2018-05-02 | セロオリゴ糖の製造方法 |
KR1020207031957A KR20210005047A (ko) | 2018-05-02 | 2019-04-11 | 셀로올리고당의 제조 방법 |
US17/052,017 US11505813B2 (en) | 2018-05-02 | 2019-04-11 | Cellooligosaccharide production method |
CN201980029877.4A CN112074607A (zh) | 2018-05-02 | 2019-04-11 | 纤维寡糖的制造方法 |
EP19796874.6A EP3789493B1 (en) | 2018-05-02 | 2019-04-11 | Cellooligosaccharide production method |
PCT/JP2019/015839 WO2019211971A1 (ja) | 2018-05-02 | 2019-04-11 | セロオリゴ糖の製造方法 |
TW108114017A TWI826439B (zh) | 2018-05-02 | 2019-04-22 | 纖維寡糖的製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2018088774A JP7076098B2 (ja) | 2018-05-02 | 2018-05-02 | セロオリゴ糖の製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2019193601A true JP2019193601A (ja) | 2019-11-07 |
JP7076098B2 JP7076098B2 (ja) | 2022-05-27 |
Family
ID=68386399
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018088774A Active JP7076098B2 (ja) | 2018-05-02 | 2018-05-02 | セロオリゴ糖の製造方法 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11505813B2 (ja) |
EP (1) | EP3789493B1 (ja) |
JP (1) | JP7076098B2 (ja) |
KR (1) | KR20210005047A (ja) |
CN (1) | CN112074607A (ja) |
TW (1) | TWI826439B (ja) |
WO (1) | WO2019211971A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2022153771A1 (ja) | 2021-01-12 | 2022-07-21 | 第一工業製薬株式会社 | セロオリゴ糖の製造方法 |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023242192A1 (en) * | 2022-06-15 | 2023-12-21 | Pfeifer & Langen GmbH & Co. KG | Syrup containing high concentration of cellooligosaccharides |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016106013A1 (en) * | 2014-12-23 | 2016-06-30 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Enzymatically produced cellulose |
WO2016113933A1 (ja) * | 2015-01-15 | 2016-07-21 | Jx日鉱日石エネルギー株式会社 | セルロースナノ構造体及びその製造方法 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001112496A (ja) | 1999-10-20 | 2001-04-24 | Nippon Paper Industries Co Ltd | セロオリゴ糖の製造法 |
JP2011112496A (ja) * | 2009-11-26 | 2011-06-09 | Pioneer Electronic Corp | 地図情報検索装置、制御方法、プログラム、及び記憶媒体 |
KR20170101578A (ko) * | 2016-02-29 | 2017-09-06 | 씨제이제일제당 (주) | 신규 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소 및 이를 이용한 포도당-6-인산 제조방법 |
CN110267663A (zh) * | 2016-12-06 | 2019-09-20 | 卡莱多生物科技有限公司 | 聚糖聚合物及其相关方法 |
-
2018
- 2018-05-02 JP JP2018088774A patent/JP7076098B2/ja active Active
-
2019
- 2019-04-11 CN CN201980029877.4A patent/CN112074607A/zh active Pending
- 2019-04-11 EP EP19796874.6A patent/EP3789493B1/en active Active
- 2019-04-11 KR KR1020207031957A patent/KR20210005047A/ko not_active Application Discontinuation
- 2019-04-11 US US17/052,017 patent/US11505813B2/en active Active
- 2019-04-11 WO PCT/JP2019/015839 patent/WO2019211971A1/ja unknown
- 2019-04-22 TW TW108114017A patent/TWI826439B/zh active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016106013A1 (en) * | 2014-12-23 | 2016-06-30 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Enzymatically produced cellulose |
WO2016113933A1 (ja) * | 2015-01-15 | 2016-07-21 | Jx日鉱日石エネルギー株式会社 | セルロースナノ構造体及びその製造方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
ANAL. CHEM., vol. 87, no. 19, JPN6019026408, 2015, pages 9639 - 9646, ISSN: 0004695310 * |
CARBOHYDR. RES., vol. 344, no. 18, JPN6019026407, 2009, pages 2468 - 2473, ISSN: 0004695309 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2022153771A1 (ja) | 2021-01-12 | 2022-07-21 | 第一工業製薬株式会社 | セロオリゴ糖の製造方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2019211971A1 (ja) | 2019-11-07 |
EP3789493A1 (en) | 2021-03-10 |
JP7076098B2 (ja) | 2022-05-27 |
TW201947038A (zh) | 2019-12-16 |
