CN109007497A - 利用食用菌发酵增加饮料功能多糖的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用食用菌发酵增加饮料功能多糖的制备方法，按以下步骤进行：选取成熟水果制备汁状或粉状原料；以大豆蛋白胨，加入煮沸的纯化水制备培养基；灭菌；在超净工作台接入5％液体柴达木大肥菇菌种得到培养液；培养液放入恒温振荡培养器培养；抽滤；往发酵原液加入纯净水、糖和柠檬酸调配食用菌源发酵饮料。本发明以液体柴达木大肥菇菌种为食用菌源，分别以枸杞、沙棘、青海香梨作为基础原料，通过培养基制备、灭菌、接菌发酵、培养、抽滤、勾兑与调配等制备流程，分别制得食用菌枸杞发酵饮料、食用菌发酵沙棘饮料和食用菌梨汁发酵饮料，饮料具有味道鲜美、营养丰富、含多种氨基酸、多种矿物质和真菌多糖，具有天然的色、香、味。

Description

利用食用菌发酵增加饮料功能多糖的制备方法
技术领域
本发明涉及生物食品技术领域，具体涉及一种以食用菌源为基础的发酵饮料的制备方法。
背景技术
随着人们健康意识的加强，饮料市场随之变化，开始向碳酸饮料、含乳饮料、果蔬汁饮料、果酒饮料、果醋饮料、茶饮料等多元发展，发酵饮料也越来越受到人们的喜爱。发酵饮料的营养健康性体现在其发酵过程中益生菌的加入或功能性成分(如小分子肽、抗氧化活性物质、微生物代谢产物等)的变化上。
食用菌发酵饮料在近年来随着消费者对营养及其疗效的追捧，发展迅速，根据食用菌菌丝体的营养一般要高于子实体这一特点，有许多科学工作者对食用真菌深层发酵进行了研究，已经开发的有香菇保健饮料，其技术特点是利用发酵法先得到食用菌的菌丝体并浸提其有效成分或滤取发酵后的原料液，配合辅料制成。李磊等人的松乳菇发酵生产松乳菇菌丝体制成松乳菇饮料，方苏等人通过虫草菌种液体发酵，利用胞外有效营养物质，对分离后的发酵液调制得到美味的营养保健饮料，均获得了较好的影响。
枸杞味甘、性平，富含枸杞多糖、蛋白质、微量元素、维生素、甜菜碱、矿物质、黄酮类等多种活性成分，枸杞中的VC含量比橙子高，β-胡萝卜素含量比胡萝卜高，是常用的营养滋补的中药材之一，具有补肾养肝、润肺明目之功效,现代药理研究表明枸杞拥有增强机体免疫力、抗肿瘤、抗衰老、降血脂和降血糖等诸多功效。据中科院西北高原生物研究所测定，柴达木枸杞含多种维生素和人体所必需的18种氨基酸，其中有利于人体健康和智力开发的有机硒、锗、锌的含量高。
沙棘为多年生落叶灌木、小乔木或乔木，是主要分布于青海省的药食同源性植物。现代药理研究表明，沙棘果实中的维生素类的研究报道较多，主要有维生素A、维生素C、维生素E、维生素F、维生素K1、维生素P、维生素B1、维生素B2、维生素B12等。此外，还富含多种生物活性物质、人体必需氨基酸和微量元素。例如S Geetha等在研究沙棘的抗氧化活性及免疫调节功能时，发现沙棘果有很明显的抗氧化活性及细胞保护功能，说明了沙棘具有十分重要的食用和药用价值。
青海香梨是新疆库尔勒香梨的引种品，具有芳香味，风味优良，营养价值高，有润肺、凉心、消痰、止咳等作用，是一种食疗佳品，且含许多人体所必需的营养成分，如蛋白质、脂肪、糖、维生素、矿物质等深受到国内外客商及广大消费者的青睐。虽然青海香梨相对库尔勒香梨营养成分含量较低，但是其中的营养成分和库尔勒香梨相同。
柴达木大肥菇是青藏高原柴达木盆地特殊生态环境条件下的一种分类十分重要的野生大型食用真菌。因其生长在恶劣的环境下使其具有子实体巨大、抗逆性强、地下结实、低温出菇等特点，为大肥蘑菇中的特殊菌种。柴达木大肥菇子实体含粗蛋白24.0％、粗脂肪2.10％、粗纤维17.32％、碳水化合物34.91％、灰分13.65％，具有抗肿瘤、耐疲劳、降血糖、抗缺氧等功效。
然而，目前却没有公开过基于枸杞、沙棘、青海香梨、柴达木大肥菇菌种等青海独有的一些原料制备食用菌源发酵饮料的技术方案
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可使柴达木大肥菇纯多糖的纯化程度得到改善和提高的利用食用菌发酵增加饮料功能多糖的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种利用食用菌发酵增加饮料功能多糖的制备方法，其特征在于：处理流程为：水果添加原料制备→培养基制备→灭菌→接菌发酵→发酵培养→抽滤→发酵原液勾兑与调配；
具体制备过程按以下步骤进行：
1)水果添加原料制备：选取成熟水果果实制备汁状原料或粉状原料；
2)培养基制备：以0.5％的大豆蛋白胨，加入煮沸的纯化水制备好培养基，将水果添加原料与培养基混合一起装入灭菌瓶内；
3)灭菌：将灭菌瓶封口，然后在高压灭菌锅中以超过100℃的温度灭菌；
4)接菌发酵：在超净工作台接入5％液体柴达木大肥菇菌种得到培养液；
5)发酵培养：将培养液放入恒温振荡培养器中室温培养，125rpm培养5天；
6)抽滤：使用真空泵垫两层滤进行抽滤，得到上清液为发酵原液，冷藏，备用；
