CN102876706A

CN102876706A - 高通量筛选高效表达外源蛋白的重组里氏木霉的方法

Info

Publication number: CN102876706A
Application number: CN2012102718262A
Authority: CN
Inventors: 董志扬; 秦丽娜
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2012-08-01
Filing date: 2012-08-01
Publication date: 2013-01-16
Anticipated expiration: 2032-08-01
Also published as: CN102876706B

Abstract

本发明公开了高通量筛选高效表达外源蛋白的重组里氏木霉的方法。该高通量筛选高效表达外源蛋白的重组里氏木霉的方法包括如下步骤：比较经流式细胞仪鉴定的表达外源蛋白的重组里氏木霉的红色荧光强度，根据红色荧光强度的高低鉴定外源蛋白的表达能力，红色荧光强度越高的表达外源蛋白的重组里氏木霉的外源蛋白表达能力越高。其中的外源蛋白基因以融合基因的形式导入里氏木霉，该融合基因是将红色荧光蛋白基因通过连接肽2A序列与外源蛋白基因连接得到的融合基因，所述外源蛋白基因位于所述红色荧光蛋白基因的上游或下游；所述外源蛋白基因的5′端具有信号肽序列；所述连接肽2A序列编码序列表中序列8的第290-306位所示的连接肽2A。

Description

高通量筛选高效表达外源蛋白的重组里氏木霉的方法

技术领域

本发明涉及高通量筛选高效表达外源蛋白的重组里氏木霉的方法。

背景技术

丝状真菌里氏木霉（Trichoderma reesei)是纤维素酶、半纤维素酶的主要工业生产菌株，该菌是美国FDA认证的食品安全级的工业生产菌株，具有强大的蛋白分泌能力，某些突变株的外分泌蛋白量可达100g/L，并且具有与高等哺乳动物相似的糖基化系统，因此里氏木霉是一种非常理想的重组蛋白表达宿主，得到国际著名酶制剂公司（如Genencor、Novozymes等）高度重视，并成功应用于多种药物、化学试剂以及酶试剂的表达和生产。同时，里氏木霉的发酵工艺成熟，发酵成本较低，为其投入工业化生产奠定了良好的基础。近年来，随着里氏木霉基因组学的快速发展以及其遗传操作系统的不断完善，利用里氏木霉表达异源蛋白也越来越受到重视。

值得指出的是外源DNA片段多以非同源末端连接的途径NHEJ（nonhomologousend-joining）整合入宿主基因组，呈随机插入的形式。异源蛋白的表达框在基因组中的不同位置会直接影响到其表达水平。例如，若外源基因插入了沉默子的调控区可能直接导致其不能转录而表达失败，如果外源基因插入增强子的可调控区域也可能使其表达量有大幅度的提高。另一个方面，外源基因进入基因组后，其在基因组中的拷贝数也是随机的，而拷贝数本身也是影响表达量的一个重要因素。由于里氏木霉基因组信息的不完善以及其同源重组率的局限性，很难确定基因组中具体哪一个位置更有利于基因的表达，同时，对所有转化子进行拷贝数鉴定本身也是十分繁琐的工作。随着里氏木霉遗传操作体系的不断优化，其转化效率已经可以基本满足人们的需要，但当得到大量的转化子，如何筛选目的蛋白高效表达的转化子成了问题的关键。对于重组蛋白的异源表达，传统的筛选手段只能是挑取大量的转化子进行发酵后，对目的蛋白进行活性测定等方法进行筛选，这样的方法比较繁琐，需耗费大量的人力物力，而且从得到转化子到筛选到高效表达的菌株周期也比较长。更重要的是，随着转化效率的不断提高，用传统的方法很难对所有的转化子进行鉴定，这样很容易把一些真正的高表达菌株遗漏掉。这就需要建立一种高通量的筛选方法。

流式细胞仪技术(flow cytometry)是一种对处在液流中的单个细胞或其它生物颗粒等进行快速定量分析和分选的技术。流式细胞仪将流体喷射技术、激光技术、空气技术、γ射线能谱术及电子计算机等技术与显微荧光光度计密切结合的一种非常先进的检测仪器，通过测量细胞及其他生物颗粒的散射光和标记荧光强度，来快速分析颗粒的物理或化学性质，并可以对细胞进行分类收集，可以高速分析上万个细胞，同时从一个细胞中测得多个细胞特征参数，进行定性或定量分析，具有速度快、精度高、准确性好等特点。2003年BD公司推出了世界上首款台式高速多荧光检测和分选的流式细胞仪FACS Aria，其主要用途是从细胞群中高速分选出被指定的细胞，其分选准确度高，速度快，可达到70000个/s。由于分选时间短，使分选到的细胞活性良好，并且它可以将细胞分选至流式细胞管、培养皿、细胞培养板（6孔板、24孔板及96孔板），以便作进一步鉴定、功能研究或细胞培养。目前，流式细胞仪分选技术已广泛应用于医学研究，但其在丝状真菌领域的应用较少。目前，国内外尚没有利用流式细胞仪分选技术高通量筛选高效表达重组蛋白的里氏木霉工程菌的报道。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是提供一种鉴定或辅助鉴定高效表达外源蛋白的重组里氏木霉的方法。

本发明所提供的鉴定或辅助鉴定表达外源蛋白的重组里氏木霉的方法，包括如下步骤：

1）将红色荧光蛋白基因通过连接肽2A序列与外源蛋白基因连接得到融合基因，所述外源蛋白基因位于所述红色荧光蛋白基因的上游或下游；所述外源蛋白基因的5′端具有信号肽序列；所述连接肽2A序列编码序列表中序列8的第290-306位所示的连接肽2A；

