CN106929532A - 人工创制玉米雄性不育系与高效的转育方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了人工创制玉米雄性不育系与高效的转育方法。本发明选择利用基因编辑技术对玉米育性基因Ms26进行定点修饰，删除5号外显子，从而改变Ms26基因表达的蛋白功能，创制出雄性不育植株，为玉米杂种优势的利用提供了基础。本发明还采用含有基因编辑转化体的植株作为突变的供体与受体材料进行杂交，通过活体内定向突变可直接突变受体材料中的野生型基因，在BC2代进行自交获得受体背景的玉米雄性不育材料。不仅避免了回交导入的连锁累赘，而且还大大提高了回交转育效率，缩短了育种周期。

Description

人工创制玉米雄性不育系与高效的转育方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及人工创制玉米雄性不育系与高效的转育方法。

背景技术

杂种优势在遗传学上是指杂交子代在生长、成活、繁殖能力或生产性能等方面均优于双亲均值的现象。玉米是杂种优势利用最为成功的作物之一。因此，杂交种制种是种业开发的重要环节。人们可通过人工或机械去雄来保持杂交种的纯度，但这种方法存在着工作量大、成本高、去雄不彻底而影响种子纯度与质量等缺点。雄性不育系的应用可以大大降低种子生产成本、提高种子质量、保护母本等优势，在玉米杂种优势利用过程中具备重要应用价值。以细胞质不育为基础的三系配套法(不育系、保持系、恢复系)的出现大大的提高了杂交种创制的效率，但依然存在着不育系不稳定、恢复系匹配不成功、细胞质专化性小斑病等生产风险。目前，以单隐性基因控制的核不育为基础的两系配套法(不育系、恢复系)可以有效解决了细胞质不育系的问题，提高效率，降低生产风险。

当前已经鉴定出几十种玉米相关的育性基因。以玉米育性核基因Ms26为例，该基因位于1号染色体的短臂上，由5个外显子组成，它的氨基酸序列和细胞色素P450家族中的一个成员CYP704B1-Zm基因高度的同源。细胞色素P450蛋白多数属于长链脂肪酸ω-羟化酶，参与长链脂肪酸的ω-羟化过程，这种酶是花粉粒形成孢外壁的关键酶，缺少这种酶就会造成花粉孢外壁长链脂肪酸合成受阻，从而出现花粉粒孢外壁异常导致植株败育。Heme结合结构域是细胞色素P450蛋白中关键的保守结构域，位于Ms26基因的5号外显子上，其氨基酸序列如图1所示。通过对该基因定向突变，可以创制隐性核基因不育系。

2012年，一种基于细菌利用RNA向导的免疫系统—规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)是继归巢核酸酶(meganuclease)、锌指核酸酶(zinc-fnger nucleases，ZFNs)、类转录激活效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALENs)之后，具有高灵敏度、靶向范围广、设计操作简便等优点的基因编辑技术。CRISPR/Cas9技术原理是通过向导RNA的定点靶向作用，融合Cas9蛋白结合DNA靶点产生双键断裂(double-strand breaks，DSB)，并引入两种修复方式—非同源末端连接修复方式(non-homologous end-joining，NHEJ)和同源重组修复(homology-directed repair，HDR)，从而实现DNA的定向编辑,创制目标基因定点突变。

传统的回交育种过程中，通常通过目标基因回交导入到受体，再通过受体高代回交实现轮回亲本遗传背景回复。在目标基因的回交导入过程中，尤其是在目标基因的两侧往往带入了供体亲本的染色体片段，称之为连锁累赘。要打破这种连锁累赘需要通过在大群体中逐个单株鉴定减数分裂过程中，于目标基因两侧发生双交换而导入目标基因但遗传背景回复高的个体，工作量巨大，成本高，效率低。连锁累赘成为回交育种中重要的限制因素。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何培育玉米雄性不育系及其高效转育的方法。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种培育玉米雄性不育系的方法。

本发明提供的培育玉米雄性不育系的方法包括如下步骤：利用CRISPR/Cas9系统对受体玉米基因组中的育性基因进行编辑，进而使所述育性基因功能丧失，得到玉米雄性不育系。

上述方法中，应用实例中所述育性基因为编码MS26蛋白的基因,并不仅限于该基因；

所述CRISPR/Cas9系统中包括两个sgRNA，分别命名为sgRNA1和sgRNA2；

所述sgRNA1和所述sgRNA2识别的靶序列均为所述受体玉米基因组中编码MS26蛋白的DNA片段。

上述方法中，所述MS26蛋白为a1)或a2)：

a1)氨基酸序列是序列8所示的蛋白质；

a2)将序列8所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的由a1)衍生的蛋白质。

上述方法中，

所述sgRNA1识别的靶序列为序列4所示的DNA分子；

所述sgRNA2识别的靶序列为序列5所示的DNA分子。

上述方法中，所述编辑的方法为将向所述受体玉米中导入玉米基因组编辑的载体；所述玉米基因组编辑的载体含有所述sgRNA1的编码基因、所述sgRNA2的编码基因、RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子、Cas9蛋白表达盒和筛选标记基因。

上述方法中，

所述sgRNA1的编码基因是序列7第7245-7347位所示的DNA分子；

所述sgRNA2的编码基因是序列7第6692-6794位所示的DNA分子；

用于启动所述sgRNA1的编码基因转录的RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子可为启动子ZmU6-2；所述启动子ZmU6-2是下述b1)或b2)或b3)所示的DNA分子：

b1)序列2所示的DNA分子；

b2)与b1)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA分子；

b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的DNA序列杂交，且具有启动子功能的DNA分子；

用于启动所述sgRNA2的编码基因转录的RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子可为启动子ZmU6-6；所述启动子ZmU6-6是下述c1)或c2)或c3)所示的DNA分子：

c1)序列3所示的DNA分子；

c2)与c1)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA分子；

c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的DNA序列杂交，且具有启动子功能的DNA分子。

上述方法中，所述Cas9蛋白表达盒自上游至下游依次包括用于启动Cas9蛋白表达的启动子、Cas9蛋白的编码基因和终止子，所述用于启动Cas9蛋白表达的启动子具体为玉米UBI启动子，所述终止子具体为NOS终止子；

所述Cas9蛋白的编码基因是下述d1)或d2)或d3)所示的DNA分子：

d1)序列7自5’末端起第447-4547位所示的DNA分子；

d2)与d1)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性的DNA分子；

d3)在严格条件下与d1)或d2)限定的DNA序列杂交的DNA分子。

上述方法中，所述筛选标记基因具体为抗草铵膦的bar基因。

上述方法中，所述玉米基因组编辑的载体具体为载体CPB-ZmU6-2：sgRNA1-ZmU6-6：sgRNA2，其核苷酸序列为序列7。其中，序列7自5’末端起第115-367位所示的核苷酸为NOS终止子，第399-446位所示的核苷酸为核定位序列(NLS)，第447-4547位所示的核苷酸序列为Cas9蛋白的编码基因，第4572-4592位所示的核苷酸为核定位信号(SV40NLS)，第4599-4664位所示的核苷酸为3×FLAG标签，第4691-6662位所示的核苷酸序列为玉米UBI启动子，第6692-6794位所示的核苷酸序列为sgRNA2的编码基因(sgRNA2识别的靶序列为序列5)，第6795-7239位所示的核苷酸序列为启动子ZmU6-6，第7245-7347位所示的核苷酸序列为sgRNA1的编码基因(sgRNA1识别的靶序列为序列4)，第7348-7742位所示的核苷酸序列为启动子ZmU6-2，第9377-10006位所示的核苷酸序列为PSV1StaA，第10435-11508位所示的核苷酸序列为PSV1RepA，第12438-13029位所示的核苷酸序列为复制子ori，第14451-15245位所示的核苷酸序列为卡那霉素抗性基因，第15772-15946位所示的核苷酸序列为CaMV poly(A)signal，第15953-16504位所示的核苷酸序列为抗草铵膦的bar基因，第16549-17225位所示的核苷酸序列为CaMV 35s增强型启动子。

上述载体CPB-ZmU6-2：sgRNA1-ZmU6-6：sgRNA2可通过使用农杆菌介导、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。在本发明的一个具体实施例中，上述载体CPB-ZmU6-2：sgRNA1-ZmU6-6：sgRNA2采用农杆菌介导的方法转化受体玉米的愈伤组织，并经过共培养、恢复培养、抗除草剂阳性筛选、诱导胚状体、分化、再分化、生根壮苗和炼苗等步骤，得到转基因阳性植株。

为了解决上述技术问题，本发明又提供了上述玉米基因组编辑的载体。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述玉米基因组编辑的载体的新用途。

本发明提供了上述玉米基因组编辑的载体在培育玉米雄性不育系中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述方法获得的玉米雄性不育系的新用途。

本发明提供了上述方法获得的玉米雄性不育系在玉米育种中的应用。

本发明还提供了上述方法获得的玉米雄性不育系在培育玉米雄性不育系品种中的应用。

本发明还提供了上述方法获得的玉米雄性不育系在提高玉米回交转育效率中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种培育玉米雄性不育系品种的方法。

