CN103114089A - 源于里氏木霉的强启动子及其表达载体和应用 - Google Patents
源于里氏木霉的强启动子及其表达载体和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103114089A CN103114089A CN2012105164634A CN201210516463A CN103114089A CN 103114089 A CN103114089 A CN 103114089A CN 2012105164634 A CN2012105164634 A CN 2012105164634A CN 201210516463 A CN201210516463 A CN 201210516463A CN 103114089 A CN103114089 A CN 103114089A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- strong promoter
- expression vector
- terminator
- trichodermareesei
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 title claims abstract description 59
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims abstract description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 claims description 15
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 15
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 15
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 15
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 15
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 claims description 14
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 12
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 3
- 229940059442 hemicellulase Drugs 0.000 claims description 3
- 108010002430 hemicellulase Proteins 0.000 claims description 3
- 101150099105 alien gene Proteins 0.000 claims description 2
- 230000002478 diastatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 19
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 19
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 description 15
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 11
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 8
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 6
- -1 dextran glycosides Chemical class 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 4
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 4
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 3
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 3
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 101150052795 cbh-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- XUWPJKDMEZSVTP-LTYMHZPRSA-N kalafungina Chemical compound O=C1C2=C(O)C=CC=C2C(=O)C2=C1[C@@H](C)O[C@H]1[C@@H]2OC(=O)C1 XUWPJKDMEZSVTP-LTYMHZPRSA-N 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710187001 DNA terminal protein Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N EtOH Substances CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 101710082836 Probable HNH endonuclease Proteins 0.000 description 2
