CN102899258A

CN102899258A - 从红葡萄酒生产原料或窖泥中分离纯化鉴定季也蒙有孢汗逊酵母菌的方法

Info

Publication number: CN102899258A
Application number: CN2012103811574A
Authority: CN
Inventors: 冯涛; 游雪燕; 庄海宁; 荣志伟; 周彬耀
Original assignee: Shanghai Institute of Technology
Current assignee: Shanghai Institute of Technology
Priority date: 2012-10-10
Filing date: 2012-10-10
Publication date: 2013-01-30

Abstract

本发明公开了从红葡萄酒生产原料或窖泥中分离纯化鉴定获得季也蒙有孢汗逊酵母菌株的方法。即包括红葡萄生产原料及窖泥进行纯化分离，及按照WL营养琼脂培养基形态学鉴定法结合《微生物分类学》的方法进行菌种鉴定2个步骤，最终得到纯化的季也蒙有孢汗逊酵母菌株。从红葡萄酒生产原料或窖泥中分离纯化鉴定获得季也蒙有孢汗逊酵母菌株的方法，有利于用纯菌株培养出具有独特愉快香气风格的红葡萄酒。并且，这种从红葡萄酒生产原料或窖泥中分离纯化鉴定获得季也蒙有孢汗逊酵母菌株的方法具有无杂菌污染、菌种易保藏、操作快速简便、产品质量稳定的特点。

Description

从红葡萄酒生产原料或窖泥中分离纯化鉴定季也蒙有孢汗逊酵母菌的方法

技术领域

本发明涉及一种从红葡萄酒生产原料及窖泥中分离纯化鉴定季也蒙有孢汗逊酵母菌的方法。

背景技术

非酿酒酵母（non-Saccharomyces）常常是葡萄酒非接种发酵的主要参与菌群，它们的代谢与发酵作用深刻地影响着葡萄酒的成分和风味品质，在一定程度上能够提高葡萄酒产品风味的复杂性，它不仅能够代谢葡萄汁中的糖生成甘油、高级醇、各种挥发性化合物，还能够产生多种胞外酶影响葡萄酒的结构与风味品质。

Moreria等（2005）对葡萄汁有孢汉逊酵母（H. uvarum），季也蒙有孢汉逊酵母（H.guilliermondii）和酿酒酵母（S. cerevisiae）的纯种发酵及混合发酵进行了研究，发现三种菌株都具有相似乙醇产量和生产率，在混合发酵时，葡萄汁有孢汗生酵母（H. uvarum）和酿酒酵母（S. cerevisiae）皆会受季也蒙有孢汗逊酵母的影响，生长率降低。而季也蒙有孢汉逊酵母（H. guilliermondii）具有最高的生长力，同时也是最佳的2-乙酸苯乙酯和2-苯基乙醇的产生者，并且不受其它菌的影响，而这些物质可赋于葡萄酒果香与花香。在纯种发酵中，葡萄汁有孢汗生酵母（H. uvarum）生成最高量的含重硫化合物，季也蒙有孢汗逊酵母（H. guilliermondii）和酿酒酵母（S. cerevisiae）产生相似量的甲硫醇和2-甲基四氢噻吩-3-酮。但季也蒙有孢汗逊酵母（H.guilliermondii）能生相对成较高量的3-甲硫基丙酸，3-甲硫基乙酸丙酯。

传统的分类鉴定主要根据《酵母菌的分类研究学》（Kreger-van Rij，1998）第四版和Barnett等（2000）编著的《酵母菌：特征与鉴定》第三版的标准为依据。在对酵母进行鉴定前，须在形态学和生理学方面获得大量的鉴定特征。

WL(Wallerstein Laboratory Nutrient Agar)培养基鉴定方法相对于酵母菌的常规鉴定是一种新兴的、较快的鉴定方法。

大量研究表明葡萄酒自然发酵过程中出现的大多数典型酵母菌都可以基于其在WL培养基上生长所形成的菌落颜色及形态进行归类和区别，并对不同葡萄酒酵母在WL培养基上的菌落特征进行了详细的描述。特别是对于季也蒙有孢汗逊酵母的鉴定，在颜色形态方面有着相当详细具体的描述，具有很好的鉴别能力，可以避免生理生化分析的大量工作，对于酵母菌鉴定工作来说，是相当简便、快速并且十分有效和节俭的方法，由于WL培养基对菌种的生理状态依赖程度很大，菌种处于不同的生理状态可能会导致不同的培养结果，尤其是菌落的颜色。所以本试验作出相应的改进。

