CN104911116B - 一株酿酒酵母及其在发酵山楂酒中的应用 - Google Patents

一株酿酒酵母及其在发酵山楂酒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株酿酒酵母及其在发酵山楂酒中的应用，属于工业微生物领域。该酿酒酵母从山楂果实中自然发酵分离得到，具有较强的低pH耐受能力，使用该株酿酒酵母制得的发酵山楂酒乙醇产量高，副产物甘油少，降低柠檬酸效果好，发酵较为完全，残糖含量低，且酒精比产率高。最终制得的山楂酒风味良好，是一株适合酿造山楂酒的酿酒酵母。将该株酿酒酵母于2015年3月15日保藏在位于武汉市洛枷山武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号Saccharomyces cerevisiae CCTCC NO:M 2015119。

Description

一株酿酒酵母及其在发酵山楂酒中的应用
技术领域
本发明涉及一株酿酒酵母及其在发酵山楂酒中的应用，属于工业微生物领域。
背景技术
山楂是我国特有的水果，属于蔷薇科山楂属植物，其野生品种广泛的分布于世界各地，但在我国早在唐代就以作为栽培水果加以利用。山楂具有重要的药用保健价值，自古以来，人们将它视为消食化滞、活血化痰、健脾开胃的良药。山楂中的维生素含量丰富，维生素C、维生素E以及胡萝卜素的含量均在水果中名列前茅。除维生素外，山楂还含有丰富的有机酸、黄酮类物质、单宁类物质以及矿物质，这些成分都对人们的身体健康有着积极的影响，可以起到提高机体免疫力、强健体魄的作用。据报道，山楂富含的抗氧化剂成分可以起到防老化、起到美容、防癌和防治动脉硬化的功效，黄酮类物质有利于稳定、调节血压、降低胆固醇，山楂中丰富的膳食纤维和果胶成分，可以促进肠道的螺动和消化腺的分泌，有助于食物的消化和废物排泄。果胶具有降低胆固醇和血糖、预防胆结石的功效。
目前我国市场上较多的加工产品有山楂片、山楂糕、蜜饯山楂脯、果丹皮、山楂酱、山楂饼、山楂耀头、山楂酒、山楂汁、山楂饴等，而山楂酒种类少，品质差。其中市售的山楂酒一般多为调制酒，其制作工艺依然停留在浸泡工艺或是模仿葡萄酒加工工艺，口感上多以苦湿为主，很难获得消费者青睐，一些所谓的高黄酮山楂酒是在山楂汁中加入了部分山楂叶黄酮而得到，均为非发酵酒。山楂饮品多釆用调配工艺，产品定位属于低成本快消品范畴，很少注重产品的营养成分保护和风味特征。现有的少数发酵山楂酒多采用山楂清汁发酵，其营养物质损失较大，口感风味较差。
酵母是一些单细胞真菌，并非系统演化分类的单元。是子囊菌、担子菌等几科单细胞真菌的通称，可用于酿造生产。酵母是酿造山楂酒的关键因素之一，是影响山楂酒口感和风味的重要因素，决定着果酒品质的优劣。我国果酒酿造中使用的酵母大部分来源于商业活性干酵母，其品质单一，通用适用性强，但对于个别特殊条件适应力差，活性干酵母在生产上多经好氧培养，因此其厌氧发酵性能、低温发酵性能，耐低pH及耐乙醇性能等较差。而山楂酒山楂汁的酸度较高，pH较低，商业活性干酵母及部分酵母菌在此条件下难以生长，导致酒精产量低，因此有必要对酵母菌进行筛选，从而筛出一株低pH条件下仍可以正常生长并高产酒精的酵母菌。
山楂酒口感较酸，原因是山楂酒中含有较多有机酸，其中主要有机酸为柠檬酸，柠檬酸是三元酸，酸性较强。目前传统的降酸方法有化学降酸法，通过添加CaCO3、K2CO3、KHCO3降低酸度；物理降酸法：壳聚糖吸附降酸法、明胶吸附降酸法等。但这两种方法易导致酒体浑浊，同时破坏酒体口感，导致酒的品质降低。本发明筛选出的酵母菌通过实验发现具有显著的降柠檬酸能力，这种降酸过程在发酵中自然发生，不添加新物质，不会导致酒体浑浊、口感降低。而且通过降低酸度改善了山楂酒的口感，提升了品质。
发明内容
本发明内容的目的是提供一株适用于发酵山楂酒的特色酵母菌株，用于酿造发酵山楂酒。