7)发酵原液勾兑与调配：以发酵原液为基础原液，在发酵原液中加入纯净水、糖和柠檬酸进行调配食用菌源发酵饮料。
优选地，所述水果添加原料为枸杞汁；挑选清洗过的枸杞为原料，在枸杞中以1：5加入蒸馏水，充分浸泡4h，用打浆机打浆，后用四层纱布过滤，静置澄清制成枸杞汁，并置于冰箱避光冷藏待用；在培养基中加入0.05％维生素B护色，保证产品色泽鲜亮；将培养基与枸杞汁按比例混合，添加适量白砂糖，再经115℃灭菌15min、接菌发酵、28℃发酵培养、抽滤、发酵原液勾兑与调配后制得食用菌枸杞发酵饮料。
或者，所述水果添加原料为沙棘果粉，以4％沙棘果粉与0.5％大豆蛋白胨、蒸馏水制作沙棘果粉培养液，并用0.5％氢氧化钠溶液调节pH至4.7±0.1，115℃灭菌15min，按5％(v,v)接种量接种液体柴达木大肥菇菌种，再经25℃发酵培养、抽滤、发酵原液勾兑与调配后制得食用菌发酵沙棘饮料。
或者，所述水果添加原料为青海香梨梨汁，去除青海香梨果实中的皮和籽制取梨原汁的榨汁，将梨汁培养基pH调节至5.6±0.2，115℃灭菌15min，按5％(v,v)接种量接种液体柴达木大肥菇菌种，再经25℃发酵培养、抽滤、发酵原液勾兑与调配后制得食用菌梨汁发酵饮料。
优选地，在制作枸杞发酵原液配方时，枸杞汁的量为9％，白砂糖的量为7.5％；在制作食用菌枸杞发酵饮料时，枸杞汁的添加量为3％、白砂糖为2.5％、柠檬酸为3％。
优选地，在制作沙棘发酵原液配方时，沙棘果粉的量为4％，白砂糖的量也为4％；在制作食用菌发酵沙棘饮料时，沙棘果粉的添加量为0.4％、白砂糖为0.9％，柠檬酸为0.6％。
优选地，在制作梨汁发酵原液配方时，梨汁稀释2倍，白砂糖的添加量为6％；在制作食用菌梨汁发酵饮料时，纯净水的添加量为75％、柠檬酸为0.2％，白砂糖为1.5％。
本发明以液体柴达木大肥菇菌种为食用菌源，分别以枸杞、沙棘、青海香梨作为基础原料，通过培养基制备、灭菌、接菌发酵、培养、抽滤、勾兑与调配等制备流程，分别制得食用菌枸杞发酵饮料、食用菌发酵沙棘饮料和食用菌梨汁发酵饮料。
其中枸杞汁可作为食用菌的保存基质及活菌的营养促进剂，让菌种更好的生长，获得更加鲜美、营养丰富的发酵原液，又能让枸杞饮料的风味更佳。而且食用菌发酵过程中能产生风味物质，使得饮料的风味加鲜美，同时发酵过程中能产生很多对人体有益的活性成分。
而以沙棘果粉为主要原料的沙棘发酵饮料营养丰富，含多种氨基酸，并含多种矿物质元素和真菌多糖，且无需添加色素和增香物质，具有天然的色和香味、保健、营养为一体，符合人们在青海这一特殊地理环境条件下对抗缺氧食品和饮料的需求。
青海香梨发酵果汁饮料通过对果汁发酵，最大限度地保留水果营养,有独特的发酵果蔬风味，且发酵过程中产生大量氨基酸、有机酸等营养物质，不仅让消费者可以更好地吸收青海香梨的营养物质，而且有助于解决果农增产不增收的现实问题，提高产品附加值。
附图说明
图1为不同枸杞汁浓度对多糖浓度的影响曲线图；
图2为枸杞汁浓度对生物量的影响曲线图；
图3为白砂糖加量对发酵原液多糖及感官的影响图；
图4为加糖浓度对发酵原液多糖浓度的影响曲线图；
图5为不同加糖量发酵原液发酵产生生物量的影响曲线图
图6为葡萄糖为对照品的标准曲线图；
图7为沙棘果粉添加量确定实验的生物量的影响数据图；
图8为沙棘果粉添加量确定实验的多糖浓度的影响曲线图；
图9为沙棘果粉添加量确定实验的多糖浓度差值的影响曲线图；
图10为白砂糖添加量确定实验的生物量的影响数据图
图11为白砂糖添加量确定实验的多糖浓度的影响曲线图；
图12为葡萄糖为对照品的标准曲线图；
图13为梨汁稀释倍数对各组分菌丝体质量影响的对比图(高柱为湿重，低柱为干柱)；
图14为梨汁稀释倍数对各组分多糖浓度的影响曲线图；
图15为白糖梯度添加对各组分菌丝体质量的影响曲线图(高柱为湿重，低柱为干柱)；
图16为白糖梯度添加对空白组与实验组多糖浓度的影响曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但这并不意味着对本发明的任何限制。
所述利用食用菌发酵增加饮料功能多糖的制备方法的基本处理流程为：水果添加原料制备→培养基制备→灭菌→接菌发酵→发酵培养→抽滤→发酵原液勾兑与调配；
具体制备过程按以下步骤进行：
1)水果添加原料制备：选取成熟水果果实制备汁状原料或粉状原料；
2)培养基制备：以0.5％的大豆蛋白胨，加入煮沸的纯化水制备好培养基，将水果添加原料与培养基混合一起装入灭菌瓶内；
3)灭菌：将灭菌瓶封口，然后在高压灭菌锅中以超过100℃的温度灭菌；
4)接菌发酵：在超净工作台接入5％液体柴达木大肥菇菌种得到培养液；
5)发酵培养：将培养液放入恒温振荡培养器中室温培养，125rpm培养5天；
6)抽滤：使用真空泵垫两层滤进行抽滤，得到上清液为发酵原液，冷藏，备用；
7)发酵原液勾兑与调配：以发酵原液为基础原液，在发酵原液中加入纯净水、糖和柠檬酸进行调配食用菌源发酵饮料。
在此基础上确定以下三个实施例：
实施例1，食用发酵菌枸杞饮料制备
一、材料
1原料
青海枸杞(产地：青海柴达木盆地)
