CN101481704A - 一种四环素严紧调控的真核表达载体 - Google Patents

Abstract

一种四环素严紧调控的真核表达载体，其分别引入如下DNA元件：hCMV、rtTA2^S－M2、IRES、EGFP－Puro、编码荧光素酶的元件(Luc)和P_tetbi－RFC，应用于外源性兴趣基因在真核细胞中的表达和筛选。该载体转染后受到Tet或Dox严紧控制，并且基因的表达水平通过加入Tet或Dox的量进行定量调节；通过检测Luc荧光素酶的活性就可以间接检测兴趣基因的表达水平；载体的转染效率可以通过检测绿色荧光细胞的比例来完成；稳定转染的细胞通过流式细胞仪分选，使得确定兴趣基因的表达简洁、方便；而且所筛选得到的稳定细胞系，兴趣基因已经整合于宿主的基因组，具有长期稳定表达的特性和优势。

Description

一种四环素严紧调控的真核表达载体

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种四环素严紧调控的真核表达载体，特别涉及不同兴趣外源性基因方便的重组入该载体，及转染该载体显阳性的细胞的筛选。

背景技术

飞速发展的功能基因组学的研究需要严紧调控的基因表达系统，以便外源基因在宿主细胞的表达能够得到精确调控，使得其功能研究顺利进行。近年来四环素(tetracycline，Tet)调控的基因表达系统得到广泛的应用。Tet诱导的表达系统分为两种：一种是Tet关闭型，另一种是Tet开放型。前者在没有Tet和其衍生物强力霉素(doxycycline，Dox)存在的情况下组成型表达，在Tet或者Dox存在的情况下受到调控，表达系统关闭(Lee，Y.B.，A.S.Cosgrave，C.P.Glover，A.Bienemann，D.Heywood，R.J.Hobson and J.B.Uney.2005.Increased utility in the CNS of a powerful neuron-specific tetracycline-regulatableadenoviral system developed using a post-transcriptional enhancer.J Gene Med.7：576-583.)；而后者在Tet或Dox存在的条件下表达系统被激活而表达(Gossen，M.，S.Freundlieb，G.Bender，G.Muller，W.Hillen and H Bujard.1995.Transcri-ptional activation by tetracyclines in mammalian cells.Science.268：1766-1769.)。与Tet关闭型表达系统相比，Tet开放型表达系统的优点是：加入诱导剂产生的表达激活要比从Tet关闭型系统中去除Tet或Dox产生的表达激活效应快得多，因为Tet关闭型系统需要一定的药物洗脱时间；此外Tet开放型系统可以通过加入不同剂量的诱导剂，控制目的基因的表达水平(Kistner，A.，M.Gossen，F.Zimmermann，J.Jerecic，C.Ullmer，H.Lubbert and H.Bujard.1996.Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expressionin transgenic mice.Proc Natl Acad Sci U S A.93：10933-10938.4)。

虽然目前已经有很多Tet或Dox诱导表达系统的报道(Georgievska，B.，J.Jakobsson，E.Persson，C.Ericson，D.Kirik and C.Lundberg.2004.Regulateddelivery of glial ce11line-derived neurotrophic factor into rat striatum，using atetracycline-dependent lentiviral vector.Hum Gene Ther.15：934-944.；Aurisicchio，L.，A.De Tomassi，N.La Monica，G.Ciliberto，C.Traboni and F.Palombo，2005.Regulated and liver-specific tamarin alpha interferon genedelivery by a helper-dependent adenoviral vector.J Virol.79：6772-6780)，但存在的问题是，受Tet或Dox调控的目的基因置换不方便；例如经过高通量的方法筛选得到很多待检测的兴趣基因，就需要根据不同基因的序列和酶切位点，设计重组方案，采用传统的酶切和连接方法，构建Tet或Dox调控系统，工作量大，费时费力。此外，在基因功能学的研究中，对于兴趣基因的转入、表达以及稳定表达体的获取，都需要有相应的高效的筛选标记，这对于工作的成败有至关重要的作用；现有的筛选标记还没有达到简洁、快速、方便的筛选效果。最后，目前报道的Tet或Dox诱导表达载体，具有真核复制子，转入真核细胞后，能够自主复制；虽然见效较快，但没有整合到宿主基因组中的外源性基因，表达不够稳定，在较长的时间(数月)之后有载体表达的减弱和丢失现象发生，影响对基因功能的长期研究。

发明内容

本发明解决的问题在于构建一种四环素严紧调控的真核表达载体，该载体高通量的筛选在真核细胞的表达的兴趣外源性基因，既能够方便的置换不同的外源性兴趣基因，又具备高效筛选标记。

本发明是通过以下技术方案来实现上述发明目的：

一种四环素严紧调控的真核表达载体，包括启动子，沿启动子方向分布有编码四环素反应表达框抑制子的rtTA2^S-M2和四环素反应表达框，所述的四环素反应表达框包括四环素控制的双向启动子P_tetbi，所述rtTA2^S-M2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，P_tetbi的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述启动子P_tetbi一侧为外源性兴趣基因的读码框RFC；所述RFC的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

所述启动子P_tetbi另一侧为编码萤光素酶(luciferase)的元件，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

所述四环素严紧调控的真核表达载体，在rtTA2^S-M2元件后还插入EGFP-Puro序列，EGFP-Puro序列是编码绿色荧光蛋白EGFP和嘌罗霉素(Puromicine)抗性蛋白的融合基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

所述四环素严紧调控的真核表达载体，在rtTA2^S-M2元件和EGFP-Puro序列之间还插入核糖体进入位点(IRES)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

所述的四环素严紧调控的真核表达载体是重组质粒pE1l-IGR-RFC，其引入的DNA元件排列如下：hCMV-rtTA2^S-M2-IRES-EGFP-Puro-编码萤光素酶的元件(Luc)-P_tetbi-RFC，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

所述的四环素严紧调控的真核表达载体pE1l-IGR-RFC应用于外源性兴趣基因在真核细胞中表达的筛选。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、在无Tet和Dox存在时，抑制子编码的rtTA2^S-M2蛋白通过与四环素反应元件结合，抑制其控制的基因(启动子P_tetbi两侧的基因)的转录；在Tet和Dox存在下，Tet和Dox与rtTA2^S-M2蛋白结合，从而解除其对于Tet或Dox反应元件的抑制，而开放基因的表达；经过优化的rtTA2^S-M2比传统的rtTA对于Dox有更高的敏感性。兴趣基因引入到本发明所提供的表达载体中，其表达受到Tet或Dox严紧控制，并且基因的表达水平通过加入Tet或Dox的量进行定量调节。

2、将Tet诱导表达系统的反应元件rtTA与P_tetbi整合于同一个载体之中，通过对普通细胞系单次转染就可以实现兴趣基因(gene of interest)的诱导表达，而不必先筛选稳定转染rtTA的细胞系，再转染P_tetbi-兴趣基因(P_tetbi-geneof interest)，可以节约大量的时间和费用。

3、启动子P_tetbi控制的RFC来源于商品化的Gateway重组系统(Invitrogen，USA)，中间载体pENTR-gene of interest与表达载体的RFC读码框经过重组酶催化，得到最终的表达载体pE11-IGR-gene of interest，从而不必针对不同的兴趣基因重新设计设计重组方案，利用本发明提供的表达载体通过重组技术可以实现多种兴趣基因的批量检测，提高工作效率，降低实验成本。

4、双向启动子P_tetbi一侧为用于置换入兴趣基因的读码框RFC，另一侧为萤光素酶(luciferase，Luc)，萤光素酶的表达水平可以间接反映兴趣基因的表达状态；通过检测Luc的活性就可以间接检测兴趣基因的表达水平，使得确定兴趣基因的表达简洁、方便。

