CN117907594A - 一种高通量筛选和分析酵母单细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物和微流控技术领域，尤其涉及一种高通量筛选和分析酵母单细胞的方法，所述方法包括如下步骤：S1.液滴生成；S2.液滴孵育；S3.液滴分选。本发明可以在单个酵母水平上对异源分泌蛋白进行快速、高效和可靠的动力学分析，还可以高通量完成分泌蛋白质和菌株的定向进化，筛选百万级酵母菌株仅需2~5 h，荧光试剂仅需1~6μL，大幅度降低试剂成本。
Description
技术领域
本发明涉及微生物和微流控技术领域，尤其涉及一种高通量筛选和分析酵母单细胞的方法。
背景技术
重组蛋白市场一般包括蛋白治疗剂、诊断蛋白和工业酶三个方向，全球重组蛋白市场从2015年的70亿美元增长至2020年的108亿美元，预计2025年市场规模有望突破200亿美元，呈现蓬勃发展态势。随着中国生物制药行业的日益发展，国内重组蛋白市场发展势头强劲。在重组蛋白市场中，大约有20%~30%的生物治疗产品和工业酶是由酵母生产得到。与细菌和哺乳动物生产宿主相比，酵母结合了微生物和高等真核表达系统的一系列优势，包括发酵简单、快速、便宜，易于遗传操作，具有蛋白质翻译后修饰功能，可分泌表达，纯化工艺简单而且安全等。为了提高异源蛋白表达量及分泌效率，往往需要对酵母表达系统进行优化，现有技术中一般通过平板筛选方法或流式细胞术获得高性能菌株。平板筛选方法耗时长，成本高，通量低，不能快速获得高性能菌株，而流式细胞术难以检测胞外分泌的异源蛋白，二者均很难兼顾收益和效果的平衡。
微流控荧光激活液滴分选技术可以对酵母单个细胞进行包裹，并通过分泌异源蛋白产量进行荧光定量，根据荧光信号筛选出高性能菌株。该筛选方法具有体积小、通量高和特异性强特点，其应用难点在于通过分泌的异源蛋白产量进行荧光定量。
中国专利CN111718862B公开了基于液滴微流控芯片的毕赤酵母高通量筛选方法，通过构建毕赤酵母菌株、毕赤酵母菌株突变体库、对毕赤酵母菌株突变体库种的菌株进行单液滴包埋和液滴培养，得到含有毕赤酵母菌株突变体的液滴、根据液滴内荧光的强度进行液滴微流控分选，筛选出液滴、对液滴分别进行摇瓶发酵及复筛，得到分泌木聚糖酶能力提高的毕赤酵母菌株。
中国专利CN108485984A公开了纤维素酶高产菌株的高通量筛选方法，包括：步骤一、将纤维素酶产生菌的孢子置于湿室培养，直至孢子萌动至接近萌发的状态结束湿室培养；步骤二、采用液滴微流控技术将孢子、培养基以及纤维素酶标记底物包埋于液滴中，进行预培养，在孢子萌发产生的菌丝长度达到液滴边缘之前结束预培养；步骤三、检测液滴内的荧光，根据液滴内的荧光强度进行液滴微流控分选，筛选出荧光强度相对较高的一个或几个液滴；步骤四、对分选后的液滴中的孢子进行纯培养及复筛，以筛选出纤维素酶高产菌株。
发明内容
本发明提供了一种高通量筛选和分析酵母单细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
S1.液滴生成：试剂相与酵母相在微流体生成芯片中混合时被油相切割，得到液滴；
S2.液滴孵育：液滴在20-30℃环境孵育12-36h，直至液滴中能够观察到荧光聚集；
S3.液滴分选：将液滴、隔离油、平衡油注入微流体分选芯片，激光扫描液滴，光电倍增管读取荧光信号，通过阈值分选收集阳性液滴；
所述试剂相包括微球和荧光抗体。
进一步地，所述荧光抗体可与异源分泌蛋白结合，用于指示分泌蛋白聚集在微球表面。
在一些实施方式中，所述微球需要进行预处理，所述预处理包括将微球与生物素化抗原或生物素化标签抗体共孵育，和/或，所述微球为链霉亲和素聚苯乙烯微球。
进一步地，将微球与生物素化抗原或生物素化标签抗体在旋转仪上室温孵育1h，用于后续结合异源分泌蛋白。
在一些实施方式中，所述酵母相为单细胞酵母悬液。
在一些实施方式中，在S1的液滴生成中，被油相切割后得到的液滴为独立的反应腔室，单细胞酵母在液滴中分泌异源蛋白，异源蛋白与试剂相反应，导致荧光聚集在微球表面。
在一些实施方式中，所述试剂相与酵母相中加入悬浮液添加剂，和/或，所述酵母相中加入细胞保护剂。