发明内容

本发明的目的在于为了解决上述的季也蒙有孢汗逊酵母菌在WL培养基上可能会出现不同的培养结果，而导致鉴定结果失败的现象，提供一种改进后的WL培养基即WL营养琼脂培养基分离纯化鉴定红葡萄酒生产原料或窖泥中季也蒙有孢汗逊酵母菌的方法。

本发明的技术方案

一种从红葡萄酒生产原料及窖泥中分离纯化鉴定季也蒙有孢汗逊酵母菌的方法，包括下述工艺步骤

（1）、从张裕红葡萄酒生产原料或窖泥中分离纯化鉴定季也蒙有孢汗逊酵母菌

①、在无菌条件下，取张裕红葡萄酒生产原料或窖泥8~15g，加入50~150mL浓度为0.9%的无菌生理盐水，浸泡15~25min后摇匀，用移液枪吸取0.05mL～0.2mL菌液，采用浓度为0.9%的生理盐水分别进行15~25倍、90~120倍、900~1200倍的梯度稀释，得三份待分离的稀释菌液;

②、在超净工作台上，取融化后并降温至约45~55℃的YPD固体培养基倒平板，每个平板中注入约15~25mL，按平板中所加入的融化后并降温至约45~55℃的YPD固体培养基的量计算，即每升融化后并降温至约45~55℃的YPD固体培养基加入0.1～100mg的抑制细菌的抗生素，待融化后并降温至约45~55℃的YPD固体培养基凝固后，取①所得的三份待分离的稀释菌液0.05mL～0.2mL分别加入到平板上，用无菌的三角刮铲将菌液均匀涂布于平板表面;

所述的YPD固体培养基配方：糖12～20g，多价蛋白酵母膏5～10g，蛋白胨12～20g，琼脂12～20g，水1000mL；其中所述的糖为白糖、红糖、蔗糖、冰糖、葡萄糖或蜂蜜中的一种或两种以上组成的混合物；

所述的抑制细菌的抗生素为青霉素、链霉素、氯霉素、红霉素或庆大霉素；

③、将步骤②制备好的平板置于25℃～30℃的培养箱中培养3～5天；

④、用接种环分别挑取每个平板上出现的10-30个形态具有区别的典型酵母菌菌落至另一空白的YPD固体培养基平板划线，将平板置于25℃～30℃的培养箱中培养3～5天；

⑤、重复步骤④直至菌落完全纯化，纯化菌株斜面保藏于4℃冰箱中备用；

（2）、将步骤（1）分离纯化获得的多个纯的酵母菌菌株每株分别划线接种于YPD固体培养基、YPD液体培养基和空白的WL营养琼脂培养基平板上，27~30℃下分别培养5-7天后，按照WL营养琼脂培养基形态学鉴定法结合《微生物分类学》的方法进行菌种鉴定，经鉴定最终获得季也蒙有孢汉逊酵母菌；

其中所述的YPD固体培养基配方：糖12～20g，多价蛋白酵母膏5～10g，蛋白胨12～20g，琼脂12～20g，水1000mL；其中所述的糖为白糖、红糖、蔗糖、冰糖、葡萄糖或蜂蜜中的一种或两种以上组成的混合物；

所述的YPD液体培养基配方，以每升计算，酵母浸粉1g、葡萄糖2g、蛋白胨2g、琼脂2g，余量以水补足；

所述的WL营养琼脂培养基，以每升计算，含有5.0g酵母浸粉、5.0g酸水解酪蛋白、50g葡萄糖、0.55g磷酸氢二钾、0.425g氯化钾、0.125g氯化钙、0.125g硫酸镁、0.022溴甲酚绿、17.0g琼脂,余量由去离子水补足。配制好的WL培养基，调节pH值为6.0，在120℃下灭菌20分钟。