5、IRES(internal ribosome entry site)被加在rtTA2SM2和EGFP-Puro的序列之间，实现这两个基因被一个启动子驱动。EGFP-Puro是绿色荧光蛋白和嘌罗霉素抗性蛋白的融合基因，可以用于真核细胞转染该表达载体后的阳性转染体的筛选。载体的转染效率可以通过检测绿色荧光细胞(EGFP阳性)的比例来完成；稳定转染的细胞通过流式细胞仪分选，结合嘌罗霉素筛选来完成，比现行的单一方法(如用抗生素)筛选，所需时间大为缩短。

6、本表达载体由于没有真核复制子，转染入真核宿主细胞后，不能自主复制，只能整合到宿主的基因组才能表达；因此经过筛选得到的稳定细胞系，兴趣基因已经整合于宿主的基因组，具有长期稳定表达的特性和优势。

附图说明

图1是RFC的DNA元件连接示意图。

图2是表达载体pE11-IGR-RFC引入的DNA元件的连接示意图。

图3是构建表达载体pE11-IGR-外源性兴趣基因的流程示意图。

图4是表达载体pE11-IGR-β-catenin-ERα转染HTEB56细胞后的荧光素酶的活性检测结果图；横坐标表示不同浓度Tet或Dox诱导的细胞，纵坐标表示相对荧光素酶活性。

图5是表达载体pE11-IGR-β-catenin-ERα转染细胞后，以β-catenin作为内参照的Western杂交检测结果图；横坐标表示不同浓度Tet或Dox诱导的细胞。

图6是以未转染的细胞作为阴性对照，表达载体pE11-IGR-β-catenin-ERα转染细胞后，以EGFP作为标记进行流式细胞术分选的结果，与未进行流式细胞术分选的细胞对照图；横坐标为EGFP荧光强度，纵坐标为相对细胞计数；图A是转染32D细胞，图B转染HTB56细胞。

图7是纯化的表达载体表达阳性的绿色细胞荧光显微镜照片。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做详细说明，所述实施例是对本发明的解释而不是对本发明的限定。

本发明所述的四环素严紧控制表达系统，是基于Tet开放型表达系统，Tet调控所需要的元件由两个表达框(expression cassettes)组成，其中一个编码Tet或Dox反应元件，另一个编码抑制子。沿启动子方向插入抑制子rtTA2^S-M2元件，其序列如SEQ ID NO.1所示，编码rtTA2^S-M2蛋白；rtTA2^S-M2是优化的四环素反应元件的抑制子。在无Tet和Dox存在时，rtTA2^S-M2蛋白通过与四环素反应表达元件(Tet或Dox反应元件)结合，抑制其控制的基因转录；而Tet和Dox可以与rtTA2S-M2蛋白结合，从而解除对于Tet或Dox反应元件的抑制，启动其控制基因的表达。四环素反应表达框包括四环素控制的双向启动子P_tetbi，P_tetbi一侧为外源性兴趣基因的读码框RFC，另一侧为编码萤光素酶(luciferase，Luc)的元件；所述P_tetbi的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，RFC读码框的引入是为了能够方便置换不同的兴趣外源性基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；Luc元件的引入是为了快速、简便的检测真核表达载体的表达，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。P_tetbi作为双向启动子，Luc元件的表达水平可以间接反映兴趣基因的表达状态；通过检测萤光素酶的活性间接检测兴趣基因的表达水平。

为了具备高效筛选标记，筛选表述载体表达阳性的细胞克隆，在表达载体Tet调控元件之后还引入表达融合蛋白EGFP-Puro的序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；同时在两者之间插入IRES序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示，实现这两个基因被一个启动子驱动，从而同时表达。EGFP-Puro是绿色荧光蛋白和嘌罗霉素抗性蛋白的融合蛋白，可以用于真核细胞转染该表达载体后的阳性转染体的筛选。载体的转染效率可以通过检测绿色荧光细胞(EGFP阳性)的比例来完成，同时稳定转染的细胞通过流式细胞术以EGFP标记进行分选，结合嘌罗霉素筛选来转染细胞的纯化。

上述RFC的结构参见Invitrogen公司的Gateway vector conversion system，目录号11828-029，如图1所示；RFC两端的attR1和attR2是重组酶识别位点，primerl和primer2是测序引物，用于检测attR1和attR2是否完整；氯霉素抗性基因Cm^R(chloramphenicol resistance gene)用于筛选含有RFC的载体；ccdB基因，在没有外源性基因插入的情况下，表达毒蛋白，会杀死没有ccdB抗性的宿主菌，外源性兴趣基因的导入会置换掉ccdB基因，从而有外源性基因插入的载体可以在没有ccdB抗性的宿主菌中复制。

如图3所示，外源性兴趣基因克隆入RFC的重组反应：兴趣基因替换掉原有的ccdB毒蛋白序列，克隆入载体pENTR，获得中间载体pENTR-gene ofinterest；表达载体的RFC读码框和pENTR-gene of interest经过重组酶(Gateway Clonase enzyme mixtures，Invitrogen)催化，通过基因重组得到最终的表达载体pE11-IGR-gene of interest，从而不必针对不同的兴趣基因重新设计设计重组方案。pENTR的结构(参见Invitrogen公司Gateway

 pENTR^TMVectors，目录号11813-011，11816-014，11817-012，11818-010，11819-018)。

RFC与pENTR-gene of interest的重组反应采用LR重组酶混合物II(Invitrogen， LR Clonase.II Enzyme Mix，目录号11791-020)，该混合物含有细菌噬菌体的重组酶(Integrase)和切除酶(Excisionase)和整合宿主因子(Integration Host Factor，IHF)，可以识别attL与attR，催化上述目的载体(destination nvector)和pENTR-gene of interest的重组，将attL1和attL2之间的兴趣基因导入目的载体的attR1和attR2之间，从而完成LR重组反应，实现DNA序列的重组互换。具体实验步骤和条件如下：

(1)于室温下在1.5ml的离心管加入以下成分，并混匀：pENTR-gene of interest(50-150ng/μl)，1～7μl，含RFC的四环素严紧控制表达系统，(150ng/μl)1μlTE缓冲液(pH8.0)，8μl

(2)LR重组酶混合物II冰浴解冻2min，振荡混匀(2s/次)；

(3)步骤(1)的离心管中加入LR重组酶混合物II(2μl/管)，混匀；

(4)25℃保温1小时；

(5)每管加1μl蛋白酶K溶液，37℃保温10min，终止反应；

(6)取1μl反应液转化DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，扩大培养获取大量重组入兴趣基因的四环素严紧控制表达载体。

本发明将RFC引入四环素严紧控制表达载体，为方便、快捷的置换入不同的兴趣基因做好准备。因此，本发明提供的载体既能在真核细胞中有效表达和筛选兴趣外源性基因，又能够方便的置换不同的外源性兴趣基因。

以重组质粒pE11-IGR-RFC来详细说明上述元件的引入和表达载体的构建。所构建的重组质粒以hCMV作为启动子，其DNA元件排列如图2所示：hCMV-rtTA2^S-M2-IRES-EGFP-Puro-Luc-P_tetbi-RFC，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。其构建过程如下：

第一步：重组质粒pIGR的制备

以pUHrT62-1载体为模板，进行PCR扩增，得到831bp的产物片段，其两端在引物合成时引入Nhe I和Sac I酶切位点；PCR产物经酶切、纯化，连接入pMA87(IRES/EGFP-Puro)载体，得到pIGR(hCMV-rtTA-IRES-EGFP-Puro)。pUHrT62-1和pMA87(IRES/EGFP-Puro)均由德国明斯特大学医学院血液与肿瘤学系Carsten Muller-Tidow教授惠赠。