柴达木大肥菇液体菌种(青海大学农牧楼实验室提供)
纯净水
2试剂
白砂糖为市售；柠檬酸，天津市致远化学试剂有限公司；大豆蛋白胨，北京奥博星生物技术有限责任公司；95％浓硫酸为分析纯，天津百世化工有限公司；80％苯酚为分析纯，北京鼎国生物技术公司
3主要仪器
DHG-9070A电热鼓风干燥箱，上海-恒科技有限公司；THZ-82恒温振荡培养箱，常州国华电器有限公司；SW-CJ-2D超净工作台，江苏华东设备有限公司；SHZ-111循环水真空泵，上海亚荣生化仪器厂；721N可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司制造；LDZM-60KCS立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；F2004电子天平，历辰科技。
二、方法
1、发酵原液的制备
枸杞汁：即以挑选清洗过的枸杞为原料，在枸杞中以1：5加入蒸馏水，充分浸泡4h,用打浆机打浆，后用四层纱布过滤，静置澄清，并置于冰箱避光冷藏待用，作为枸杞汁。
培养基：秤取大豆蛋白胨0.5％，加入煮沸的纯化水中，为后续发酵过程提供N源，因为高温灭菌会使枸杞中的色素发生褐变，颜色变暗，不利于产品品质，故加入0.05％维生素B护色，保证产品色泽鲜亮。置于干净的容器中放凉待用。
加糖混合：将培养基与枸杞汁按比例混合，添加适量的白砂糖提供给菌种C源，即预实验。pH自然，并用糖度计测定糖度，每个样测三次平行。然后在250mL锥形瓶装100mL封口在高压灭菌锅中灭菌。灭菌条件115℃，15min。
接菌发酵：在超净工作台接入5％液体柴达木大肥菇菌。将培养液放入恒温振荡培养器中培养，在28℃，125rpm培养5d。
抽滤：使用真空泵垫两层滤纸进行抽滤,所得发酵原液进行静置备用。
1、发酵原液的勾兑与调配
加辅料调配：以发酵液添加量,蔗糖添加量,柠檬酸添加量为因素,以感官评分为指标,进行饮料的调配,通过正交实验和单因素分析,确定发酵原液、蔗糖和柠檬酸的最佳添加量。使该饮料在酸甜程度上更适口，风味更协调。
三、测定
1、多糖含量的测定：苯酚-硫酸法
(1)制定标准曲线：精确配制0.1mg/mL的葡萄糖标准溶液，后分别配成0，0.005，0.01，0.015，0.02，0.025，0.03，0.035，0.04，0.045，0.05mg/mL不同浓度梯度的葡萄糖溶液，加入0.5mL 6％苯酚溶液，5mL浓硫酸在沸水浴中加热15min后，取出并立即放入流动水中冷却，用紫外分光光度计测定各样液在490nm处吸光度，每组浓度做三次平行试验。以葡萄糖含量为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。
2、测定待测样品多糖含量：取预处理后的枸杞发酵液0.1mL于试管中，加入0.9mL蒸馏水、0.5mL6％苯酚溶液、5mL浓硫酸，至沸水浴中加热15min后，取出放入流动水中迅速冷却，用紫外分光光度计测定各试管在490nm处的吸光值，通过标准曲线方程计算多糖含量。
式中：C：多糖浓度(mg/mL)；A：样品液的平均吸光度值；n：样品稀释倍数
3、pH的测定：用精密pH计测定。
4、总糖度的测定：用手持式折光光度计测定,在测糖度前先用纯化水冲洗玻璃表面，并用吸水纸擦干，后用纯化水调零，测待测液时在玻璃面上滴加一滴样液，拿镜筒朝光线亮处观测。视野中明暗交界处刻度即为所测糖度，每个样测三次。
5、生物量的测定：将枸杞发酵原液抽滤获得的菌丝体样品置于恒温干燥箱(60-80℃)中烘干后放冷称重，该质量占发酵液体积即为所测发酵液的生物量，以g/L表示。
6、料的感官评价方法：(1)色泽、组织形态：取适量样品置于洁净烧杯中，在自然光下观察色泽和组织状态；
表1感官评分标准
注：从发酵饮料的风味(40分)形态(30分)颜色(20分)口味(10分)请10位同学分别品尝，得分高的为较优配方。
四、实验检验
单因素试验设计和发酵特性正交试验设计
1、发酵原液的制备实验：以枸杞汁的用量(0％、3％、6％、9％、12％)、蔗糖用量(5％、7.5％、10％)为影响因素以多糖浓度和生物量及感官评价为指标，进行预实验确定最佳的培养基配方。
2、饮料调配单因素实验：在发酵原液的基础上以枸杞汁的量，蔗糖用量和柠檬酸用量为单因素以感官评分为指标进行单因素实验。确定枸杞汁用量、蔗糖用量、柠檬酸用量的最佳配方。
3、正交试验：根据单因素实验所得到的最优配比，以多糖浓度和感官评分为指标设计正交试验，对饮料的最佳调配方案进行具体优化。
五、结果分析
1、枸杞汁添加量对发酵效果的影响
以枸杞汁添加量(0％、3％、6％、9％、12％)，白砂糖添加量6％，食用菌接种量为5％，培养温度28℃条件下置恒温震荡培养箱中培养，每组做两个平行，同时做空白实验。观察菌丝球的生长状况。对发酵完成后对各组抽滤得到的发酵原液测多糖浓度及生物量，以多糖浓度和生物量确定最终枸杞汁加量。并通过观察菌丝体生长状态及pH和糖度变化确定最佳发酵时间。结果如图1所示。