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- MURGITYSBWUQTI-UHFFFAOYSA-N fluorescin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C1C2=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C21 MURGITYSBWUQTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- YQYJSBFKSSDGFO-FWAVGLHBSA-N hygromycin A Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](C(=O)C)O[C@@H]1Oc1ccc(\C=C(/C)C(=O)N[C@@H]2[C@@H]([C@H]3OCO[C@H]3[C@@H](O)[C@@H]2O)O)cc1O YQYJSBFKSSDGFO-FWAVGLHBSA-N 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Natural products C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- XQFCCTPWINMCQJ-UHFFFAOYSA-N 1-(1H-indol-3-yl)-N,N-dimethylpropan-2-amine Chemical compound CC(N(C)C)CC1=CNC2=CC=CC=C12 XQFCCTPWINMCQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PHNGFPPXDJJADG-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyinosine-5'-monophosphate Chemical group O1[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 PHNGFPPXDJJADG-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150073246 AGL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 1
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 101100184662 Caenorhabditis elegans mogs-1 gene Proteins 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 101710112457 Exoglucanase Proteins 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- MCWXGJITAZMZEV-UHFFFAOYSA-N dimethoate Chemical compound CNC(=O)CSP(=S)(OC)OC MCWXGJITAZMZEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000007967 glucose restriction Effects 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007826 nucleic acid assay Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000008279 sol Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Natural products CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 1
- 238000009923 sugaring Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种源于里氏木霉的强启动子及其应用。本发明从里氏木霉（Trichoderma reesei）中分离克隆得到强启动子以及与该强启动子相对应的终止子，其核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。本发明还提供了包含有该强启动子和与该强启动子相对应的终止子的重组表达载体及含有该重组表达载体的转化子。本发明进一步公开了它们在里氏木霉中蛋白同源或异源表达、基因定位方面的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种真菌蛋白表达的强启动子，尤其涉及从里氏木霉中分离、克隆得到的强启动子，还涉及包含有该强启动子和终止子的质粒载体及含有该质粒载体的转化子，以及他们在里氏木霉中蛋白同源或异源表达、基因定位方面的应用,本发明属于源于里氏木霉中启动子的分离与应用领域。
背景技术
里氏木霉（Trichoderma reesei）是一种广泛存在自然界的嗜温腐生真菌，可以分泌多种酶类，包括纤维素酶、半纤维素酶以及蛋白酶和淀粉酶，尤其是纤维素酶含量很高，分泌的纤维素酶多年来已广泛应用于饲料、制糖、化纤、造纸，等行业中（Feed Industry，2003,24(1)）。近年来，随着能源危机的出现，利用生物质纤维素生产生物乙醇燃料是目前解决燃料危机的有效方式之一。
纤维素酶是由葡萄糖内切酶（EC.3.2.1.4，）葡萄糖外切酶（EC.3.2.1.91）和β-葡萄糖苷酶（EC.3.2.1.2）三种主要成分组成的诱导性复合酶系。在里氏木霉所产生的纤维素酶中，内切葡聚糖苷酶和外切葡聚糖苷酶的比例相对较高，而β-葡萄糖苷酶的比例极低。在实际生产中，生物质纤维素的降解最终是由β-葡萄糖苷酶水解纤维素降解过程中释放的纤维二糖降解成葡萄糖，从而去除其对另外两种纤维素酶组成部分的阻遏作用，是纤维素水解过程中的最后一步，也是最关键的限制因素。但里氏木霉中β-葡萄糖苷酶活低成为大规模工业化生产纤维素酶的瓶颈因素。提高里氏木霉中的β-葡萄糖苷酶的活力成为整体提高里氏木霉纤维素酶活力以及其水解能力的关键。里氏木霉中β-葡萄糖苷酶基因的稳定高效表达进而提高酶活，已成为各国研究人员努力公关的项目之一。针对上述问题，一些研究人员致力于传统方式的菌种改造上，通常采用诱变育种方式获得高产菌株，来提高β-葡萄糖苷酶的酶活，虽然也取得了一定的进展（乐易林等，2005；张秋卓等，2009；韩承业等，2010；覃玲灵，2011），但该方式得到的菌株常存在菌种退化、突变问题，而且筛选工作量大，周期长，诱变菌株在生产中并没有得到很好的应用。