本发明提供的培育玉米雄性不育系品种的方法包括如下步骤：

(1)按照上述方法获得玉米雄性不育系；

(2)以受体玉米为轮回亲本，对所述玉米雄性不育系进行回交转育，得到玉米雄性不育系品种。

上述所述方法包括如下步骤：

1)以所述玉米雄性不育系为母本，以受体玉米为父本进行杂交，得到F1代；

2)从所述F1代中选取具有雄性不育表型的植株为母本，以所述受体玉米为父本进行杂交，得到BC1代；

3)从所述BC1代中选取具有雄性不育表型的植株为母本，以所述受体玉米为父本进行杂交，得到BC2代；

4)用检测上述筛选标记基因的物质对所述BC2代植株个体进行检测，从所述BC2代中选取没有所述筛选标记基因的植株进行自交，得到自交后代；从所述自交后代中选取具有雄性不育表型的植株个体，即为玉米雄性不育系品种。

上述方法中，所述雄性不育表型具体为小穗紧凑，护颖紧闭。

上述方法中，所述检测上述筛选标记基因的物质具体为Bar试纸条，没有所述筛选标记基因的植株即为没有出现阳性条带的植株。

上述方法或应用中，所述受体玉米具体可为玉米自交系CA335。

本发明的一个优势是基于CRISPR/Cas9基因编辑技术对玉米育性基因进行定点定向突变。本发明应用实例为对Ms26进行定点修饰，并不限于该基因。通过Cas9的靶向编辑作用，将Ms26基因的5号外显子删除，从而改变Ms26基因表达的蛋白功能，影响花粉粒孢外壁的形成，造成败育，创制出雄性不育植株，为玉米杂种优势的利用提供了基础。具体来说是设计双向导RNA介导的CRISPR/Cas9编辑载体，通过农杆菌转化到受体中，表达出Cas9与向导RNA复合体，定向结合到靶位点行使剪切功能，当两个靶位点同时被编辑，5号外显子被敲除，就产生了Ms26删除突变体，进而使Ms26基因失去功能，影响花粉粒孢外壁的发育，获得玉米雄性不育植株。本发明还有一个优势是利用CRISPR/Cas9基因编辑技术快速高效的创制纯合突变体，并且因CRISPR/Cas9基因编辑技术是通过转入基因编辑元件，表达出编辑复合物对靶标基因进行定点修饰，修饰后的靶标基因的遗传背景还是受体亲本，不是通过回交过程中的遗传重组来导入目标基因，携带该编辑元件的单株与受体杂交后，在孢子体与配子体水平，均能活体中诱导受体目标基因定向突变，成为隐性核不育基因。因此，不会传统隐性目标基因回交过程中遗传连锁累赘。而转入的基因编辑元件也可以通过杂交过程中的分离转移到其它受体材料中，即可分离出不含该元件的育种材料或亲本，因此，在BC2代自交即可得到高背景回复、受体转变成雄性不育的亲本，相比传统育种大大缩短了转育周期、避免了连锁累赘。

本发明提供了一种人工高效创制玉米雄性不育的方法。该方法基于双向导RNA引导的CRISPR/Cas9系统，在第四内含子和3，UTR位置上选择两个合适的靶位点，构建转化载体，利用高效的基因编辑定点定向基因敲除的方法高效的删除了该基因的其中一个外显子区域，定向突变了玉米育性基因Ms26，并通过测序筛选出纯合突变体即为雄性不育突变体。由于玉米育性基因Ms26的突变导致该基因蛋白质翻译不出完整功能蛋白行使生物学功能，花粉粒孢外壁发育异常，从而获得核基因隐性突变体，即雄性不育株系，达到完全不育。本发明还采用含有基因编辑转化体的植株作为突变的供体与受体进行杂交，通过活体内定向突变可直接突变受体野生型基因，从而避免回交导入的连锁累赘，大大提高了回交转育效率。本发明采用生物技术方法，获得非转基因雄性不育株系，可以应用于玉米杂交种母本转育成隐性核不育系以应用于种业生产。

附图说明

图1为Ms26基因5号外显子氨基酸序列。

图2为基因编辑遗传转化载体图谱。

图3为T0代转基因阳性植株PCR鉴定电泳图。

图4为T0代转基因植株删除突变类型PCR鉴定电泳图。

图5为TO代删除突变株测序结果。

图6为ms26/ms26基因型植株T0-10表型鉴定。

图7为基因编辑创制的玉米雄性不育系高效的转育方案。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的pEASY-Blunt Cloning Kit、Trans5α化学感受态细胞、PEASY-blunt simple vector和Trans T1感受态细胞均为北京全式金生物技术有限公司的产品。

下述实施例中的玉米自交系CA335在文献“Chuanxiao Xie,Shihuang Zhang_,Minshun Li,Xinhai Li,Zhuanfang Hao,Li Bai,Degui Zhang,Yehong Liang.InferringGenome Ancestry and Estimating Molecular Relatedness Among 187Chinese MaizeInbred Lines.Journal of Genetics and Genomics(Formerly Acta Genetica Sinica).2007,34(8):738-748”中公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所(即申请人)获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、基因编辑遗传转化载体的构建

一、RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子ZmU6-2和ZmU6-6的克隆

1、启动子ZmU6-2和ZmU6-6的扩增引物的设计

启动子ZmU6-2扩增引物序列如下：

ZmU6-2-F：5’-AATTGGCCCTTACAAAATAG-3’；

ZmU6-2-R：5’-GGAGCGGTGGTCGCAGCTGA-3’；

启动子ZmU6-6扩增引物序列如下：

ZmU6-6-F：5’-AACCTCGCTTGTATAGTTCC-3’；

ZmU6-6-R：5’-AATTCGGTGCTTGCGGCTCG-3’。

2、PCR扩增

提取玉米自交系郑58的基因组DNA，以玉米自交系郑58的基因组DNA为模板，分别采用步骤1中设计的启动子ZmU6-2和ZmU6-6的扩增引物进行PCR扩增，分别得到ZmU6-2和ZmU6-6。PCR扩增体系如表1所示。PCR扩增程序如下：94℃2min；94℃15s，55℃30s，68℃30s，35个循环；68℃10min。

表1、PCR反应体系

PCR扩增产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒(Axygen，AP-GX-250)回收，将回收的产物连接亚克隆载体-Blunt Simple Cloning Kit(全式金，CB111-01),转入Trans1-T1Phage Resistant Chemically Competent Cell(全式金，CD501-01)进行转化，挑取单克隆摇菌进行测序。

测序结果表明：启动子ZmU6-2的核苷酸序列为序列2，启动子ZmU6-6的核苷酸序列为序列3。

二、载体CPB-ZmU6-2：sgRNA1-ZmU6-6：sgRNA2的构建

1、片段ZmU6-2、sgRNA1、ZmU6-6、sgRNA2的扩增

(1)以步骤一的2中的ZmU6-2为模板，采用ZmU6-2-F1和ZmU6-2-R1引物进行PCR扩增，得到片段ZmU6-2；引物序列如下：

ZmU6-2-F1：5’-CGACGGCCAGTGCCAAGCTAATTGGCCCTTACAAAATAGCTAG-3’；

ZmU6-2-R1：5’-CGATGCAACGCATATGTGGCGGAGCGGTGGTCGCAGCTGAAC-3’。

(2)以步骤一的2中的ZmU6-6为模板，采用ZmU6-6-F1和ZmU6-6-R1引物进行PCR扩增，得到片段ZmU6-6；引物序列如下：

ZmU6-6-F1：5’-GTCGGTGCTTTTTTTAAGCTAACCTCGCTTGTATAGTTCCTTG-3’；

ZmU6-6-R1：5’-CTTAATCCACGACAAATAACAATTCGGTGCTTGCGGCTCGG-3’。

(3)以sgRNA(sgRNA的序列为序列6)为模板，采用sgRNA1-F和sgRNA-R为模板进行PCR扩增，得到片段sgRNA1，引物序列如下：

sgRNA1-F：5’-GCCACATATGCGTTGCATCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3’；

sgRNA-R：5’-CACGCTGCACTGCACAAGCTTAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCC-3’。

(4)以sgRNA(sgRNA的序列为序列6)为模板，采用sgRNA2-F和sgRNA-R为模板进行PCR扩增，得到片段sgRNA2，引物序列如下：

sgRNA2-F：5’-GTTATTTGTCGTGGATTAAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3’；

sgRNA-R：5’-CACGCTGCACTGCACAAGCTTAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCC-3’。

2、重叠PCR

(1)以步骤1获得的ZmU6-2和sgRNA1为模板，采用ZmU6-2-F1和sgRNA-R引物进行PCR扩增，得到重叠PCR产物ZmU6-2：sgRNA1。

(2)以步骤1获得的ZmU6-6、sgRNA2为模板，采用ZmU6-6-F1和sgRNA-R引物进行PCR扩增，得到重叠PCR产物ZmU6-6：sgRNA2。

上述重叠PCR反应体系均如表2所示。

表2、重叠PCR反应体系

3、用HindⅢ限制性内切酶37℃酶切CPB载体3小时，得到CPB线性化大片段；将重叠PCR产物ZmU6-2：sgRNA1与CPB线性化大片段用重组酶(全式金，CU101-01)进行重组，50℃重组15min，然后转化测序，将正确的测序载体用HindⅢ限制性内切酶酶切，以同样的方法连接ZmU6-6：sgRNA2，并测序，将正确的测序载体命名为CPB-ZmU6-2：sgRNA1-ZmU6-6：sgRNA2(载体图谱如图2所示)。

