CN109593660A - 一种基于孔板技术的红曲霉分离纯化方法 - Google Patents

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周康熙
刘志彬
张雯
张晨
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Abstract

本发明提供了一种基于孔板技术的红曲霉分离纯化方法，在装有酸醇米粉培养基的六孔板中对红曲霉进行扩培，而后在装有PDA的六孔板中进行涂布，提取形态各异的菌落进行24孔板点样复检。本发明所述的分离纯化方法，一方面极大地抑制了除红曲霉以外的大部分微生物的生长，减轻了杂菌的干扰，缩短了实验周期；另一方面基于孔板进行操作，其工作效率相比于传统的摇瓶‑平板体系显著提高，减少了工作量，能够更快地获得红曲霉。

Description

一种基于孔板技术的红曲霉分离纯化方法
技术领域
本发明属于红曲霉分离纯化技术领域，具体涉及一种基于孔板技术的红曲霉分离纯化方法。
背景技术
红曲霉是一种红曲黄酒酿造用菌，工业中也有应用红曲霉进行生产红曲色素、洛伐他汀、γ-氨基丁酸、麦角固醇的实例，可见红曲霉具有很大的实用价值。
目前红曲霉主要由红曲分离纯化而得。尽管红曲霉是红曲的优势菌，但红曲中还有其他微生物：酵母菌、青霉、黑曲霉、根霉菌、乳酸菌等，这使得红曲霉的分离纯化较为困难。
有些学者在对红曲霉进行分离纯化时，在真菌培养基中加入了抗生素以抑制细菌的生长，然而该培养配方难以避免其他真菌对红曲霉的干扰；有些学者在分离纯化培养基中加入了脱氧胆酸钠以抑制真菌菌丝体的蔓延，以此来减轻其他真菌对红曲霉的抑制，但此方法同样也抑制了红曲霉的生长。此外，传统的分离纯化操作基本以来摇瓶或平板，工作量大、试剂耗费也大，而若使用孔板来进行操作，则大大提高了工作效率。
为了既满足红曲霉的生长，又要抑制其他大部分微生物的干扰，本发明利用红曲霉耐受酒精、嗜好乳酸、易染大米的特性进行培养基的配置，而大部分微生物难以同时耐受乳酸和酒精而受到抑制，可以达到红曲霉分离纯化的目的。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术不足，提供一种基于孔板技术的红曲霉分离纯化方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于孔板技术的红曲霉分离纯化方法：将0.5~2.0g待分离样品分别加至每孔装有20~30mL液体酸醇米粉培养基的深六孔板中进行红曲霉扩培，30℃、200r/min扩培3d后在无菌超净台内各取100uL样品在PDA上进行涂布，30℃培养5d后挑取形态各异的菌落在含有鉴定培养基的24孔板中进行点样复检，24孔板第一至四行每行分别加1.5mL的CYA、G25N、MEA、PDA培养基，最后将复检后的红曲霉菌株在PDA斜面培养基上划线培养后4℃保藏。
其中，液体酸醇米粉培养基的配置方法为：无水葡萄糖5~15g、过40目的籼米粉15~30g、乳酸8~12mL，加去离子水定容至950mL，121℃灭菌20min。灭菌后再在无菌超净台中加入50mL无水乙醇，混匀，分装于深六孔板中。
PDA培养基的具体配置方法为：马铃薯削皮切块，取200g块状马铃薯加蒸馏水800mL沸水蒸煮20~30min，用八层纱布过滤残渣，取滤液加20g葡萄糖和17~20g琼脂，煮沸冷却后定容至1L,121℃20min灭菌。
CYA培养基的配置方法为：硝酸钠3g、磷酸氢二钾1g、氯化钾0.5g、七水合硫酸镁0.5g、七水合硫酸亚铁0.01g、酵母提取粉5.0g、蔗糖30g、17~20g琼脂，定容至1L后121℃20min灭菌。
G25N培养基的配置方法为：CYA培养基中加入25wt.%的甘油。
MEA培养基的配置方法为：酵母提取粉20g、蛋白胨10g、葡萄糖20g、17~20g琼脂，定容至1L后121℃20min灭菌。
本发明的有益效果在于：
（1）以深六孔板替代摇瓶、以浅六孔板替代平板，不仅节省培养基原料，而且摇床及培养基的使用效率提高了6倍，减少了操作的工作量，增加了同批次可分离纯化的样品数；
（2）利用红曲霉耐受酒精、嗜好乳酸、易染大米的特性而设计选择性培养基，由于其他大部分微生物难以同时耐受乳酸和酒精，可大大降低其他微生物对红曲霉分离纯化的干扰；
（3）挑取PDA上形状各异的菌落进行24孔板点样复检，不仅节约了鉴定成本，还能减少单一培养基对挑选不同菌株的误判。
附图说明
图1为红曲米在深六孔板中的培养图。
图2为发酵液在浅六孔板中的涂布结果图。
图3为不同红曲霉在24孔板中点样复检图。
图4为传统分离纯化方法效果图。
图5为米粉培养基分离纯化方法效果图。
图6为酸醇米粉培养基分离纯化方法效果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不仅仅限于这些实施例。
实施例1
将1.0g待分离样品加至每孔装有25mL液体酸醇米粉培养基的深六孔板中进行红曲霉扩培（如图1）， 30℃、200r/min扩培3d后在无菌超净台内各取100uL样品在PDA上进行涂布，30℃培养5d后菌落图如图2，培养后挑取形态各异的菌落在含有鉴定培养基的24孔板中进行点样复检，24孔板第一至四行每行分别加1.5mL的CYA、G25N、MEA、PDA培养基，点样后30℃培养5d后如图3，最后将复检后的红曲霉菌株在PDA斜面培养基上划线培养后4℃保藏。
其中，液体酸醇米粉培养基的配置方法为：无水葡萄糖10g、过40目的籼米粉25g、乳酸10mL，加去离子水定容至950mL，121℃灭菌20min。灭菌后再在无菌超净台中加入50mL无水乙醇，混匀，分装于深六孔板中。
PDA培养基的具体配置方法为：马铃薯削皮切块，取200g块状马铃薯加蒸馏水800mL沸水蒸煮25min，用八层纱布过滤残渣，取滤液加20g葡萄糖和18g琼脂，煮沸冷却后定容至1L,121℃20min灭菌。
CYA培养基的配置方法为：硝酸钠3g、磷酸氢二钾1g、氯化钾0.5g、七水合硫酸镁0.5g、七水合硫酸亚铁0.01g、酵母提取粉5.0g、蔗糖30g、18g琼脂，定容至1L后121℃20min灭菌。
G25N培养基的配置方法为：CYA培养基中加入25wt%的甘油。
MEA培养基的配置方法为：酵母提取粉20g、蛋白胨10g、葡萄糖20g、18g琼脂，定容至1L后121℃20min灭菌。
本发明的效果对比如下：
传统的分离纯化方法为：取0.5g红曲米于10mL生理盐水中振荡冲洗30s，取100uL冲洗液于PDA培养基中进行涂布（如图4），由于红曲米中含有杂菌，该方法容易造成杂菌早于红曲霉形成优势菌的情况，不利于红曲霉的分离纯化。
使用米粉培养基对红曲霉进行分离纯化：将0.5g红曲米放置于30mL 含15g/L米粉的培养基中进行30℃培养3d，培养后取发酵液进行涂布。图5结果表明，红曲霉易于利用大米，容易在培养基中生长而形成优势菌，杂菌也同时存在。杂菌对红曲霉的分离纯化干扰较小。
使用酸醇米粉培养基对红曲霉进行分离纯化的效果如图6所示，由于乳酸和酒精的抑菌作用，杂菌基本被抑制，平板中只能见到红曲霉，表明该方法最实用于红曲霉的分离纯化。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (7)