目前对于里氏木霉的研究主要集中在基因的诱导表达获得目的产物上，尤其是在各种分泌性目的蛋白类，对于菌种本身的研究较少。基因诱导表达中，最重要的工作是基因表达的第一阶段即转录过程，转录的“开关”启动子决定转录的起始位点，基因表达的程度，在里氏木霉中，广泛使用编码外切葡聚糖酶的基因cbh1的启动子，应用该启动子可提高目的基因的表达量，也可提高某种纤维素酶组分的产量（T Liu et al.2008,Z Rahmanet al.2009,J Zhang et al.2010,O Ribeiro et al.2010,Y Zhong etal.2011,L Ma et al.2011,LN Qin et al.2012），但cbh1启动子是一个诱导型的启动子，必须在诱导条件下才能强启动目的基因的表达，另外，该启动子与里氏木霉中其他参与纤维素酶调控的转录因子存在相互作用。因此，采用cbh1启动子往往并不一定能高效表达目的基因，因此找到一种能够高强度并稳定表达的强启动子尤为重要。
发明内容
鉴于上述状况，本发明目的之一在于提供一种从里氏木霉（Trichoderma reesei）中所分离、克隆的强启动子RPL。
本发明的另一目的在于构建一种含有该强启动子RPL和与其对应的终止子的质粒载体及其包含该质粒载体的任何转化子。
本发明的目的之三是将含有该强启动子RPL和与其对应的终止子的质粒载体应用于里氏木霉中控制蛋白在体内的强烈表达，以及应用于关键目的基因的定位。
为实现上述目的，本发明一方面提供了一种从里氏木霉（Trichoderma reesei）中所分离、克隆的强启动子RPL，其多核苷酸序列为（a）或（b）所示:
（a）、SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列；
（b）、与SEQ ID NO:1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸仍具有启动子的功能或活性。
优选的，本发明所述的从里氏木霉（Trichoderma reesei）中所分离强启动子为SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列。
本发明从里氏木霉（Trichoderma reesei）中所分离、克隆的强启动子RPL的基因序列中没有TATA框，在-80～-110bp处的富含GCCACACCC或GGGCGGG序列的GC框基因序列，富含GC框赋予该启动子高速转录起始频率，同时该启动子基因序列远隔部位富有AT碱基对，能加速转录起始的频率，该基因序列特点决定了启动子RPL在里氏木霉的菌丝、孢子的生长阶段均可以高强度启动，快速持续高效稳定的启动RNA聚合酶进行转录过程。
本发明还提供了对应于该从里氏木霉（Trichoderma reesei）中所分离、克隆的强启动子RPL的终止子，该终止子的多核苷酸序列为SEQ ID No.2。
本发明进一步提供了一种在真菌或里氏木霉中表达外源基因的重组表达载体或表达盒以及含有该重组表达载体或表达盒的重组宿主菌株或转化子。
该重组表达载体或表达盒包括：本发明所分离的强启动子、待转录的外源基因序列以及终止子；其中，待转录的外源基因序列位于强启动子下游，终止子位于待转录的外源基因序列的下游。
所述的待转录的外源基因可以是编码纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶或淀粉酶的各种多核苷酸序列。
将本发明所分离的强启动子可操作的与待转录的外源基因相连接，可以指导或调控待转录的外源基因在真菌或里氏木霉中进行转录或表达。例如，将本发明的启动子可操作的与编码纤维素酶的核苷酸序列相连接（其中，该编码纤维素酶的核苷酸序列还与3′非编码区可操作的连接，所述的3′非编码区可以包含终止子序列、mRNA切割序列等）得到可以在真菌或里氏木霉中表达纤维素酶的重组表达载体。
将本发明所述启动子与待转录的异源性DNA序列进行可操作的连接，即得到在真菌或里氏木霉中转录或表达所述待转录的外源基因的重组表达载体。可以采用任何常规的转化方法（例如，直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法）将所述的重组表达载体转化到真菌或里氏木霉中，得到相应的转化子或重组宿主菌株。
本发明所分离的强启动子RPL在里氏木霉的菌丝、孢子的生长阶段均可以高强度启动，快速持续高效稳定的启动RNA聚合酶进行转录过程，进一步的，本发明提供了包含强启动子RPL和与其对应的终止子的质粒载体在里氏木霉中蛋白同源或异源表达、基因定位方面的应用。
里氏木霉中蛋白同源或异源表达是指该强启动子不仅可以启动RNA聚合酶促使转录表达里氏木霉菌体内各个组织蛋白及其分泌的胞内或胞外蛋白，还可以是非组织或分泌蛋白，没有同源性的外源基因或蛋白。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。
术语“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高（例如超过本底至少2倍。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100%互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献（Tijssen,Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridizationwith Nucleic Probes,"Overview of principles of hybridizationand the strategy of nucleic acid assays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点（Tm）约5-10℃。Tm为在平衡状态下50%与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度（在指定离子强度、pH和核酸浓度下）（因为目标序列过量存在，所以在Tm下在平衡状态下50%的探针被占据）。严谨条件可为以下条件：其中在pH 7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子浓度，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度（或其它盐），并且温度对于短探针（包括（但不限于）10到50个核苷酸）而言为至少约30℃，而对于长探针（包括（但不限于）大于50个核苷酸）而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50%甲酰胺，5×SSC和1%SDS，在42℃下培养；或5×SSC，1%SDS，在65℃下培养，在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1%SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。