不同浓度的枸杞汁在接食用菌液体发酵后多糖浓度随着菌丝体的不断生长大量积累，图1反应了在不同浓度的发酵原液中，多糖浓度随着枸杞汁浓度的加大而不断升高，而且接了食用菌发酵后，该体系中的多糖浓度比未接菌发酵的要高出很多，这也验证了通过食用菌液体发酵可以产生大量食用菌多糖的报道，增加该饮料的营养性，保健性。图中数据表明枸杞汁浓度在6％、9％、12％时多糖浓度较高，并且在9％、12％的枸杞汁浓度与同浓度未进行发酵的相比多糖浓度差较大。说明发酵过程中该枸杞汁浓度范围内产生较多的多糖，菌丝体生长良好。
从图2不同枸杞汁浓度对生物量的影响可知，生物量随着加入的枸杞汁的浓度增加相应的增大，这是因为加入的枸杞汁浓度越高，其中能供给食用菌发酵所需的营养物质越丰富。在6％-12％之间生物量相差较大，说明菌丝体在枸杞汁量浓度对食用菌发酵效果影响较大，即在9％和12％浓度时菌丝体生长较好，另外在实验过程中发现加入了9％的枸杞汁后发酵获得的发酵原液感官评价最好，这主要与发酵液的色泽及风味有关。其中添加了12％的枸杞汁发酵液色泽较深，颜色成暗黄色，而9％的色泽成亮橙黄色，有淡淡的枸杞风味。
综合考虑多糖浓度、生物量、感官确定发酵体系中枸杞汁的加量为9％。另外菌丝球在恒温震荡培养第二天开始生长，菌丝球较大，随着培养时间延长，到第五天菌丝球密集生长，形态较小液体较为浓稠，且液体色泽较好，到第六天的发酵原液色泽暗淡，液体过于黏稠。同时从发酵原液pH及糖度测定发现到第五天变化明显，说明此时食用菌生长处于旺盛期，产品品质最好。pH随着发酵进行，逐渐降低，糖度也随着食用菌生长利用而上什，因此确定发酵时间为5天较为合适。
2、白砂糖添加量对发酵效果的影响
以接入5％的食用菌，加入9％枸杞汁，于250mL锥形瓶中装100mL，并添加5％、7.5％、10％的白砂糖为因素制作发酵原液，每组设2个平行。在28℃下恒温震荡培养五天，因为制作的是饮料，因此结合饮料的感官对产品的影响，从抽滤后发酵原液的色泽、组织状态、风味感官特性和多糖浓度为指标，确定白砂糖添加量。
表2不同加糖量对发酵原液感官的影响
加入的白砂糖不仅可以供给食用菌发酵所需的能量，而且能使发酵液中的白砂糖转化为对人体有益的多糖，从柱状图3可以看出，白砂糖加量为7.5％时，获得的感官评分最高。图4中显示发酵液中的多糖浓度与加入白砂糖加量10％的差不多，均达到30mg/mL以上。
用循环式真空泵抽滤各组发酵液得到发酵原液，并将抽滤得到的菌丝体烘干得到发酵过程中产生的生物量进行比较，结果如图5所示。
从上表2中可知，当加糖量为7.5％时，生物量最大，说明在加糖量为7.5％发酵过程中发酵所需条件更适于菌丝体的生长，同时与前一次实验中枸杞汁加量9％，加糖6％相比发酵产生的菌丝体更多，因此也说明加糖量对发酵体系中生物量存在较大的影响。
综合考虑多糖浓度及感官评分，确定以枸杞汁的加量为9％，加白砂糖7.5％为发酵原液的配方，并在此发酵原液的基础上以枸杞汁，白砂糖，柠檬酸和枸杞汁加量为单因素进行饮料配方的优化调配。
3、配方的优选
优良的配方使饮料具有良好的口感、风味，组织状态和色泽，本研究初步筛选出数个较优的配比，然后采用3因素3水平的正交试验寻找最佳配方。
(1)先取一部分发酵原液，再次加入适量的白砂糖，使口感既不会过甜，覆盖发酵原液本身的口感，又不让发酵液口味太平淡的情况下，暂定一个白砂糖加入量，在此基础上通过改变柠檬酸的添加量和枸杞汁加量以感官评分为指标确定调配较优配方。结果如表3、表4。
表3枸杞发酵型饮料调配单因素试验因素与水平
表4枸杞发酵型饮料调配单因素试验结果
从以上的数据得出食用菌发酵枸杞饮料获得的最优方案为A3B3C4，即白砂糖加量在3.0％柠檬酸加量在0.3％、枸杞汁加量2.5％时配方感官评分较高。受到群体的喜欢。并在此基础上进行正交试验，获得最优配方。
表5枸杞发酵型饮料调配优化正交试验因素水平表
表6枸杞发酵型饮料调配优化正交试验因素结果表
从表5、表6分析可知，枸杞汁的添加量影响最大，其次为白砂糖，柠檬酸影响最小。最优配方为D2E2F3,即枸杞汁的添加量为3％时，白砂糖添加量为2.5％,柠檬酸的添加量为3％。经调配的枸杞发酵饮料不仅酸甜适口，口感协调，而且颜色澄清透明，成橙黄色，风味独特，既具有发酵饮料特殊的香气，又具有枸杞的自然香味。
实施例2，食用菌发酵沙棘饮料制备
一、材料
1、原材料
表7
2、仪器
表8
3、试剂
表9
二、方法
1、工艺流程
(1)沙棘果粉培养液的制作：4％沙棘果粉，0.5％大豆蛋白胨，蒸馏水，分别有4％、6％、8％加糖水平，每个实验3个平行。在已灭菌250mL锥形瓶装入100mL液体培养基，并用0.5％氢氧化钠溶液调节pH至4.7±0.1，灭菌，条件为115℃，15min；
(2)接种液体菌种：按5％(v,v)接种量；
(3)发酵培养：将沙棘培养液放入恒温振荡培养器中培养5d，25℃，120rpm；
(4)抽滤：使用真空泵垫两层滤进行抽滤，上清液(发酵液)冷藏，备用；
