CN111718862B - 基于液滴微流控芯片的毕赤酵母高通量筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物生物技术领域,涉及一种基于液滴微流控芯片的毕赤酵母高通量筛选方法,所述筛选方法包括如下步骤,步骤1、构建毕赤酵母菌株;步骤2,毕赤酵母菌株突变体库;步骤3,对毕赤酵母菌株突变体库种的菌株进行单液滴包埋和液滴培养,得到含有毕赤酵母菌株突变体的液滴,步骤4,根据液滴内荧光的强度进行液滴微流控分选,筛选出液滴;步骤5、对液滴分别进行摇瓶发酵及复筛,得到分泌木聚糖酶能力提高的毕赤酵母菌株。本发明采用液滴微流控技术对木聚糖酶融合荧光蛋白的毕赤酵母菌株进行筛选,其筛选通量可以达到每小时10万菌株,筛选百万级别的菌株库仅需要10h,消耗荧光试剂总体积100μL。
Description
技术领域
本发明属于微生物生物技术领域。更具体地说,本发明涉及一种基于液滴微流控芯片的毕赤酵母高通量筛选方法。
背景技术
毕赤酵母作为一种成熟的外源蛋白表达系统,已经实现了1000多种外源蛋白的表达,其多个优良的表达特性早已得到广泛验证,如分泌效率高、遗传操作简单、培养成本低等。目前,针对外源蛋白在毕赤酵母中的高效表达,一方面在分子水平上对外源基因进行改造,能够大大提高外源基因的表达,另一方面利用高通量筛选技术来获得高表达菌株。以往毕赤酵母的筛选方法主要是基于平板和孔板等传统方法,如利用刚果红染色法或者G418抗性筛选,其筛选的库容量为二千个左右,孔板筛选其筛选的库容量也为千个数量级。由于毕赤酵母的外分泌特性,表达的产物分泌到细胞外,不能使用用于细胞内或表面物质的流式细胞仪进行高通量筛选。以上这些常规的筛选方法存在成本高、耗时长、通量低等问题,无法快速有效地筛选出高表达毕赤酵母。
液滴微流控技术是近几年发展起来的高通量筛选新技术,该系统最大的优势在于可以将单细胞包埋在液滴中,每个液滴皆可作为独立的微反应器进行细胞的培养及代谢物或酶生产,通过对液滴内物质信号的检测进行分析与分选。其最高筛选通量达 108/天,检测试剂消耗成本低、速度快、通量高的显著特点,实现了包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母等不同类型工业微生物生产相关目标酶或代谢产物的高效筛选。关于毕赤酵母的液滴微流控高通量筛选尚未见其报道。因每种宿主由于自身特点不同,故不能直接用已报道的方法进行筛选。
发明内容
本发明旨在通过对表达外源蛋白的毕赤酵母单细胞液滴包埋条件、液滴培养和时间等参数优化,建立基于液滴微流控的毕赤酵母表达系统的高通量筛选方法,解决了毕赤酵母常规筛选的缺点问题,为获得表达和分泌异源蛋白能力提高的毕赤酵母工程菌株提供了有效途径。
本发明提供一种基于液滴微流控芯片的毕赤酵母高通量筛选方法,包括如下步骤:
步骤1、构建表达外源蛋白融合荧光蛋白的毕赤酵母菌株;
步骤2,通过诱变步骤1中的毕赤酵母菌株,建立毕赤酵母菌株突变体库;
步骤3,对步骤2中的毕赤酵母菌株突变体库中的菌株进行单液滴包埋和液滴培养,构建得到液滴微流控芯片;
步骤4,检测步骤3中的液滴内的荧光,根据液滴内荧光的强度进行液滴微流控分选,筛选出荧光强度相对较高的一个或几个液滴,即得到表达外源蛋白能力提高的毕赤酵母菌株。
其中,还包括步骤5、对步骤4中分选后得到的液滴分别进行摇瓶发酵和复筛,筛选出表达和分泌荧光蛋白及外源蛋白能力提高的毕赤酵母菌株。
其中,所述步骤5中的复筛是指将筛选出高产菌株,再按步骤2-4进行2-5轮液滴微流控筛选。
其中,所述外源蛋白为木聚糖酶,所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白。