在一些实施方式中，所述悬浮液添加剂为Optiprep，所述细胞保护剂PluronicF-68。
在一些实施方式中，所述液滴在20-30℃环境孵育12-36h后，需要在显微镜下观察液滴中微球聚集荧光的情况，若荧光信号明显则用于后续液滴分选；若荧光信号较弱，则继续孵育，直至微球出现较强的荧光信号。
在一些实施方式中，在S3的液滴分选中，若液滴中荧光信号超过分选阈值，则对液滴施加电场，液滴发生偏转进入收集流道；若液滴中荧光信号未超过分选阈值，则液滴进入废弃流道。
在一些实施方式中，所述S1中油相的流速为450-800μL/h，试剂相的流速为150-400μL/h，酵母相的流速为150-400μL/h。
申请人在研发中发现，流速过高会导致液滴生成不稳定，流速过低导致液滴生成速度缓慢。相对于现有技术，本发明的液滴生成速度快。
在一些实施方式中，所述S3中分选的参数：方波数8-30，输出频率8-13KHz，延迟时间0us，分选电压1000-1200V。
在实际操作中，设定参数不在上述限定的范围内，会导致液滴无法正确分选，如阳性液滴进入废液流道，或阴性液滴进入收集流道。相对于现有技术，本发明的分选准确率高。
在一些实施方式中，所述S3中隔离油的流速为600-1500μL/h，平衡油的流速为400-1000μL/h，液滴的流速为80-200μL/h。
在筛选过程中，流速过大会导致液滴无法正常分选，流速过低会导致分选速度降低。相对于现有技术，本发明的液滴分选速度快。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明可以在单个酵母水平上对异源分泌蛋白进行快速、高效和可靠的动力学分析。
2.本发明可以高通量完成分泌蛋白质和菌株的定向进化，筛选百万级酵母菌株仅需2~5 h，荧光试剂仅需1~6 μL，大幅度降低试剂成本。
3.相较于CN111718862B，本发明筛选百万级别菌株耗时更短，仅为其时长的1/5-1/2；且本发明筛选百万级别菌株试剂消耗更少；此外，相对于其需要构建外源蛋白融合荧光蛋白的酵母菌株，本发明不需要对酵母菌株进行任何工程化改造，可直接筛选突变库菌株，降低了筛选复杂性和困难度。
4．相较于CN108485984A的筛选通量为104突变体/天，本发明筛选通量是其通量的100倍以上。
附图说明
图1为本发明筛选方法的示意图。
图2为本发明液滴生成芯片，其中1为生成油口，2为试剂相口，3为酵母相口，4为液滴口。
图3为本发明液滴分选芯片，其中5为隔离油口，6为平衡油口，7为液滴口，8为收集口，9为废液口。
图4为实施例1中酵母在液滴中增殖的结果图。
图5为实施例1中液滴分选结果图。
图6为对比例1的液滴分选结果图。
图7为对比例2的液滴分选结果图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供了一种高通量筛选和分析酵母单细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
S1.液滴生成：试剂相与酵母相在微流体生成芯片中混合时被油相切割，得到液滴；
S2.液滴孵育：液滴在28℃环境孵育16h，直至液滴中能够观察到荧光聚集；
S3.液滴分选：将液滴、隔离油、平衡油注入微流体分选芯片，激光扫描液滴，光电倍增管读取荧光信号，通过阈值分选收集阳性液滴；
所述微球为链霉亲和素聚苯乙烯微球；
所述油相为生成油；
所述试剂相的制备方法如下：
1）取250 μL链霉亲和素聚苯乙烯微球（Spherotech，SVP-60-5）悬液加入1.5 mLEP管，室温2000×g离心5 min；
2）弃上清，加入200 μL PBS缓冲液重悬微球，室温2000×g离心5 min；
3）重复步骤2，使用PBS缓冲液洗涤2次；
4）加入200 μL PBS缓冲液及15 μg生物素化抗原或生物素化标签抗体（可以购买或定制，本实施例选用的是生物素化标签抗体（Biotin anti-c-Myc Antibody,Biolegend, 908805）），重悬混匀，置于旋转仪上室温孵育1h；
5）室温2000×g离心5 min，弃上清；
