CN105463009B - 利用重组载体在丝状真菌中筛选外源基因的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种重组载体，其包括启动子、外源基因、荧光蛋白和终止子，所述外源基因位于启动子的下游，位于终止子或荧光蛋白的上游；本发明还公开了重组载体在里氏木霉中表达目的蛋白及代谢途径构建中的应用。以及利用重组载体在丝状真菌中快速筛选外源基因的方法，以判定待测外源基因是否成功表达。该方法比传统的筛选方法大大缩短了筛选时间，提高了筛选的工作效率，同时，筛选过程中获得的可表达外源基因的转化子可通过复筛，获得高产量纯系转化子，以适应实际生产的需要；通过该方法还可以建立一套检测外源基因表达以及高表达量纯系转化子的快速筛选系统，该系统可以有效加快丝状真菌的遗传改造进程，促进构建丝状真菌细胞工厂的发展。

Description

利用重组载体在丝状真菌中筛选外源基因的方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种应用重组载体在丝状真菌中筛选外源基因的方法。
背景技术
丝状真菌是一类由有隔菌丝组成的多细胞微生物，具有较强的蛋白分泌能力，可以产生丰富的次级代谢产物，因此在酶蛋白、药物、化工品等的工业生产中有着重要的应用(Verdoes et al.,1995；Wang et al.,2005)。
众多重要的丝状真菌菌株中，黑曲霉和里氏木霉在科学研究及工业生产中应用最为广泛，两者都是美国食品和药品管理局认证的GRAS(Generally Recognized as Safe)菌株，里氏木霉主要作为纤维素酶生产菌而受到重视，其野生型因纤维素的降解能力而被鉴定，经过多轮的诱变筛选，里氏木霉的胞外蛋白产量可以达到100g/L以上(Cherry andFidantsef,2003；Xu et al.,2009)，滤纸酶活力可以达到33FPU/ml以上，已经成为最主要的纤维素酶生产菌。
菌种改造是提升菌株生产性能的关键，基于基因工程的遗传改造是一种有效的菌种改造的措施(Meyer,2008)。虽然里氏木霉可以生产完整的纤维素降解酶系，但是胞外酶液中β-葡萄糖苷酶含量较低，Zhang等使用四个拷贝的cbh1启动子驱动bgl1基因在里氏木霉Rut C30中的过表达，将β-葡萄糖苷酶活性提高3.7倍，滤纸酶活提高130％，酶解玉米芯产生还原性糖的产量提高29％(Zhang et al.,2010)。
里氏木霉具有强大的木质纤维素降解能力，因此在联合生物加工(CBP)过程中有着重要的潜在应用(Singh et al.,1992；Xu et al.,2009)，CBP的目的是在菌株中构建高效的由木质纤维素向化学品(如乙醇、脂肪酸等)的一步转化途径，目前CBP的研究主要集中在对酵母的纤维素酶产生能力的改造，这主要是由于酵母乙醇产生能力较强，以及其基因工程的易操作性；但是纤维素酶系组分较多，有效的组合改造难度较大，因此改造纤维素降解菌的代谢路径，实现化学品的生产为我们提供了另一条CBP的思路。
构建及筛选性状优良的基因工程菌是一个系统工程，包括基因组水平改造(基于遗传转化的过表达或敲除基因)、改造后工程菌的筛选以及性状评价等(Moore,2007)。丝状真菌的遗传转化方法已经相对成熟，包括原生质体转化、农杆菌介导转化、电转化等，将DNA片段随机地插入到基因组中。但是由于其形态特点，丝状真菌的遗传改造过程相对模式微生物大肠杆菌、酿酒酵母等更加漫长，丝状真菌菌落为多核菌丝相互缠绕形成的菌团结构，不同于常规模式微生物的单一纯系菌落，为了在高假阳性背景的转化平板上获得纯系转化子，只能通过繁琐的单孢分离过程分离单核孢子，造成遗传改造周期过长；在此基础上的高表达量菌株的筛选则更加费时费力。
