JP2021532743A - 組換え株を迅速にスクリーニングするための組換え発現ベクター及びその応用 - Google Patents
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Abstract
Description
cbh1プロモーター、赤色蛍光タンパク質遺伝子DsRed、細胞表面にタンパク質を固定させるシグナルペプチド遺伝子AfMp1及びcbh1ターミネーターという要素が含まれている遺伝子発現カセットをプラスミドに導入することにより、組換え発現ベクターを得るステップであって、ここで、DsRed遺伝子のヌクレオチド配列がSEQ ID NO.2に示され、AfMp1遺伝子のヌクレオチド配列がSEQ ID NO.3に示されるステップ(1)と、
前記ステップ(1)で構築された前記組換え発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換することにより、組換え株を得るステップ(2)と、
前記組換え株を培養し、前記組換え株の表面に赤色蛍光タンパク質の発現を誘導するステップ(3)と、
赤色蛍光を示す前記組換え株をスクリーニングするステップ(4)と、を含む。
cbh1プロモーター、赤色蛍光タンパク質遺伝子DsRed、細胞表面にタンパク質を固定させるシグナルペプチド遺伝子AfMp1及びcbh1ターミネーターという要素が含まれている遺伝子発現カセットをプラスミドに導入することにより、組換え発現ベクターを得るステップであって、ここで、DsRed遺伝子のヌクレオチド配列がSEQ ID NO.2に示され、AfMp1遺伝子のヌクレオチド配列がSEQ ID NO.3に示されるステップ(1)と、
前記ステップ(1)で構築された前記組換え発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換することにより、組換えトリコデルマ・リーゼイを得るステップ(2)と、
前記ステップ(2)で得られた前記組換えトリコデルマ・リーゼイに、タンパク質分泌の経路関連遺伝子を導入するか、又は、前記ステップ(2)で得られた前記組換えトリコデルマ・リーゼイにベクター又は遺伝子をランダムに挿入することにより、前記組換えトリコデルマ・リーゼイの変異体ライブラリーを得るステップ(3)と、
表面に強烈な赤色蛍光を示す前記組換えトリコデルマ・リーゼイをフローサイトメーターでスクリーニングするステップ(4)と、
前記ステップ(4)でスクリーニングされた前記組換えトリコデルマ・リーゼイのセルラーゼ酵素活性を測定し、セルラーゼ酵素活性が向上した前記組換えトリコデルマ・リーゼイを取得するステップ(5)と、を含むことを特徴とする。
赤色蛍光タンパク質遺伝子と、細胞表面にタンパク質を固定させるシグナルペプチド遺伝子とのDsRed−AfMP1融合遺伝子が含まれている組換え発現ベクターを構築するステップであって、ここで、DsRed遺伝子のヌクレオチド配列がSEQ ID NO.2に示され、AfMp1遺伝子のヌクレオチド配列がSEQ ID NO.3に示されるステップ(1)と、
前記ステップ(1)で構築された前記組換え発現ベクターを用いて菌株を形質転換することにより、組換え株を得るステップ(2)と、
前記ステップ(2)で得られた前記組換え株に、スクリーニング待ちの標的遺伝子を導入するか、又は、前記ステップ(2)で得られた前記組換え株にベクター又は遺伝子をランダムに挿入することにより、前記組換え株の変異体ライブラリーを得るステップ(3)と、
表面に赤色蛍光を示す組換え株をフローサイトメーターでスクリーニングするステップ(4)と、
前記ステップ(4)でスクリーニングされて表面に赤色蛍光を示す前記組換え株のセルラーゼ酵素活性を測定し、セルラーゼ酵素活性が向上した前記組換え株を取得するステップ(5)と、
セルラーゼ酵素活性が向上した前記組換え株に発現される外因性標的遺伝子、又は干渉された内因性遺伝子を特定して、セルラーゼ酵素活性の向上に関係するタンパク質分泌の経路関連遺伝子を取得するステップ(6)と、を含む。
RTQactR(5'-GGTACCACCAGACATGACAATGTTG-3')
RTQhacF(5'-ACAACGTCCTGCAGTGTCAA-3')
RTQhacR(5'-TAGCGATCTGCATCAAGGGC-3')
RTQbipF(5'-AAGAAGGTTACCCACGCCG-3')
RTQbipR(5'-ATCAAAGGTACCACCACCGAG-3')
Claims (11)
- 遺伝子発現カセットにおいて上流から下流まで、cbh1プロモーター、赤色蛍光タンパク質遺伝子DsRed、細胞表面にタンパク質を固定させるシグナルペプチド遺伝子AfMp1及びcbh1ターミネーターという要素が順に含まれ、ここで、DsRed遺伝子のヌクレオチド配列がSEQ ID NO.2に示され、AfMp1遺伝子のヌクレオチド配列がSEQ ID NO.3に示されることを特徴とする、セルラーゼ高発現トリコデルマ・リーゼイを迅速にスクリーニングするための組換え発現ベクター。
- 請求項1に記載のセルラーゼ高発現トリコデルマ・リーゼイを迅速にスクリーニングするための組換え発現ベクターを含む組換えトリコデルマ・リーゼイ。
- 請求項1に記載のセルラーゼ高発現トリコデルマ・リーゼイを迅速にスクリーニングするための組換え発現ベクターの応用。