2）制备融合基因表达盒和筛选标记基因表达盒以及含有所述融合基因表达盒和所述筛选标记基因表达盒的重组表达载体；

3）用含有所述融合基因表达盒和所述筛选标记基因表达盒的重组表达载体转化里氏木霉，得到转化子；培养所述转化子并将所有转化子制备成原生质体，收集所述转化子的原生质体细胞；

4）用流式细胞仪对步骤3）的所述原生质体进行分选，有红色荧光的所述转化子为表达外源蛋白的重组里氏木霉或候选表达外源蛋白的重组里氏木霉，无红色荧光的所述转化子为非表达外源蛋白的重组里氏木霉或候选非表达外源蛋白的重组里氏木霉。

其中，表达盒是包含目的基因（所述融合基因或所述筛选标记基因）及其表达所必需的所有调控序列的单链或双链核酸分子。所述调控序列在其相容条件下能指导编码序列在合适的宿主细胞中表达目的基因。所述调控序列包括，但不限于，前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列和转录终止子。最低限度，调控序列要包括启动子以及转录和翻译的终止信号。为了导入载体的特定限制性酶位点以便将调控序列与目的基因的编码区进行连接，可以提供带接头的调控序列。调控序列可以是合适的启动子序列，即可被表达核酸序列的宿主细胞识别的核酸序列。启动子序列含有介导目的基因表达的转录调控序列。启动子可以是在所选宿主细胞中有转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，可以得自编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因。调控序列还可以是合适的转录终止序列，即能被宿主细胞识别从而终止转录的一段序列。终止序列可操作连接在编码多肽的核酸序列的3’末端。在所选宿主细胞中可发挥功能的任何终止子都可以用于本发明。调控序列还可以是合适的前导序列，即对宿主细胞的翻译十分重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作连接于目的基因的5’末端。在所选宿主细胞中可发挥功能的任何前导序列均可用于本发明。在这些例子中，应将目的基因的核酸序列与调控序列可操作连接在一起。

术语“可操作连接”在文中定义为这样一种构象，其中调控序列位于目的基因的适当位置，以使调控序列指导目的基因的表达。

其中，2）中的含有所述融合基因表达盒和所述筛选标记基因表达盒的重组表达载体可以是一个重组表达载体也可以是两个重组表达载体，即所述融合基因表达盒和所述筛选标记基因表达盒位于同一个重组表达载体中或所述融合基因表达盒位于一个重组表达载体中，所述筛选基因表达盒位于另一个重组表达载体中。

上述所述筛选基因表达盒中的筛选标记基因是这样一个基因，其产物赋予对杀生物剂或病毒的抗性、对重金属的抗性，或赋予营养缺陷体原养型等。细菌选择标记的例子如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者抗生素如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素的抗性标记。在本发明的实施例中，所述筛选标记基因为pyr4，是营养选择性标记基因乳清酸核苷-5′-单磷酸脱羧酶的基因。

上述1）中的融合基因也属于本发明的保护范围。

所述融合基因具体可为由红色荧光蛋白基因通过连接肽2A序列与外源蛋白基因连接得到的DNA片段，所述外源蛋白基因位于所述红色荧光蛋白基因的上游或下游；所述连接肽2A序列的核苷酸序列为序列表中的序列7的第868-918位核苷酸。该连接肽2A序列是根据里氏木霉密码子偏好性设计的。

本申请的实验证明，所述外源蛋白基因位于所述红色荧光蛋白基因的上游的融合基因比所述外源蛋白基因位于所述红色荧光蛋白基因的下游的融合基因的外源蛋白表达量高。

在本发明的一个实施例中，所述融合基因中所述外源蛋白基因具体为脂肪酶基因；所述脂肪酶基因编码的蛋白的氨基酸序列是序列表中序列8的第20-289位，所述红色荧光蛋白基因编码的蛋白的氨基酸序列是序列表中序列8的第307-531位。

所述融合基因的编码序列具体可为B1-B3中的任一种：

B1、序列表中序列7的第1-1596位（SL2AR基因的编码序列）；

B2、序列表中序列7的第58位-1596位（L2AR基因的编码序列）；

B3、序列是序列表中序列5的第10-1629位（R2AL的编码序列）。

本发明的实施例中，公开了两个融合基因表达盒。一个融合基因表达盒从上游至下游依次由CBH1基因启动子、CBH1基因信号肽序列、脂肪酶基因、连接肽序列、红色荧光蛋白基因和CBH1基因终止子组成。其中，CBH1基因信号肽序列、脂肪酶基因、连接肽序列和红色荧光蛋白基因组成融合基因SL2AR基因。SL2AR基因的编码序列是序列表中的序列7的第1-1596位核苷酸，其中第1-51位为CBH1基因信号肽的编码序列，52-57位为EcoRI识别序列，第58位-867位为脂肪酶的成熟蛋白编码序列，第868-918位为连接肽2A的编码序列，第919-1596位为红色荧光蛋白的编码序列。SL2AR基因编码序列表中序列8的融合蛋白SL2AR。序列表中序列8的第1-17位为CBH1基因信号肽，第20-531位为融合蛋白SL2AR的成熟蛋白L2AR序列，第20-289位为脂肪酶的成熟蛋白序列，290-306位为连接肽2A，第307-531位为红色荧光蛋白。CBH1基因启动子的序列是序列1的第1-1912位，CBH1基因终止子（Tcbh1）的序列如序列表中序列3所示。