第二步：克隆pIGR(hCMV-rtTA-IRES-EGFP-Puro)和RFC(reading frameC，购自Invitrogen公司)以获得足够量的片段

以pIGR为模板，进行PCR扩增，得到3695bp的产物，该产物采用Zero

TOPO PCR亚克隆试剂盒(Invitrogen公司，产品目录号K2830-20)，构建成pTOPO-IGR亚克隆；

将RFC(reading frame C，购自Invitrogen公司，产品目录号11828-029)，采用Zero 

 TOPO PCR亚克隆试剂盒(Invitrogen公司，产品目录号K2830-20)构建成pTOPO-RFC亚克隆；

pTOPO-RFC和pTOPO-IGPR分别经Nsi I酶切获得RFC(1826bp)和IGR(hCMV-rtTA-IRES-EGFP-Puro，3741bp)。

第三步：重组质粒pE11-RFC的制备

pE11-Cyclin A1(由德国明斯特大学医学院血液与肿瘤学系CarstenMuller-Tidow教授惠赠)和pTOPO-RFC分别经Psi I和Nsi I(Psi I和Nsi I是同尾酶，即切出的末端相同)酶切，进而将RFC片段连接入pE11，得到pE11-RFC(Luc-P_tetbi-RFC)。

第四步：表达载体pE11-IGR-RFC的制备

pE11-RFC经过Cla I酶切，连接入人工合成的接头(linker)，目的在于引入Nsi I酶切位点，经Nsi I酶切，连接进来自pTOPO-IGR的IGR片段，得到最终载体pE11-IGR-RFC(pE11-hCMV-rtTA-IRES-EGFP-Puro-Luc-P_tetbi-RFC)。

下面给出以β-catenin-ERα融合基因作为兴趣基因克隆入表达载体pE11-IGR-RFC，构建表达载体pE11-IGR-β-catenin-ERα，并将其转入宿主细胞为实施例说明本发明的载体应用于外源性兴趣基因在真核细胞中的表达的筛选。

融合基因β-catenin-ERα编码一个包括野生型β-catenin和雌激素受体α激素结合结构域的嵌合体蛋白，β-catenin-ERα的基因序列由两部分组成：其中，β-catenin的序列参见GenBank accession no.Z19054；ERα的序列和结构参见Trevor D.Littlewood，David C.Hancock，Paul S.Danielian，Malcolm G.Parker，and Gerard I.Evan A modified oestrogen receptor ligand-binding domain as animproved switch for the regulation of heterologous proteins Nucl.Acids Res.1995 23：1686-1690。β-catenin-ERα融合蛋白和β-catenin的分子量分别为136和92kD。

按照上述表达载体的构建方法，首先将β-catenin-ERα融合基因克隆进入pENTR，形成中间载体pENTR-β-catenin-ERα；其次，pENTR-β-catenin-ERα与pE11-IGR-RFC体外重组，得到重组载体pE11-IGR-β-catenin-ERα，并分别将pE11-IGR-β-catenin-ERα分别转染贴壁生长的人肺癌细胞系HTB56和悬浮生长的小鼠骨髓瘤细胞系32D，评价载体中各个元件的效果，说明本发明提供的表达载体，在筛选真核细胞的表达的兴趣外源性基因，具备简洁、高效、方便的筛选标记，便于得到高纯度的表达载体表达阳性的细胞。

具体实施过程如下：

①细胞培养

HTB56非小细胞肺癌细胞系培养于含10％无Tet胎牛血清(FCS)的MEM培养液(Modified Eagle′s medium，Invitrogen，Calsbad，CA，USA)，培养液中补充1％的非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺、100u/ml青霉素和100μg/mi链霉素，培养于37℃含5％CO₂的孵箱中。所述非必需氨基酸是一种商品化的溶液，由七种10mM的非必需氨基酸(丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸)溶液组成，购自HyClone公司，目录号SH30236.01。

小鼠骨髓瘤细胞系32D的培养按照已有报道的方法进行(Mizuki，M.，R.Fenski，H.Halfter，I.Matsumura，R，Schmidt，C.Muller，W.Gruning，K.Kratz-Albers，et al.2000.Flt3 mutations from patients with acute myeloidleukemia induce transformation of 32D cells mediated by the Ras and STAT5pathways.Blood.96：3907-3914.)。

②基因转染

HTB56细胞于转染8h前接种于6孔培养板，密度为300,000细胞/孔。转染采用脂质体(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，每孔转染未经线性化处理的1μg pE11-IGR-β-catenin-ERα，Tet或Dox(Sigma，St.Louis，MO，USA)在转染后24h加入细胞培养液中，不同孔的细胞加入的浓度线性递增Tet：0-5μg/ml，Dox：0.01-1μg/ml。

在转染32D细胞前，将pE11-IGR-β-catenin-ERα用I-SceI限制性内切酶(New England Biolabs，Ipswich，MA，USA)处理，从而使其线性化。采用电穿孔转染法，将含有3 x 10⁶ 32D细胞的300μl细胞悬液转移至直径4mm的电转杯，加入含32μg线性化的pE11-IGR-β-catenin-ERα的悬浮液。电穿孔条件为采用EPI2500型电转仪(Pulse Generator EPI 2500，Fischer，Heidelberg，Germany)，300V，6ms。

③荧光素酶(Luciferase，Luc)活性检测

对于荧光素酶活性检测，0.1μg编码花虫荧光素酶的pRLSV40与pE11-IGR-β-catenin-ERα共转染，以便作为内参照来标准化表达载体的转染效率。

同一样品中荧光素酶和花虫荧光素酶的活性，依次采用荧光素酶双报告系统(Dual-Luciferase Report Assay System，Promega，Madison，Wisconsin，USA)进行测定(参照Promega公司萤光素酶检测系统技术手册，http://www.promega.com.cn/techserv/ctbs/yingguangTB281.pdf)。经过Tet或Dox处理24h，细胞经PBS缓冲液(NaCl16g，Na₂HPO₄(12H₂O)，5.65g，KCl0.4g，KH₂PO₄0.4g加双蒸水至1000ml pH7.0)洗2次，加入120μl裂解液，室温裂解15min。取10μl细胞裂解产物，迅速与100μl萤火虫荧光素酶测定试剂在发光管中混合；在5s预测定延迟之后，荧光素酶发射的光被记录10s的时间，实验采用TD-20/20萤光光度计(Turner Designs Instrument，CA，USA)。随后，100μl萤火虫荧光素酶测定试剂加入到同一发光管中，灭活萤火虫荧光素酶的同时激活花虫荧光素酶。检测荧光素酶活性间接得到的表达载体转染效率的波动，通过荧光素酶活性除以花虫荧光素酶活性得以标准化校正。

④Western杂交

转染表达载体的细胞经过冰的PBS冲洗，在冰浴中以含150mM NaCl的RIPA缓冲液裂解30min(Tickenbrock，L，J.Schwable，M.Wiedehage，B.Steffen，B.Sargin，C.Choudhary，C.Brandts，W.E.Berdel，et al.2005.Flt3tandem duplication mutations cooperae with Wnt signaling in leukemic signaltransduction.Blood.105：3699-3706.)，细胞裂解后离心20000g×10min去除细胞碎片和其他的不溶物。测定浓度后，裂解液在SDS加样缓冲液中煮沸5min，SDS聚丙烯酰胺凝胶(PAGE，4-12％，Invitrogen)电泳分离。凝胶经过转PVDF(polyvinylidene difluoride，Millipore，Bedford，MA，USA)膜，Western蛋白杂交采用抗人-β-catenin为一抗(0.38μg/ml，BD Biosciences，NJ，USA)，进而结合辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的二抗，最终以化学发光法(chemoluminescence detection，ECL Plus，Amersham Pharmacia，Uppsala，Sweden)检测荧光强度，来反映待检抗原的表达水平。