同时利用上述的从红葡萄酒生产原料或窖泥中分离纯化季也蒙有孢汗逊酵母菌的方法还可同时获得葡萄汁有孢汉逊酵母菌、酿酒酵母菌和红酵母菌。

季也蒙有孢汗逊酵母菌、葡萄汁有孢汉逊酵母菌、酿酒酵母菌和红酵母菌，这4种酵母菌都是在葡萄酒中发现的，但在张裕红葡萄酒的生产原料或窖泥中，对这些酵母菌的分离和纯化是为了找出其中的各种菌与葡萄酒风味产生之间的直接关系。

上述最终所得的季也蒙有孢汗逊酵母菌（Hanseniaspora guilliermondii），其生长特征在于：在YPD固体培养基上3-5天菌落较大，圆形，乳白色凸起，边缘整齐，易挑起；在YPD液体培养基生长有沉淀。在WL营养琼脂培养基5-7天菌落中央深绿色泛白，四周浅黄色，菌落扁平，边缘有透明环。

本发明的有益效果

本发明的从红葡萄酒生产原料及窖泥中分离纯化季也蒙有孢汗逊酵母菌的方法，由于采用WL营养琼脂培养基并结合微生物学技术从红葡萄酒生产原料及窖泥中分离纯化出季也蒙有孢汗逊酵母菌菌株，以利于用纯菌株培养出具有独特愉快香气风格的红葡萄酒。

进一步，本发明的从红葡萄酒生产原料及窖泥中分离纯化季也蒙有孢汗逊酵母菌的方法，具有无杂菌污染、菌种易保藏、操作快速简便、产品质量稳定的特点。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进一步阐述，但并不限制本发明。

本发明所用的红葡萄酒生产原料或窖泥取自山东烟台张裕卡斯特酒庄。

本发明的各实施例所用的各种实验材料及试剂见下表：

名称	规格	来源
			WL营养琼脂	分析纯	上海江莱生物科技有限公司
多价蛋白胨酵母膏	分析纯	上海江莱生物科技有限公司
			葡萄糖	分析纯	国药集团化学试剂有限公司
蛋白胨鱼粉	分析纯	国药集团化学试剂有限公司
			琼脂粉	分析纯	国药集团化学试剂有限公司
氯化钠	分析纯	国药集团化学试剂有限公司
			无水乙醇	分析纯	国药集团化学试剂有限公司
氢氧化钠	分析纯	国药集团化学试剂有限公司

实施例1

从红葡萄酒生产原料或窖泥中分离纯化季也蒙有孢汗逊酵母菌的方法，具体包括如下步骤：

（1）、从张裕红葡萄酒生产发酵所用的葡萄中分离纯化季也蒙有孢汗逊酵母菌

①、取张裕红葡萄酒生产发酵所用的葡萄，在无菌条件下，取样品8~15g，加入50~150mL浓度为0.9%的无菌生理盐水，浸泡15~25min后摇匀，用移液枪吸取0.05mL～0.2mL菌液，采用浓度为0.9%生理盐水进行15~25倍、90~120倍、900~1200倍的梯度稀释，得三份稀释菌液;

②、在超净工作台上，取融化后并降温至约45~55℃的YPD固体培养基倒平板，每个平板中注入约15~25mL，按平板中所加入的融化后并降温至约45~55℃的YPD固体培养基的量计算，即每升融化后并降温至约45~55℃的YPD固体培养基加入0.1～100mg的抑制细菌的抗生素，待融化后并降温至约45~55℃的YPD固体培养基凝固后，取①中所得的三份待分离的稀释菌液0.05mL～0.2mL分别加入六个平板上，用无菌的三角刮铲将菌液均匀涂布于平板表面;

所用的YPD固体培养基配方：白糖15g，多价蛋白酵母膏7g，蛋白胨20g，琼脂20g，水1000mL；

③、将步骤②制备好的六个平板置于25℃～30℃的培养箱中培养3～5天；

④、用接种环分别挑取六个平板上出现的10-30个形态具有区别的典型酵母菌菌落至另一新配置的YPD固体培养基平板划线，将平板置于25℃～30℃的培养箱中培养3～5天；