代谢通路的构建过程、菌种改造过程中通常需要外源基因的成功表达，但是外源基因产物会由于生物体严谨的控制系统而不能正常形成(Casselton and de la FuenteHerce,1989；Ngoepe,2011)，造成人力物力资源及时间的浪费，这种无效消耗在丝状真菌的遗传操作过程中更加严重。
因此建立一套检测外源基因表达以及高表达量纯系转化子的快速筛选系统，可以有效加快丝状真菌的遗传改造进程，促进构建丝状真菌细胞工厂的发展。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种在丝状真菌中成功表达的外源基因的快速筛选方法，该方法能够对外源基因是否能够在丝状真菌中表达进行快速筛选，比传统的筛选方法大大缩短了筛选时间，提高了筛选的工作效率，并且通过后期对转化子的复筛，获得高产量纯系转化子，以适应实际生产的需要。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了
一种重组载体，其包括启动子、外源基因、荧光蛋白和终止子，所述外源基因位于启动子的下游，位于终止子或荧光蛋白的上游；所述荧光蛋白位于所述启动子或外源基因的下游，位于所述终止子的上游。
优选的是，其中，所述外源基因为脂酰辅酶A还原酶基因或与脂酰辅酶A还原酶的氨基酸序列相似性高于80％的脂酰辅酶A衍生物基因，所述启动子为翻译延伸因子1启动子和丙酮酸激酶启动子；所述终止子为内切葡聚糖苷酶I终止子和外切葡聚糖苷酶II终止子。
重组载体在里氏木霉中表达目的蛋白的应用。
利用重组载体在丝状真菌中快速筛选外源基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、将所述的不含外源基因的重组载体转入丝状真菌获得转化子Ⅰ；
步骤二、将所述转化子Ⅰ培养产孢，应用流式细胞仪分析转化子孢子Ⅰ和阴性对照组获得分析图Ⅰ和分析图Ⅱ，分析图Ⅰ中沿横坐标排布有孢子群Ⅰ和孢子群Ⅱ，根据分布在分析图Ⅰ右侧的孢子群Ⅱ的分布范围设定圈定门，在分析图Ⅱ中应用所述圈定门圈定孢子群Ⅲ；
步骤三、构建带有丝状真菌启动子、待测外源基因、荧光蛋白表达基因、和终止子的丝状真菌的转化子Ⅱ；以及
步骤四、重复步骤二，应用流式细胞仪分析转化子孢子Ⅱ获得分析图Ⅲ，应用所述圈定门在分析图Ⅲ中圈定范围，当落入所述圈定门内的孢子群Ⅳ中孢子数量超过孢子群Ⅲ中孢子数量时，判定所述待测外源基因成功表达，当落入圈定门内的孢子群Ⅳ中孢子数量低于孢子群Ⅲ中孢子数量时，判定所述待测外源基因没有成功表达；
其中，所述转化子孢子Ⅰ为实验组，所述阴性对照组为带有空载体的丝状真菌孢子，所述丝状真菌的转化子Ⅱ为待检测组。
优选的是，其中，所述步骤二中圈定门的最小值为分析图Ⅰ中沿横坐标排布的孢子群Ⅰ和孢子群Ⅱ之间的接触处所对应的分析图Ⅰ中的横坐标值。
优选的是，其中，所述步骤二中应用流式细胞仪分析转化子孢子Ⅰ和丝状真菌孢子的具体方法为：设置流式细胞仪的样品压力为20000EPS，利用前向角散射光面积和宽度图，去除粘连和杂信号；荧光信号使用488nm激光激发，FL1通道分析。
优选的是，其中，所述转化子的构建方法具体为：
7.1)以丝状真菌的基因组DNA和含荧光蛋白表达基因的质粒为模板PCR扩增获得启动子基因片段、终止子片段和荧光蛋白表达基因片段；
7.2)将所述启动子基因片段、终止子片段和荧光蛋白表达基因片段克隆入载体制备成质粒；以及
7.3)制备丝状真菌原生质体，应用所述质粒转化原生质体获得所述转化子。
优选的是，其中，所述启动子为翻译延伸因子1启动子和丙酮酸激酶启动子；所述终止子为内切葡聚糖苷酶I终止子和外切葡聚糖苷酶II终止子。
优选的是，其中，所述步骤7.2)还包括：在重组酶的作用下，将PCR扩增得到的启动子、终止子片段和荧光蛋白表达基因片段组装成Ppki-gfp-Tcbh2、Ppki-hph-Tcbh2或Ptef1-gfp-Tegl1的结构克隆到pSIMPLE-19EcoR V BAP载体上；以及将外源待测基因整合至上述载体gfp的上游位置。