另一个融合基因表达盒从上游至下游依次由CBH1基因启动子、红色荧光蛋白基因、连接肽序列、脂肪酶信号肽序列、脂肪酶基因和CBH1基因终止子组成。其中，红色荧光蛋白基因、连接肽序列、脂肪酶信号肽序列和脂肪酶基因组成融合基因R2AL基因。R2AL基因的编码序列是序列表中序列5的第10-1629位，序列5的第10-684位为红色荧光蛋白基因，第685-735位为连接肽2A序列，第736-1629位为带信号肽的脂肪酶基因，其中第736-816为脂肪酶自身信号肽序列，第817-1629位成熟的脂肪酶基因。R2AL编码的融合蛋白的氨基酸序列是序列表中的序列6，序列6中，第1-225位为红色荧光蛋白序列，第226-242位为连接肽2A序列，第243-269为脂肪酶自身信号肽序列，第270-539位为脂肪酶的成熟蛋白序列。CBH1基因启动子的序列是序列表中的序列2，CBH1基因终止子（Tcbh1）的序列如序列表中序列3所示。

上述鉴定或辅助鉴定表达外源蛋白的重组里氏木霉的方法可用于筛选高表达外源蛋白的重组里氏木霉。

本发明还提供了一种具体的筛选高表达外源蛋白的重组里氏木霉的方法。

本发明所提供的筛选高表达外源蛋白的重组里氏木霉的方法，包括如下步骤：比较经上述任一种方法鉴定的表达外源蛋白的重组里氏木霉的红色荧光强度，根据红色荧光强度的高低鉴定外源蛋白的表达能力，红色荧光强度越高的表达外源蛋白的重组里氏木霉的外源蛋白表达能力越高。

本发明的实验证明，融合基因中的连接肽2A序列可使红色荧光蛋白和目标外源蛋白这两个蛋白等量（1：1）表达并独立存在，具有信号肽的外源蛋白（脂肪酶）可以有效分泌到胞外，而缺乏信号肽的红色荧光蛋白留在胞内，红色荧光强度越高的表达外源蛋白的重组里氏木霉的外源蛋白表达能力越高。本发明的实验证明红色荧光蛋白的荧光强度可以很好地表征外源蛋白的表达量，细胞内红色荧光蛋白的荧光强度和发酵液中外源蛋白的分泌量呈正相关。

本发明还涉及下述任一种与上述融合基因相关的生物材料：

1）由上述融合基因转录得到的RNA分子；

2）含有上述融合基因的重组载体、重组细胞或重组微生物；

3）含有1）所述RNA分子的重组载体、重组细胞或重组微生物；

4）由上述融合基因编码的蛋白质；所述蛋白质的氨基酸序列为A1-A4中的任一种：

A1、序列表中的序列8（带脂肪酶信号肽的前体蛋白SL2AR序列）；

A2、序列表中的序列8第20-531位（SL2AR的成熟蛋白L2AR序列）；

A3、序列表中的序列6（带脂肪酶信号肽的前体蛋白R2AL序列）

A4、将序列表中序列6的第243-269位缺失得到的序列（将R2AL中的脂肪酶信号肽去掉得到的成熟蛋白）。

在本发明的一个实施例中，含有上述融合基因的重组微生物具体为里氏木霉(Trichoderma reesei)的菌株号为TR1124，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.6384。

本发明可用于筛选高效表达外源蛋白的里氏木霉工程菌，本发明筛选到的一株表达脂肪酶的里氏木霉工程菌-里氏木霉(Trichoderma reesei)TR1124 CGMCC No.6384其发酵上清液的脂肪酶酶活可达238IU/mL。

菌种名称：里氏木霉

拉丁名：Trichoderma reesei

菌株编号：TR1124

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2012年7月20日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.6384

附图说明

图1为质粒pSKLR和pSKRL的结构示意图

图2为原生质体的制备及红色荧光蛋白的诱导表达示意图。

图3为红色荧光蛋白和脂肪酶表达量的对应关系示意图

图4为SDS-Page比较分析里氏木霉工程菌TR1124、菌株TU6和N10的发酵液上清。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

培养基、试剂

1)土豆培养基PDA（100ml）：20g去皮马铃薯，切碎，加入90mL水，煮沸30min，双层纱布过滤，加入2g葡萄糖和1.8g琼脂粉，用水定容至100mL,115℃高压蒸气灭菌。

2)基本培养基（Minimal medium，MM）组成：溶剂为水，每升培养基中溶质及其质量为：0.05g（NH₄）₂SO₄，0.15g KH₂PO₄，0.006g MgSO₄，0.006g CaCl₂，0.00005g FeSO₄·7H₂O，0.000016g MnSO₄·H₂O，0.000014g ZnSO₄·7H₂O，0.00002g CoCl₂。