其中,所述步骤3中,所述菌株单液滴包埋条件为:对菌株进行0.5-2min超声分散处理,液滴包埋的起始细胞浓度为OD600=0.1-0.5。需要注意的是,此处,对菌株进行超声分散处理是指,将构建完的突变体库中的菌株进行培养后,将带有培养菌株的菌种悬浊液进行超声分散处理。
其中,超声处理的条件为,超声仪器总功率950W,使用功率4%,超声9.9s,停9.9s,循环交替进行。
进一步,所述步骤3中,所述菌株单液滴包埋条件为:对菌株进行1min超声分散处理,液滴包埋的起始细胞浓度为OD600=0.3。
其中,所述步骤3中,所述单细胞液滴培养时间:为16-48h,培养温度为25-35℃。
进一步,所述步骤3中,所述单细胞液滴培养时间:为24h,培养温度为30℃。
其中,所述步骤2中的诱变方法为常压室温等离子体诱变法。
其中,所述步骤2中,所述菌株的常压室温等离子体诱变时间为30-90s。
进一步,所述步骤2中,所述菌株的常压室温等离子体诱变时间为60s。
其中,所述步骤4中,所述融合的毕赤酵母菌株测定的木聚糖酶活值与荧光蛋白表达强度成正相关,检测液滴内的荧光强弱即可进行木聚糖酶活值强弱的筛选。
本发明至少包括以下有益效果:本发明采用液滴微流控技术对木聚糖酶融合荧光蛋白的毕赤酵母菌株进行筛选,其筛选通量可以达到每小时10万菌株,筛选百万级别的菌株库仅需要10h,消耗荧光试剂总体积100μL。采用本发明的高通量筛选方法,得到了若干株酶活提高的突变株,其中最高突变株木聚糖酶提高达到300%,分泌能力提升达到160%。
附图说明
图1为本发明的实施例中毕赤酵母液滴微流控的高通量筛选方法的流程图;
图2(a)为本发明的实施例中重组质粒的酶切鉴定图;图2(b)为本发明的实施例中重组毕赤酵母转化子PCR验证图;图2(c)为本发明的实施例中毕赤酵母重组子的荧光显微镜图;
图3(a)为本发明实施例中不同培养时间单细胞液滴内绿色荧光信号;图3(b)为本发明实施例中的单细胞液滴内木聚糖酶活检测图;
图4为本发明的实施例中重组毕赤酵母菌株ARTP诱变致死率的测定结果;
图5为本发明的实施例中液滴微流控五轮筛选后突变株的木聚糖酶酶活值比较图;
图6为本发明的实施例中液滴微流控五轮筛选后突变株的分泌特性分析图。
具体实施方式
下面结合附图和实施案例对本发明作进一步详细说明,但本发明保护范围不局限于所述内容;实施案例中主要采用常规的基因工程分子生物学克隆方法,这些方法是本领域普通技术人员所熟知的。案例中所涉及的木聚糖基因xyn5来源于芽孢杆菌 Bacillussp.QH14/XynQH14。
实施例1毕赤酵母高产木聚糖的液滴微流控高通量筛选方法
一、木聚糖酶融合绿色荧光蛋白的毕赤酵母菌株构建与表达
通过PCR扩增得到木聚糖酶xyn5基因和绿色荧光蛋白gfp基因融合片段,并克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中构建出木聚糖酶融合绿色荧光蛋白的质粒 pPIC9K-xyn5-gfp,用EcoRⅠ和NotⅠ对其进行双酶切验证,从图2(a)中可以看到 xyn5-gfp融合片段和pPIC9K载体片段两条带;将质粒电转化至毕赤酵母GS115中,通过提取基因组进行PCR扩增验证整合效率,由图2(b)琼脂糖凝胶电泳检测结果表明扩增条带与外源基因片段xyn5-gfp大小一致,重组毕赤酵母菌株GS115/pPIC9K-xyn5 –gfp构建成功;将上述转化子经含有1%甲醇的BMMY培养基诱导培养后,显微镜检测细胞呈现绿色荧光,外源蛋白gfp基因成功表达。
二、单细胞液滴包埋条件的优化
为了获得最佳的单细胞液滴包埋效果,本案例分别从粘连细胞的单细胞超声分散处理和用于液滴包埋的起始细胞浓度两方面进行优化。
将菌株接种于2mL YPD培养基中,30℃,250r/min培养14h,以OD600=0.1转接至BMGY培养基30℃,250r/min培养14h,洗涤重悬以OD600=1转接至5mL BMMY 无甲醇培养基中,超声处理(仪器总功率950W,使用功率4%,超声9.9s,停9.9s,共1min、0.5min或者2min)获得单分散的毕赤酵母细胞。采用液滴包埋芯片进行单细胞液滴包埋,液滴包埋的起始细胞浓度分别为OD600=0.5、OD600=0.3和OD600=0.1。