⑤实验结果及统计学分析

定量数据以均数±标准差(SD)表示，统计学分析采用SPSS 10.0(SPSSScience，Chicago，IL，USA)，多组间差异比较采用单因素方差分析，p<0.05认为有显著差异。

a、荧光素酶的活性检测结果显示，Tet或Dox严紧且定量的控制兴趣基因的表达

荧光素酶的活性检测结果如图4所示，转染pE11-IGR-β-catenin-ERα的HTEB56细胞暴露于不同浓度的Tet(0-5μg/ml)或Dox(0.01-1lμg/ml)，横坐标表示经不同Tet或Dox浓度诱导的细胞，纵坐标表示相对荧光素酶活性(荧光素酶活性除以花虫荧光素酶活性)，*表示P<0.05，**表示P<0.001，以未经Tet或Dox处理的对照细胞的相对荧光素酶活性值设定为1。结果显示：0.05～5μg/ml Tet或0.01～1lμg/ml Dox剂量依赖性的诱导荧光素酶表达，从表达幅度来看该表达载体对Dox比对Tet更加敏感。当Dox的浓度达到1μg/ml，荧光素酶的活性比没有Tet和Dox存在的情况下升高80倍左右(p<0.001)。这种剂量依赖性的诱导效应显示，兴趣基因的表达水平可以通过加入不同剂量的Tet或Dox人为调控。而荧光素酶的活性间接反映另一侧β-catenin-ERα的表达活性，说明通过Tet或Dox的剂量依赖性的诱导表达，兴趣基因不但可以定性，还可以定量的在宿主细胞中表达。

b、Tet或Dox对于β-catenin-ERα表达的诱导效应

融合基因β-catenin-ERα编码一个包括野生型β-catenin和雌激素受体α激素结合结构域的嵌合体蛋白。转染pENTR-β-catenin-ERα的32D细胞或者HTB56细胞经过Dox或Tet处理24h之后，经Western杂交检测β-catenin-ERα的表达。β-catenin-ERα融合蛋白和β-catenin的分子量分别为136和92kD，与预期分子量一致。

抗人-β-catenin可以同时识别β-catenin-ERα融合蛋白和野生型的β-catenin，因此以野生型的β-catenin作为内参照，结果如图5所示，横坐表示经不同浓度Tet(0-5μg/ml)或Dox(0.01-1μtg/ml)诱导的细胞。与荧光素酶的检测结果相吻合，0.01～1μg/ml的Dox剂量依赖性的诱导β-catenin-ERα表达，5μg/ml的Tet也可以显著诱导β-catenin-ERα的表达，并且在无Tet存在时β-catenin-ERα的背景表达很低。无Tet或Dox时，β-catenin-ERα的低背景表达提示，该表达系统的诱导控制非常严紧。

c、EGFP是流式细胞术筛选表达载体阳性转染细胞的有效标记

在表达载体pE1l-IGR-β-catenin-ERα中，EGFP-Puro组成型表达，与Tet或Dox控制的表达框被一个启动子驱动，分别独立表达。绿色荧光蛋白EGFP作为一种筛选标记，转入真核细胞后会表达绿色荧光蛋白EGFP，流式细胞仪可以检测到该绿色荧光，并且以此作为分选标记，经过流式细胞术可以检测到EGFP阳性细胞，以此来评价转染效率；同时经过流式细胞术分选，还可以得到纯度相当高的EGFP阳性细胞，起到纯化阳性细胞的作用。分选过程在几个小时内就可以完成，相对于几周甚至几个月的抗生素筛选节省了时间，提高了效率。

如图6所示，采用正常(未转染)HTB56或32D细胞作为阴性对照细胞，表达载体pE11-IGR-β-catenin-ERα转染细胞后以EGFP作为标记进行流式细胞术分选的结果，与未进行流式细胞术分选的细胞对照图；图中所示的细胞分为“未转染”(没有转染pE11-IGR-β-catenin-ERα表达载体，阴性对照)、“转染后未分选”(转染pE11-IGR-β-catenin-ERα表达载体后，没有通过EGFP标记分选的总体细胞)和“转染后经分选”(转染pE1l-IGR-β-catenin-ERα表达载体后，以EGFP标记流式细胞术分选的具有绿色荧光的细胞)，而“阳性细胞范围”是指在选定的荧光强度范围内(x轴)，阴性细胞即不发出绿色荧光的细胞计数(y轴)小于1％。

如图6A所示，在选定的荧光强度范围内，“未转染”、“转染后未分选”和“转染后经分选”的32D细胞中，阳性细胞的比例分别为0.84％，7.97％和67.76％；如图6B所示，在选定的荧光强度范围内，“未转染”、“转染后未分选”和“转染后经分选”的HTB56细胞中，EGFP阳性细胞的比例分别为0.16％，9.80％和79.05％。以上结果显示，EGFP是一个有效的流式细胞术分选标记。

表达载体转染48h后只有不到10％的绿色细胞，经过流式细胞术分选后，绿色细胞占70％左右。相对较低的转染效率可能是由于该表达载体大于10kb。尽管瞬时转染的效率不高，但是，低背景表达和高效的诱导特性能够保证该载体易于筛选、扩增。而且绿色细胞偏少的另外一个原因是该载体中没有真核复制子，因此转染进入宿主细胞后，不能在胞浆中自主复制。有报道显示，一些游离复制载体(没有整合到宿主的基因组)不能长期稳定表达，其原因就是抗生素的筛选不能分辨出兴趣基因是游离的，还是整合于基因组的(Urlinger，S.，U.Baron，M.Thellmann，M.T.Hasan，H.Bujard and W.Hi1len.2000.Exploring the sequence space for tetracycline-dependent transcriptionalactivators：novel mutations yield expanded range and sensitivity.Proc Natl AcadSci U S A.97：7963-7968.)。考虑到表达稳定性，在表达载体的构建过程中，去除了该表达载体中的真核复制原。这样做的优点是，一旦得到稳定的细胞系，兴趣基因一定是已经整合于基因组中，有利于长期研究兴趣基因的功能。

另外与转染HTB56细胞相比，成功的用电穿孔方法将线性化的pE11-IGR-β-catenin-ERα转染进入32D细胞；这表明，无论对于贴壁生长还是悬浮生长的细胞，该载体是否线性化，都能有效转染和表达。

d、流式细胞术对EGFP分选，结合嘌罗霉素筛选可以获得稳定表达细胞系

针对EGFP-Puro融合蛋白，HTB56细胞转染pE11-IGR-β-catenin-ERα，48h后，以0.5μg/ml的嘌罗霉素(Sigma，St.Louis，MO，USA)筛选，同时每过1-2周，采用流式细胞术分选、纯化绿色的EGFP阳性细胞。经过2-3月，得到纯度高于90％的绿色细胞，也即表达载体表达阳性的细胞，如图7所示荧光显微镜照片。