- cbh1プロモーター、赤色蛍光タンパク質遺伝子DsRed、細胞表面にタンパク質を固定させるシグナルペプチド遺伝子AfMp1及びcbh1ターミネーターという要素が含まれている遺伝子発現カセットをプラスミドに導入することにより、組換え発現ベクターを得るステップであって、ここで、DsRed遺伝子のヌクレオチド配列がSEQ ID NO.2に示され、AfMp1遺伝子のヌクレオチド配列がSEQ ID NO.3に示されるステップ(1)と、
前記ステップ(1)で構築された前記組換え発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換することにより、組換え株を得るステップ(2)と、
前記組換え株を培養し、前記組換え株の表面に赤色蛍光タンパク質の発現を誘導するステップ(3)と、
赤色蛍光を示す前記組換え株をスクリーニングするステップ(4)と、
を含むことを特徴とする組換えトリコデルマ・リーゼイを迅速にスクリーニングする方法。 - 前記ステップ(4)において、表面に赤色蛍光を示す前記組換え株をフローサイトメーターでスクリーニングすることを特徴とする請求項4に記載の組換えトリコデルマ・リーゼイを迅速にスクリーニングする方法。
- cbh1プロモーター、赤色蛍光タンパク質遺伝子DsRed、細胞表面にタンパク質を固定させるシグナルペプチド遺伝子AfMp1及びcbh1ターミネーターという要素が含まれている遺伝子発現カセットをプラスミドに導入することにより、組換え発現ベクターを得るステップであって、ここで、DsRed遺伝子のヌクレオチド配列がSEQ ID NO.2に示され、AfMp1遺伝子のヌクレオチド配列がSEQ ID NO.3に示されるステップ(1)と、
前記ステップ(1)で構築された前記組換え発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換することにより、組換えトリコデルマ・リーゼイを得るステップ (2)と、
前記ステップ(2)で得られた前記組換えトリコデルマ・リーゼイに、タンパク質分泌の経路関連遺伝子を導入するか、又は、前記ステップ(2)で得られた前記組換えトリコデルマ・リーゼイにベクター又は遺伝子をランダムに挿入することにより、前記組換えトリコデルマ・リーゼイの変異体ライブラリーを得るステップ (3)と、
表面に強烈な赤色蛍光を示す前記組換えトリコデルマ・リーゼイをフローサイトメーターでスクリーニングするステップ (4)と、
前記ステップ(4)でスクリーニングされた前記組換えトリコデルマ・リーゼイのセルラーゼ酵素活性を測定し、セルラーゼ酵素活性が向上した前記組換えトリコデルマ・リーゼイを取得するステップ(5)と、
を含むことを特徴とする高酵素活性のセルラーゼ高発現トリコデルマ・リーゼイを迅速にスクリーニングする方法。 - 前記ステップ(3)において、前記タンパク質分泌の経路関連遺伝子は、bip1遺伝子、hac1遺伝子、ftt1遺伝子、sso2遺伝子、sar1遺伝子及びypt1遺伝子を含むことを特徴とする請求項6に記載の高酵素活性のセルラーゼ高発現トリコデルマ・リーゼイを迅速にスクリーニングする方法。
- 前記ステップ(3)において、アグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介を介して前記組換えトリコデルマ・リーゼイを形質転換することにより、前記組換えトリコデルマ・リーゼイの変異体ライブラリーを得ることを特徴とする請求項6に記載の高酵素活性のセルラーゼ高発現トリコデルマ・リーゼイを迅速にスクリーニングする方法。
- 赤色蛍光タンパク質遺伝子と、細胞表面にタンパク質を固定させるシグナルペプチド遺伝子とのDsRed−AfMP1融合遺伝子が含まれている組換え発現ベクターを構築するステップであって、ここで、DsRed遺伝子のヌクレオチド配列がSEQ ID NO.2に示され、AfMp1遺伝子のヌクレオチド配列がSEQ ID NO.3に示されるステップ(1)と、
前記ステップ(1)で構築された前記組換え発現ベクターを用いて菌株を形質転換することにより、組換え株を得るステップ(2)と、
前記ステップ(2)で得られた前記組換え株に、スクリーニング待ちの標的遺伝子を導入するか、又は、前記ステップ(2)で得られた前記組換え株にベクター又は遺伝子をランダムに挿入することにより、前記組換え株の変異体ライブラリーを得るステップ(3)と、
表面に赤色蛍光を示す前記組換え株をフローサイトメーターでスクリーニングするステップ(4)と、
前記ステップ(4)でスクリーニングされて表面に赤色蛍光を示す前記組換え株のセルラーゼ酵素活性を測定し、セルラーゼ酵素活性が向上した前記組換え株を取得するステップ(5)と、
セルラーゼ酵素活性が向上した前記組換え株に発現される外因性標的遺伝子、又は干渉された内因性遺伝子を特定して、セルラーゼ酵素活性の向上に関係するタンパク質分泌の経路関連遺伝子を取得するステップ(6)と、
を含むことを特徴とするセルラーゼ酵素活性の向上に関係するタンパク質分泌の経路関連遺伝子を迅速にスクリーニングする方法。 - 前記組換え株は、トリコデルマ・リーゼイであることを特徴とする請求項9に記載のセルラーゼ酵素活性の向上に関係するタンパク質分泌の経路関連遺伝子を迅速にスクリーニングする方法。
- 前記タンパク質分泌の経路関連遺伝子は、bip1遺伝子、及びhac1遺伝子のうち少なくとも1つを含むことを特徴とする請求項9に記載のセルラーゼ酵素活性の向上に関係するタンパク質分泌の経路関連遺伝子を迅速にスクリーニングする方法。
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