载体CPB-ZmU6-2：sgRNA1-ZmU6-6：sgRNA2的核苷酸序列如序列7所示。其中，序列7自5’末端起第115-367位所示的核苷酸为NOS终止子，第399-446位所示的核苷酸为核定位序列(NLS)，第447-4547位所示的核苷酸序列为Cas9蛋白的编码基因，第4572-4592位所示的核苷酸为核定位信号(SV40NLS)，第4599-4664位所示的核苷酸为3×FLAG标签，第4691-6662位所示的核苷酸序列为玉米UBI启动子，第6692-6794位所示的核苷酸序列为sgRNA2的编码基因(sgRNA2识别的靶序列为序列5)，第6795-7239位所示的核苷酸序列为启动子ZmU6-6，第7245-7347位所示的核苷酸序列为sgRNA1的编码基因(sgRNA1识别的靶序列为序列4)，第7348-7742位所示的核苷酸序列为启动子ZmU6-2，第9377-10006位所示的核苷酸序列为PSV1StaA，第10435-11508位所示的核苷酸序列为PSV1RepA，第12438-13029位所示的核苷酸序列为复制子ori，第14451-15245位所示的核苷酸序列为卡那霉素抗性基因，第15772-15946位所示的核苷酸序列为CaMV poly(A)signal，第15953-16504位所示的核苷酸序列为抗草铵膦的bar基因，第16549-17225位所示的核苷酸序列为CaMV 35s增强型启动子。

实施例2、Ms26雄性不育植株的获得及鉴定

一、Ms26雄性不育植株的获得

1、农杆菌的制备

将实施例1制备的载体CPB-ZmU6-2：sgRNA1-ZmU6-6：sgRNA2转化农杆菌BMGV3301(北京博迈德基因技术有限公司，CC3201)，得到重组菌。挑取重组菌克隆接种于300μl无抗性YEP液体培养基(牛肉膏10g、酵母膏10g、NaCl 5g溶于1L蒸馏水)，220rpm振荡培养4h，然后接种于含卡那霉素抗性基因的YEP固体平板上，28℃培养48h，挑取单克隆进行鉴定，将经鉴定正确的农杆菌-80℃保存，待用于下述农杆菌转化实验。

2、农杆菌介导的玉米遗传转化

(1)受体材料的处理

将玉米自交系CA335种子浸泡水中37℃4h，在28℃平皿中萌发48h，将发芽后的种子置于装营养土的盆中培养，待授粉后10天，选取幼胚做为诱导愈伤组织材料。在操作台中将幼穗用75％(体积分数)乙醇消毒10min，无菌水冲洗干净后，晾干。用手术刀切掉籽粒一半，然后用镊子将胚分离出来，放置无菌水中待用。

(2)愈伤组织诱导和继代培养

将幼胚放置N6培养基(BINDER，AA958)，28℃暗培养一周，将生长旺盛，颜色鲜艳的愈伤组织切成小块，放置在N6培养基上继续培养，每两周继代一次，保持愈伤组织的良好状态，并选取长势良好的愈伤组织，待用。

(3)农杆菌侵染

取出步骤1中保存的农杆菌，接种摇菌，待OD₆₀₀值为0.8左右，5000r/min离心10min，收集菌体，用侵染buffer(1L侵染buffer是将4g含N6 vitamin的N6 Salts，2mg 2,4-D，100mg肌醇，0.7g L-脯氨酸，68.4g蔗糖，36g葡萄糖，1mL AgNO₃(10mg/mL)，1mL As(100mol/L)和水混匀得到的，PH5.2)悬浮菌体，使OD₆₀₀值为0.5左右，然后28℃，150r/min振荡0.5h，得到侵染液。将(2)中选取的长势良好的愈伤组织浸泡侵染buffer中1h，然后转移至含农杆菌的侵染液浸泡15min，晾干，得到侵染后的愈伤组织。

(4)共培养、恢复培养

将侵染后的愈伤组织放至共培养基(1L共培养基是将4g含N6 vitamin的N6Salts，2mg 2,4-D，30g蔗糖，8g琼脂，1mL AgNO₃(10mg/mL)，1mL As(100mol/L)，3mL L-半胱氨酸(100mg/mL)和水混匀得到的，PH5.8)，20℃培养3天，转至恢复培养基(1L恢复培养基是将4g含N6 vitamin的N6 Salts，2mg 2,4-D，0.7g L-脯氨酸，30g蔗糖，0.5g MES，4g植物凝胶，1mL AgNO₃(10mg/mL)，1mL头孢霉素(250mg/mL)和水混匀得到的，PH5.8)培养10天，然后转至加入草铵膦的恢复培养基筛选阳性愈伤组织。

(5)分化、再分化、生根、炼苗

将上述阳性愈伤组织转至诱导胚状体培养基(1L诱导胚状体培养基是将4.43g含MS vitamin的MS Salts(含肌醇)，0.25mg 2,4-D，30g蔗糖，5mg 6-BA，4g植物凝胶，1mLCefo(250mg/mL)和水混匀得到的，PH5.8)，暗培养2周，然后转至分化培养基(1L分化培养基是将4.43g含MS vitamin的MS Salts(含肌醇)，30g蔗糖，4g植物凝胶，1mL Cefo(250mg/mL)和水混匀得到的，PH5.8)，待长出绿苗后转移至生根培养基(1L生根培养基是将2.215g 1/2MS，30g蔗糖，51.55mg MS vitamin，4g植物凝胶和水混匀得到的，PH5.8)生根，长到一定高度，暴露在空气中培养3天，移苗。

(6)Bar试纸条筛选阳性植株

取植株叶片3厘米左右，放入管中研磨充分，加入500μl的buffer，插入Bar试纸条(上海佑隆生物科技有限公司，目录号：EnviroLogix AS03)，出现阳性条带的植株即为T0代阳性转基因植株。

二、转基因植株的基因型鉴定及表型验证

1、转基因植株的基因型鉴定

(1)植物基因组提取

提取步骤一获得的T0代阳性转基因植株的基因组DNA。具体步骤如下：取步骤一获得的T0代阳性转基因植株新鲜叶片放入干净研钵中，加入液氮研磨至粉末状，移至2mL离心管中，加入800μl 65℃预热的CTAB缓冲液(500mLCTAB缓冲液是将50mL 1M Tris-7.5，70mL5M NaCl、50mL 0.5M EDTA(PH8.0)、5.0g CTAB、5.0mL 14Mβ-巯基乙醇与ddH₂O混匀得到的，CTAB提取液现用现配，β-巯基乙醇最后于通风橱下加入)，迅速颠倒混匀，65℃水浴40min，冷却室温，加入800μl氯仿：异戊醇(24:1)，混匀后12000rpm离心10min，转移上清至新管，加入5μl RNase，37℃水浴1h，加入氯仿：异戊醇(24:1)再抽提一遍，离心转移上清至新管，加入0.7倍体积预冷异丙醇，混匀置于-20℃静置30min，离心去上清，用70％(体积分数)乙醇洗涤两次，置于超净台中晾干，加入50μlddH₂O溶解DNA。

(2)转基因植株基因型鉴定

1)以18株T0代阳性转基因植株的基因组DNA为模板，采用引物Bar-F(5’-CCATCGTCAACCACTACATCG-3’)和Bar-R(5’-AGCTGCCAGAAACCCACGT-3’)对T0代转基因阳性植株进行PCR扩增，分别得到PCR扩增产物，然后将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。PCR扩增产物的电泳结果如图3所示。

结果表明：18株T0代阳性转基因植株的PCR扩增产物均得到大小为430bp的目的条带，而野生型玉米植株CA335(WT)中没有扩增得到目的条带。

2)以18株T0代阳性转基因植株的基因组DNA为模板，采用引物Deletion-F(5’-CCTCCTCACCTACGACAGCCTC-3’)和Deletion-R(5’-CCAAGCCACCAATGAAACCC-3’)进行PCR扩增，分别得到PCR扩增产物，然后将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，PCR扩增产物的电泳结果如图4所示。并统计突变率，突变率＝发生删除植株数/总植株数。

结果表明：野生型玉米植株CA335(WT)PCR扩增得到大小为711bp的条带，从T0-1到T0-18的18株T0代阳性转基因植株中，T0-2、T0-9、T0-13和T0-17PCR扩增均得到大小为711bp和207bp的条带，均为杂合突变型；而T0-10PCR扩增仅得到大小为207bp的条带，为纯合突变型，并将该植株命名为Ms26雄性不育植株(ms26/ms26)。杂合突变型是指该T0代阳性转基因植株的两条同源染色体中的一条同源染色体的Ms26基因发生了突变、另一条同源染色体的Ms26基因未发生突变；纯合突变型是指该T0代阳性转基因植株的两条同源染色体的Ms26基因发生了相同的突变。突变率为27.8％(5/18)。