核苷酸序列表

<110>中国人民解放军第四军医大学

<120>一种四环素严紧调控的真核表达载体

<160>7

<210>1

<211>771

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

tcgacaattc accatgtcta gactggacaa gagcaaagtc ataaacggcg ctctggaatt   60

actcaatgga gtcggtatcg aaggcctgac gacaaggaaa ctcgctcaaa agctgggagt   120

tgagcagcct accctgtact ggcacgtgaa gaacaagcgg gccctgctcg atgccctgcc   180

aatcgagatg ctggacaggc atcataccca cttctgcccc ctggaaggcg agtcatggca   240

agactttctg cggaacaacg ccaagtcatt ccgctgtgct ctcctctcac atcgcgacgg   300

ggctaaagtg catctcggca cccgcccaac agagaaacag tacgaaaccc tggaaaatca   360

gctcgcgttc ctgtgtcagc aaggcttctc cctggagaac gcactgtacg ctctgtccgc   420

cgtgggccac tttacactgg gctgcgtatt ggaggaacag gagcatcaag tagcaaaaga   480

ggaaagagag acacctacca ccgattctat gcccccactt ctgagacaag caattgagct   540

gttcgaccgg cagggagccg aacctgcctt ccttttcggc ctggaactaa tcatatgtgg   600

cctggagaaa cagctaaagt gcgaaagcgg cgggccggcc gacgcccttg acgattttga   660

cttagacatg ctcccagccg atgcccttga cgactttgac cttgatatgc tgcctgctga   720

cgctcttgac gattttgacc ttgacatgct ccccgggtaa ctaagtaagg a            771

<210>2

<211>618

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

ctagcacgcg tcagctgact agaggatccc cgggtaccga gctcgaattc ggggccgcgg   60

aggctggatc ggtcccggtg tcttctatgg aggtcaaaac agcgtggatg gcgtctccag   120

gcgatctgac ggttcactaa acgagctctg cttatatagg cctcccaccg tacacgccta   180

ctcgacccgg gtaccgagct cgactttcac ttttctctat cactgatagg gagtggtaaa   240

ctcgactttc acttttctct atcactgata gggagtggta aactcgactt tcacttttct   300

ctatcactga tagggagtgg taaactcgac tttcactttt ctctatcact gatagggagt   360

ggtaaactcg actttcactt ttctctatca ctgataggga gtggtaaact cgactttcac   420

ttttctctat cactgatagg gagtggtaaa ctcgactttc acttttctct atcactgata   480

gggagtggta aactcgacct atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc agatcgcctg   540

gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat ccagcctccg   600

cggccccgaa ttcctgca                                                618

<210>3

<211>3434

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

atcaaacaag tttgtacaaa aaagctgaac gagaaacgta aaatgatata aatatcaata   60

tattaaatta gattttgcat aaaaaacaga ctacataata ctgtaaaaca caacatatcc   120

agtcctatgg gcggccgcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta   180

taatgtgtgg attttgagtt aggatccgtc gagattttca ggagctaagg aagctaaaat   240

ggagaaaaaa atcactggat ataccaccgt tgatatatcc caatggcatc gtaaagaaca   300

ttttgaggca tttcagtcag ttgctcaatg tacctataac cagaccgttc agctggatat   360

tacggccttt ttaaagaccg taaagaaaaa taagcacaag ttttatccgg cctttattca   420

cattcttgcc cgcctgatga atgctcatcc ggaattccgt atggcaatga aagacggtga   480

gctggtgata tgggatagtg ttcacccttg ttacaccgtt ttccatgagc aaactgaaac   540

gttttcatcg ctctggagtg aataccacga cgatttccgg cagtttctac acatatattc   600

gcaagatgtg gcgtgttacg gtgaaaacct ggcctatttc cctaaagggt ttattgagaa   660

tatgtttttc gtctcagcca atccctgggt gagtttcacc agttttgatt taaacgtggc   720

caatatggac aacttcttcg cccccgtttt caccatgggc aaatattata cgcaaggcga   780

caaggtgctg atgccgctgg cgattcaggt tcatcatgcc gtttgtgatg gcttccatgt   840

cggcagaatg cttaatgaat tacaacagta ctgcgatgag tggcaggcgg ggcgtaatct   900

agaggatccg gcttactaaa agccagataa cagtatgcgt atttgcgcgc tgatttttgc   960

ggtataagaa tatatactga tatgtatacc cgaagtatgt caaaaagagg tatgctatga   1020

agcagcgtat tacagtgaca gttgacagcg acagctatca gttgctcaag gcatatatga   1080

tgtcaatatc tccggtctgg taagcacaac catgcagaat gaagcccgtc gtctgcgtgc   1140

cgaacgctgg aaagcggaaa atcaggaagg gatggctgag gtcgcccggt ttattgaaat   1200

gaacggctct tttgctgacg agaacagggg ctggtgaaat gcagtttaag gtttacacct   1260

ataaaagaga gagccgttat cgtctgtttg tggatgtaca gagtgatatt attgacacgc   1320

ccgggcgacg gatggtgatc cccctggcca gtgcacgtct gctgtcagat aaagtccccc   1380

gtgaacttta cccggtggtg catatcgggg atgaaagctg gcgcatgatg accaccgata   1440

tggccagtgt gccggtctcc gttatcgggg aagaagtggc tgatctcagc caccgcgaaa   1500

atgacatcaa aaacgccatt aacctgatgt tctggggaat ataaatgtca ggctccctta   1560

tacacagcca gtctgcaggt cgaccatagt gactggatat gttgtgtttt acagtattat   1620

gtagtctgtt ttttatgcaa aatctaattt aatatattga tatttatatc attttacgtt   1680

tctcgttcag ctttcttgta caaagtggtt cgatrvrscm atcgaaccac tttgtacaag   1740

aaagctgaac gagaaacgta aaatgatata aatatcaata tattaaatta gattttgcat   1800

aaaaaacaga ctacataata ctgtaaaaca caacatatcc agtcactatg gtcgacctgc   1860

agactggctg tgtataaggg agcctgacat ttatattccc cagaacatca ggttaatggc   1920

gtttttgatg tcattttcgc ggtggctgag atcagccact tcttccccga taacggagac   1980

cggcacactg gccatatcgg tggtcatcat gcgccagctt tcatccccga tatgcaccac   2040

cgggtaaagt tcacggggga ctttatctga cagcagacgt gcactggcca gggggatcac   2100

catccgtcgc ccgggcgtgt caataatatc actctgtaca tccacaaaca gacgataacg   2160

gctctctctt ttataggtgt aaaccttaaa ctgcatttca ccagcccctg ttctcgtcag   2220

caaaagagcc gttcatttca ataaaccggg cgacctcagc catcccttcc tgattttccg   2280

ctttccagcg ttcggcacgc agacgacggg cttcattctg catggttgtg cttaccagac   2340

cggagatatt gacatcatat atgccttgag caactgatag ctgtcgctgt caactgtcac   2400

tgtaatacgc tgcttcatag catacctctt tttgacatac ttcgggtata catatcagta   2460

tatattctta taccgcaaaa atcagcgcgc aaatacgcat actgttatct ggcttttagt   2520

aagccggatc ctctagatta cgccccgcct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat   2580

taagcattct gccgacatgg aagccatcac aaacggcatg atgaacctga atcgccagcg   2640

gcatcagcac cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga   2700

agttgtccat attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg   2760

agacgaaaaa catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac   2820

acgccacatc ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc   2880

agagcgatga aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat   2940

cccatatcac cagctcaccg tctttcattg ccatacggaa ttccggatga gcattcatca   3000

ggcgggcaag aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct   3060

ttaaaaaggc cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact   3120

gaaatgcctc aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag   3180

tgattttttt ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgacgga tcctaactca   3240

aaatccacac attatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgcgg  3300

ccgcccatag gactggatat gttgtgtttt acagtattat gtagtctgtt ttttatgcaa   3360

aatctaattt aatatattga tatttatatc attttacgtt tctcgttcag cttttttgta   3420

caaacttgtt tgat                                                    3434

<210>4

<211>1971

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

tttaccacat ttgtagaggt tttacttgct ttaaaaaacc tcccacacct ccccctgaac   60

ctgaaacata aaatgaatgc aattgttgtt gttaacttgt ttattgcagc ttataatggt   120

tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct   180

agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg tctgctcgaa gcggccggcc   240