优选的是，其中，将分析图Ⅲ中落入所述圈定门内的孢子群Ⅳ中孢子以单孔单孢的形式，分选到浅层黑色培养板中培养6天，酶标仪在入射光波长488nm，出射光波长530nm测定各转化子培养物的荧光值，其中，荧光值高于400的转化子培养物所对应的转化子为外源基因高表达的纯系转化子。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明提供的重组载体，能够将外源基因转化入丝状真菌中，并且，利用所述重组载体在丝状真菌中对外源基因是否能够成功表达进行快速筛选，比传统的筛选方法大大缩短了筛选时间，提高了筛选的工作效率，同时，筛选过程中获得的可表达外源基因的转化子可通过复筛，获得高产量纯系转化子，以适应实际生产的需要。
通过本发明提供的利用重组载体在丝状真菌中筛选外源基因的方法，可以建立一套检测外源基因表达以及高表达量纯系转化子的快速筛选系统，该系统可以有效加快丝状真菌的遗传改造进程，促进构建丝状真菌细胞工厂的发展。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明所述在丝状真菌中成功表达的外源基因的快速筛选方法中构建的质粒pSIMPLE-19-Ppki-gfp-Tcbh2的模式图；
图2为本发明所述在丝状真菌中成功表达的外源基因的快速筛选方法中构建的质粒pSIMPLE-19-Ppki-hph-Tcbh2的模式图；
图3为本发明所述在丝状真菌中成功表达的外源基因的快速筛选方法中构建的质粒pSIMPLE-19-Ptef1-gfp-Tegl1的模式图；
图4为pSIMPLE-19-Ppki-far-gfp-Tcbh2质粒(4-1)、pSIMPLE-19-Ppki-hph-Tcbh2质粒(4-2)和pSIMPLE-19-Ptef1-gfp-Tegl1质粒(4-3)分别经HindIII、XbaI、SpeI酶切验证的琼脂糖电泳图；
图5为本发明所述在丝状真菌中成功表达的外源基因的快速筛选方法中一个实施例中转化子孢子Ⅰ的分析图Ⅰ；
图6为本发明所述在丝状真菌中成功表达的外源基因的快速筛选方法中另一个实施例中转化子孢子Ⅰ的分析图Ⅰ；
图7本发明所述在丝状真菌中成功表达的外源基因的快速筛选方法中一个实施例中的丝状真菌孢子的分析图Ⅱ；
图8为本发明所述在丝状真菌中成功表达的外源基因的快速筛选方法中另一个实施例中转化子孢子Ⅱ的分析图Ⅲ；
图9本发明所述在丝状真菌中成功表达的外源基因的快速筛选方法中一个实施例中的丝状真菌孢子的分析图Ⅲ。
图10GC-FID分析复筛获得的里氏木霉转化子的脂肪醇提取物的色谱图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明提供一种重组载体，其包括启动子、外源基因、荧光蛋白和终止子，所述外源基因位于启动子的下游，位于终止子或荧光蛋白的上游；所述荧光蛋白位于所述启动子或外源基因的下游，位于所述终止子的上游。
一个优选方案是，其中，所述外源基因为脂酰辅酶A还原酶基因或与脂酰辅酶A还原酶的氨基酸序列相似性高于80％的脂酰辅酶A衍生物基因，所述启动子为翻译延伸因子1启动子和丙酮酸激酶启动子；所述终止子为内切葡聚糖苷酶I终止子和外切葡聚糖苷酶II终止子。
一个优选方案是，其中，所述重组载体还包括荧光蛋白基因，其位于所述启动子的下游，位于所述终止子的上游。
重组载体在里氏木霉中表达目的蛋白的应用。
利用重组载体在丝状真菌中快速筛选外源基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、将所述的不含外源基因的重组载体转入丝状真菌获得转化子Ⅰ；