将T0-2、T0-9、T0-13、T0-10和T0-17的扩增产物用琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒回收进行桑格测序。T0-10测序结果如图5所示，红色箭头为裂解位点。测序结果表明：T0代阳性转基因植株T0-10(Ms26雄性不育植株)产生了精确删除，其为将野生型玉米植株CA335的两条同源染色体的Ms26基因第1559-2062位删除，且保持野生型玉米植株CA335的基因组其他序列不变后得到的植株。Ms26基因的核苷酸序列为序列1，Ms26基因编码的Ms26蛋白的氨基酸序列为序列8。

2、Ms26雄性不育植株表型验证

步骤1获得的Ms26雄性不育植株(ms26/ms26)突变了玉米育性基因Ms26，由于Ms26基因与花粉粒孢外壁的形成相关，玉米育性基因Ms26的突变导致无法表达出完整功能蛋白Ms26，因此Ms26雄性不育植株(ms26/ms26)不会产生正常的花粉。

对Ms26雄性不育植株(ms26/ms26)的表型进行观察，结果如图6所示。从图中可以看出：Ms26雄性不育植株(ms26/ms26)表现为雄穗主轴和侧枝上小穗紧凑，护颖紧闭，无正常花粉形成，花粉粒孢外壁发育异常。说明本发明成功获得了雄性不育株系——Ms26雄性不育植株(ms26/ms26)。

实施例3、玉米雄性不育系的高效转育方法

对玉米雄性不育系进行其他材料的转育，转育流程如图7所示，具体转育步骤如下：

1、以CA335-ms26(实施例2获得的Ms26雄性不育植株(ms26/ms26))为母本(基因型为Cas9/Cas9：ms26/ms26)，以受体材料玉米自交系CA335为父本(基因型为-/-：MS26/MS26)进行杂交，得到F1代。

2、通过对F1代进行表型观察，选取小穗紧凑、护颖紧闭的雄性不育植株(基因型为Cas9/-：ms26/ms26)为母本，受体材料玉米自交系CA335为父本(基因型为-/-：MS26/MS26)进行杂交，得到BC1代。

3、通过对BC1代进行表型观察，选取小穗紧凑，护颖紧闭为雄性不育植株(基因型为Cas9/-：ms26/ms26)为母本，受体材料玉米自交系CA335为父本(-/-：MS26/MS26)进行杂交，得到BC2代。

4、通过对BC2代植株进行Bar试纸条检测，舍弃出现阳性条带的含转基因成分的植株(基因型为Cas9/-：-/-)，选取没有出现条带的不含转基因成分的植株(基因型为-/-：MS26/ms26)。

5、将步骤4获得的没有出现条带的不含转基因成分的植株(基因型为-/-：MS26/ms26)进行自交，通过对自交后代的进行表型筛选，选取小穗紧凑，护颖紧闭的植株(基因型为-/-：ms26/ms26)，即为玉米不育系品种。

序列表

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>人工创制玉米雄性不育系与高效的转育方法

<160>8

<210>1

<211>2266bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

atggaggaag ctcacctcac gccggcgacg ccatcgccat tcttcccact agcagggcct 60

cacaagtaca tcgcgctcct tctggttgtc ctctcatgga tcctggtcca gaggtggagc 120

ctgaggaagc agaaaggccc gagatcatgg ccagtcatcg gcgcaacggt ggagcagctg 180

aggaactacc accggatgca cgactggctt gtcgggtacc tgtcacggca caggacagtg 240

accgtcgaca tgccgttcac ttcctacacc tacatcgctg acccggtgaa tgtcgagcat 300

gtcctcaaga ctaacttcac caattacccc aaggtaaatg acctgaactc actgatgttc 360

agtcttcgga aatcagagct gaaagctgaa tcgaatgtgc ctgaacaccg tgtagggaat 420

cgtgtacaga tcctacatgg acgtgctcct cggtgacggc atcttcaacg ccgacggcga 480

gctgtggagg aagcagagga agacggcgag tttcgagttc gcctccaaga acctgaggga 540

tttcagcgcc attgtgttca gagagtactc cctgaagctg tcgggtatac tgagccaggc 600

atccaaggca ggcaaagttg tggacatgca ggtgagatat cactggtccc ttgccattgc 660

caacatgagc atttcaacct gagacacgag agctaccttg ccgattcagg aactttacat 720

gaggatgacg ctggactcca tctgcaaggt tgggttcggg gtcgagatcg gcacgctgtc 780

gccagatctc cccgagaaca gcttcgcgca ggcgttcgat gccgccaaca tcatcatcac 840

gctgcggttc atcgacccgc tgtggcgcat caagaggttc ttccacgtcg ggtcagaggc 900

cctcctagcg cagagcatca agctcgtgga cgagttcacc tacagcgtga tccgccggag 960

gaaggccgag atcgtcgagg tccgggccag cggcaaacag gagaaggtac gtgcacatga 1020

ctgtttcgat tcttcagttc atcgtcttgg ccgggatgga cctgatcctg attgattata 1080

tatccatgtg acttgtgagg gcaaattaaa atgggcagat gaagcacgac atcctgtcac 1140

ggttcatcga gctgggcgag gccggcgacg acggcggcgg cttcggggac gataagagcc 1200

tccgggacgt ggtgctcaac ttcgtgatcg ccgggcggga cacgacggcg acgacgctgt 1260

cgtggttcac gcacatggcc atgtcccacc cggacgtggc cgagaagctg cgccgcgagc 1320

tgtgcgcgtt cgaggcggag cgcgcgcgcg aggagggcgt cacgctcgtg ctctgcggcg 1380

gcgctgacgc cgacgacaag gcgttcgccg cccgcgtggc gcagttcgcg ggcctcctca 1440

cctacgacag cctcggcaag ctggtctacc tccacgcctg cgtcaccgag acgctccgcc 1500

tgtaccccgc cgtccctcag gtgagcgcgc ccgtcacgtc acgacctccg gtccgcgatg 1560

caacgcatat gtggctgtcc gcagagcaca gcatgcagtg agtggacctg aatgcaatgc 1620

acatgcactt gcgcgcgcgc aggaccccaa ggggatcctg gaggacgacg tgctgccgga 1680

cgggacgaag gtgagggccg gcgggatggt gacgtacgtg ccctactcga tggggcggat 1740

ggagtacaac tggggccccg acgcggcgag cttccggccg gagcggtgga tcaacgagga 1800

tggcgcgttc cgcaacgcgt cgccgttcaa gttcacggcg ttccaggcgg ggccgaggat 1860

ctgcctgggc aaggactcgg cgtacctgca gatgaagatg gcgctggcca tcctcttccg 1920

cttctacagc ttccggctgc tggaggggca cccggtgcag taccgcatga tgaccatcct 1980

ctccatggcg cacggcctca aggtccgcgt ctctagggcc gtctgatgtc atggcgattt 2040

ggatatggat atcgtcccgc ttaatccacg acaaataacg ctcgtgttac aaatttgcat 2100

gcatgcatgt aagggaaagc gatgggtttc attggtggct tggcttaagc cttaaaaact 2160

ccgtcgggtc ttgcgaacca ccacatcact agtgttttgt actctactcc tcagtggaag 2220

tgtagtgaca gcatacaagt tcatcatata tattatcctc tttctt 2266

<210>2

<211>395bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

aattggccct tacaaaatag ctagacgtgc aggtggctgg atgtgcgctc cctgaatatc 60

aacttgtgtc tcctccgatt cagtccgcag atgaaacttg gtaataactg cagctgatcc 120

gtcgtcattc atgctatgca ggggattcga tcttcagcat gtgcagtgca ggcaacaaca 180

atctacgttg tctgggcttg cgataggtac acgaccacga gggaaggcaa cgcgtgatgt 240

atgggccgcg cctaagcatc cagcccacgc gggcgtgcgc gtcgtcgcta cggcttgcgg 300

gggaagggat caagggacga accgagaact agtaccagac cggccagcga gcattgcaga 360

caccggctta taagttcagc tgcgaccacc gctcc 395

<210>3

<211>444bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

aacctcgctt gtatagttcc ttgtgctcta acacacgatg atgataagtc gtaaaatagt 60

ggtgtccaaa gaatttccag gcccagttgt aaaagctaaa atgctattcg aatttctact 120

agcagtaagt cgtgtttaga aattattttt ttatatacct tttttccttc tatgtacagt 180

aggacacagt gtcagcgccg cgttgacgga gaatatttgc aaaaaagtaa aagagaaagt 240

catagcggcg tatgtgccaa aaacttcgtc acagagaggg ccataagaaa catggcccac 300

ggcccaatac gaagcaccgc gacgaagccc aaacagcagt ccgtaggtgg agcaaagcgc 360

tgggtaatac gcaaacgttt tgtcccacct tgactaatca caagagtgga gcgtacctta 420

taaaccgagc cgcaagcacc gaat 444

<210>4

<211>23bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

gccacatatg cgttgcatcg cgg 23

<210>5

<211>23bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

gttatttgtc gtggattaag cgg 23

<210>6

<211>83bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60

ggcaccgagt cggtgctttt ttt 83

<210>7

<211>17432bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

ctcattaggc accccaggct ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg 60

tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gctatgacat gattacgaat tcccgatcta 120