gccccgactc tagaattaca cggcgatctt tccgcccttc ttggccttta tgaggatctc   300

tctgattttt cttgcgtcga gttttccggt aagacctttc ggtacttcgt ccacaaacac   360

aactcctccg cgcaactttt tcgcggttgt tacttgactg gcgacgtaat ccacgatctc   420

tttttccgtc atcgtctttc cgtgctccaa aacaacaacg gcggcgggaa gttcaccggc   480

gtcatcgtcg ggaagacctg cgacacctgc gtcgaagatg ttggggtgtt ggagcaagat   540

ggattccaat tcagcgggag ccacctgata gcctttgtac ttaatcagag acttcaggcg   600

gtcaacgatg aagaagtgtt cgtcttcgtc ccagtaagct atgtctccag aatgtagcca   660

tccatccttg tcaatcaagg cgttggtcgc ttccggattg tttacataac cggacataat   720

cataggacct ctcacacaca gttcgcctct ttgattaacg cccagcgttt tcccggtatc   780

cagatccaca accttcgctt caaaaaatgg aacaacttta ccgaccgcgc ccggtttatc   840

atccccctcg ggtgtaatca gaatagctga tgtagtctca gtgagcccat atccttgcct   900

gatacctggc agatggaacc tcttggcaac cgcttccccg acttccttag agaggggagc   960

gccaccagaa gcaatttcgt gtaaattaga taaatcgtat ttgtcaatca gagtgctttt   1020

ggcgaagaag gagaataggg ttggcaccag cagcgcactt tgaatcttgt aatcctgaag   1080

gctcctcaga aacagctctt cttcaaatct atacattaag acgactcgaa atccacatat   1140

caaatatccg agtgtagtaa acattccaaa accgtgatgg aatggaacaa cacttaaaat   1200

cgcagtatcc ggaatgattt gattgccaaa aataggatct ctggcatgcg agaatctcac   1260

gcaggcagtt ctatgaggca gagcgacacc tttaggcaga ccagtagatc cagaggagtt   1320

catgatcagt gcaattgtct tgtccctatc gaaggactct ggcacaaaat cgtattcatt   1380

aaaaccggga ggtagatgag atgtgacgaa cgtgtacatc gactgaaatc cctggtaatc   1440

cgttttagaa tccatgataa taattttttg gatgattggg agcttttttt gcacgttcaa   1500

aattttttgc aacccctttt tggaaacgaa caccacggta ggctgcgaaa tgcccatact   1560

gttgagcaat tcacgttcat tataaatgtc gttcgcgggc gcaactgcaa ctccgataaa   1620

taacgcgccc aacaccggca taaagaattg aagagagttt tcactgcata cgacgattct   1680

gtgatttgta ttcagcccat atcgtttcat agcttctgcc aaccgaacgg acatttcgaa   1740

gtactcagcg taagtgatgt ccacctcgat atgtgcatct gtaaaagcaa ttgttccagg   1800

aaccagggcg tatctcttca tagccttatg cagttgctct ccagcggttc catcttccag   1860

cggatagaat ggcgccgggc ctttctttat gtttttggcg tcttccatgg tggctttacc   1920

aacagtaccg gaatgccaag cttacttaga tcgcagatct cgagcccggg g            1971

<210>5

<211>1324

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

cgccaccatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga   60

gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc   120

cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg   180

gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca   240

catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac   300

catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga   360

caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct   420

ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca   480

gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca   540

gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga   600

caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca   660

catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta   720

caagatgacc gagtacaagc ccacggtgcg cctcgccacc cgcgacgacg tcccccgggc   780

cgtacgcacc ctcgccgccg cgttcgccga ctaccccgcc acgcgccaca ccgtcgaccc   840

ggaccgccac atcgagcggg tcaccgagct gcaagaactc ttcctcacgc gcgtcgggct   900

cgacatcggc aaggtgtggg tcgcggacga cggcgccgcg gtggcggtct ggaccacgcc   960

ggagagcgtc gaagcggggg cggtgttcgc cgagatcggc ccgcgcatgg ccgagttgag   1020

cggttcccgg ctggccgcgc agcaacagat ggaaggcctc ctggcgccgc accggcccaa   1080

ggagcccgcg tggttcctgg ccaccgtcgg cgtctcgccc gaccaccagg gcaagggtct   1140

gggcagcgcc gtcgtgctcc ccggagtgga ggcggccgag cgcgccgggg tgcccgcctt   1200

cctggagacc tccgcgcccc gcaacctccc cttctacgag cggctcggct tcaccgtcac   1260

cgccgacgtc gagtgcccga aggaccgcgc gacctggtgc atgacccgca agcccggtgc   1320

ctga                                                               1324

<210>6

<211>574

<212>DNA

<213>人工合成

<400>6

ggccaattcc gcccctctcc cccccccccc tctccctccc ccccccctaa cgttactggc   60

cgaagccgct tggaataagg ccggtgtgcg tttgtctata tgtgattttc caccatattg   120

ccgtcttttg gcaatgtgag ggcccggaaa cctggccctg tcttcttgac gagcattcct   180

aggggtcttt cccctctcgc caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt gaaggaagca   240

gttcctctgg aagcttcttg aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg caggcagcgg   300

aaccccccac ctggcgacag gtgcctctgc ggccaaaagc cacgtgtata agatacacct   360

gcaaaggcgg cacaacccca gtgccacgtt gtgagttgga tagttgtgga aagagtcaaa   420

tggctctcct caagcgtatt caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt accccattgt   480

atgggatctg atctggggcc tcggtgcaca tgctttacat gtgtttagtc gaggttaaaa   540

aaacgtctag gccccccgaa ccacggggac gtgg                               574

<210>7

<211>12132

<212>DNA

<213>人工合成

<400>7

caattgcatg aagaatctgc ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc   60

cagatatacg cgttgacatt gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc   120

attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc   180

tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt   240

aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca   300

cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg   360

taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc caaaatgtcg   420

taacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat   480

aagcagagct cgtttaaaca gaggaacctc aaataggcaa gaggcttcta aagaaatgtt   540

tgatccggcc actttccccg gccagaggat aggtgtccgc ccggcccggg agccctttgc   600

ctgagcatcg gtgacagaca tcttggttcc gggactccac cctgagtgtt ctgcacaggt   660

gagagtgtgg aatacaggta ccgggccgaa gttcctattc ttcaaatagt ataggaactt   720

cgggcccccc ctcgaggtcg acggatcctt atcgatgcat caagcttggt accgagctcg   780

gatccactag taacggccgc cagtgtgctg gaattcgccc ttaaacggat cgatagggaa   840

caaaagctgg tggatccccc gggctgcagg aattcgatat agtaatcaat tacggggtca   900

ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct   960

ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta   1020

acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac   1080

ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt   1140

aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag   1200

tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat   1260

gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat   1320

gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc   1380

ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctggt   1440

ttagtgaacc gtcagatccg ctagctcgac aattcaccat gtctagactg gacaagagca   1500

aagtcataaa cggcgctctg gaattactca atggagtcgg tatcgaaggc ctgacgacaa   1560

ggaaactcgc tcaaaagctg ggagttgagc agcctaccct gtactggcac gtgaagaaca   1620

agcgggccct gctcgatgcc ctgccaatcg agatgctgga caggcatcat acccacttct   1680

gccccctgga aggcgagtca tggcaagact ttctgcggaa caacgccaag tcattccgct   1740

gtgctctcct ctcacatcgc gacggggcta aagtgcatct cggcacccgc ccaacagaga   1800

aacagtacga aaccctggaa aatcagctcg cgttcctgtg tcagcaaggc ttctccctgg   1860

agaacgcact gtacgctctg tccgccgtgg gccactttac actgggctgc gtattggagg   1920

aacaggagca tcaagtagca aaagaggaaa gagagacacc taccaccgat tctatgcccc   1980

cacttctgag acaagcaatt gagctgttcg accggcaggg agccgaacct gccttccttt   2040

tcggcctgga actaatcata tgtggcctgg agaaacagct aaagtgcgaa agcggcgggc   2100

cggccgacgc ccttgacgat tttgacttag acatgctccc agccgatgcc cttgacgact   2160

ttgaccttga tatgctgcct gctgacgctc ttgacgattt tgaccttgac atgctccccg   2220

ggtaactaag taaggagagc tcaagcttcg aattctgcag tcgacggtac cgcgggcccg   2280

gcgcccctct ccctcccccc cccctaacgt tactggccga agccgcttgg aataaggccg   2340

gtgtgcgttt gtctatatgt tattttccac catattgccg tcttttggca atgtgagggc   2400

ccggaaacct ggccctgtct tcttgacgag cattcctagg ggtctttccc ctctcgccaa   2460

aggaatgcaa ggtctgttga atgtcgtgaa ggaagcagtt cctctggaag cttcttgaag   2520

acaaacaacg tctgtagcga ccctttgcag gcagcggaac cccccacctg gcgacaggtg   2580

cctctgcggc caaaagccac gtgtataaga tacacctgca aaggcggcac aaccccagtg   2640

ccacgttgtg agttggatag ttgtggaaag agtcaaatgg ctctcctcaa gcgtattcaa   2700

caaggggctg aaggatgccc agaaggtacc ccattgtatg ggatctgatc tggggcctcg   2760

gtgcacatgc tttacatgtg tttagtcgag gttaaaaaaa cgtctaggcc ccccgaacca   2820

cggggacgtg gttttccttt gaaaaacacg atgataatat ggccacaacc atggtgagca   2880

agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac ggcgacgtaa   2940

acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac ggcaagctga   3000

ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc ctcgtgacca   3060

ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag cagcacgact   3120

tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc ttcaaggacg   3180

acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg gtgaaccgca     3240

tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac aagctggagt     3300

acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac ggcatcaagg     3360

tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc gaccactacc     3420

agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac tacctgagca     3480

cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc ctgctggagt     3540

tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtcc ggactcagat     3600

ctaggagacg accttccatg accgagtaca agcccacggt gcgcctcgcc acccgcgacg     3660

acgtcccccg ggccgtacgc accctcgccg ccgcgttcgc cgactacccc gccacgcgcc     3720

acaccgtcga cccggaccgc cacatcgagc gggtcaccga gctgcaagaa ctcttcctca     3780

cgcgcgtcgg gctcgacatc ggcaaggtgt gggtcgcgga cgacggcgcc gcggtggcgg     3840

tctggaccac gccggagagc gtcgaagcgg gggcggtgtt cgccgagatc ggcccgcgca     3900

tggccgagtt gagcggttcc cggctggccg cgcagcaaca gatggaaggc ctcctggcgc     3960

cgcaccggcc caaggagccc gcgtggttcc tggccaccgt cggcgtctcg cccgaccacc     4020

agggcaaggg tctgggcagc gccgtcgtgc tccccggagt ggaggcggcc gagcgcgccg     4080

gggtgcccgc cttcctggag acctccgcgc cccgcaacct ccccttctac gagcggctcg     4140

gcttcaccgt caccgccgac gtcgagtgcc cgaaggaccg cgcgacctgg tgcatgaccc     4200

gcaagcccgg tgcccgggat ccaccggatc tagataactg atcataatca gccataccac     4260

atttgtagag gttttacttg ctttaaaaaa cctcccacac ctccccctga acctgaaaca     4320

taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata     4380

aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgatc     4440

gatccgaata agggcgaatt ctgcagatat ccatcacact ggcggccgct cgagcatgca     4500

tcgattttac cacatttgta gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc     4560

tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata     4620

atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc     4680

attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgc tcgaagcggc     4740

cggccgcccc gactctagaa ttacacggcg atctttccgc ccttcttggc ctttatgagg     4800

atctctctga tttttcttgc gtcgagtttt ccggtaagac ctttcggtac ttcgtccaca     4860

aacacaactc ctccgcgcaa ctttttcgcg gttgttactt gactggcgac gtaatccacg     4920

atctcttttt ccgtcatcgt ctttccgtgc tccaaaacaa caacggcggc gggaagttca     4980

ccggcgtcat cgtcgggaag acctgcgaca cctgcgtcga agatgttggg gtgttggagc     5040

aagatggatt ccaattcagc gggagccacc tgatagcctt tgtacttaat cagagacttc     5100

aggcggtcaa cgatgaagaa gtgttcgtct tcgtcccagt aagctatgtc tccagaatgt     5160

agccatccat ccttgtcaat caaggcgttg gtcgcttccg gattgtttac ataaccggac     5220

ataatcatag gacctctcac acacagttcg cctctttgat taacgcccag cgttttcccg     5280

gtatccagat ccacaacctt cgcttcaaaa aatggaacaa ctttaccgac cgcgcccggt     5340

ttatcatccc cctcgggtgt aatcagaata gctgatgtag tctcagtgag cccatatcct     5400

tgcctgatac ctggcagatg gaacctcttg gcaaccgctt ccccgacttc cttagagagg     5460

ggagcgccac cagaagcaat ttcgtgtaaa ttagataaat cgtatttgtc aatcagagtg     5520

cttttggcga agaaggagaa tagggttggc accagcagcg cactttgaat cttgtaatcc     5580

tgaaggctcc tcagaaacag ctcttcttca aatctataca ttaagacgac tcgaaatcca     5640

catatcaaat atccgagtgt agtaaacatt ccaaaaccgt gatggaatgg aacaacactt     5700

aaaatcgcag tatccggaat gatttgattg ccaaaaatag gatctctggc atgcgagaat     5760

ctcacgcagg cagttctatg aggcagagcg acacctttag gcagaccagt agatccagag     5820

gagttcatga tcagtgcaat tgtcttgtcc ctatcgaagg actctggcac aaaatcgtat     5880

tcattaaaac cgggaggtag atgagatgtg acgaacgtgt acatcgactg aaatccctgg    5940

taatccgttt tagaatccat gataataatt ttttggatga ttgggagctt tttttgcacg    6000

ttcaaaattt tttgcaaccc ctttttggaa acgaacacca cggtaggctg cgaaatgccc    6060

atactgttga gcaattcacg ttcattataa atgtcgttcg cgggcgcaac tgcaactccg    6120

ataaataacg cgcccaacac cggcataaag aattgaagag agttttcact gcatacgacg    6180

attctgtgat ttgtattcag cccatatcgt ttcatagctt ctgccaaccg aacggacatt    6240

tcgaagtact cagcgtaagt gatgtccacc tcgatatgtg catctgtaaa agcaattgtt    6300

ccaggaacca gggcgtatct cttcatagcc ttatgcagtt gctctccagc ggttccatct    6360

tccagcggat agaatggcgc cgggcctttc tttatgtttt tggcgtcttc catggtggct    6420

ttaccaacag taccggaatg ccaagcttac ttagatcgca gatctcgagc ccggggctag    6480

cacgcgtcag ctgactagag gatccccggg taccgagctc gaattcgggg ccgcggaggc    6540

tggatcggtc ccggtgtctt ctatggaggt caaaacagcg tggatggcgt ctccaggcga    6600

tctgacggtt cactaaacga gctctgctta tataggcctc ccaccgtaca cgcctactcg    6660

acccgggtac cgagctcgac tttcactttt ctctatcact gatagggagt ggtaaactcg    6720

actttcactt ttctctatca ctgataggga gtggtaaact cgactttcac ttttctctat    6780

cactgatagg gagtggtaaa ctcgactttc acttttctct atcactgata gggagtggta    6840

aactcgactt tcacttttct ctatcactga tagggagtgg taaactcgac tttcactttt    6900

ctctatcact gatagggagt ggtaaactcg actttcactt ttctctatca ctgataggga    6960

gtggtaaact cgacctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat cgcctggaga    7020