所用的YPD固体培养基配方：白糖16g，多价蛋白酵母膏7g，蛋白胨16g，琼脂16g，水1000mL；

⑤、重复步骤④至少2次，直至菌落完全纯化，得到20个以上的酵母菌菌株；纯化菌株斜面保藏于4℃冰箱中备用；

（2）、将分离获得的多个纯的酵母菌菌株每株分别划线接种于YPD固体培养基、YPD液体培养基和WL营养琼脂培养基平板上，28℃培养5-7天后，按照WL营养琼脂培养基形态学鉴定法结合《微生物分类学》的方法进行菌种鉴定，经鉴定最终获得季也蒙有孢汉逊酵母菌（Hanseniaspora guilliermondii）；其在YPD固体培养基上3-5天菌落较大，圆形，乳白色凸起，边缘整齐，易挑起；在YPD液体培养基生长有沉淀；在WL营养琼脂培养基5-7天菌落中央深绿色泛白，四周浅黄色，菌落扁平，边缘有透明环；

其中所用的YPD固体培养基配方：白糖16g，多价蛋白酵母膏7g，蛋白胨16g，琼脂16g，水1000mL；

所用的YPD液体培养基配方，以每升计算，酵母浸粉1g、葡萄糖2g、蛋白胨2g、琼脂2g，余量以水补足；

所用的WL营养琼脂培养基，其组成及含量为：5.0g酵母浸粉、5.0g酸水解酪蛋白、50.0g葡萄糖、0.55g磷酸氢二钾、0.425g氯化钾、0.125g氯化钙、0.125g硫酸镁、0.022g溴甲酚绿、17.0g琼脂,水1000mL。

上述的从红葡萄酒生产原料或窖泥中分离纯化季也蒙有孢汗逊酵母菌的方法还可同时获得葡萄汁有孢汉逊酵母菌、酿酒酵母菌和红酵母菌。

上述的季也蒙有孢汗逊酵母菌、葡萄汁有孢汉逊酵母菌、酿酒酵母菌和红酵母菌，特别是季也蒙有孢汗逊酵母菌在张裕红葡萄酒的生产原料或窖泥中的分离纯化，对找出其与张裕红葡萄酒风味产生之间的直接关系提供了基础。

实施例2

步骤（1）中的②、④中所用的YPD固体培养基配方：葡萄糖12g，多价蛋白酵母膏5g，蛋白胨12g，琼脂12g，水1000mL，其它同实施例1。

实施例3

红葡萄酒生产原料或窖泥中分离纯化季也蒙有孢汗逊酵母菌的方法，具体包括如下步骤：

步骤（1）中的②、④中所用的YPD固体培养基配方：蜂蜜20g，多价蛋白酵母膏10g，蛋白胨20g，琼脂20g，水1000mL。其它同实施例1。

以上所述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种从红葡萄酒生产原料或窖泥中分离纯化鉴定季也蒙有孢汗逊酵母菌的方法，其特征在于包括如下步骤：

首先，利用YPD固体培养基从红葡萄酒生产原料或窖泥中分离纯化季也蒙有孢汗逊酵母菌；所述的YPD固体培养基配方：糖12～20g，多价蛋白酵母膏5～10g，蛋白胨12～20g，琼脂12～20g，水1000mL；

然后，将分离纯化获得的酵母菌菌株分别划线接种于空白的WL营养琼脂培养基平板上，27~30℃培养5-7天后，按照WL营养琼脂培养基形态学鉴定法结合《微生物分类学》的方法进行菌种鉴定，最终获得季也蒙有孢汉逊酵母菌；

其中所述的WL营养琼脂培养基，以每升计算，含有4.5~5.5g酵母浸粉、4.5~5.5g酸水解酪蛋白、45~55g葡萄糖、0.45~0.65g磷酸氢二钾、0.325~0.525g氯化钾、0.10~0.15g氯化钙、0.10~0.15g硫酸镁、0.020~0.024g溴甲酚绿、15~19g琼脂,余量由去离子水补足。

2.如权利要求1所述的一种从红葡萄酒生产原料或窖泥中分离纯化鉴定季也蒙有孢汗逊酵母菌的方法，其特征在于所述的利用YPD固体培养基从红葡萄酒生产原料或窖泥中分离纯化季也蒙有孢汗逊酵母菌，具体包括如下步骤：