gtaacataga tgacaccgcg cgcgataatt tatcctagtt tgcgcgctat attttgtttt 180

ctatcgcgta ttaaatgtat aattgcggga ctctaatcat aaaaacccat ctcataaata 240

acgtcatgca ttacatgtta attattacat gcttaacgta attcaacaga aattatatga 300

taatcatcgc aagaccggca acaggattca atcttaagaa actttattgc caaatgtttg 360

aacgatcggg gaaattcgag ctcggtaccg agctcttact ttttcttttt tgcctggccg 420

gcctttttcg tggccgccgg ccttttgtcg cctcccagct gagacaggtc gatccgtgtc 480

tcgtacaggc cggtgatgct ctggtggatc agggtggcgt ccagcacctc tttggtgctg 540

gtgtacctct tccggtcgat ggtggtgtca aagtacttga aggcggcagg ggctcccaga 600

ttggtcaggg taaacaggtg gatgatattc tcggcctgct ctctgatggg cttatcccgg 660

tgcttgttgt aggcggacag cactttgtcc agattagcgt cggccaggat cactctcttg 720

gagaactcgc tgatctgctc gatgatctcg tccaggtagt gcttgtgctg ttccacaaac 780

agctgtttct gctcattatc ctcgggggag cccttcagct tctcatagtg gctggccagg 840

tacaggaagt tcacatattt ggagggcagg gccagttcgt ttcccttctg cagttcgccg 900

gcagaggcca gcattctctt ccggccgttt tccagctcga acagggagta cttaggcagc 960

ttgatgatca ggtccttttt cacttctttg tagcccttgg cttccagaaa gtcgatggga 1020

ttcttctcga agctgcttct ttccatgatg gtgatcccca gcagctcttt cacactcttc 1080

agtttcttgg acttgccctt ttccactttg gccaccacca gcacagaata ggccacggtg 1140

gggctgtcga agccgccgta cttcttaggg tcccagtcct tctttctggc gatcagctta 1200

tcgctgttcc tcttgggcag gatagactct ttgctgaagc cgcctgtctg cacctcggtc 1260

tttttcacga tattcacttg gggcatgctc agcactttcc gcacggtggc aaaatcccgg 1320

cccttatccc acacgatctc cccggtttcg ccgtttgtct cgatcagagg ccgcttccgg 1380

atctcgccgt tggccagggt aatctcggtc ttgaaaaagt tcatgatgtt gctgtagaag 1440

aagtacttgg cggtagcctt gccgatttcc tgctcgctct tggcgatcat cttccgcacg 1500

tcgtacacct tgtagtcgcc gtacacgaac tcgctttcca gcttagggta ctttttgatc 1560

agggcggttc ccacgacggc gttcaggtag gcgtcgtggg cgtggtggta gttgttgatc 1620

tcgcgcactt tgtaaaactg gaaatccttc cggaaatcgg acaccagctt ggacttcagg 1680

gtgatcactt tcacttcccg gatcagcttg tcattctcgt cgtacttagt gttcatccgg 1740

gagtccagga tctgtgccac gtgctttgtg atctgccggg tttccaccag ctgtctcttg 1800

atgaagccgg ccttatccag ttcgctcagg ccgcctctct cggccttggt cagattgtcg 1860

aactttctct gggtaatcag cttggcgttc agcagctgcc gccagtagtt cttcatcttc 1920

ttcacgacct cttcggaggg cacgttgtcg ctcttgcccc ggttcttgtc gcttctggtc 1980

agcaccttgt tgtcgatgga gtcgtccttc agaaagctct gaggcacgat atggtccaca 2040

tcgtagtcgg acagccggtt gatgtccagt tcctggtcca cgtacatatc ccgcccattc 2100

tgcaggtagt acaggtacag cttctcgttc tgcagctggg tgttttccac ggggtgttct 2160

ttcaggatct ggctgcccag ctctttgatg ccctcttcga tccgcttcat tctctcgcgg 2220

ctgttcttct gtcccttctg ggtggtctgg ttctctctgg ccatttcgat cacgatgttc 2280

tcgggcttgt gccggcccat cactttcacg agctcgtcca ccaccttcac tgtctgcagg 2340

atgcccttct taatggcggg gctgccggcc agattggcaa tgtgctcgtg caggctatcg 2400

ccctggccgg acacctgggc tttctggatg tcctctttaa aggtcaggct gtcgtcgtgg 2460

atcagctgca tgaagtttct gttggcgaag ccgtcggact tcaggaaatc caggattgtc 2520

ttgccggact gcttgtcccg gatgccgttg atcagcttcc ggctcagcct gccccagccg 2580

gtgtatctcc gccgcttcag ctgcttcatc actttgtcgt cgaacaggtg ggcataggtt 2640

ttcagccgtt cctcgatcat ctctctgtcc tcaaacagtg tcagggtcag cacgatatct 2700

tccagaatgt cctcgttttc ctcattgtcc aggaagtcct tgtccttgat aattttcagc 2760

agatcgtggt atgtgcccag ggaggcgttg aaccgatctt ccacgccgga gatttccacg 2820

gagtcgaagc actcgatttt cttgaagtag tcctctttca gctgcttcac ggtcactttc 2880

cggttggtct tgaacagcag gtccacgatg gcctttttct gctcgccgct caggaaggcg 2940

ggctttctca ttccctcggt cacgtatttc actttggtca gctcgttata cacggtgaag 3000

tactcgtaca gcaggctgtg cttgggcagc accttctcgt tgggcaggtt cttatcgaag 3060

ttggtcatcc gctcgatgaa gctctgggcg gaagcgccct tgtccaccac ttcctcgaag 3120

ttccaggggg tgatggtttc ctcgctcttt ctggtcatcc aggcgaatct gctgtttccc 3180

ctggccagag ggcccacgta gtaggggatg cggaaggtca ggatcttctc gatcttttcc 3240

cggttgtcct tcaggaatgg gtaaaaatct tcctgccgcc gcagaatggc gtgcagctct 3300

cccaggtgga tctggtgggg gatgctgccg ttgtcgaagg tccgctgctt ccgcagcagg 3360

tcctctctgt tcagcttcac gagcagttcc tcggtgccgt ccatcttttc caggatgggc 3420

ttgatgaact tgtagaactc ttcctggctg gctccgccgt caatgtagcc ggcgtagccg 3480

ttcttgctct ggtcgaagaa aatctctttg tacttctcag gcagctgctg ccgcacgaga 3540

gctttcagca gggtcaggtc ctggtggtgc tcgtcgtatc tcttgatcat agaggcgctc 3600

aggggggcct tggtgatctc ggtgttcact ctcaggatgt cgctcagcag gatggcgtcg 3660

gacaggttct tggcggccag aaacaggtcg gcgtactggt cgccgatctg ggccagcagg 3720

ttgtccaggt cgtcgtcgta ggtgtccttg ctcagctgca gtttggcatc ctcggccagg 3780

tcgaagttgc tcttgaagtt gggggtcagg cccaggctca gggcaatcag gtttccgaac 3840

aggccattct tcttctcgcc gggcagctgg gcgatcagat tttccagccg tctgctcttg 3900

ctcagtctgg cagacaggat ggccttggcg tccacgccgc tggcgttgat ggggttttcc 3960

tcgaacagct ggttgtaggt ctgcaccagc tggatgaaca gcttgtccac gtcgctgttg 4020

tcggggttca ggtcgccctc gatcaggaag tggccccgga acttgatcat gtgggccagg 4080

gccagataga tcagccgcag gtcggccttg tcggtgctgt ccaccagttt ctttctcagg 4140

tggtagatgg tggggtactt ctcgtggtag gccacctcgt ccacgatgtt gccgaagatg 4200

gggtgccgct cgtgcttctt atcctcttcc accaggaagg actcttccag tctgtggaag 4260

aagctgtcgt ccaccttggc catctcgttg ctgaagatct cttgcagata gcagatccgg 4320

ttcttccgtc tggtgtatct tcttctggcg gttctcttca gccgggtggc ctcggctgtt 4380

tcgccgctgt cgaacagcag ggctccgatc aggttcttct tgatgctgtg ccggtcggtg 4440

ttgcccagca ccttgaattt cttgctgggc accttgtact cgtcggtgat cacggcccag 4500

cccacagagt tggtgccgat gtccaggccg atgctgtact tcttgtcggc tgctgggact 4560

ccgtggatac cgaccttccg cttcttcttt ggggccatct tatcgtcatc gtctttgtaa 4620

tcaatatcat gatccttgta gtctccgtcg tggtccttat agtccatcgg ggatcctcta 4680

gagtcgacct gcagaagtaa caccaaacaa cagggtgagc atcgacaaaa gaaacagtac 4740

caagcaaata aatagcgtat gaaggcaggg ctaaaaaaat ccacatatag ctgctgcata 4800

tgccatcatc caagtatatc aagatcaaaa taattataaa acatacttgt ttattataat 4860

agataggtac tcaaggttag agcatatgaa tagatgctgc atatgccatc atgtatatgc 4920

atcagtaaaa cccacatcaa catgtatacc tatcctagat cgatatttcc atccatctta 4980

aactcgtaac tatgaagatg tatgacacac acatacagtt ccaaaattaa taaatacacc 5040

aggtagtttg aaacagtatt ctactccgat ctagaacgaa tgaacgaccg cccaaccaca 5100

ccacatcatc acaaccaagc gaacaaaaag catctctgta tatgcatcag taaaacccgc 5160

atcaacatgt atacctatcc tagatcgata tttccatcca tcatcttcaa ttcgtaacta 5220