3)发酵培养基：在MM培养基中加入下列碳源（如1%纤维素、3%乳糖、1%木聚糖、2%葡萄糖、2%甘油，终浓度）之一，pH 5.2±0.1。

A1、含1.0M山梨醇但不含尿苷的MM培养基平板（MM+山梨醇+2%葡萄糖）：在MM+2%葡萄糖培养基中加入山梨醇至终浓度为1.0M，再加入琼脂制成固体培养基。

A2、MM+0.1%Triton X100的平板：在含有2%葡萄糖的MM中加入Triton X100至体积终浓度为0.1%，再加入琼脂制成固体培养基。

A3、含2%葡萄糖的MM液体培养基：在MM中加入葡萄糖至终浓度为2%（质量百分浓度）得到的液体培养基。

A4、MM+1%微晶纤维素液体培养基：在MM中加入微晶纤维素至终浓度为1%（质量百分浓度）得到的液体培养基。

4）LB培养基：溶剂是水，每升培养基中溶质及其质量百分含量为：1%蛋白胨，1%氯化钠，0.5%酵母提取物。

5）里氏木霉染色体DNA提取缓冲液：

Tris.Cl pH 8.5 200mM

EDTA pH 8.0 25mM

NaCl 250mM

SDS 2%

6）原生质体制备及转化相关试剂

0.2M磷酸缓冲液pH7.4(每100mL)

0.2M Na₂HPO₄ 81mL

0.2M NaH₂PO₄ 19mL

1.2mol/L的MgSO₄溶液

MgSO₄ 1.2M

磷酸缓冲液pH 7.4 10mM

0.6M的山梨醇溶液

山梨醇 0.6M

Tris.Cl pH 7.0 0.01M

1.0M的山梨醇溶液

山梨醇 1.0M

CaCl₂ 0.01M

Tris.Cl pH 7.5 0.01M

PEG溶液

PEG4000 50%

CaCl₂ 0.05M

Tris.Cl pH 7.5 0.01M

实施例1、高产异源脂肪酶的重组里氏木霉菌株的筛选

本实施例筛选到了两种转化子，分别是pSKLR转化子和pSKRL转化子。

1、红色荧光蛋白与异源脂肪酶融合表达载体pSKLR和pSKRL的构建

1）PCR扩增纤维二糖水解酶I（CBH1）基因启动子和信号肽片段PScbh1：

以里氏木霉（Trichoderma reesei)菌株QM9414(ATCC 26921)基因组DNA为模板，Pcbh1-F，PScbh1-R为引物进行PCR扩增，扩增条件为：95℃预变性5min，94℃变性30s，61.1℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃扩展延伸10min，扩增得到是含有cbh1基因信号肽的启动子片段PScbh1。琼脂糖凝胶电泳试剂盒回收目的条带，连接至pEASY-Blunt simple载体，形成重组载体，转化大肠杆菌DH5α。挑取转化子进行鉴定并抽提质粒，进行测序，结果表明PScbh1的序列如序列表中序列1所示，序列1的第1-1912位为CBH1基因启动子，第1913-1963位为CBH1基因信号肽序列。

2）PCR扩增纤维二糖水解酶I（CBH1）基因启动子Pcbh1：

以里氏木霉（Trichoderma reesei)菌株QM9414(ATCC 26921)基因组DNA为模板，Pcbh1-F，Pcbh1-R为引物进行PCR扩增，扩增条件为：95℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃扩展延伸10min，扩增得到cbh1基因的启动子片段Pcbh1。琼脂糖凝胶电泳试剂盒回收目的条带，连接至pEASY-Bluntsimple载体，形成重组载体，转化大肠杆菌DH5α。挑取转化子进行鉴定并抽提质粒，进行测序，结果表明Pcbh1的序列如序列表中序列2所示。

3）PCR扩增纤维二糖水解酶I（CBH1）基因终止子Tcbh1

以里氏木霉（Trichoderma reesei)菌株QM9414(ATCC 26921)基因组DNA为模板，Tcbh1-F，Tcbh1-R为引物进行PCR扩增，扩增条件为：95℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2.5min，30个循环；最后72℃扩展延伸10min，扩增得到cbh1基因的终止子片段Tcbh1。琼脂糖凝胶电泳试剂盒回收目的条带，连接至pEASY-Blunt simple载体，形成重组载体，转化大肠杆菌DH5α。挑取转化子进行鉴定并抽提质粒，进行测序，结果表明Tcbh1的序列如序列表中序列3所示。

4）重叠延伸PCR扩增红色荧光蛋白，2A序列与脂肪酶基因的融合片段L2AR（脂肪酶基因在上游，红色荧光蛋白基因在下游）。第一轮PCR：以黑曲霉总RNA反转录得到的cDNA为模板，lipase2a-F，lipase2a-R为引物扩增含有连接肽2A序列和部分红色荧光蛋白基因片段的脂肪酶基因片段。以质粒pDsRed-Monomer-N1（ClontechCatalog#6921-1）为模板，2ared-F，2ared-R为引物扩增含有2A序列和部分脂肪酶基因片段的红色荧光蛋白基因。将这两个片段进行琼脂糖凝胶电泳并胶回收试剂盒纯化。第二轮PCR：将胶回收纯化的两个PCR产物等摩尔混合作为模板，lipase2a-F，2ared-R为引物进行Overlap PCR扩增即可得到两个基因融合的片段L2AR。将该片段克隆入pMD18Tsimple载体中进行测序。测序结果表明L2AR的核苷酸序列是序列表中序列4的第8-1547位，序列4的第8-818位为脂肪酶基因，第819-869位为连接肽2A序列，第870-1547位为红色荧光蛋白基因。