6）加入200 μL PBS缓冲液，重悬混匀，室温2000×g离心5 min；
7）弃上清，加入200 μL酵母培养基（市售），重悬混匀，室温2000×g离心5 min；
8）重复步骤7，酵母培养基洗涤1次；
9）弃上清，加入166 μL酵母培养基，32 μL悬浮液添加剂（Optiprep）及2μL荧光标记的抗体（市售），充分重悬混匀。
所述酵母相的制备方法如下：
1）取1mL已诱导培养的酵母悬液，使用超声波破碎仪震荡酵母，制成单细胞悬液；
2）使用紫外分光光度计测量酵母OD600，或对酵母悬液梯度稀释后使用血球计数板计数；
3）取1.5×106酵母，加入166 μL酵母培养基，再加入36 μL悬浮液添加剂（Optiprep）和2μL细胞保护剂（Pluronic F-68），充分重悬混匀。
所述S1.液滴生成的具体操作方法如下：
1）取2.5 mL第一注射器加入2 mL生成油（HFE-7500中添加5%的表面活性剂），取2.5 mL第二注射器加入300 μL已过滤HFE（氟醚）和200 μL试剂相，取2.5 mL第三注射器加入300 μL已过滤HFE和200 μL酵母相；
2）取3根30 cm的PTFE微管，安装至3支注射器上，并分别将注射器固定于3个注射泵；
3）调节3个注射泵速度，使液滴移至微管的端口；
4）如图2所示，将第一注射器连接的微管插入芯片1口，第二注射器连接的微管插入芯片2口，第三注射器连接的微管插入芯片3口；
5）取1根15 cm的PTFE微管，插入芯片4口；
6）打开注射泵，设置注射泵参数，生成油（第一注射器）流速为450 μL/h，试剂相（第二注射器）流速为200 μL/h，酵母相（第三注射器）流速为200 μL/h；
7）等液滴生成稳定后，将芯片3口的微管另一端插入预冷的EP管中；
8）取1μL液滴置于显微镜下观察，并测量液滴直径。
本发明所述的表面活性剂均为Rain Dance Technologies公司的EA Surfactant商品。
所述S2液滴孵育的具体操作方法如下：
1）将生成的液滴置于28ºC培养箱16 h；
2）取1μL液滴置于显微镜下观察，若液滴中微球有明显的荧光聚集，则进行分选。
所述S3液滴分选的具体操作方法如下：
1）取两支2.5 mL第四注射器和第五注射器，分别加入2mL隔离油（HFE-7500中添加1.5%的表面活性剂）和2mL平衡油（HFE-7500中添加1.5%的表面活性剂），另取2.5 mL第六注射器加入300μL隔离油，再将液滴转移至注射器;
2）取3根30 cm的PTFE微管，安装至3支注射器上，并分别将注射器固定于3个注射泵；
3）调节3个注射泵速度，使液滴移至微管的端口；
4）如图3所示，将第四注射器连接的微管插入芯片5口，第五注射器连接的微管插入芯片6口，第六注射器连接的微管插入芯片7口；
5）取2根15 cm的PTFE微管，分别插入芯片8口和9口，另一端分别插入两个EP管；
6）将电压放大器的输出正负极接至芯片对应的电极上；
7）启动注射泵，设置注射泵参数，隔离油（第四注射器）流速为600 μL/h，平衡油（第五注射器）流速为680 μL/h，液滴（第六注射器）流速为80 μL/h；
8）液滴稳定后，开启激光，将激光调节至芯片的合适位置；
9）设置分选软件（LabVIEW）参数：Bursts 30、Output frequency 13 kHz、Delay0、Sorting amplitude 5；
10）启动电压放大器，设置电压放大器为250倍；
11）观察液滴分选情况，调整各项参数，至阳性液滴成功分选；
12）分选结束后，关闭电压放大器，将芯片5口的微管轻轻拔出，转移至新EP管中；
13）取1μL分选后液滴置于显微镜下观察，计算分选准确率。
S1 -S2的实验结果如图4所示，部分生成的液滴中包裹酵母单细胞和微球，随着液滴孵育时间的延长，酵母开始增殖（如图中箭头所示）。酵母少量增殖时，显微镜下不能观察到微球聚集的荧光；当液滴孵育16 h后，酵母开始大量增殖，此时观察到微球聚集荧光，因而可以用于后续的液滴分选。当液滴孵育72 h后，酵母充满液滴，此时液滴荧光背景增强，无法观察到微球聚集的荧光，不适于后续的液滴分选。