tgaatatgta tggcacacac atacagatcc aaaattaata aatccaccag gtagtttgaa 5280

acagaattaa ttctactccg atctagaacg accgcccaac cagaccacat catcacaacc 5340

aagacaaaaa aaagcatgaa aagatgaccc gacaaacaag tgcacggcat atattgaaat 5400

aaaggaaaag ggcaaaccaa accctatgca acgaaacaaa aaaaatcatg aaatcgatcc 5460

cgtctgcgga acggctagag ccatcccagg attccccaaa gagaaacact ggcaagttag 5520

caatcagaac gtgtctgacg tacaggtcgc atccgtgtac gaacgctagc agcacggatc 5580

taacacaaac acggatctaa cacaaacatg aacagaagta gaactaccgg gccctaacca 5640

tggaccggaa cgccgatcta gagaaggtag agaggggggg ggggggagga cgagcggcgt 5700

accttgaagc ggaggtgccg acgggtggat ttgggggaga tctggttgtg tgtgtgtgcg 5760

ctccgaacaa cacgaggttg gggaaagagg gtgtggaggg ggtgtctatt tattacggcg 5820

ggcgaggaag ggaaagcgaa ggagcggtgg gaaaggaatc ccccgtagct gccggtgccg 5880

tgagaggagg aggaggccgc ctgccgtgcc ggctcacgtc tgccgctccg ccacgcaatt 5940

tctggatgcc gacagcggag caagtccaac ggtggagcgg aactctcgag aggggtccag 6000

aggcagcgac agagatgccg tgccgtctgc ttcgcttggc ccgacgcgac gctgctggtt 6060

cgctggttgg tgtccgttag actcgtcgac ggcgtttaac aggctggcat tatctactcg 6120

aaacaagaaa aatgtttcct tagttttttt aatttcttaa agggtatttg tttaattttt 6180

agtcacttta ttttattcta ttttatatct aaattattaa ataaaaaaac taaaatagag 6240

ttttagtttt cttaatttag aggctaaaat agaataaaat agatgtacta aaaaaattag 6300

tctataaaaa ccattaaccc taaaccctaa atggatgtac taataaaatg gatgaagtat 6360

tatataggtg aagctatttg caaaaaaaaa ggagaacaca tgcacactaa aaagataaaa 6420

ctgtagagtc ctgttgtcaa aatactcaat tgtcctttag accatgtcta actgttcatt 6480

tatatgattc tctaaaacac tgatattatt gtagtactat agattatatt attcgtagag 6540

taaagtttaa atatatgtat aaagatagat aaactgcact tcaaacaagt gtgacaaaaa 6600

aaatatgtgg taatttttta taacttagac atgcaatgct cattatctct agagaggggc 6660

acgaccgggt cacgctgcac tgcacaagct taaaaaaagc accgactcgg tgccactttt 6720

tcaagttgat aacggactag ccttatttta acttgctatt tctagctcta aaaccttaat 6780

ccacgacaaa taacaattcg gtgcttgcgg ctcggtttat aaggtacgct ccactcttgt 6840

gattagtcaa ggtgggacaa aacgtttgcg tattacccag cgctttgctc cacctacgga 6900

ctgctgtttg ggcttcgtcg cggtgcttcg tattgggccg tgggccatgt ttcttatggc 6960

cctctctgtg acgaagtttt tggcacatac gccgctatga ctttctcttt tacttttttg 7020

caaatattct ccgtcaacgc ggcgctgaca ctgtgtccta ctgtacatag aaggaaaaaa 7080

ggtatataaa aaaataattt ctaaacacga cttactgcta gtagaaattc gaatagcatt 7140

ttagctttta caactgggcc tggaaattct ttggacacca ctattttacg acttatcatc 7200

atcgtgtgtt agagcacaag gaactataca agcgaggtta gcttaaaaaa agcaccgact 7260

cggtgccact ttttcaagtt gataacggac tagccttatt ttaacttgct atttctagct 7320

ctaaaaccga tgcaacgcat atgtggcgga gcggtggtcg cagctgaact tataagccgg 7380

tgtctgcaat gctcgctggc cggtctggta ctagttctcg gttcgtccct tgatcccttc 7440

ccccgcaagc cgtagcgacg acgcgcacgc ccgcgtgggc tggatgctta ggcgcggccc 7500

atacatcacg cgttgccttc cctcgtggtc gtgtacctat cgcaagccca gacaacgtag 7560

attgttgttg cctgcactgc acatgctgaa gatcgaatcc cctgcatagc atgaatgacg 7620

acggatcagc tgcagttatt accaagtttc atctgcggac tgaatcggag gagacacaag 7680

ttgatattca gggagcgcac atccagccac ctgcacgtct agctattttg taagggccaa 7740

ttagcttggc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc 7800

aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc 7860

gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatgctag agcagcttga 7920

gcttggatca gattgtcgtt tcccgccttc agtttaaact atcagtgttt gacaggatat 7980

attggcgggt aaacctaaga gaaaagagcg tttattagaa taatcggata tttaaaaggg 8040

cgtgaaaagg tttatccgtt cgtccatttg tatgtgcatg ccaaccacag ggttcccctc 8100

gggatcaaag tactttgatc caacccctcc gctgctatag tgcagtcggc ttctgacgtt 8160

cagtgcagcc gtcttctgaa aacgacatgt cgcacaagtc ctaagttacg cgacaggctg 8220

ccgccctgcc cttttcctgg cgttttcttg tcgcgtgttt tagtcgcata aagtagaata 8280

cttgcgacta gaaccggaga cattacgcca tgaacaagag cgccgccgct ggcctggtgg 8340

gctatgcccg cgtcagcacc gacgaccagg acttgaccaa ccaacgggcc gaactgcacg 8400

cggcctatga ggtaaagaga aaatgagcaa aagccaaaca cgctaagtgc cggccgtccg 8460

agcgcacgca gcagcaaggc tgcaacgttg gccagcctgg cagacacgcc agccatgaag 8520

cgggtcaact ttcagttgcc ggagctggcc aggatgcttg accacctacg ccctggcgac 8580

gttgtgacag tgaccaggct agaccgcctg gcccgcagca cccgcgacct actggacatt 8640

gccgagcgca tccaggaggc cggcgcgggc ctgcgtagcc tggcagagcc gtgggccgac 8700

accaccacgc cggccggccg catggtgttg accgtgttcg ccggcattgc cgagttcgag 8760

cgttccctaa tcatcgaccg cacccggagc gggcgcgagg ccgccaaggc ccgaggcgtg 8820

aagtttggcc cccgccctac cctcaccccg gcacagatcg cgcacgcccg cgagctgatc 8880

gaccaggaag gccgcaccgt gaaagaggcg gctgcactgc ttggcgtgca tcgctcgacc 8940

ctgtaccgcg cacttgagcg cagcgaggaa gtgacgccca ccgaggccag gcggcgcggt 9000

gccttccgtg aggacgcatt gaccgaggcc gacgccctgg cggccgccga gaatgaacgc 9060

caagaggaac aagcatgaaa ccgcaccagg acggccagga cgaaccgttt ttcattaccg 9120

aagagatcga ggcggagatg atcgcggccg ggtacgtgtt cgagccgccc gcgcacgtct 9180

caaccgtgcg gctgcatgaa atcctggccg gtttgtctga tgccaagctg gcggcctggc 9240

cggccagctt ggccgctgaa gaaaccgagc gccgccgtct aaaaaggtga tgtgtatttg 9300

agtaaaacag cttgcgtcat gcggtcgctg cgtatatgat gcgatgagta aataaacaaa 9360

tacgcaaggg gaacgcatga aggttatcgc tgtacttaac cagaaaggcg ggtcaggcaa 9420

gacgaccatc gcaacccatc tagcccgcgc cctgcaactc gccggggccg atgttctgtt 9480

agtcgattcc gatccccagg gcagtgcccg cgattgggcg gccgtgcggg aagatcaacc 9540

gctaaccgtt gtcggcatcg accgcccgac gattgaccgc gacgtgaagg ccatcggccg 9600

gcgcgacttc gtagtgatcg acggagcgcc ccaggcggcg gacttggctg tgtccgcgat 9660

caaggcagcc gacttcgtgc tgattccggt gcagccaagc ccttacgaca tatgggccac 9720

cgccgacctg gtggagctgg ttaagcagcg cattgaggtc acggatggaa ggctacaagc 9780

ggcctttgtc gtgtcgcggg cgatcaaagg cacgcgcatc ggcggtgagg ttgccgaggc 9840

gctggccggg tacgagctgc ccattcttga gtcccgtatc acgcagcgcg tgagctaccc 9900

aggcactgcc gccgccggca caaccgttct tgaatcagaa cccgagggcg acgctgcccg 9960

cgaggtccag gcgctggccg ctgaaattaa atcaaaactc atttgagtta atgaggtaaa 10020

gagaaaatga gcaaaagcac aaacacgcta agtgccggcc gtccgagcgc acgcagcagc 10080

aaggctgcaa cgttggccag cctggcagac acgccagcca tgaagcgggt caactttcag 10140

ttgccggcgg aggatcacac caagctgaag atgtacgcgg tacgccaagg caagaccatt 10200

accgagctgc tatctgaata catcgcgcag ctaccagagt aaatgagcaa atgaataaat 10260

gagtagatga attttagcgg ctaaaggagg cggcatggaa aatcaagaac aaccaggcac 10320