5）重叠延伸PCR扩增红色荧光蛋白，2A序列与脂肪酶基因的融合片段R2AL (红色荧光蛋白基因在上游，脂肪酶基因在下游)。第一轮PCR：以质粒pDsRed-Monomer-N1为模板，2aRed-cF，2aRed-cR为引物扩增含有部分脂肪酶基因片段的红色荧光蛋白（RFP）基因片段。以黑曲霉总RNA反转录得到的cDNA为模板，2alp-cF，2alp-cR为引物扩增含有部分RFP基因片段的脂肪酶基因。将这两个片段进行琼脂糖凝胶电泳并胶回收试剂盒纯化。第二轮PCR：将胶回收纯化的两个PCR产物等摩尔混合作为模板，2aRed-cF，2alp-cR为引物进行PCR扩增即可得到两个基因融合的片段R2AL。将该片段克隆入pMD18-T simple载体中进行测序。测序结果表明R2AL的核苷酸序列是序列表中序列5的第10-1629位，序列5的第10-684位为红色荧光蛋白基因，第685-735位为连接肽2A序列，第736-1629位为脂肪酶基因，其中第736-816为脂肪酶自身信号肽序列。R2AL编码的融合蛋白的氨基酸序列是序列表中的序列6，序列6中，第1-225位为红色荧光蛋白序列，第226-242位为连接肽2A序列，第243-269为脂肪酶自身信号肽序列，第270-539位为脂肪酶的成熟蛋白序列。

6）融合基因表达载体pSKRL和pSKLR的构建：

用限制性内切酶SalI和SpeI对质粒pBluescript SK(+)（Stratagene,Catalog#212205）进行双酶切，SalI，EcoRI对Pcbh1片段和PScbh1进行双酶切消化，EcoRI，SpeI对片段R2AL和L2AR进行双酶切消化，分别将消化好的载体片段、Pcbh1片段、R2AL或载体片段、PScbh1片段、L2AR片段混合进行三片段连接，转化大肠杆菌，分别用引物2aRed-cF，2alp-cR和lipase2a-F，2ared-R引物对两种转化子进行菌落PCR鉴定，挑取鉴定正确的克隆抽提质粒命名为pPSKPRL和pPSKPLR。

用限制性内切酶SpeI和NotI酶切消化终止子片段Tcbh1以及质粒载体pPSKPRL和pPSKPLR，并将酶切消化后的终止子片段分别与消化后的pPSKPRL和pPSKPLR进行连接，转化大肠杆菌，引物Tcbh1-F和Tcbh1-R对所得克隆进行菌落PCR鉴定，挑取鉴定正确的克隆抽提质粒即为融合表达载体pSKRL和pSKLR(结构见图1)。所用到的引物见表1。

pSKLR的结构示意图如图1中A所示，含有的融合基因表达盒由CBH1基因启动子、CBH1基因信号肽序列、脂肪酶基因、连接肽基因、红色荧光蛋白基因和CBH1基因终止子组成。CBH1基因启动子、CBH1基因信号肽在图中以PScbh1表示，脂肪酶基因以lipase表示，连接肽基因以2A表示，红色荧光蛋白基因以DsRed表示，CBH1基因终止子以Tcbh1表示。pSKLR含有的将红色荧光蛋白基因通过连接肽2A序列与外源蛋白基因连接得到融合基因是SL2AR基因（脂肪酶基因在上游，红色荧光蛋白基因在下游）。SL2AR基因的编码序列是序列表中的序列7的第1-1596位核苷酸，其中第1-51位为CBH1基因信号肽的编码序列，52-57位为EcoRI识别序列，第58位-867位为脂肪酶的成熟蛋白编码序列，第868-918位为连接肽2A的编码序列，第919-1596位为红色荧光蛋白的编码序列。SL2AR基因编码序列表中序列8的融合蛋白SL2AR。序列表中序列8的第1-17位为CBH1基因信号肽，第20-531位为融合蛋白SL2AR的成熟蛋白L2AR序列，第20-289位为脂肪酶的成熟蛋白序列，290-306位为连接肽2A，第307-531位为红色荧光蛋白。

pSKRL的结构示意图如图1中B所示，含有的融合基因表达盒由CBH1基因启动子、红色荧光蛋白基因、连接肽基因、脂肪酶基因和CBH1基因终止子组成。CBH1基因启动子在图中以Pcbh1表示，脂肪酶基因以lipase表示，连接肽基因以2A表示，红色荧光蛋白基因以DsRed表示，CBH1基因终止子以Tcbh1表示。pSKRL含有的将红色荧光蛋白基因通过连接肽2A序列与外源蛋白基因连接得到融合基因是R2AL基因（脂肪酶基因在下游，红色荧光蛋白基因在上游）。R2AL基因的编码序列是序列表中序列5的第10-1629位，序列5的第10-684位为红色荧光蛋白基因，第685-735位为连接肽2A序列，第736-1629位为带信号肽的脂肪酶基因，其中第736-816为脂肪酶自身信号肽序列，第817-1629位成熟的脂肪酶基因。R2AL编码的融合蛋白的氨基酸序列是序列表中的序列6，序列6中，第1-225位为红色荧光蛋白序列，第226-242位为连接肽2A序列，第243-269为脂肪酶自身信号肽序列，第270-539位为脂肪酶的成熟蛋白序列。