本发明一方面提供了一种酿酒酵母Y2(Saccharomyces cerevisiae Y2)，该株酵母菌具有较强的低pH耐受能力，使用该株酿酒酵母制得的发酵山楂酒乙醇产量高，副产物甘油少，降低柠檬酸效果好，发酵较为完全，残糖含量低，且酒精比产率高，最终制得的山楂酒风味良好。所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Y2，于2015年3月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2015119。
本发明还提供了应用上述酿酒酵母酿制发酵山楂酒的方法，是以山楂果浆为底物进行发酵。具体包括以下步骤：
1.按1:3～1:4的料水比将山楂打浆；
2.加入果胶酶在50℃条件下处理3～4h，果胶酶添加量150ppm；
3.加入200g/L葡萄糖、0.4g/L磷酸氢二铵、0.2g/L亚硫酸钠，与山楂果浆混合均匀；
4.接入酵母菌Y2种子培养液，接种量15％～20％；
5.置于厌氧环境下进行发酵，
6.发酵结束后离心灌装灭菌。
本发明的酿酒酵母在pH2.7-2.9的低pH条件下产酒精能力强，乙醇产量比其余实验酵母所酿山楂酒多15g/L以上，同时降柠檬酸效果显著，柠檬酸从19g/L降至3g/L，副产物甘油少，发酵效果比普通商业活性干酵母好，风味口感好。
生物材料保藏
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Y2，于2015年3月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2015119。
附图说明
图1.二级种子生长曲线
图2.发酵培养基中酵母菌生长曲线
图3.乙醇产量趋势图
图4.甘油产量趋势图
图5.山楂酒柠檬酸含量变化趋势图
图6.残糖含量变化趋势图
图7.不同酵母酿造山楂酒比产率
具体实施方式
下述实施例中各培养基的配方如下：
YPD培养基(一级种子培养基)：酵母提取物20g/1000mL，蛋白胨20g/1000mL，葡萄糖20g/1000mL，自然pH值，115℃、20min高压灭菌。固体培养基中加入17g/1000mL琼脂粉。
二级种子培养基：山楂浓缩汁调整终糖浓度50g/L，加入0.4g/L磷酸氢二铵，0.2g/L亚硫酸钠，调节pH2.7-2.9。
发酵培养基：山楂浓缩汁调整终糖浓度200g/L，加入0.4g/L磷酸氢二铵，0.2g/L亚硫酸钠。按体积比10-20％接种二级种子培养液，于20-25℃下发酵6-15天。
山楂购自山东省枣庄市山亭区水泉镇，品种为五棱山楂。山楂浓缩汁的制备：按1:4的料水比将山楂打浆，加入果胶酶在50℃条件下处理3h，果胶酶添加量150ppm。
对山楂酒样品进行高效液相色谱分析：
A预处理
(1)将取样的1mL菌液放入1.5mL离心管中离心去除菌体，离心条件12000rpm，1min。
(2)取上清液0.75mL移入EP管中，加入0.75mL的10％三氯乙酸溶液，振荡混匀，放入4℃冰箱静置5h。
(3)静置完毕后进行离心，离心条件12000rpm，20min，取上清液1mL过0.22μm水系膜移入液相进样瓶中备用。
B液相色谱分析
使用Shodex SC1011折射率检测柱(昭和电工有限公司，东京，日本)分析测定葡萄糖、果糖、乙醇、甘油和柠檬酸。在50℃，流动相为0.01mol/L的稀H2SO4溶液，在50℃条件下以1mL/min的流速进样。
实施例1酵母菌的分离纯化
1.出发菌株的选育
(1)自然发酵分离酵母菌
无菌称量50g成熟山楂，用无菌研钵研碎后放入500mL锥形瓶中，加入150mL无菌水，纱布封口，置于恒温摇床进行培养，培养条件30℃、150rpm。
每隔24h取发酵液lmL，加入9mL无菌水中进行梯度稀释至10-7，取50μl稀释后菌液放入YPD固体培养基涂布，放入30℃培养箱中培养48h。
(2)纯化培养
对培养箱中已培养48h的酵母菌株，挑取培养基中长出的肉眼可见的真菌菌落，分别移入YPD固体平板培养基上，30℃恒温培养、纯化直至得到单菌落后，转接至斜面试管作为出发菌株，得到65株菌。
2.酵母菌株初筛