cgccatccac gctgttttga cctccataga agacaccggg accgatccag cctccgcggc    7080

cccgaattcc tgcaatgcat ttattgtaga agaagaactg catcaagctt ggtaccgagc    7140

tcggatccac tagtaacggc cgccagtgtg ctggaattcg cccttatcaa acaagtttgt    7200

acaaaaaagc tgaacgagaa acgtaaaatg atataaatat caatatatta aattagattt    7260

tgcataaaaa acagactaca taatactgta aaacacaaca tatccagtcc tatgggcggc    7320

cgcattaggc accccaggct ttacacttta tgcttccggc tcgtataatg tgtggatttt    7380

gagttaggat ccgtcgagat tttcaggagc taaggaagct aaaatggaga aaaaaatcac     7440

tggatatacc accgttgata tatcccaatg gcatcgtaaa gaacattttg aggcatttca    7500

gtcagttgct caatgtacct ataaccagac cgttcagctg gatattacgg cctttttaaa    7560

gaccgtaaag aaaaataagc acaagtttta tccggccttt attcacattc ttgcccgcct    7620

gatgaatgct catccggaat tccgtatggc aatgaaagac ggtgagctgg tgatatggga     7680

tagtgttcac ccttgttaca ccgttttcca tgagcaaact gaaacgtttt catcgctctg    7740

gagtgaatac cacgacgatt tccggcagtt tctacacata tattcgcaag atgtggcgtg    7800

ttacggtgaa aacctggcct atttccctaa agggtttatt gagaatatgt ttttcgtctc    7860

agccaatccc tgggtgagtt tcaccagttt tgatttaaac gtggccaata tggacaactt    7920

cttcgccccc gttttcacca tgggcaaata ttatacgcaa ggcgacaagg tgctgatgcc    7980

gctggcgatt caggttcatc atgccgtttg tgatggcttc catgtcggca gaatgcttaa    8040

tgaattacaa cagtactgcg atgagtggca ggcggggcgt aatctagagg atccggctta    8100

ctaaaagcca gataacagta tgcgtatttg cgcgctgatt tttgcggtat aagaatatat    8160

actgatatgt atacccgaag tatgtcaaaa agaggtatgc tatgaagcag cgtattacag    8220

tgacagttga cagcgacagc tatcagttgc tcaaggcata tatgatgtca atatctccgg    8280

tctggtaagc acaaccatgc agaatgaagc ccgtcgtctg cgtgccgaac gctggaaagc    8340

ggaaaatcag gaagggatgg ctgaggtcgc ccggtttatt gaaatgaacg gctcttttgc    8400

tgacgagaac aggggctggt gaaatgcagt ttaaggttta cacctataaa agagagagcc    8460

gttatcgtct gtttgtggat gtacagagtg atattattga cacgcccggg cgacggatgg    8520

tgatccccct ggccagtgca cgtctgctgt cagataaagt cccccgtgaa ctttacccgg    8580

tggtgcatat cggggatgaa agctggcgca tgatgaccac cgatatggcc agtgtgccgg     8640

tctccgttat cggggaagaa gtggctgatc tcagccaccg cgaaaatgac atcaaaaacg     8700

ccattaacct gatgttctgg ggaatataaa tgtcaggctc ccttatacac agccagtctg     8760

caggtcgacc atagtgactg gatatgttgt gttttacagt attatgtagt ctgtttttta     8820

tgcaaaatct aatttaatat attgatattt atatcatttt acgtttctcg ttcagctttc     8880

ttgtacaaag tggttcgata agggcgaatt ctgcagatat ccatcacact ggcggccgct     8940

cgagcatgca gtgcattgct tcagactcca cgggctgctg ctggaagacg aaatctggga     9000

gccccggtcc ttcccagctg agatactctt ctccccagcc cccaataaaa gatccagggt     9060

acatgattgc gggaaagccg gtctccatat gcatgcccgg gggatccact agttctagaa     9120

gctcgctgat cagcctcgac tgtgcctcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc     9180

ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg     9240

aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg     9300

acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta     9360

tggcttctga ggcggaaaga accagctggg gctcgaggaa gttcctattc tctagaaagt     9420

ataggaactt cgcggccgct cgcgcactac tcagcgacct ccaacacaca agcagggagc     9480

agatactggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac tgagagtcga ccatagggga     9540

tcgggagatc tcccgatccg tcgacgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa     9600

cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac     9660

cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg     9720

tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc     9780

tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg     9840

atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga     9900

gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc     9960

aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag     10020

aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga     10080

gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg     10140

cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga     10200

atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt     10260

tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact     10320

ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt     10380

ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg     10440

ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta     10500

tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaag     10560

aagttcctat tctctagaaa gtataggaac ttcttaatta acggctagca aatcacaaat     10620

aaatgaaagc ctgtaaaaag aacagctgat ttctcagtga aaacattcaa agccagaaga     10680

accatagaaa tatactccaa atcctaaaag actaagacag ccaaactaag gtaacatatc     10740

caacaaaact agtgagatga ctgaagaaga aggaatattt cccataatat aatttccata     10800

atataaacag cctctaaaat tttgtatgtt caataagtca aatctaaaga agacacaaga     10860

agcattgttt aaacgctagc tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc     10920

ttatcatgtc tgtataccgt cgacctctag ctagagcttg gcgtaatcat ggtcatagct     10980

gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat     11040

aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc     11100

actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg     11160

cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct     11220

gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt     11280

atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc     11340

caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga     11400

gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata     11460

ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac     11520

cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcaat gctcacgctg     11580

taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc     11640

cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag     11700

acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt     11760

aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt     11820

atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg     11880

atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac     11940

gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca     12000

gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac     12060

ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac     12120

ttggtctgac ag                                                         12132

Claims (7)

1、一种四环素严紧调控的真核表达载体，包括启动子，其特征在于，沿启动子方向分布有编码四环素反应表达框抑制子的rtTA2^S-M2和四环素反应表达框，所述的四环素反应表达框包括四环素控制的双向启动子P_tetbi；

所述rtTA2^S-M2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，P_tetbi的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2、如权利要求1所述的四环素严紧调控的真核表达载体，其特征在于，双向启动子P_tetbi的一侧为能够重组入外源性兴趣基因的读码框RFC，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3、如权利要求1或2所述的四环素严紧调控的真核表达载体，其特征在于，双向启动子P_tetbi的另一侧为编码萤光素酶的元件，其核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。

4、如权利要求1所述的四环素严紧调控的真核表达载体，其特征在于，在rtTA2^S-M2元件之后还插入EGFP-Puro序列，EGFP-Puro序列是编码绿色荧光蛋白EGFP和嘌罗霉素抗性蛋白的融合基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

5、如权利要求4所述的四环素严紧调控的真核表达载体，其特征在于，在rtTA2^S-M2元件和EGFP-Puro序列之间还插入核糖体进入位点(IRES)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

6、如权利要求1所述的四环素严紧调控的真核表达载体，其特征在于，所述的四环素严紧调控的真核表达载体是重组质粒pE11-IGR-RFC，在质粒pE11-IGR引入的DNA元件排列如下：hCMV-rtTA2^S-M2-IRES-EGFP-Puro-编码萤光素酶的元件-P_tetbi-RFC，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

7、权利要求6所述的四环素严紧调控的真核表达载体应用于外源性兴趣基因在真核细胞中表达的筛选。

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