表1：用于构建重组载体的引物

2、尿嘧啶缺陷筛选标记基因表达载体pSKpyr4的构建

1）里氏木霉pyr4基因的克隆：以里氏木霉（Trichoderma reesei)菌株QM9414(ATCC26921)的基因组DNA为模板，Pyr4-F，Pyr4-R为引物进行PCR扩增，扩增条件为：95℃预变性5min，94℃变性30s，62℃退火40s，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃扩展延伸10min。将所得PCR产物于1％琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳试剂盒回收目的条带，TA克隆连入pMD18T-Simple载体中，进行测序。测序结果表明Pyr4-F和Pyr4-R扩增得到的pyr4基因表达框的核苷酸序列是序列表中序列9的第9-1926位。将含有序列表中序列9的PCR产物的重组载体命名为pMD-pyr4。

2）质粒载体pSKpyr4的构建：分别用限制性内切酶ClaI和EcoRI对质粒pBluescriptSK(+)和pMD-pyr4质粒进行双酶切，回收酶切处理的pBluescript SK(+)载体片段和pyr4基因片段，并进行连接。转化大肠杆菌Top10，挑取转化子进行菌落PCR鉴定，引物为Pyr4-F和Pyr4-R。提取验证正确的质粒即为尿嘧啶缺陷菌株TU6的互补质粒载体pSKpyr4（pyr4基因插入pBluescript SK(+)的ClaI和EcoRI位点间）。

二、表达异源脂肪酶的里氏木霉转化子的获得

1、里氏木霉菌株TU6的原生质体制备

6）原生质体制备及转化相关试剂

0.2M磷酸缓冲液pH7.4(每100mL)

0.2M Na₂HPO₄ 81mL

0.2M NaH₂PO₄ 19mL

1.2mol/L的MgSO₄溶液

MgSO₄ 1.2M

磷酸缓冲液pH 7.4 10mM

0.6M的山梨醇溶液

山梨醇 0.6M

Tris.Cl pH 7.0 0.01M

1.0M的山梨醇溶液

山梨醇 1.0M

CaCl₂ 0.01M

Tris.Cl pH 7.5 0.01M

PEG溶液

PEG4000 50%

CaCl₂ 0.05M

Tris.Cl pH 7.5 0.01M

1）取新鲜培养的斜面或平板上的里氏木霉（Trichoderma reesei)菌株TU6（Thedevelopment of a heterologous transformation system for the cellulolyticfungus Trichoderma reesei based on a pyrG-negative mutant strain.E Gruber 1,j.Visser 2,C.P.Kubicek 1,and L.H.de Graaff 2.Curr Genet(1990)18:71-76；公众可从中国科学院微生物研究所获得该菌株）孢子，用适量无菌水洗涤孢子制成孢子悬液，200目筛子过滤除去残余的菌丝。将过滤的孢子悬液接种至装有100mL MM培养基的500mL三角瓶中，28℃培养13h-14h，至菌丝伸展。

2）将培养液经200目筛子过滤，收集菌体，无菌水洗涤2-3次，最后用1.2M的MgSO₄溶液洗涤一次，让溶液自然流尽；

3）将筛子上的菌体冲洗到装有15mL裂解液的三角瓶中（裂解液是含有150mg的裂解酶和15mg纤维素酶的1.2M MgSO₄溶液），30℃反应1.5h，显微镜下观察原生质体产生的情况，1h后每隔10min取样观察一次；

4）当原生质体大量产生并且仍有大量菌丝存在时，加等体积0.6M的山梨醇溶液终止反应，200目筛子过滤除去残余的菌丝，室温3000rpm离心10min收集原生质体沉淀；

5）沿着沉淀一侧倒去上清，原生质体沉淀用1.0M山梨醇溶液重悬，室温3000rpm离心10min；

6）重复步骤5，弃上清将原生质体悬浮于200μL1.0M山梨醇溶液中，血球板计数器观察并计数。

2、融合基因表达载体和筛选标记基因表达载体共转化里氏木霉制备pSKRL转化子和pSKLR转化子

将融合基因表达载体pSKRL与筛选标记基因表达载体pSKpyr4共转化里氏木霉（Trichoderma reesei)菌株TU6，将融合基因表达载体pSKLR与筛选标记基因表达载体pSKpyr4共转化里氏木霉（Trichoderma reesei)菌株TU6，具体方法如下;

1）将所有待转化质粒pSKpyr4，pSKRL及pSKLR进行大量抽提并用2倍体积的无水乙醇及1/10体积的3.0M醋酸钠(pH5.2)过夜沉淀，用70%乙醇洗涤2次，用灭菌ddH₂O溶解，使各个质粒浓度达μg级。

2）质粒pSKpyr4与pSKRL按摩尔比1:3的比例混合，质粒pSKpyr4与pSKLR按摩尔比1:3的比例混合，体积不超过20μL，将该混合液加入到上述制备的原生质体中，轻轻混匀，再往其中各加入50μLPEG4000，再次混匀，冰上放置30min；设对照，对照用等体积的无菌水代替DNA混合液。

3）再往上述管中各加入1mL PEG4000，混匀，室温放置20min。

4）最后再各自加入1mL 1.0M山梨醇，再次混匀，将所有的原生质体转化液转移至装有50mL诱导再生培养基的250mL三角瓶中，诱导再生培养基配方为每升培养基中溶质为1g葡萄糖，1g甘油20g乳糖，180g山梨醇，0.05g（NH₄）₂SO₄，0.15g KH₂PO₄，0.006g MgSO₄，0.006g CaCl₂，0.00005g FeSO₄·7H₂O，0.000016gMnSO₄·H₂O，0.000014g，ZnSO₄·7H₂O，0.00002g CoCl₂；溶剂为水。培养条件为30℃，100rpm缓慢震荡培养24h后将转速调至200rpm继续震荡培养，至观察到菌丝变红为止。