步骤二、将所述转化子Ⅰ培养产孢，应用流式细胞仪分析转化子孢子Ⅰ和阴性对照组获得分析图Ⅰ和分析图Ⅱ，分析图Ⅰ中沿横坐标排布有孢子群Ⅰ和孢子群Ⅱ，根据分布在分析图Ⅰ右侧的孢子群Ⅱ的分布范围设定圈定门，在分析图Ⅱ中应用所述圈定门圈定孢子群Ⅲ；
步骤三、构建带有丝状真菌启动子、待测外源基因、荧光蛋白表达基因、和终止子的丝状真菌的转化子Ⅱ；以及
步骤四、重复步骤二，应用流式细胞仪分析转化子孢子Ⅱ获得分析图Ⅲ，应用所述圈定门在分析图Ⅲ中圈定范围，当落入所述圈定门内的孢子群Ⅳ中孢子数量超过孢子群Ⅲ中孢子数量时，判定所述待测外源基因成功表达，当落入圈定门内的孢子群Ⅳ中孢子数量低于孢子群Ⅲ中孢子数量时，判定所述待测外源基因没有成功表达；
其中，所述转化子孢子Ⅰ为实验组，所述阴性对照组为带有空载体的丝状真菌孢子，所述丝状真菌的转化子Ⅱ为待检测组。
一个优选方案是，其中，所述步骤二中圈定门的最小值为分析图Ⅰ中沿横坐标排布的孢子群Ⅰ和孢子群Ⅱ之间的接触处所对应的分析图Ⅰ中的横坐标值。
一个优选方案是，其中，所述步骤二中应用流式细胞仪分析转化子孢子Ⅰ和丝状真菌孢子的具体方法为：设置流式细胞仪的样品压力为20000EPS，利用前向角散射光面积和宽度图，去除粘连和杂信号；荧光信号使用488nm激光激发，FL1通道分析。
一个优选方案是，其中，所述转化子的构建方法具体为：
7.1)以丝状真菌的基因组DNA和含荧光蛋白表达基因的质粒为模板PCR扩增获得启动子基因片段、终止子片段和荧光蛋白表达基因片段；
7.2)将所述启动子基因片段、终止子片段和荧光蛋白表达基因片段克隆入载体制备成质粒；以及
7.3)制备丝状真菌原生质体，应用所述质粒转化原生质体获得所述转化子。
一个优选方案是，所述步骤7.2)还包括：在重组酶的作用下，将PCR扩增得到的启动子、终止子片段和荧光蛋白表达基因片段组装成Ppki-gfp-Tcbh2、Ppki-hph-Tcbh2或Ptef1-gfp-Tegl1的结构克隆到pSIMPLE-19EcoR V BAP载体上；以及将外源待测基因整合至上述载体gfp的上游位置。
一个优选方案是，将分析图Ⅲ中落入所述圈定门内的孢子群Ⅳ中孢子以单孔单孢的形式，分选到浅层黑色培养板中培养6天，酶标仪在入射光波长488nm，出射光波长530nm测定各转化子培养物的荧光值，其中，荧光值高于的转化子培养物所对应的转化子为外源基因高表达的纯系转化子。
其中，荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
应用上述方法进行实验室整体构建在丝状真菌中能够成功表达的外源基因的快速筛选系统，具体涉及到的所有试验步骤如下：
实施例1：里氏木霉表达载体的构建
(1)表达载体的模块的克隆
根据里氏木霉数据库(http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html)中的翻译延伸因子1(Tef1)启动子、丙酮酸激酶(pki)启动子、内切葡聚糖苷酶I(egl1)终止子、外切葡聚糖苷酶II(cbh2)终止子序列，以及荧光蛋白基因(GFP)序列设计相关引物，所述引物序列见表1。
表1用于组装质粒和外源基因克隆的引物
据上述表格，将引物序列依次编号为如SEQ ID No.2～SEQ ID No.25所示多核苷酸序列。
以-20℃保存的QM9414菌株基因组DNA或含gfp基因的质粒为模板，进行PCR扩增获得两端为重叠序列的模块片段。
其中，PCR反应体系为：
PCR反应条件为：
(2)表达载体的模块化组装与验证
在重组酶的作用下，将PCR扩增得到的模块片段组装成Ppki-gfp-Tcbh2、Ppki-hph-Tcbh2或Ptef1-gfp-Tegl1的结构克隆到pSIMPLE-19EcoR V BAP载体上，获得质粒pSIMPLE-19-Ppki-gfp-Tcbh2如图1所示，质粒pSIMPLE-19-Ppki-hph-Tcbh2如图2所示，质粒pSIMPLE-19-Ptef1-gfp-Tegl1如图3所示。