cgacgccgtg gaatgcccca tgtgtggagg aacgggcggt tggccaggcg taagcggctg 10380

ggttgcctgc cggccctgca atggcactgg aacccccaag cccgaggaat cggcgtgagc 10440

ggtcgcaaac catccggccc ggtacaaatc ggcgcggcgc tgggtgatga cctggtggag 10500

aagttgaagg ccgcgcaggc cgcccagcgg caacgcatcg aggcagaagc acgccccggt 10560

gaatcgtggc aagcggccgc tgatcgaatc cgcaaagaat cccggcaacc gccggcagcc 10620

ggtgcgccgt cgattaggaa gccgcccaag ggcgacgagc aaccagattt tttcgttccg 10680

atgctctatg acgtgggcac ccgcgatagt cgcagcatca tggacgtggc cgttttccgt 10740

ctgtcgaagc gtgaccgacg agctggcgag gtgatccgct acgagcttcc agacgggcac 10800

gtagaggttt ccgcagggcc ggccggcatg gccagtgtgt gggattacga cctggtactg 10860

atggcggttt cccatctaac cgaatccatg aaccgatacc gggaagggaa gggagacaag 10920

cccggccgcg tgttccgtcc acacgttgcg gacgtactca agttctgccg gcgagccgat 10980

ggcggaaagc agaaagacga cctggtagaa acctgcattc ggttaaacac cacgcacgtt 11040

gccatgcagc gtacgaagaa ggccaagaac ggccgcctgg tgacggtatc cgagggtgaa 11100

gccttgatta gccgctacaa gatcgtaaag agcgaaaccg ggcggccgga gtacatcgag 11160

atcgagctag ctgattggat gtaccgcgag atcacagaag gcaagaaccc ggacgtgctg 11220

acggttcacc ccgattactt tttgatcgat cccggcatcg gccgttttct ctaccgcctg 11280

gcacgccgcg ccgcaggcaa ggcagaagcc agatggttgt tcaagacgat ctacgaacgc 11340

agtggcagcg ccggagagtt caagaagttc tgtttcaccg tgcgcaagct gatcgggtca 11400

aatgacctgc cggagtacga tttgaaggag gaggcggggc aggctggccc gatcctagtc 11460

atgcgctacc gcaacctgat cgagggcgaa gcatccgccg gttcctaatg tacggagcag 11520

atgctagggc aaattgccct agcaggggaa aaaggtcgaa aaggtctctt tcctgtggat 11580

agcacgtaca ttgggaaccc aaagccgtac attgggaacc ggaacccgta cattgggaac 11640

ccaaagccgt acattgggaa ccggtcacac atgtaagtga ctgatataaa agagaaaaaa 11700

ggcgattttt ccgcctaaaa ctctttaaaa cttattaaaa ctcttaaaac ccgcctggcc 11760

tgtgcataac tgtctggcca gcgcacagcc gaagagctgc aaaaagcgcc tacccttcgg 11820

tcgctgcgct ccctacgccc cgccgcttcg cgtcggccta tcgcggccgc tggccgctca 11880

aaaatggctg gcctacggcc aggcaatcta ccagggcgcg gacaagccgc gccgtcgcca 11940

ctcgaccgcc ggcgcccaca tcaaggcacc ctgcctcgcg cgtttcggtg atgacggtga 12000

aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg 12060

gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg gcgcagccat 12120

gacccagtca cgtagcgata gcggagtgta tactggctta actatgcggc atcagagcag 12180

attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa 12240

taccgcatca ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg 12300

ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg 12360

gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 12420

gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga 12480

cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 12540

ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 12600

tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg 12660

gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 12720

tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca 12780

ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 12840

ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct 12900

ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc 12960

accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 13020

tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 13080

cgttaagggc tgatgaatcc cctaatgatt ttggtaaaaa tcattaagtt aaggtggata 13140

cacatcttgt catatgatca aatggtttcg cgaaaaatca ataatcagac aacaagatgt 13200

gcgaactcga tattttacac gactctcttt accaattctg ccccgaatta cacttaaaac 13260

gactcaacag cttaacgttg gcttgccacg cattacttga ctgtaaaact ctcactctta 13320

ccgaacttgg ccgtaacctg ccaaccaaag cgagaacaaa acataacatc aaacgaatcg 13380

accgattgtt aggtaatcgt cacctccaca aagagcgact cgctgtatac cgttggcatg 13440

ctagctttat ctgttcgggc aatacgatgc ccattgtact tgttgactgg tctgatattc 13500

gtgagcaaaa acgacttatg gtattgcgag cttcagtcgc actacacggt cgttctgtta 13560

ctctttatga gaaagcgttc ccgctttcag agcaatgttc aaagaaagct catgaccaat 13620

ttctagccga ccttgcgagc attctaccga gtaacaccac accgctcatt gtcagtgatg 13680

ctggctttaa agtgccatgg tataaatccg ttgagaagct gggttggtac tggttaagtc 13740

gagtaagagg aaaagtacaa tatgcagacc taggagcgga aaactggaaa cctatcagca 13800

acttacatga tatgtcatct agtcactcaa agactttagg ctataagagg ctgactaaaa 13860

gcaatccaat ctcatgccaa attctattgt ataaatctcg ctctaaaggc cgaaaaaatc 13920

agcgctcgac acggactcat tgtcaccacc cgtcacctaa aatctactca gcgtcggcaa 13980

aggagccatg ggttctagca actaacttac ctgttgaaat tcgaacaccc aaacaacttg 14040

ttaatatcta ttcgaagcga atgcagattg aagaaacctt ccgagacttg aaaagtcctg 14100

cctacggact aggcctacgc catagccgaa cgagcagctc agagcgtttt gatatcatgc 14160

tgctaatcgc cctgatgctt caactaacat gttggcttgc gggcgttcat gctcagaaac 14220

aaggttggga caagcacttc caggctaaca cagtcagaaa tcgaaacgta ctctcaacag 14280

ttcgcttagg catggaagtt ttgcggcatt ctggctacac aataacaagg gaagacttac 14340

tcgtggctgc aaccctacta gctcaaaatt tattcacaca tggttacgct ttggggaaat 14400

tatgagggga tctctcagcg ttaagggatt ttggtcatgc attctaggta ctaaaacaat 14460

tcatccagta aaatataata ttttattttc tcccaatcag gcttgatccc cagtaagtca 14520

aaaaatagct cgacatactg ttcttccccg atatcctccc tgatcgaccg gacgcagaag 14580

gcaatgtcat accacttgtc cgccctgccg cttctcccaa gatcaataaa gccacttact 14640

ttgccatctt tcacaaagat gttgctgtct cccaggtcgc cgtgggaaaa gacaagttcc 14700

tcttcgggct tttccgtctt taaaaaatca tacagctcgc gcggatcttt aaatggagtg 14760

tcttcttccc agttttcgca atccacatcg gccagatcgt tattcagtaa gtaatccaat 14820

tcggctaagc ggctgtctaa gctattcgta tagggacaat ccgatatgtc gatggagtga 14880

aagagcctga tgcactccgc atacagctcg ataatctttt cagggctttg ttcatcttca 14940

tactcttccg agcaaaggac gccatcggcc tcactcatga gcagattgct ccagccatca 15000

tgccgttcaa agtgcaggac ctttggaaca ggcagctttc cttccagcca tagcatcatg 15060

tccttttccc gttccacatc ataggtggtc cctttatacc ggctgtccgt catttttaaa 15120

tataggtttt cattttctcc caccagctta tataccttag caggagacat tccttccgta 15180

tcttttacgc agcggtattt ttcgatcagt tttttcaatt ccggtgatat tctcatttta 15240

gccatttatt atttccttcc tcttttctac agtatttaaa gataccccaa gaagctaatt 15300

ataacaagac gaactccaat tcactgttcc ttgcattcta aaaccttaaa taccagaaaa 15360

cagctttttc aaagttgttt tcaaagttgg cgtataacat agtatcgacg gagccgattt 15420

tgaaaccgcg gtgatcacag gcagcaacgc tctgtcatcg ttacaatcaa catgctaccc 15480