S1 -S2步骤说明了酵母可以在本发明的液滴中增殖，并且与酵母共包裹的微球可以聚集荧光。
S3的实验结果如图5所示，高产酵母与微球共包裹的液滴（如图中箭头所示）在分选前的占比约为0.66%，而分选后的占比上升至83%，证明微流控技术可以有效筛选高表达异源分泌蛋白的酵母。
S3步骤说明了微球聚集的荧光信号高于分选阈值，可以筛选到高产酵母菌株。
对比例1
本对比例与实施例1的不同之处在于，所述S2液滴孵育中，液滴孵育时间延长至72h。
结果如图6所示，酵母充满液滴后，即使没有包裹微球也可以提高背景荧光信号（如图中箭头所示）。此时，高于分选阈值的荧光信号可能来自阳性液滴中微球聚集的荧光或来自假阳性液滴中提高的背景荧光，最终导致假阳性率升高至85%以上。
对比例2
本对比例与实施例1的不同之处在于，所述S3液滴分选中参数设定不同。本对比例降低了方波数（Bursts）和输出频率（Output frequency），方波数设定为6，输出频率设定为6KHz，其余参数不变。结果如图7所示，出现分选异常现象，阳性液滴无法偏转进入收集流道。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种高通量筛选和分析酵母单细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1.液滴生成：试剂相与酵母相在微流体生成芯片中混合时被油相切割，得到液滴；
S2.液滴孵育：液滴在20-30℃环境孵育12-36h，直至液滴中能够观察到荧光聚集；
S3.液滴分选：将液滴、隔离油、平衡油注入微流体分选芯片，激光扫描液滴，光电倍增管读取荧光信号，通过阈值分选收集阳性液滴；
所述试剂相包括微球和荧光抗体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微球需要进行预处理，所述预处理包括将微球与生物素化抗原或生物素化标签抗体共孵育，和/或，所述微球为链霉亲和素聚苯乙烯微球。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酵母相为单细胞酵母悬液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在S1的液滴生成中，被油相切割后得到的液滴为独立的反应腔室，单细胞酵母在液滴中分泌异源蛋白，异源蛋白与试剂相反应，导致荧光聚集在微球表面。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述试剂相与酵母相中加入悬浮液添加剂，和/或，所述酵母相中加入细胞保护剂。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述悬浮液添加剂为Optiprep，所述细胞保护剂PluronicF-68。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在S3的液滴分选中，若液滴中荧光信号超过分选阈值，则对液滴施加电场，液滴发生偏转进入收集流道；若液滴中荧光信号未超过分选阈值，则液滴进入废弃流道。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S1中油相的流速为450-800μL/h，试剂相的流速为150-400μL/h，酵母相的流速为150-400μL/h。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S3中分选的参数：方波数8-30，输出频率8-13KHz，延迟时间0us，分选电压1000-1200V。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S3中隔离油的流速为600-1500μL/h，平衡油的流速为400-1000μL/h，液滴的流速为80-200μL/h。
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