其中，克隆反应体系为：
利用限制性内切酶HindIII、XbaI和SpeI验证正确构建的质粒，酶切反应体系如下：
(3)快速检测外源基因表达的质粒构建
本实施例中的外源基因以脂酰辅酶A还原酶(FAR)为例，通过PCR及酶切连接的方法将来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)或仓鸮(Tyto alba)的FAR编码基因(缺失终止密码子)克隆到pSIMPLE-19-Ppki-gfp-Tcbh2质粒中gfp的上游。
利用限制性内切酶验证正确构建的质粒并测序确证如图4所示。
实施例2：里氏木霉的转化
将上述构建的含有GFP或者FAR-GFP结构的质粒与pSIMPLE-19-Ppki-hph-Tcbh2质粒共转化QM9414，通过原生质体转化的方式进行，具体操作步骤如下：
1新鲜菌丝的培养
取新鲜的(两周以内)充分产孢的里氏木霉QM9414培养平板，使用孢子洗脱液将菌丝及孢子刮下，剪头枪头将孢子悬液吹散均匀，双层擦净纸过滤得到用于接种的孢子悬液；
将合适大小的灭菌玻璃纸铺在MEX平板上，用涂布棒铺平，取50-100μL孢子悬液滴在玻璃纸上，并涂布均匀，准备8-10个平板，28℃培养16-20h；
2原生质体的制备
制备细胞酶解液：将0.1g裂解酶充分溶解在20mL Solution A，并使用0.2μm无菌滤膜过滤除菌至无菌50mL离心管中，即得细胞裂解液；
在无菌培养皿中加入2-3mL细胞裂解液，将长有萌发孢子的玻璃纸在培养皿中放置平整，在其上加入2-3mL裂解液，然后依次将所有的玻璃纸放置在同一个培养皿中，注意避免在不同的玻璃纸间产生气泡，28℃酶解90min；
将玻璃纸小心除去，将酶解液通过四层擦净纸过滤至冰上放置的50mL离心管，并用少量Solution A洗涤，2000rpm 4℃离心10min，去除上清并用4mL Solution B重悬沉淀，再次2000rpm 4℃离心10min，0.5-1mL Solution B重悬沉淀，即得原生质体。
3原生质体转化
在冰上放置的15mL离心管中加入如下组分：
200μL原生质体悬液，10μL质粒(5μL表达质粒+5μL pSIMPLE-19-Ppki-hph-Tcbh2质粒)，50μL PEG缓冲液
混合均匀，冰上放置20min；
加入2mL PEG缓冲液，混合均匀，室温放置5min；
加入4mL Solution B，混合均匀
4原生质体转化子再生
将0.2-1mL转化液与4mL上层培养基混合均匀，倾倒在底层培养基上，待培养基凝固后移至28℃培养，一般2-4天可见转化子长出，根据不同需求进行后续的转化子验证。
所需缓冲液及培养基：
孢子洗脱液：0.8-0.9％NaCl，0.05％Tween
Solution A：0.1M KH2PO4，1.2M山梨醇，pH 5.6
Solution B：50mM CaCl2，1M山梨醇，10mM Tris·HCl，pH 7.5
PEG缓冲液：25％PEG6000，50mM CaCl2，10mM Tris·HCl，pH 7.5
下层培养基：基础培养基，2％琼脂，1M山梨醇，100mg/L潮霉素
上层培养基：基础培养基，2％琼脂糖，1M山梨醇，100mg/L潮霉素
实施例3：转化子的产孢与分析
(1)转化子的培养产孢与收集
将转化子菌块挑至新的筛选培养基(无山梨醇)上进行培养，每个平板可挑8个转化子，28℃培养至产孢。
用7ml无菌水冲洗平板上的孢子(所有转化子的孢子)，重悬混匀，4层擦镜纸过滤至无菌15ml尖底离心管中，即为流式细胞仪分析及分选的孢子悬液，孢子浓度控制在105至107个孢子/mL。