1.一种基于孔板技术的红曲霉分离纯化方法，其特征在于：将0.5~2.0g待分离样品分别加至每孔装有20~30mL液体酸醇米粉培养基的深六孔板中进行红曲霉扩培，30℃、200r/min扩培3d后在无菌超净台内各取100uL样品在PDA上进行涂布，30℃培养5d后挑取形态各异的菌落在含有鉴定培养基的24孔板中进行点样复检，最后将复检后的红曲霉菌株在PDA斜面培养基上划线培养后4℃保藏。
2.根据权利要求1所述的一种基于孔板技术的红曲霉分离纯化方法，其特征在于：所述液体酸醇米粉培养基的具体配置方法为：无水葡萄糖5~15g、过40目的籼米粉15~30g、乳酸8~12mL，加去离子水定容至950mL，121℃灭菌20min；灭菌后再在无菌超净台中加入50mL无水乙醇，混匀，待用。
3.根据权利要求1所述的一种基于孔板技术的红曲霉分离纯化方法，其特征在于：所述PDA培养基的具体配置方法为：马铃薯削皮切块，取200g块状马铃薯加蒸馏水800mL沸水蒸煮20~30min，用八层纱布过滤残渣，取滤液加20g葡萄糖和17~20g琼脂，煮沸冷却后定容至1L,121℃20min灭菌。
4.根据权利要求1所述的一种基于孔板技术的红曲霉分离纯化方法，其特征在于：菌落的复检方法为：在24孔板中加入鉴定培养基，每孔1.5mL，24个孔共四行六列，一至四行培养基分别为CYA、G25N、MEA、PDA培养基。
5.根据权利要求4所述的一种基于孔板技术的红曲霉分离纯化方法，其特征在于：CYA培养基的配置方法为：硝酸钠3g、磷酸氢二钾1g、氯化钾0.5g、七水合硫酸镁0.5g、七水合硫酸亚铁0.01g、酵母提取粉5.0g、蔗糖30g、17~20g琼脂，定容至1L后121℃20min灭菌。
6.根据权利要求4所述的一种基于孔板技术的红曲霉分离纯化方法，其特征在于：G25N培养基的配置方法为：CYA培养基中加入25wt.%的甘油。
7.根据权利要求4所述的一种基于孔板技术的红曲霉分离纯化方法，其特征在于：MEA培养基的配置方法为：酵母提取粉20g、蛋白胨10g、葡萄糖20g、17~20g琼脂，定容至1L后121℃20min灭菌。
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