(5)勾兑与调配：按一定比例加入沙棘果粉、柠檬酸、白砂糖进行饮料配方的研究。
三、测定
1、pH的测定
用蒸馏水冲洗电极头部，用滤纸条吸干。将样品倒入小烧杯中，将电极浸入样液中，轻轻摇动小烧杯，当示数稳定时，读数即为样液的pH。测试完毕，将电极冲洗干净，放入保护液中。每次做三组平行。
2、糖度的测定
打开手持式折光仪盖板(a)，用干净的纱布或卷纸小心擦干棱镜玻璃面。在棱镜玻璃面上滴2滴蒸馏水，盖上盖板。于水平状态，从接眼部(b)处观察，检查视野中明暗交界线是否处在刻度的零线上。若与零线不重合，则旋动刻度调节螺旋，使分界线面刚好落在零线上。打开盖板，用纱布或卷纸将水擦干，然后如上法在棱镜玻璃面上滴2滴果蔬汁，进行观测，读取视野中明暗交界线上的刻度，糖的大致含量。重复三次并记录数据。
3、多糖浓度的测定
a、制定标准曲线：精确配制0.1mg/mL的葡萄糖标准溶液，后分别配成0，0.005，0.01，0.015，0.02，0.025，0.03，0.035，0.04，0.045，0.05mg/mL不同浓度梯度的葡萄糖溶液，加入0.5mL6％苯酚溶液，5mL浓硫酸在沸水浴中加热15min后，取出并立即放入流动水中冷却，用紫外分光光度计测定各样液在490nm处吸光度，每组浓度做三次平行试验。以葡萄糖含量为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线如图6所示。
b、测定待测样品多糖含量：取预处理后的沙棘发酵液1mL于试管中，加入1mL蒸馏水、0.5mL6％苯酚溶液、5mL浓硫酸，至沸水浴中加热15min后，取出放入流动水中迅速冷却，用紫外分光光度计测定各试管在490nm处的吸光值，通过标准曲线方程计算多糖含量。
4、生物量的测定
称重法：将抽滤获得的菌丝体样品于已烘干称重的小烧杯中,再放入105℃的烘箱中烘干、冷却和称重,即可计算出每毫升发酵液里生物量的干重,结果以g/mL表示。
5、感官评定
选择30名评价员，并让30名评价员对饮料的色泽、表观状态、香气、口感等指标进行描述，根据评价员对各类指标的描述情况，判断他们的敏感度、识别力、记忆力、表达力，选出12名初级感官评价员。然后，根据他们对各项指标理解能力的高低，选出10名优秀饮料感官评价员，并将此10位训练好的评价员组成感官评定小组。样品采用随机编码，常温下进行品评。鉴别时需避免混杂外来气味并不断漱口以保持口腔清爽。感官评分标准如表10所示。
表10沙棘发酵型饮料感官评分标准
四、实验检验
1沙棘果粉发酵原液配方的确定
以沙棘果粉用量、蔗糖用量为调节因素，生物量的测定和多糖含量的测定为指标进行预实验，确定最佳的培养基配方。
(1)沙棘果粉添加量的确定：沙棘粉(三个水平：5％、8％、10％)、大豆蛋白胨0.5％、白砂糖15％、混合并搅匀原料，加蒸馏水至100mL，调节pH至4.7±0.1制得培养基。每个水平3个平行。均以不接菌为对照组。对培养液接菌发酵培养后的以下指标进行检测：多糖浓度、生物量。通过本次实验，以多糖浓度和生物量为指标确定了配方中为指标确定了沙棘果粉的添加量。
(2)白砂糖添加量的确定：以最佳沙棘果粉的添加量为基础进行实验来确定配方中白砂糖的添加量。配方及方法：沙棘粉8％、大豆蛋白胨0.5％、白砂糖(三个水平：4％、6％、8％)、混合并搅匀原料，加蒸馏水至100mL，调节pH至4.7±0.1制得培养基。每个水平3个平行，均以不接菌为对照组。对培养液接菌发酵培养后的以下指标进行检测：多糖浓度、生物量。通过本次实验，以多糖浓度和生物量为指标确定了配方中白砂糖的添加量。
2沙棘饮料勾兑与调配实验
将培养发酵后的发酵原液制备好后进行调配。按不同比例加入沙棘果粉、白砂糖、柠檬酸混合搅匀至无固体颗粒为止。以感官评分为指标确定最佳调配比例。
(1)单因素实验
以沙棘果粉用量、蔗糖用量和柠檬酸用量为因素，经文献查询取3个水平，以多糖含量和感官评分为指标进行单因素实验。确定沙棘果粉、蔗糖、柠檬酸用量的最佳配比。如表11所示。
表11沙棘发酵型饮料调配单因素实验因素水平表
(2)正交实验
根据单因素试验所得到的最优配比，以多糖含量和感官评分为指标设计正交实验，对饮料的最佳调配方案进行具体优化。
五、结果分析
1、沙棘果粉添加量的确定
沙棘果粉(三个水平：5％、8％、10％)、大豆蛋白胨0.5％、白砂糖15％、混合并搅匀原料，加蒸馏水至100mL，调节pH至4.7±0.1制得培养基。每个水平3个平行。均以不接菌为对照组。对培养液接菌发酵培养后的以下指标进行检测：多糖浓度、生物量。通过本次实验，以多糖浓度和生物量为指标确定了配方中为指标确定了沙棘果粉的添加量。生物量如图7所示，多糖浓度如图8所示，多糖浓度差值如图9所示。
由图8可知实验组的多糖浓度明显高于对照组的多糖浓度，且实验组和对照组均是沙棘果粉的浓度越高多糖浓度值越大，由图9可知沙棘果粉浓度在4％时，实验组与对照组的多糖浓度差是最大的，且随着沙棘果粉的添加量增大多糖浓度差呈递减趋势。因此可以表明沙棘果粉在4％时，柴达木大肥菇液体食用菌将还原糖转化为多糖的转化率是很高的。