流式细胞仪分析转化子孢子
转化子孢子的分析使用MoFlo XDP(Beckman)流式细胞仪进行，样品压力设为20000EPS(每秒分析20000个信号颗粒)；利用前向角散射光面积和宽度图，去除粘连和杂信号；荧光信号使用488nm激光激发，FL1通道(529/28滤光片)分析；利用GFP表达的阴阳性对照菌株设定电压以分辨表达GFP的孢子集群。根据阴阳性孢子的信号差别，设门(R)圈定阳性孢子区域，所有样品的分析在相同的方法下进行。
具体为：
a)应用流式细胞仪分析转化子孢子Ⅰ和丝状真菌孢子获得分析图Ⅰ(如图5和图6所示)和分析图Ⅱ(如图7所示)，分析图Ⅰ中沿横坐标排布有孢子群Ⅰ和孢子群Ⅱ，根据分布在分析图Ⅰ右侧的孢子群Ⅱ的分布范围设定圈定门，(图中矩形方框)，在分析图Ⅱ中应用所述圈定门圈定孢子群Ⅲ；
b)构建带有丝状真菌启动子、荧光蛋白表达基因、待测外源基因和终止子的丝状真菌的转化子Ⅱ；以及
c)重复a)和b)，应用流式细胞仪分析转化子孢子Ⅱ获得分析图Ⅲ(如图8和图9所示)，应用所述圈定门在分析图Ⅲ中圈定范围，当落入所述圈定门内的孢子群Ⅳ中孢子数量超过孢子群Ⅲ中孢子数量时，判定所述待测外源基因成功表达，如图8中的圈定门内的阳性包子群数量高于图7中圈定门内孢子数量，因此，表示该外源基因far成功表达；当落入圈定门内的孢子群Ⅳ中孢子数量低于孢子群Ⅲ中孢子数量时，判定所述待测外源基因没有成功表达；如图9中的圈定门内的阳性包子群数量低于图7中圈定门内孢子数量，因此，表示该外源基因far1没有成功表达。
实施例4：脂酰辅酶A还原酶整合转化子分选
用上述的操作步骤和方法分析整合FAR-GFP的孢子，并分析孢子集群在圈定门(表达GFP的孢子的阳性区域)内的分布律，并与GFP信号的阴性孢子集群比较，通过分布律之间的显著差异，确定圈定门内分布律高于阴性对照的FAR-GFP孢子集群，相应的FAR基因则作为初筛获得的可在里氏木霉成功表达的外源基因。
将圈定门内的孢子以单孔单孢的形式，分选到加有200μL筛选培养液的96孔浅层黑色培养板中。
实施例5：产脂肪醇里氏木霉菌株的复筛及分析
将上述分选到的孢子培养6天，酶标仪测定各转化子培养物荧光值，入射光波长488nm，出射光波长530nm。
将复筛得到的转化子接种至50mL培养液中，培养48h，过滤收集菌丝体并压干，取～30mg菌丝提取脂肪醇，具体步骤如下：
将菌丝置于1.5mL离心管，低温条件下玻璃钻头研磨30s；
加入600μL正己烷，将菌丝转移至装有玻璃珠的2mL震荡管中；
漩涡震荡30min；
12000g离心样品10min；
将上层有机相经0.22μm滤膜过滤处理，并转移至气相分析瓶中，用于GC-FID检测，结果如图10所示。
脂肪醇的分离使用安捷伦HP-INNOWax毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)进行，以氮气为载气，柱温箱程序为：70℃保持2min，10℃/min升温至240℃，240℃保持10min。
表2复筛(荧光检测)获得的里氏木霉转化子的脂肪醇产率
其中，复筛的转化子T1和T2的脂肪醇产率明显高于T3，为复筛出的高产量纯系转化子。
应用上述实施例1-实施例5的方法对外源的β-葡萄糖苷酶编码基因进行筛选，也成功筛选到来源于桧状青霉和黑曲霉的β-葡萄糖苷酶可在里氏木霉中表达。
本发明方法能够对外源基因是否能够在丝状真菌中表达进行快速筛选，比传统的筛选方法大大缩短了筛选时间(此处最好给出时间上较传统方法缩短多少，有一个数据支撑，更能说明效果)，大大提高了筛选的工作效率，并且通过后期对转化子的复筛，获得高产量纯系转化子，以适应实际生产的需要。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (8)