5）30℃培养3-6d后，菌丝变红，收集所有的菌丝，得到pPSKRL转化子菌丝和pPSKLR转化子菌丝。再次制备原生质体进行流式细胞仪分选用（见图2）。图2中，A：原生质体在再生诱导培养基中诱导96h后的菌丝生长状况；B：荧光显微镜下观察红色荧光蛋白的诱导情况；C：普通光学显微镜下观察重新将诱导的转化子制备成的原生质体；D：荧光显微镜下观察重新将诱导的转化子制备成原生质体后红色荧光蛋白的表达情况。

三、转化子的流式细胞仪筛选

1、样品制备：收集所有转化子在诱导条件下再生的菌丝，再次制备成原生质体悬液，400目筛子过滤。镜检观察原生质体制备的完整性并用血球计数板进行计数。将原生质体悬液调整至浓度为10⁷/mL的悬液，500μL。荧光显微镜观察红色荧光蛋白表达情况。

2、流式细胞分选仪调试：用FACS Aria流式细胞仪(美国BD FACS Aria)分选原生质体中带RFP的细胞。100μm喷嘴，557nm绿光激发，鞘液压力为20psi。选定100μm喷嘴，超声清洗1分钟。开机后，打开主液流断点窗口，点击主液流，调节液流振动幅度(Ampl)，使液滴间隔值(Gap值)稳定，将调试参数尽量设置到最佳，保持主液流的连续性和稳定性。主液流稳定后，打开侧液流窗口电压，点击Test Sort，调整参数，使液流分束清晰。安装四路分选装置，打开侧液流窗口电压，点击Test Sort，收起废液抽屉，调整侧液流窗的电压滚动条，使偏转的分选液流落入相应的收集管中。将主液流窗中实际调出的Dmpl值添到默认窗口中。

3、四通道细胞分选：以出发菌株里氏木霉（Trichoderma reesei)菌株TU6的原生质体作为阴性对照建立分选门。分选门的确定基于以下几个原则：完整的原生质体具有较高的前向角(forward scatter，FSC)和侧向角(side scatter，SSC)比值，相对于阴性对照，RFP阳性细胞在绿光通道(585nm)有强烈的发射光。细胞直接分选至原生质体再生培养基中(MM+山梨醇)。

4、转化子原生质体的二次筛选：将以上分选到的荧光强度最强的一组原生质体进行再生，再次制备原生质体悬液，进行96孔微孔板单个细胞分选，微孔板中装入诱导再生培养基。有红色荧光的转化子为表达外源蛋白的重组里氏木霉或候选表达外源蛋白的重组里氏木霉，无红色荧光的转化子为非表达外源蛋白的重组里氏木霉或候选非表达外源蛋白的重组里氏木霉。

四、红色荧光蛋白和异源脂肪酶表达量的对应关系测定

96孔微孔板单个细胞分选后，pSKRL转化子和pSKLR转化子各选荧光强度各不同的46株菌在PDA固体平板上产孢。将孢子制备成孢子悬液接种种子瓶，种子瓶培养基的配方为每升培养基中，溶质及其含量为20g葡萄糖，0.05g（NH₄）₂SO₄，0.15g KH₂PO₄，0.006g MgSO₄，0.006g CaCl₂，0.00005g FeSO₄·7H₂O，0.000016gMnSO₄·H₂O，0.000014g，ZnSO₄·7H₂O，0.00002g CoCl₂；溶剂为水。培养条件为30℃，200rpm震荡培养48h后，四层纱布过滤菌体，分别称取1.8g菌体接种至发酵培养基中，发酵培养基配方为种子培养基的碳源更换为乳糖即可，30℃，200rpm震荡培养96h后，测定发酵液上清液的脂肪酶酶活，并对菌丝体荧光强度进行测定。经检测，菌丝具有红色荧光的转化子的发酵液上清液无红色荧光，说明红色荧光蛋白留在了细胞内，没有分泌到细胞外。

1、红色荧光蛋白的荧光测定

称取等重的菌丝体置于24孔微孔板中，用多功能荧光读板仪读取各个转化子的荧光值，设定激发光波长为557nm，发射光波长为585nm，采用13×13多点扫描的方式进行扫描后取其平均值，然后将不表达红色荧光蛋白的里氏木霉（Trichodermareesei)菌株TU6的荧光值设为1，转化子取相对荧光值。

2、脂肪酶的活性测定

脂肪酶的活性测定参照国标GB/T 23535，反应底物为橄榄油乳化液。脂肪酶活力单位（IU）定义为：在试验条件下，每毫升酶液每分钟催化底物释放出1μmol的游离脂肪酸，定义为一个脂肪酶活力单位（IU）。

红色荧光蛋白和异源脂肪酶表达量的对应关系见图3，由图可以看出，转化子的红色荧光蛋白的表达水平与体外脂肪酶的活性趋势基本吻合，结果表明，利用2A序列作为连接肽融合表达红色荧光蛋白和脂肪酶，可以使这两个蛋白等量表达并独立存在，具有信号肽的脂肪酶可以有效分泌到胞外，而缺乏信号肽的红色荧光蛋白留在胞内作为报告基因进行流式细胞仪高通量筛选脂肪酶高表达的菌株。图3也表明在相同荧光强度下，pSKLR转化子的脂肪酶活性更高，因此pSKLR组合更有利于筛选到高效表达的转化株。图3中，A：pSKRL转化子；B：pSKLR转化子。