TWI826439B (zh) | 2023-12-21 |
CN112074607A (zh) | 2020-12-11 |
KR20210005047A (ko) | 2021-01-13 |
US11505813B2 (en) | 2022-11-22 |
US20210238641A1 (en) | 2021-08-05 |
EP3789493A4 (en) | 2022-03-02 |
EP3789493B1 (en) | 2023-02-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Hamer et al. | Enzymatic production of defined chitosan oligomers with a specific pattern of acetylation using a combination of chitin oligosaccharide deacetylases | |
Lamarque et al. | New route of deacetylation of α-and β-chitins by means of freeze− pump out− thaw cycles | |
Frommhagen et al. | Quantification of the catalytic performance of C1-cellulose-specific lytic polysaccharide monooxygenases | |
Martinou et al. | Chitin deacetylation by enzymatic means: monitoring of deacetylation processes | |
KR102497368B1 (ko) | 점도-저하제를 함유하는 폴리삭카라이드 및 핵산 제형 | |
WO2019211971A1 (ja) | セロオリゴ糖の製造方法 | |
Guerry et al. | Aniline-catalyzed reductive amination as a powerful method for the preparation of reducing end-“clickable” chitooligosaccharides | |
JP5812537B2 (ja) | アミノ糖含有グルカン、その製造法および利用 | |
Schmidt et al. | Mechanistic and molecular investigations on stabilization of horseradish peroxidase C | |
Yuan et al. | Enzymatic production of specifically distributed hyaluronan oligosaccharides | |
EP1369133B1 (en) | Gene carriers comprising a beta-1,3-glucan and process for producing the same | |
Öhlknecht et al. | Cellobiose dehydrogenase and chitosan‐based lysozyme responsive materials for antimicrobial wound treatment | |
Lee et al. | Enhancement of enzyme activity and stability by poly (γ-glutamic acid) | |
D’ambrosio et al. | Production and purification of higher molecular weight chondroitin by metabolically engineered Escherichia coli K4 strains | |
Zhang et al. | Discovery of exolytic heparinases and their catalytic mechanism and potential application | |
Sletmoen et al. | Structure–function relationships in glycopolymers: Effects of residue sequences, duplex, and triplex organization | |
Kumari et al. | The streptococcal hyaluronan synthases are inhibited by sulfhydryl-modifying reagents, but conserved cysteine residues are not essential for enzyme function | |
Melançon et al. | Characterization of TDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose-3, 4-ketoisomerase from the D-mycaminose biosynthetic pathway of Streptomyces fradiae: in vitro activity and substrate specificity studies | |
Sieradzki et al. | Tailoring quaternized starch as a non‐viral carrier for gene delivery applications | |
Butty et al. | Elucidating the formation of 6-Deoxyheptose: biochemical characterization of the GDP-d-glycero-d-manno-heptose C6 dehydratase, DmhA, and its associated C4 reductase, DmhB | |
Jerga et al. | Pseudomonas aeruginosa C5-mannuronan epimerase: steady-state kinetics and characterization of the product | |
JP2018145216A (ja) | セルロースオリゴマーから成る三次元構造体の酵素合成 | |
JP2017201895A (ja) | ゼラチン共存セルロース三次元構造体 | |
Huang et al. | Recombinant Escherichia coli K5 strain with the deletion of waaR gene decreases the molecular weight of the heparosan capsular polysaccharide | |
JP6231993B2 (ja) | ヒアルロン酸組成物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210202 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220201 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220316 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20220405 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20220428 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7076098 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |