CN102114013B - 抑制血管生成的化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明从海参的共附生微生物的发酵培养物中提取分离得到一种抑制血管生成的化合物及其制备方法，它包括如下步骤：1)从海参利用PDA培养基得到链格孢霉(Alternaria sp.)HS-3，2。菌落初白色，渐变为黑绿色，基质黑色分生孢子梗单枝，长短不一，顶生不分枝，分生孢子有纵横隔膜，倒棍棒形、卵形；2)制作种子培养基获种子培养液；3)发酵生产；发酵培养基：葡萄糖0.5-1.5，酵母提取物，0.05-0.2，蛋白胨0.1-0.4，琼脂1-1.5，氯化钠3-6、水100，将斜面种培养好的菌株挑入发酵培养基，于室温25-30℃静置1-2个月；将发酵液经纱布过滤和离心去除菌体，上清液在50-60℃左右浓缩至5L，用乙酸乙酯萃取3-5次，利用柱层析色谱进行分离，以石油醚，乙酸乙酯或者氯仿、甲醇流动体系进行洗脱。
Description
技术领域
本发明涉及海参共附生微生物发酵制备具有抑制血管生成作用的新的代谢产物1(4-乙酰基-5-羟基-3，6，7-三甲基苯并呋喃-2-酮)以及化合物2(4-乙酰基-5-甲氧基-3，6，7-三甲基苯并呋喃-2-酮)的制备及其抑制血管生成的用途。
背景技术
海洋微生物次级代谢产物的研究引起了越来越多的注意。海洋高盐、高压、贫营养或者少光照等特殊的生态环境，造就了海洋生物的多样性和特殊性，其海洋微生物的种类多达100余万种。据John教授2007年在《Natural ProductsReport》报道，2006年和2007年对比1965-2005年，海洋微生物有了个非常大的增长。目前各国已经从海洋细菌、放线菌、真菌等微生物中分离得到多种活性物质，并具有强烈的生物活性，例如抗菌、抗肿瘤、抗病毒等，其中有些已经进入了临床研究。已有文献报道具有二氢苯并呋喃结构的化合物具有抑制肿瘤血管生成的作用。某些苯并呋喃类化合物具有良好的抑制HUVEC(人脐带静脉内皮细胞)增殖活性，而且对抑制内皮细胞增殖具有很好的选择性。
肿瘤特别是恶性实体瘤是人类头号杀手。研究一直血管生成类抗肿瘤药物引起了人们越来越多的重视。与大、小鼠等模式生物一样，近年来斑马鱼(Daniorerio)也逐渐被用作人类疾病动物模型。其胚胎在发育24h时，体节间血管开始由背动脉出芽形成于相邻体节之间。此血管生成模式与肿瘤新生血管形成模式相近，因此斑马鱼胚胎可作为抑制血管生成类抗肿瘤药物的评价模型。
发明内容
本发明涉及一种利用微生物发酵制备一种新的代谢产物1(4-乙酰基-5-羟基-3，6，7-三甲基苯并呋喃-2-酮)以及化合物2(4-乙酰基-5-甲氧基-3，6，7-三甲基苯并呋喃-2-酮)的制备工艺、结构以及抑制血管生成的药理活性。
本发明从海参的共附生微生物的发酵培养物中提取分离得到一种抑制血管生成的化合物1和2，他是通式为
的化合物，其中R＝H或CH3。
化合物1(4-乙酰基-5-羟基-3，6，7-三甲基苯并呋喃-2-酮)：Mp：113--115℃；1H NMR：2.31(s)，2.24(s)，2.21(s)，1.57(d，6)，4.3(q，7.2)，10.8(s)；
13C NMR 169.4，167.7，159.2，148.5，136.6，125.3，124.5，102.7，39.1，29.3，17.3，14.5.11.7；IR：3385cm-1，3208cm-1，3005cm-1，2963cm-1，2935cm-1，1800cm-1，1699cm-1，1601cm-1，1577cm-1；EIMS：[M]+234，[M-CO]+206，[M-CH3CO]+191.
化合物2(4-乙酰基-5-甲氧基-3，6，7-三甲基苯并呋喃-2-酮)：
Mp：120--121℃；1H NMR：2.31(s)，2.26(s)，2.22(s)，1.58(d，6)，3.5(s)，4.3(q，7.2)；13C NMR 169.5，167.8，159.3，148.7，136.9，125.3，124.7，102.7，50.2，39.1，29.3，17.4，14.6.11.9；IR：3000cm-1，2957cm-1，2920cm-1，1770cm-1，1659cm-1，1600cm-1，1520cm-1，
一种抑制血管生成的化合物的制备方法，它包括如下步骤：
1)从海参中，利用PDA马铃薯葡萄糖琼脂进行培养，得到链格孢霉(Alternaria sp.)HS-3，2。菌落初白色，渐变为黑绿色，基质黑色分生孢子梗单枝，长短不一，顶生不分枝，分生孢子有纵横隔膜，倒棍棒形、卵形；
2)制作种子培养基：将菌株斜面接种于葡萄糖、蛋白胨酵母浸膏培养基中：pH：6.5-7.5，在温度23-30℃、转速149rpm、培养120h，获种子培养液；
3)发酵生产：种子培养液以葡萄糖0.5-1.5，酵母提取物0.05-0.2，蛋白胨0.1-0.4，琼脂1-1.5，氯化钠3-6、水100，以上的数值皆为重量份，以下相同，制成使馆斜面，挑取菌株接入斜面，30-35℃培养7-9天；
发酵培养基：葡萄糖0.5-1.5，酵母提取物，0.05-0.2，蛋白胨0.1-0.4，琼脂1-1.5，氯化钠3-6、水100，将斜面种培养好的菌株挑入发酵培养基，于室温25-30℃静置1-2个月；将发酵液经纱布过滤和离心去除菌体，上清液在50-60℃左右浓缩至5L，用乙酸乙酯萃取3-5次，利用硅胶和凝胶LH-20柱层析色谱进行分离，以石油醚，乙酸乙酯、甲醇或者氯仿、甲醇流动体系进行洗脱。得到白色化合物1和2。本方案的具体特点还有：在利用硅胶30-50％乙酸乙酯/石油醚的流动相下洗脱，然后利用凝胶色谱LH-20以石油醚/乙酸乙酯/甲醇为流动相进行分离，重结晶，即得到白色化合物1和2。
所述化合物1和2在抑制血管生成生物活性的应用。
结构确定：利用核磁数据和质谱以及红外光谱，确定了化合物的结构。通过检索，化合物1和2为新化合物。通过抑制血管活性测试，具有抑制血管生成的活性。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明实验证明，化合物1和2易得，具有抑制血管生成作用，具有用于抗肿瘤药物制备的的前景。
具体实施方式
菌株保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为：CCTCC No：M2010303。地址：中国、武汉.武汉大学邮编：430072，保藏日期2010.11.17，该生物材料的分类命名及拉丁文名称：链格孢霉(Alternaria sp.HS-3，2)。并于2010年11月22日经中国典型培养物保藏中心检测，检测结果为存活。
将菌株HS-3，2斜面接种于葡萄糖蛋白胨酵母浸膏培养基中：pH：7.0，在温度28℃、转速149rpm，培养120h，获种子培养液。种子培养液以葡萄糖1.0，酵母提取物，0.1，蛋白胨0.2，琼脂，1，氯化钠4、水100，以上的数值皆为重量比，以下相同，制成试管斜面，挑取菌株接入斜面，30-35℃培养8天。发酵培养基：葡萄糖1，酵母提取物，0.1，蛋白胨0.2，琼脂，1，氯化钠3、水100，以上的数值皆为重量比，将斜面种培养好的菌株挑入发酵培养基，于室温28℃静置1个月。
提取：将发酵液经纱布过滤和离心去除菌体，上清液用3-5倍的乙酸乙酯萃取，清液在50-60℃左右浓缩，用1-2倍的乙酸乙酯萃取3-5次，利用柱层析色谱进行分离，以石油醚，乙酸乙酯或者氯仿、甲醇流动体系进行洗脱。
在30-50％乙酸乙酯/石油醚的流动相下洗脱，然后利用凝胶色谱LH-20进行分离，重结晶，即得到化合物1和2。
实施例1：将菌株斜面接种于葡萄糖蛋白胨酵母浸膏培养基中：pH：7.5，在温度30℃、转速150rpm、培养120h，获种子培养液。种子培养液以葡萄糖1.0，酵母提取物，0.1，蛋白胨0.2，琼脂，1，氯化钠3、水100，以上的数值皆为重量比，以下相同，制成试管斜面，挑取菌株接入斜面，30℃培养8天；
发酵培养基：葡萄糖1，酵母提取物，0.1，蛋白胨0.2，琼脂，1，氯化钠3、水100，将斜面培养好的菌株转入发酵培养基，于室温28℃静置40天。
提取：将发酵液经纱布过滤和离心去除菌体，50℃浓缩，上清液用3倍的乙酸乙酯萃取，得到浸膏。利用硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯为流动体系，50％石油醚/乙酸乙酯为流动相，然后利用凝胶色谱LH-20，石油醚/乙酸乙酯/甲醇体系(2∶2∶1)洗脱，得到化合物1和2。
实施例2：化合物1和2对新生血管生成的抑制作用(见表1)
TG(VEGFR2：GFP)系血管荧光转基因斑马鱼受精卵发育24h时，在体视显微镜下挑选正常的斑马鱼胚胎，移入96孔培养板中，每孔1枚。样孔中预先加入一定体积药物，每浓度32孔，然后用营养用水补充体积至300μl，对照为胚胎营养用水。在受精卵发育72h时，荧光显微镜观察斑马鱼体节间血管的生长情况，计算抑制率，并观察胚胎或仔鱼死亡情况。
表1不同浓度异化合物1和2对斑马鱼胚胎节间血管的抑制作用
注：*与对照组相比有显著性差异(P＜0.05)；**与对照组相比有极其显著性差异(P＜0.001)。化合物1在10μg/ml达到抑制率38.09％，在50μg/ml的抑制率达到100％。化合物2在10μg/ml达到抑制率49.5％，在50μg/ml达到100％。
Claims (7)
1.一种抑制血管生成的化合物，其特征是它是通式为
的化合物，其中R＝H或CH3。
2.根据权利要求1所述的抑制血管生成的化合物，其特征是4-乙酰基-5-羟基-3，6，7-三甲基苯并呋喃-2-酮的物化参数是：
Mp：113--115℃；
1H NMR：2.31(s)，2.24(s)，2.21(s)，1.57(d，6)，4.3(q，7.2)，10.8(s)；
13C NMR 169.4，167.7，159.2，148.5，136.6，125.3，124.5，102.7，39.1，29.3，17.3，14.5.11.7；
IR：3385cm-1，3208cm-1，3005cm-1，2963cm-1，2935cm-1，1800cm-1，1699cm-1，1601cm-1，1577cm-1；
EIMS：[M]+234，[M-CO]+206，[M-CH3CO]+191。
3.根据权利要求1所述的抑制血管生成的化合物，其特征是4-乙酰基-5-甲氧基-3，6，7-三甲基苯并呋喃-2-酮的物化参数是：
Mp：120--121℃；
1H NMR：2.31(s)，2.26(s)，2.22(s)，1.58(d，6)，3.5(s)，4.3(q，7.2)；
13C NMR 169.5，167.8，159.3，148.7，136.9，125.3，124.7，102.7，50.2，39.1，29.3，17.4，14.6.11.9；
IR：3000cm-1，2957cm-1，2920cm-1，1770cm-1，1659cm-1，1600cm-1，1520cm-1；
EIMS：[M]+248。
4.根据权利要求1所述的抑制血管生成的化合物的制备方法，其特征是它包括如下步骤：
1)制作种子培养基：将链格孢霉Alternaria sp.HS-3，2菌株斜面接种于葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏培养基中：pH：6.5-7.5，在温度23-30℃、转速149rpm、培养120h，获得种子培养液；
2)发酵生产：发酵培养基：葡萄糖0.5-1.5，酵母提取物，0.05-0.2，蛋白胨0.1-0.4，琼脂1-1.5，氯化钠3-6、水100；将斜面培养好的菌株挑入发酵培养基，于室温25-30℃静置1-2个月；
将发酵液经纱布过滤和离心去除菌体，上清液在50-60℃左右浓缩至5L，用乙酸乙酯萃取3-5次，利用多次硅胶和凝胶LH-20柱层析色谱进行分离，以石油醚、乙酸乙酯、甲醇或者氯仿、甲醇流动体系进行洗脱，最后得到化合物4-乙酰基-5-羟基-3，6，7-三甲基苯并呋喃-2-酮以及化合物4-乙酰基-5-甲氧基-3，6，7-三甲基苯并呋喃-2-酮。
5.根据权利要求4所述的抑制血管生成的化合物的制备方法，其特征是利用硅胶为固定相在30-50％乙酸乙酯/石油醚的流动相下洗脱，然后利用凝胶色谱LH-20以石油醚/乙酸乙酯/甲醇为流动相进行分离，重结晶，即得到白色化合物4-乙酰基-5-羟基-3，6，7-三甲基苯并呋喃-2-酮以及化合物4-乙酰基-5-甲氧基-3，6，7-三甲基苯并呋喃-2-酮。
6.根据权利要求4所述的抑制血管生成的化合物的制备方法，其特征是步骤1)得到的所述链格孢霉Alternaria sp.HS-3，2菌株，菌落开始为白色，渐变为黑绿色，基质黑色分生孢子梗单枝，长短不一，顶生不分枝，分生孢子有纵横隔膜，倒棍棒形、卵形。
7.根据权利要求1所述的抑制血管生成的化合物的应用，其特征是所述化合物4-乙酰基-5-羟基-3，6，7-三甲基苯并呋喃-2-酮以及化合物4-乙酰基-5-甲氧基-3，6，7-三甲基苯并呋喃-2-酮在制备抑制血管生成生物活性方面的药物中的应用。
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