经过不同时间的超声处理后,毕赤酵母细胞的聚集显著下降,95%以上的细胞为分散细胞,且超声处理前后的单细胞液滴包埋率变化显著。不同起始细胞浓度对应不同超声处理时间得到的单细胞包埋率见表1。从表1中可以看出,按照泊松分布计算,当起始细胞浓度为OD600=0.3时,单细胞包埋率约为19.2%,空液滴率为78.2%,单细胞包埋率最佳。经超声处理后的单细胞液滴包埋率比未经超声处理的单细胞包埋率高 13倍。增大细胞浓度OD600=0.5时,单细胞包埋率比理论计算的包埋率低,实时观测显示过高的起始细胞浓度易造成细胞在微流控芯片内堆积成团,使得实际分散细胞数目减少,致使细胞液滴包埋率降低。综上,最终确定最佳单细胞液滴包埋条件为菌体超声分离处理1min,细胞起始OD600=0.3。
表1
OD<sub>600</sub> | 超声处理时间 | 单细胞包埋率(理论) | 单细胞包埋率(实际) |
0.1 | 1min | 7.5 | <1 |
0.3 | 未处理 | 19.2 | ≈1 |
0.3 | 0.5min | 19.2 | ≈5 |
0.3 | 1min | 19.2 | ≈13 |
0.3 | 2min | 19.2 | ≈12.3 |
0.5 | 1min | 27.2 | ≈8 |
0.5 | 2min | 27.2 | ≈6.9 |
三、液滴培养时间的优化
对不同培养时间(16h、24h和48h)的单细胞液滴内融合荧光蛋白的荧光信号和木聚糖酶活性测定,如图3(a)和3(b)显示单细胞液滴培养24h时,液滴内SG工程菌株和GS115空宿主对照的荧光蛋白信号差异显著,此时工程菌株的信号比空宿主菌株信号提高近4倍,酶标仪孔板测定的木聚糖酶的酶活与液滴内荧光信号差异一致。上述研究结果表明木聚糖酶活与荧光蛋白表达强度成正相关,可以通过检测液滴内的荧光蛋白的荧光信号强弱来反映木聚糖酶的产量,进而筛选高表达木聚糖酶的菌株。继续培养至48h时检测,两种菌株的差异信号未见明显增加,结合缩短筛选周期的需求,因此单细胞液滴的培养时间24h后进行液滴微流控高通量分选。
四、菌株ARTP诱变致死率的测定
采用常压室温等离子体(ARTP)诱变重组毕赤酵母构建突变体库。菌体悬液稀释至5×107个/mL后进行1min超声处理,将处理后菌液滴在铁片上,进行ARTP诱变,诱变时间分别为30s,40s,50s,60s,90s。诱变后将铁片至于1mL生理盐水中涡旋震荡洗下菌体,得到的菌悬液稀释100倍,取100μL涂布于YPD平板上,以0 s作为对照,30℃静置培养至长出单菌落,计算出致死率。
致死率(%)=[(对照组菌落数-诱变实验菌落数)/对照组菌落数]×100%
图4为本发明的重组毕赤酵母菌株按照上述时间进行ARTP诱变致死率的测定结果。从图4中可知,30s致死率急速增长到60%,从40s到90s缓慢达到100%,60s 的正突变率最高为20%,选取60s为最终的构建突变体库的时间。
五、液滴微流控筛选
通过步骤三中发现融合的毕赤酵母菌株测定的木聚糖酶活与荧光蛋白表达强度成正相关,检测液滴内的荧光强弱即可进行筛选。以重组毕赤酵母菌株SG为出发菌株,经ARTP诱变后建立突变菌株库,进行单细胞液滴制备、培养和筛选,得到蛋白荧光信号强的液滴涂布平板。从筛选获得的单菌落中随机挑选出部分菌株,采用摇瓶发酵,甲醇诱导24h后测定发酵液上清的荧光值及酶活,得到一株木聚糖酶高表达的菌株 SG-m1。以SG-m1为出发菌株,进行同样流程的第二轮诱变建库和液滴微流控筛选,以此类推。结果如图5所示,经过五轮筛选,突变菌株表达木聚糖酶的酶活值逐步增加,最终得到一株木聚糖酶高表达菌株SG-m5,酶活值为149.17U/mg,比出发菌株提高 300%。