术语“转化子”或“重组宿主菌株”意指包含本发明强启动子RPL和与其对应的终止子的质粒载体的受体细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生受体细胞，例如直接吸取、转导或所属领域中已知的其它方法。
术语“多核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA（肽核酸）、在反义技术中所用的DNA类似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等）。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体（包括（但不限于）简并密码子取代）和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选（或所有）密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代（Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991);Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);和Cas sol等人,(1992);Rossolini等人,Mol Cell.Probes8:91-98(1994)）。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白（即抗原），其中氨基酸残基经由共价肽键连接。
术语“启动子”能够在真菌中指导或调控所控制的开放阅读框（ORF）在真菌中的转录或表达,具有持续性、不表现时空特异性。
术语“外源基因”指该DNA序列对该特定的宿主细胞而言属于外来的来源，或若来自相同的原始来源但对该原始序列进行了修饰或改造。
术语“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。
术语“转化”：将外源基因序列引入到宿主细胞或有机体的方法。
术语“表达”：内源性基因或转基因在宿主细胞中的转录和/或翻译。
术语“编码序列”：转录成RNA的核酸序列。
附图说明
图1是含有里氏木霉RPL启动子和终止子的表达载体pCAMBIA1300-RPL的构建流程图；
图2是绿色荧光蛋白GFP重组表达载体pCAMBIA1300-RPLGFP的构成流程图；
图3是孢子明场拍摄图；
图4是孢子荧光观察图；
图5是菌丝明场拍摄图；
图6是菌丝荧光观察图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1：从里氏木霉中分离启动子RPL
从里氏木霉菌株QM9414（实验室保存）中提取基因组DNA作为模板，再根据里氏木霉基因组数据库中的信息设计引物，采用高保真PCR获得目的片段。
里氏木霉生殖菌丝细胞基因组DNA的提取
将生长于PDA平板上的里氏木霉菌株QM9414孢子用灭菌水清洗，清洗后用灭菌三层擦镜纸过滤，浓度稀释至孢子含量106个/ml；取1ml孢子悬液接种于含有80ml CM培养基的三角瓶中，28°C，180rpm培养24h。将培养好的菌丝用灭菌三层擦镜纸过滤，并用蒸馏水清洗菌丝2-3次后收集，用吸水纸吸干，冻存于－20°C。将收集得到的菌丝用液氮研磨，2-3次；所得的菌丝粉末转移到1.5ml离心管中，每管加入2%的CTAB 700μL；将1.5ml离心管上下颠倒混匀，65℃保温30min，每隔10min摇匀1次；再加入等体积氯仿：异戊醇（24:1，V/V），平板摇床上轻摇10min后，12000r/min离心10min；取上清，加入等体积异丙醇，颠倒混匀后，室温放置10min，12000r/min离心10min，倒掉上清,加70％的酒精500μL洗沉淀,室温干燥加入50μLTE dd H2O使DNA完全溶解，加入RNase A(10mg/mL),65℃保温30min，最后DNA溶于30μL ddH2O中。
RPL启动子基因片段PCR(聚合酶链式反应)扩增
根据里氏木霉基因组数据库中的信息设计引物序列如下：
PRPLp1：5’-TTggtaccCAAGAGGCCACGGAACAAT-3’
PRPLp2：5’-AAggatccGTTTTGGTGGTGGTCTCTTCTA-3’
小写字体表示对应的酶切位点，上游引物中引入KpnI，下游引物中引入BamHI。
PCR反应条件为：94°C 5分钟，（94°C 30秒，55°C 30秒，68°C 1分30秒）共计35个循环，72°C 10分钟。
PCR反应体系为：里氏木霉基因组DNA1μl，Taq plus聚合酶1μl，浓度100mM引物各0.4μl，Taq plus缓冲液5μl，浓度25mMdNTP1μl，其余用水补足至50μl。将上述反应体系溶液放入PCR扩增仪中进行扩增，94°C，5分钟高温变性，变性中94°C30秒致使DNA双链完全变性，迅速降温至55°C保持30秒，最终升温至72°C 10分钟进行链延伸，待反应完毕，将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后胶回收纯化。
RPL启动子基因的获得
将PCR胶回收RPL启动子基因产物3μl，pUCM-T载体1μl，T4连接酶1μl，T4连接酶缓冲液1μl混合，其余用ddH2O补足至10μl，应用T4连接酶处理纯化回收后的克隆启动子基因产物和pUCM-T载体，促使RPL启动子基因与pUCM-T基因重组，将重组的pUCM-T载体转染至大肠杆菌DH-5α，挑取阳性克隆，并经菌落PCR及酶切验证，验证正确后送样测序，其核苷酸序列为SEQ ID No.1。
实施例2：相对应于里氏木霉RPL终止子的获得
根据里氏木霉基因组数据库中的信息设计引物，利用高保真PCR获得目的片段RPL终止子。引物序列如下：
TRPLp1：5’-ATtctagaCGAGGAGCTGCTTTCTTAT-3’
TRPLp2：5’-AAgtcgacTTTCTCGTACTGGCAACA-3’
引物序列中小写字体表示对应的酶切位点，上游引物中引入XbaI，下游引物中引入SalI。
PCR反应条件与、反应体系、反应进程同实施例1启动子RPL的PCR扩增的反应条件、反应体系、反应进程相同。