3、一株高产异源脂肪酶的pSKLR转化子

将筛选到一株高产异源脂肪酶的pSKLR转化子命名为里氏木霉工程菌TR1124，已于2012年7月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏登记号为CGMCC No.6384，其分类命名为里氏木霉(Trichoderma reesei)。

本发明的实验证明，该工程菌中，异源脂肪酶基因在里氏木霉内源纤维二糖水解酶1（CBH1）基因处发生了同源重组，与内源纤维二糖水解酶1基因发生了替换。由于纤维二糖水解酶1基因在里氏木霉中的表达量极高，已有很多文献报道该基因表达量的减少可以明显提高里氏木霉异源蛋白的产量。因此，CBH1基因的缺失是该工程菌异源脂肪酶高效表达的原因之一。该工程菌在基础培养基中摇瓶发酵，三次重复实验结果表明里氏木霉(Trichoderma reesei)TR1124 CGMCC No.6384的发酵上清液的脂肪酶酶活可达238IU/mL（平均值），具体的操作方法为：首先将1mL浓度为10⁷个孢子/mL的里氏木霉(Trichoderma reesei)TR1124 CGMCC No.6384孢子悬液接种于装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，28℃，200rpm震荡培养48h，四层纱布过滤，称取1.8g菌丝接种于装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，28℃，200rpm震荡培养144h后取发酵液上清液（无红色荧光）进行活性测定。种子培养基配方为：每升培养基中，溶质及其含量为20g葡萄糖，0.05g（NH₄）2SO₄，0.15g KH₂PO₄，0.006g MgSO₄，0.006g CaCl₂，0.00005g FeSO₄·7H₂O，0.000016g MnSO₄·H₂O，0.000014g ZnSO₄·7H₂O，0.00002g CoCl₂；溶剂为水。发酵培养基配方为将种子培养基中的20g葡萄糖更换为10g微晶纤维素和10g甘油。

经检测，里氏木霉(Trichoderma reesei)TR1124 CGMCC No.6384的菌丝具有红色荧光，其发酵液上清液无红色荧光，说明红色荧光蛋白留在了细胞内，没有分泌到细胞外。

与实验室中通过传统方法筛选到的一株生产脂肪酶的里氏木霉菌株N10相比，该工程菌的脂肪酶产量明显提高（图4），由图4也可看出，里氏木霉(Trichoderma reesei)TR1124的CBH1没有表达。图4中，Tu6为里氏木霉（Trichoderma reesei)菌株TU6。

Claims

1.鉴定或辅助鉴定表达外源蛋白的重组里氏木霉的方法，包括如下步骤：

3）用所述重组表达载体转化里氏木霉，得到转化子；培养所述转化子并制备成原生质体，收集所述转化子的原生质体细胞；

4）用流式细胞仪对步骤3）的所述原生质体细胞进行分选，有红色荧光的所述转化子为表达外源蛋白的重组里氏木霉或候选表达外源蛋白的重组里氏木霉，无红色荧光的所述转化子为非表达外源蛋白的重组里氏木霉或候选非表达外源蛋白的重组里氏木霉。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述融合基因是权利要求6-8中任一所述的融合基因。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述融合基因表达盒由纤维二糖水解酶I基因的启动子、纤维二糖水解酶I基因终止子和位于二者之间的所述融合基因组成，所述纤维二糖水解酶I基因的启动子位于所述融合基因的上游。

4.权利要求1-3中任一所述的方法在筛选高表达外源蛋白的重组里氏木霉中的应用。

5.筛选高表达外源蛋白的重组里氏木霉的方法，包括如下步骤：比较经权利要求1-3中任一所述方法鉴定的表达外源蛋白的重组里氏木霉的红色荧光强度，根据红色荧光强度的高低鉴定外源蛋白的表达能力，红色荧光强度越高的表达外源蛋白的重组里氏木霉的外源蛋白表达能力越高。

6.融合基因，是由红色荧光蛋白基因通过连接肽2A序列与外源蛋白基因连接得到的DNA片段，所述外源蛋白基因位于所述红色荧光蛋白基因的上游或下游；所述连接肽2A序列的核苷酸序列为序列表中的序列7的第868-918位核苷酸。

7.根据权利要求6所述的融合基因，其特征在于：所述外源蛋白基因为脂肪酶基因；所述脂肪酶基因编码的蛋白的氨基酸序列是序列表中序列8的第20-289位，所述红色荧光蛋白基因编码的蛋白的氨基酸序列是序列表中序列8的第307-531位。

8.根据权利要求7所述的融合基因，其特征在于：所述融合基因的编码序列为B1-B3中的任一种：

B1、序列表中序列7的第1-1596位；

B2、序列表中序列7的第58位-1596位；

B3、序列是序列表中序列5的第10-1629位。

9.下述任一种材料：

1）由权利要求6-8中任一所述的融合基因转录得到的RNA分子；

2）含有权利要求6-8中任一所述的融合基因的重组载体、重组细胞或重组微生物；

4）由权利要求6-8中任一所述的融合基因编码的蛋白质；所述蛋白质的氨基酸序列为A1-A4中的任一种：

A1、序列表中的序列8；

A2、序列表中的序列8第20-531位；

A3、序列表中的序列6；

A4、将序列表中序列6的第243-269位缺失得到的序列。

10.里氏木霉(Trichoderma reesei)，其特征在于：所述里氏木霉(Trichodermareesei)的菌株号为TR1124，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.6384。