2、白砂糖添加量的确定实验
以最佳沙棘果粉的添加量为基础进行实验来确定配方中白砂糖的添加量。配方及方法：沙棘果粉8％、大豆蛋白胨0.5％、白砂糖(三个水平：4％、6％、8％)、混合并搅匀原料，加蒸馏水至100mL，调节pH至4.7±0.1制得培养基。每个水平3个平行，均以不接菌为对照组。对培养液接菌发酵培养后的以下指标进行检测：多糖浓度、生物量。通过本次实验，以多糖浓度和生物量为指标确定了配方中白砂糖的添加量。生物量如图10所示，多糖浓度如图11所示。
生物量的测定直接反应了柴达木大肥菇液体食用菌的生长情况。生物量越高则说明了该菌的生长情况越是好。由图10可以知道沙棘果粉浓度越高，生物量越高，白砂糖浓度为8％的实验组生物量最高。
由图11可知实验组的多糖浓度明显高于对照组的多糖浓度，且实验组和对照组均是加糖浓度越高多糖浓度值越大。经文献查询得知，水果发酵饮料中多糖浓度需要在20到30mg/mL最佳。白砂糖添加量为4％时，多糖浓度为25.38mg/mL的实验组十分成功，而白砂糖添加量为6％、8％的实验组多糖浓度过高了，因此最佳白砂糖的添加量应该是4％。
3、沙棘饮料勾兑与调配实验
(1)、单因素实验
按照简单对比的方法，研究A(沙棘果粉)、B(白砂糖)、C(柠檬酸)3个因素的不同配比，以感官评分为指标确定正交实验的数据。对应表2.4所设计的单因素实验，实验结果如表12所示。
表12沙棘发酵型饮料调配单因素实验因素结果表
从表中得知，评分最高的分别为A4、B3、C4，因此分别取A3、A4、A5；B1、B3、B5；C3、C4、C5为正交实验的数据。
(2)、正交实验
以单因素实验得到的A(沙棘果粉)、B(白砂糖)、C(柠檬酸)3个因素的水平进行正交实验，根据感官评分对调配工艺进行综合评定。对照表13的设计得到正交实验安排表和结果表14。
表13沙棘发酵型饮料调配正交实验安排表
表14沙棘发酵型饮料调配正交实验结果表
由表14可以看出，发酵沙棘果汁的最佳配方为D2E2C3，即原沙棘果粉0.4％，白砂糖0.9％，柠檬酸0.6％。三个因素对产品感官评分的影响顺序为：D＞E＞F，即沙棘果粉添加量影响最大，通过发酵除去了沙棘中的少许不良风味，并且使果汁带有淡淡的发酵香，是发酵果汁的主体，也因此大幅度减少了沙棘果汁的原味。其次是白砂糖添加量，在预调配时添加的部分糖在发酵时被利用，后面添加的主要起调和口感，增加饮料的厚实度的作用。最后是柠檬酸添加量，柠檬酸使得酸味缓和、可口，入口后酸味迅速达到最高点并很快降低，后延续时间较短。饮品特有的天然香气和淡淡的发酵香，酸甜适口，无沉淀及分层现象。
实施例3，食用菌发酵梨汁饮料制备
一、材料
1、原材料
2、主要试剂
3、主要仪器
二、方法
1、梨汁发酵原液的制备
(1)在制取梨原汁的榨汁时要去除梨果实中的皮和籽；
(2)大豆蛋白胨加量是0.5％；
(3)培养基pH调节至5.6±0.2；
(4)杀菌采用高温蒸汽灭菌方法：空瓶灭菌条件是120℃、30min，培养基灭菌条件是115℃、15min；
(5)液体菌种的接种量是5％；
(6)发酵培养：在恒温振荡培养箱中设定25℃、125rpm；
(7)得到梨汁发酵原液后进行多糖含量、总糖度、生物量和pH的测定。
三、测定
1、多糖含量的测定：苯酚-硫酸法
(1)制定标准曲线：取适量葡萄糖在105℃下烘干至恒重，准确称取0.5000g，用蒸馏水定容到100mL容量瓶中，用移液管精确吸取1mL上述葡萄糖溶液至50mL容量瓶中，定容，分别精密量取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0mL的标准溶液于干净试管中，加蒸馏水至2mL，加入0.5mL的6％苯酚溶液(6％苯酚配制：精确量取80％苯酚1mL，加12.3mL蒸馏水稀释，用玻璃棒搅拌均匀，现配现用)、5mL浓硫酸静置20min后，用紫外分光光度计测定各试管在490nm处吸光值，以葡萄糖含量(mg)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线，如图12所示。
(2)样品多糖含量的测定：
将经过预处理的大肥菇子实体粗多糖，取10μL多糖于10mL容量瓶中定容，然后从中取2mL溶液，加入0.5mL 6％的苯酚溶液、5mL的浓硫酸，静置20min后，用紫外分光光度计测定各试管在490nm处测定吸光值，每组做三个平行，多糖含量计算公式如下：
式中：C：多糖浓度(mg/mL)；A：样品液的平均吸光度值；n：样品稀释倍数
注意：因标注曲线0.2-0.8范围内呈线性关系，故应调整所测吸光值在0.2-0.8范围。
2、总糖度的测定：用手持折光糖度计测量
(1)在使用前后都要用蒸馏水冲洗并用滤纸擦干；
(2)每次测量前用蒸馏水调零；
(3)每组平行测三次。
3、pH测定