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后胶回收纯化，将PCR胶回收RPL终止子基因产物3μl，pUCM-T载体1μl，T4连接酶1μl，T4连接酶缓冲液1μl混合，其余用ddH2O补足至10μl，应用T4连接酶处理纯化回收后的克隆终止子基因产物和pUCM-T载体，促使RPL终止子基因与pUCM-T基因重组，将重组的pUCM-T载体转染至大肠杆菌DH-5α，挑取阳性克隆，并经菌落PCR及酶切验证，验证正确后送样测序，其核苷酸序列为SEQ ID No.2。
实施例3：构建含有里氏木霉RPL启动子和终止子的表达载体
图1是构建含有里氏木霉RPL启动子和终止子的表达载体的过程。从图中可以看到，表达载体构建过程如下：将原始的pCAMBIA1300质粒用RPL启动子含有的酶切位点KpnI和BamHI双限制性内切酶酶切切后，与RPL启动子（SEQ ID No.1）相连接，连接体系如实施例1或2中的重组载体的连接所述条件体系，构建含有里氏木霉RPL启动子表达载体。连接产物转化至大肠杆菌DH-5α，将含有重组质粒载体的大肠杆菌DH-5α涂于含有卡那霉素抗性的平板上筛选，挑取转化子培养，提取质粒并酶切验证。将验证正确的含有RPL启动子的载体用XbaI和SalI双限制性内切酶酶切，与RPL终止子（SEQ ID No.2）相连接，连接体系如实施例1或2中的重组载体的连接所述条件体系。连接产物转化大肠杆菌DH-5α，转化产物涂于含有卡那霉素抗性的平板上筛选，挑取转化子培养，提取质粒并酶切验证，将构建好的载体命名为pCAMBIA1300-RPL。
实施例4：绿色荧光蛋白GFP重组表达载体的构建
图2是绿色荧光蛋白GFP重组表达载体构建过程，具体如下：
根据已有的GFP序列设计引物，引物序列如下：
GFPp1：5’-ATggtaccATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3’
GFPp2：5’-TTtctagaCTTGTACAGCTCGTCCAT-3’
引物序列中小写字体表示对应的酶切位点，上游引物中引入BamHI，下游引物中引入XbaI。
PCR反应条件为：94°C 5分钟，（94°C 30秒，55°C 30秒，68°C 1分30秒）共计35个循环，72°C 10分钟。
连接条件：GFP扩增产物3μl，pUCM-T载体1μl，T4连接酶1μl，T4连接酶缓冲液1μl混合，其余用ddH2O补足至10μl，4°C过夜。
将扩增得到的GFP基因片段连接到pUCM-T载体中，转化至大肠杆菌，并对所得到的转化子提取质粒并酶切验证，经测序鉴定，得到的GFP片段为正确插入片段。重组载体pCAMBIA1300-RPL用BamHI和XbaI双限制性内切酶酶切后，将GFP片段与酶切好的载体连接，并转化至大肠杆菌中。转化产物涂于含有卡那霉素抗性的平板上筛选，挑取阳性转化子培养，提取质粒并用B amHI和XbaI双限制性内切酶酶切验证。验证正确的载体命名为pCAMBIA1300-RPLGFP。
实施例5：RPL启动子启动荧光蛋白在里氏木霉体内强烈表达
农杆菌介导ATMT法转化pCAMBIA1300-RPLGFP重组载体到里氏木霉中：采用冻融法转化，即将pCAMBIA1300-RPLGFP载体转入到农杆菌AGL1中。从新鲜培养的LB平板（含50μg/ml卡那霉素）上挑选一农杆菌单菌落接种于5ml含卡那霉素的LB中，28°C 200rpm过夜培养；第二天将200-400μl培养液转移到5ml含200μmol/L AS和50μg/ml卡那霉素的诱导液体培养基AIM中，OD值约0.15，28°C培养5-6h使OD600达到0.5-0.6。
里氏木霉孢子的收集：用5ml灭菌蒸馏水从培养10d的PDA平板上洗下孢子，在装有无菌玻璃珠的试管中，涡旋振荡后，三层擦镜纸过滤后，5000rpm离心，用无菌水清洗两次后，用血球计数板计数。
共转化：将100μl培养好的农杆菌AGL-1菌液和100μl稀释好的里氏木霉孢子悬浮液混合，然后均匀涂布混合液于铺有硝酸纤维素膜（NC）的AIM平板上，20°C共培养48h；将膜剪成小片，在选择性培养基PDA上25°C培养，直到转化子出现。选择性培养基中含200μg/ml潮霉素、400μg/ml头孢霉素、60μg/ml链霉素。转化子长出后，再在含有200μg/ml潮霉素的PDA平板上再次筛选。
荧光观察：
将再次筛选得到的转化子接到PDA平板上，28°C培养2-3天，至新鲜孢子长出。牙签挑取转化子于载玻片上，置于激光共聚焦显微镜下观察。
图3是孢子明场拍摄影像，图4是孢子荧光观察图，图5是菌丝明场拍摄影像，图6是菌丝荧光观察图，通过共聚焦显微镜观察发现，在里氏木霉的孢子和菌丝中均有强烈的荧光表达，证明本发明所分离的RPL启动子可以在里氏木霉的孢子和菌丝中强烈启动GFP的稳定高效表达。
以上结合具体实施方案对本发明进行了说明。不过，这些实施方案仅是说明性的，其对本发明的保护范围并不构成任何限制。本领域技术人员理解，在不超出或偏离本发明保护范围的情况下，本发明的技术方案及其实施方式有多种修饰、改进或等价物，这些均应落入本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种从里氏木霉（Trichoderma reesei）中所分离、克隆的强启动子，其特征在于，其多核苷酸序列为（a）或（b）所示:
（a）、SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列；
（b）、与SEQ ID NO.1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸具有启动子的功能或活性。
2.从里氏木霉（Trichoderma reesei）中所分离、克隆的与权利要求1所述强启动子相对应的终止子，其特征在于：该终止子的多核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。
3.含有权利要求1所述强启动子的重组表达载体。
4.含有权利要求2所述终止子的重组表达载体。
5.一种重组表达载体，其特征在于，包括：权利要求1所述的强启动子、待转录的外源基因以及终止子；其中，待转录的外源基因序列位于强启动子下游，终止子位于待转录的外源基因序列的下游。
6.按照权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：所述的待转录的外源基因是编码纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶或淀粉酶的任意一种多核苷酸序列；所述终止子的多核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。