(1)镜检初筛：挑取斜面试管中的菌株接种于YPD液体培养基中置于恒温摇床培养48h，培养条件30℃，150rpm。以16×40倍显微镜镜检，筛选出以多端出芽繁殖的菌株，得到26株菌。
(2)WL营养琼脂培养基筛选：将镜检筛选出的菌株，接种YPD液体培养基活化24h后接种到WL营养琼脂培养基，30℃培养5d后观察，筛选出菌落颜色为奶油色(乳白色)，球形突起的表面光滑、不透明、奶油状的菌株，得到7株菌。另取2株商业活性干酵母作为实验对照菌株。
3.酵母菌保藏
取YPD液体培养基中底部大量菌悬液1mL于2mL甘油保藏管中，加入1mL 30％的甘油，放置于-80超低温冰箱中保藏，结果如下表1所示。
表1
实施例2酵母菌二级种子生长曲线
1.取已培养20h的酵母种2.5mL于50mL二级种子培养基中，接种量5％，每组做两个平行。
2.用纱布封口，置于恒温摇床进行培养，培养条件：30℃，150rpm
3.于第0h、7h、9.5h、12.5h、15.5h、20.5h、23.5h、34.5h、39.5h分别取0.5mL菌液，稀释适当倍数，在λ＝600条件下测量吸光度。
实验结果如图1所示，从图1中可以看出，酵母菌在7.5小时左右从停滞期进入对数期，生长加快，在二级种子培养基中酵母菌Y2、Y3、Y5、SY长势较好，而酵母菌Y1长势一般。
实施例3酵母菌发酵培养基生长曲线
1.取已培养24h的二级种子2.5mL于50mL发酵培养基中，接种量10％，每组做两个平行。
2.用保鲜膜封口，置于25℃恒温培养箱中培养。
3.于第0h、12h、22.5h、34.5h、45h、64h、82h、106h、130h分别取0.5mL菌液，稀释适当倍数，在λ＝600条件下测量吸光度。
实验结果如图2所示，从图2中可以看出，发酵培养基中酵母菌从开始就生长较快，这是由于接入发酵培养基的二级种子培养基培养时间为20h，正处于微生物生长最快的对数期，因此从0h起酵母菌就以较快速率生长，到45h左右微生物开始进入静止期，生长放缓，菌液浓度基本不变。发酵培养基中，酵母菌Y3、Y5、Y7、RW、SY长势较好，酵母菌Y2长势处于平均水平，酵母菌Y1长势较差。
实施例4酵母菌发酵山楂酒酸醛醇测定
山楂浓缩汁调整终糖浓度200g/L，加入0.4g/L磷酸氢二铵，0.2g/L亚硫酸钠。接种二级种子培养基20％。于20℃下发酵6天。
对山楂酒样品进行高效液相色谱分析，测定葡萄糖、果糖、乙醇、甘油和柠檬酸含量。
1.乙醇产量如图3所示
从图中可以看出，酵母菌Y1的乙醇产量非常低，因此对其不予分析。其余8株酵母菌在开始时乙醇产量较低，从第22h开始乙醇产量急剧上升，到64h以后，基本不再产出乙醇，乙醇总量几乎维持不变。最终山楂酒中乙醇浓度在55g/L～70g/L。其中酵母菌Y2产乙醇量最多，为70g/L。
2.甘油产量如图4所示
甘油作为副产物影响山楂酒中糖醇转化率，开始时甘油产量增长较快，从0～45h甘油产量迅速增加，45h后甘油产量基本不变，从图中可以看出不同酵母菌其甘油产率均有不同，其中酵母菌Y5发酵山楂酒甘油产量最高，达到9g/L，酵母菌Y2发酵山楂酒的甘油产量最少，为6g/L。
3.柠檬酸测定值如图5所示
从图中可以看出山楂酒汇总柠檬酸的产量呈反S型，先较快下降，后维持不变，不同酵母菌发酵山楂酒其柠檬酸变化基本一致，从0～25h柠檬酸下降较快，25～45h柠檬酸下降较慢，45h后柠檬酸浓度基本不变。柠檬酸从19g/L降至约6g/L左右，说明在酵母菌代谢作用下可以有效的降低柠檬酸含量，酵母菌Y2发酵山楂酒的柠檬酸含量最少，为3g/L。
4.残糖含量如图6所示
从图中可以看出开始时总糖约190g/L，随时间推移，总糖含量持续减少，与乙醇产量趋势图相吻合，0～20h总糖减少速率快，20～60h时酵母菌消耗糖的速率明显减缓，60h后残糖含量基本不变，其中Y1酵母菌残糖含量较高，其余酵母菌的残糖含量基本一致，最终残糖含量约10g/L。
5.不同酵母菌酿造山楂酒比产率如图7所示
从图中可以看出山楂酒比产率最高为酵母菌Y1和Y2，其中Y1菌体长势不行且乙醇产量少，因此排除，酵母菌Y2虽然菌体长势处于平均水平，但乙醇产量最高，说明Y2产乙醇的效率最高，为8.9。
实施例5山楂酒中风味物质测定
山楂浓缩汁调整终糖浓度200g/L，加入0.4g/L磷酸氢二铵，0.2g/L亚硫酸钠。接种二级种子培养基10％。于20℃下发酵15天。
发酵山楂酒挥发性组分中主要含有醇类、醛类、酸类和酯类等风味物质。其中，烃基类化合物和醚键类化合物的香气阈值较高，与前几类挥发性物质相比对风味贡献较小，而酯类化合物、羰基类化合物、羧基类化合物等改善口感的主要风味化合物从种类到含量上普遍优于相较于普通果酒。风味测定结果如下表2所示：
表2不同酵母酿制山楂酒风味分析
酯类化合物是风味物质的重要组成之一。其中辛酸乙酯和乙酸乙酯等酯类化合物含有果香的风味特征，其香气阈值较低，使山楂酒富含香气的能力较强，极易对人体感官产生影响，测试结果表明Y2发酵所得的山楂酒酯类含量较高。
羰基类化合物的香气阈值也较低，同样可以赋予较强的香气。烯酮可以表达出山楂的风味特征，辛酮则具有水果的香气特征，并且伴随着碳链的增长酮类化合物可以给出更强的香气特征。少量的醛类化合物可以使食品的香气更加浓郁醇厚，例如存在柠檬草中的壬醛可以给人的感官带来令人喜欢的香气，其他醛类化合物也有助于食品香气的产生。其中Y1、Y2发酵所得的山楂酒的羰基类化合物的含量显著高于其他酵母发酵山楂酒。
醇类物质具有特殊的香气，乙醇是山楂酒中的主要成分，其余醇类物质也对山楂酒的风味有积极作用，异戊醇、活性戊醇可以使酒拥有苹果白兰地香气，β-苯乙醇可以表达柔和的玫瑰花香。通过测试可以发现Y2的醇类物质含量显著高于其他酵母菌发酵山楂酒。
有机酸可以给食品带来酸味口感，例如异丁酸、己酸在含量合适的情况下可以给人带来优良的口感。而戊酸则有难闻的臭味，Y2中未检出，测试结果表明Y2的有机酸含量适中。
实施例6果浆发酵山楂酒的制作
1.按1:4的料水比将山楂打浆
2.加入果胶酶在50℃条件下处理3h，果胶酶添加量150ppm/L。
3.加入200g/L葡萄糖，0.4g/L磷酸氢二铵，0.2g/L亚硫酸钠，与山楂果浆混合均匀。
4.接入酵母菌Y2的二级种子培养液，接种量20％
5.置于厌氧环境下进行发酵
6.发酵结束后离心灌装灭菌。
通过上述图表数据可以看出，在pH2.7条件下，酵母菌Y2菌体长势虽然处于平均水平，但乙醇产量最高，说明Y2具有较强的低pH耐受能力，其余酵母菌虽然可以生长，但乙醇产量相对较少，说明在低pH条件下其产乙醇能力受到了抑制，同时Y2所酿山楂酒副产物甘油产量最少，在风味物质方面Y2的成分含量最好，因此本发明的酵母菌Y2是一株良好的适合酿造发酵山楂酒的酿酒酵母。同时本发明的果浆发酵山楂酒由于其制作工艺的原因，使得山楂中大部分营养物质得以保留，对人体健康十分有益。而且其酸甜适中的风味符合当下消费者的口感，其中富含的有机酸、维生素、矿物质、多酚也满足了消费者对于商品营养、健康的要求。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (2)

1.酿酒酵母酿造山楂酒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)按1:3～1:4的料水比将山楂打浆；
(2)加入果胶酶在50℃条件下处理3～4h，果胶酶添加量150ppm；
(3)加入200g/L葡萄糖、0.4g/L磷酸氢二铵、0.2g/L亚硫酸钠，与山楂果浆混合均匀；
(4)接入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Y2的种子培养液，接种量15％～20％，置于厌氧环境下进行发酵，所述酿酒酵母于2015年3月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2015119。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的山楂酒为发酵型山楂酒。
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