1.利用重组载体在丝状真菌中快速筛选外源基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、将不含外源基因的重组载体转入丝状真菌获得转化子Ⅰ；
步骤二、将所述转化子Ⅰ培养产孢，应用流式细胞仪分析转化子孢子Ⅰ和阴性对照组获得分析图Ⅰ和分析图Ⅱ，分析图Ⅰ中沿横坐标排布有孢子群Ⅰ和孢子群Ⅱ，根据分布在分析图Ⅰ右侧的孢子群Ⅱ的分布范围设定圈定门，在分析图Ⅱ中应用所述圈定门圈定孢子群Ⅲ；
步骤三、构建带有丝状真菌启动子、待测外源基因、荧光蛋白表达基因、和终止子的丝状真菌的转化子Ⅱ；以及
步骤四、重复步骤二，应用流式细胞仪分析转化子孢子Ⅱ获得分析图Ⅲ，应用所述圈定门在分析图Ⅲ中圈定范围，当落入所述圈定门内的孢子群Ⅳ中孢子数量超过孢子群Ⅲ中孢子数量时，判定所述待测外源基因成功表达，当落入圈定门内的孢子群Ⅳ中孢子数量低于孢子群Ⅲ中孢子数量时，判定所述待测外源基因没有成功表达；
其中，所述转化子孢子Ⅰ为实验组，所述阴性对照组为带有空载体的丝状真菌孢子，所述丝状真菌的转化子Ⅱ为待检测组。
2.如权利要求1所述的利用重组载体在丝状真菌中快速筛选外源基因的方法，其特征在于，重组载体，其包括启动子、外源基因、荧光蛋白和终止子，所述外源基因位于启动子的下游，位于终止子或荧光蛋白的上游；所述荧光蛋白位于所述启动子或外源基因的下游，位于所述终止子的上游，所述外源基因为脂酰辅酶A还原酶基因，所述启动子为翻译延伸因子1启动子和丙酮酸激酶启动子；所述终止子为内切葡聚糖苷酶I终止子和外切葡聚糖苷酶II终止子。
3.如权利要求1所述的利用重组载体在丝状真菌中快速筛选外源基因的方法，其特征在于，所述步骤二中圈定门的最小值为分析图Ⅰ中沿横坐标排布的孢子群Ⅰ和孢子群Ⅱ之间的接触处所对应的分析图Ⅰ中的横坐标值。
4.如权利要求1所述的利用重组载体在丝状真菌中快速筛选外源基因的方法，其特征在于，所述步骤二中应用流式细胞仪分析转化子孢子Ⅰ和丝状真菌孢子的具体方法为：设置流式细胞仪的样品压力为20000EPS，利用前向角散射光面积和宽度图，去除粘连和杂信号；荧光信号使用488nm激光激发，FL1通道分析。
5.如权利要求1所述的利用重组载体在丝状真菌中快速筛选外源基因的方法，其特征在于，所述转化子的构建方法具体为：
7.1)以丝状真菌的基因组DNA和含荧光蛋白表达基因的质粒为模板PCR扩增获得启动子基因片段、终止子片段和荧光蛋白表达基因片段；
7.2)将所述启动子基因片段、终止子片段和荧光蛋白表达基因片段克隆入载体制备成质粒；以及
7.3)制备丝状真菌原生质体，应用所述质粒转化原生质体获得所述转化子。
6.如权利要求1所述的利用重组载体在丝状真菌中快速筛选外源基因的方法，其特征在于，所述启动子为翻译延伸因子1启动子和丙酮酸激酶启动子；所述终止子为内切葡聚糖苷酶I终止子和外切葡聚糖苷酶II终止子。
7.如权利要求5所述的利用重组载体在丝状真菌中快速筛选外源基因的方法，其特征在于，所述步骤7.2)还包括：在重组酶的作用下，将PCR扩增得到的启动子、终止子片段和荧光蛋白表达基因片段组装成Ppki-gfp-Tcbh2、Ppki-hph-Tcbh2或Ptef1-gfp-Tegl1的结构克隆到pSIMPLE-19 EcoR V BAP载体上；以及将外源待测基因整合至上述载体gfp的上游位置。
8.如权利要求1所述的利用重组载体在丝状真菌中快速筛选外源基因的方法，其特征在于，将分析图Ⅲ中落入所述圈定门内的孢子群Ⅳ中孢子以单孔单孢的形式，分选到浅层黑色培养板中培养6天，酶标仪在入射光波长488nm，出射光波长530nm测定各转化子培养物的荧光值，其中，荧光值高于400的转化子培养物所对应的转化子为外源基因高表达的纯系转化子。
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