7.含有权利要求3-6任何一项所述重组表达载体的宿主细胞。
8.权利要求1所述的强启动子在指导外源基因在真菌细胞中转录或表达中的应用。
9.权利要求1所述的强启动子在定位外源基因在真菌细胞中表达位置中的应用。
10.权利要求3-6任何一项所述重组表达载体在真菌细胞中表达外源基因或定位外源基因在真菌细胞中表达位置中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210516463.4A CN103114089B (zh) | 2012-12-05 | 2012-12-05 | 源于里氏木霉的强启动子及其表达载体和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210516463.4A CN103114089B (zh) | 2012-12-05 | 2012-12-05 | 源于里氏木霉的强启动子及其表达载体和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103114089A true CN103114089A (zh) | 2013-05-22 |
| CN103114089B CN103114089B (zh) | 2014-06-25 |
Family
ID=48412506
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210516463.4A Expired - Fee Related CN103114089B (zh) | 2012-12-05 | 2012-12-05 | 源于里氏木霉的强启动子及其表达载体和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103114089B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105463009A (zh) * | 2015-12-28 | 2016-04-06 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 利用重组载体在丝状真菌中筛选外源基因的方法 |
| CN108070609A (zh) * | 2017-12-27 | 2018-05-25 | 福建师范大学 | 利用里氏木霉作为宿主表达重组蛋白的方法 |
| CN115772519A (zh) * | 2021-09-06 | 2023-03-10 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 源于蛹虫草的强启动子及其应用 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3296401B1 (en) * | 2016-09-20 | 2020-02-19 | Clariant International Ltd | Method for selective carbon source-independent expression of protein-encoding sequences in a filamentous fungus cell |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101560513A (zh) * | 2009-05-15 | 2009-10-21 | 邢苗 | 一种里氏木霉表达盒及其重组菌株和应用 |
| CN102268448A (zh) * | 2011-06-28 | 2011-12-07 | 华东理工大学 | 一种用于在里氏木霉细胞内表达外源蛋白的表达设备及其基因工程菌 |
-
2012
- 2012-12-05 CN CN201210516463.4A patent/CN103114089B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101560513A (zh) * | 2009-05-15 | 2009-10-21 | 邢苗 | 一种里氏木霉表达盒及其重组菌株和应用 |
| CN102268448A (zh) * | 2011-06-28 | 2011-12-07 | 华东理工大学 | 一种用于在里氏木霉细胞内表达外源蛋白的表达设备及其基因工程菌 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| YAPENG CHAO ET AL.: "Secretome characteristics of pelletized Trichoderma reesei and cellulase production", 《WORLD J MICROBIOL BIOTECHNOL》 * |
| 张晓烜 王傲雪: "里氏木霉外源表达载体的构建", 《安徽农业科学》 * |
| 董欣睿 等: "糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)漆酶POXA1在里氏木霉中的高效表达及酶学性质", 《微生物学报》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105463009A (zh) * | 2015-12-28 | 2016-04-06 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 利用重组载体在丝状真菌中筛选外源基因的方法 |
| CN105463009B (zh) * | 2015-12-28 | 2019-03-22 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 利用重组载体在丝状真菌中筛选外源基因的方法 |
| CN108070609A (zh) * | 2017-12-27 | 2018-05-25 | 福建师范大学 | 利用里氏木霉作为宿主表达重组蛋白的方法 |
| CN108070609B (zh) * | 2017-12-27 | 2020-12-18 | 福建师范大学 | 利用里氏木霉作为宿主表达重组蛋白的方法 |