(1)将pH6.68和pH4的两包缓冲剂粉末打开后倒入250ml容量瓶中，以少量蒸馏水冲洗塑料袋内壁，倒入容量瓶中，并稀释至刻度，摇匀备用即可。开pH计预热30min。在小烧杯中放入pH6.68的标准缓冲溶液；把电极浸入缓冲溶液中，待示数稳定后按下定位开关调节定位器，使示数与缓冲溶液的pH值相同。定位后不要再移动定位器。用蒸馏水冲洗电极头部，洗净后用滤纸条吸干。
(2)测量：用蒸馏水冲洗电极头部，用滤纸条吸干。将样品倒入小烧杯中，将电极浸入样液中，轻轻摇动小烧杯，当示数稳定时，读数即为样液的pH。测试完毕，将电极冲洗干净，放入保护液中。每次做三组平行。
4、生物量的测定
菌丝的生物量测定——干/湿重法
用定性滤纸过滤发酵液，收集菌丝，测出湿重后，将菌丝置于80℃烘箱中烘干至恒重，再测出的菌丝重量即为干重。
5、感官评分的测定
选10名优秀饮料感官评价员，并将这10位训练好的评价员组成感官评定小组。样品采用随机编码，常温下进行品评。鉴别时需避免混杂外来气味并不断漱口以保持口腔清爽。感官评分标准如表15所示。
表15梨汁发酵型饮料感官评分标准
四、实验检验
1、发酵培养液配方实验
首先用100mL的土豆汁，加梨汁10mL，加大豆蛋白胨0.5％，复合维B0.01％，接菌量5％。梨原汁：加10mL原汁、梨x1：梨原汁稀释一倍加10mL、梨x2：梨原汁稀释二倍后加入10mL，确定最佳发酵梨汁浓度；然后用总量为200mL，梨汁稀释2倍，即梨原汁稀释2倍。加大豆蛋白胨0.5％，接菌量5％，以白糖加量为梯度依次做5％，10％，15％，来确定发酵中蔗糖添加量的大致范围；最后用总量为100mL，梨汁与水的比例为1：2，加大豆蛋白胨0.5％，接菌量为5％，以白糖添加量为题度分别做0％，2％，4％，6％，8％的培养基，均做不接菌空白对照，来确定发酵最佳蔗糖添加量。
2、梨汁发酵饮料的调配
以发酵液为基础原液，在发酵原液中加入纯净水、蔗糖和柠檬酸进行调配；进行感官评分；以多糖含量、蔗糖含量和柠檬酸含量为单因素进行单因素实验；进行正交实验对配方进行优化得到最优配方组。
(1)单因素实验
以纯净水含量、蔗糖含量和柠檬酸含量为单因素，以多糖含量和感官评分为指标进行单因素实验：
1)暂定蔗糖和柠檬酸的加量，纯净水的含量分别取五个水平做单因素实验并进行感官评分；
2)通过第一组实验确定纯净水含量的最优值，柠檬酸加量不变，蔗糖加量分别取五个水平做单因素实验并进行感官评分；
3)通过前两组实验确定纯净水和蔗糖的加量的最优值，柠檬酸的加量分别取五个水平做单因素实验并进行感官评分得到柠檬酸加量的最优值。
通过查阅文献大致确定三个单因素的添加量得出下面得单因素因素表
表16单因素实验因素水平表
(2)正交实验
根据单因素试验最优水平为中心水平，再分别取两个水平进行正交试验，确定梨汁发酵饮料调配的最优配比按正交试验L9(34)设计正交实验方案，对饮料的最佳配方进行具体优化。
表17正交试验因素水平表
五、结果分析
1、最佳发酵培养原液配方的确定
(1)梨汁稀释倍数对发酵过程的影响
用100mL的土豆汁，加梨汁10mL，加大豆蛋白胨0.5％，复合维B0.01％，接菌量5％。梨原汁：加10mL原汁、梨x1：梨原汁稀释一倍加10mL、梨x2：梨原汁稀释二倍后加入10mL,通过发酵一周后所得菌丝体质量如图13所示。
由图13可知通过测定发酵后三组培养基中菌丝体的质量得到梨原汁稀释2倍后食用菌菌丝体质量最多，说明食用菌在梨汁稀释2倍的培养基中生长最好，食用菌生长好就可以更多的转化梨汁中的多糖。所以可以确定发酵培养基中梨汁稀释2倍最佳。
由图14可以看出白糖加量5％中多糖含量是18.75mg/mL、白糖加量10％中多糖含量是37.42mg/mL、白糖加量15％中多糖含量是45.67mg/mL，查文献得知多糖含量在20～30mg/mL最佳[21]，由此得到梨原汁稀释2倍白糖加量5％的这一组多糖含量最为接近，而10％和15％这两个梯度的多糖含量不符合。最后确定梨汁稀释倍数为2倍，白砂糖添加量5％左右的配方最佳。
(2)、白糖梯度添加对发酵过程的影响
由图15得知当白砂糖的含量在6％和8％时发酵液中菌丝体质量相对最多，说明食用菌在梨汁稀释2倍白砂糖含量在6％和8％的培养基中生长最好。
由图16得出白糖加量0％时多糖含量2.88mg/mL、白糖加量2％时多糖含量14.76mg/mL、白糖加量4％时多糖含量18.35mg/mL、白糖加量6％时多糖含量24.13mg/mL、白糖加量8％时多糖含量37.26mg/mL，多糖含量在20～30mg/mL之间的是梨汁稀释2倍白糖加量6％的发酵培养基配方是最佳的。
经过发酵后各组的pH都上升，上升的原因是在发酵过程中有碱性物质生成。在经过发酵后各个组分的总糖度降低，降低的原因是在发酵过程中发酵培养基中的糖经过食用菌发酵后转换成多糖和其他一些物质。
2.梨汁发酵饮料的勾兑与调配
(1)单因素实验结果
表18单因素实验设计计及结果分析