六、突变株分泌特性分析
通过测定菌体的发酵液的上清和细胞菌体的荧光值,计算上清/细胞菌体的荧光比例来探究菌株的分泌特性。
将五轮依次筛选出的高表达菌株分别进行50mL摇瓶发酵,甲醇诱导24h后测定其OD600值,上清荧光值、细胞菌体荧光值,并计算出分泌比例,结果如图6所示。图 6显示在24h内细胞菌体的荧光值均大于上清荧光值,表示细胞均未发生裂解。经过多轮的液滴微流控筛选,获得的高产菌株,不仅木聚糖酶的产量得到提高,突变菌株的分泌能力也提到了提高,对比出发菌株SG,筛选获得突变菌株SG-m5的分泌能力提高了160%。
实施例2
毕赤酵母高产纤维素酶的液滴微流控高通量筛选方法
用来源于草酸青霉Penicilliuoxalicum的cbh1基因构建产纤维素酶的毕赤酵母菌株 GS115/pPIC9K-cbh1,将菌株按实施例1中的步骤2-4进行处理,其中菌株经ARTP诱变建立突变体库,诱变时间为60s,将毕赤酵母突变体库中的菌株进行1min超声处理(仪器总功率950W,使用功率4%,超声9.9s,停9.9s,共1min),之后以包埋OD600=0.3进行单液滴包埋和液滴培养,30℃,培养40h后检测液滴内的纤维素酶底物荧光信号强度进行液滴微流控分选,筛选出信号强度较高的一个或几个液滴,分别进行摇瓶发酵筛选出纤维素酶高产菌株;再将筛选出的菌株按上述步骤进行2-5轮液滴微流控筛选(即复筛步骤),得到若干株纤维素酶活提高突变株,其中最高突变株酶活值比出发菌株提高220%。
本发明上述实施例中所述的酶活值均是值酶的比活力,即每毫克蛋白所含的酶活力单位数。当酶活值越大时,表明酶的纯度越高,即菌种针对酶的表达量高了。
Claims (5)
1.一种基于液滴微流控芯片的毕赤酵母高通量筛选方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1,构建表达外源蛋白融合荧光蛋白的毕赤酵母菌株;
步骤2,通过诱变步骤一中的毕赤酵母菌株,建立毕赤酵母菌株突变体库;
步骤3,对步骤2中的毕赤酵母菌株突变体库中的菌株进行单液滴包埋和液滴培养,构建得到液滴微流控芯片;
步骤4,检测步骤3中的液滴内的荧光,根据液滴内荧光的强度进行液滴微流控分选,筛选出荧光强度相对较高的一个或几个液滴,即得到表达外源蛋白能力提高的毕赤酵母菌株;
所述步骤3中,所述菌株单液滴包埋条件为:对菌株进行1min超声分散处理,液滴包埋的起始细胞浓度为OD 600 =0.3,所述单细胞液滴培养时间:为24h,培养温度为30℃;还包括步骤5、对步骤4中分选后得到的液滴分别进行摇瓶发酵筛选和复筛筛选出表达和分泌荧光蛋白及外源蛋白能力提高的毕赤酵母菌株;所述外源蛋白为木聚糖酶或纤维素酶,超声处理的条件为,超声仪器总功率950 W,使用功率4%,超声9.9 s,停9.9 s,循环交替进行。
2.根据权利要求1中所述的一种基于液滴微流控芯片的毕赤酵母高通量筛选方法,其特征在于,所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白。
3.根据权利要求1-2任一所述的一种基于液滴微流控芯片的毕赤酵母高通量筛选方法,其特征在于,所述步骤2中的诱变方法为常压室温等离子体诱变法。
4.根据权利要求3所述的一种基于液滴微流控芯片的毕赤酵母高通量筛选方法,其特征在于,所述步骤2中,所述菌株的常压室温等离子体诱变时间为30-90 s。
5.根据权利要求4所述的一种基于液滴微流控芯片的毕赤酵母高通量筛选方法,其特征在于,所述菌株的常压室温等离子体诱变时间为60 s。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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