| CN115772519A (zh) * | 2021-09-06 | 2023-03-10 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 源于蛹虫草的强启动子及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103114089B (zh) | 2014-06-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6937740B2 (ja) | ゲノム編集システムおよび使用方法 | |
| CN105586355B (zh) | 在镶片镰孢的酶缺陷突变体中产生多肽的方法 | |
| CN103114089B (zh) | 源于里氏木霉的强启动子及其表达载体和应用 | |
| KR20140033048A (ko) | 변경된 점성 표현형을 갖는 사상균 | |
| AU2011293263B2 (en) | Filamentous fungi having an altered viscosity phenotype | |
| CN107075451A (zh) | 丝状真菌双重突变体宿主细胞 | |
| CN108070609B (zh) | 利用里氏木霉作为宿主表达重组蛋白的方法 | |
| CN111808834B (zh) | 在枯草芽孢杆菌中高效表达耐高温α-淀粉酶的方法、重组启动子以及应用 | |
| CN101469325A (zh) | 一种马克斯克鲁维酵母外切菊粉酶的分泌表达方法 | |
| CN106520766B (zh) | 一种海藻内源组成型启动子及其应用 | |
| CN113667688A (zh) | 一种长梗木霉质粒载体及其构建方法和应用 | |
| CN103757019A (zh) | 一种启动子及表达外源蛋白的重组表达系统 | |
| CN113755509A (zh) | 溶血磷脂酶变体及其构建方法和在黑曲霉菌株中的表达 | |
| CN103060341B (zh) | 源于里氏木霉的转录调控因子及编码基因和应用 | |
| CN102586284B (zh) | 源于里氏木霉的转录因子及其编码基因和应用 | |
| CN108251447B (zh) | 一种能高效表达脂肪酶的质粒、其构建方法及其应用 | |
| CN101928723B (zh) | 一种新的载脂蛋白a-ⅱ的制备 | |
| Jiang et al. | High-efficiency transformation of the plant pathogenic fungus Marssonina brunnea. | |
| CN102952807B (zh) | 多角体基因前180bp片段及其应用 | |
| CN115820746B (zh) | 激酶基因在调控丝状真菌菌丝形态中的应用 | |
| CN110029108B (zh) | 一种海藻内源全生活史组成型启动子及其应用 | |
| CN102146383B (zh) | 一种植物转化终止子dna序列及其应用 | |
| CN105039287A (zh) | GH61家族糖苷水解酶基因PpGH61及其用途 | |
| CN107129996A (zh) | 一种质粒载体及其构建方法和应用 | |
| Li et al. | Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of the white-rot fungus Dichomitus squalens |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: TIANJIN INSTITUTE OF INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGY, CHI Free format text: FORMER OWNER: TIANJIN INSTITUTE OF INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGY Effective date: 20140418 Owner name: HANGZHOU XINWEI LOW CARBON TECHNOLOGY R + D CO., L Effective date: 20140418 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: He Ronglin Inventor after: Yang Zongxin Inventor after: Ma Lijuan Inventor after: Zhang Dongyuan Inventor after: Chen Shulin Inventor before: He Ronglin Inventor before: Ma Lijuan Inventor before: Zhang Dongyuan Inventor before: Chen Shulin |
|
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: HE RONGLIN MA LIJUAN ZHANG DONGYUAN CHEN SHULIN TO: HE RONGLIN YANG ZONGXIN MA LIJUAN ZHANG DONGYUAN CHEN SHULIN |
|
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20140418 Address after: 300308 Tianjin Airport Economic Zone seven West Road No. 32 Applicant after: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences Applicant after: Hangzhou Xinwei Low Carbon Technology R & D Co., Ltd. Address before: 300308 Tianjin Airport Economic Zone seven West Road No. 32 Applicant before: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140625 Termination date: 20181205 |