通过查文献暂定柠檬酸和蔗糖的加量为0.2％和1.5％，纯净水的含量分别取90％、85％、80％、75％、70％五个水平做单因素实验并进行感官评分得出纯净水含量75％是评分最高；确定纯净水含量的最优值为75％，蔗糖加量1.5％，柠檬酸加量分别取0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％五个水平做单因素实验并进行感官评分，得出柠檬酸加量0.2％时评分最高；确定纯净水和柠檬酸的加量的最优值为75％和0.2％，蔗糖的加量分别取0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％五个水平做单因素实验并进行感官评分得到蔗糖加量的最优值为1.0％。
(2)正交实验结果
根据单因素试验最优水平纯净水含量75％、柠檬酸含量0.2％、蔗糖含量1.0％为中心水平，再分别取最优值两边得两个水平进行正交试验，确定梨汁发酵饮料调配的最优配比按正交试验L9(34)设计正交实验方案，对饮料的最佳配方进行具体优化。
表19正交试验设计及结果分析
由表19可以看出，发酵梨汁的最佳调配配方为D2E2C3，即纯净水75％，柠檬酸0.2％，蔗糖1.5％。三个因素对产品感官评分的影响顺序为：D＞E＞F，即纯净水添加量影响最大，通过稀释发酵液除去了发酵液的少许不良风味，并且使果汁带有淡淡的发酵香，是发酵果汁的主体，也因此大幅度减少了梨汁的原味。其次是柠檬酸添加量，柠檬酸使得酸味缓和、可口，入口后酸味迅速达到最高点并很快降低，后延续时间较短。最后是蔗糖添加量，在预调配时添加的部分糖在发酵时被利用，后面添加的主要起调和口感，增加饮料的厚实度的作用。饮品特有的天然香气和淡淡的发酵香，酸甜适口，无沉淀及分层现象。
以上已将本发明做一详细说明，以上所述，仅为本发明之较佳实施例而已，当不能限定本发明实施范围，即凡依本申请范围所作均等变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖范围内。

Claims (7)

1.一种利用食用菌发酵增加饮料功能多糖的制备方法，其特征在于：处理流程为：水果添加原料制备→培养基制备→灭菌→接菌发酵→发酵培养→抽滤→发酵原液勾兑与调配；
具体制备过程按以下步骤进行：
1)水果添加原料制备：选取成熟水果果实制备汁状原料或粉状原料；
2)培养基制备：以0.5％的大豆蛋白胨，加入煮沸的纯化水制备好培养基，将水果添加原料与培养基混合一起装入灭菌瓶内；
3)灭菌：将灭菌瓶封口，然后在高压灭菌锅中以超过100℃的温度灭菌；
4)接菌发酵：在超净工作台接入5％液体柴达木大肥菇菌种得到培养液；
5)发酵培养：将培养液放入恒温振荡培养器中室温培养，125rpm培养5天；
6)抽滤：使用真空泵垫两层滤进行抽滤，得到上清液为发酵原液，冷藏，备用；
7)发酵原液勾兑与调配：以发酵原液为基础原液，在发酵原液中加入纯净水、糖和柠檬酸进行调配食用菌源发酵饮料。
2.根据权利要求1所述的利用食用菌发酵增加饮料功能多糖的制备方法，其特征在于：所述水果添加原料为枸杞汁；挑选清洗过的枸杞为原料，在枸杞中以1：5加入蒸馏水，充分浸泡4h，用打浆机打浆，后用四层纱布过滤，静置澄清制成枸杞汁，并置于冰箱避光冷藏待用；在培养基中加入0.05％维生素B护色，保证产品色泽鲜亮；将培养基与枸杞汁按比例混合，添加适量白砂糖，再经115℃灭菌15min、接菌发酵、28℃发酵培养、抽滤、发酵原液勾兑与调配后制得食用菌枸杞发酵饮料。
3.根据权利要求1所述的利用食用菌发酵增加饮料功能多糖的制备方法，其特征在于：所述水果添加原料为沙棘果粉，以4％沙棘果粉与0.5％大豆蛋白胨、蒸馏水制作沙棘果粉培养液，并用0.5％氢氧化钠溶液调节pH至4.7±0.1，115℃灭菌15min，按5％(v,v)接种量接种液体柴达木大肥菇菌种，再经25℃发酵培养、抽滤、发酵原液勾兑与调配后制得食用菌发酵沙棘饮料。
4.根据权利要求1所述的利用食用菌发酵增加饮料功能多糖的制备方法，其特征在于：所述水果添加原料为青海香梨梨汁，去除青海香梨果实中的皮和籽制取梨原汁的榨汁，将梨汁培养基pH调节至5.6±0.2，115℃灭菌15min，按5％(v,v)接种量接种液体柴达木大肥菇菌种，再经25℃发酵培养、抽滤、发酵原液勾兑与调配后制得食用菌梨汁发酵饮料。
5.根据权利要求2所述的利用食用菌发酵增加饮料功能多糖的制备方法，其特征在于：在制作发酵原液配方时，枸杞汁的量为9％，白砂糖的量为7.5％；在制作食用菌枸杞发酵饮料时，枸杞汁的添加量为3％、白砂糖为2.5％、柠檬酸为3％。
6.根据权利要求3所述的利用食用菌发酵增加饮料功能多糖的制备方法，其特征在于：在制作发酵原液配方时，沙棘果粉的量为4％，白砂糖的量也为4％；在制作食用菌发酵沙棘饮料时，沙棘果粉的添加量为0.4％、白砂糖为0.9％，柠檬酸为0.6％。
7.根据权利要求4所述的利用食用菌发酵增加饮料功能多糖的制备方法，其特征在于：在制作发酵原液配方时，梨汁稀释2倍，白砂糖的添加量为6％；在制作食用菌梨汁发酵饮料时，纯净水的添加量为75％、柠檬酸为0.2％，白砂糖为1.5％。
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