tccgcgagat catccgtgtt tcaaacccgg cagcttagtt gccgttcttc cgaatagcat 15540

cggtaacatg agcaaagtct gccgccttac aacggctctc ccgctgacgc cgtcccggac 15600

tgatgggctg cctgtatcga gtggtgattt tgtgccgagc tgccggtcgg ggagctgttg 15660

gctggctggt ggcaggatat attgtggtgt aaacaaattg acgcttagac aacttaataa 15720

cacattgcgg acgtttttaa tgtactgaat taacgccgaa ttaattcggg ggatctggat 15780

tttagtactg gattttggtt ttaggaatta gaaattttat tgatagaagt attttacaaa 15840

tacaaataca tactaagggt ttcttatatg ctcaacacat gagcgaaacc ctataggaac 15900

cctaattccc ttatctggga actactcaca cattattatg gagaaactcg agtcaaatct 15960

cggtgacggg caggaccgga cggggcggta ccggcaggct gaagtccagc tgccagaaac 16020

ccacgtcatg ccagttcccg tgcttgaagc cggccgcccg cagcatgccg cggggggcat 16080

atccgagcgc ctcgtgcatg cgcacgctcg ggtcgttggg cagcccgatg acagcgacca 16140

cgctcttgaa gccctgtgcc tccagggact tcagcaggtg ggtgtagagc gtggagccca 16200

gtcccgtccg ctggtggcgg ggggagacgt acacggtcga ctcggccgtc cagtcgtagg 16260

cgttgcgtgc cttccagggg cccgcgtagg cgatgccggc gacctcgccg tccacctcgg 16320

cgacgagcca gggatagcgc tcccgcagac ggacgaggtc gtccgtccac tcctgcggtt 16380

cctgcggctc ggtacggaag ttgaccgtgc ttgtctcgat gtagtggttg acgatggtgc 16440

agaccgccgg catgtccgcc tcggtggcac ggcggatgtc ggccgggcgt cgttctgggc 16500

tcatggtaga ctcgagagag atagatttgt agagagagac tggtgatttc agcgtgtcct 16560

ctccaaatga aatgaacttc cttatataga ggaagggtct tgcgaaggat agtgggattg 16620

tgcgtcatcc cttacgtcag tggagatatc acatcaatcc acttgctttg aagacgtggt 16680

tggaacgtct tctttttcca cgatgctcct cgtgggtggg ggtccatctt tgggaccact 16740

gtcggcagag gcatcttgaa cgatagcctt tcctttatcg caatgatggc atttgtaggt 16800

gccaccttcc ttttctactg tccttttgat gaagtgacag atagctgggc aatggaatcc 16860

gaggaggttt cccgatatta ccctttgttg aaaagtctca atagcccttt ggtcttctga 16920

gactgtatct ttgatattct tggagtagac gagagtgtcg tgctccacca tgttcacatc 16980

aatccacttg ctttgaagac gtggttggaa cgtcttcttt ttccacgatg ctcctcgtgg 17040

gtgggggtcc atctttggga ccactgtcgg cagaggcatc ttgaacgata gcctttcctt 17100

tatcgcaatg atggcatttg taggtgccac cttccttttc tactgtcctt ttgatgaagt 17160

gacagatagc tgggcaatgg aatccgagga ggtttcccga tattaccctt tgttgaaaag 17220

tctcaatagc cctttggtct tctgagactg tatctttgat attcttggag tagacgagag 17280

tgtcgtgctc caccatgttg gcaagctgct ctagccaata cgcaaaccgc ctctccccgc 17340

gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag 17400

tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct ca 17432

<210>8

<211>365

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

Met Ala His Thr Ala Thr Ser Ala Gly His Lys Tyr Ala Val Val Ser

1 5 10 15

Trp Val Arg Trp Ser Arg Lys Lys Gly Arg Ser Trp Val Gly Ala Thr

20 25 30

Val Arg Asn Tyr His Arg Met His Asp Trp Val Gly Tyr Ser Arg His

35 40 45

Arg Thr Val Thr Val Asp Met Thr Ser Tyr Thr Tyr Ala Asp Val Asn

50 55 60

Val His Val Lys Thr Asn Thr Asn Tyr Lys Gly Val Tyr Arg Ser Tyr

65 70 75 80

Met Asp Val Gly Asp Gly Asn Ala Asp Gly Trp Arg Lys Arg Lys Thr

85 90 95

Ala Ser Ala Ser Lys Asn Arg Asp Ser Ala Val Arg Tyr Ser Lys Ser

100 105 110

Gly Ser Ala Ser Lys Ala Gly Lys Val Val Asp Met Tyr Met Arg Met

115 120 125

Thr Asp Ser Cys Lys Val Gly Gly Val Gly Thr Ser Asp Asn Ser Ala

130 135 140

Ala Asp Ala Ala Asn Thr Arg Asp Trp Arg Lys Arg His Val Gly Ser

145 150 155 160

Ala Ala Ser Lys Val Asp Thr Tyr Ser Val Arg Arg Arg Lys Ala Val

165 170 175

Val Arg Ala Ser Gly Lys Lys Met Lys His Asp Ser Arg Gly Ala Gly

180 185 190

Asp Asp Gly Gly Gly Gly Asp Asp Lys Ser Arg Asp Val Val Asn Val

195 200 205

Ala Gly Arg Asp Thr Thr Ala Thr Thr Ser Trp Thr His Met Ala Met

210 215 220

Ser His Asp Val Ala Lys Arg Arg Cys Ala Ala Arg Ala Arg Gly Val

225 230 235 240

Thr Val Cys Gly Gly Ala Asp Ala Asp Asp Lys Ala Ala Ala Arg Val

245 250 255

Ala Ala Gly Thr Tyr Asp Ser Gly Lys Val Tyr His Ala Cys Val Thr

260 265 270

Thr Arg Tyr Ala Val Asp Lys Gly Asp Asp Val Asp Gly Thr Lys Val

275 280 285

Arg Ala Gly Gly Met Val Thr Tyr Val Tyr Ser Met Gly Arg Met Tyr

290 295 300

Asn Trp Gly Asp Ala Ala Ser Arg Arg Trp Asn Asp Gly Ala Arg Asn

305 310 315 320

Ala Ser Lys Thr Ala Ala Gly Arg Cys Gly Lys Asp Ser Ala Tyr Met

325 330 335

Lys Met Ala Ala Arg Tyr Ser Arg Gly His Val Tyr Arg Met Met Thr

340 345 350

Ser Met Ala His Gly Lys Val Arg Val Ser Arg Ala Val

355 360 365

Claims (10)

1.一种培育玉米雄性不育系的方法，包括如下步骤：利用CRISPR/Cas9系统对受体玉米基因组中的育性基因进行编辑，进而使所述育性基因功能丧失，得到玉米雄性不育系。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述育性基因为编码MS26蛋白的基因；

或，所述CRISPR/Cas9系统中包括两个sgRNA，分别命名为sgRNA1和sgRNA2；

或，所述sgRNA1和所述sgRNA2识别的靶序列均为所述受体玉米基因组中编码MS26蛋白的DNA片段。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述sgRNA1识别的靶序列为序列4所示的DNA分子；

或，所述sgRNA2识别的靶序列为序列5所示的DNA分子；

或，所述编辑的方法为将向所述受体玉米中导入玉米基因组编辑的载体；

或，所述玉米基因组编辑的载体含有所述sgRNA1的编码基因、所述sgRNA2的编码基因、RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子、Cas9蛋白表达盒和筛选标记基因。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：

所述sgRNA1的编码基因是序列7第7245-7347位所示的DNA分子；

或，所述sgRNA2的编码基因是序列7第6692-6794位所示的DNA分子；

或，用于启动所述sgRNA1的编码基因转录的RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子为启动子ZmU6-2；

或，用于启动所述sgRNA2的编码基因转录的RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子为启动子ZmU6-6；

或，所述启动子ZmU6-2是下述b1)或b2)或b3)所示的DNA分子：

b1)序列2所示的DNA分子；

b2)与b1)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA分子；

b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的DNA序列杂交，且具有启动子功能的DNA分子；

或，所述启动子ZmU6-6是下述c1)或c2)或c3)所示的DNA分子：

c1)序列3所示的DNA分子；

c2)与c1)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA分子；

c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的DNA序列杂交，且具有启动子功能的DNA分子。

5.如权利要求3或4中任一所述的方法，其特征在于：

所述玉米基因组编辑的载体的核苷酸序列为序列7。

6.权利要求3-5中任一所述的玉米基因组编辑的载体。

7.权利要求3-5中任一所述的玉米基因组编辑的载体在培育玉米雄性不育系中的应用。

8.权利要求1-5中任一所述方法获得的玉米雄性不育系在玉米育种中的应用；

或，权利要求1-5中任一所述方法获得的玉米雄性不育系在培育玉米雄性不育系品种中的应用；

或，权利要求1-5中任一所述方法获得的玉米雄性不育系在提高玉米回交转育效率中的应用。

9.一种培育玉米雄性不育系品种的方法，包括如下步骤：

(1)按照权利要求1-5中任一所述方法获得玉米雄性不育系；

(2)以受体玉米为轮回亲本，对所述玉米雄性不育系进行回交转育，得到玉米雄性不育系品种。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

1)以所述玉米雄性不育系为母本，以受体玉米为父本进行杂交，得到F1代；

2)从所述F1代中选取具有雄性不育表型的植株为母本，以所述受体玉米为父本进行杂交，得到BC1代；

3)从所述BC1代中选取具有雄性不育表型的植株为母本，以所述受体玉米为父本进行杂交，得到BC2代；

4)用检测权利要求3中所述筛选标记基因的物质对所述BC2代植株个体进行检测，从所述BC2代中选取没有所述筛选标记基因的植株进行自交，得到自交后代；从所述自交后代中选取具有雄性不育表型的植株个体，即为玉米雄性不育系品种。