①、在无菌条件下，取红葡萄酒生产原料或窖泥8~15g，加入50~150mL浓度为0.9%的无菌生理盐水，浸泡15~25min后摇匀，用移液枪吸取0.05mL～0.2mL菌液，采用浓度为0.9%的生理盐水分别进行15~25倍、90~120倍、900~1200倍的梯度稀释，得三份待分离的稀释菌液;

②、在超净工作台上，取融化后并降温至约45~55℃的YPD固体培养基倒平板，每个平板中注入约15~25mL，按平板中所加入的融化后并降温至约45~55℃的YPD固体培养基的量计算，即每升融化后并降温至约45~55℃的YPD固体培养基加入0.1～100mg的抑制细菌的抗生素，待融化后并降温至约45~55℃的YPD固体培养基凝固后，取①中所得的三份待分离的稀释菌液0.05mL～0.2mL分别加入平板上并涂布均匀；

④、用接种环分别挑取每个平板上出现的10-30个形态具有区别的典型酵母菌菌落至空白的YPD固体培养基平板上进行划线，然后置于25℃～30℃的培养箱中培养3～5天；

所述的YPD固体培养基配方：糖12～20g，多价蛋白酵母膏5～10g，蛋白胨12～20g，琼脂12～20g，水1000mL；

⑤、重复步骤④直至菌落完全纯化，纯化的菌株斜面保藏于4℃冰箱中备用。

3.如权利要求2所述的一种从红葡萄酒生产原料或窖泥中分离纯化鉴定季也蒙有孢汗逊酵母菌的方法，其特征在于所述的WL营养琼脂培养基，以每升计算，含有5.0g酵母浸粉、5.0g酸水解酪蛋白、50g葡萄糖、0.55g磷酸氢二钾、0.425g氯化钾、0.125g氯化钙、0.125g硫酸镁、0.022溴甲酚绿、17.0g琼脂,余量由去离子水补足。

4.如权利要求3所述的从红葡萄酒生产原料或窖泥中分离纯化鉴定季也蒙有孢汗逊酵母菌方法，其特征在于所述的红葡萄酒为张裕红葡萄酒。

5.如权利要求4所述的从红葡萄酒生产原料或窖泥中分离纯化鉴定季也蒙有孢汗逊酵母菌方法，其特征在于步骤②、④中所用的YPD固体培养基配方：糖12～20g，多价蛋白酵母膏5～10g，蛋白胨12～20g，琼脂12～20g，水1000mL。

6.如权利要求5所述的从红葡萄酒生产原料或窖泥中分离纯化鉴定季也蒙有孢汗逊酵母菌方法，其特征在于步骤②、④中所用的YPD固体培养基配方中所用的糖为白糖、红糖、葡萄糖、蔗糖、冰糖或蜂蜜中的一种或两种以上组成的混合物。

7.如权利要求6所述的从红葡萄酒生产原料或窖泥中分离纯化鉴定季也蒙有孢汗逊酵母菌方法，其特征在于步骤②中所述的抑制细菌的抗生素为青霉素、链霉素、氯霉素、红霉素或庆大霉素。

8.如权利要求1~7任一权利要求所述的从红葡萄酒生产原料或窖泥中分离纯化季也蒙有孢汗逊酵母菌方法中所用的WL营养琼脂培养基，其特征在于以每升计算，含有4.5~5.5g酵母侵粉、4.5~5.5g酸水解酪蛋白、45~55g葡萄糖、0.45~0.65g磷酸氢二钾、0.325~0.525g氯化钾、0.10~0.15g氯化钙、0.10~0.15g硫酸镁、0.020~0.024g溴甲酚绿、15~19g琼脂,余量由去离子水补足。

9.如权利要求8所述的WL营养琼脂培养基，其特征在于以每升计算，含有5.0g酵母浸粉、5.0g酸水解酪蛋白、50g葡萄糖、0.55g磷酸氢二钾、0.425g氯化钾、0.125g氯化钙、0.125g硫酸镁、0.022溴甲酚绿、17.0g琼脂,余量由去离子水补足。